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AQP1是一項人神經膠質瘤總生存期(OS)及無進展生存期(PFS)的預后指標.pdf

摘要
申請專利號:

CN201510332587.0

申請日:

2015.06.16

公開號:

CN106257284A

公開日:

2016.12.28

當前法律狀態:

撤回

有效性:

無權

法律詳情: 發明專利申請公布后的視為撤回IPC(主分類):G01N 33/68申請公布日:20161228|||公開
IPC分類號: G01N33/68 主分類號: G01N33/68
申請人: 寧波美麗人生醫藥生物科技發展有限公司
發明人: 田曉麗
地址: 315899 浙江省寧波市保稅西區創業大道7號4幢305室
優先權:
專利代理機構: 代理人:
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法律狀態
申請(專利)號:

CN201510332587.0

授權公告號:

|||

法律狀態公告日:

2018.12.04|||2016.12.28

法律狀態類型:

發明專利申請公布后的視為撤回|||公開

摘要

本發明涉及生物醫藥領域,特別是涉及AQP1為人神經膠質瘤總生存期(OS)及無進展生存期(PFS)的預后指標。本發明發明人探索了過度表達AQP1所引起的膠質瘤患者總生存期(OS)及無進展生存期(PFS)下調及膠質瘤患者體內β-catenin表達上調的作用形式。通過采用Kaplan-Meier法估算,對數秩檢驗證實AQP1是總生存期(OS)及無進展生存期(PFS)的一項高度獨立預后指標。

權利要求書

1.AQP1為人神經膠質瘤總生存期(OS)及無進展生存期(PFS)的預后指標。2.如權利要求1所述AQP1為人神經膠質瘤總生存期(OS)及無進展生存期(PFS)的預后指標,其中所涉及的細胞模型是人膠質母細胞瘤細胞。3.如權利要求1所述AQP1為人神經膠質瘤總生存期(OS)及無進展生存期(PFS)的預后指標,其中所涉及的臨床樣品是神經膠質瘤組織樣本。4.如權利要求2至3所述AQP1為人神經膠質瘤總生存期(OS)及無進展生存期(PFS)的預后指標,是通過采用Kaplan-Meier法估算,對數秩檢驗應用于計算P值得以確定的,其具有作為膠質瘤治療應用中預后指標的潛在臨床價值。

說明書

AQP1是一項人神經膠質瘤總生存期(OS)及無進展生存期(PFS)的預后指標

技術領域

本發明涉及生物醫藥領域,特別是涉及AQP1是一項人神經膠質瘤總生存期(OS)及無進展生存期(PFS)的預后指標。

背景技術

水通道蛋白(AQPs)屬于小分子疏水性內在膜蛋白家族,介導涉及滲透壓梯度的水分子跨膜轉運(Verkman 2005)。哺乳動物機體內存在13種水通道蛋白(AQP-AQP12)。此類AQPs可分成兩個功能組:傳統的水通道蛋白(AQP1,2,4,5,8),只便于水分子轉運;甘油水通道蛋白(AQP3,7,9,10),也可以傳輸不帶電荷的小分子,如甘油,乳酸和尿素(verkman 2005)。

由于AQPs與腫瘤發展關系密切,故其研究備受大眾關注。在肝臟,結腸,宮頸癌,以及在食管鱗狀細胞癌中AQP3的表達量均上調(Kusayama et al.2011,Hara-Chikuma & Verkman 2008,Guo et al.2013,Shi et al.1971,Li et al.2013)。AQP3的表達量也與肝細胞癌預后不良有關(Guo et al.2013)。在卵巢癌,宮頸癌和乳腺癌患者中發現高表達的AQP5(Wang et al.2012,Yang et al.2006,Zhanget al.2012,Jung et al.2011)。此外,AQP5已被證實是宮頸癌,肝癌和乳腺癌預后較差的指標(Guo et al.2013,Zhang et al.2012,Shi et al.2012)。相比于正常組織和良性腫瘤,AQP7和AQP9在卵巢上皮癌中的表達水平均較高(Verkman et al.2008)。

值得注意的是,AQP家族的兩個成員,AQP1和AQP4已確定存在于腦腫瘤(Benga & Huber 2012)。AQP4在乳腺癌和非小細胞肺癌中表達量較低(Shi et al.2012,Warth et al.2011)。相反,AQP4在高級別星形細胞瘤中表達量較高且呈廣泛分布,其有可能成為腫瘤相關水腫的治療靶標(Saadoun et al.2002b,Warth et al.2007,Warth et al.2005,Warth et al.2004,Sawada et al.2007)。此外,我們以前的研究表明:AQP4與腦膠質瘤細胞的侵襲和遷移相關,siRNA介導的AQP4表達下調可誘導腦膠質瘤細胞凋亡(Ding et al.2011,Ding et al.2013)。最新證據表明,AQP1在肺,結腸和乳腺癌中表達量增加(Hoque et al.2006,Otterbach et al.2010, Yoshida et al.2013)。另外研究顯示,AQP1的表達與結腸癌和乳腺癌患者的腫瘤高級別及較短生存期有關(Yoshida et al.2013,Otterbach et al.2010)。然而,迄今為止,有關人腦腫瘤中AQP1表達情況的報道仍較少。先前基于相對少量患者組織樣本的免疫組化研究表明(由世界衛生組織[WHO]定義的各病理分級約五個膠質瘤患者病例),在低級別到高級別的星形細胞瘤中,AQP1的表達量存在潛在上調趨勢(Saadoun et al.2002a,Oshio et al.2005,Deb et al.2012)。基于這些研究,我們推測AQP1的表達與膠質瘤分級和膠質瘤患者術后生存期相關。

最近研究顯示,AQP1在腫瘤生長和血管生成中具有一定的作用。AQP1在腫瘤血管內皮細胞中呈廣泛表達,而AQP1缺失可抑制內皮細胞遷移,從而延遲腫瘤血管生成,(Saadoun et al.2005,Nicchia et al.2013,Esteva-Font et al.2013,Verkman et al.2008)。最近,AQP1在促進腫瘤細胞遷移方面的關鍵性作用也備受關注。AQP1促進多種腫瘤細胞系(包括HT20結腸癌細胞,B16F10黑色素瘤細胞和4T1乳腺腫瘤細胞)的腫瘤細胞遷移(Jiang 2009,Hu & Verkman 2006)。但是AQP1介導腫瘤細胞遷移的分子機制尚不清楚。在這方面,Monzani等人提出通過相關Lin-7/β-catenin的機制,AQP1可提高HMEC-1人微血管內皮細胞及WM115人黑色素瘤細胞系的遷移能力(Monzani et al.2009)。具體而言,AQP1與Lin-7聯合免疫沉淀及AQP1的表達抑制均顯著影響F-肌動蛋白細胞骨架組織以及LIN-7/β-catenin的表達。然而目前還沒有相關的臨床數據得以證實人腫瘤組織中AQP1和β-catenin之間的關系。

發明內容

水通道蛋白(AQPs)屬于小分子疏水性內在膜蛋白家族,介導涉及滲透壓梯度的水分子跨膜轉運(Verkman 2005)。AQP家族的兩個成員,AQP1和AQP4已確定存在于腦腫瘤(Benga & Huber 2012)。基于先前相對少量患者組織樣本的免疫組化研究表明(由世界衛生組織[WHO]定義的各病理分級約五個膠質瘤患者病例),在低級別到高級別的星形細胞瘤中,AQP1的表達量存在潛在上調趨勢(Saadoun et al.2002a,Oshio et al.2005,Deb et al.2012)。最新研究發現,AQP1在促進腫瘤細胞遷移方面具有關鍵性作用。故研究結果均顯示,AQPs與腫瘤發展關系密切,但有關腦膠質瘤AQP1與患者總生存率(OS)及無進展生存期(PFS) 報道仍較少。

鑒于以上所述現有技術,本發明第一方面提供AQP1在提高人神經膠質瘤細胞增殖及侵襲力中的作用。

由于細胞遷移能力通常與細胞侵襲能力呈正相關;相關數據顯示,與非腫瘤組織相比,腦膠質瘤組織中AQP1 mRNA表達量呈上調,且AQP1過表達可提高LN229細胞的增殖與侵襲力,所以AQP1過表達在提高人神經膠質瘤細胞增殖及侵襲力中具有實際應用價值。

本發明第二方面提供AQP1表達水平與β-catenin表達水平呈正向關系。

由于先前研究顯示,神經膠質瘤細胞中AQP1和β-catenin關系密切,其兩者增加量與組織學分級相對應。此外,AQP1標簽指數與β-catenin蛋白表達正相關。AQP1高表達與高等級膠質瘤和β-catenin蛋白高表達顯著相關,所以AQP1表達量與β-catenin表達量之間存在正向關系。

本發明第三方面提供AQP1及β-catenin與腫瘤病理分級之間呈正相關。

由于1級神經膠質瘤及54%二級膠質瘤(n=33)存在高表達AQP1,然而71%三級膠質瘤中(n=39)和69%GBM(n=45)存在高表達AQP1。AQP1的表達水平隨腫瘤組織學分級顯著增加。與低等級(1級與2級)膠質瘤相比,高等級(3級與4級)膠質瘤具有大量的胞漿內β-catenin蛋白的表達,所以AQP1及β-catenin表達水平隨與腫瘤病理分級顯著增加。

本發明第四方面提供β-catenin表達與神經膠質瘤患者預后之間的關系。

由于高表達β-catenin蛋白與OS和PFS顯著相關。高表達β-catenin蛋白患者總生存率的中值為31個月,而低表達β-catenin蛋白患者總生存率為27個月。高表達和低表達患者PFS中值分別為18和22個月,所以β-catenin表達與神經膠質瘤患者預后之間存在密切的關系。

本發明第五方面提供AQP1可作為人神經膠質瘤總生存期(OS)及無進展生存期(PFS)的預后指標和藥物靶標。

由于高表達AQP1患者生存率低于低表達AQP1患者,且AQP1過表達與無進展生存期(PFS)下降密切有關,高表達AQP1患者總生存率的中值為26個月,而低表達AQP1患者總生存期45個月。高表達及低表達患者PFS中值分別為18和47個月。表明AQP1與膠質瘤患者預后不良息息相關。所以AQP1作為 人神經膠質瘤總生存期(OS)及無進展生存期(PFS)的預后指標具有重要的臨床意義。

本發明第六方面提供AQP1作為膠質瘤輔助治療中一個潛在的預后標志物和藥物靶標。

由于高表達AQP1,高表達β-catenin,年齡,腫瘤大小,高病理分級分別與OS縮短密切相關。此外,高表達AQP1,高表達β-catenin,腫瘤大小,年齡,高病理分級,以及缺乏輔助放療均與PFS期下降密切相關。多變量分析表明,AQP1表達量,年齡,腫瘤大小,組織學分級為OS的獨立預后因素,僅AQP1表達量及組織學分級與PFS有關。總之,我們的分析結果顯示,AQP1的表達與OS相關,且腫瘤分級是患者PFS獨立預后指標,所以AQP1作為膠質瘤輔助治療中一個潛在的預后標志物和藥物靶標具有實際應用價值。

綜上所述,本發明發明人證實了AQP1是腦膠質瘤患者總生存期(OS)及無進展生存期(PFS)的一項高度獨立預后指標。AQP1的表達水平與膠質瘤分級密切相關,我們的研究也首次顯示,無論OS及PFS,膠質瘤中AQP1的過表達是一個獨立的危險因素。

附圖說明

圖1:LN229細胞系中AQP1的過表達導致細胞增殖及β-catenin的上調。同源LN229細胞系未發現AQP1表達。腎組織作為陽性對照(A)。建立穩定表達AQP1的AQP1/LN229細胞系。AQP1與GFP作為一個重組蛋白表達(B)。AQP1過表達導致β鏈蛋白表達水平上調(C)。表達AQP1的綠色熒光蛋白(GFP)慢病毒載體或空白載體轉染LN229細胞,結果顯示AQP1位于細胞質內(D:×200)。轉染AQP1的LN229細胞系的代表性顯微圖(上圖)和Brdu定量檢測(下圖)(E:×200)。

圖2:AQP1過表達導致LN229細胞增殖及侵襲能力增強。MTT檢測結果顯示AQP1過表達導致LN229細胞增殖能力增強(A)。在第7天細胞增值率明顯升高。(P*<0.05)。軟瓊脂實驗表明AQP/LN229細胞集落形成能力增強。典型的細胞集落圖像(B:×200)。基底膜侵襲實驗顯示AQP1過表達可增加神經腦膠質瘤細胞侵襲性(C:×200)。

圖3:神經腦膠質瘤組織中AQP1中表達。A:基于源于倫勃朗數據庫的基因表達分析數據分析標準AQP1 mRNA表達水平。這些數據包括神經腦膠質瘤組織(n=454)和非腫瘤組織(n=24)。B:人神經腦膠質瘤組織中AQP1蛋白的Western Blot檢測。神經腦膠質瘤中AQP1蛋白條帶大小為28kd。陰性對照包括:N(正常組織)和S(神經鞘瘤)

圖4:神經腦膠質瘤組織中AQP1和β-catenin的免疫組化。AQP1免疫反應性研究(A)。正常腦組織(N)和腫瘤組織(T)中AQP1的表達情況(40×)(a)。星形膠質細胞瘤(200×)(b)和少突神經膠質瘤(200×)(c)中AQP1的表達情況。二級腫瘤的內皮細胞免疫組化染色觀察AQP1表達情況(40×)(d)。成膠質細胞瘤內增殖的內皮細胞無AQP1表達(200×)(e)。血管周圍大量AQP1表達(40×)(f)。腫瘤浸潤區AQP1表達(100×)(g)。活性星形細胞中AQP1表達(100×)(h)。幾乎所有的腫瘤細胞中AQP1顯著表達(200×)(i)。接近壞死區域的膠質母細胞瘤(GBM)中無AQP1或微弱AQP1表達(200×)(j)。不同等級的神經膠質瘤中AQP1(B)及β-catenin(D)免疫組化(I-IV,200×)。不同等級的膠質瘤中AQP1(C)(P=0.017)和β-catenin(E)(P=0.010)得分示意圖。

圖5:總生存期(OS)及無進展生存期(PFS)的實驗結果。所有神經膠質瘤患者(AQP1均表達)的總生存期(OS)及無進展生存期(PFS)(A和B)。膠質母細胞瘤患者(AQP1均表達)的總生存期(OS)及無進展生存期(PFS)(C和D)。所有神經膠質瘤患者(β-catenin均表達)的總生存期(OS)及無進展生存期(PFS)(E和F)。

具體實施方式

以下通過特定的具體實例說明本發明的實施方式,本領域技術人員可由本說明書所揭露的內容輕易地了解本發明的其他優點與功效。本發明還可以通過另外不同的具體實施方式加以實施或應用,本說明書中的各項細節也可以基于不同觀點與應用,在沒有背離本發明的精神下進行各種修飾或改變。

在進一步描述本發明具體實施方式之前,應理解,本發明的保護范圍不局限于下述特定的具體實施方案;還應當理解,本發明實施例中使用的術語是為了描 述特定的具體實施方案,而不是為了限制本發明的保護范圍;在本發明說明書和權利要求書中,除非文中另外明確指出,單數形式“一個”、“一”和“這個”包括復數形式。

當實施例給出數值范圍時,應理解,除非本發明另有說明,每個數值范圍的兩個端點以及兩個端點之間任何一個數值均可選用。除非另外定義,本發明中使用的所有技術和科學術語與本技術領域技術人員通常理解的意義相同。除實施例中使用的具體方法、設備、材料外,根據本技術領域的技術人員對現有技術的掌握及本發明的記載,還可以使用與本發明實施例中所述的方法、設備、材料相似或等同的現有技術的任何方法、設備和材料來實現本發明。

除非另外說明,本發明中所公開的實驗方法、檢測方法、制備方法均采用本技術領域常規的免疫組織化學(IHC)分析,Western blot(免疫印跡法),細胞培養,載體構建和慢病毒轉染,MTT法,軟瓊脂分析法,侵襲檢測,BrdU標記檢測法,統計分析及相關領域的常規技術。

水通道蛋白(AQPs)屬于小分子疏水性內在膜蛋白家族,介導涉及滲透壓梯度的水分子跨膜轉運(Verkman 2005)。哺乳動物機體內存在13種水通道蛋白(AQP-AQP12)。此類AQPs可分成兩個功能組:傳統的水通道蛋白(AQP 1,2,4,5,8),只便于水分子轉運;甘油水通道蛋白(AQP3,7,9,10),也可以傳輸不帶電荷的小分子,如甘油,乳酸和尿素(verkman 2005)。AQP1過度表達所引起的膠質瘤患者總生存期(OS)及無進展生存期(PFS)下調及膠質瘤患者體內β-catenin表達上調的作用形式。凍存人腦膠質瘤組織的Western blot檢測結果顯示,高度惡性腫瘤中AQP1表達量居高。通過采用Kaplan-Meier法估算,對數秩檢驗應用于計算P值,認為AQP1是總生存期(OS)及無進展生存期(PFS)的一項高度獨立預后指標。

各實施例中所使用的LN229人膠質母細胞瘤細胞系來源美國典型菌種保藏中心(Manassas,VA,USA),并于RPMI-1640培養基中進行培養,培養條件為5% CO2,37℃;培養基中含有10%胎牛血清、100μg/ml青霉素、100μg/mL的鏈霉素。重組人表皮生長因子(EGF)來源于R&D系統公司(Minneapolis,MN,USA)。細胞系由天津醫科大學附屬腫瘤研究醫院檢測。

各實施例中所使用的臨床樣品由天津醫科大學附屬腫瘤研究醫院提供,由 1999至2013年間,186個神經膠質瘤確診患者在放療和化療之前的原發腫瘤標本組成。其中135例病患的隨訪信息均可用,隨訪時間直至2013年10月份或直到他們發展成為神經膠質瘤或直至死亡。30-33級患者術后放療的照射劑量60Gy。術后化療采用替莫唑胺。

免疫組織化學(IHC)分析

水通道蛋白和β-catenin的免疫組織化學使用福爾馬林固定,進行石蠟包埋的組織切片(5μm)。載玻片在65℃下烘烤3h,用二甲苯脫蠟,再溶解于濃度遞減的乙醇中,并用磷酸鹽緩沖鹽水進行清洗。AQP1和β-catenin的抗原修復通過在高壓鍋中加熱,分別在檸檬鹽酸緩沖液(PH6.0)加熱2分鐘50秒,其次在乙二胺四乙酸(EDTA)中加熱2分鐘15秒。用過氧化氫和正常山羊血清封閉切片,隨后與抗AQP1多克隆抗體(1:500,SC-20810,Santa Cruz Biotechnology,Santa Cruz,CA,USA)或抗β-catenin的鼠抗人的多克隆抗體(1:150,SC-7963,Santa Cruz Biotechnology)溫育過夜。所有的載玻片均置于3,3-二氨基聯苯胺四鹽酸鹽中3-10分鐘。陰性對照包括用非免疫血清替代初級抗體。

免疫組化結果由兩位病理學家來進行評估,而他們對病人的臨床資料并不了解。免疫組化評定結果基于雙評分系統(染色強度乘以染色區),得出的數值總范圍為0-9。染色強度評定如下:0=沒有著色,1=明確,但微弱著色,2=中度著色,3=強度著色。染色區域評定如下:0=0-25%區域著色,1=26-50%區域著色,2=51-75%區域著色,3=腫瘤細胞的76-100%區域著色。高表達AQP1和β-catenin免疫組化的評分為5-9,蛋白質低表達和中度表達組評分為1-4,蛋白質無表達組評分為0分。生存分析結果顯示,患者分為以下幾組:無/低AQP1表達(綜合得分0-3),中/高AQP1表達(綜合得分4-9),無/低β-catenin表達(綜合得分0-4),中/高β-catenin表達(綜合得分5-9)。

Western blot(免疫印跡法)

在2010至2013年間收集的新鮮凍存神經膠質瘤樣品(n=26,二級:10,Ⅲ級:7,IV級:9)應快速冷凍,并在取用之前存儲于-80℃。用于本研究的所有腫瘤組織均是最初樣品。在切除手術之前,患者未接受放療或化療。大腦標本必須來源于兩個腦水腫患者和一個神經鞘瘤患者。

簡而言之,使用超聲細胞破碎機裝置將組織進行粉碎。然后組織和細胞置于 1×SDS裂解緩沖液中,在冰上(62.5mM三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽,2%十二烷基硫酸鈉,10%甘油)裂解30分鐘。將樣品煮沸10分鐘,然后10000rpm,離心10分鐘,去除上清液。蛋白經SDS-PAGE分離,并電轉移到硝酸纖維素膜上。轉印膜在一抗作用下4℃孵育過夜(AQP1抗體(1:500),β-catenin(1:2000),綠色熒光蛋白(1:7000,KM8009;SanJian,China),β-actin(1:5000,SC-47778,Santa Cruz Biotechology)。轉移膜在抗兔抗體(Odyssey LiCor,IR800,1:8000)或抗鼠抗體(Odyssey LiCor,IR700,1:8000)作用下室溫孵育50分鐘。用LiCor Odyssey成像系統對轉移膜進行分析,并用LiCor Odyssey軟件進行光密度分析。

細胞培養和試劑

LN229人膠質母細胞瘤細胞系來源美國典型菌種保藏中心(Manassas,VA,USA),并于RPMI-1640培養基中進行培養,培養條件為5% CO2,37℃;培養基中含有10%胎牛血清、100μg/ml青霉素、100μg/mL的鏈霉素。重組人表皮生長因子(EGF)來源于R&D系統公司(Minneapolis,MN,USA)。細胞系由天津醫科大學附屬腫瘤研究醫院檢測。

載體構建和慢病毒轉染

提取接受乳腺癌根治術的患者的新鮮正常乳腺體中總RNA。在距離惡性病變2厘米左右獲取鄰近的正常組織。組織用Trizol試劑(Invitrogen公司提供)處理(具體操作按照制造商的說明書)。總RNA用M-MLV反轉錄酶(Takara)反轉錄成cDNA。采用選擇性引物對人AQP1基因組進行PCR擴增(基因庫登錄號:NM_198098.2),F:5′-AATTGAATTCGCCACCATGGCCAGCGAGTTCAAG-3′和R:5′-CGGGATCCCTATTTGGGCTTCATCTC-3′。序列兩側設立EcoRI和BamH1位點,用于克隆入慢病毒為基礎的PCDH-CMV-MCS-EF1-Puro載體。mGFP也插入慢病毒載體,產生可見報告基團。通過測序分析證實重組產物的正確結構。人胚胎腎293T細胞接種并在磷酸鈣轉染后24h轉染,用于生產相關病毒。轉染48h后,收集含有慢病毒顆粒的細胞上清液。LN229細胞(1.5×105/孔)接種于6孔板,并與含聚凝胺(10μg/ml)的慢病毒上清液共同孵育4-5h,孵育條件5%CO2,37℃。在兩天內,通過嘌呤(1μg/ml)選擇穩定轉染LN229細胞系。借助Westernblot實驗檢測穩定轉染細胞系中AQP1的表達水平。

MTT法

細胞鋪于24孔板中(5×103cell/孔),并孵育24h。使用3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT)對活性細胞進行定量檢測。簡而言之,將50μl的MIT存儲液(5mg/ml)加至每個孔中,37℃孵育。孵育4h后,去除培養基,用二甲基亞砜溶解轉換后的染料。采用酶標儀(BioTek Epoch)檢測570nm處的光密度值(OD)。增值率由以下公式進行計算:增值率=每個時間點的OD/第一天的OD。MTT測定法中樣品一式三份,并重復3次。

軟瓊脂分析法

軟瓊脂測定法可測定單個細胞在非依賴性生長的體外環境下長成集落的存活能力。簡而言之,穩定轉染的細胞(AQP1/LN229或載體/LN229)接種于頂層為0.35%瓊脂和底層為0.6%瓊脂的完全培養基的6孔培養板中(1×104細胞/孔)。培養板在37℃下孵育4周,其次用0.005%的結晶紫染色1h。菌落大于50μm進行評分,使用Olympus顯微鏡(Olympus,Japan)拍照。所有數據代表三個獨立的實驗。

侵襲檢測

Boyden chamber侵襲測定法來檢測體外細胞侵襲力(Corning,NY,USA)。簡而言之,將24孔插入式細胞培養皿(8μm孔徑)覆蓋基質膠。用胰蛋白酶對細胞進行消化,并將200μL細胞懸浮液(5×105細胞/ml)加入孔中(一式三份)。將培養基(350μL)(RPMI-1640,0.1%牛血清蛋白,25mM的羥乙基哌嗪乙硫磺酸)且含有10ng/ml的表皮細胞生長因子(EGF)加至較低的孔中,37℃,5%CO2培養24h。通過擦拭細胞膜的上測,去除非侵入細胞;同時固定并染色侵入細胞。在五個預先確定的領域,計數侵入細胞,并在顯微鏡下(放大倍數200倍)進行拍攝。所有測定數據由三個獨立的實驗中重復測定得出。

BrdU標記檢測法

細胞接種于35mm的平底培養皿(1×105細胞/孔),并培養72h。用溴脫氧尿苷(BrdU)標記試劑(1mg/ml)處理48h,將細胞用4%多聚甲醛固定30分鐘。在與硼酸鈉中和之前,將細胞經2M鹽酸在37℃條件下處理10分鐘。再與0.2%的Triton-X-100孵育10分鐘后,將細胞用3%的牛血清蛋白(BSA)在室溫下封閉1h。然后將細胞與鼠抗BrdU抗體(1:200;ZM0013;ZhongShan,China) 在4℃下過夜孵育,隨后用羊抗抗體(Alexa Fluor594綴合二抗)(1:100;ZF-0513;ZhongShan)避光孵育1h。最后,細胞用49,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)(1μg/ml)染色10分鐘。

BrdU-DAPI雙染色的細胞被認為是BrdU陽性細胞。使用熒光顯微鏡(TE2000-U,Nikon,Japan,倍率200×)拍攝圖像。所有的實驗都進行了三次。

統計分析

IHC統計分析采用SPSS17.0軟件(IBM,Armonk,New York,USA)。方差分析檢測主要進行組間比較及兩個變量關聯性分析,并由斯皮爾曼等級相關法進行評價。總生存率(OS)和無進展生存率(PFS)分別采用Kaplan-Meier法估算,對數秩檢驗應用于計算P值。根據已鑒定的相關預后因素來建立Cox比例風險模型。患者生存時間從手術之日起計算,直至因神經膠質瘤死亡或神經膠質瘤全身復發為止,以最后隨訪時間或非癌癥相關死亡的時間作為審查結點。在所有分析中,P≤0.05則被認為具有統計學意義。使用Prism3軟件(GraphPad Software)(San Diego,CA,USA)進行細胞增殖統計分析,所有數據表示為平均值±標準偏差。采用雙尾t檢驗用以測定組間比較值具有重要統計學意義。

實施例1

AQP1過表達提高LN229細胞的增殖與侵襲力

先前研究表明,AQP1可提高HT20,12/40B16F10以及4T1細胞系的細胞遷移能力(Jiang 2009,Hu & Verkman2006)。為了研究AQP1在腦膠質瘤中的作用,我們采用Western Blot方法檢測AQP1在同源性LN229細胞系中的表達情況。在LN229細胞中未檢測到AQP1表達(圖1A)。然后,我們將表達AQP1序列全長的質粒轉染LN229細胞,獲得穩定表達AQP1的LN229細胞,并命名為AQP1/LN229細胞系。將空載體轉染LN229細胞,獲得穩定表達空載體的LN229細胞,并命名為載體/LN229細胞系,作為對照細胞系。與載體/LN229細胞相比,AQP1蛋白表達水平在AQP1/LN229細胞中顯著上調(圖1B)。為了完成AQP1的細胞定位,故進行免疫熒光染色實驗,經細胞質染色圖案得出結論(圖1D)。

為了探索AQP1在細胞增殖中的作用,我們進行了BrdU實驗。與對照組相比,AQP1過表達組中BrdU檢測陽性細胞數顯著增加(圖1E)。與此結果一致, MTT檢測法顯示,在第七天時,AQP1/LN229組的細胞增殖率明顯高于對照組(圖2A)。軟瓊脂實驗也用于測定AQP1/LN229及載體/LN229組中的細胞增殖率。與空載體對照組相比,AQP1過表達組形成的細胞集落數的顯著增加。這些結果表明,AQP1在調節神經膠質瘤細胞增殖方面具有重要作用(圖2B)。

細胞遷移能力的減弱通常會導致細胞侵襲能力的降低。先前研究表明,AQP1介導多類細胞遷移(Saadoun et al.2005,Jiang2009,Hu & Verkman 2006,Monzani et al.2009)。因此,我們采用基質膠Boyden測定法,對AQP1過表達細胞組的侵襲能力進行測定。結果顯示AQP1/LN229組與對照組存在顯著差異(圖2C)。與對照組相比,AQP1過表達組具有較高的侵襲率。此外,Monzani等人之前的研究表明,通過在HMEC-1和WM115細胞系中Lin-7/β-catenin相互作用,AQP1可提高細胞的遷徙能力(Monzani et al.2009)。Western Blot實驗顯示,在LN229細胞系中,伴隨AQP1過表達,β-catenin表達水平升高(圖1C)。

實施例2

人腦膠質瘤組織中AQP1的表達情況

為了進一步探討AQP1在腦膠質瘤組織中的功能性作用,基于源于倫勃朗數據庫的基因表達分析數據,我們進一步檢測AQP1 mRNA表達水平。(分子腦瘤數據查找,https://caintegrator.nci.nih.gov/rembrandt/)。這些數據包括腦膠質瘤組織(n=454)以及非腫瘤組織(n=24)。有效數據表明,與非腫瘤組織相比,腦膠質瘤組織(1.96±0.29)中AQP1 mRNA水平呈上調(圖3A)。其次,我們利用Western Blot實驗檢測多種WHO等級的神經膠質瘤中AQP1蛋白表達水平(圖3B)。兩個正常的腦樣本和一個神經鞘樣本被作為對照組。通過Western Blot實驗發現,在非腫瘤組織和神經鞘瘤樣本裂解液中未檢測到AQP1表達。與之相反,在人體膠質瘤組織中AQP1表達水平上調。此外,與低等級(2級)腦膠質瘤相比,AQP1在高等級(3到4級)膠質瘤中表達水平顯著上調。特別是,在2級腦膠質瘤的10例樣品中,僅有3例顯示高表達的AQP1;其余均在高等級膠質瘤中存在高表達的AQP1。

實施例3

神經膠質瘤患者中AQP1的表達情況

有趣的是,我們觀察到AQP1-免疫組化顯示特定圖案(圖4Aa-j)。與先前研究相比,正常腦組織的神經膠質細胞中未檢測到AQP1表達(Saadoun et al.2002a,Hayashi et al.2007)。與之相反,腫瘤區域的AQP1表達水平上調(圖4Aa)。在星形細胞瘤(圖4Ab)和少突神經膠質瘤(圖4Ac)中觀察到AQP1表達。在星形細胞瘤中,AQP1染色呈現了典型的星形膠質細胞外觀。在低等級的膠質瘤內皮細胞中,人體膠質瘤組織切片中觀察到AQP1表達,而在高等級腦膠質瘤的增殖內皮細胞中AQP1表達缺失。此外,AQP1免疫反應更加聚集且在血管周圍分布更加密集(圖4Af)。進一步的觀察顯示,AQP1在腫瘤浸潤區域(圖4Ag)存在表達,且定位于星形膠質瘤活性區(圖4Ah)。在等級4的神經膠質瘤(膠質母細胞瘤,GBM)中,AQP1呈現兩種免疫組化染色的模式。在特定區域中,在腫瘤細胞中AQP1一直表達,且與特定結構并無關聯(圖4Ai)。然而,在其他區域,AQP1染色在壞死區域中呈現無或微弱。

AQP1表達量與膠質瘤等級呈正相關。在一般情況下,細胞膜,細胞質以及兩種腫瘤細胞中均可檢測到AQP1的免疫反應性(圖4B)。在低等級(1級和2級)的神經膠質瘤中,AQP1的表達水平主要受限于一定比例的腫瘤細胞的細胞膜。在高等級(3級和4級)的神經膠質瘤中,AQP1呈現廣泛且密集的細胞膜和細胞內表達。1級神經膠質瘤及54%二級膠質瘤(n=33)存在高表達AQP1,然而71%三級膠質瘤中(n=39)和69%GBM(n=45)存在高表達AQP1。AQP1中間值及其數值范圍見圖4C。AQP1的表達水平隨腫瘤組織學分級顯著增加(rs=0.175,P=0.017),但與階層年齡限制,腫瘤大小,性別,病理類型,水腫程度以及腫瘤位置無關。

實施例4

神經膠質瘤患者的AQP1表達與預后的關系

在135個神經膠質瘤患者的有效隨訪資料中,32例患者由于失去隨訪,故未能提供相關資料。剩余103患者的全面隨訪數據從1至158個月。其中,72位患者在隨訪期間因膠質瘤死亡,78位患者呈現疾病惡化。

通過比較高表達(AQP1=3-9)與低表達(AQP1=0-2)的AQP1組發現,總 生存率(OS)存在明顯不同(P=0.001,圖5A)。此外,高表達AQP1患者生存率低于低表達AQP1患者,同時上調的AQP1與無進展生存期(PFS)下降有關(P=0.000,圖5B)。高表達AQP1患者總生存率的中值為26個月(95%Cl:置信區間,22.19-29.82),而低表達AQP1患者總生存期45個月(95%Cl:置信區間,34.23-58.76)。高表達及低表達患者PFS中值分別為18(95%Cl:置信區間,12.41-23.59)和47個月(95%Cl:置信區間,36.84-61.35)。Kaplan-Meier生存分析結果顯示,AQP1與膠質瘤患者預后不良有關

Kaplan-Meier分析結果也用于評估GBM患者。在低/高表達AQP1組,高表達AQP1患者表現較低的OS(P=0.035,圖5C)和PFS(P=0.043,圖5D)

實施例5

膠質瘤患者中β-catenin的表達

先前研究顯示,神經膠質瘤細胞中的AQP1和β-catenin關系非常密切。在此基礎上,我們假設此關聯也適用于體內研究。先前研究顯示,神經膠質瘤中β-catenin呈過表達,其高表達與膠質瘤惡性程度相關(Liu et al.2011,Rossi et al.2011)。在我們的研究中,β-catenin蛋白主要在細胞質中呈不同強度及不同位置的表達(圖4D)。與低等級(1級與2級)膠質瘤相比,高等級(3級與4級)膠質瘤具有大量的胞漿內β-catenin蛋白的表達。然而,在標本(包括高等級膠質瘤)中并沒有觀察到明顯的細胞核染色,。1級膠質瘤及39%二級膠質瘤(n=24)存在β-catenin蛋白高表達,但55%三級膠質瘤(n=30)和58%GBM(n=38)存在β-catenin蛋白高表達。β-catenin蛋白數值的范圍及其中間值見圖4C。β-catenin蛋白的表達與組織學分級密切有關(rs=0.188,P=0.010),而與其他臨床病理特征無明顯關系。

實施例6

神經膠質瘤患者中β-catenin蛋白表達與預后之間的關系

Kaplan-Meier分析結果顯示,高表達β-catenin蛋白與OS(P=0.034,圖5E)和PFS(P=0.005,圖5F)顯著相關。高表達β-catenin蛋白患者總生存率的中值為31個月(95%Cl:置信區間,0.00-89.77),而低表達β-catenin蛋白(綜合評 分:0-2)患者總生存率為27個月(95%Cl:置信區間,19.33-34.67)。高表達和低表達患者PFS中值分別為18(95%Cl:置信區間,12.18-23.82)和22個月(95%Cl:置信區間,7.65-36.36)。

實施例7

神經膠質瘤患者中AQP1與β-catenin蛋白之間的關系

接下來,我們對神經膠質瘤患者中AQP1和β-catenin蛋白之間的關系進行研究。AQP1和β-catenin蛋白的增加量與組織學分級相對應。此外,AQP1標簽指數與β-catenin蛋白表達正相關(rs=0.168,P=0.022)。AQP1高表達與高等級膠質瘤和β-catenin蛋白高表達顯著相關。

實施例8

神經膠質瘤患者中AQP1表達的多因素分析

為進一步評估AQP1的獨立預測價值,我們采用Cox回歸方法,依據可能預后因素(如病理分級,年齡,腫瘤大小等)進行亞組分析。單因素分析表明,高表達AQP1,高表達β-catenin,年齡,腫瘤大小,高病理分級分別與OS縮短顯著相關。此外,高表達AQP1,高表達β-catenin,腫瘤大小,年齡,高病理分級,以及缺乏輔助放療均與PFS期下降顯著相關。多變量分析表明,AQP1表達量,年齡,腫瘤大小,組織學分級為OS的獨立預后因素,僅AQP1表達量及組織學分級與PFS有關。總之,我們的分析結果顯示,AQP1的表達與OS相關(HR:風險比,3.023;95%CI,1.045-8.745;P=0.041),且腫瘤分級是患者PFS獨立預后指標(HR,3.224;95%CI,1.089-9.548;P=0.035)

AQP1表達是一個繼年齡,腫瘤大小,性別,切除,家族史,病理分級,化療的程度,和影像學圖像的獨立預后指標。然而,β-catenin多變量分析研究結果顯示,其不再是患者OS(P=0.064)及PFS(P=0.513)的一項獨立預后指標。

綜上所述,本發明有效克服了現有技術中的種種缺點而具高度產業利用價值。

上述實施例僅例示性說明本發明的原理及其功效,而非用于限制本發明。任何熟悉此技術的人士皆可在不違背本發明的精神及范疇下,對上述實施例進行修飾或改變。因此,舉凡所屬技術領域中具有通常知識者在未脫離本發明所揭示的 精神與技術思想下所完成的一切等效修飾或改變,仍應由本發明的權利要求所涵蓋。

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AQP1 一項 神經 膠質 生存 OS 進展 PFS 預后 指標
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