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一種基于表面增強拉曼散射技術的復合材料及其制備方法.pdf

摘要
申請專利號:

CN201610234754.2

申請日:

2016.04.14

公開號:

CN106257271A

公開日:

2016.12.28

當前法律狀態:

實審

有效性:

審中

法律詳情: 實質審查的生效IPC(主分類):G01N 21/65申請日:20160414|||公開
IPC分類號: G01N21/65 主分類號: G01N21/65
申請人: 中國科學院寧波材料技術與工程研究所
發明人: 沈折玉; 吳愛國; 武小俠; 張玉杰; 阮慧敏
地址: 315201 浙江省寧波市鎮海區莊市大道519號
優先權: 2015.06.19 CN 2015103516191
專利代理機構: 上海一平知識產權代理有限公司 31266 代理人: 馬莉華;劉真真
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法律狀態
申請(專利)號:

CN201610234754.2

授權公告號:

|||

法律狀態公告日:

2017.01.25|||2016.12.28

法律狀態類型:

實質審查的生效|||公開

摘要

本發明涉及一種基于表面增強拉曼散射技術的復合材料及其制備方法。具體地,本發明公開了一種復合材料,所述復合材料包括表面修飾有第一靶分子的微球與表面修飾有拉曼信號分子和經第二靶分子修飾的高分子的第二組分;并且,在含待測物溶液中,所述待測物與所述微球和所述第二組分通過所述第一靶分子和所述第二靶分子結合形成易于離心沉淀的復合物。本發明還公開了所述復合材料的制法和用途,使用所述復合材料對人前列腺特異性抗原(PSA)、人血紅蛋白(Hb)、降鈣素原(PCT)或疾病標志物(如腫瘤標志物、心血管疾病標志物、老年癡呆癥標志物、支原體、衣原體等)等進行檢測,可有效降低假陽性和假陰性效應,具有高靈敏、簡單、快速、低成本等優點。

權利要求書

1.一種復合材料,其特征在于,所述復合材料包括:
(a)第一組分,所述第一組分包括:
(a-i)作為內核的微球,所述微球易于離心沉淀;和
(a-ii)位于外層的第一靶分子,所述第一靶分子修飾于所述微球表面,且與待測物具
有特異性相互作用;和
(b)第二組分,所述第二組分包括:
(b-i)作為內核的貴金屬粒子;
(b-ii)拉曼信號分子,所述拉曼信號分子固定和/或吸附于所述貴金屬粒子表面;
(b-iii)作為中間層的高分子,所述高分子具有多個與所述貴金屬粒子進行結合的結
合官能團(binding functional group),且所述高分子通過多個所述結合官能團結合于所
述貴金屬粒子的外周;和
(b-iv)位于外層的第二靶分子,所述第二靶分子偶聯于所述高分子,且與待測物具有
特異性相互作用;
并且,在含待測物溶液中,所述待測物與所述第一組分和所述第二組分通過所述第一
靶分子和所述第二靶分子結合形成易于離心沉淀的復合物。
2.如權利要求1所述的復合材料,其特征在于,所述微球表面具有選自下組的基團:羧
基、氨基、羥基、或其組合;和/或
所述微球的粒徑為100nm-1000μm。
3.如權利要求1所述的復合材料,其特征在于,所述貴金屬粒子選自下組:金、銀、鉑、或
其組合;和/或
所述貴金屬粒子的粒徑為5-500nm。
4.如權利要求1所述的復合材料,其特征在于,所述結合官能團選自下組:巰基、氨基、
羧基、羥基、或其組合;和/或
所述高分子為線性高分子,且所述高分子的各分子鏈通過多個“金屬-S鍵”和/或“金
屬-N鍵”與所述貴金屬粒子化學鍵合。
5.如權利要求1所述的復合材料,其特征在于,所述第一靶分子和所述第二靶分子可相
同或不同,各自獨立地選自下組:單克隆抗體、葉酸、半乳糖胺、表皮生長因子EGF、多肽類物
質、核酸適配體、或其組合。
6.一種非診斷性、非治療性檢測人前列腺特異性抗原(PSA)、人血紅蛋白(Hb)、降鈣素
原(PCT)或疾病標志物的方法,其特征在于,所述方法包括如下步驟:
a)將權利要求1所述的復合材料與待測樣品均勻混合,得到第一混合液;
b)離心沉淀第一混合液,使用拉曼光譜儀檢測所得沉淀的拉曼信號,確定待測樣品中
PSA、Hb、PCT或疾病標志物的存在與否和/或數量。
7.如權利要求6所述的方法,其特征在于,所述方法具有選自下組的一個或多個特征:
i)當待測物為PSA時,其檢測靈敏度下限為0.1ng/L;
ii)當待測物為Hb時,其檢測靈敏度下限為1.0ng/L;
iii)當待測物為胰腺癌標志物MUC4(黏蛋白)時,其檢測靈敏度下限為0.1μg/L;
ⅳ)當待測物為老年癡呆癥標志物β-淀粉樣肽時,其檢測靈敏度下限為0.01μg/L;
v)當待測物為心臟病標志物肌鈣蛋白I時,其檢測靈敏度下限為5ng/L。
8.一種權利要求1所述的復合材料的制備方法,其特征在于,所述方法包括如下步驟:
1)提供權利要求1所述的第一組分和第二組分,其中,
所述第一組分是如下制備的:
a-1)提供微球和第一靶分子;
a-2)在催化劑作用下,使微球和第一靶分子反應得到所述第一組分;
所述第二組分是如下制備的:
b-1)提供第一混合液、第二混合液、第三混合液和第四混合液,其中,
所述第一混合液含有第一溶劑和所述貴金屬粒子;
所述第二混合液含有第二溶劑和所述拉曼信號分子;
所述第三混合液含有第三溶劑和所述高分子;
所述第四混合液含有第四溶劑和所述第二靶分子;
b-2)將所述第二混合液加入所述第一混合液中進行反應;
b-3)將所述第三混合液加入步驟b-2)所得產物中進行反應;
b-4)在催化劑作用下,將所述第四混合液加入步驟b-3)所得產物中進行反應,得到所
述第二組分;
2)混合步驟1)所得第一組分和第二組分,得到權利要求1所述的復合材料。
9.一種權利要求1所述的復合材料的用途,其特征在于,用于制備鑒定和/或檢測用試
劑或藥劑,優選地用于鑒定和/或檢測PSA、Hb、PCT或疾病標志物。
10.一種產品,其特征在于,所述產品含有權利要求1所述的復合材料或由權利要求1所
述的復合材料組成。

說明書

一種基于表面增強拉曼散射技術的復合材料及其制備方法

技術領域

本發明涉及醫藥技術領域,具體地涉及一種基于表面增強拉曼散射技術的復合材
料及其制備方法

背景技術

特異性的分子識別,例如抗原-抗體、生物素-親和素、DNA-DNA或RNA,是很重要的
生物分析。其中抗原-抗體的特異性相互作用在人類疾病檢測中的應用最廣泛。人類免疫系
統可以在非正常細胞表面產生不同種抗原,利用抗原的檢測可以達到診斷疾病的效果。而
目前臨床檢測抗原的方法,包括血清檢測、酶聯免疫吸附測試等,上述方法均存在操作復
雜、耗時長、在低濃度抗原檢測時靈敏度低的不足。另外,人類疾病的早期診斷對醫藥治療
和減小治療的副作用起著至關重要的作用。因此,發展一種高通量、高靈敏、低成本的準確
檢測早期疾病的診斷方法是一個亟待解決的問題。

拉曼光譜術是一種基于拉曼散射效應而發展起來的分子光譜技術,采用拉曼光譜
技術可以從分子水平上探測組織細胞內的蛋白、核酸、脂類以及糖類等生物分子的精細結
構和信息。與常規檢測技術相比,拉曼光譜技術具有樣本預處理簡單、無損和快速等優點,
然而,由于分子的拉曼散射截面小,使得拉曼光譜檢測液體樣品的信號非常微弱(約為熒光
的萬分之一),一些與抗原多肽相關的指紋信號易被熒光等背景噪聲所掩蓋。因此,如能對
拉曼信號進行增強,同時抑制熒光等背景信號,將顯著提高癌癥檢測的靈敏度。1974年,
Fleishman等發現,當吡啶分子吸附在粗糙銀表面上,其拉曼散射信號比溶液中吡啶分子的
拉曼散射信號增強約6個數量級,這種增強效應被稱為表面增強拉曼散射(SERS)效應。目前
SERS增強效應最高可達到1014~1015數量級,實現了某種意義上可稱為靈敏度最高的單分
子檢測。SERS技術保留了拉曼光譜技術簡單、無損和快速等原有優點,同時具備了高靈敏度
的獨特優勢。因此,將SERS技術應用于生物蛋白的檢測已成為檢測抗原多肽的最佳手段之
一。

但是,現有技術中多為直接在SERS納米粒子表面修飾Raman信號分子和抗體,這不
可避免地會使得金屬納米粒子裸露的表面與抗原上的-SH發生反應,產生假陽性的結果。

綜上所述,本領域急需開發一種新型的可有效降低假陽性和假陰性效應,且可高
靈敏、簡單、快速、低成本檢測人前列腺特異性抗原(PSA)、人血紅蛋白(Hb)、降鈣素原(PCT)
或疾病標志物的復合材料及其制備方法。

發明內容

本發明的目的在于提供一種新型的可有效降低假陽性和假陰性效應,且可高靈
敏、簡單、快速、低成本檢測人前列腺特異性抗原(PSA)、人血紅蛋白(Hb)、降鈣素原(PCT)或
疾病標志物的復合材料及其制備方法。

本發明的第一方面,提供了一種復合材料,所述復合材料包括:

(a)第一組分,所述第一組分包括:

(a-i)作為內核的微球,所述微球易于離心沉淀;和

(a-ii)位于外層的第一靶分子,所述第一靶分子修飾于所述微球表面,且與待測
物具有特異性相互作用;和

(b)第二組分,所述第二組分包括:

(b-i)作為內核的貴金屬粒子;

(b-ii)拉曼信號分子,所述拉曼信號分子固定和/或吸附于所述貴金屬粒子表面;

(b-iii)作為中間層的高分子,所述高分子具有多個與所述貴金屬粒子進行結合
的結合官能團(binding functional group),且所述高分子通過多個所述結合官能團結合
于所述貴金屬粒子的外周;和

(b-iv)位于外層的第二靶分子,所述第二靶分子偶聯于所述高分子,且與待測物
具有特異性相互作用;

并且,在含待測物溶液中,所述待測物與所述第一組分和所述第二組分通過所述
第一靶分子和所述第二靶分子結合形成易于離心沉淀的復合物。

在另一優選例中,所述待測物選自下組:人前列腺特異性抗原(PSA)、人血紅蛋白
(Hb)、降鈣素原(PCT)、疾病標志物(如腫瘤標志物、心血管疾病標志物、老年癡呆癥標志物、
支原體、衣原體等)、或其組合。

在另一優選例中,所述復合材料還包括溶劑。

在另一優選例中,所述溶劑選自下組:水、四氫呋喃、PBS、或其組合。

在另一優選例中,所述復合材料在所述溶劑中的重量百分含量為0.01-10%,較
佳地0.05-5%,更佳地0.1-0.5%。

在另一優選例中,所述微球表面具有選自下組的基團:羧基、氨基、羥基、或其組
合;和/或

所述微球的粒徑為100nm-1000μm。

在另一優選例中,所述微球的粒徑為200nm-500μm,較佳地為300nm-300μm,更佳地
為400nm-200μm,最佳地為500nm-100μm。

在另一優選例中,所述微球的形狀選自下組:球形、類球形、棒形、星形、三角片、立
方體、三角錐。

在另一優選例中,所述微球選自下組:聚苯乙烯-丙烯酸微球、聚苯乙烯-甲基丙烯
酸微球、聚苯乙烯微球、聚乳酸微球、聚乳酸-羥基乙酸微球、或其組合。

在另一優選例中,所述“易于離心沉淀”是指:在離心處理過程中,2.0mL 2.0mg/mL
的所述微球在500×g離心力下在20min內的沉淀率為30-100%,較佳地為70-100%,更佳
地為90-100%。

在另一優選例中,在所述復合材料中,所述微球的濃度為0.01-50mg/mL,較佳地為
0.5-3.0mg/mL,更佳地為1.0-2.0mg/mL。

在另一優選例中,在所述復合材料中(溶劑除外,包括微球、第一靶分子、貴金屬粒
子、拉曼信號分子、高分子和第二靶分子),所述微球的重量百分含量為10-95wt%,較佳地
為30-90wt%,更佳地為50-90wt%。

在另一優選例中,在所述復合材料中,所述微球的體積百分含量為40-99體積%,
較佳地為50-98體積%,更佳地為60-95體積%。

在另一優選例中,所述第一靶分子經選自下組的基團與所述微球連接:羧基、氨
基、羥基、巰基或其組合。

在另一優選例中,所述貴金屬粒子選自下組:金、銀、鉑、或其組合;和/或

所述貴金屬粒子的粒徑為5-500nm。

在另一優選例中,所述貴金屬粒子的粒徑為10-400nm,較佳地為20-300nm,更佳地
為30-200nm,最佳地為40-100nm。

在另一優選例中,所述貴金屬粒子的形狀選自下組:球形、類球形、棒形、星形、三
角片、立方體、三角錐、或其組合。

在另一優選例中,所述貴金屬粒子選自下組:金納米球、金納米立方體、金納米星、
金納米棒、銀納米球、銀納米三角片、鉑納米球、鉑納米片、金包銀球、金包銀星、銀包金球、
或其組合。

在另一優選例中,在所述復合材料中,所述貴金屬粒子的濃度為0.1-5.0mg/mL,較
佳地為0.2-3.0mg/mL,更佳地為0.4-2.0mg/mL。

在另一優選例中,在所述復合材料中(溶劑除外,包括微球、第一靶分子、貴金屬粒
子、拉曼信號分子、高分子和第二靶分子),所述貴金屬粒子的重量百分含量為5-90wt%,較
佳地為10-70wt%,更佳地為10-50wt%。

在另一優選例中,在所述復合材料中,所述微球和所述貴金屬粒子的質量比為1:
30-10000,較佳地1:50-1000,更佳地1:50-500,最佳地1:50-120。

在另一優選例中,在所述復合材料中,所述貴金屬粒子的體積百分含量為1-60體
積%,較佳地為2-50體積%,更佳地為5-40體積%。

在另一優選例中,所述拉曼信號分子為在拉曼光譜中具有明顯共軛振動的有機分
子。

在另一優選例中,所述“固定”和/或所述“吸附”為化學鍵合和/或物理吸附。

在另一優選例中,所述有機分子選自下組:4-巰基苯甲酸、巰基吡啶、4-巰基苯胺、
巰基萘、對氟硫酚、羅丹明、結晶紫、耐爾藍、或其組合。

在另一優選例中,所述拉曼信號分子與所述貴金屬粒子的質量比為0.001-0.3,
較佳地為0.01-0.25,更佳地為0.1-0.2。

在另一優選例中,在所述復合材料中,所述拉曼信號分子的濃度為5-500μM,較佳
地為50-200μM,更佳地為100-150μM。

在另一優選例中,所述結合官能團選自下組:巰基、氨基、羧基、羥基、或其組合;
和/或

所述高分子為線性高分子,且所述高分子的各分子鏈通過多個“金屬-S鍵”和/或
“金屬-N鍵”與所述貴金屬粒子化學鍵合。

在另一優選例中,所述高分子為具有巰基和/或氨基的聚合物(包括直鏈和支鏈聚
合物)。

在另一優選例中,所述高分子“平躺式”地與所述貴金屬粒子結合,即所述高分子
的各分子鏈基本平鋪于所述貴金屬粒子表面,和/或所述高分子的各分子鏈基本平行于所
述貴金屬粒子的表面。

在另一優選例中,所述“平躺式”指所述高分子中的每個分子均通過多個結合官能
團與所述貴金屬粒子在n個位置發生連接,其中n為≥3的正整數,較佳地n≥10個,更佳地≥
50個。

在另一優選例中,所述高分子的分子量≥1000道爾頓,較佳地≥5000道爾頓,更佳
地≥10000道爾頓。

在另一優選例中,所述高分子的分子量通常≤1000000道爾頓,較佳地≤100000道
爾頓。

在另一優選例中,所述高分子選自下組:寡肽、多肽、蛋白質、多糖、聚醚類改性化
合物、聚酯類改性化合物、或其組合。

在另一優選例中,所述多肽含有多個巰基。

在另一優選例中,所述多肽的長度≥20個氨基酸,較佳地50-2000個氨基酸,更佳
地100-1000個氨基酸。

在另一優選例中,所述多肽包括:聚谷氨酸、聚天門冬氨酸、含谷氨酸化合物、含天
門冬氨酸化合物、聚賴氨酸、聚精氨酸、含賴氨酸化合物、含精氨酸化合物、或其組合。

在另一優選例中,所述蛋白質為還原型蛋白質,如還原型牛血清白蛋白(rBSA)。

在另一優選例中,所述多糖選自下組:殼聚糖、葡聚糖、甲殼素、纖維素、淀粉、瓊
脂、或其組合。

在另一優選例中,所述改性化合物具有選自下組的基團:氨基、羧基、羥基、或其組
合。

在另一優選例中,所述高分子末端帶有選自下組的基團:氨基、羧基、羥基、或其組
合。

在另一優選例中,所述高分子在所述貴金屬粒子表面的覆蓋率為≥30%,較佳地
≥70%,更佳地≥80%,最佳地≥90%或100%。

在另一優選例中,在所述復合材料中,所述高分子的濃度為0.1-20μg/mL,較佳地
為0.5-10μg/mL,更佳地為3-5μg/mL。

在另一優選例中,所述第一靶分子和所述第二靶分子可相同或不同,各自獨立地
選自下組:單克隆抗體、葉酸、半乳糖胺、表皮生長因子EGF、多肽類物質、核酸適配體、或其
組合。

在另一優選例中,所述第一靶分子和所述第二靶分子相同,且選自下組:單克隆抗
體、葉酸、半乳糖胺、表皮生長因子EGF、多肽類物質、核酸適配體、或其組合。

在另一優選例中,所述單克隆抗體選自下組:人前列腺特異性抗體、人血紅蛋白
(Hb)特異性抗體、腫瘤標志物特異性抗體、心血管疾病標志物特異性抗體、老年癡呆癥標志
物特異性抗體、EPCAM抗體、CD44抗體、或其組合。

在另一優選例中,所述多肽類物質選自下組:RGD肽、轉鐵蛋白、或其組合。

在另一優選例中,所述第一靶分子在所述微球表面均勻分布。

在另一優選例中,所述第一靶分子在所述微球表面的覆蓋率為≥10%,較佳地≥
30%,更佳地≥50%。

在另一優選例中,所述“均勻分布”指在所述微球的任一單位表面積內所述第一靶
分子的覆蓋率與在所述微球的整個表面積內所述第一靶分子的覆蓋率的比值為0.8-1.2,
較佳地為0.9-1.1。

在另一優選例中,所述第二靶分子在所述第二組分表面均勻分布。

在另一優選例中,所述第二靶分子在所述第二組分表面的覆蓋率為≥10%,較佳
地≥30%,更佳地≥50%。

在另一優選例中,所述“均勻分布”指在所述第二組分的任一單位表面積內所述第
二靶分子的覆蓋率與在所述第二組分的整個表面積內所述第二靶分子的覆蓋率的比值為
0.8-1.2,較佳地為0.9-1.1。

在另一優選例中,在所述復合材料中(溶劑除外,包括微球、第一靶分子、貴金屬粒
子、拉曼信號分子、高分子和第二靶分子),所述第一靶分子的重量百分含量為0.1-5wt%,
較佳地為1-4wt%,更佳地為2-3wt%。

在另一優選例中,在所述復合材料中(溶劑除外,包括微球、第一靶分子、貴金屬粒
子、拉曼信號分子、高分子和第二靶分子),所述第二靶分子的重量百分含量為0.1-5wt%,
較佳地為1-4wt%,更佳地為2-3wt%。

在另一優選例中,所述第二靶分子通過酰胺鍵與所述高分子共價鍵合。

在另一優選例中,所述復合材料是使用本發明第三方面的方法制備的。

本發明的第二方面,提供了一種檢測人前列腺特異性抗原(PSA)、人血紅蛋白
(Hb)、降鈣素原(PCT)或疾病標志物的方法,所述方法包括如下步驟:

a)將本發明第一方面所述的復合材料與待測樣品均勻混合,得到第一混合液;

b)離心沉淀第一混合液,使用拉曼光譜儀檢測所得沉淀的拉曼信號,確定待測樣
品中PSA、Hb、PCT或疾病標志物的存在與否和/或數量。

在另一優選例中,在步驟a)之后還任選地包括如下步驟:培養第一混合液。

在另一優選例中,在步驟b)中使用拉曼光譜儀檢測所得沉淀之前還任選地包括步
驟:使用純水分散所述沉淀。

在另一優選例中,所述待測樣品選自下組:精斑、血跡、血液、唾液、尿液。

在另一優選例中,所述待測樣品中待測物的濃度為0.0001-1000μg/L,較佳地為
0.001-100μg/L,更佳地為0.01-10μg/L。

在另一優選例中,所述疾病標志物選自下組:腫瘤標志物、心血管疾病標志物、老
年癡呆癥標志物、支原體、衣原體、或其組合。

在另一優選例中,所述培養的培養時間為10-80min,較佳地20-60min。

在另一優選例中,步驟b)所述離心的離心力為300-1000×g,離心時間為2-
60min,較佳地3-40min。

在另一優選例中,所述經純水分散的沉淀液中所述沉淀的濃度為1.0-100mg/mL,
較佳地為5.0-50mg/mL,更佳地為10-20mg/mL。

在另一優選例中,所述方法是非診斷性的、非治療性的。

在另一優選例中,所述方法具有選自下組的一個或多個特征:

i)當待測物為PSA時,其檢測靈敏度下限為0.1ng/L;

在另一優選例中,當待測物為PSA時,其檢測靈敏度下限為0.1ng/L,較佳地為
0.5ng/L,更佳地為5ng/L,最佳地為30ng/L。

ii)當待測物為Hb時,其檢測靈敏度下限為1.0ng/L;

在另一優選例中,當待測物為Hb時,其檢測靈敏度下限為1.0ng/L,較佳地為
5.0ng/L,更佳地為10ng/L,最佳地為50ng/L。

iii)當待測物為胰腺癌標志物MUC4(黏蛋白)時,其檢測靈敏度下限為0.1μg/L;

在另一優選例中,當待測物為胰腺癌標志物MUC4(黏蛋白)時,其檢測靈敏度下限
為0.1μg/L,較佳地為1μg/L,更佳地為5μg/L,最佳地為10μg/L。

ⅳ)當待測物為老年癡呆癥標志物β-淀粉樣肽時,其檢測靈敏度下限為0.01μg/L;

v)當待測物為心血管疾病標志物肌鈣蛋白I時,其檢測靈敏度下限為5ng/L。

在另一優選例中,當待測物為心血管疾病標志物肌鈣蛋白I時,其檢測靈敏度下限
為5ng/L,較佳地為10ng/L,更佳地為50ng/L,最佳地為100ng/L。

在另一優選例中,當待測物為老年癡呆癥標志物β-淀粉樣肽時,其檢測靈敏度下
限為0.01μg/L,較佳地為0.1μg/L,更佳地為0.5μg/L,最佳地為1.0μg/L。

本發明的第三方面,提供了一種本發明第一方面所述的復合材料的制備方法,所
述方法包括如下步驟:

1)提供本發明第一方面所述的第一組分和第二組分,其中,

所述第一組分是如下制備的:

a-1)提供微球和第一靶分子;

a-2)在催化劑作用下,使微球和第一靶分子反應得到所述第一組分;

所述第二組分是如下制備的:

b-1)提供第一混合液、第二混合液、第三混合液和第四混合液,其中,

所述第一混合液含有第一溶劑和所述貴金屬粒子;

所述第二混合液含有第二溶劑和所述拉曼信號分子;

所述第三混合液含有第三溶劑和所述高分子;

所述第四混合液含有第四溶劑和所述第二靶分子;

b-2)將所述第二混合液加入所述第一混合液中進行反應;

b-3)將所述第三混合液加入步驟b-2)所得產物中進行反應;

b-4)在催化劑作用下,將所述第四混合液加入步驟b-3)所得產物中進行反應,得
到所述第二組分;

2)混合步驟1)所得第一組分和第二組分,得到本發明第一方面所述的復合材料。

在另一優選例中,所述微球、所述第一靶分子、所述貴金屬粒子、所述拉曼信號分
子、所述高分子和所述第二靶分子如本發明第一方面所述。

在另一優選例中,所述第一靶分子和/或第二靶分子經活化劑活化。

在另一優選例中,所述催化劑選自下組:EDC、NHS、或其組合。

在另一優選例中,所述第一溶劑、第二溶劑、第三溶劑和第四溶劑可相同或不同,
各獨立地選自下組:水、四氫呋喃、PBS、或其組合。

在另一優選例中,所述活化劑選自下組:EDC、NHS、或其組合。

在另一優選例中,在所述第一混合液中所述貴金屬粒子的濃度為0.1-4.0mg/mL。

在另一優選例中,在所述第二混合液中所述拉曼信號分子的濃度為10-500μM。

在另一優選例中,在所述第三混合液中所述高分子的濃度為0.2-40mg/mL。

在另一優選例中,在所述第四混合液中所述第二靶分子的濃度為10-100μg/mL。

在另一優選例中,所述第一混合液、第二混合液、第三混合液和第四混合液的添加
體積比為:5-10:0.001-0.005:0.01-0.1:0.5-2。

本發明的第四方面,提供了一種本發明第一方面所述的復合材料的用途,用于制
備檢測人前列腺特異性抗原(PSA)、人血紅蛋白(Hb)、降鈣素原(PCT)或疾病標志物的試劑
或藥劑。

在另一優選例中,PSA的檢測是用來確定強奸犯案件中精斑存在與否。

在另一優選例中,Hb的檢測是用來確定兇殺案件中的血跡為人血還是動物血。

在另一優選例中,PCT的檢測是用來確定是否細菌感染。

在另一優選例中,所述疾病標志物選自下組:腫瘤標志物、心血管疾病標志物、老
年癡呆癥標志物、支原體、衣原體、或其組合。

本發明的第五方面,提供了一種產品,所述產品含有本發明第一方面所述的復合
材料或由本發明第一方面所述的復合材料組成。

應理解,在本發明范圍內中,本發明的上述各技術特征和在下文(如實施例)中具
體描述的各技術特征之間都可以互相組合,從而構成新的或優選的技術方案。限于篇幅,在
此不再一一累述。

附圖說明

圖1是本發明復合物的結構示意圖,其中(灰色)代表微球、(紫紅色)代表貴
金屬粒子、代表拉曼信號分子、代表高分子、代表與待測物具有特異性相互作用
的抗體、代表待測物。

圖2是本發明實施例1所得復合材料1檢測人前列腺特異性抗原(PSA)的選擇性和
靈敏度的初步驗證結果,(a)為所述復合材料1對前列腺特異性抗原選擇性檢測結果,(b)為
所述復合材料1對前列腺特異性抗原靈敏度檢測結果。

圖3是本發明實施例6所述復合材料6檢測人血紅蛋白(Hb)的選擇性和靈敏度的初
步驗證結果,(a)為所述復合材料6對人血紅蛋白選擇性檢測結果,(b)為所述復合材料6對
人血紅蛋白靈敏度檢測結果。。

圖4是本發明實施例7所述復合材料7檢測人胰腺癌標志物MUC4的選擇性和靈敏度
的初步驗證結果,(a)為所述復合材料7對人胰腺癌標志物MUC4選擇性檢測結果,(b)為所述
復合材料7對人胰腺癌標志物MUC4靈敏度檢測結果。

圖5是本發明實施例8所述復合材料8檢測老年癡呆癥標志物β-淀粉樣肽的選擇性
和靈敏度的初步驗證結果,(a)為所述復合材料8對老年癡呆癥標志物β-淀粉樣肽選擇性檢
測結果,(b)為所述復合材料8對老年癡呆癥標志物β-淀粉樣肽靈敏度檢測結果。

具體實施方式

本發明人經過長期而深入的研究,意外地制得一種具有特定新型結構的復合材
料,將該復合材料應用于人前列腺特異性抗原(PSA)、人血紅蛋白(Hb)、降鈣素原(PCT)或疾
病標志物的檢測可有效降低假陽性和假陰性效應,且可高靈敏、簡單、快速、低成本檢測
PSA、Hb、PCT或疾病標志物。具體地,本發明人通過將易于離心的表面修飾有第一靶分子的
微球與表面修飾有拉曼信號分子和經第二靶分子修飾的高分子的第二組分組合得到一種
新型的復合材料,將該復合材料應用于PSA、Hb、PCT或疾病標志物檢測時,PSA、Hb、PCT或疾
病標志物與所述微球和所述第二組分通過所述第一靶分子與所述第二靶分子特異性結合,
在所述微球的存在下,在離心步驟可極大地提高待測樣品的沉淀率,進而顯著提高PSA、Hb、
PCT或疾病標志物檢測的靈敏度。在此基礎上,發明人完成了本發明。

復合材料

本發明提供了一種復合材料,所述復合材料包括:

(a)第一組分,所述第一組分包括:

(a-i)作為內核的微球,所述微球易于離心沉淀;和

(a-ii)位于外層的第一靶分子,所述第一靶分子修飾于所述微球表面,且與待測
物具有特異性相互作用;和

(b)第二組分,所述第二組分包括:

(b-i)作為內核的貴金屬粒子;

(b-ii)拉曼信號分子,所述拉曼信號分子固定和/或吸附于所述貴金屬粒子表面;

(b-iii)作為中間層的高分子,所述高分子具有多個與所述貴金屬粒子進行結合
的結合官能團(binding functional group),且所述高分子通過多個所述結合官能團結合
于所述貴金屬粒子的外周;和

(b-iv)位于外層的第二靶分子,所述第二靶分子偶聯于所述高分子,且與待測物
具有特異性相互作用;

并且,在含待測物溶液中,所述待測物與所述第一組分和所述第二組分通過所述
第一靶分子和所述第二靶分子結合形成易于離心沉淀的復合物。

在本發明中,所述第一靶分子、第二靶分子、拉曼信號分子、高分子、貴金屬粒子和
微球的種類、形貌和粒徑沒有特別限制,可根據實際需要在很大范圍內進行變化。

代表性地,所述待測物包括(但并不限于):人前列腺特異性抗原(PSA)、人血紅蛋
白(Hb)、降鈣素原(PCT)、疾病標志物(如腫瘤標志物、心血管疾病標志物、老年癡呆癥標志
物、支原體、衣原體等)、或其組合。

在本發明中,所述復合材料通常還包括溶劑,所述溶劑的種類和用量沒有特別限
制,可根據實際需要在很大范圍內進行調整。

代表性地,所述溶劑包括(但并不限于):水、四氫呋喃、PBS、或其組合。

典型的,所述復合材料在所述溶劑中的重量百分含量為0.01-10%,較佳地
0.05-5%,更佳地0.1-0.5%。

在本發明中,所述微球表面具有包括(但并不限于)的基團:羧基、氨基、羥基、或其
組合;和/或

所述微球的粒徑為100nm-1000μm。

在另一優選例中,所述微球的粒徑為200nm-500μm,較佳地為300nm-300μm,更佳地
為400nm-200μm,最佳地為500nm-100μm。

代表性地,所述微球的形狀包括(但并不限于):球形、類球形、棒形、星形、三角片、
立方體、三角錐。

代表性地,所述微球包括(但并不限于):聚苯乙烯-丙烯酸微球、聚苯乙烯-甲基丙
烯酸微球、聚苯乙烯微球、聚乳酸微球、聚乳酸-羥基乙酸微球、或其組合。

在本發明中,所述“易于離心沉淀”是指:在離心處理過程中,2.0mL 2.0mg/mL的所
述微球在500×g離心力下在20min內的沉淀率為30-100%,較佳地為70-100%,更佳地為
90-100%。

在本發明中,在所述復合材料中,所述微球的濃度為0.01-50mg/mL,較佳地為0.5-
3.0mg/mL,更佳地為1.0-2.0mg/mL。

在另一優選例中,在所述復合材料中(溶劑除外,包括微球、第一靶分子、貴金屬粒
子、拉曼信號分子、高分子和第二靶分子),所述微球的重量百分含量為10-95wt%,較佳地
為30-90wt%,更佳地為50-90wt%。

在另一優選例中,在所述復合材料中,所述微球的體積百分含量為40-99體積%,
較佳地為50-98體積%,更佳地為60-95體積%。

在另一優選例中,所述第一靶分子經包括(但并不限于)下組的基團與所述微球連
接:羧基、氨基、羥基、巰基或其組合。

代表性地,所述貴金屬粒子包括(但并不限于):金、銀、鉑、或其組合;和/或

所述貴金屬粒子的粒徑為5-500nm。

在另一優選例中,所述貴金屬粒子的粒徑為10-400nm,較佳地為20-300nm,更佳地
為30-200nm,最佳地為40-100nm。

代表性地,所述貴金屬粒子的形狀包括(但并不限于):球形、類球形、棒形、星形、
三角片、立方體、三角錐、或其組合。

代表性地,所述貴金屬粒子包括(但并不限于):金納米球、金納米立方體、金納米
星、金納米棒、銀納米球、銀納米三角片、鉑納米球、鉑納米片、金包銀球、金包銀星、銀包金
球、或其組合。

典型的,在所述復合材料中,所述貴金屬粒子的濃度為0.1-5.0mg/mL,較佳地為
0.2-3.0mg/mL,更佳地為0.4-2.0mg/mL。

在本發明中,在所述復合材料中(溶劑除外,包括微球、第一靶分子、貴金屬粒子、
拉曼信號分子、高分子和第二靶分子),所述貴金屬粒子的重量百分含量為5-90wt%,較佳
地為10-70wt%,更佳地為10-50wt%。

在本發明中,在所述復合材料中,所述微球和所述貴金屬粒子的質量比沒有特別
限制,可根據實際需要在很大范圍內變化。

在另一優選例中,在所述復合材料中,所述微球和所述貴金屬粒子的質量比為1:
30-10000,較佳地1:50-1000,更佳地1:50-500,最佳地1:50-120。

在另一優選例中,在所述復合材料中,所述貴金屬粒子的體積百分含量為1-60體
積%,較佳地為2-50體積%,更佳地為5-40體積%。

在另一優選例中,所述拉曼信號分子為在拉曼光譜中具有明顯共軛振動的有機分
子。

在另一優選例中,所述“固定”和/或所述“吸附”為化學鍵合和/或物理吸附。

在本發明中,所述有機分子的種類沒有特別限制,可根據實際需要在很大范圍內
進行調整。

代表性地,所述有機分子包括(但并不限于):4-巰基苯甲酸、巰基吡啶、4-巰基苯
胺、巰基萘、對氟硫酚、羅丹明、結晶紫、耐爾藍、或其組合。

典型地,所述拉曼信號分子與所述貴金屬粒子的質量比為0.001-0.3,較佳地為
0.01-0.25,更佳地為0.1-0.2。

在另一優選例中,在所述復合材料中,所述拉曼信號分子的濃度為5-500μM,較佳
地為50-200μM,更佳地為100-150μM。

在本發明中,所述結合官能團包括(但并不限于):巰基、氨基、羧基、羥基、或其組
合;和/或

所述高分子為線性高分子,且所述高分子的各分子鏈通過多個“金屬-S鍵”和/或
“金屬-N鍵”與所述貴金屬粒子化學鍵合。

在另一優選例中,所述高分子為具有巰基和/或氨基的聚合物(包括直鏈和支鏈聚
合物)。

應理解,在本發明中,所述高分子“平躺式”地與所述貴金屬粒子結合,即所述高分
子的各分子鏈基本平鋪于所述貴金屬粒子表面,和/或所述高分子的各分子鏈基本平行于
所述貴金屬粒子的表面。

在本發明中,所述“平躺式”指所述高分子中的每個分子均通過多個結合官能團與
所述貴金屬粒子在n個位置發生連接,其中n為≥3的正整數,較佳地n≥10個,更佳地≥50
個。

典型地,所述高分子的分子量≥1000道爾頓,較佳地≥5000道爾頓,更佳地≥
10000道爾頓。

典型地,所述高分子的分子量通常≤1000000道爾頓,較佳地≤100000道爾頓。

代表性地,所述高分子包括(但并不限于):寡肽、多肽、蛋白質、多糖、聚醚類改性
化合物、聚酯類改性化合物、或其組合。

典型地,所述多肽含有多個巰基。

通常,所述多肽的長度≥20個氨基酸,較佳地50-2000個氨基酸,更佳地100-1000
個氨基酸。

代表性地,所述多肽包括(但并不限于):聚谷氨酸、聚天門冬氨酸、含谷氨酸化合
物、含天門冬氨酸化合物、聚賴氨酸、聚精氨酸、含賴氨酸化合物、含精氨酸化合物、或其組
合。

優選地,所述蛋白質為還原型蛋白質,如還原型牛血清白蛋白(rBSA)。

代表性地,所述多糖包括(但并不限于):殼聚糖、葡聚糖、甲殼素、纖維素、淀粉、瓊
脂、或其組合。

代表性地,所述改性化合物具有包括(但并不限于)下組的基團:氨基、羧基、羥基、
或其組合。

代表性地,所述高分子末端帶有包括(但并不限于)下組的基團:氨基、羧基、羥基、
或其組合。

典型地,所述高分子在所述貴金屬粒子表面的覆蓋率為≥30%,較佳地≥70%,更
佳地≥80%,最佳地≥90%或100%。

通常,在所述復合材料中,所述高分子的濃度為0.1-20μg/mL,較佳地為0.5-10μ
g/mL,更佳地為3-5μg/mL。

在本發明中,所述第一靶分子和所述第二靶分子可相同或不同,各自獨立地包括
(但并不限于):單克隆抗體、葉酸、半乳糖胺、表皮生長因子EGF、多肽類物質、核酸適配體、
或其組合。

在另一優選例中,所述第一靶分子和所述第二靶分子相同,且包括(但并不限于):
單克隆抗體、葉酸、半乳糖胺、表皮生長因子EGF、多肽類物質、核酸適配體、或其組合。

代表性地,所述單克隆抗體包括(但并不限于):人前列腺特異性抗原(PSA)的特異
性抗體、人血紅蛋白(Hb)特異性抗體、降鈣素原(PCT)特異性抗體、腫瘤標志物特異性抗體、
心血管疾病標志物特異性抗體、老年癡呆癥標志物特異性抗體、EPCAM抗體、CD44抗體、或其
組合。

代表性地,所述多肽類物質包括(但并不限于):RGD肽、轉鐵蛋白、或其組合。

在另一優選例中,所述第一靶分子在所述微球表面均勻分布。

典型地,所述第一靶分子在所述微球表面的覆蓋率為≥10%,較佳地≥30%,更佳
地≥50%。

在另一優選例中,所述“均勻分布”指在所述微球的任一單位表面積內所述第一靶
分子的覆蓋率與在所述微球的整個表面積內所述第一靶分子的覆蓋率的比值為0.8-1.2,
較佳地為0.9-1.1。

在另一優選例中,所述第二靶分子在所述第二組分表面均勻分布。

在另一優選例中,所述第二靶分子在所述第二組分表面的覆蓋率為≥10%,較佳
地≥30%,更佳地≥50%。

在另一優選例中,所述“均勻分布”指在所述第二組分的任一單位表面積內所述第
二靶分子的覆蓋率與在所述第二組分的整個表面積內所述第二靶分子的覆蓋率的比值為
0.8-1.2,較佳地為0.9-1.1。

在另一優選例中,在所述復合材料中(溶劑除外,包括微球、第一靶分子、貴金屬粒
子、拉曼信號分子、高分子和第二靶分子),所述第一靶分子的重量百分含量為0.1-5wt%,
較佳地為1-4wt%,更佳地為2-3wt%。

在另一優選例中,在所述復合材料中(溶劑除外,包括微球、第一靶分子、貴金屬粒
子、拉曼信號分子、高分子和第二靶分子),所述第二靶分子的重量百分含量為0.1-5wt%,
較佳地為1-4wt%,更佳地為2-3wt%。

在另一優選例中,所述第二靶分子通過酰胺鍵與所述高分子共價鍵合。

在另一優選例中,所述復合材料是使用本發明第三方面的方法制備的。

在本發明中,一方面,發明人通過采用線性高分子與貴金屬粒子“平躺式”結合的
連接方式,極大地增加了與高分子連接的第二靶分子的數量同時顯著減薄了位于所述貴金
屬粒子表面的高分子層的厚度;另一方面,發明人將易于離心沉淀的微球通過第一靶分子
經人前列腺特異性抗原(PSA)、人血紅蛋白(Hb)、降鈣素原(PCT)或疾病標志物與第二組分
結合,可顯著提高離心沉淀率,從而可以有效地提高所述復合材料對PSA、Hb、PCT或疾病標
志物的檢測靈敏度。

檢測方法

本發明還提供了一種檢測人前列腺特異性抗原(PSA)、人血紅蛋白(Hb)、降鈣素原
(PCT)或疾病標志物的方法,所述方法包括如下步驟:

a)將所述的復合材料與待測樣品均勻混合,得到第一混合液;

b)離心沉淀第一混合液,使用拉曼光譜儀檢測所得沉淀的拉曼信號,確定待測樣
品中PSA、Hb、PCT或疾病標志物的存在與否和/或數量。

在另一優選例中,在步驟a)之后還任選地包括如下步驟:培養第一混合液。

在另一優選例中,在步驟b)中使用拉曼光譜儀檢測所得沉淀之前還任選地包括步
驟:使用純水分散所述沉淀。

在本發明中,所述待檢樣品及其中待測物的濃度沒有特別限制,可在實際應用中
根據需要在很大范圍內調整。

代表性地,所述待測樣品包括(但并不限于):精斑、血跡、血液、唾液、尿液。

代表性地,所述待測樣品中待測物的濃度為0.0001-1000μg/L,較佳地為0.001-
100μg/L,更佳地為0.001-10μg/L。

代表性地,所述疾病標志物包括(但并不限于):腫瘤標志物、心血管疾病標志物、
老年癡呆癥標志物、支原體、衣原體、或其組合。

在另一優選例中,所述培養的培養時間為10-80min,較佳地20-60min。

在另一優選例中,步驟b)所述離心的離心力為300-1000×g,離心時間為2-
60min,較佳地3-40min。

在另一優選例中,所述經純水分散的沉淀液中所述沉淀的濃度為1.0-100mg/mL,
較佳地為5.0-50mg/mL,更佳地為10-20mg/mL。

在另一優選例中,所述方法是非診斷性的、非治療性的。

在本發明中,所述方法具有包括(但并不限于)的一個或多個特征:

i)當待測物為PSA時,其檢測靈敏度下限為0.1ng/L;

在另一優選例中,當待測物為PSA時,其檢測靈敏度下限為0.1ng/L,較佳地為
0.5ng/L,更佳地為5ng/L,最佳地為30ng/L。

ii)當待測物為Hb時,其檢測靈敏度下限為1.0ng/L;

在另一優選例中,當待測物為Hb時,其檢測靈敏度下限為1.0ng/L,較佳地為
5.0ng/L,更佳地為10ng/L,最佳地為50ng/L。

iii)當待測物為胰腺癌標志物MUC4(黏蛋白)時,其檢測靈敏度下限為0.1μg/L;

在另一優選例中,當待測物為胰腺癌標志物MUC4(黏蛋白)時,其檢測靈敏度下限
為0.1μg/L,較佳地為1μg/L,更佳地為5μg/L,最佳地為10μg/L。

ⅳ)當待測物為老年癡呆癥標志物β-淀粉樣肽時,其檢測靈敏度下限為0.01μg/L。

在另一優選例中,當待測物為老年癡呆癥標志物β-淀粉樣肽時,其檢測靈敏度下
限為0.01μg/L,較佳地為0.1μg/L,更佳地為0.5μg/L,最佳地為1.0μg/L。

在本發明中,通過進一步優化所述復合材料中各組分的結構和比例,可使得對待
測物的檢測靈敏度下限進一步降低。

制備方法

本發明還提供了一種所述的復合材料的制備方法,所述方法包括如下步驟:

1)提供所述的第一組分和第二組分,其中,

所述第一組分是如下制備的:

a-1)提供微球和第一靶分子;

a-2)在催化劑作用下,使微球和第一靶分子反應得到所述第一組分;

所述第二組分是如下制備的:

b-1)提供第一混合液、第二混合液、第三混合液和第四混合液,其中,

所述第一混合液含有第一溶劑和所述貴金屬粒子;

所述第二混合液含有第二溶劑和所述拉曼信號分子;

所述第三混合液含有第三溶劑和所述高分子;

所述第四混合液含有第四溶劑和所述第二靶分子;

b-2)將所述第二混合液加入所述第一混合液中進行反應;

b-3)將所述第三混合液加入步驟b-2)所得產物中進行反應;

b-4)在催化劑作用下,將所述第四混合液加入步驟b-3)所得產物中進行反應,得
到所述第二組分;

2)混合步驟1)所得第一組分和第二組分,得到所述的復合材料。

應理解,所述微球、所述第一靶分子、所述貴金屬粒子、所述拉曼信號分子、所述高
分子和所述第二靶分子如本發明第一方面所述。

在另一優選例中,所述第一靶分子和/或第二靶分子經活化劑活化。

典型地,所述催化劑包括(但并不限于):EDC、NHS、或其組合。

典型地,所述第一溶劑、第二溶劑、第三溶劑和第四溶劑可相同或不同,各獨立地
包括(但并不限于):水、四氫呋喃、PBS、或其組合。

典型地,所述活化劑包括(但并不限于):EDC、NHS、或其組合。

在本發明中,所述第一混合液、第二混合液、第三混合液和第四混合液中各組分的
濃度沒有特別限制,可根據實際需要在很大范圍內進行調整。

通常,在所述第一混合液中所述貴金屬粒子的濃度為0.1-4.0mg/mL。

通常,在所述第二混合液中所述拉曼信號分子的濃度為10-500μM。

通常,在所述第三混合液中所述高分子的濃度為0.2-40mg/mL。

通常,在所述第四混合液中所述第二靶分子的濃度為10-100μg/mL。

典型地,所述第一混合液、第二混合液、第三混合液和第四混合液的添加體積比
為:5-10:0.001-0.005:0.01-0.1:0.5-2。

在本發明中,一種典型的制備所述貴金屬粒子的方法包括如下步驟:

c-1)提供貴金屬化合物的水溶液和溶有還原劑的溶液;

c-2)將所述溶有還原劑的溶液加入到所述貴金屬化合物的水溶液中,進行反應,
得到所述的貴金屬粒子。

在另一優選例中,所述貴金屬化合物的水溶液還含有保護劑。

在另一優選例中,在步驟c-2)之后還包括如下步驟:

c-3)提供生長液,所述生長液含有保護劑、貴金屬化合物和還原劑;

c-4)將步驟c-2)所得產物加入步驟c-3)所述生長液中,制得所述貴金屬納米粒
子。

在另一優選例中,所述反應在避光條件下進行。

在本發明中,所述貴金屬化合物沒有特別限制,可根據實際需要在很大范圍內進
行調整。

代表性地,所述貴金屬化合物包括(但并不限于):氯金酸、氯化金、氯化亞金、氯金
酸鉀、氯金酸鈉、硝酸銀、醋酸銀、三氟乙酸銀、三氟甲烷磺酸銀、六氟銻酸銀、四氟硼酸銀、
或其組合。

在另一優選例中,步驟c-1)所述貴金屬化合物和步驟c-3)所述貴金屬化合物可相
同或不同。

典型地,所述還原劑包括(但并不限于):檸檬酸三鈉、硼氫化鈉、檸檬酸、草酸鈉、
沒食子酸、抗壞血酸、水合肼、葡萄糖酸鈉、葡聚糖、過氧化氫、或其組合。

典型地,所述保護劑包括(但并不限于):十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)、聚乙烯吡
咯烷酮(PVP)、檸檬酸、檸檬酸三鈉、吐溫、十二烷基硫酸鈉(SDS)、或其組合。

用途

本發明還提供了一種所述的復合材料的用途,用于制備檢測人前列腺特異性抗原
(PSA)、人血紅蛋白(Hb)、降鈣素原(PCT)或疾病標志物的試劑或藥劑。

通常,PSA的檢測是用來確定強奸犯案件中精斑存在與否。

通常,Hb的檢測是用來確定兇殺案件中的血跡為人血還是動物血。

通常,PCT的檢測是用來確定是否細菌感染。

代表性地,所述疾病標志物包括(但并不限于):腫瘤標志物、心血管疾病標志物、
老年癡呆癥標志物、支原體、衣原體、或其組合。

應用

本發明還提供了一種產品,所述產品含有所述的復合材料或由所述的復合材料組
成。

與現有技術相比,本發明具有以下主要優點:

(1)通過在所述貴金屬粒子表面包覆所述線性高分子,可避免貴金屬粒子與待測
物的反應,進而有效降低假陽性和假陰性效應;

(2)通過采用所述線性高分子與所述貴金屬粒子“平躺式”結合的連接方式,可顯
著降低貴金屬粒子表面的高分子層厚度,從而提高對待測物的檢測靈敏度;

(3)通過引入易于離心沉淀的微球,并將其與所述第二組分和待測物經第一靶分
子和第二靶分子結合,可明顯提高所得復合物的離心沉淀率,提高對待測物的檢測靈敏度;

(4)使用所述復合材料,可在極低的檢測濃度下實現對人前列腺特異性抗原
(PSA)、人血紅蛋白(Hb)、降鈣素原(PCT)或疾病標志物的高靈敏檢測,從而便于實現對疾病
的早發現、早治療;

(5)使用所述復合材料,可實現對PSA、Hb、PCT或疾病標志物的高靶向性、高選擇性
的檢測;

(6)所述復合材料制備方法簡單、成本低;

(7)所述檢測方法操作簡單、便于產業化推廣。

下面結合具體實施例,進一步闡述本發明。應理解,這些實施例僅用于說明本發明
而不用于限制本發明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法,通常按照常規條
件或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明,否則百分比和份數按重量計算。

除非另行定義,文中所使用的所有專業與科學用語與本領域熟練人員所熟悉的意
義相同。此外,任何與所記載內容相似或均等的方法及材料皆可應用于本發明方法中。文中
所述的較佳實施方法與材料僅作示范之用。

實施例1

制備復合材料1

(1)具有SERS功能的金納米球(AuNPs)的制備

把10mL5mM氯金酸加入到30mL超純水中,加熱至沸,再加入10mL1%檸檬酸三鈉,待
反應溶液的顏色變為紫色,停止反應,自然冷卻至室溫,溶液變為酒紅色,便制得AuNPs,4℃
保存。

(2)連接有拉曼信號分子的金納米球(AuNP-MBA)的制備

把4-巰基苯甲酸(4-MBA)溶在四氫呋喃溶劑中,配制濃度為50mM的4-巰基苯甲酸
的四氫呋喃溶液。

取3mL(1)所述的金納米球,加入到9mL超純水中,混合均勻,再加入30.0μL4-巰基
苯甲酸溶液,待反應一定時間后,便制得AuNP-MBA材料,4℃保存。

(3)含有二硫鍵的高分子牛血清白蛋白(BSA)的還原及包裹有高分子的金納米球
(AuNP-MBA-BSA)的制備

配制1mg/mL的BSA水溶液,取10mL1mg/mLBSA,向其中加入65μL0.1M硼氫化鈉水溶
液,室溫反應1h,在70℃水浴至無氣泡產生,將制備的還原牛血清白蛋白(rBSA)稀釋至
0.5mg/mL,4℃保存。

取120μL0.5mg/mLrBSA加入到12mLAuNP-MBA溶液中,待反應一定時間后,制得
AuNP-MBA-rBSA材料,4℃保存。

(4)還原BSA表面抗體的偶聯

在EDAC(1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺)的催化下,利用人前列腺特異性
抗體FA的羧基與還原BSA表面的氨基之間的化學反應,在還原BSA表面偶聯能夠特異性靶向
作用于人前列腺特異性抗原的人前列腺特異性抗體。

優選地,所述人前列腺特異性抗體在使用前需進行活化處理,具體處理方法簡述
如下:取人前列腺特異性抗體、EDC和NHS,溶于磷酸緩沖液(PBS)中,避光反應8h。

取經活化的人前列腺特異性抗體加入到12mLAuNP-MBA-rBSA中,反應16h,再使用
超濾離心管(MWCO3.0kDa)濃縮離心,將AuNP-MBA-rBSA-FA濃縮至2mL,即可獲得表面偶聯有
人前列腺特異性抗體的AuNP-MBA-rBSA-FA復合納米材料。

(5)微球的制備及表面抗體的偶聯

利用微乳液法制備聚苯乙烯微球,且在EDAC(1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞
胺)的催化下,利用人前列腺特異性抗體的氨基與微球表面的羧基之間的化學反應,在微球
表面偶聯能夠特異性靶向作用于的人前列腺特異性抗原的人前列腺特異性抗體。

取經活化的人前列腺特異性抗體加入到微球中,反應16h,再使用超濾離心管
(MWCO3.0kDa)濃縮離心,將微球濃縮,即可獲得表面偶聯有人前列腺特異性抗體的復合微
球材料。表面偶聯有人前列腺特異性抗體的AuNP-MBA-rBSA-FA復合納米材料和表面偶聯有
人前列腺特異性抗體的復合微球材料共同構成基于SERS技術的復合材料1。

人前列腺特異性抗原(PSA)、人血紅蛋白(Hb)、降鈣素原(PCT)或疾病標志物檢測

復合材料的選擇性實驗:取200μL 1mg/mL AuNP-MBA-rBSA-FA和400μL 2mg/mL接
枝有葉酸的復合微球加入到4mL 0μg/L和10μg/L人前列腺特異性抗原中,在35℃恒溫培養
箱中孵育30min,500×g離心5min,棄去上清液,在使用PBS在相同轉速時間下離心清洗3次,
棄去上清液并將沉淀物定容到200μL,利用拉曼光譜儀測0μg/L和10μg/L人前列腺抗原樣品
的拉曼光譜。

復合材料的靈敏度實驗:取100μL 1mg/mL AuNP-MBA-rBSA-FA和200μL 2mg/mL接
枝有葉酸的復合微球加入到4mL 50-1000ng/L人前列腺特異性抗原中(即50、100、500、
1000ng/L濃度的人前列腺特異性抗原),在35℃恒溫培養箱中孵育30min,500×g離心5min,
棄去上清液,在使用PBS在相同轉速時間下離心清洗3次,棄去上清液并將沉淀物定容到200
μL,利用拉曼光譜儀測50、100、500、1000ng/L的人前列腺特異性抗原樣品的拉曼光譜。

結果

對實施例1所得產物進行粒徑分析、形貌分析、成分分析和人前列腺特異性抗原
(PSA)、人血紅蛋白(Hb)、降鈣素原(PCT)或疾病標志物等檢測。

經測算,所得金納米球的平均粒徑為60nm,形貌為球形。

所得聚苯乙烯微球的平均粒徑為1000nm,形貌為球形。

所得復合材料1中金納米球和聚苯乙烯微球的質量比為1:50-80。

在人前列腺特異性抗原(PSA)、人血紅蛋白(Hb)、降鈣素原(PCT)或疾病標志物檢
測過程中,在所述離心條件下,金納米球的沉淀率為0-1%,聚苯乙烯微球的沉淀率為90-
100%,故復合材料1的沉淀率可達到90-100%。

圖2是實施例1所得復合材料1檢測人前列腺特異性抗原(PSA)的選擇性和靈敏度
的初步驗證結果,(a)為所述復合材料1對前列腺特異性抗原選擇性檢測結果,(b)為所述復
合材料1對前列腺特異性抗原靈敏度檢測結果。從圖2可知,復合材料1對前列腺特異性抗原
具有高檢測靈敏度,且在50-1000ng/L人前列腺抗原濃度范圍內,有清晰的信號峰,可實現
對人前列腺抗原的低濃度檢測。

上述實驗結果表明,所述復合材料1對人前列腺抗原的檢測靈敏度下限可低至
50ng/L。

實施例2

制備復合材料2

(1)具有SERS功能的金納米棒(AuNRPs)的制備

第一步,金種的制備,7.5mLCTAB和0.5mL5mM氯金酸混合均勻,再快速加入
0.6mL0.01M硼氫化鈉,待溶液變為棕色,即可制得金種,4℃保存。

第二步,生長液制備,100mL0.1MCTAB和0.1mL20mM硝酸銀混合,加入12mL5mM氯金
酸攪拌均勻,再加入0.48mL抗壞血酸水溶液,待溶液變為無色后,加入0.2mL金種,避光反
應,待顏色變為深藍色,便可制得具有SERS功能的金納米棒(AuNRPs)。

(2)在納米粒子表面連接拉曼信號分子、生物分子的二硫鍵的還原、在納米粒子表
面包裹還原生物高分子、還原生物高分子表面人前列腺特異性抗體的偶聯、微球的制備及
表面人前列腺特異性抗體的偶聯與實施例1相同,即可制備一種基于SERS技術可用于檢測
人前列腺特異性抗原的復合材料2。

結果

經測試,得知復合材料2也可實現對人前列腺抗原的低濃度檢測。

具體實驗結果表明,所述復合材料2對人前列腺抗原的檢測靈敏度下限可低至約
30ng/L。

實施例3

制備復合材料3

(1)具有SERS功能的金納米星(AuNS)的制備

第一步,金種的制備,把3mL5mM氯金酸加入到45mL超純水中,加熱至沸,再快速加
入2.5mL1%檸檬酸三鈉,待顏色變為紫色時停止反應,自然冷卻至室溫,液體顏色變為酒紅
色,4℃保存。第二步,生長液制備,1.0mL0.1MCTAB、2.75mL5mM氯金酸加入到45mL超純水中,
再加入50μL50mM硝酸銀溶液,而后加入0.565mL10mg/mL抗壞血酸,待液體顏色變為無色時,
加入50μL金種,待顏色變為深藍色,便可制得具有SERS功能的金納米星(AuNS)。

(2)在納米粒子表面連接拉曼信號分子、生物分子的二硫鍵的還原、在納米粒子表
面包裹還原生物高分子、還原生物高分子表面人前列腺特異性抗體的偶聯、微球的制備及
表面人前列腺特異性抗體的偶聯與實施例1相同,即可制備一種基于SERS技術可用于檢測
人前列腺特異性抗原的復合材料3。

結果

經測試,得知復合材料3也可實現對人前列腺抗原的低濃度檢測。

具體實驗結果表明,所述復合材料3對人前列腺抗原的檢測靈敏度下限可低至約
40ng/L。

實施例4

制備復合材料4

(1)具有SERS功能的銀納米球(AgNPs)的制備

把1mL20mM硝酸銀加入到97mL超純水中,再加入1mL保護劑(30mM檸檬酸三鈉),再
加入1mL0.1M硼氫化鈉,待反應一定時間后,便可制得顏色為黃色的銀納米球(AgNPs)。

(2)在納米粒子表面連接拉曼信號分子、生物分子的二硫鍵的還原、在納米粒子表
面包裹還原生物高分子、還原生物高分子表面人前列腺特異性抗體的偶聯、微球的制備及
表面人前列腺特異性抗體的偶聯與實施例1相同,即可制備一種基于SERS技術可用于檢測
人前列腺特異性抗原的復合材料4。

結果

經測試,得知復合材料4也可實現對人前列腺抗原的低濃度檢測。

具體實驗結果表明,所述復合材料4對人前列腺抗原的檢測靈敏度下限可低至約
45ng/L。

實施例5

制備復合材料5

(1)具有SERS功能的銀納米三角片(AgNRPs)的制備

把6mL30mM檸檬酸三鈉、6mL0.7mM聚乙烯吡咯烷酮加入到99.5mL超純水中,攪拌混
合,向其中加入0.5mL20mM硝酸銀和0.24mL30%過氧化氫,攪拌均勻。快速加入1mL0.1M硼氫
化鈉,避光反應一定時間后,待顏色變為藍色后,便可制得具有SERS功能的銀納米三角片
(AgNRPs)。

(2)在納米粒子表面連接拉曼信號分子、生物高分子的二硫鍵的還原、在納米粒子
表面包裹還原生物高分子、還原生物高分子表面人前列腺特異性抗體的偶聯、微球的制備
及表面人前列腺特異性抗體的偶聯與實施例1相同,即可制備一種基于SERS技術可用于檢
測人前列腺特異性抗原的復合材料5。

結果

經測試,得知復合材料5也可實現對人前列腺抗原的低濃度檢測。

具體實驗結果表明,所述復合材料5對人前列腺抗原的檢測靈敏度下限可低至約
35ng/L。

實施例6

制備復合材料6

將實施例1步驟(4)中還原BSA表面偶聯的抗體和步驟(5)中聚苯乙烯微球偶聯的
抗體改為人血紅蛋白特異性抗體。具體地,在EDAC的催化下,利用人血紅蛋白特異性抗體的
氨基與還原BSA和聚苯乙烯微球表面的羧基之間的化學反應,在還原BSA和微球表面偶聯能
夠特異性靶向作用于人血紅蛋白的特異性抗體。具體制備方法簡述如下:用PBS作溶劑配制
的人血紅蛋白特異性抗體溶液,將EDAC溶于人血紅蛋白特異性抗體溶液(冰浴),然后取2mL
活化人血紅蛋白特異性抗體溶液加入到12mL AuNP-MBA-rBSA中,反應4-24h,即可獲得表面
偶聯有人血紅蛋白特異性抗體的AuNP-MBA-rBSA復合納米材料;取活化人血紅蛋白特異性
抗體溶液加入到聚苯乙烯微球溶液中,反應4-24h,即可獲得表面偶聯有人血紅蛋白特異性
抗體的復合微球材料。其他步驟與實施例1相同,即可制得一種基于SERS技術特異性檢測人
血紅蛋白的復合材料6。

結果

圖3是實施例6所述復合材料6檢測人血紅蛋白(Hb)的選擇性和靈敏度的初步驗證
結果,(a)為所述復合材料6對人血紅蛋白選擇性檢測結果,(b)為所述復合材料6對人血紅
蛋白靈敏度檢測結果。從圖3可以看出,復合材料6對人血紅蛋白(Hb)具有高檢測靈敏度,且
在100-1000ng/L人血紅蛋白(Hb)濃度范圍內,有清晰的信號峰,可實現對人血紅蛋白(Hb)
的低濃度檢測。

所述復合材料6對人血紅蛋白(Hb)的檢測靈敏度下限可低至100ng/L。

實施例7

制備復合材料7

將實施例1步驟(4)中還原BSA表面偶聯的抗體和步驟(5)中聚苯乙烯微球偶聯的
抗體改為胰腺癌標志物MUC4的特異性抗體,在EDAC的催化下,利用胰腺癌標志物MUC4的特
異性抗體的氨基與還原BSA和聚苯乙烯微球表面的羧基之間的化學反應,在還原BSA和聚苯
乙烯微球表面偶聯能夠特異性靶向作用于胰腺癌標志物MUC4的特異性抗體。具體制備方法
簡述如下:用PBS作溶劑配制胰腺癌標志物MUC4的特異性抗體溶液,將EDAC溶于胰腺癌標志
物MUC4的特異性抗體溶液(冰浴),然后取2mL活化胰腺癌標志物MUC4的特異性抗體溶液加
入到12mL AuNP-MBA-rBSA中,反應4-24h,即可獲得表面偶聯有胰腺癌標志物MUC4的特異性
抗體的AuNP-MBA-rBSA復合納米材料;取活化胰腺癌標志物MUC4的特異性抗體溶液加入到
聚苯乙烯微球溶液中,反應4-24h,即可獲得表面偶聯有胰腺癌標志物MUC4的特異性抗體的
復合微球材料。其他步驟與實施例1相同,即可制得一種基于SERS技術特異性檢測胰腺癌標
志物MUC4的復合材料7。

結果

圖4是實施例7所述復合材料7檢測人胰腺癌標志物MUC4的選擇性和靈敏度的初步
驗證結果,(a)為所述復合材料7對人胰腺癌標志物MUC4選擇性檢測結果,(b)為所述復合材
料7對人胰腺癌標志物MUC4靈敏度檢測結果。從圖4可以看出,復合材料7對人胰腺癌標志物
MUC4具有高檢測靈敏度,且在0.01-10μg/L人胰腺癌標志物MUC4濃度范圍內,有清晰的信號
峰,可實現對人胰腺癌標志物MUC4的低濃度檢測。

所述復合材料7對人胰腺癌標志物MUC4的檢測靈敏度下限可低至0.01μg/L。

實施例8

制備復合材料8

將實施例1步驟(4)中還原BSA表面偶聯的抗體和步驟(5)中聚苯乙烯微球偶聯的
抗體改為老年癡呆癥標志物β-淀粉樣肽的特異性抗體,在EDAC的催化下,利用老年癡呆癥
標志物β-淀粉樣肽的特異性抗體的氨基與還原BSA和聚苯乙烯微球表面的羧基之間的化學
反應,在還原BSA和聚苯乙烯微球表面偶聯能夠特異性靶向作用于老年癡呆癥標志物β-淀
粉樣肽的特異性抗體。具體制備方法簡述如下:用PBS作溶劑配制老年癡呆癥標志物β-淀粉
樣肽的特異性抗體溶液,將EDAC溶于老年癡呆癥標志物β-淀粉樣肽的特異性抗體溶液(冰
浴),然后取2mL活化老年癡呆癥標志物β-淀粉樣肽的特異性抗體溶液加入到12mL AuNP-
MBA-rBSA中,反應4-24h,即可獲得表面偶聯有老年癡呆癥標志物β-淀粉樣肽的特異性抗體
的AuNP-MBA-rBSA復合納米材料;取2mL活化老年癡呆癥標志物β-淀粉樣肽的特異性抗體溶
液加入到10mL聚苯乙烯微球溶液中,反應4-24h,即可獲得表面偶聯有老年癡呆癥標志物β-
淀粉樣肽的特異性抗體的復合微球材料。其他步驟與實施例1相同,即可制得一種基于SERS
技術特異性檢測老年癡呆癥標志物β-淀粉樣肽的復合材料8。

結果

圖5是實施例8所述復合材料8檢測老年癡呆癥標志物β-淀粉樣肽的選擇性和靈敏
度的初步驗證結果,(a)為所述復合材料8對老年癡呆癥標志物β-淀粉樣肽選擇性檢測結
果,(b)為所述復合材料8對老年癡呆癥標志物β-淀粉樣肽靈敏度檢測結果。從圖5可以看
出,復合材料8對老年癡呆癥標志物β-淀粉樣肽具有高檢測靈敏度,且在1-50μg/L老年癡呆
癥標志物β-淀粉樣肽濃度范圍內,有清晰的信號峰,可實現對老年癡呆癥標志物β-淀粉樣
肽的低濃度檢測。

所述復合材料8對老年癡呆癥標志物β-淀粉樣肽的檢測靈敏度下限可低至1μg/L。

實施例9

制備復合材料9

將實施例1步驟(5)中的聚苯乙烯微球改為聚苯乙烯-丙烯酸微球,并在其表面偶
聯人前列腺特異性抗體,在EDAC的催化下,利用人前列腺特異性抗體的氨基與聚苯乙烯-丙
烯酸微球表面的羧基之間的化學反應,在聚苯乙烯-丙烯酸微球表面偶聯能夠特異性靶向
作用于人前列腺的特異性抗體。

在納米粒子表面連接拉曼信號分子、生物高分子的二硫鍵的還原、在納米粒子表
面包裹還原生物高分子、還原生物高分子表面人前列腺特異性抗體的偶聯、聚苯乙烯-丙烯
酸微球的制備方法及表面人前列腺特異性抗體的偶聯與實施例1相同,即可制備一種基于
SERS技術可用于檢測人前列腺特異性抗原的復合材料9。

結果

經測試,得知復合材料9也可實現對人前列腺抗原的低濃度檢測。

具體實驗結果表明,所述復合材料9對人前列腺抗原的檢測靈敏度下限可低至約
40ng/L。

實施例10

制備復合材料10

將實施例1步驟(5)中的聚苯乙烯微球改為聚苯乙烯-甲基丙烯酸微球,并在其表
面偶聯人前列腺特異性抗體,在EDAC的催化下,利用人前列腺特異性抗體的氨基與聚苯乙
烯-甲基丙烯酸微球表面的羧基之間的化學反應,在聚苯乙烯-甲基丙烯酸微球表面偶聯能
夠特異性靶向作用于人前列腺特異性抗原的特異性抗體。

在納米粒子表面連接拉曼信號分子、生物高分子的二硫鍵的還原、在納米粒子表
面包裹還原生物高分子、還原生物高分子表面人前列腺特異性抗體的偶聯、聚苯乙烯-甲基
丙烯酸微球的制備方法及表面人前列腺特異性抗體的偶聯與實施例1相同,即可制備一種
基于SERS技術可用于檢測人前列腺特異性抗原的復合材料10。

結果

經測試,得知復合材料10也可實現對人前列腺抗原的低濃度檢測。

具體實驗結果表明,所述復合材料10對人前列腺抗原的檢測靈敏度下限可低至約
40ng/L。

實施例11

制備復合材料11

將實施例1步驟(5)中的聚苯乙烯微球改為聚乳酸微球,并在其表面偶聯人前列腺
特異性抗體,在EDAC的催化下,利用人前列腺特異性抗體的氨基與聚乳酸微球表面的羧基
之間的化學反應,在聚乳酸微球表面偶聯能夠特異性靶向作用于人前列腺特異性抗原的特
異性抗體。

在納米粒子表面連接拉曼信號分子、生物高分子的二硫鍵的還原、在納米粒子表
面包裹還原生物高分子、還原生物高分子表面人前列腺特異性抗體的偶聯、聚乳酸微球的
制備方法及表面人前列腺特異性抗體的偶聯與實施例1相同,即可制備一種基于SERS技術
可用于檢測人前列腺特異性抗原的復合材料11。

結果

經測試,得知復合材料11也可實現對人前列腺抗原的低濃度檢測。

具體實驗結果表明,所述復合材料11對人前列腺抗原的檢測靈敏度下限可低至約
40ng/L。

實施例12

制備復合材料12

將實施例1步驟(5)中的聚苯乙烯微球改為聚乳酸-羥基乙酸微球,并在其表面偶
聯人前列腺特異性抗體,在EDAC的催化下,利用人前列腺特異性抗體的氨基與聚乳酸-羥基
乙酸微球表面的羧基之間的化學反應,在聚乳酸-羥基乙酸微球表面偶聯能夠特異性靶向
作用于人前列腺特異性抗原的特異性抗體。

在納米粒子表面連接拉曼信號分子、生物高分子的二硫鍵的還原、在納米粒子表
面包裹還原生物高分子、還原生物高分子表面人前列腺特異性抗體的偶聯、聚乳酸-羥基乙
酸微球的制備方法及表面人前列腺特異性抗體的偶聯與實施例1相同,即可制備一種基于
SERS技術可用于檢測人前列腺特異性抗原的復合材料12。

結果

經測試,得知復合材料13也可實現對人前列腺抗原的低濃度檢測。

具體實驗結果表明,所述復合材料13對人前列腺抗原的檢測靈敏度下限可低至約
30ng/L。

對比例1復合材料C1

同實施例1,區別在于:所述復合材料C1中不含聚苯乙烯微球

結果表明,當復合材料C1中不含聚苯乙烯微球時,500×g離心5min,復合材料C1與
金納米球相互作用的人前列腺抗原不能沉淀下來,或其沉淀率極小,導致復合材料C1對人
前列腺抗原無選擇性,或檢測靈敏度下限要求非常高。

對比例2復合材料C2

同實施例1,區別在于:所述復合材料C2中高分子為非平躺式

當復合材料C2中高分子為非平躺式結合時,一方面,該高分子與靶分子葉酸相互
作用的官能團很少,導致復合材料C2中接枝的葉酸量顯著減少,使得沉淀率急劇下降,在拉
曼檢測中拉曼信號變得非常差,這進一步表明當使用該復合材料C2檢測人前列腺抗原時要
求更高的靈敏度下限;另一方面,在保證足夠量的葉酸含量的情況下,就要求保護金納米球
的高分子數量增加,使得保護層變厚,阻礙SERS增強效果,導致拉曼信號變差,這會嚴重影
響對人前列腺抗原的檢測靈敏度。

在本發明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考,就如同每一篇文獻被單獨
引用作為參考那樣。此外應理解,在閱讀了本發明的上述講授內容之后,本領域技術人員可
以對本發明作各種改動或修改,這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定的范
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