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射流裝置.pdf

摘要
申請專利號:

CN201380067708.2

申請日:

2013.10.22

公開號:

CN104995509A

公開日:

2015.10.21

當前法律狀態:

授權

有效性:

有權

法律詳情: 授權|||實質審查的生效IPC(主分類):G01N 33/49申請日:20131022|||公開
IPC分類號: G01N33/49; B01F5/00; G01N13/00 主分類號: G01N33/49
申請人: 劍橋企業有限公司
發明人: 塞繆爾·科亨; 圖奧馬斯·諾爾斯; 克里斯托夫·多布森; 盧克·拉加; 敦坎·懷特
地址: 英國劍橋郡
優先權: 1219014.6 2012.10.23 GB
專利代理機構: 北京派特恩知識產權代理有限公司11270 代理人: 浦彩華; 武晨燕
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法律狀態
申請(專利)號:

CN201380067708.2

授權公告號:

||||||

法律狀態公告日:

2018.04.27|||2015.11.11|||2015.10.21

法律狀態類型:

授權|||實質審查的生效|||公開

摘要

在此提供了一種用于測定一種或多種組分的擴散的方法,該方法包括以下步驟:(i)提供包含一種或多種組分的一個組分流體流;(ii)提供一個空白流體流;(iii)在一個大橫截面通道中使該流(i)與該流(ii)接觸,從而生成兩個層流;(iv)允許在(iii)中生成的這些層流從該大橫截面通道中流入一個小橫截面通道中;(v)在該小橫截面通道中測量該一種或多種組分從該組分流到該空白流體流中的徑向擴散。在此還提供了一種擴散方法,該方法包括在多個擴散時間測量該一種或多種組分從該組分流到該空白流體流中的徑向擴散的步驟。在此還提供了一種確定包含多種組分的一個流體的組成的方法,該方法(i)提供包含該多種組分的該流體的一個或多個測量的擴散曲線;(ii)提供具有已知流體動力學半徑的組分的一系列預測的分布;并且(iii)使用關于具有已知流體動力學半徑的組分的該系列分布的一種最高熵正規化方法,使該一種或多種組分的該測量的徑向擴散曲線去卷積。

權利要求書

權利要求書
1.  一種用于測定一種或多種組分的擴散的方法,該方法包括以下步驟:
(i)提供包含一種或多種組分的一個組分流體流;
(ii)提供一個空白流體流;
(iii)在一個大橫截面通道中使該流(i)與該流(ii)接觸,從而生成兩個層流;
(iv)允許在(iii)中生成的這些層流從該大橫截面通道中流入一個小橫截面通道中;
(v)在該小橫截面通道中測量該一種或多種組分從該組分流到該空白流體流中的徑向擴散。

2.  根據權利要求1所述的方法,其中該組分流體流包含兩種或更多種組分。

3.  根據權利要求1或權利要求2所述的方法,其中該大橫截面通道的最大寬度是該小橫截面通道的寬度的至少2倍。

4.  根據權利要求3所述的方法,其中該大橫截面通道的寬度是該小橫截面通道的寬度的至少10倍。

5.  根據以上權利要求中任一項所述的方法,其中該小橫截面通道的寬度是在范圍10至500μm內。

6.  根據以上權利要求中任一項所述的方法,其中該大橫截面通道的長度是在范圍50至500μm內。

7.  根據以上權利要求中任一項所述的方法,其中該小橫截面通道的長度是在范圍0.5至50mm內。

8.  根據以上權利要求中任一項所述的方法,其中該大橫截面通道具有帶有基本上恒定的最大寬度的一個區域,該區域是在該大橫截面通道的一個區域的上游,其中該寬度收斂至該小橫截面通道的寬度。

9.  根據以上權利要求中任一項所述的方法,其中在多個擴散時間測量該一種或多種組分從該組分流到該空白流體流中的徑向擴散。

10.  根據以上權利要求中任一項所述的方法,其中該組分或這些組分是一種聚合物。

11.  根據權利要求10所述的方法,其中該聚合物是一種生物聚合物或者包含一種生物聚合物。

12.  根據權利要求11所述的方法,其中該生物聚合物選自下組,該組由多肽、多核苷酸和多糖組成。

13.  根據以上權利要求中任一項所述的方法,該方法用于測定一種或多種組分的擴散系數,每組組分具有在范圍0.5至500nm內的流體動力學半徑。

14.  根據以上權利要求中任一項所述的方法,其中步驟(ii)提供兩個空白流體流,并且這些空白流體流與該組分流體流接觸并且被提供在該組分流體流的兩側,從而生成三個流體流。

15.  根據以上權利要求中任一項所述的方法,其中在步驟(v)中的該一種或多種組分的擴散是通過熒光測量來測定的。

16.  根據以上權利要求中任一項所述的方法,該方法進一步包括該步驟(vi),其中一種組分的擴散系數值是由步驟(v)的徑向擴散測量值確定的,并且任選地流體動力學半徑是由擴散系數值確定的。

17.  根據權利要求16所述的方法,其中步驟(vi)包括比較來自步驟(v)的該一種或多種組分的該測量的徑向擴散曲線與具有已知流體動力學半徑的組分的一系列分布,從而確定該一種或多種組分中每一種的流體動力學半徑。

18.  根據權利要求16或權利要求17所述的方法,其中步驟(vi)包括使用關于具有已知流體動力學半徑的組分的一系列分布的最高熵正規化方法,使來自步驟(v)的該一種或多種組分的該測量的徑向擴散曲線去卷積,從而確定該一種或多種組分中每一種的流體動力學半徑。

19.  一種在用于測定一種或多種組分的擴散的方法中使用的射流裝置,該裝置包括與兩個上游供應通道流體連通的一個大橫截面通道和與該大橫截面通道流體連通的一個下游小橫截面通道。

20.  根據權利要求19所述的射流裝置,其中該大橫截面通道的最大寬度是該小橫截面通道的寬度的至少2倍。

21.  根據權利要求20所述的射流裝置,其中該大橫截面通道的寬度是該小橫截面通道的寬度的至少10倍。

22.  根據權利要求19至21中任一項所述的射流裝置,其中該小橫截面的寬度是在范圍10至500μm內。

23.  根據權利要求19至22中任一項所述的射流裝置,其中該大橫截面通道的長度是在范圍50至500μm內。

24.  根據權利要求19至23中任一項所述的射流裝置,其中該小橫截面通道的長度是在范圍0.5至50mm內。

25.  根據權利要求19至24中任一項所述的射流裝置,其中該大橫截面通道具有帶有基本上恒定的最大寬度的一個區域,該區域是在其中該寬度收斂至該小橫截面通道的寬度的一個區域的上游。

26.  根據權利要求19至25中任一項所述的射流裝置,該射流裝置被適配為與用于測量該小橫截面通道中的擴散的一個分析裝置相互作用。

27.  根據權利要求19至26中任一項所述的射流裝置,其中該大橫截面通道是與三個上游供應通道流體連通的。

28.  一種用于測定一種或多種組分的擴散系數的方法,該方法包括以下步驟:
(i)提供包含一種或多種組分的一個組分流體流;
(ii)提供一個空白流體流;
(iii)在一個通道中使該流(i)與該流(ii)接觸,從而生成兩個層流;
(iv)在多個擴散時間測量該一種或多種組分從該組分流到該空白流體流中的徑向擴散。

29.  根據權利要求28所述的方法,其中該組分流體流包含兩種或更多種組分,并且步驟(iv)包括在多個擴散時間測量兩種或更多種組分從該組分流到該空白流體流直接的徑向擴散。

30.  根據權利要求28或權利要求29所述的方法,其中該徑向擴散是在三個或更多個擴散時間測量的。

31.  根據權利要求28至30中任一項所述的方法,其中該方法進一步包括該步驟(v),其中一種組分的擴散系數值是由步驟(iv)的徑向擴散測量值確定的,并且任選地流體動力學半徑是由擴散系數值確定的。

32.  根據權利要求31所述的方法,其中步驟(v)包括比較來自步驟(iv)的該一種或多種組分的該測量的徑向擴散曲線與具有已知流體動力學半徑的組分的一系列分布,從而確定該一種或多種組分中每一種的流體動力學半徑。

33.  根據權利要求31或32所述的方法,其中步驟(v)包括使用關于具有已知流體動力學半徑的組分的一系列分布的最高熵正規化方法,使來自步驟(iv)的該一種或多種組分的該測量的徑向擴散曲線去卷積,從而確定該一種或多種組分中每一種的流體動力學半徑。

34.  根據權利要求28至33中任一項所述的方法,其中步驟(ii)提供兩個空白流體流,并且這些空白流體流與該組分流體流接觸并且被提供在該組分流體流的兩側,從而生成三個流體流。

35.  一種確定包含多種組分的流體的組成的方法,該方法包括以下步驟:
(i)提供包含該多種組分的該流體的一個或多個測量的擴散曲線;
(ii)提供具有已知流體動力學半徑的組分的一系列預測的分布;以及
(iii)使用關于具有已知流體動力學半徑的組分的該系列分布的最高熵正規化方法,使該一種或多種組分的該測量的徑向擴散曲線去卷積。

36.  根據權利要求35所述的方法,其中該一個或多個測量的擴散曲線是通過如權利要求1至15、28至30以及34中任一項所述的方法獲得或者可獲得的。

37.  一種用于分析包含一種或多種組分的流體的組成變化的方法,該方法包括在一個第一時間從該流體中獲取一個第一樣品并且進行根據權利要求1至18和28至34中任一項所述的方法,從而確定該流體在該第一時間的該組成;以及在該第一時間之后的一個第二時間從該流體中獲取一個第二樣品并且根據本發明的第一方面或第三方面進行一個分析,從而確定該流體在該第二時間的該組成。

38.  一種用于測定組分在組合物中的濃度的方法,該方法包括進行根據權利要求1至18和28至34中任一項所述的一種方法并且由該組合物的分辨的擴散曲線確定該組分的濃度。

說明書

說明書射流裝置
相關申請
本案要求2012年10月23日(23/10/2012)提交的GB 1219014.6的優先權和權益,該申請的內容通過引用以其全部內容結合在此。
技術領域
本發明涉及用于分析組分混合物如多肽混合物的流動擴散方法和流動儀器。
背景技術
基本上重要或技術上重要的很多系統作為多種異質組分的多分散混合物存在。在此類混合物中個別組分的固有特性的說明在從分析化學到生物物理學范圍的領域內是一個決定性問題。
異質顆粒混合物中的顆粒大小測量在由藥物延伸的領域中是一個常見的問題,其中大小測量判斷治療劑到顏料、油墨和涂料的溶解性和純度,所有這些的納米和微尺度組分的大小必須受到嚴密地控制和監控以確保所希望的功能。
其中微尺度組分的大小是特別重要的并且具有大的定義重要性的領域是蛋白質締合和自組裝的領域;絕大部分蛋白質不是作為單體物質而是作為較大功能性復合物的一部分來實踐其生物功能;如果沒有出現以希望的方式將蛋白質組裝成此類復合物而是形成異常物質,則此異常組裝頻繁地導致機能障礙和疾病。通常用于測量多肽大小的現有生物物理學技術表現最好以用于均質制備純化的組分,而具有很多生物系統特征的均質混合物的定量研究仍具有挑戰性。
基于現有微流體擴散的定量技術[1]主要涉及發現均質溶液[5]中的一種單一物質的大小或者典型地使用熒光標記的物質[8、7、3、11、12、19]測量兩種分離的物質之間的相互作用。還報道了不需要熒光標記樣品的技術[4]。
例如,耶格爾(Yager)等人[11]描述了一種用于光學測量微通道中的橫向分子擴散的T-傳感器。該T-傳感器具有兩個輸入端口,通過這些端口提供一個含分析物流體和一個緩沖液流體。兩個流體物流在T型接頭處接觸并且被允許沿著一個檢測通道并排地流動。在這些流沿著該通道行進時,分析物從分析物流體擴散到緩沖液流體中。作者使用若干種熒光標記蛋白質作為測試分析物,并且這些蛋白質的擴散是通過在該接頭下游的一個測量位置處進行熒光顯微鏡檢查來檢測的。所述的方法集中于單分散分析物溶液的分析。
耶格爾等人注意到由所記錄的實驗擴散數據計算的擴散系數值包括誤差,該誤差涉及在計算中這些流體在整個檢測通道中具有一個充分展開的速度曲線的假設。這個假設是不正確的,如作者所解釋的。實際上,觀察到流體的速率沿著該通道從這些流體首先接觸的停滯點(在該接頭處的零級流動區域)開始加快到也在下游一個點處充分展開的速率。為了補償較緩慢的流體流動的此區域,作者描述了解釋并定量流動發展的計算方法。作者自己承認,這些溶液的數值計算是粗糙的,緩慢計算(約1天的計算時間),并且僅可以給出關 于在所謂流動發展區域中擴散效應大小的意見。由此,由記錄的數據計算的擴散系數不能適當地補償在T型接頭處的流體停滯。
US 2006/263903描述了加號(+)形狀的微通道網絡測定一種樣品溶質的分子量和擴散率的用途。在此,一個單一分析物流體流在一個交叉點與一個單一空白流體流接觸。這些流隨后分離,其中每個流在一個單獨的出口通道中離開該接觸區域。對于一個范圍的不同分析物和空白流體流速,測定已分散到接觸區域中的空白流體流中的分析物的量。分析物的擴散率和分子量是通過比較所記錄的擴散曲線與由標準分子的擴散生成的一個擴散率曲線數據組來測定的。所述的方法集中于單分散分析物溶液的分析。
本領域還已知用于基于一個流體通道中的一種物質的泰勒(Taylor)分散確定擴散特征的替代性射流方法。例如,US 2011/264380描述了用于測定多分散物質的流體動力學半徑的方法。將有待分析的物質與一個單分散標準混合。將所得的混合物添加到沿著一個毛細管流動的一個載體流體中并且在該混合物排出該毛細管時記錄它的泰勒曲線。
如US 2011/284380所注意到的,泰勒分散方法不適用于多分散混合物,因為所獲得的結果簡單地是一個平均信號,該平均信號反映了該混合物的全局特征而不是該混合物中每種組分的單個貢獻。US 2011/264380通過使用一種多分散樣品內的一個內部標準來部分解決這一點,該標準提供了對該平均信號的一個已知貢獻。例如,在分析一種多分散聚合物產品的情況下,可以存在一種單體前體的一種內部標準。然后可以推導出多分散物質對于總體信號的貢獻,并且可以測定多分散物質的平均流體動力學半徑。然而,此方法僅可以提供一種多分散混合物的平均流體動力學半徑。此外,基于泰勒分散的方法需要一個擴散的時間分辨的測量,這與通過耶格爾等人[11]描述的穩態方法相比典型地具有一個更低的敏感度。
本發明人已開發了考慮到在流動通道中分析組分擴散的這些問題的分析方法。
發明內容
本發明大體上提供了一種用于測定一種組分、包括一種多分散組分混合物的擴散系數的方法。具體地說,該方法可用于測定在一種混合物中的一種組分、優選地兩種或更多種組分的流體動力學半徑。本發明方法特別適用于分析聚合物混合物如蛋白質混合物。還提供了一種用于分析方法中的射流裝置。
本發明的方法和裝置可用于以比現存方法提高的準確度測定一種組分的擴散系數和流體動力學半徑。在一些方面,本發明的方法和裝置解決了在一個微型通道中的流體停滯的問題并且使得從停滯點延伸的流體發展區域最小化,從而允許在一個減小的時間內形成一個穩定流。
本發明的方法允許有待隨著時間測量的一種或多種組分的擴散。以這種方式,該方法可以用于研究這些流體的組成變化,并且更具體地說用于研究一種組分以另一種相同組分或一種不同的組分的相互作用。例如,本發明可以用于監控這些流體中的組分的聚集,如多肽的聚集。一種混合物隨著時間的擴散曲線變化可以用于進行組分聚集物的生成和分離。
使用擴散方法的另一個一般優點是研究天然狀態下的生物分子如蛋白質的機會。
在本發明的一個第一方面,提供了一種用于測定一種或多種組分的擴散系數的方法,該方法包括以下步驟:
(i)提供包含一種或多種組分的一個組分流體流;
(ii)提供一個空白流體流;
(iii)在一個大橫截面通道中使該流(i)與該流(ii)接觸,從而生成兩個層流;
(iv)允許在(iii)中生成的這些層流從該大橫截面通道中流入一個小橫截面通道中;
(v)在該小橫截面通道中測量該一種或多種組分從該組分流到該空白流體流中的徑向擴散。
在一個實施例中,在該方法中的步驟(i)提供一種包含一種或多種組分的組分流體流。
在一個實施例中,該組分流體流和該空白流體流是水流。
在一個實施例中,在步驟(ii)中提供兩個空白流,并且這些空白流被提供在大橫截面通道的組分流的一側,從而在步驟(iii)中在大橫截面通道中生成三個層流。
在本發明的一個第二方面,提供了一種用于本發明的第一方面的方法中的射流裝置,該裝置包括與兩個上游供應通道流體連通的一個大橫截面通道和與大橫截面通道流體連通的一個下游小橫截面通道。
在本發明的第一方面的方法中,這些供應通道可以被提供用于一個組分流體流和一個空白流體流。射流裝置被適配為用于檢測流體流中的一種或多種組分的一種分析裝置。該分析裝置用于測量一種或多種組分在一個小橫截面通道中的擴散。
在一個流體中存在多于一種組分的情況下,在此所述的方法允許測定每個組分的擴散系數,而不是組分混合物的一個平均擴散系數。記錄的擴散曲線的去卷積可以通過在不同擴散時間記錄多個擴散曲線,這具有減小記錄的數據的噪音水平的益處。
在本發明的一個第三方面,提供了一種用于測定一種或多種組分的擴散系數的方法,該方法包括以下步驟:
(i)提供包含一種或多種組分的一個組分流體流;
(ii)提供一個空白流體流;
(iii)在一個通道中使該流(i)與該流(ii)接觸,從而生成兩個層流;
(iv)在多個擴散時間,例如在三個或更多個擴散時間測量該一種或多種組分從該組分流到該空白流體流中的徑向擴散。
提到多個擴散時間是提到在沿著流動通道的不同位置記錄的徑向擴散測量。因此,一個第二測量點可以位于一個第一測量點的通道下游。另外的測量點可以位于也沿著該通道下游的位置。
在一個實施例中,在該方法中的步驟(i)提供一種包含一種或多種組分的組分流體流。因此,步驟(iv)包括在多個擴散時間測量兩種或更多種組分從該組分流到該空白流體流中的徑向擴散。
在一個實施例中,該組分流體流和該空白流體流是水流。
在一個實施例中,在步驟(ii)中提供兩個空白流,并且這些空白流被提供在大橫截面通道的組分流的一側,從而在步驟(iii)中在大橫截面通道中生成三個層流。
在一個實施例中,該方法進一步包括步驟(v),其中一種組分的一個擴散系數值是由步驟(iv)的徑向擴散測量值確定的,并且任選地流體動力學半徑是由擴散系數值確定的。
在一個實施方案中,步驟(v)包括比較來自步驟(iv)的一種或多種組分的測量的徑向擴散曲線與具有已知流體動力學半徑的組分的一系列分布,從而確定該一種或多種組分中每一種的流體動力學半徑。
在一個實施方案中,步驟(v)包括使用關于具有已知流體動力學半徑的組分的一系列分布的一種最高熵正規化方法,使來自步驟(iv)的一種或多種組分的測量的徑向擴散曲線去卷積,從而確定該一種或多種組分中每一種的流體動力學半徑。在此實施例中,可以使用一種最小平方分析。具有已知流體動力學半徑的組分的該系列分布可以是一系列預測的分布。
在本發明的另一個方面,提供了一種確定包含多種組分的一個流體的組成的方法,該方法包括以下步驟:
(i)提供包含該多種組分的該流體的一個或多個測量的擴散曲線;
(ii)提供具有已知流體動力學半徑的組分的一系列預測的分布;以及
(iii)使用關于具有已知流體動力學半徑的組分的該系列分布的一種最高熵正規化方法,使該一種或多種組分的測量的徑向擴散曲線去卷積,從而確定該一種或多種組分中每一種的流體動力學半徑。
在一個實施例中,確定一個流體的組成的方法提供基于該流體中每種組分的流體動力學半徑的一個組成曲線。
在步驟(i)中的測量的擴散曲線可以是通過根據本發明的第一方面或第三方面的一種方法獲得或可獲得的。
在本發明的另一個方面,提供了一種用于分析包含一種或多種組分的一個流體中的組成改變的方法,該方法包括以下步驟:在一個第一時間從該流體中獲取一種第一樣品并且根據本發明的第一方面或第三方面進行一個分析,從而確定該流體在該第一時間的組成;以及在該第一時間之后的一個第二時間從該流體獲取一個第二樣品并且根據本發明的第一方面或第三方面進行一個分析,從而確定該流體在該第二時間的組成。
該方法可以包括在隨后的時間獲取另外的、如第三樣品和第四樣品并且根據第一方面或第三方面進行一個分析。
該方法允許生成有待檢測的組分的聚集物并且允許分離有待檢測的組分。反應速度可以是由這些結果確定。
本發明的其他方面和本發明的不同實施例為如在此所述的。
附圖說明
圖1a是根據應用的本發明的一個實施例的一個射流裝置的一部分的示意圖,其中圖像顯示在噴嘴處的一個組分流體流的分布(在此情況下,是牛血清白蛋白和β乳球蛋白在水中的混合物)和在沿著測量通道(小橫截面通道)的1mm、3mm和9mm處的三個測量區域。空白流(黑色)被提供在組分流(白色)的一側。
圖1b是圖1b的示意圖的平面圖。
圖2包括涉及使用具有25nm和100nm半徑的熒光標記組分(膠質)的一種50:50混合物(按體積計是0.1%)校準圖1的射流裝置的圖表。A:徑譜通過使用最大熵正規化記錄的分布數據的一種最小平方分析(底部光譜)生成,并且與這些膠質中每一種的均質溶液的徑譜(頂部光譜和從頂部光譜起的第二個光譜)相比較。在此還示出了由在三個測量點(底部光譜)與一個單一測量點(從底部光譜起的第二個光譜)下記錄的數據生成的徑譜之間的比較。使用多個測量點提供了具有較大準確度和較大分辨率的分辨譜。B:組分混合物在沿著該通道的1mm、3mm和9mm處的三個不同測量點的分布以及對于通過最小平方算法生成的這些分布的擬合。
圖3示出了在120分鐘內由單體生長的的Aβ(1-42)聚集物的大小分布。A:隨著時間的ThT熒光強度-在0分鐘時(在任何聚集之前)、在30和50分鐘時(在生長期之前和期間)、以及在單體已耗盡之后的120分鐘內獲取等份樣品。B:大小分布發現使用以最大熵正規化擬合的最小平方。溶液最初是單體,在形成低聚物、原纖維以及最終的宏觀原纖維“叢”之前。
圖4示出了接頭,該接頭是其中一個組分流體流(白色)在三個不同的噴嘴或大橫截面通道中遇到兩個空白流體流(黑色)的點,這些噴嘴或通道從左開始具有300μm、1,000μm和3,000μm的寬度,其中該寬度是指該噴嘴中的最大橫截面,該寬度比在接頭處的組流體流的寬度(即,具有30μm、100μm和300μm的寬度)寬十倍。大橫截面通道允許建立一個清潔且限定的組分流,它在接頭處具有一個減小的滯留時間(減小的停滯)。流速是4μLh-1并且組分是一種25nm膠質。
圖5示出了微流體擴散光譜法的分辨率的數值評估,其中(A)是當用不同水平的隨機噪聲分辨的一種單一物質時在一個單峰的位置上的分數誤差,并且(B)是在不同水平的隨機噪聲下分辨兩種物質之前這兩種物質之間的最小分數差分。
圖6示出了在個別均質溶液中的A(胰高血糖素)、B(β乳球蛋白)、以及C(BSA)和作為所有三種物質的1:1:1混合物的D的大小分布,表示為流體動力學半徑。在365nm下使用一個倒置顯微鏡上的LED光源照射樣品并且使用一個高量子產率CCD照相機檢測這些樣品。一個樣品的穩態分布的測量的持續時間是10s。在出口處的總流速是40μLh-1。
圖7示出了BSA在pH 7緩沖液的溶液和在80%DMSO的溶液中的流體動力學半徑,如通過本發明的一種方法測定的。
圖8示出了(a)純化的αB-晶狀體蛋白的SDS-PAGE分析。與在變性條件下出現的大約20kDa相對應的條帶與純的單體αB-晶狀體蛋白的預期分子質量20,159Da一致;并且示出(b)未處理的和OPA-標記的αB-晶狀體蛋白的MALDI-MS分析。在OPA-標記時出現的m/z-位移與大約2,200Da相對應。考慮到每個標簽修飾增加176Da質量,這些結果表明完全標記每個αB-晶狀體蛋白分子的11個胺(10個伯胺和N-末端胺)。
圖9示出了(a)30uMαB-晶狀體蛋白在本發明的射流儀器中的擴散曲線。對于在1、3和9cm處的三個測量點的擴散曲線描繪熒光強度對比通道位置的實驗數據(實線)和相關擬合(虛線),其中在90μm通道位置從頂部到底部的曲線與1、3和9cm曲線測量值相對應。并且示出了(b)30uMαB-晶狀體蛋白的大小分布。兩個群體代表單體和低聚體αB-晶狀體蛋白。
圖10示出了用DLS(暗線)和本發明的微流體裝置(淺線)測量的30μMαB-晶狀體蛋白的大小分布。擴散光譜法允許檢測低大小的物質(約2nm)和低聚體物質(約6nm)。DLS專門揭示了反映αB-晶狀體蛋白的低聚體形式的一個廣泛大小分布峰(中心在約8nm處)。
圖11示出了(a)使用αB-晶狀體蛋白的一個蛋白質轉位實驗的電流跟蹤。在一個負電壓-500mV下使用50kHz貝塞爾濾波器進行這些實驗;并且示出了(b)顯示轉位實驗中的平均事件電流與事件持續時間之間的關系的一個二維散點圖。事件的頻率是通過側面標度所示的陰影表示的。
圖12示出了在(a)15μM、(b)30μM、(c)50μM、以及(d)125μM單體蛋白質濃度下的αB-晶狀體蛋白的大小分布,如通過根據本發明的擴散光譜法測量的。
圖13示出了脂質體的大小分布,如通過根據本發明的擴散光譜法測量的,其中這些脂質體具有(a)15nm和(c)50nm擠出半徑和(e)二者的一個1:1混合物。各個曲線表示在沿著擴散通道(在1、3和9cm處,其中在90μm通道位置上從頂部到底部的曲線與1、3和9cm曲線測量相對應)的不同測量點的擴散。對于所有三個測量點,穿過微型通道的熒光強度曲線(虛線)與對應最小平方擬合(實線)一起描繪。具有(b)15nm和(d)50nm擠出半徑的脂質體和(f)二者的一個1:1混合物的大小分布,如使用DLS(暗線)和微流體擴散(淡線)測量的。在大約4nm處的峰與游離的標記的脂質相對應。僅擴散光譜測量值確定此物質。
具體實施方式
本發明提供一種用于分析一種組分從一個流體流中擴散到另一個流體流中的方法。本發明人已發現對于一個標準T型接頭流裝置的改變允許以較大準確度測量該組分的擴散。具體地說,本發明人已發現當流體在接頭處接觸時使它們的停滯最小化或消除該停滯的一種方式。
如在此所述的,本發明人已發現在其中組分和空白流接觸的接頭處使用一個大橫截面通道使流體停滯對擴散分析的有害影響最小化。如以下所述的,大橫截面通道可以是在例 如比下游通道寬度更寬十倍的區域中,其中進行擴散測量。本發明人已確定一個大橫截面通道在接頭處提供一個清潔且限定的組分流。因此,本發明人已將一個大橫截面通道引入用于測量組分擴散的一個射流裝置中。在大橫截面通道下游是一個小橫截面通道,該小橫截面通道是檢測通道。
使用一個大橫截面通道被認為提高多種益處。首先,其中建立流的區域由于對于一個給定的流速(flow rate)相對更低的流動速度(flow velocity)而縮短。第二,由于接頭到小流動通道的相對大小減小,較小比例的組分進入零級流動區域。第三,擴散相對于通道寬度w的凈效應減小,因為速率尺度是1/√w并且因此擴散距離是√w。
這些效應的結果將在組分流和空白流進入小橫截面通道時,提供用于組分流中的組分的良好限定的初始構型。因此,使用一個大流動通道是在例如小寬度通道下游的通道中建立一個恒定速率曲線之前使顆粒擴散最小化的一種有效方式,在該小寬度通道中進行擴散測量。
本發明的方法包括測量組分從一個組分流到一個相鄰空白流中的徑向擴散的步驟。從這些測量中,最終可以測量樣品中的一種組分的擴散系數。雖然可以由一個單一測量值測定一種組分或一種
組分混合物的一個擴散系數,本發明人已發現沿著小橫截面通道的多個擴散測量提供準確的擴散系數值。
在組分流包含兩種或更多種組分的情況下,鑒于逆變換相對于擴散系數組合的近退化,一個單一擴散曲線的去卷積是特別具有挑戰的。為了實現個別組分的分辨,在多個位置、例如在三個或更多個位置處測量這些組分到空白流中的擴散性傳播。
每個測量值因此對應于一個不同的擴散時間。使用多個擴散曲線減小了基底函數之間的退化。本發明人已確定使用多個測量點提供了分辨的徑譜,該徑譜具有較大準確度(即,預測的組分大小更緊密地配合流體中的組分的實際大小)并且具有更大的分辨率(例如,可以區分具有更接近的半徑的組分)。
本發明的流動方法允許在不同擴散時間同時測量的組分的空間分布。以這種方式,可以完全分辨在復雜混合物中個別組分的擴散系數的分布譜。這使得本發明優于先前所述的方法,該先前所述的方法僅提供多分散組分混合物的平均擴散系數值。
由于使用小流體通道、特別是微流體通道,所以可以分析非常小的樣品體積。因此,在小于一微升體積的流體中提供的組分可以是通過在此所述的方法進行分析的。另外,流體流動技術還可以用于通過適當增加測量次數來分析非常稀的樣品。
此外,擴散光譜法對于在這些流中使用的溶劑條件的性質特別不敏感。因此,可以研究在其天然條件下的生物分子如蛋白質。以這種方式,擴散測量可以提供生物組分的絕對大小值,并且對于分析不需要包括將外源條件下獲得的一個大小測量值轉換成在天然條件下的一個預期大小的一個校準步驟。
具有帶有不同大小的通道的微型裝置是已知的,然而此類裝置不被適配用于測量一種或多種組分穿過一個通道的擴散。本發明人已發現在一個大橫截面通道中發展一個層流,然后使該層流進入一個小橫截面通道,提供了一種用于研究組分穿過該層流的移動的改進的方法。EP 1,481,723描述了一種用于使流體混合并反應的微型裝置。該微型裝置包括以一個同軸的多個圓柱形結構安排的一系列流體供應通路。流體在該裝置的同軸通道內流動,并且這些流被允許在一個反應流動路徑中結合在一起,以形成一個薄層形狀的層流。在下游,減小反應流動路徑的寬度以便使該流動收縮。
EP 1,481,723并未描述用于測量組分在層流之間的移動的方法,并且它并未描述用于測定那些組分的擴散系數的方法。在EP 1,481,723裝置中的通道安排將允許所有組成從一個流快速擴散到另一個流,其目的是為了在一個短時間內實現所有組成的均勻分布。這據說對于避免非均相反應通路是重要的。在用于測量擴散系數的一個裝置內,所有物質的快速擴 散是不希望的,因為它不會允許區別不同大小的多種組分(即,不同的擴散系數)。此外,快速擴散可能不允許在一種組分已擴散到通道邊緣之前進行一個擴散測量。EP 1,481,723的教義因此與改進的擴散測量系統的發展不相關。
擴散
由進行布朗運動的一個顆粒表現出的平均均方位移與其擴散系數D直接成比例并且與其流體動力學半徑rh成反比,這是允許簡單評估由平均均方位移獲得的分子大小的愛因斯坦關系(Einstein relation)。當各自具有一個不同的擴散系數的物質的一種混合物存在于溶液中時,情況更復雜。
所得擴散曲線的形狀可以被認為是含有關于存在于溶液中作為一個線性疊加的所有物質的流體動力學半徑的全光譜的信息。然而,這個曲線到對應于分散物質的高斯維爾斯特拉斯核的總量的逆變換對于實驗噪音是非常敏感的。因此,此方法作為在異質混合物中進行測量的基礎通常并不實際。
為了克服此困難,本發明人已開發了一種方法,該方法允許由最初位于空間(在組分流體流中)中的分析物組分的布朗運動所形成的擴散曲線在它們傳播穿過小橫截面通道到達空白流體流中時同時持續多次擴散時間進行測量。
本發明的一個方面涉及使用一個大橫截面通道,該大橫截面通道解決了在接頭處的零級流動的問題,在該接頭處該組分流與該空白流第一次接觸。大橫截面通道的一個優點是它迫使這些組分進入良好限定的初始構型中。以這種方式準確定位這些組分確保了所記錄的擴散數據更能代表一個預測的擴散曲線。
可以與該第一方面有利地結合的本發明的另一個方面是沿著一個擴散通道使用多個分析測量點。在不同擴散時間的測量減小了基底函數之間的退化,并且允許擴散系數以更大的準確度和更大的確定性進行測定。
在本發明的方法的一個一般方面中,一種組分被允許從該組分流移動到小橫截面通道中的緩沖液流中。這可以被稱為該組分穿過一個通道的徑向移動。
在一個實施例中,一種組分被允許從該組分流(一個高組分濃度區域)中擴散到緩沖液流(并且是一個低組分濃度區域)。在此,該組分的移動是簡單的擴散運輸。
在一個替代實施例中,一種組分從組分流到緩沖液流中的移動是對施加電場的響應。因此,擴散可以被稱為該組分的電泳擴散。在該通道內的組分流是響應于施加電場而偏轉。偏轉程度與施加場和組分的凈電荷有關。將了解的是,具有不同電荷的組分可以通過其響應于施加場的不同偏轉分開穿過該通道。在此實施例中,使流動發展區域最小化也是有利地,因為這使流體停滯最小化。在知道施加場和偏轉程度(從電泳擴散曲線)的情況下,技術人員能夠測定組分在流體中的電泳遷移率和電荷。
通過赫林(Herling)等人[37]描述了在一種微流體裝置中的電泳擴散技術的一般用途。
本發明的方法適用于與允許一種組分穿過通道徑向移動的其他技術一起使用。這可以被廣泛地稱為擴散。在一個實施例中,擴散是指以上所述的擴散運輸。
一般方法
本發明的第一方面的方法通常用于測定在一個溶液中的一種或多種組分如聚合物的擴散系數。在一個大橫截面通道中使包含該一種或多種組分的一個流體流與一個空白流體流接觸。允許層流從該大橫截面通道中流入一個小橫截面通道中。在沿著該小橫截面通道中的一個或多個位置處測量該一種或多種組分到該空白流體流中的徑向擴散。通過一個或多個擴散曲線,可以確定該一種或多種組分的擴散系數和大小和/或分子量。
該大橫截面通道和小橫截面通道是一種射流裝置的部分。該射流裝置被適配為與用于這些組分的一種檢測器一起使用。
在分析步驟過程中以一個基本上恒定的水平維持每個流的流速。僅可以當在該小截面通道中建立一個穩定流時進行分析。
本發明的第三方面的方法通常用于測定在一個溶液中的一種或多種組分如聚合物的擴散系數。在一個通道中使包含該一種或多種組分的一個流體流與一個空白流接觸。在沿著該通道的多個位置處測量該一種或多種組分的擴散。通過該多個擴散曲線,可以確定該一種或多種組分的擴散系數和大小和/或分子量。
該通道是一種射流裝置的一部分。該射流裝置被適配為與用于在該通道中的多個位置處的這些組分的一種檢測器一起使用。該通道是與用于空白流和組分流的供應通道流體連通的。
在分析步驟過程中以一個基本上恒定的水平維持每個流的流速。僅可以當在該通道中建立一個穩定流時進行分析。
在本發明的其他方面,一種射流裝置可以用于測定在組分流中的多種組分的總濃度。在此,所記錄的擴散信號的強度(如通過在此所述的方法獲得的)可以用于直接獲得這些組分的總濃度。在一些實施例中,可能需要提供額外試劑以允許獲取準確濃度讀數。例如,在組分流包含多肽的情況下,在分析測量之前使這些多肽變性可以是有利的。出于此目的,可以在緩沖流中提供一種變性劑如DMSO。
另一方面用于通過獲取含有一種組分的流體樣品并且獲得每種樣品的擴散曲線來監控該組分隨著時間的變化(或無變化),如聚集和分離。擴散曲線隨著時間的變化可以指示聚集或分離事件。
射流裝置
本發明的第一方面的方法利用一種射流裝置,該射流裝置包括與一個小橫截面通道流體連通的一個大橫截面通道。每個大通道和小通道的橫截面典型地是在微米范圍內,并且用于本發明的第一方面的方法中的該射流裝置可以因此被稱為一種微流體裝置。
本發明還提供在此所述的微流體裝置。
微流體通道保持該組分和空白流的用途確保這些流以低雷諾數(Reynolds number)出現,并且因此對流和擴散是在該系統內質量輸運的僅有相關機制。因此,這允許對給定大小的每種組分進行準確的數值計算。
選擇該裝置中的這些通道的總體尺寸以提供合理的移動速度和分析時間。還可以選擇該裝置的尺寸以減小持續一個足夠的分析運行所需要的流體的量。
大橫截面通道和小橫截面通道是具有允許在兩個(或三個)物流中生成并保持一個層流的適合尺寸的那些通道。兩個物流的層流意指這些流是并排地并且是穩定的。因此,典型地不存在其中這些流體再循環的區域并且湍流是最少的。典型地,通過小通道如微型通道提供此類條件。
用于分散測量的裝置是本領域已熟知的,并且例如通過耶格爾等人[11]進行描述。本發明人已在此類裝置的接頭處引入一個大橫截面通道。
該大橫截面通道是其中組分溶液的流體與空白溶液的流接觸的區域。然后這些流通過大橫截面通道導向小橫截面通道中。在小橫截面通道中監控該一種或多種組分到該空白流中的擴散。
大橫截面通道是與小橫截面通道流體連通的。
大橫截面通道是與用于供應空白流體的一個或多個儲罐流體連通的。
大橫截面通道是與用于供應組分流體的一個儲罐流體連通的。
可以通過一個供應通道從一個儲罐向大橫截面通道提供流體。因此,該裝置可以包括一個組分流體流供應通道和一個空白流體流供應通道。
在此提到一個通道是提到具有一個基本上矩形的橫截面的一個通道。因此,該通道可以是由一個基本上平的基底(具有基本上垂直于該基底延伸的多個壁)和任選一個頂蓋形成的。典型地,該基底和這些壁被形成為一個硅襯底。該蓋可以是一個玻璃蓋,例如一個標準玻璃載片或一個硼硅酸鹽晶片。
大截面通道可以被稱為一個收斂噴嘴。
大橫截面通道可以具有帶有一個基本上恒定的最大寬度的區域,然后在下游是一個收斂區域,在該收斂區域中通道的寬度變窄直到該寬度匹配小橫截面通道的寬度為止。
或者,大橫截面通道可以僅包括一個收斂區域,在該收斂區域中該通道的寬度從一個最大寬度變窄直到該寬度匹配小橫截面通道的寬度為止。
收斂區域變窄的速度可以是恒定的。
收斂區域變窄(噴嘴的角度)的精確速度并沒有特別限制,因為該變窄通常遠離組分流。然而,本發明人已大體上發現噴嘴具有范圍40°至70°、如50°至70°、如55°至85°內的角度。在此,該角度是相對于組分流在寬橫截面通道中的流動方向。
提到寬度是提到該通道中的擴散尺度(在一些現有技術參考文獻中被稱為d)。
大橫截面通道的最大寬度w是大于小截面通道的寬度的。
在一個實施例中,沒有截面是具有比小橫截面通道的寬度更小的寬度的大橫截面通道。在一個實施例中,大橫截面通道的最小寬度是與小橫截面通道的寬度相同的。
大橫截面通道的最大寬度w可以是至多500μm、至多700μm、至多1,000μm、至多2,000μm、至多5,000μm或至多10,000μm。
通常大于10,000μm的通道寬度是不實際的,因為制成該裝置的材料(典型地是PDMS)可能會松弛。
大截面通道的最大寬度w可以是至少50μm、至少100μm、至少200μm或至少500μm。
在一個實施例中,大橫截面通道的最大寬度可以是在選自上文所給出的上限值和下限值的范圍內。例如,該寬度可以是在范圍200至5,000μm、如200至1,000μm或如1,000至5,000μm內。
大截面通道的長度是至多500μm、至多700μm或至多1,000μm。
大截面通道的長度可以是至少10μm、至少50μm、至少100μm或至少200μm。
在一個實施例中,大橫截面通道的長度可以是在選自上文所給出的上限值和下限值的范圍內。例如,該長度可以是在范圍50至500μm、如100至500μm內。
在大橫截面通道包括具有帶有基本上恒定的最大寬度的一個區域和其中寬度收斂至小橫截面通道的寬度的一個下游區域,具有帶有基本上恒定的最大寬度的該區域可以是該大橫截面通道總長度的至少50%、至少60%、至少70%、至少80%或至少90%。
小截面通道在其整個長度上具有一個基本上恒定的寬度。
小截面通道的寬度可以是至多500μm、至多700μm、至多1,000μm或至多2,000μm。
小截面通道的寬度可以是至少5μm、至少10μm、至少50μm、至少100μm或至少200μm。
在一個實施例中,小橫截面的寬度可以是在選自上文所給出的上限值和下限值的范圍內。例如,該寬度可以是在范圍10至500μm。
在一個實施例中,大截面通道的最大寬度是小截面通道的寬度的至少1.2倍、至少1.5倍、至少2倍、至少5倍或至少10倍。
在一個實施例中,大截面通道的最大寬度是小截面通道的寬度的至多20倍、至多50倍或至多100倍。在一個實施例中,大橫截面通道相對于小截面通道的最大寬度可以是在選自上文所給出的上限值和下限值的范圍內。例如,大橫截面通道的最大寬度可以是在小截面通道寬度的5至20倍范圍內。
小截面通道的長度可以是適用于允許組分流中的最大組分擴散到形成空白流邊界的通道邊緣的長度。因此,在流體流到達小截面通道末端時,存在于組分流中的所有組分已到達最大熵構型中。
在其他實施例中,小截面通道具有允許檢測空白流中的最大組分的一個足夠的長度。在此,不需要最大組分到達其最大熵構型中。
大截面通道的長度是從空白流體流和組分流體流接觸的點到大截面通道的通道寬度匹配小截面通道寬度的點的距離。
小截面通道從大橫截面通道接收空白流體流和組分流體流。可以收集從小橫截面通道排出的流體以用于進一步分析。因此,小橫截面通道是與一個樣品收集儲罐流體連通的。
小截面通道的長度是足以允許最大的分子從該流中擴散到該空白流中的。對于具有在此所述的分子量的聚合物,具有1mm長度或更大長度的小截面通道長度通常是足夠的。在一個實施例中,小截面通道是至少0.5mm、至少1mm、至少2mm或至少5mm長。
在一個實施例中,小截面通道是至多10mm、至多20mm或至多50mm長。
在一個實施例中,小橫截面長度可以是在選自上文所給出的上限值和下限值的范圍內。例如,該小截面通道長度可以是在范圍0.5至50mm、如1至20mm內。
這些流體的流動是沿著小橫截面通道的縱軸。在組分流中的組分到空白流中的擴散是橫向于流動的縱軸,穿過通道寬度。
小橫截面通道可以是基本上直線的并且與大橫截面通道一致。在一些實施方案中,該小截面通道的至少一部分是旋繞的。因此,該小截面通道可以例如包括一個圈或一系列圈。使用旋繞的幾何結構允許使該裝置的大小最小化。使用旋繞的路徑也可以在一個單一檢測區域內提供多個流動通道。在一個單一檢測區域內,多個通道(與不同流動距離相對應并因此具有不同擴散時間)可以穿過一個檢測器以允許進行多個且同時的測量。
小橫截面通道可以是與一個次要射流裝置的一個流體通道流體連通的。該次要射流裝置可以是用于分析該流中的這些組分的一種物理性質或化學性質的一種裝置。
因此,本發明可以用其他射流裝置串聯地使用以獲得流體流中的組分的特征數據。
微流體裝置可以被提供有供應通道,以在該儲罐與大橫截面通道之間提供流體連通。在兩個空白流被提供到大橫截面通道中的情況下,每個空白流可以被獨立地從不同儲罐中遞送出來。然而,每個流體空白流可以是從一個單一儲罐中提供,該儲罐通過兩個供應通道連接到大橫截面通道。
每個儲罐可以是連接到微流體裝置的一個供應管線的一個注射器。該注射劑可以是在適當編程的計算機控制下,該計算機能夠大致地(indecently)控制流體從該儲罐到該大截面通道的流速。此類裝置的控制是本領域已熟知的。
或者,每個儲罐可以作為微流體裝置的部分來提供。
在其他實施例中,來自一個或多個儲罐的流體流可以是一個重力供料。
根據本發明的并且用于在此所述的方法中的一種射流裝置可以是使用本領域已知的標準技術制備的。因此,可以使用光刻法以一種適當襯底如一種硅樹脂襯底形成流體通道和任選地流體儲罐耶格爾等人[11]所述的技術可以與對光刻掩膜的適當改變一起用于在適當時適應一個大橫截面通道和額外空白流通道的引入。
通過光刻技術制備的流體通道可以是通過提供流體接近端口和排出端口,例如通過鉆入該襯底中以提供對相關通道的接近來完成。在外部儲罐如注射器用于將流體直接供應到大橫截面通道或者供應到一個供應通道中的情況下,可以使用一種適當的歧管。
射流裝置可以與適當編程且可編程的計算機結合用于控制進入大橫截面通道中的流動并且用于管理檢測裝置。該計算機也可以分析所記錄的數據并且提供實時擴散值。
該裝置適用于與一種檢測器整合,以用于測量在小橫截面通道中的該一種或多種組分的徑向擴散。
可以選擇通道深度以減小分析擴散穿過通道寬度的時間尺度(從而減小接近穩態溶液所使用的時間)。可以選擇通道的深度以便使與最深通道相關的人工制品最小化或消除該人工 制品(參見耶格爾等人,生物物理學(Biophysical))。可以選擇通道的深度以便使與非常淺的通道相關的負載問題和高流體阻力最小化或消除這些問題和阻力(出處同上)。
在一些現有技術參考文獻中,通道的高度或深度被稱為寬度w。
縱橫比是通道寬度與通道高度的比率,它可以是100或更小、50或更小、25或更小或者10或更小。
縱橫比可以是1或更大、2或更大、4或更大或者5或更大。
在一個實施例中,縱橫比可以是在選自上文所給出的上限值和下限值的范圍內。例如,該縱橫比可以是在范圍5至100內。
通常較大縱橫比如4或更大是有利的,因為充分展開的速度曲線穿過通道高度將是拋物線的并且穿過通道寬度將是近似鈍形的(參見耶格爾等人,生物物理學)。
大截面通道和/或小截面通道的通道高度(或通道深度)并沒有特別限制,除以上所討論的考慮因素之外。大橫截面通道和小橫截面通道的通道高度可以是相同的。通道高度貫穿該大橫截面通道和小橫截面通道是基本上恒定的。在一個實施例中,通道高度是至少5μm、至少10μm或至少15μm。
在一個實施例中,通道高度是至多30μm、至多50μm、至多100μm或至多500μm。
在一個實施例中,通道高度可以是在選自上文所給出的上限值和下限值的范圍內。例如,該通道高度可以是在范圍10至50μm內。
由現有技術已知的通道典型地具有范圍10至100μm內的深度(參見耶格爾等人,[8、11和12])。
如以上所注的,可以相對于通道的寬度選擇通道的深度以提供一個適合的縱橫比。
不需要彼此分離這些層流以便進行分析性分析。分析測量可以穿過組分流和空白流二者來記錄。
本發明的第三方面的方法利用一種射流裝置,該射流裝置包括與用于空白流和組分流的供應通道流體連通的一個通道。在本發明的此方面通道的尺寸可以與在本發明的第一方面和第二方面的方法和裝置中的小橫截面通道的尺寸相對應。
本發明的裝置可以包括與大橫截面通道流體連通的供應通道。每個供應通道的尺寸并沒有特別限制并且可以與小橫截面通道相似或相同。在一個實施例中,每個供應通道具有大于小橫截面通道的寬度的一個寬度。在一個實施例中,每個供應通道具有小于小橫截面通道的寬度的一個寬度。
在一個實施例中,本發明的方法利用電泳擴散來允許一種組分移動穿過該流體流,例如從組分流移動到緩沖液流。例如,射流裝置可以被提供有與擴散通道(小橫截面通道)相鄰地安排的電極并且這些電極可以被適配用于與一個電源和控制器電連通,以控制電壓和電流。通過席琳等人[37]描述用于指導一個流體通道中的組分移動的適合儀器.
檢測
本發明的某些方法包括測定一種或多種組分穿過一個流體通道的分布的步驟。對于測量一種聚合物到空白流中的擴散的方式并沒有特別的限制,并且所采用的檢測方法可以是基于有待檢測的組分的性質。
該檢測器是適用于與流體流通道并且特別是微流體通道一起使用的一種檢測器。擴散檢測方法是本領域已熟知的,并且例如通過耶格爾等人[11]進行描述。實例包括紫外可見光法、熒光或發光光譜法、以及其他方法。
可以在小橫截面通道的一個位置處確定這種或這些組分的分布。然而,特別是在存在兩種或更多種組分的情況下,可以在沿著較小橫截面通道內的兩個或更多個如三個、四個或五個位置處確定組分分布。如以上所注的,該方法可以包括確定多種組分在小寬度通道的多個位置處的擴散曲線的步驟。
在組分流中的一種組分已擴散到裝置邊界的通道邊緣到空白流體流之前應記錄至少一個擴散測量值。將最快擴散到通道邊緣的組分是組分流中的最小組分。
對于未知組成的一種樣品,可以建立一個試驗流,以確定第一組分到達邊界邊緣的哪一點。第一擴散測量值可以因此在此點的上游獲取。
或者,可以在小橫截面通道的一個非常早的點處進行一個第一擴散測量。
在沿著小橫截面通道進行多次擴散測量的情況下,每個第二測量并隨后沿著該通道的測量位置并沒有特別限制。典型地,在沿著小截面通道的足夠遠的距離處獲取隨后的測量值以獲得與先前測量值的有用差值的擴散曲線。
在本發明的方法中,建立組分流和空白流的一個層流并且將其提供在小橫截面通道中。當建立該流時,沿著該小橫截面通道提供一個擴散梯度。因此不同擴散時間的數據可以是通過分析沿著小橫截面通道的兩個或更多位置處的擴散曲線來同時獲得的。
本發明的方法不需要分離空白流與組分流。因此,在該組分流與該空白流接觸時可以測量該一種或多種組分的擴散曲線。
耶格爾等人[11]描述了在具有一個組分流(具有一種單一組分)和一個空白流的一個通道中的一個單一測量位置處的擴散曲線的測量。
在US 2006/263903的流體系統中,在一個橫向通道區域中接觸一段時間之后,空白流從組分流中轉移。在接觸點處,組分流中的一種組分可以擴散到空白流中。分析單獨的空白流并且定量組分的量。為了獲得該組分的一個擴散系數值,需要以多個不同的流速隨著時間獲取空白流、組分流或二者的若干個測量值。
在分析之前,可以標記感興趣的組分以允許以本發明的方法進行檢測。該標簽可以利用一個化學基團的形式,該化學基團是可通過例如標準紫外可見光法、熒光或發光光譜法檢測的。
組分和組分流
本發明可以用于測定一種組分的擴散系數并因此測定流體動力學半徑。在本發明的一個優選的實施例中,該組分是或者包括一種聚合物。
本發明可以用于測定例如在溶液中的一個單一組分的擴散系數。然而,本發明可以有利地用于測定在一個流體中的兩種或更多種組分的擴散系數。
每個組分可以溶解于該流體中。然而,本發明還可以用于研究分散于一個流體中的組分。因此,在該方法中使用的流體可以是膠質,并且可是一種溶膠或一種乳狀液,其中該組分是分散相。
含水流體典型地用于本發明的方法中。出于進行本發明的方法的目的,這種或這些組分可以被納入溶液中。這些組分已處于溶液中并且此溶液可以直接用作流體。或者,這種溶液可以在適當時濃縮或稀釋,以用于最佳分析。出于使溶液中的這些組分穩定的目的,例如出于維持該組分的結構完整性或保持溶液中的這些組分的目的,該溶液還可以包含額外試劑。例如,這些組分可以被提供在一種緩沖溶液中。
含水流體流可以是在適用于維持該流內的這些組分的完整性的一個pH下。該pH可以是在從pH 4至10、如5至9、如6至8的一個范圍內。
該pH可以是生理pH。
或者,可以選擇含水混合物的pH,以便引起混合物的組成改變,如聚集事件和分離事件,這些可以使用本發明的方法進行監控。
一個含水流體流可以額外包含一種易混合有機溶劑。這可以被提供來保留溶液或懸浮液中的組分。例如,DMSO可以與水一起使用。有機溶劑可以高至25%、高至20%、高至10%、高至5%或高至1%v/v存在。
根據本發明的方法進行分析所需要的組分的量并不大,并且非常少量的材料可以穿過該微流體裝置。還可以收集從小截面通道中排出的流體,并且這可以例如在適當濃縮所收集的流體流之后重新分析。
提到一種組分混合物是提到具有不同分子量和/或不同擴散率的兩種或更多種組分的一種溶液。該組合混合物可以具有三種、四種、五種或更多種組分,每種組分具有不同的分子量和/或不同擴散率。
提到一種組分可以是指一種聚合物。一種聚合物可以是或者包括一種多肽。
提到多肽包括提到蛋白質、抗體。一種聚合物可以是或者包括一種多糖。
一種聚合物可以是或者包括一種多核苷酸。
在一個實施例中,一種組分可以包含結合另一種化合物的一種聚合物。另一種組分可以是在此所述的一種組分。在一個實施例中,一種組分可以包含保持在聚集物中的兩種或更多種聚合物。例如,該組分可以包含兩種或更多種多肽。如在此所述的,本發明方法可以用于檢測聚集物如多肽聚集物的形成。
在一種組分包含兩種或更多種聚合物的情況下,這些聚合物可以通過共價鍵或非共價鍵或其組合保持在一起。聚合物之間的共價鍵的實例可以包括酯、酰胺和二硫鍵。非共價鍵的實例包括氫鍵、離子鍵、以及相互作用,以及其他非共價鍵。
在一個實施例中,該組分是具有范圍1至500nm、如5至100nm的一個最大尺寸的一種納米顆粒,如一個顆粒。該顆粒可以是一種金屬納米顆粒。該金屬可以是或者包括金或銀。
本發明適用于測定具有300Da或更大、500Da或更大、1,000Da(1kDa)或更大或者2kDa或更大的分子量的聚合物分子的擴散率。
本發明適用于測定具有5kDa或更小、10kDa或更小、50kDa或更小或者100kDa或更小的分子量的聚合物分子的擴散率。
本發明適用于測定具有至少0.05nm、至少0.1nm、至少0.5nm、至少1nm或者至少5nm的半徑的聚合物分子的擴散系數。
本發明適用于測定具有至多10nm、至多15nm、至多25nm、至多50nm、至多100nm、或至多200nm、或至多500nm的半徑的聚合物分子的擴散系數。
具體地說,本發明特別適用于測定具有范圍0.5至500nm、如0.5至200nm、如0.5至15nm的半徑的生物聚合物如多肽的擴散系數。
本發明的方法包括測量組分到空白流中的擴散的步驟。這些組分可以是使用標準分析技術如熒光光譜法、發光光譜法、紫外可見光光譜法以及其他方法可檢測的。例如,在該組分是一種多肽的情況下,該多肽可以是通過熒光光譜法進行檢測的。
在一些實施例中,可能需要標記一種組分以允許在小截面通道中檢測到它。該標簽是一種可分析檢測到的原子或基團。
在一個實施例中,該標簽可以是共價連接到該組分的一個紫外可見光標簽、熒光標簽或發光標簽。此類標簽通常用于生物分子,如多肽、多核苷酸和多糖。用于本發明中的一個標簽的實例是熒光素。用于本發明中的這些標簽與它所連接的組分相比典型地是相對小的。因此,該標簽基本上不會改變該組分的擴散特性。
在適當時,一種組分可以具有多個標簽,以輔助檢測。
提到一種組分可以被認為提到具有一個分析標簽的一種組分。
本發明的一個優點是在一個組分流中的每種組分可以是相同地標記的。本發明的方法能夠基于該組分的擴散曲線區分并鑒別組分。不需要使用單獨的且不同的標簽來標記感興趣的組分。
可以獨立于空白流的流速改變組分流的流速。
該組分流可以是由含有一種或多種組分的一種分析樣品生成的。在適當時可以稀釋或濃縮該分析樣品以提供一種組分流體,該組分流體適合于流過在此所述的一種裝置并且適合用于檢測。
可以選擇該流體中的這些組分的濃度,以便確保這些組分本身對流體的粘度不具有作用。可以選擇該流體中的這些組分的濃度,以便確保這些組分在該流體流內可容易檢測。
原則上,用于這些方法中的最大濃度可以是該流體用這些組分飽和的濃度。
本發明人已發現,具有濃度低至0.1μM、例如低至0.5μM、包括低至1μM的組分的流體可以用于本發明的方法中。在這些濃度下,可以獲得有意義的分布曲線。在較低濃度下,這些組分可能難以在小橫截面通道中檢測到,并且信噪比可能較差。
當然,分析樣品的精確組成可能并不知道,并且該流體的生成可以是基于一系列初始測試運行,以建立使用條件。該流體的制備還可以是基于樣品的初步分析,以提供至少一個大體的濃度指示。
空白流體和空白流體流
本發明的方法包括監控一種或多種組分從一個組分流到一個空白流中的擴散的步驟。
在一個實施例中,該空白流體可以是與沒有組分的組分流相同的。
在一個實施例中,該空白流體是一種緩沖液。
典型地,該空白流體流和該組分流是水流。
在一個實施例中,該空白流體可以包含額外試劑,其中此類試劑是用于與組分流中的一種或多種組分相互作用。在本發明的一些實施例中,提供了一種用于測定一種分析物濃度的結合測定。在此,例如,在該空白流中的一個已知濃度的一種試劑與來自組分流的一個配對物的相互作用允許通過結合試劑的部分組分確定該組分的濃度。此類方法特別適用于其中該試劑是一種抗體并且該組分是一種抗原的情況。
可以獨立于組分流的流速改變空白流的流速。
在一些實施例中,在該組分流的兩側提供兩個空白流。本發明的方法可以因此著眼于該組分流中的多種組分到一個或兩個空白流中的擴散。使用兩個空白流是有利地,因為這些可以用于在該組分流上提供一個穩定的平衡壓力。
典型地,兩個空白流的組成是相同的。典型地,兩個空白流的流速是相同的。
擴散系數的分析和測定
本發明提供了用于測定一個流體中的一種或多種組分的擴散系數的方法。
在該組分流體包含一個單分散組分的情況下,可以使用標準技術測定該組分的疏水半徑。這例如通過耶格爾等人[8、11和12]進行描述。在本發明的第一方面的方法中記錄的擴散曲線可以被認為是組分的擴散鑒于以下事實而更具有代表性:大橫截面通道限制了該裝置的接頭處的停滯作用。因此,計算的擴散系數值和疏水半徑可以被認為是具有較大準確度的。
在該組分流體包含一種多分散組分混合物的情況下,本發明提供一種用于測定該混合物中的兩種或更多種或每一種組分的擴散系數的方法。這與本領域已知的方法相反,該方法典型地僅提供整體混合物的一個平均擴散值。在本發明的第三方面的方法中,在不同擴散時間內記錄多個擴散測量值。
如在此所注的,本發明的方法提供了兩個層狀流體流。以低雷諾數進行這些方法,其中對流和擴散是質量運輸的僅有的相關機制。這簡化了組分移動在一個通道內的模擬。
通常,所記錄的擴散譜相對于對一個范圍的組分測定的一系列理論擴散曲線去卷積,這些組分具有這些組分在研究中的可能半徑范圍內的疏水半徑(和因此的擴散系數)。去卷積步驟使記錄的數據擬合由最可能的個別理論擴散曲線集合構成的總體曲線。對于與實驗誤差一致的最簡單溶液進行該擬合。在上下文中,提到最簡單溶液是提到一個最高熵正規化。
參考一個生成的基底函數,進行所記錄的擴散曲線的去卷積。該基底函數是一個理論擴散曲線的集合,其中每個理論曲線是對于具有一個特定流體動力學半徑的一個組分。該集合是由一個流體動力學半徑范圍的曲線構成。對于含有多肽的樣品,例如,這些曲線跨越可能的多肽組分半徑范圍,如0.5至200nm、如0.5至15nm。
在最大熵正規化的情況下,使用最小二乘法擬合進行所記錄的數據的回歸分析。與模擬的基底函數結合,所記錄的空間分布可以被去卷積成個別擴散曲線的一個圖譜。
上文所述的去卷積方法是有利地,因為它們提供在含有最少信息的最佳擬合的誤差內的溶液。這進而防止該數據的所謂過度擬合。
在另外的詳情中,本發明方法允許進行準確數值計算,以確定給定大小的物質的核心。在流實驗中獲取的擴散曲線然后被總體擬合到預測核心的一個線性疊加,其中每個核心的振幅是通過一個受限的最小平方擬合來確定的,其中這些系數被限制成間隔0至1,以確保其被物理解釋為分級濃度。在擬合中的殘差提供了測量值誤差的一個評估。然后進行一個第二系列的最小平方擬合,此時距最大熵正規化。熵術語是幅度逐漸增加,直到正規化擬合的x2值不同于隨機誤差水平的非正規擬合的值為止。然后此最終擬合的系數是與實驗誤差一致的最簡單(最高熵)溶液。
在最小平方擬合提供了實驗數據中的噪聲水平的一個評估時,具有該技術的總體精密度的一個評估是有用的。在此,通過以不同水平的添加的隨機噪聲生成人工數據的一個大數據集來獲得此評估。圖5描述了兩個最相關的測量值精密度(測定一個單一物質的擴散系數的精密度)和兩個分散物質之間的擴散系數的最小可分辨差值(用于使隨機噪聲水平不同)。此方法忽略了引入的任何系統誤差,例如在裝置制造過程中或者通過樣品的不均勻照射。
一個組分的流體動力學半徑可以是通過擴散系數確定的,如本領域已知的。
這些擴散曲線還可以用于確定組分流中的多種組分的濃度,如本領域已知的。
本發明的方法
在一個方面,本發明提供了一種用于測定一個組分混合物中的一種組分或每一種組分的擴散系數的方法。該方法包括以下步驟:
(i)提供包含一種或多種組分的一個組分流體流;
(ii)提供一個空白流體流;
(iii)在一個大橫截面通道中使流(i)與流(ii)接觸,從而生成兩個層流;
(iv)允許在(iii)中生成的這些層流從大橫截面通道中流入一個小橫截面通道中;
(v)在該小橫截面通道中測量該一種或多種組分從該組分流到該空白流體流中的徑向擴散。
本發明的方法典型地在具有一個低雷諾數的流中進行。例如,一個流的雷諾數可以是1或更小、0.5或更小、0.1或更小或者0.05或更小。
在一個實施例中,流體流速是至少1、至少5、至少10、至少50或者至少100μLh-1。
在一個實施例中,流體流速是至多200、至多400、至多500、至多1,000、至多2,000或者至多5,000μLh-1。
在一個實施例中,該流速是選自一個范圍的一個值,該范圍具有選自以上值的上限值和下限值。例如,該流速可以是在范圍5至400μLh-1內。
流體流速是在穩態下的流速。
使用具有在以上所指示的范圍內的流速的微流體裝置意指在一次分析運行中可以使用相對少量的組分流體。例如,出于獲得至少一個擴散曲線讀數的目的,在該范圍內的體積是足以在小橫截面通道內建立一個穩態流的。
在一個實施例中,用于該組分流體流中的流體的總體積是至多50、至多100、至多200、至多500或者至多1,000μL。
在一個實施例中,用于該組分流體流中的流體的總體積是至少0.1、是至少0,5、是至少1、是至少5或者是至少10μL。
在一個實施例中,用于組分流體流中的流體的總體積是選自一個范圍的一個值,該范圍具有選自以上值的上限值和下限值。例如,該總體積可以是在范圍1至50μL內。
本發明的方法可以是在室溫下或大約在室溫下,例如15℃、20℃或25℃下進行的。或者,本發明的方法可以是在較低溫度如5℃或10℃下或者在較高溫度如35℃、40℃或50℃下進行的。
在一個實施例中,在多個擴散時間測量一種或多種組分從該組分流到該空白流體流中的徑向擴散。在測量點之間的分離沒有特別限制,但是可以具有足夠的距離,使得所記錄的擴散曲線在測量點之間顯著改變。
在一個實施例中,該方法包括在一段時間之后重復步驟(i)至(v),從而隨著時間分析一種組分流體的組成。在此實施例中,該方法可以用于監控該組分流體的改變,如這些組分的聚集或者可以是一種聚集物的一種組分到更小部分的分離。在此描述了一種用于分析淀粉樣蛋白的聚集物的方法。
在一個實施例中,該方法進一步包括步驟(vi),其中一種組分的一個擴散系數值是由步驟(v)的徑向擴散測量值確定的,并且任選地一個流體動力學半徑是由一個擴散系數值確定的。
在一個實施方案中,步驟(vi)包括比較來自步驟(v)的一種或多種組分的測量的徑向擴散曲線與具有已知流體動力學半徑的組分的一系列分布,從而確定該一種或多種組分中每一種的流體動力學半徑。
在一個實施方案中,步驟(vi)包括使用關于具有已知流體動力學半徑的組分的一系列分布的一種最高熵正規化方法,使來自步驟(v)的一種或多種組分的測量的徑向擴散曲線去卷積,從而確定該一種或多種組分中每一種的流體動力學半徑。在此實施例中,可以使用一種最小平方分析。具有已知流體動力學半徑的組分的該系列分布可以是一系列預測的分布。
在本發明的一種替代方法中,提供了一種用于測定一種或多種組分的擴散系數的方法,該方法包括以下步驟:
(i)提供包含一種或多種組分的一個組分流體流;
(ii)提供一個空白流體流;
(iii)在一個通道中使該流(i)與該流(ii)接觸,從而生成兩個層流;
(iv)在多個擴散時間測量該一種或多種組分從該組分流到該空白流體流中的徑向擴散。
在測量點之間的分離沒有特別限制,但是可以具有足夠的距離,使得所記錄的擴散曲線在測量點之間顯著改變。
以上所討論的流速、體積和溫度也可適用于此方法。
在一個實施例中,本發明的第一方面和第二方面的特征可以被有利地組合,以提供一種用于以提高的準確度分析一種組分流體的方法。該方法因此可以包括以下步驟:
(i)提供包含一種或多種組分的一個組分流體流;
(ii)提供一個空白流體流;
(iii)在一個大橫截面通道中使流(i)與流(ii)接觸,從而生成兩個層流;
(iv)允許在(iii)中生成的這些層流從大橫截面通道中流入一個小橫截面通道中;
(v)在多個擴散時間測量一種或多種組分從該組分流到該空白流體流中的徑向擴散。
使用大橫截面通道的優點和記錄多個擴散曲線的優點因此可以集合在一起。
其他參數選擇
在此明確披露了以上所述的實施例的各個和每個相容性組合,就像單獨地且明確地敘述各個和每個組合一樣。
鑒于本披露,本領域技術人員將清楚本發明的多個不同的其他方面和實施例。
在此使用的“和/或”應當理解為明確地公開了兩個具體特征或組件中的每一個(具有或不具有另外一個)。例如,“A和/或B”應當理解為明確地披露了(i)A、(ii)B和(iii)A和B中的每一種情況,就像在此單獨地列出每一種情況一樣。
除非上下文中另外指出,否則上述列出的特征的描述和定義并不限于本發明的任何特定方面或實施方式,并且等同地應用于所描述的所有方面和實施例。
現在將僅借助于實例并參照以上所述的附圖來說明本發明的某些方面和實施例。
實驗
使用標準軟刻蝕技術[20,14]將微流體通道制造成在硅掩膜上具有SU-8光刻膠的聚二甲基硅氧烷(PDMS;道康寧公司(Dow Corning))。將這些通道等離子體結合至玻璃載片,以形成密封裝置。該通道高度是25μm。通道寬度在該裝置的不同區域是不同的-在小橫截面通道中該寬度是300μm,在噴嘴處從3,000μm收縮(大橫截面通道)。將緩沖液(空白)流體和分析物流體引入該噴嘴中的通道的寬度是100μm。用于在此所述的實驗中的裝置示出在圖1a和圖1b中。在以下還描述了另外的制備詳情。
注射器泵(哈佛儀器(Harvard Apparatus))用于控制流體流。
用于本發明的25nm和100nm膠質是來自西格瑪奧德里奇公司(Sigma Aldrich)的聚苯乙烯膠質,它是在用熒光素預先標記的情況下供應的。這些膠質被提供在去離子水中。所使用的流速典型地是4μL/h。
用于本發明的蛋白質是胰高血糖素、β-乳球蛋白和牛血清白蛋白,它們全部都可從西格瑪奧德里奇公司獲得。這些蛋白質是熒光標記的。這些蛋白質被提供在具有20%DMSO的pH 8 50mM磷酸鹽緩沖液中。用于蛋白質實驗的流速典型地是40μL/h。
這些組分在該通道中的擴散是通過使用標準技術穿過通道進行熒光檢測來測量的(也參見耶格爾等人[11]等)。暴露時間典型地是10s。
將Aβ(1-42)克隆到“PetSacKan”質粒中,在大腸桿菌BL21細胞中重組表達,并且使用陰離子交換色譜法以分批模式進行純化。此程序允許產生大量的高純度肽[18]。將所得的肽分成1mL等分試樣,將其凍干并保存在-20℃,直到進一步使用為止。
擴散光譜法研究復合蛋白質締合過程如在此所述的那些過程的應用依賴于使用最近詳細報道的一種非微擾性共價標記技術。考慮到擴散光譜法的主要優點是其獲得一種異質混合物中的顆粒大小的光譜的能力,從而選定允許擴散流動在觀察下可視化的一種標記技術,熒光共價標記是最佳方法。熒光標記有助于使用一個常規光學顯微鏡檢查設置來方便采集高信噪比圖像。共價標記確保該異質混合物內的所有物質被標記并且因此能夠被檢測。在歷史上,蛋白質復合物的共價熒光標記是具有挑戰性的。如果用一種熒光染料標記所形成的蛋白質復合物,未結合染料必須在分析之前從反應混合物中去除,并且所需的純化步驟破壞了瞬時形成的締合物質的結構。
或者,個別蛋白質可以在其締合之前被標記并從未結合染料中純化,但是甚至一種熒光報道基因的位點特異性安裝較大或較小程度上破壞了復合物締合。在此,用一種潛在熒光團標記所形成蛋白質復合物。因為僅標記的蛋白質和蛋白質復合物是熒光的,所以不需要純化步驟,并且熒光標記物質的異質混合物用擴散光譜法直接分析。
在堿性pH下并且在一種硫醇(在此,β-巰基乙醇,BME)存在下,在蛋白質和蛋白質復合物的表面上暴露的胺與鄰-苯二醛(OPA)反應以在原位形成一種雙環、異吲哚型熒光團[15、16]。
盡管最初觀察到此過程的快速動力學[2],它對于分析蛋白質混合物的應用通常限于針對后置柱或前置柱肽衍化[13、17]或者針對生物組織內少量氨基酸的定量檢測[21、6]的努力。
本發明的示例性裝置
圖1a和圖1b是根據本發明的一個實施例的一種微流體裝置的示意圖。圖1a是所使用的一種裝置的3D表示圖,該裝置具有一個組分流體流和多個空白流體流,在該表示圖中具有分析物在噴嘴處的分布的插圖以及在從如下所述的小橫截面通道開始的1mm、3mm和9mm處的三個測量點的插圖。圖1b是該裝置的平面圖。
圖1a示出了在小橫截面通道中的牛血清白蛋白和β乳球蛋白的一種混合物的擴散。
用于本發明的一種裝置1可以包括在一個噴嘴的一個接頭處接觸一個空白流體流供應通道3a的一個組分流體流供應通道2,該噴嘴是一個大橫截面通道4。在多個優選的實施例中,提供兩個空白流體流供應通道3a和3b,如圖1b所示的。該組分流體流供應通道2可以是與一個上游組分流體儲罐5流體連通的,該組分流體儲罐可以包括一個可控注射器或者可以是該可控注射器的一部分(未示出)。每個空白流體流供應通道3a和3b可以是與一個上游空白流體儲罐6流體連通的,該空白流體儲罐可以包括一個可控注射器或者可以是該可控注射器的一部分(未示出)。一個儲罐6可以供應兩個空白流體流通道3a和3b。
在大橫截面通道下游并且與其流體連通的是一個小橫截面通道7。該小橫截面通道7可以具有一個彎曲(旋繞)路徑,如圖1b所示的。該小橫截面通道7被適配為與一個分析檢測器(未示出)一起使用,該分析檢測器可以被安排來在沿著小橫截面通道7的一個或多個位置處分析存在于該通道中的一個流體中的多種組分。該分析檢測器可以被安排為穿過小橫截面通道的兩個或更多個截面同時檢測一個流體中的多種組分,如通過檢測區域8說明性地示出的。該小橫截面通道可以是與一個下游收集儲罐9流體連通的。
大橫截面通道4典型地具有一個橫截面,該橫截面是該小橫截面通道7的橫截面的十倍。因此,在圖1a中,插圖顯示該小橫截面通道7的寬度是300μm(這在9mm圖像中是清楚的,其中該組分已擴散到空白流體流的邊緣,其中該流體接觸該通道壁)。大橫截面通道4具有3,000μm的最大寬度。
大橫截面通道4具有從該接頭延伸的恒定寬度的一個區域。然后該通道逐漸減小(以與該流體流動方向成約60°的角度),直到該通道是小橫截面通道7的寬度為止。大橫截面通道7從該接頭(其中該組分流體供應通道和空白流體供應通道相遇)到小橫截面通道7開始的長度可以是約100μm。
小橫截面通道7的寬度在其整個路徑上保持基本上恒定。小橫截面通道7從其中大橫截面通道4結束的點開始到儲罐9的長度可以是在10mm的范圍內。
本發明的裝置用于分析在一個流體中的一種組分如一種多肽的半徑,并且優選地分析多種組分的個別半徑。提供作為一個射流裝置的一個流的組分流體并且測量在流體流中的每種組分到一個相鄰空白流體流中的擴散。該空白流體是缺乏該組分的一個流體。
射流裝置1可以是使用標準軟刻蝕技術、使用例如聚二甲硅氧烷作為基底材料來制備的。適合的光刻膠可以是根據所需的流體流通道和儲罐的形狀和尺寸來制備的。
在使用時,一個組分流體被提供到該儲罐5中并且被允許流過該組分流體供應通道2,流到該大橫截面通道4中,在該大橫截面通道中它接觸空白流體流。這些空白流體被提供到儲罐6并且被允許流過這些組分流體供應通道3a和3b,流到該大橫截面通道4。流速可以是通過注射器泵控制的,該注射器泵供應這些供應通道2、3a和3b。或者,該流動是來自儲罐5和6的流體的一個重力供料。
該組分流體流和這些空白流體流在大橫截面通道4中接觸并且在這些空白流體流之間形成該組分流體流的一個層流。這些流被允許從大橫截面通道4向下游流入小橫截面通道7。在組分流體流內的多種組分被允許從組分流體流中擴散到這些空白流體流中。這些組分的 擴散可以是在沿著小橫截面通道7的一個或多個位置處,例如在檢測區域8中測量。典型地,在一個組分(如最小的組分)已到達該空白流體流的邊緣之前獲取第一個測量值,其中該流體接觸該通道壁。一旦進行適當數目的擴散測量,就可以在一個儲罐9中收集這些流體流或者就可以允許這些流體流流入到一個第二分析裝置中,該第二分析裝置是與流體裝置1流體連通的。在圖1a中示出了在小橫截面通道7的長度上的擴散曲線,其中可見白色的組分擴散到較黑的空白流體流中。
本發明人已確定在用于檢測組分擴散的射流裝置中使用一個大橫截面通道提供了允許更準確地測定一個流體中的多種組分的半徑的一些益處。使用該裝置引起用于組分流中的這些組分的良好限定的初始構型,該初始構型從其中組分流和空白流進入小寬度通道7的一點開始。在例如小橫截面通道7下游的通道中建立一個恒定速度曲線之前,使用一個大流動通道4使組分的擴散最小化,在該小橫截面通道中進行擴散測量。
圖4示出使用比小橫截面通道寬十倍的一個大橫截面通道引起一個清潔且限定的組分流。在圖4中,示出了從一個組分流體供應通道進入一個大橫截面通道中的一個組分流體流(白色)的三個圖像。在大橫截面通道中的組分流體流似乎是相對清潔的并且從組分流體第一次接觸該空白流體流(灰色)的一點來限定。
描述圖1a和圖1b的微流體裝置的制備的一個有用的實例列出在以下α-B晶狀體蛋白實驗中。
多組分混合物的分析
使用以上所述的微流體裝置分析包含等量(按體積計0.02%)的25nm和100nm膠質的一種含水混合物。還制備每種膠質的個別溶液。使溶液以40μLh-1流過該裝置并且在480nm使用一個LED光源照射.使用高量子產率CCD照相機獲取三次10s暴露,在三個測量點中每一個點處獲取一次暴露.
在三個不同的擴散時間在從小橫截面通道開始的1mm、3mm和9mm處測量擴散曲線(參見圖2,底部圖)。使用在此所述的一種最高熵正規化方法使擴散曲線的組合去卷積,以顯示具有不同流體動力學半徑的兩種組分的存在(圖2,底部光譜),該流體動力學半徑非常緊密配合對于個別膠質所測定的實驗來源的值(頂部光譜和從頂部光譜起的第二個光譜)。對于比較,進行一個單個擴散曲線的去卷積(從底部光譜起的第二個光譜)。如可以看出,此去卷積錯誤地表明在該混合物中的三種不同組分的存在,其中具有一個較小半徑的組分被分辨為兩個單獨的信號。此外,具有一個較大半徑的組分被分辨為具有一個較高半徑的一個信號。使用多個測量點因此在擴散曲線的去卷積中提供更大準確度和更大分辨率。
微流體擴散技術也可以用于分辨蛋白質的多組分混合物。對于蛋白質胰高血糖素、β-乳球蛋白和牛血清白蛋白(BSA)的混合物進行一個第二校準。將每種蛋白質制備為含有20%DMSO的磷酸鹽緩沖液中的一種均質溶液以及為該三種蛋白質的一種1:1:1混合物(按質量計),DMSO用于確保在實驗過程中所有蛋白質保持在單體狀態并且沒有形成未知復合物。
這三個蛋白質是熒光標記的。在此,用一個潛在熒光團標記所形成的蛋白質復合物,即僅在結合時是熒光的并且如果游離在溶液中則檢測到。因為僅標記的蛋白質和蛋白質復合物是熒光的,所以不需要純化步驟,并且熒光標記物質的異質混合物用擴散光譜法直接分析。在堿性pH下并且在一種硫醇(在此,β-巰基乙醇,BME)存在下,在蛋白質和蛋白質復合物的表面上暴露的胺與鄰-苯二醛(OPA)反應以在原位形成一種雙環、異吲哚型熒光團。
以與以上相同的方式進行擴散實驗。在實驗中使用的照射波長是365nm。圖6示出了對個別和組合的測試溶液的擴散測量的結果。在與均質溶液中大小類似的大小的混合物中分辨三種物質,盡管與β乳球蛋白和牛血清白蛋白對應的峰稍微更靠近地一起偏移。這可能 是實驗中的隨機誤差和系統誤差的作用,并且這兩個峰在此信噪比水平下接近于微流體擴散實驗的分辨力。
BSA的分析
當表征單分散溶液如單一蛋白質時,微流體擴散技術可能是極其精密的。如所證明的,微流體擴散用于研究溶解于pH 7和溶解于具有80%DMSO的相同緩沖液中的蛋白質牛血清白蛋白(BSA)的流體動力學半徑的變化。
將5mg/mL的BSA溶解于pH 7磷酸鹽緩沖液(例如,5mM HEPES緩沖液),之后在β-巰基乙醇(BME)存在下用OPA進行標記。標準標記混合物是12mM OPA、18mM BME、4%SDS以及200mM碳酸鹽的溶液,pH在范圍9.5-10.5內。提前制備該溶液并且以與蛋白質溶液的1:1體積比率混合。
然后在相同緩沖液和DMSO中將此標記的BSA的儲備溶液稀釋至1mg/mL(其中最終DMSO濃度是按體積計80%)。使用與以上詳述的多組分混合物相同的實驗技術測量每種溶液(緩沖液和80%DMSO)中的BSA的流體動力學半徑。
圖7示出了對于每種BSA溶液計算的擴散系數。在水性緩沖液中的BSA的擴散系數與流體動力學半徑3.5nm相對應,這可與文獻值相比。在80%DMSO中,該蛋白質是顯著展開的,其中流體動力學半徑是6+0.5nm。
胰島素聚集事件的分析
本發明的方法可以用于研究單體、二聚體和六聚體形式的胰島素共存。胰島素(可從商業來源獲得)可以是在生理pH下共價標記的。可以隨著時間測量一種胰島素樣品的組成的變化。因此,可以從該樣品中取出等分試樣并且使用本發明的一種擴散方法進行測試。擴散曲線的變化可以與該樣品、例如增加的聚集物的組成變化連接。還可以在胰島素樣品的pH變化的情況下監控聚集物的變化。例如,可以在pH 2和pH 4下測定聚集物。可以比較在這些樣品中的不同物質的群體。
Aβ(1-42)聚集事件的分析
擴散光譜法可以用于分析蛋白質復合物的高異質混合物。用于研究的一種特別具有挑戰性的類型的生物分子締合方法是富含異常β折疊的聚集物的形成方法:該聚集物通常被稱為淀粉樣原纖維。淀粉樣-β,特別是低聚物形式,涉及阿爾茨海默病的主要致病因素之一。在蛋白質溶液經受聚集時獲得它的一個大小分布對于理解疾病病理學和聚集的潛在機制是重要的。
通常使用原子力顯微鏡獲得淀粉樣聚集物的大小分布。然而,AFM技術通常需要降低樣品的濃度,這意味著在可以進行測量之前動態復合物可以解離。AFM還在發現真實大小分布方面具有問題,因為分析物在一個表面上的分布很少是均勻的。擴散光譜法是一種整體技術(bulk technique),并且擴散時間是足夠短的,使得樣品溶液的組成在其沿著擴散通道行進的整個過程應保持不變。實際上,每個分子在該裝置內僅花費約10秒或20秒。另外,用于分析的物質僅稀釋至多系數十,這使得解離最小化。
圖3示出了在從單體蛋白質開始的一個聚集反應中的四個不同時間點的Aβ(1-42)聚集物的大小分布。擴散測量值的詳情與以上詳述的其他蛋白質溶液的詳情相同,盡管在每個測量點使用100s暴露時間而不是10s。
在反應開始時,該肽是單體的,如所預期的。感興趣的是,較大物質的一個峰開始出現在時間進程中的僅30分鐘,在ThT熒光強度已明顯增加之前。這些較大物質具有一個大小范圍跨越的低聚物至小原纖維,并且假定缺乏締合的ThT信號,則可能的是大部分峰包括被認為與疾病有關的小的、ThT陰性低聚物。在50分鐘之后,在反應生長期開始時,仍存在大部分的單體以及先前觀察到的低聚物和原纖維的混合物。存在流體動力學半徑的較大大小高至約20nm的大量原纖維群,并且在此時首先出現聚集的原纖維的外觀(在大約 400nm處的峰)。在已消耗所有單體的時候,在120分鐘時,在這些大原纖維團中包含所有這些聚集物。
實驗
將Aβ(1-42)克隆到“PetSacKan”質粒中,在大腸桿菌BL21細胞中重組表達,并且使用陰離子交換色譜法以分批模式進行純化。此程序允許以相對高的純度產生大量的肽。將所得的肽分成1mL等分試樣,將其凍干并保存在-20℃,直到進一步使用為止。盡管獲得Aβ(1-42)肽聚集物的可再生動力學數據在歷史上是具有挑戰性的[10],但是最近已顯示在聚集反應之前立即進行從低聚物中間體中分離純蛋白質單體的一個排阻色譜步驟,從而顯著提高所獲得的動力學數據的質量[9]。因此,將一個單一等分試樣溶解于6M鹽酸胍中并且使其穿過一個休珀代克斯(Superdex)75 10/300凝膠過濾柱。收集在約13與15mL之間的僅在蛋白質單體峰被摒棄之前洗脫的低聚物“肩部(shoulder)”和洗脫的純單體。洗脫在20mM磷酸鈉緩沖液、pH 8.0、200μM EDTA以及0.02%疊氮化鈉中的大約1.3μM蛋白質單體并且將其保持在冰中。
thioavin T(ThT)動力學測定用于監控過濾過程,使用以上緩沖液中的1.2μM Aβ(1-42)、20μM ThT重復4次。實時地并且在與聚集反應開始、滯后時間結束、生長期初期以及平衡相形成相對應的時間點監控原纖維形成,等分試樣從4個額外孔中去除并且與在以上動力學緩沖液中的10μL OPA-BME標記的儲備液組合。將含有大約1.0μM Aβ(1-42)、600μM OPA和900μM BME的等分試樣保持在冰中并且然后在擴散裝置中快速分析。
α-B晶狀體蛋白的分析
通過擴散光譜法研究αB-晶狀體蛋白低聚反應。
雖然仍在討論中[22],已出現一個廣泛的共識,天然狀態下的αB-晶狀體蛋白組裝為大小范圍是從10個亞基到40個亞基的低聚物[23],并且低聚反應平衡的動力學對于蛋白質功能可能是至關重要的。它是使蛋白質的研究更復雜的此異質性。存在關于來自一個截短變體的結晶域的一些結構信息,從而要求承認低聚物由二聚體、7-鏈β折疊結構嵌段組成[24],并且對于描述αB-晶狀體蛋白的多分散性的嘗試是通過質譜分析法[23]、[25]、[26]來成功實現的。然而,迄今為止,不可能在多分散混合物中追蹤大量的單體物質。
αB-晶狀體蛋白如以下所述地表示并純化。在最后的純化步驟之后,通過SDS-PAGE證實αB-晶狀體蛋白的特性(參見圖8(a))。在20kDa的一個單一條帶證實存在在變性條件下的單體、純αB-晶狀體蛋白。通過質譜分析法獲得αB-晶狀體蛋白純度的另外的證明(圖8(b),上圖)。發現實驗質量20,160Da非常緊密地配合所希望的理論質量20,159Da。
對于擴散光譜法實驗,用鄰苯二甲醛(OPA)標記αB-晶狀體蛋白,如以上所述的。用質譜分析法證明完全標記(參見圖8(b),下圖)。大約2,200Da的m/z偏移與OPA-標記的12.5個胺相對應,幾乎匹配在αB-晶狀體蛋白序列中的完全標記的10個伯胺和N-末端胺。使用未標記αB-晶狀體蛋白進行DLS和玻璃納米孔分析(以下進一步描述)。
使用擴散光譜法測定αB-晶狀體蛋白的大小,以便鑒別單體以及不同低聚物蛋白質群。在下文中進一步詳細描述所使用的擴散裝置。將不同測量點的擴散數據與沿著微型通道的熒光強度繪圖,從而產生一個擴散曲線(圖9(a)),并且將實驗數據與在此所述的理論模型擬合,從而獲得αB-晶狀體蛋白的大小分布(圖9(b))。實際上,通過擴散光譜法分辨兩個群體:具有大約2nm的平均流體動力學半徑的一種物質的小群體和具有約7nm的流體動力學半徑的一種物質的較大群體。
構成小于20%的混合物的小群體表示單體αB-晶狀體蛋白,并且非常豐富的群體占包含低聚物形式的蛋白質的樣品中的多于80%。沒有關于低聚物分布的結論是可能的。然而,持續第一時間低大小的物質被鑒別為大量的分離物質,并且兩種物質的相對群體的定量允許研究αB-晶狀體蛋白低聚反應平衡。
對于比較,使用DLS分析無標簽30μMαB-晶狀體蛋白。發現與通過擴散光譜法測量的大小分布重疊的一個廣泛大小分布表示低聚物αB-晶狀體蛋白(圖10)。兩種技術的良好一致性表明共價標簽對低聚反應不存在直接影響。然而,使用DLS,在2nm處沒有檢測到低大小物質的信號。在較大顆粒顯著更亮地散射時,通過DLS測量的強度偏向低聚物蛋白質,并且因此大低聚物可能具有掩蔽的小的、弱散射單體αB-晶狀體蛋白。因此,DLS不是研究αB-晶狀體蛋白的低聚反應平衡的一種適合的技術。
使用單個分子檢測通過一個玻璃納米孔進行對定量無標簽αB-晶狀體蛋白的單體低聚物平衡的另一個嘗試(與劍橋大學卡文迪什實驗室(the Cavendish Laboratory,University of Cambridge)的尼古拉斯貝爾(Nicholas Bell)和烏爾里希凱澤階博士(Ulrich Keyser)合作)在[27]和[28]中描述了該技術及其對單個蛋白質分子檢測的應用。由于樣品中的單體和低聚物αB-晶狀體蛋白的共存,事件的雙峰分布被預期為多分散樣品通過玻璃納米孔的轉位特征。在測量之前,將樣品的pH調節到10.5,以便防止粘附和附著到玻璃納米孔的各側并且確保蛋白質快速行進(ballistic travel)通過納米孔。在施加500mV電壓穿過該孔時出現電滲流動,并且記錄這些運輸事件。
離子電流追蹤中的峰值(圖11(a))示出了離子電流變化事件并且因此反映了單一分析物分子穿過納米孔。平均事件電流對比事件持續時間的散射熱圖(圖11(b))(其中這些顏色表示轉位的次數)示出了在濾波器截止時間(對于50kHz濾波器是約10μs)的事件群集,事件持續時間限制由濾波器頻率強加。大部分轉位接近于可檢測閾值,但是雖然如此主要群集可能與快速行進的蛋白質相對應,如對于單一、單分散蛋白質樣品所報道的[28]。無疑地檢測蛋白質的存在,但是在現有分辨率的情況下,轉位事件到單體和低聚物群體的分配由于重疊的轉位統計而保持難以實行的。
通過擴散光譜法研究單體蛋白質濃度對αB-晶狀體蛋白的低聚反應平衡的影響。在單體濃度范圍是從15μm到125μM的情況下使用MFD評估單體和低聚物αB-晶狀體蛋白的相對群體。獨立于蛋白質單體濃度,在所有測定中鑒別兩種物質。具有約2nm的平均流體動力學半徑的較小物質構成該混合物的10%-20%,并且具有7nm半徑的物質展現出80%-90%的相對豐度。
單體與低聚物的相對群體并不被視為取決于初始單體濃度。考慮到該方法的誤差,小的相對豐度變化表示按照所評估的單體濃度次序,單體濃度對低聚反應平衡不存在較大的影響。
αB-晶狀體蛋白的大小測定(Sizing)揭示了具有不同流體動力學半徑的兩種不同物質,這表示樣品的異質性。對于單體和低聚物蛋白分別是約2nm和7nm的平均流體動力學半徑與先前公布的數據非常一致。非常合理的平均低聚物半徑值7nm與來自質譜分析法[26]、電子顯微鏡法[22]、小角x射線散射和固態NMR[29]的數據非常一致。
微流體擴散光譜法可以用于在一個單一測量中鑒別作為一種分離的物質的αB-晶狀體蛋白,其中小流體動力學半徑與蛋白質的低聚物形式共存。發現物質的此分辨率對于擴散光譜法是獨特的,因為DLS或納米孔實驗二者都沒有揭示單體物質的存在。在DLS中朝向較大、較高散射顆粒的偏向掩蓋了較小大小的顆粒的存在,并且本發明納米孔技術并不足夠敏感以檢測事件的雙峰分布,如對于單體和低聚物群體的混合物所預期的。此外,先前對于使用質譜分析法描述伴侶蛋白大小分布的嘗試引起個別低聚物群體的詳細描述,而不會追蹤該單體([25]和[26])。
實驗
通過安德魯鮑德溫公司(Andrew Baldwin;英國牛津大學(University of Oxford,United Kingdom))友好地供應編碼人αB-晶狀體蛋白的基因的質粒。
蛋白質表達和純化將編碼人αB-晶狀體蛋白的基因的質粒轉化到感受態大腸桿菌BL21(DE3)細胞中(英杰公司(Invitrogen))。用12mL轉化細胞的整夜培養物接種供應有 1%(v/v)甘油和100μg/mL卡那霉素的整夜表達即時TB自身誘導培養基(500ml,Novagen)中。整夜誘導蛋白質過度表達,在30℃下劇烈振搖。通過離心作用收獲細胞(6000g,15min,4℃)并且將其重懸于每500ml培養基含有1mg/ml溶菌酶(西格瑪-奧爾德里奇公司(Sigma-Aldrich)、完全無EDTA蛋白酶抑制劑混合片劑(羅氏公司(Roche))和一藥勺尖的DNA酶I(羅氏公司)的20mM Tris~HCI,pH 8.3(20mL/500mL培養物)中。通過在超聲波破碎儀XL超聲儀(Misonix公司)上使用輸出6超聲處理20×15s來溶解細胞。將溶胞產物離心作用(18,000g,30min,4℃)以去除所有細胞碎片并且過濾通過一個0.45μm注射器。過濾器(密理博公司(Millipore))將過濾的溶胞產物裝載到一個Q瓊脂糖柱(通用電氣醫療集團(GE Healthcare))中,該瓊脂糖柱用20mM Trls-HCl(pH 8.3)預先平衡并且以4個柱體積通過從0至200mM NaCL的線性梯度洗脫進行洗脫。將含蛋白質級分施加到一個HiLoad 26/600休珀代克斯(Superdex)75pg凝膠過濾柱(通用電氣醫療集團)中以在20mM NaPi(pH 8.5)中進行最后的純化,并且以1ml/min流速進行洗脫。用SDS-PAGE和MALDI-MS檢查含蛋白質級分的特性。
微流體裝置制造。將SU-8 3025光刻膠(微化學公司(Microchem))在硅片上以500rpm旋轉涂布7s并且以3000rpm旋轉涂布另外30s。將旋轉涂布的硅片在95℃電爐中軟烘焙12min,然后用掩膜做內襯,并且持續15s暴露于UV光。在暴露之后,將這些硅片烘焙另外5min,之后使用PGME發展模具。通過將用碳納米粉(西格瑪奧德里奇公司)加黑的液體預聚物(10:1(v/v)硅酮彈性體:交聯劑)倒入模具上并且在60℃下使其固化2h來產生PDMS印模。將這些PDMS印模用一個解剖刀切斷并且在用一個活檢針穿刺入口孔和出口孔之后,這些印模暴露于一個空氣等離子體中10s(O2分壓4.0,功率4.0)并且結合于玻璃蓋玻片(磨砂邊緣90°,賽默飛世爾科技公司(Thermo Scientific))。該裝置被形成為具有25μm高度和范圍是從1,000(例如,在大橫截面通道處)到10μm的寬度通道。
微流體擴散色譜法。在OPA相對于伯胺超過10倍或20倍下使用鄰苯二甲醛(OPA)染料溶液(200mM NaHCO3(pH 10.5)、60mM鄰苯二甲醛、90mM(β-巰基乙醇)標記人αB-晶狀體蛋白。使用凝膠裝載的吸管尖將緩沖溶液和熒光標記的蛋白質添加在相應入口中,并且使連接到250μL玻璃注射器(哈密爾頓公司(Hamilton))的管配合流動出口。將neMESYS注射器泵(Cetoni公司)用于設定總抽取速率為80μL/h。用UV光激活OPA-標記的αB-晶狀體蛋白并且在使用一個Evolve 512EMCCD照相機(光測量公司(Photometries))的一個Axio Observer.D1顯微鏡(蔡司公司(Zeiss))上以10倍放大率使用一個49000-ET-DAPI濾光立方體(彩度科技有限公司(Chroma Technology Corp))進行成像。圖像數據擬合至線性疊加的一組基底函數,從而描述了直徑范圍是0nm至800nm的均質顆粒在與三個熒光測量點(在1、3和9cm處)相對應的距離處的溶液分布。
動態光散射(DLS)。使用具有反向散射檢測的一個Zetasizer Nano ZSP(馬爾文儀器公司(Malvern Instruments))以173°散射角進行動態光散射實驗。將水的速度和折射率用作緩沖溶液的參數,將分析物的材料特性設定為蛋白質。在分析之前,使所有樣品過濾通過一個0.22μm Millex注射器過濾器(密理博公司)。使用“多個窄”模式的馬爾文儀器軟件分析數據,以使相關函數去卷積成一個大小分布。
納米孔檢測測量.與劍橋大學卡文迪什實驗室的尼古拉斯貝爾和烏爾里希凱澤階合作進行這些實驗,如先前在[28]中所述的。使用在pH 10.5下濃度為1ΜM的αB-晶狀體蛋白進行測量。
MALDI質譜分析法。通過MALDI質譜分析法測量未標記和OPA標記的αB-晶狀體蛋白的質量(劍橋大小生物化學系PNAC部門(the PNAC Facility,Department of Biochemistry,University of Cambridge)的倫恩帕克曼博士(Dr Len Packman))。將理論分子質量20,159Da用于與未標記αB-晶狀體蛋白的實驗質量進行比較。
蛋白質濃度。通過使用摩爾消光系數13,980M-1cm-1測量單體材料在280nm處的豐度來計算單體蛋白質濃度。
脂質體的分析
通過擴散光譜法研究不同大小的脂質體結構。
脂質體大小已顯示對于人工生物膜系統并且對于藥物遞送的適當藥代動力學是重要的[30]。在最近幾年,在文獻中已討論了測定囊泡大小的不同方法:電子顯微鏡法[31]、分析超速離心[32]、分析排阻色譜[33]、流場流分離[34]、酶脂質定量測定[35]以及動態光散射(DLS)[36],其中DLS是對于容易使用的強度的選擇的技術。然而,特別在復合的均質脂質體混合物中準確可靠且可再現性測定脂質囊泡大小由于需要復雜的儀器或技術限制而依然具有挑戰性。將微流體擴散光譜法用于測定熒光標記的脂質體的大小并且在具有不同大小的脂質體混合物中分辨囊泡的大小。
制備用于測定大小的擠出孔直徑是30nm和100nm的熒光脂質體均質溶液以及二者的1:1混合物。將微流體擴散光譜法用于分析脂質體并且計算其大小。對于所有的樣品,測量沿著微型通道在各自與一個不同擴散時間相對應的三個測量點處的熒光強度,以獲得擴散曲線(圖13(a)、圖13(c)和圖13(e))。使用如上所述的一種微流體射流裝置。
擠出通過具有15nm孔半徑的小囊泡比擠出至50nm半徑的較大囊泡更快地擴散(如由斯托克斯愛因斯坦關系所預期的)。在每個測量點處,較小囊泡更廣泛地傳播通過該通道,并且在較小脂質體的情況下,在通道中間的初始入口位置處的熒光強度更快速地減小。通過具有基底函數的線性疊加的擴散曲線的最小平方擬合來獲得最佳擬合大小分布(圖13(b)、圖13(d)和圖13(f)),從而描述了限定大小的顆粒的擴散行為。
通過對于擠出至30nm、100nm和二者的混合物的囊泡分別是0.05、0.14和0.06的低卡方值來證實良好擬合。擠出通過具有15nm半徑的孔的過濾器的脂質體的平均流體動力學半徑被確定為22nm,并且發現具有50nm擠出半徑的脂質體具有45nm的流體動力學半徑。該混合物的分析揭示了兩種物質的單獨群體,其中二者明確分離。
相同樣品的DLS測量值以相同順序揭示了脂質體的平均流體動力學半徑的結果:對于擠出至15nm半徑的囊泡是27nm并且對于擠出至50nm半徑的囊泡是53nm。然而,通過DLS發現的大小分布廣泛地分布,這使得難以可靠地檢測一種混合物中的兩個不同的峰。在微流體擴散在混合物中的兩種脂質體物質之間明確區分而沒有任何先驗信息時,DLS僅在使分析偏向一個異質樣品時鑒別兩個部分重疊的峰。在沒有關于樣品多分散性的任何先驗信息的情況下,發現具有一個平均大小的一個單一、明顯的寬峰,該平均大小從較大囊泡的平均半徑稍微向較小囊泡的平均半徑偏移(數據未示出),在該情況下,區分的準確度是非常差的并且達到檢測限。與DLS不同,擴散光譜法沒有偏向較大的、較高的散射顆粒。
認為在進一步改變在此所述的擴散測量技術的情況下可以提高所記錄的這些脂質體的流體動力學半徑的準確度。
正如與以上所述的關于α-B晶狀體蛋白的實驗一樣,微流體擴散測量技術允許測定復合多分散混合物的顆粒大小。擴散測量值的特征在于它們具有一個相對低的樣品消耗、增加的靈敏度和再現性,并且發生對異質混合物中顆粒大小的測定而沒有顯著偏向具有大流體動力學半徑的物質。
實驗
熒光脂質體的制備.將氯仿(阿盤提極性脂質公司(Avanti Polar Lipids))中的1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酰乙醇胺-N-羧基熒光素(PE CF)熒光脂質用作測定大小實驗中所使用的脂質體的熒光標簽。使用干氮蒸發氯仿以獲得一個脂質膜。然后將該膜重懸于重蒸餾水,在液氮中冷凍并且將其凍干過夜以干燥。將干燥的熒光脂質重懸于最終含量10%的熒光脂質中,在20mM NaPi、0.01%NaN2中的1mM二肉豆蔻酰磷脂酰膽堿(DMPC)脂質(阿盤 提極性脂質公司)中,并且在室溫下將懸浮液徹底攪拌1h。通過五個凍融循環破壞所得大的多層囊泡,并且通過使用阿盤提微型擠出器(阿盤提極性脂質公司)擠出穿過具有不同大小的孔的聚碳酸酯膜過濾器(阿盤提極性脂質公司)來制備不同大小的多層囊泡。使用具有30nm和100nm直徑的孔直徑的擠出過濾器制備500μM脂質體儲備溶液。實際測量濃度是250μM其中使用25μM熒光脂質的。
微流體擴散光譜法.
用緩沖溶液(20mM NaPi,0.01%NaN2)填充該擴散裝置,并且將熒光標記的囊泡添加在相應入口中。如以前一樣使用neMESYS注射器泵(Cetoni公司)以設定總抽取流速為80μL/h。在使用Evolve 512EMCCD照相機(光測量公司)的Axio Observer.D1顯微鏡(蔡司公司)上使用ET-GFP濾光立方體(型號49002,彩度科技有限公司)觀察到結合在脂質體中的熒光團。圖像數據被擬合到線性疊加的一組基底函數中,如上所述的。
動態光散射(DLS)。如上所述地進行動態光散射實驗。
參考文獻
在本說明書中提及的所有文獻均通過引用以其全部內容結合在此。
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