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一種血清TPOABIGG4水平檢測方法.pdf

摘要
申請專利號:

CN201610667954.7

申請日:

2016.08.15

公開號:

CN106257288A

公開日:

2016.12.28

當前法律狀態:

撤回

有效性:

無權

法律詳情: 發明專利申請公布后的視為撤回IPC(主分類):G01N 33/96申請公布日:20161228|||實質審查的生效IPC(主分類):G01N 33/96申請日:20160815|||公開
IPC分類號: G01N33/96; G01N33/574; G01N33/68 主分類號: G01N33/96
申請人: 余洋
發明人: 高瑩; 余洋; 張晶; 劉明明
地址: 100034 北京市西城區西什庫大街8號北大醫院第二住院部內科樓五層內分泌科
優先權:
專利代理機構: 北京國坤專利代理事務所(普通合伙) 11491 代理人: 姜彥
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法律狀態
申請(專利)號:

CN201610667954.7

授權公告號:

||||||

法律狀態公告日:

2018.06.05|||2017.01.25|||2016.12.28

法律狀態類型:

發明專利申請公布后的視為撤回|||實質審查的生效|||公開

摘要

本發明公開了一種血清TPOAb?IgG4水平檢測方法,其特征在于,包括如下步驟:S1、包板:用0.05mol/L碳酸鹽緩沖液將TPO稀釋成2μg/ml,各孔加50μl包被酶標板;S2、封閉:采用PBS?T溶解的3%BSA封閉酶標板;S3、血清的稀釋與檢測:待測血清用PBS?T以1:50稀釋,各孔加入50μl,每份血清復孔檢測,每塊酶標板均設立空白、陽性和陰性對照;S4、二抗:各孔加入50μl用以PBS?T稀釋的HRP標記的鼠抗人IgG4;S5、反應底物及終止反應:各孔加入50μl辣根酶的底物顯色液,靜置6~8分鐘,顯色后各孔加50μl的1mol/L鹽酸終止反應,用酶標儀在490nm下測定各孔OD值;S6、數據處理:血清標本的OD值為抗原包被孔與相應的非抗原包被孔OD值的差值,該方法能有效的檢測血清TPOAb?IgG4的水平,方法實施簡單,可靠性強。

權利要求書

1.一種血清TPOAb IgG4水平檢測方法,其特征在于,包括如下步驟:
S1、包板:用0.05mol/L碳酸鹽緩沖液將TPO稀釋成2μg/ml,各孔加50μl包被酶標板;非
抗原包被孔加0.05mol/L碳酸鹽緩沖液50μl,37℃孵育1小時,用PBS-T沖洗3次,拍干;
S2、封閉:采用PBS-T溶解的3%BSA封閉酶標板,各孔加250μl,37℃孵育1小時,用PBS-T
沖洗3次后,拍干;
S3、血清的稀釋與檢測:待測血清用PBS-T以1:50稀釋,各孔加入50μl,每份血清復孔檢
測,每塊酶標板均設立空白、陽性和陰性對照,37℃孵育1小時,用PBS-T沖洗3次后,拍干;
S4、二抗:各孔加入50μl用以PBS-T稀釋的HRP標記的鼠抗人IgG4為二抗,37℃孵育1小
時,用PBS-T沖洗3次后,拍干;
S5、反應底物及終止反應:各孔加入50μl辣根酶的底物顯色液,靜置6~8分鐘,顯色后
各孔加50μl的1mol/L鹽酸終止反應,用酶標儀在490nm下測定各孔OD值;
S6、數據處理:血清標本的OD值為抗原包被孔與相應的非抗原包被孔OD值的差值。
2.根據權利要求1所述的一種血清TPOAb IgG4水平檢測方法,其特征在于,所述
0.05mol/L碳酸鹽緩沖液的配制如下:將1.08g的Na2CO3和2.95g的NaHCO3粉碎混合;再加蒸
餾水定容至900ml,調pH值至9.6。
3.根據權利要求1所述的一種血清TPOAb IgG4水平檢測方法,其特征在于,所述0.1%
PBS-T配制如下:將500ml的0.01mol/L磷酸鹽緩沖液和0.5ml的Tween-20混合。
4.根據權利要求3所述的一種血清TPOAb IgG4水平檢測方法,其特征在于,所述
0.01mol/L磷酸鹽緩沖液的配制如下:將4.25g的NaCl、2.901g的Na2HPO4·12H2O和0.296g的
NaH2PO4·2H2O加蒸餾水定容至500ml,調pH值至7.2。
5.根據權利要求1所述的一種血清TPOAb IgG4水平檢測方法,其特征在于,所述底物顯
色液的配制方法為:在使用前5分鐘內配制,將4mg的鄰苯二胺、10ml的檸檬酸緩沖液和3%
過氧化氫溶液混合。
6.根據權利要求5所述的一種血清TPOAb IgG4水平檢測方法,其特征在于,所述檸檬酸
緩沖液的配制方法為:將1.05mg的檸檬酸和3.58g的Na2HPO4·12H2O加蒸餾水定容至150ml,
調pH值至5.0。
7.根據權利要求5所述的一種血清TPOAb IgG4水平檢測方法,其特征在于,所述3%過
氧化氫溶液的配制方法為:將2ml的30%H2O2加蒸餾水定容至20ml。
8.根據權利要求1所述的一種血清TPOAb IgG4水平檢測方法,其特征在于,所述1mol/L
鹽酸配制方法為:將43.1ml的濃鹽酸加蒸餾水定容至500ml。
9.根據權利要求1所述的一種血清TPOAb IgG4水平檢測方法,其特征在于,所述3%BSA
封閉液的配制方法為:將0.3g的BSA和10ml的0.01MPBS-T緩沖液混合。

說明書

一種血清TPOAb IgG4水平檢測方法

技術領域

本發明涉及體外診斷技術領域,具體涉及一種血清TPOAb IgG4水平的檢測方法。

背景技術

甲狀腺過氧化物酶抗體(thyroid peroxidase antibody,TPOAb)是橋本甲狀腺炎
(Hashimoto’s thyroiditis,HT)的標志性抗體,其能夠通過抗體依賴的細胞介導的細胞毒
作用(antibody dependent cell mediated cytotoxicity,ADCC)或補體依賴的細胞毒作
用(complement dependent cytotoxicity,CDC)損傷甲狀腺細胞,因此在HT的發病機制中
發揮重要作用。TPOAb還能進一步干擾甲狀腺過氧化物酶的催化作用,阻礙甲狀腺激素的合
成,進而導致甲狀腺功能減退(簡稱甲減)。

TPOAb主要為IgG型抗體。人IgG根據其鉸鏈區氨基酸組成和重鏈二硫鍵數目、位置
的不同又可以分為四種亞型:IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。IgG4在血清中的含量最低,在IgG總
量中所占比例不足5%,平均濃度為0.35-0.51mg/mL。由于IgG4分子存在“半抗體轉換”機制
導致“雙特異性”IgG4抗體形成,其不能與抗原形成免疫復合物,且IgG4與C1q及Fc受體的親
和力較低,不能進一步激活補體及介導免疫效應細胞的功能。基于上述特點,有學者認為
IgG4是一種非致病性抗體。

近年有研究報道,HT患者依據免疫組化染色結果可分為IgG4陽性及陰性HT。同
IgG4陰性HT相比,IgG4陽性HT患者年齡更小,病情進展更快,更容易出現甲減,組織病理上
纖維化程度更重。此外,有報道發現IgG4陽性HT患者中甲狀腺乳頭狀癌(papillary
thyroid carcinoma,PTC)的發生率明顯升高,且在IgG4陽性HT基礎上發生的PTC預后更差。
綜上所述,將HT患者進一步分為IgG4陽性及陰性兩種免疫表型具有重要的臨床意義,但目
前IgG4陽性HT的診斷仍依靠術后組織病理切片的免疫組化染色結果,而大部分HT患者并不
需要手術治療,因此臨床實踐中迫切需要尋找并確定能夠早期診斷IgG4陽性HT的無創性血
清學診斷指標。

在IGg4相關性疾病(IgG4-related diseases,IgG4-RD)的研究中,血清總IgG4濃
度大于135mg/dL是其血清學診斷標準。且在部分IgG4-RD患者中,血清IgG4濃度的變化與疾
病活動度相關。因此部分學者認為血清總IgG4可能可以作為無創性血清學方法應用于IgG4
陽性HT。但本研究組在前期工作中發現,IgG4陽性HT組中血清IgG4水平與IgG4陰性HT組相
比,差異無顯著性,提示應用血清總IgG4水平并不能區分上述兩種免疫表型。而IgG4陽性HT
組患者術前血清TPOAb的IgG4水平均明顯高于IgG4陰性組。因此檢測TPOAb IgG4水平可能
有助于鑒別這兩種免疫表型,但目前國內外并無TPOAb IgG4的成熟檢測方法。

發明內容

針對以上問題,本發明提供了一種血清TPOAb IgG4水平檢測方法,可以有效解決
背景技術中的問題。

為了實現上述目的,本發明采用的技術方案如下:一種血清TPOAb IgG4水平檢測
方法,包括如下步驟:

S1、包板:用0.05mol/L碳酸鹽緩沖液將TPO稀釋成2μg/ml,各孔加50μl包被酶標
板;非抗原包被孔加0.05mol/L碳酸鹽緩沖液50μl,37℃孵育1小時,用PBS-T沖洗3次,拍干;

S2、封閉:采用PBS-T溶解的3%BSA封閉酶標板,各孔加250μl,37℃孵育1小時,用
PBS-T沖洗3次后,拍干;

S3、血清的稀釋與檢測:待測血清用PBS-T以1:50稀釋,各孔加入50μl,每份血清復
孔檢測,每塊酶標板均設立空白、陽性和陰性對照,37℃孵育1小時,用PBS-T沖洗3次后,拍
干;

S4、二抗:各孔加入50μl用以PBS-T稀釋的HRP標記的鼠抗人IgG4為二抗,37℃孵育
1小時,用PBS-T沖洗3次后,拍干;

S5、反應底物及終止反應:各孔加入50μl辣根酶的底物顯色液,靜置6~8分鐘,顯
色后各孔加50μl的1mol/L鹽酸終止反應,用酶標儀在490nm下測定各孔OD值;

S6、數據處理:血清標本的OD值為抗原包被孔與相應的非抗原包被孔OD值的差值。

根據上述技術方案,所述0.05mol/L碳酸鹽緩沖液的配制如下:將1.08g的Na2CO3和
2.95g的NaHCO3粉碎混合;再加蒸餾水定容至900ml,調pH值至9.6。

根據上述技術方案,所述0.1%PBS-T配制如下:將500ml的0.01mol/L磷酸鹽緩沖
液和0.5ml的Tween-20混合。

根據上述技術方案,所述0.01mol/L磷酸鹽緩沖液的配制如下:將4.25g的NaCl、
2.901g的Na2HPO4·12H2O和0.296g的NaH2PO4·2H2O加蒸餾水定容至500ml,調pH值至7.2

根據上述技術方案,所述底物顯色液的配制方法為:在使用前5分鐘內配制,將4mg
的鄰苯二胺、10ml的檸檬酸緩沖液和3%過氧化氫溶液混合。

根據上述技術方案,所述檸檬酸緩沖液的配制方法為:將1.05mg的檸檬酸和3.58g
的Na2HPO4·12H2O加蒸餾水定容至150ml,調pH值至5.0。

根據上述技術方案,所述3%過氧化氫溶液的配制方法為:將2ml的30%H2O2加蒸餾
水定容至20ml。

根據上述技術方案,所述1mol/L鹽酸配制方法為:將43.1ml的濃鹽酸加蒸餾水定
容至500ml。

根據上述技術方案,所述3%BSA封閉液的配制方法為:將0.3g的BSA和10ml的
0.01M PBS-T緩沖液混合。

本發明的有益效果:

本發明通過配制0.05mol/L碳酸鹽緩沖液、0.1%PBS-T、底物顯色液以及3%BSA封
閉液等溶液,將血清TPOAb依次經過包板、封閉、血清的稀釋與檢測、二抗、反應底物及終止
反應進行檢測,該方法能有效的檢測血清TPOAb IgG4的水平,方法實施簡單,可靠性強。

具體實施方式

為了使本發明的目的、技術方案及優點更加清楚明白,以下結合實施例,對本發明
進行進一步詳細說明。應當理解,此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發明,并不用于
限定本發明。

實施例:

一種血清TPOAb IgG4水平檢測方法,包括如下步驟:

S1、包板:用0.05mol/L碳酸鹽緩沖液將TPO稀釋成2μg/ml,各孔加50μl包被酶標
板;非抗原包被孔加0.05mol/L碳酸鹽緩沖液50μl,37℃孵育1小時,用PBS-T沖洗3次,拍干;

S2、封閉:采用PBS-T溶解的3%BSA封閉酶標板,各孔加250μl,37℃孵育1小時,用
PBS-T沖洗3次后,拍干;

S3、血清的稀釋與檢測:待測血清用PBS-T以1:50稀釋,各孔加入50μl,每份血清復
孔檢測,每塊酶標板均設立空白、陽性和陰性對照,37℃孵育1小時,用PBS-T沖洗3次后,拍
干;

S4、二抗:各孔加入50μl用以PBS-T稀釋的HRP標記的鼠抗人IgG4為二抗,37℃孵育
1小時,用PBS-T沖洗3次后,拍干;

S5、反應底物及終止反應:各孔加入50μl辣根酶的底物顯色液,靜置6~8分鐘,顯
色后各孔加50μl的1mol/L鹽酸終止反應,用酶標儀在490nm下測定各孔OD值;

S6、數據處理:血清標本的OD值為抗原包被孔與相應的非抗原包被孔OD值的差值。

上述溶液的配制方法如下:

0.05mol/L碳酸鹽緩沖液的配制如下:將1.08g的Na2CO3和2.95g的NaHCO3;再加蒸
餾水定容至900ml,調pH值至9.6。

0.1%PBS-T配制如下:將500ml的0.01mol/L磷酸鹽緩沖液和0.5ml的Tween-20混
合。

0.01mol/L磷酸鹽緩沖液的配制如下:將4.25g的NaCl、2.901g的Na2HPO4·12H2O和
0.296g的NaH2PO4·2H2O加蒸餾水定容至500ml,調pH值至7.2

底物顯色液的配制方法為:在使用前5分鐘內配制,將4mg的鄰苯二胺、10ml的檸檬
酸緩沖液和3%過氧化氫溶液混合。

檸檬酸緩沖液的配制方法為:將1.05mg的檸檬酸和3.58g的Na2HPO4·12H2O加蒸餾
水定容至150ml,調pH值至5.0。

3%過氧化氫溶液的配制方法為:將2ml的30%H2O2加蒸餾水定容至20ml。

1mol/L鹽酸配制方法為:將43.1ml的濃鹽酸加蒸餾水定容至500ml。

3%BSA封閉液的配制方法為:將0.3g的BSA和10ml的0.01M PBS-T緩沖液混合。

基于上述,本發明的優點在于,本發明通過配制0.05mol/L碳酸鹽緩沖液、0.1%
PBS-T、底物顯色液以及3%BSA封閉液等溶液,將血清TPOAb依次經過包板、封閉、血清的稀
釋與檢測、二抗、反應底物及終止反應進行檢測,該方法能有效的檢測血清TPOAb IgG4的水
平,方法實施簡單,可靠性強。

以上所述僅為本發明的較佳實施例而已,并不用以限制本發明,凡在本發明的精
神和原則之內所作的任何修改、等同替換和改進等,均應包含在本發明的保護范圍之內。

關 鍵 詞:
一種 血清 TPOABIGG4 水平 檢測 方法
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