• / 9
  • 下載費用:30 金幣  

HBSAGPRES化學發光免疫檢測試劑盒及其制備方法.pdf

摘要
申請專利號:

CN201610506956.8

申請日:

2016.06.30

公開號:

CN106257283A

公開日:

2016.12.28

當前法律狀態:

實審

有效性:

審中

法律詳情: 實質審查的生效IPC(主分類):G01N 33/577申請日:20160630|||公開
IPC分類號: G01N33/577; G01N33/553; G01N33/532; G01N33/531; G01N21/76; G01N35/00 主分類號: G01N33/577
申請人: 深圳市亞輝龍生物科技股份有限公司
發明人: 錢純亙; 祝亮; 王剛; 夏福臻; 黃湘東
地址: 518057 廣東省深圳市南山區南山街道興海路荔山工業區5棟1-4層
優先權:
專利代理機構: 代理人:
PDF完整版下載: PDF下載
法律狀態
申請(專利)號:

CN201610506956.8

授權公告號:

|||

法律狀態公告日:

2017.01.25|||2016.12.28

法律狀態類型:

實質審查的生效|||公開

摘要

本發明公開了一種HBsAg?PreS化學發光免疫檢測試劑盒及其制備方法,HBsAg?PreS化學發光免疫檢測試劑盒包括:HBsAg?PreS單克隆抗體包被的羧基化的磁微粒和HBsAg?PreS單克隆抗體標記的化學發光標記物。這種HBsAg?PreS化學發光免疫檢測試劑盒能夠以全自動化學發光免疫分析儀為檢測工具,完成HBsAg?PreS的檢測。這種HBsAg?PreS化學發光免疫檢測試劑盒,經過實驗,相對于傳統的HBsAg?PreS的檢測方法靈敏度至少提高了10倍,這種HBsAg?PreS化學發光免疫檢測試劑盒的檢測精度較高。

權利要求書

1.一種HBsAg PreS化學發光免疫檢測試劑盒,其特征在于,包括:HBsAg PreS單克隆抗
體包被的羧基化的磁微粒和HBsAg PreS單克隆抗體標記的化學發光標記物。
2.根據權利要求1所述的HBsAg PreS化學發光免疫檢測試劑盒,其特征在于,所述
HBsAg PreS單克隆抗體包被的羧基化的磁微粒中,所述HBsAg PreS單克隆抗體與所述羧基
化的磁微粒的比例為1:25~100。
3.根據權利要求1所述的HBsAg PreS化學發光免疫檢測試劑盒,其特征在于,所述
HBsAg PreS單克隆抗體標記的化學發光標記物中,所述HBsAg PreS單克隆抗體與所述化學
發光標記物的比例為1:10~100。
4.根據權利要求1所述的HBsAg PreS化學發光免疫檢測試劑盒,其特征在于,所述羧基
化的磁微粒的粒徑為0.05μm~1μm。
5.根據權利要求1所述的HBsAg PreS化學發光免疫檢測試劑盒,其特征在于,所述化學
發光標記物為魯米諾、異魯米諾、三聯吡啶釕或吖啶酯。
6.根據權利要求1所述的HBsAg PreS化學發光免疫檢測試劑盒,其特征在于,還包括化
學發光底物液,所述化學發光底物液包括A液和B液。
7.根據權利要求6所述的HBsAg PreS化學發光免疫檢測試劑盒,其特征在于,所述A液
為H2O2溶液,所述B液為NaOH溶液。
8.根據權利要求1所述的HBsAg PreS化學發光免疫檢測試劑盒,其特征在于,還包括
HBsAg PreS定標品。
9.根據權利要求8所述的HBsAg PreS化學發光免疫檢測試劑盒,其特征在于,所述
HBsAg PreS定標品為COI 1~10的HBsAg PreS溶液。
10.一種根據權利要求1~9中任一項所述的HBsAg PreS化學發光免疫檢測試劑盒的制
備方法,其特征在于,包括如下步驟:
取羧基化的磁微粒的懸浮液,磁分離去上清后用MES緩沖液重懸,接著加入EDC水溶液,
活化羧基化的磁微粒的表面羧基,接著加入HBsAg PreS單克隆抗體,室溫下混懸2h~10h,磁
分離去除上清后用Tris緩沖液重懸,得到HBsAg PreS單克隆抗體包被的羧基化的磁微粒;
以及取HBsAg PreS單克隆抗體,加入碳酸鹽緩沖液后混勻,然后加入化學發光標記物后混
勻,室溫下避光反應1h~2h后除雜,得到HBsAg PreS單克隆抗體標記的化學發光標記物。

說明書

HBsAg PreS化學發光免疫檢測試劑盒及其制備方法

技術領域

本發明涉及體外檢測領域,尤其涉及一種HBsAg PreS化學發光免疫檢測試劑盒及
其制備方法。

背景技術

乙型肝炎病毒(HBV)感染已成為全球性的公共健康問題,HBV被清除的特征
為乙型肝炎表面抗原(HBsAg)在血清中消失及表面抗體(HBsAb)在血清出現。理論
上,體內存在HBV復制的同一患者中二者不可能同時檢出,但也有部分臨床患者血清標
本中二者均可檢出,且多見于慢性乙型病毒性肝炎(簡稱乙肝)患者。有研究認為HBsAg、
HBsAb共陽性與HBVS基因主要親水區α決定簇的氨基酸突變及preS區,特別是pre
S2的核酸缺失、突變等因素密切相關。

目前HBsAg PreS的檢測主要有以下幾種方法 :

一、酶聯免疫吸附法

酶聯免疫吸附法(ELISA) 被廣泛應用,但該方法也存在著下述的不足之處:

(1) 使用12×8型、6×8型、8×12型或整板型96 孔專用微孔板作為抗體包被用具和反
應容器,在使用時只能分成12 批次、6 批次、8 批次或整板一次使用,無法進行獨立的、單
人份的檢測;

(2) 定性測定所用的試劑種類較多,每一種檢測試劑都要用試劑瓶來盛裝,并且每使
用一種試劑時都需要更換吸液嘴來分別加注到微孔板的微孔中,不但試劑瓶種類多,加注
試劑的操作也極為繁瑣;

(3) 缺少對檢測信息的相應標注,只能通過查看試劑盒外包裝盒的標識才能了解或知
悉檢測試劑的生產批號及有效期信息,而且所知悉的信息在檢測過程中不受控,具有很大
的隨意性;

(4) 檢測試劑在檢測過程中處于開放的空間,容易引起各種試劑之間的交叉污染而影
響檢測結果的準確性;

(5) 檢測過程多采用手工操作,試劑或樣本的加量不很精確,操作過程極為繁瑣和復
雜,容易發生操作差錯,檢測結果的準確度和精密度較差;

(6) 在檢測項目成套試劑的數量配置及使用上均為項目數×48/96人份,如果需要檢
測10 個項目,則試劑的配置及使用數須為10×48/96人份,如果只有一份樣本需要檢測10
個不同的項目,也需要配置10×48/96人份的試劑,存在著不夠經濟合理的缺點。

二、基因診斷

對許多 RNA 病毒來說 RT-PCR 診斷方法比傳統的病毒分離和抗原診斷方法既快又靈
敏。而且RT-PCR可以很容易的同時診斷多種病毒,另一些診斷方法如病毒分離和免疫熒光
分析卻不能。 但該方法也有不足之處,如 PCR 技術,DNA擴增的高校性導致了極微量的污
染既可出現假陽性,因而使結果失真。此外病毒作為外原基因的入侵者,必須在闡明其全部
或部分核苷酸序列時,才可以設計引物或探針,進行核酸分子雜交和PCR檢測。

從現有的HBsAg PreS的檢測方法可見,EIA、RT-PCR診斷方法盡管都有一定的特異
性和敏感性的優點,但在操作上需要專業技術人員、 專門的儀器設備和特定的條件及費時
等缺點。

吖啶酯作為標記物的直接化學發光相比以上方法具有明細優勢,主要表現在:反
應不需要催化劑,只要堿性環境即可進行,反應迅速,背景發光低,信噪比高,干擾因素少,
試劑穩定性好,可以兩點定標,體系簡單,激發液成本低,吖啶酯易與蛋白質聯結,且聯結后
光子產率不減少,已經成為HBsAg PreS診斷新的發展方向。

發明內容

基于此,有必要提供一種檢測靈敏度較高的HBsAg PreS化學發光免疫檢測試劑盒
及其制備方法。

一種HBsAg PreS化學發光免疫檢測試劑盒,包括:HBsAg PreS單克隆抗體包被的
羧基化的磁微粒和HBsAg PreS單克隆抗體標記的化學發光標記物。

在一個實施例中,所述HBsAg PreS單克隆抗體包被的羧基化的磁微粒中,所述
HBsAg PreS單克隆抗體與所述羧基化的磁微粒的比例為1:25~100。

在一個實施例中,所述HBsAg PreS單克隆抗體標記的化學發光標記物中,所述
HBsAg PreS單克隆抗體與所述化學發光標記物的比例為1:10~100。

在一個實施例中,所述羧基化的磁微粒的粒徑為0.05μm~1μm。

在一個實施例中,所述化學發光標記物為魯米諾、異魯米諾、三聯吡啶釕或吖啶
酯。

在一個實施例中,還包括化學發光底物液,所述化學發光底物液包括A液和B液。

在一個實施例中,所述A液為H2O2溶液,所述B液為NaOH溶液。

在一個實施例中,還包括HBsAg PreS定標品。

在一個實施例中,所述HBsAg PreS定標品為COI分別為0~0.5、1~10的HBsAg PreS
的溶液。

一種上述的HBsAg PreS化學發光免疫檢測試劑盒的制備方法,包括如下步驟:

取羧基化的磁微粒的懸浮液,磁分離去上清后用MES緩沖液重懸,接著加入EDC水溶液,
活化羧基化的磁微粒的表面羧基,接著加入HBsAg PreS單克隆抗體,室溫下混懸2h~10h,磁
分離去除上清后用Tris緩沖液重懸,得到HBsAg PreS單克隆抗體包被的羧基化的磁微粒;
以及

取HBsAg PreS單克隆抗體,加入碳酸鹽緩沖液后混勻,然后加入化學發光標記物后混
勻,室溫下避光反應1h~2h后除雜,得到HBsAg PreS單克隆抗體標記的化學發光標記物。

這種HBsAg PreS化學發光免疫檢測試劑盒能夠以全自動化學發光免疫分析儀為
檢測工具,完成HBsAg PreS的檢測。這種HBsAg PreS化學發光免疫檢測試劑盒,經過實驗,
其檢測靈敏度相對于傳統的HBsAg PreS的檢測方法靈敏度至少提高了10倍,這種HBsAg
PreS化學發光免疫檢測試劑盒的檢測精度較高。


附圖說明

圖1為一實施方式的HBsAg PreS化學發光免疫檢測試劑盒的制備方法的流程圖;

具體實施方式

為使本發明的上述目的、特征和優點能夠更加明顯易懂,下面結合附圖和具體實
施例對本發明的具體實施方式做詳細的說明。在下面的描述中闡述了很多具體細節以便于
充分理解本發明。但是本發明能夠以很多不同于在此描述的其它方式來實施,本領域技術
人員可以在不違背本發明內涵的情況下做類似改進,因此本發明不受下面公開的具體實施
的限制。

一實施方式的HBsAg PreS化學發光免疫檢測試劑盒,包括:HBsAg PreS單克隆抗
體包被的羧基化的磁微粒和HBsAg PreS單克隆抗體單克隆抗體標記的化學發光標記物。

優選的,HBsAg PreS單克隆抗體包被的羧基化的磁微粒中,HBsAg PreS單克隆抗
體與羧基化的磁微粒的比例為1:25~100。

優選的,HBsAg PreS單克隆抗體標記的化學發光標記物中,HBsAg PreS單克隆抗
體與化學發光標記物的比例為1:10~100。

優選的,羧基化的磁微粒的粒徑為0.05μm~1μm。

化學發光標記物可以為魯米諾、異魯米諾、三聯吡啶釕或吖啶酯。其中,化學發光
標記物優選為吖啶酯。

在其他的實施例中,上述HBsAg PreS化學發光免疫檢測試劑盒還包括化學發光底
物液。

化學發光底物液包括A液和B液。A液可以為H2O2溶液,B液可以為NaOH溶液。

本實施例中,A液為濃度為0.1mol/L的H2O2溶液,B液為濃度為0.25mol/L的NaOH溶
液。

在其他的實施例中,上述HBsAg PreS化學發光免疫檢測試劑盒還包括HBsAg PreS
定標品。

HBsAg PreS定標品為COI分別為0~0.5和1~10的HBsAg PreS的溶液。

具體的,HBsAg PreS定標品可以采用標準品緩沖液、及將HBsAg PreS抗原投入標
準品緩沖液配制成COI分別為0~0.5和1~10的HBsAg PreS的溶液。

這種HBsAg PreS化學發光免疫檢測試劑盒用于HBsAg PreS檢測時,利用全自動化
學發光免疫分析儀對HBsAg PreS定標品進行檢測,確定Cutoff值,內置于電腦軟件;接著測
試實際樣本,根據樣本發光值計算樣本COI;最后對HBsAg PreS全自動化學發光免疫分析系
統進行性能(靈敏度、精密度、干擾性)的評價。

這種HBsAg PreS化學發光免疫檢測試劑盒能夠以全自動化學發光免疫分析儀為
檢測工具,完成HBsAg PreS的檢測這種HBsAg PreS化學發光免疫檢測試劑盒,經過實驗,其
檢測靈敏度相對于傳統的HBsAg PreS的檢測方法靈敏度至少提高了10倍,這種HBsAg PreS
化學發光免疫檢測試劑盒的檢測精度較高。

此外,這種HBsAg PreS化學發光免疫檢測試劑盒還具有以下優點:

1、選擇吖啶酯作為標記材料,并應用于化學發光免疫分析系統,該發光體系為直接化
學發光,與傳統的酶促化學發光相比,該反應不需要酶的參與,更加節約成本;

2、選用吖啶酯的化學發光免疫分析系統RLU讀數范圍寬,能達到200~5000000,而傳統
的HBsAg PreS的檢測方法的吸光度范圍為0~4.0;

3、吖啶酯化學發光免疫分析系統重復性高,批內及批間差均在5%以內,這是其它化學
發光免疫分析系統難以達到的;

4、化學發光免疫分析系統已實現樣本的定性,通過內置Cutoff值到測試軟件,只需測
試樣本就可直接得到樣本的COI;

5、化學發光免疫分析系統可以實現全自動化,試劑及樣本的添加全有儀器完成,操作
更加簡便,減少了人為的誤差。

如圖1所示的上述HBsAg PreS化學發光免疫檢測試劑盒的制備方法,包括如下步
驟:

取羧基化的磁微粒的懸浮液,磁分離去上清后用MES緩沖液重懸,接著加入EDC水溶液,
活化羧基化的磁微粒的表面羧基,接著加入HBsAg PreS單克隆抗體,室溫下混懸2h~10h,磁
分離去除上清后用Tris緩沖液重懸,得到HBsAg PreS單克隆抗體包被的羧基化的磁微粒。

MES(2-(N-嗎啡啉)乙磺酸)緩沖液的濃度為0.02M,pH為5.5。

Tris緩沖液的濃度為0.1M并且含有2%BSA,pH為8.0。

EDC(1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亞胺)水溶液的濃度為10mg/mL~20mg/
mL,EDC與羧基化的磁微粒的比例為0.05:0.1~1。

優選的,HBsAg PreS單克隆抗體包被的羧基化的磁微粒中,HBsAg PreS單克隆抗
體與羧基化的磁微粒的比例為1:25~100。

優選的,羧基化的磁微粒的粒徑為0.05μm~1μm。

取HBsAg PreS單克隆抗體,加入碳酸鹽緩沖液后混勻,然后加入化學發光標記物
后混勻,室溫下避光反應1h~2h后除雜,得到HBsAg PreS單克隆抗體標記的化學發光標記
物。

碳酸鹽緩沖液濃度為0.1M,pH為9.0~9.5,

除雜的操作為離心脫鹽柱脫鹽,具體操作為:先分別用純凈水及TBS緩沖液(40 mM
Tris-HCl,0.5% BSA,1% NaCl,pH 8.0)處理離心脫鹽柱,最后加入得到的HBsAg PreS單克
隆抗體標記的化學發光標記物,最后收集離心管中的液體。

優選的,HBsAg PreS單克隆抗體標記的化學發光標記物中,HBsAg PreS單克隆抗
體與化學發光標記物的比例為1:10~100。

化學發光標記物可以為魯米諾、異魯米諾、三聯吡啶釕或吖啶酯。其中,化學發光
標記物優選為吖啶酯。

得到的HBsAg PreS單克隆抗體包被的羧基化的磁微粒和HBsAg PreS單克隆抗體
標記的化學發光標記物組合即可得到上述HBsAg PreS化學發光免疫檢測試劑盒。

這種HBsAg PreS化學發光免疫檢測試劑盒在使用時,還需要化學發光底物液和
HBsAg PreS定標品。

化學發光底物液包括A液和B液。A液可以為H2O2溶液,B液可以為NaOH溶液。

本實施例中,A液為濃度為0.1mol/L的H2O2溶液,B液為濃度為0.25mol/L的NaOH溶
液。

具體的,,HBsAg PreS定標品可以采用標準品緩沖液、及將HBsAg PreS抗原投入標
準品緩沖液配制成COI分別為0~0.5和1~10的HBsAg PreS的溶液。

這種HBsAg PreS化學發光免疫檢測試劑盒的制備方法簡單方便,制得的HBsAg
PreS化學發光免疫檢測試劑盒的檢測靈敏度較高,具有良好的應用前景。


以下為具體實施例。

實施例1:HBsAg PreS化學發光免疫檢測試劑盒的制備

(1)HBsAg PreS單克隆抗體包被的羧基化的磁微粒的制備:

取含有50mg粒徑為0.05μm~1μm的羧基化的磁微粒(MagnaBind?,貨號21353)懸浮液,
磁分離去上清,用0.02 M,pH為5.5 MES緩沖液重懸,加入1mL新配置的10mg/mL的EDC水溶
液,活化磁珠表面羧基,加入4mgHBsAg PreS單克隆抗體(biorbyt,貨號orb48780),室溫下
混懸6h,磁分離,去除上清,用含2%BSA的0.1M,pH為8.0的Tris緩沖液重懸到1mg/mL,得到
HBsAg PreS單克隆抗體包被的羧基化的磁微粒,每瓶5mL分裝保存于4℃備用。

(2)HBsAg PreS單克隆抗體標記的吖啶酯的制備:

取50μL濃度為10mg/mL的HBsAg PreS單克隆抗體,加入150μL濃度為0.1M、pH為9.0~9.5
的碳酸鹽緩沖液,混勻,然后加入1.5μL濃度為5mg/mL的吖啶酯溶液混勻,室溫下避光反應,
1.5h后取出,用2mL的zeba離心脫鹽柱脫鹽處理,脫鹽過程中首先分別用純凈水及TBS緩沖
液進行處理,最后加入得到的HBsAg PreS單克隆抗體標記的吖啶酯溶液,收集離心管中的
液體至保存管得到HBsAg PreS單克隆抗體單克隆抗體標記的吖啶酯,每瓶5mL分裝保存于4
℃備用。

(3)HBsAg PreS定標品的制備:

用標準品緩沖液(40 mM Tris-HCl,0.5% BSA,1% NaCl,pH 8.0)、將HBsAg PreS抗原投
入標準品緩沖液配置成COI為0~0.5和1~10,每瓶0.5 mL分裝,4 ℃保存備用。


實施例2:HBsAg PreS化學發光免疫檢測方法

以全自動化學發光免疫分析儀(YHLO,貨號iFlash3000)為檢測工具,方法學模式為雙
抗體夾心法,即儀器依次加入50 μL的樣品、50 μL的HBsAg PreS單克隆抗體包被的羧基化
的磁微粒以及50 μL的HBsAg PreS處理液,反應20 min后,再加100μL的HBsAg PreS標記的
吖啶酯,反應20 min后,進行磁分離,儀器將反應混合物送入暗室,依次加入發光底物A液
(H2O2)及B液(NaOH)進行發光反應,最后記錄發光值。


實施例3:HBsAg PreS化學發光免疫檢測試劑盒性能評價

采用實施例2中的方法對HBsAg PreS定標品進行檢測,得到Cutoff值。

接著測試實際樣本,根據樣本發光值計算樣本COI。

精密度測定:

取COI為5及50兩個HBsAg PreS樣品,每個樣本每個濃度各做3個平行,用三批試劑盒進
行檢測,計算試劑盒批內及批間差,結果表明該試劑盒批內及批間差均小于5%。

干擾性實驗:

取混合血清分別添加干擾物包括:結合膽紅素、游離膽紅素、血紅蛋白、抗壞血酸、甘油
酯,添加比例按照 1:20進行,分別測定混合血清及添加了各種干擾物后混合血清的測值,
計算二者之間的偏差,以 ±10%為可接受范圍。結果表明,干擾性均達到 NCCLS 的文件標
準,可用于臨床實驗室HBsAg PreS 狀況的準確評估。


實施例4、HBsAg PreS化學發光免疫檢測試劑盒的對比實驗

分別用化學發光檢測方法和傳統的酶聯免疫吸附法對一組梯度稀釋樣品做檢測,兩種
方法檢測靈敏度相比,數據如下表所示:

測試次數
化學發光檢測 (COI)
酶聯免疫吸附法檢測 (COI)
原倍樣本
1122.76
17.78
1:10稀釋樣本
794.19
15.67
1:20稀釋樣本
547.48
9.17
1:40稀釋樣本
386.34
5.61
1:80稀釋樣本
220.19
3.22
1:160稀釋樣本
113.83
1.72
1:320稀釋樣本
52.32
0.94
1:640稀釋樣本
23.59
0.67
1:1280稀釋樣本
11.50
0.44
稀釋液
0.22
0.22


由上表可以看出,化學發光檢測方法的靈敏度較酶聯免疫吸附法提高了約10倍。


以上所述實施例僅表達了本發明的幾種實施方式,其描述較為具體和詳細,但并不能
因此而理解為對本發明專利范圍的限制。應當指出的是,對于本領域的普通技術人員來說,
在不脫離本發明構思的前提下,還可以做出若干變形和改進,這些都屬于本發明的保護范
圍。因此,本發明專利的保護范圍應以所附權利要求為準。

關 鍵 詞:
HBSAGPRES 化學 發光 免疫 檢測 試劑盒 及其 制備 方法
  專利查詢網所有資源均是用戶自行上傳分享,僅供網友學習交流,未經上傳用戶書面授權,請勿作他用。
關于本文
本文標題:HBSAGPRES化學發光免疫檢測試劑盒及其制備方法.pdf
鏈接地址:http://www.rgyfuv.icu/p-6100666.html
關于我們 - 網站聲明 - 網站地圖 - 資源地圖 - 友情鏈接 - 網站客服客服 - 聯系我們

[email protected] 2017-2018 zhuanlichaxun.net網站版權所有
經營許可證編號:粵ICP備17046363號-1 
 


收起
展開
山东11选5中奖结果走势图