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旋轉性隔離的翻譯元件.pdf

摘要
申請專利號:

CN201480004301.X

申請日:

2014.01.16

公開號:

CN104919059A

公開日:

2015.09.16

當前法律狀態:

授權

有效性:

有權

法律詳情: 授權|||專利申請權的轉移IPC(主分類):C12Q 1/68登記生效日:20170209變更事項:申請人變更前權利人:埃默拉爾德云實驗室有限公司變更后權利人:埃默拉爾德治療有限公司變更事項:地址變更前權利人:美國加利福利亞州變更后權利人:美國加利福利亞州|||著錄事項變更IPC(主分類):C12Q 1/68變更事項:申請人變更前:埃默拉爾德治療有限公司變更后:埃默拉爾德云實驗室有限公司變更事項:地址變更前:美國加利福利亞州變更后:美國加利福利亞州|||實質審查的生效IPC(主分類):C12Q 1/68申請日:20140116|||公開
IPC分類號: C12Q1/68; C07H21/00; C12N5/10; G06F19/20 主分類號: C12Q1/68
申請人: 埃默拉爾德治療有限公司
發明人: 丹尼爾·J·科萊博; 布瑞恩·M·福瑞扎; 布拉德·邦德; 喬納森·隆; 喬治·W·弗拉瑟
地址: 美國加利福利亞州
優先權: 61/754,339 2013.01.18 US; 13/801,762 2013.03.13 US
專利代理機構: 廣州市天河區倪律專利代理事務所(普通合伙)44348 代理人: 倪小敏
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法律狀態
申請(專利)號:

CN201480004301.X

授權公告號:

104919059B||||||||||||

法律狀態公告日:

2017.06.20|||2017.03.01|||2017.03.01|||2016.02.10|||2015.09.16

法律狀態類型:

授權|||專利申請權、專利權的轉移|||著錄事項變更|||實質審查的生效|||公開

摘要

本發明提供能夠進行邏輯操作的核酸翻譯元件,其具有改善的效率、最大化的輸出和降低的非靶標效應,特別應用于生物學系統中。本發明還提供了利用這些翻譯元件轉換信號的方法。

權利要求書

權利要求書
1.  一種組合物,包含第一核酸復合物和第二核酸復合物,每一個均包含第一、第二、第三和第四核酸鏈,每個核酸鏈按順序包含第一、第二和第三片段,其中
第一復合物的第一、第二、第三和第四鏈的核酸鏈分別被定義為B-X-D,和F-Y-C,
第二復合物的第一、第二、第三和第四鏈分別被定義為E-Y-D,F-Z-G,其中每個字母表示一個片段,每個以“-”連接的一串字母表示一個鏈,
并且其中:第一復合物和第二復合物的每一個都包含形成在第一鏈的第二片段和第二鏈的第二片段之間的第一雙鏈區(在第一復合物和第二復合物中分別為和),形成在第三鏈的第二片段和第四鏈的第二片段之間的第二雙鏈區(和),形成在第一鏈的第三片段和第三鏈的第一片段之間的第三雙鏈區(和),以及形成在第二鏈的第一片段和第四鏈的第三片段之間的第四雙鏈區(和);
在第一復合物和第二復合物中的每一個中,第一鏈的第一片段(在第一復合物和第二復合物中分別為B和)、第二鏈的第三片段(和D)、第三鏈的第三片段(和G)以及第四鏈的第一片段(F和)是單鏈的;
第一復合物的第三鏈具有與第二復合物的第二鏈(E-Y-D)適當的序列互補性,從而允許它們之間在雜交條件下結合;并且
第一復合物的第四鏈(F-Y-C)具有與第二復合物的第一鏈()適當的序列互補性,從而允許它們之間在雜交條件下結合。

2.  根據權利要求1所述的組合物,所述組合物進一步包含第三核酸復合物,該第三核酸復合物包含第一和第二核酸鏈,每個鏈按順序包括第一片段、第二片段和第三片段,其中第一鏈和第二鏈分別被定義為E-Z-H和其中該第三核酸復合物包含形成在第一鏈的第二片段和第二鏈的第二片段之間的雙鏈區并且第一鏈的第一片段(E)和第二鏈的第三片段是單鏈的,并且其中:
第二復合物的第三鏈(F-Z-G)具有與第三復合物的第二鏈適當的序列互補性,從而允許它們之間在雜交條件下結合;
第二復合物的第四鏈具有與第三復合物的第一鏈(E-Z-H)適當的序列互補性,從而允許它們之間在雜交條件下結合。

3.  根據權利要求2所述的組合物,其中第一復合物的第三鏈的第三片段與第三復合物的第一鏈的第一片段(E)具有序列互補性,但在正常雜交條件下,由于對這兩個片段的任何一個或兩個進行化學修飾而使彼此不會穩定結合;并且第一復合物的第四鏈的第一片段(F)與第三復合物的第一鏈的第三片段具有序列互補性,但在正常雜交條件下,由于對這兩個片段的任何一個或兩個進行化學修飾而使彼此不會穩定結合。

4.  根據權利要求3所述的組合物,其中所述化學修飾包括以結合了mini-PEG的絲氨酸來源的γ-PNA替換核酸片段的糖-磷酸二酯骨架。

5.  根據權利要求4所述的組合物,其中所述化學修飾包括用三環胞嘧啶類似物取代核酸片段中的至少一個核苷的含氮堿基。

6.  根據權利要求4所述的組合物,其中所述化學修飾包括在核苷酸的糖基部分的2’位置引入雜原子。

7.  根據權利要求1所述的組合物,其中所述組合物進一步包含第四核酸復合物和第五核酸復合物,每個復合物包含第一、第二、第三和第四核酸鏈,每個鏈按順序包含第一、第二和第三片段,其中第四復合物的第一、第二、第三和第四鏈分別被定義為:K-R-M,和F-S-N,第五復合物的第一、第二、第三和第四鏈分別被定義為:E-S-M,F-Z-G和其中:
第四復合物和第五復合物的每一個都包含形成于第一鏈的第二片段和第二鏈的第二片段之間的第一雙鏈區(在第四復合物和第五復合物中分別為和)、形成于第三鏈的第二片段和第四鏈的第二片段之間的第二雙鏈區(和)、形成于第一鏈的第三片段和第三鏈的第一片段之間的第三雙鏈區(和)、以及形成于第二鏈的第一片段和第四鏈的第三片段之間的第四雙鏈區(和);
在第四復合物和第五復合物的每一個中,第一鏈的第一片段(在第一和第二復合物中分別為K和)、第二鏈的第三片段(和M)、第三鏈的第三片段(和G)以及第四鏈的第一片段(F和)都是單鏈的;
第四復合物的第三鏈具有與第五復合物的第二鏈(E-S-M)合適的序列互補性,從而允許它們在雜交條件下結合;
第四復合物的第四鏈(F-S-N)具有與第五復合物的第一鏈合適的序列互補性,從而允許它們在雜交條件下結合;
第二復合物的第三鏈(F-Z-G)和第五復合物的第三鏈(F-Z-G)具有合適的序列同一性從而允許它們在雜交條件下結合至相同的靶標核酸;
第二復合物的第四鏈和第五復合物的第四鏈具有合適的序列同一性從而允許它們在雜交條件下結合至相同的靶標核酸。

8.  一種組合物,包含:
(a)第一核酸復合物,包含(i)第一核酸鏈,按順序包括第一片段、第二片段和第三片段并且被定義為S-Q-P,其中每個字母表示一個片段,以“-”連接的字母串表示一個鏈,和(ii)第二鏈,按順序包括第一片段、第二片段、第三片段和第四片段并且被定義為其中第一復合物包含形成于第一鏈的第二及第三片段和第二鏈的第三及第四片段之間的雙鏈區和
(b)第二核酸復合物,包含(i)第一核酸鏈,按順序包含第一片段、第二片段和第三片段并且被定義為(ii)第二核酸鏈,按順序包含第一片段、第二片段和第三片段并且被定義為A-X-C,和(iii)第三鏈,按順序包含第一片段、第二片段和第三片段并被定義為其中該第二復合物包含形成于第一鏈的第三片段和第二鏈的第一片段之間的第一雙鏈區形成于第一鏈的第一片段和第三鏈的第三片段之間的第二雙鏈區和形成于第二鏈的第二片段和第三鏈的第二片段之間的第三雙鏈區
其中第一復合物的第一鏈的第一片段(S)、第一復合物的第二鏈的第一(A)和第二片段、第二復合物的第三鏈的第一片段(P)、第二復合物的第二鏈的第三片段(C)、以及第二復合物的第三鏈的第一片段是單鏈的;并且
其中第一復合物的第二鏈的第一、第二和第三片段具有與第二復合物的第一鏈的第三、第二和第一片段適當的序列互補性,從而分別允許它們在雜交條件下結合。

9.  根據權利要求8所述的組合物,其中第一復合物的第一鏈(S-Q-P-R)具有與病原性核酸的核酸片段適當的序列互補性,從而允許它們在雜交條件下結合。

10.  根據權利要求9所述的組合物,其中病原性核酸是病毒DNA、病毒RNA、細菌DNA、細菌RNA、突變的腫瘤DNA或腫瘤RNA。

11.  一種組合物,包含第一核酸復合物,包含(a)第一、第二、第三和第四核酸鏈,每個鏈按順序包含第一、第二和第三片段,以及(b)第一和第二RNA鏈,其中第一復合物包含:
(i)形成于第一鏈的第二片段和第二鏈的第二片段之間的第一雙鏈區;
(ii)形成于第三鏈的第二片段和第四鏈的第二片段之間的第二雙鏈區;
(iii)形成于第一鏈的第三片段和第三鏈的第一片段之間的第三雙鏈區;
(iv)形成于第二鏈的第一片段和第四鏈的第三片段之間的第四雙鏈區;
(v)形成于第三鏈的第三片段和第一RNA之間的第五雙鏈區;和
(vi)形成于第四鏈的第一片段和第二RNA之間的第六雙鏈區,并且
第一鏈的第一片段和第二鏈的第三片段(D)是單鏈的。

12.  根據權利要求11所述的組合物,其中所述組合物進一步包含第二核酸復合物,包含第一和第二核酸鏈以及第一和第二RNA鏈,其中:
第二復合物包含形成于第一鏈的第二片段和第二鏈的第二片段之間的第一雙鏈區、形成于第一鏈的第三片段和第一RNA鏈之間的第二雙鏈區、以及形成于第二鏈的第一片段和第二RNA鏈之間的第三雙鏈區,其中第一鏈的第一片段(E)和第二鏈的第三片段是單鏈的;
第一復合物的第三鏈與第二復合物的第二鏈具有合適的序列互補性,從而允許它們在雜交條件下結合;并且
第一復合物的第四鏈與第二復合物的第一鏈具有合適的序列互補性,從而允許它們在雜交條件下結合。

13.  一種組合物,包含:
(a)第一核酸復合物,包含(i)第一核酸鏈,按順序包含第一、第二和第三片段并被定義為B-X-D,(ii)第二核酸鏈,按順序包含第一、第二和第三片段并被定義為(iii)第三鏈,按順序包含第一、第二和第三片段并被定義為和(iv)第四鏈,按順序包含第一、第二和第三片段并被定義為F-Y-C,其中第一復合物包含形成于第一鏈的第二片段和第二鏈的第二片段之間的第一雙鏈區形成于第三鏈的第二片段和第四鏈的第二片段之間的第二雙鏈區形成于第一鏈的第三片段和第三鏈的第一片段之間的第三雙鏈區以及形成于第二鏈的第一片段和第四鏈的第三片段之間的第四雙鏈區以及
(b)第二核酸復合物,包含(i)第一核酸鏈,按順序包含第一、第二和第三片段并被定義為(ii)第二核酸鏈,按順序包含第一、第二和第三片段并被定義為E-Y-D,(iii)第三鏈,按順序包含第一和第二片段,并被定義為F-Z,和(iv)第四鏈,按順序包含第一和第二片段并被定義為其中第二復合物包含形成于第一鏈的第二片段和第二鏈的第二片段之間的第一雙鏈區形成于第三鏈的第二片段和第四鏈的第一片段之間的第二雙鏈區形成于第一鏈的第三片段和第三鏈的第一片段之間的第三雙鏈區以及形成于第二鏈的第一片段和第四鏈的第二片段之間的第四雙鏈區
其中第一復合物的第一鏈的第一片段(B)、第二鏈的第三片段第三鏈的第三片段以及第四鏈的第一片段(F),以及第二復合物的第一鏈的第一片段和第二鏈的第三片段(D)都是單鏈的;
其中第一復合物的第三鏈的第一、第二及第三片段(和)具有與第二復合物的第二鏈的第三、第二和第一片段(D、Y和E)合適的序列互補性,從而分別允許它們在雜交條件下結合;并且
其中第一復合物的第四鏈的的第三、第二和第一片段(C、Y和F)具有與第二復合物的第一鏈的第一、第二和第三片段(和)合適的序列互補性,從而分別允許它們在雜交條件下結合。

14.  根據權利要求13所述的組合物,其中第一復合物的第四鏈的第一片段(F)比第一復合物的第三鏈的第三片段長至少5個核苷酸(nt)。

15.  根據權利要求13所述的組合物,其中第二復合物的第四鏈的第一片段的長度至少為30個核苷酸(nt)。

16.  一種核酸復合物,其包含第一、第二、第三、第四、第五和第六核酸鏈,其中:
第一鏈按順序包含第一、第二、第三和第四片段并被定義為其中每個字母表示一個片段,以“-”相連的字母串表示一個鏈;
第二鏈按順序包含第一、第二、第三和第四片段并被定義為
第三鏈和第五鏈每一個按順序包含第一、第二和第三片段并被定義為A-Y-C;
第四鏈和第六鏈每一個按順序包含第一、第二和第三片段并被定義為
并且其中該復合物包含:
形成于第一鏈的第二片段和第二鏈的第三鏈之間的第一雙鏈區
形成于第一鏈的第四片段和第三鏈的第一鏈之間的第二雙鏈區
形成于第一鏈的第三片段和第四鏈的第三片段之間的第三雙鏈區
形成于第二鏈的第二片段和第五鏈的第一片段之間的第四雙鏈區
形成于第二鏈的第一片段和第六鏈的第三片段之間的第五雙鏈區
形成于第三鏈的第二片段和第四鏈的第二片段之間的第六雙鏈區和
形成于第五鏈的第二片段和第六鏈的第二片段之間的第七雙鏈區
并且第一鏈的第一片段第二鏈的第四片段(P)、第三和第五鏈的第三片段(C)以及第四和第六鏈的第一片段都是單鏈的。

17.  一種組合物,其包含第一、第二和第三核酸復合物,其中:
第一復合物包含第一、第二、第三和第四核酸鏈,每個鏈按順序包含第一、第二和第三片段并且分別被定義為B-W-D,和其中每個字母表示一個片段,每個以“-”相連的字母串表示一個鏈,并且其中第一復合物包含形成于第一鏈的第二片段和第二鏈的第二片段之間的第一雙鏈區形成于第三鏈的第二片段和第四鏈的第二片段之間的第二雙鏈區形成于第一鏈的第三片段和第三鏈的第一片段之間的第三雙鏈區和形成于第二鏈的第一片段和第四鏈的第三片段之間的第四雙鏈區
第二復合物包含第一、第二、第三和第四核酸鏈,每個鏈按順序包含第一、第二和第三片段并分別被定義為F-X-H,和J-Z-G,其中第二復合物包含形成于第一鏈的第二片段和第二鏈的第二片段之間的第一雙鏈區形成于第三鏈的第二片段和第四鏈的第二片段之間的第二雙鏈區形成于第一鏈的第三片段和第三鏈的第一片段之間的第三雙鏈區以及形成于第二鏈的第一片段和第四鏈的第三片段之間的第四雙鏈區
第三復合物包含第一、第二、第三、第四、第五和第六核酸鏈,每個鏈按順序包含第一、第二、第三片段并分別被定義為I-Z-H,J-Q-M和其中第三復合物包含形成于第一鏈的第二片段和第二鏈的第二片段之間的第一雙鏈區形成于第三鏈的第二片段和第四鏈的第二片段之間的第二雙鏈區形成于第五鏈的第二片段和第六鏈的第二片段之間的第三雙鏈區形成于第一鏈的第三片段和第三鏈的第一片段之間的第四雙鏈區形成于第二鏈的第一片段和第四鏈的第三片段之間的第五雙鏈區形成于第三鏈的第三片段和第五鏈的第一片段之間的第六雙鏈區以及形成于第四鏈的第一片段和第六鏈的第三片段之間的第七雙鏈區
其中,在第一復合物中,第一鏈的第一片段(B)、第二片段的第三片段第三鏈的第三片段(H)、第四鏈的第一片段是單鏈的;在第二復合物中,第一鏈的第一片段(F)、第二片段的第三片段第三鏈的第三片段和第四鏈的第一片段(J)是單鏈的;在第三復合物中,第一鏈的第一片段第二鏈的第三片段(D)、第五片段的第三片段(M)和第六鏈的第一片段是單鏈的,
并且其中:第一復合物的第三鏈和第三復合物的第二鏈具有合適的序列互補性,從而允許它們在雜交條件下結合;
第一復合物的第四鏈和第三復合物的第一鏈具有合適的序列互補性,從而允許它們在雜交條件下結合;
第二復合物的第三鏈和第三復合物的第四鏈(I-Z-H)具有合適的序列互補性,從而允許它們在雜交條件下結合;并且
第二復合物的第四鏈(J-Z-G)和第三復合物的第三鏈具有合適的序列互補性,從而允許它們在雜交條件下結合。

18.  一種組合物,包含第一和第二核酸復合物,其中:
第一復合物包含第一、第二、第三和第四核酸鏈,每個鏈按順序包含第一、第二和第三片段并分別被定義為B-X-D,和J-Z-C,其中每個字母表示一個片段,每個以“-”相連的字母串表示一個鏈,其中第一復合物包含形成于第一鏈的第二片段和第二鏈的第二片段之間的第一雙鏈區形成于第三鏈的第二片段和第四鏈的第二片段的第二雙鏈區形成于第一鏈的第三片段和第三鏈的第一片段之間的第三雙鏈區和形成于第二鏈的第一片段和第四鏈的第三片段之間的第四雙鏈區
第二復合物包含第一和第二核酸鏈,每個鏈按順序包含第一、第二和第三片段并且分別被定義為F-Y-D和并且包含第三核酸,第三核酸按順序包含第一和第二片段并且被定義為其中第二復合物包含形成于第一鏈的第二片段和第二鏈的第二片段之間的第一雙鏈區形成于第一鏈的第三片段和第三鏈的第一片段之間的第二雙鏈區形成于第二鏈的第一片段和第三鏈的第二片段之間的第三雙鏈區
其中第一復合物的第一鏈的第一片段(B)、第一復合物的第二鏈的第三片段第一復合物的第三鏈的第三片段第一復合物的第四鏈的第一片段(J)、第二復合物的第一鏈的第一片段(F)、第二復合物的第二鏈的第三片段是單鏈的;
并且其中:第二復合物的第三鏈和第一復合物的第三鏈的第一片段及第一復合物的第四鏈的第三片段(C)的按順序的組合具有合適的序列同一性以允許它們靶定至相同的靶標核酸序列。

19.  根據權利要求1所述的組合物,其中每個片段的長度為約5個堿基至約50個堿基。

20.  根據權利要求1所述的組合物,其中每個單鏈的片段的長度為約5個堿基至約30個堿基。

21.  根據權利要求1所述的組合物,其中所述組合物進一步包含藥學上可接受的載體。

22.  包含權利要求1所述的組合物的細胞。

23.  一種非瞬時性計算機可讀介質,其包含用于呈現或顯現權利要求1的組合物的程序代碼。

說明書

說明書旋轉性隔離的翻譯元件
相關申請的交叉引用
本申請根據35 U.S.C.§ 119(e)要求2013年1月18日提交的美國臨時申請61/754,339號的優先權,并根據35 U.S.C.§ 120要求2013年3月13日提交的美國臨時申請13/801,762號的優先權,通過引用將每篇申請的內容整體合并至本文中。
背景技術
以分子來制造納米級計算機具有很大的發展潛力,部分原因在于這種計算機可很好地解決某些計算問題。特別地,使用生物分子的計算機能夠與生物學環境相容,使得它們能夠用于復雜疾病的診斷,甚至治療。
將一種核酸序列翻譯成另一種核酸序列的能力基本上使人們能夠利用核酸建立邏輯門和網絡。這些門和網絡通過兩個事件驅動,即雜交和鏈置換,這兩者通常是熱動力學上有利的,即它們涉及從較高能量狀態到較低能量狀態的轉變。因此,兩個事件可在系統內自發進行。
雜交涉及核酸的游離的單鏈片段。因此,可通過這些游離片段的可獲得性來調節核酸網絡。
“隔離事件(sequestering event)”允許某些序列有條件地用于網絡的其余部分。這些事件賦予了翻譯元件(translators)的構造,翻譯元件將一個單鏈核酸序列轉化為一個不同的單鏈核酸序列。這些翻譯元件是利用核酸建立基本邏輯算子的基礎,這些基本邏輯算子例如是與(AND)、非(NOT)、或(OR)、與非(NAND)、或非(NOR)和異或非(XNOR)。通過這些以及其他邏輯組件,可以建造包括例如放大元件的組件的較大網絡。因此,這些翻譯事件對于利用核酸的信息處理以及分子計算是重要的。
發明內容
根據本發明的一個方面,本發明提供一種組合物,其包含第一核酸復合物和第二核酸復合物,每一個均包含第一、第二、第三和第四核酸鏈,每個核酸鏈按順序包含第一、第二和第三片段,其中第一復合物的第一、第二、第三和第四鏈的核酸鏈分別被定義為B-X-D,和F-Y-C,第二復合物的第一、第二、第三和第四鏈分別被定義為E-Y-D,F-Z-G,其中 每個字母表示一個片段,每個以“-”連接的一串字母表示一個鏈,并且其中:第一復合物和第二復合物的每一個都包含形成在第一鏈的第二片段和第二鏈的第二片段之間的第一雙鏈區(在第一復合物和第二復合物中分別為和),形成在第三鏈的第二片段和第四鏈的第二片段之間的第二雙鏈區(和),形成在第一鏈的第三片段和第三鏈的第一片段之間的第三雙鏈區(和),以及形成在第二鏈的第一片段和第四鏈的第三片段之間的第四雙鏈區(和);在第一復合物和第二復合物中的每一個中,第一鏈的第一片段(在第一復合物和第二復合物中分別為B和)、第二鏈的第三片段(和D)、第三鏈的第三片段(和G)以及第四鏈的第一片段(F和)是單鏈的;第一復合物的第三鏈具有與第二復合物的第二鏈(E-Y-D)適當的序列互補性,從而允許它們之間在雜交條件下結合;并且第一復合物的第四鏈(F-Y-C)具有與第二復合物的第一鏈適當的序列互補性,從而允許它們之間在雜交條件下結合。
在一個方面,該組合物進一步包括第三核酸復合物,該第三核酸復合物包含第一和第二核酸鏈,每個鏈按順序包括第一片段、第二片段和第三片段,其中第一鏈和第二鏈分別被定義為E-Z-H和其中該第三核酸復合物包含形成在第一鏈的第二片段和第二鏈的第二片段之間的雙鏈區并且第一鏈的第一片段(E)和第二鏈的第三片段是單鏈的,并且其中:第二復合物的第三鏈(F-Z-G)具有與第三復合物的第二鏈適當的序列互補性,從而允許它們之間在雜交條件下結合;第二復合物的第四鏈具有與第三復合物的第一鏈(E-Z-H)適當的序列互補性,從而允許它們之間在雜交條件下結合。
在一些方面,第一復合物的第三鏈的第三片段與第三復合物的第一鏈的第一片段(E)具有序列互補性,但在正常雜交條件下,由于對這兩個片段的 任何一個或兩個進行化學修飾而使彼此不會穩定結合;并且第一復合物的第四鏈的第一片段(F)與第三復合物的第一鏈的第三片段具有序列互補性,但在正常雜交條件下,由于對這兩個片段的任何一個或兩個進行化學修飾而使彼此不會穩定結合。
適于本發明技術的化學修飾包括,但不限于,以結合了mini-PEG的絲氨酸來源的γ-PNA替換核酸片段的糖-磷酸二酯骨架。在一些方面,化學修飾包括用三環胞嘧啶類似物取代核酸片段中的至少一個核苷的含氮堿基。在一個方面,化學修飾包括在核苷酸的糖基部分的2’位置引入雜原子。
這些復合物的圖示及其相互關系見圖6A,其中翻譯元件102對應于第一復合物,翻譯元件103對應于第二復合物,翻譯元件104對應于第三復合物。類似地,圖10-13、14A-D和15-16也圖示了本發明范圍內的翻譯元件(核酸復合物),包括每個單獨的翻譯元件以及它們的作為翻譯元件群組形式(或組合物形式)的組合。
在一個方面,每個片段的長度為約5個堿基至約50個堿基。在另一個方面,每個單鏈片段的長度為約5個堿基至約30個堿基。
在本發明的范圍內,每種組合物可進一步任選地包含藥學上可接受的載體。本發明的一些實施方式進一步提供一種包含本發明的組合物或復合物的細胞。
本發明還提供適于模擬、設計、記錄、報道或分析本發明公開的技術的某些方面的計算機執行的方法以及非瞬時性計算機可讀介質。
附圖說明
附圖作為本發明的實施方式來提供,僅作為舉例圖示,并非作為限制。
圖1A圖示核酸翻譯元件的固相隔離實施方式,其中單個區段(A、B等)代表任意長度和序列的寡核苷酸片段。
圖1B圖示核酸翻譯元件的固相隔離實施方式如何隔離寡核苷酸片段。
圖2A圖示核酸翻譯元件的“立足點(toe-hold)”隔離實施方式。同樣地,單個區段代表任意長度和序列的寡核苷酸片段。
圖2B圖示圖2A中所示的立足點隔離實施方式如何隔離寡核苷酸片段。
圖3A顯示包含三個立足點隔離的核酸翻譯元件的系統。所顯示的反應都是鏈置換反應,都通過圖2A所示的分支遷移機制進行。
圖3B顯示具有與圖3A中所示的寡核苷酸相同的寡核苷酸系統,但不具有鏈置換反應,而是顯示立足點“碰撞”,其中立足點被不能產生鏈置換反應的序列結合。這種結合事件占據了立足點,使得期望的鏈不能結合。
圖4a-b顯示37℃時PBS緩沖液(137mM NaCl,2.7mM KCl,10mM Na2HPO4,1.76mM KH2PO4,pH 7.4)中具有立足點(a)或不具有立足點(b)時的交換反應。利用標準曲線將熒光信號轉化為濃度。a)50nM雙鏈與10-200nM[(A24)]0滴定液(10nM的增量)孵育(藍色變紅色),通過熒光共振能量轉移法(FRET)監測游離[F-(A24)]t的濃度。b)50nM雙鏈與10-200nM滴定液(10nM的增量)(從低到高)混合,的濃度通過FRET監測。
圖5顯示用于設計翻譯元件的立足點交換法。
圖6A-6B圖示旋轉隔離系統中使用的核酸復合物(翻譯元件)。
圖7顯示核酸類似物的經修飾的骨架結構,其中“B”代表任意核堿基,(a)顯示在DNA中發現的天然磷酸二酯骨架,(b)顯示肽核酸,(c)顯示胍基肽核酸,(d)顯示L-絲氨酸來源的γ-PNA,(e)顯示二酰胺基磷酸酯(在本文中具有嗎啉代糖),(f)和)g)顯示結合了mini-PEG的絲氨酸來源的γ-PNA。
圖8圖示了核酸類似物的經修飾的糖結構,其中“B”代表任意核堿基,(a)顯示在DNA中發現的天然脫氧核糖,(b)顯示嗎啉基,(c)顯示鎖核酸,(d)顯示氟修飾的RNA衍生物。
圖9圖示核酸類似物的經修飾的核堿基結構,(a)甲基胞嘧啶,(b)二氨基嘌呤,(c)吩惡嗪,(d)G形夾。
圖10示出mRNA適配元件(adaptor)。
圖11顯示RNAi適配元件。
圖12圖示反義適配元件。
圖13顯示扇入翻譯元件群組。
圖14A-14D示出四個扇出翻譯元件群組。這些群組中的兩個產生兩個或更多個相同的翻譯元件,因此起到擴增元件的作用(A和B),而另外兩個群組產生兩個或更多個不同的下游翻譯元件(C和D)。
圖15圖示一個復合條件性翻譯元件群組。
圖16顯示一個反相元件(inverter)。
圖17A-M圖示旋轉隔離翻譯元件(RST)網絡和立足點隔離翻譯元件(THST)網絡關于前景信號和背景信號的模擬結果,其中使用了不同尺寸的立足點,尺寸范圍為3個核苷酸(nt)至15nt(如圖所示)。所有模擬都以100nM翻譯元件進行3個階段。
圖18A-D顯示RST網絡和THST網絡在不同網絡深度(即涉及的翻譯元件/階段的數量,如圖所示)時的模擬結果。所有模擬均以8-nt立足點在100nm翻譯元件濃度處進行。
圖19A-N顯示以中等大小網絡(5個階段)進行的長立足點(13nt)和短立足點(8nt)的模擬結果,并且顯示網絡行為如何隨著所示的翻譯元件的濃度的改變而變化。
某些附圖或全部附圖都是示例性的圖示,因此它們不必然示出所示元件的實際相對尺寸或位置。附圖僅為了說明一個或多個實施方式的目的而提供,應當明確理解的是它們不能被用來限制本發明的范圍。
具體實施方式
固相隔離、立足點隔離和立足點交換等多種方法可被用來翻譯核酸序列,從而建立邏輯算子和網絡。以下更詳細描述的這三種具體方法通過利用三程(three-way)、立足點介導的分支遷移反應的幾何學得以示例。然而,對于分支遷移反應,其他機制也是可能的,包括但不限于,四程分支遷移、四程加速遷移和多鏈復合物遷移。
因此,雖然為了說明目的以下所述實施方式利用了三程分支遷移,但是本發明預期到DNA邏輯門和網絡被建立以利用其它分支遷移途徑。相反,本發明的實施方式可被應用于任何分支遷移反應。
在說明書和附圖中,大寫字母,例如A、B、C、X、Y、Z(任選地具有下標或上標),被用來表示任意長度的寡核苷酸的片段。相應的A’、B’、C’、X’、Y’、Z’,或可互換使用的表示各自的反向互補序列。
術語“寡核苷酸”、“多核苷酸”和“核酸”包括所有形式的核酸分子。該類別包括,但不限于,核糖核酸(RNA)、脫氧核糖核酸(DNA)、肽核酸(PNA)及其衍生物,分別可具有和不具有修飾。
固相隔離
固相隔離通過珠、納米顆粒或表面將空間內的相關序列/鏈物理性隔開。這種方法利用了位點分離的原理,其廣泛應用于有機化學中。固相隔離幾何學中的這些置換事件的發生時序可通過調節所需的鏈是處于系統的溶液相還是固相中而受控制。
圖1A顯示翻譯元件的基本固相隔離裝置,翻譯元件是允許系統將一種核酸序列替換為另一種核酸序列的組件。對于鏈A’-X’,A和X的每一個代表任意長度和序列的一段寡核苷酸,X’和A’代表它們各自的反向互補序列。鏈A’-X’結合至固體載體并且最初與Y-B-X雜交,形成不完全堿基配對雙鏈體形式的核酸結構,其可用作翻譯元件。在該構造中,鏈Y-B-X是被固相隔離的,因此不能與系統的其余部分相互作用。但是,在鏈X-A(也稱為多核苷酸置換分子)的存在下,鏈Y-B-X可從固體載體被置換出來并暴露于系統的溶液相,而鏈X-A被結合至載體。該操作包括兩個步驟:第一個步驟是互補序列A和A’的雜交(通常稱為“立足點結合”)。在第二個步驟中,鏈X-A的X區結合至鏈A’-X’的X’區,置換Y-B-X的X區,并將該鏈釋放到溶液中,而讓X-A與固體載體結合(該步驟通常稱為“分支遷移反應”)。這個兩步驟程序有效地將游離X-A鏈翻譯成游離Y-B-X鏈。
圖1B顯示的系統具有輸入鏈X-A,其與不完全堿基配對的雙鏈體(“翻譯元件1”)相互作用。輸出包括完全堿基配對雙鏈體A’-X’/X-A(被認為是“廢”產物),以及輸出鏈Y-B-X(被稱為“輸出1”并且可被作為進一步反應中的“輸入2”)。“輸入2”與“翻譯元件2”相互作用,從而產生“輸出2”和另一種廢產物。在該圖中,鏈Y-B-X的B區圖示序列在該網絡中的隔離。開始時,Y-B-X不能與翻譯元件2的B’區雜交,因為兩者被分離在單獨的固體載體上。當輸入1結合至翻譯元件1并釋放Y-B-X到溶液中時,Y-B-X隨后可與翻譯元件2相互作用。因此,Y-B-X和翻譯元件2相互作用的能力取決于輸入1的存在。
由于位阻效應,結合至一個固體表面的鏈與結合至另一固體表面的鏈極其緩慢地相互作用。因此,溶液相中的鏈是能夠與固相算子相互作用的唯一組件。
立足點隔離
立足點隔離與固相翻譯元件實現相同的操作,但通過將多段序列保持結合在雙鏈體中而起作用。正如在固相翻譯元件中一樣,置換事件可游離出感興趣的序列。所有鏈都可以共同在溶液中,其結果是,置換時間通過立足點的可獲得性而被調節。術語“立足點”在本文中是指提供置換事件的起點的單鏈核酸序列的短片段。
圖2A顯示立足點隔離的翻譯元件,其類似于圖1A中的翻譯元件,但是其基于立足點隔離而非固相隔離。在該實施例中,翻譯元件的A’區是立足點,其結合輸入鏈并允許鏈置換反應進行。
圖2B顯示基于立足點的系統,其具有與不完全堿基配對雙鏈體“翻譯元件1”相互作用的輸入鏈A-X-B。輸出包括廢產物(即完全堿基配對雙鏈體B’-X’-A’/A-X-B)和“輸出1”鏈X-B-Y-C(可用作進一步反應的“輸入2”)。“輸入2”與“翻譯元件2”相互作用,并產生“輸出2”和另一廢產物。在該圖中,X-B-Y-C的B區在翻譯元件1中通過雜交至互補的B’區而被隔離,因而不能與翻譯元件2的B’區相互作用。X-B-Y-C與翻譯元件2的相互作用能力取決于系統內輸入1(A-X-B)的存在。
雖然立足點幾何學可能非常有用,但是其用途到目前為止受到包含這種立足點幾何學的系統能夠傳播信息的速度的限制。常規立足點隔離法中的固有限制常常可以將形成的傳播降低至生物學上有用的時間尺度以下。更具體地說,由于碰撞相互作用,立足點隔離的翻譯元件僅在很窄的濃度動態范圍內以適宜的速度起作用。通常調整立足點的長度,可使碰撞相互作用在較低濃度時成為可逆的。但是,當濃度增加時,碰撞將占主要部分,系統將會慢慢停止。另一方面,當濃度降低時,立足點介導的置換也將慢慢停止。在這個意義上,要注意的是,在生物體內,濃度變化很大,因而這樣的翻譯元件很難適用于試劑的生物體環境。動力學瓶頸被認為是由非生產性反應造成的,非生產性反應在本文也稱作“立足點碰撞”,其發生于立足點被不能產生置換反應的具有互補序列或“碰撞鏈”的分子結合時。
例如,圖3A顯示了具有三個立足點隔離的核酸翻譯元件的系統,其與圖2A中的系統非常類似。但是,如果三個鏈都共同處于溶液中,可能發生其他結合事件。圖3B圖示了可能發生的一些非生產性結合事件或碰撞。通過引入“多核苷酸碰撞分子”,這些事件不會導致置換反應,但可使系統減緩,因為碰撞鏈的發生阻礙可產生置換反應的鏈結合。當核酸翻譯元件的濃度在系統內升高時,這種碰撞事件可變得更加占優勢。
這種方法的另一個限制在于由翻譯元件的大的單鏈區的暴露導致的潛在毒性。例如,當單鏈區結合至細胞的內源性DNA或RNA時,它可改變該DNA或RNA分子的轉錄、翻譯或其他功能。這種“非靶標”事件可導致細胞內的不期望的后果。
還有一個限制在于潛在的信號泄漏,這是由翻譯元件在不存在暴露的立足點的情況下的背景反應導致的,這也可能導致不期望的后果。例如,圖4a顯示了翻譯元件和立足點之間的反應性隨著立足點濃度的升高而上升。但是,在不存在立足點的情況下,也觀察到了背景反應性(圖4b)。
一種建議的解決方案是保持立足點較短從而減輕碰撞對系統的影響:立足點越短,互補序列的開關速度越快。因此,常見的是5個或6個核苷酸長度的立足點,因為在這些長度時,如果非生產性結合事件發生,雙鏈的“碰撞”狀態持續的時間則短。
但是,該方法造成了前述的動力學瓶頸,因為生產性結合事件受到相同的熱動力學參數的限制;因此,加入的鏈同樣不會牢固地結合至這些立足點。因此,當結合了正確的加入鏈時,期望的置換并非總是出現,因為它需要處于結合狀態足夠長的時間,以啟動置換反應。因此,短立足點的使用增加了出現特定操作和產生輸出所需的時間量。換言之,在發生許多結合事件(包括碰撞鏈結合和期望鏈結合)之前,置換反應不會發生。這種低效率限制了該系統的實用性,其將信息的傳播減慢到太長而無不能利用的時間尺度。
較短的立足點,聯合翻譯元件上的較短的單鏈區,也可幫助降低毒性。但是,較短的立足點不能解決信號泄漏的問題。
立足點交換
“立足點交換”使用于立足點隔離類似的配對相互作用,但使用不同的幾何學。立足點交換嘗試解決由立足點隔離途徑造成的立足點碰撞問題。參考圖5,初始立足點A-B僅與該立足點正下方的雙鏈體的單鏈區部分地互補(即)。類似地,當B-C-D立足點通過與A-B立足點的交換反應而產生時,B-C-D立足點也僅與其下方的雙鏈體的單鏈區部分地互補。這樣將不會發生立足點碰撞。
但是,立足點交換法也具有固有限制。首先,與立足點隔離類似,翻譯元件的長單鏈區可導致不期望的毒性作用(由與細胞內的內源性核酸非靶標結合導致)。
另一個問題涉及翻譯的動態濃度,這與立足點碰撞中遇到的問題類似,但不相同。但該問題對于立足點交換而言不太嚴重,因為相比于產率,它對翻譯的速度影響更大。在這種情況下,立足點的長度決定了自發解離的速率,較短的立足點自發解離速度較快。另一方面,長度還決定了正向置換速率,但較長的立足點使正向置換更快。因此,在這些限制因素之間存在一個依賴于濃度的方式的平衡。
立足點交換法的一個重要限制在于低產率,因為所有的反應都是雙向的,導致對終產物的無青睞性,除非例如整個翻譯最終被結合至不可逆反應。
旋轉隔離的翻譯元件
本發明提供了一系列翻譯元件,其解決了以上詳細描述的各種方法帶來的問題。利用這些翻譯元件,使得非靶標的毒性作用和背景反應性最小化,可避免立足點碰撞,整體產率接近于完全,并且翻譯速度被顯著提高。
圖6A圖示了“旋轉隔離翻譯元件”系統中的某些基本組件。在頂部的是形成在兩個鏈A-X-C和之間的核酸復合物(101)。借助它們的序列互補性,形成有雙鏈區而A、C、和仍為單鏈。這種部分雙鏈體下文被稱為“雙立足點”。
圖6A中顯示的第二核酸復合物(102)由四個核酸鏈構成:B-X-D、和F-Y-C。如圖所示,這些鏈在它們之間形成四個雙鏈區,在端部形成四個單鏈區。這四個鏈中的一個,與第一復合物中的其中一個鏈A-X-C互補,另一個鏈B-X-D與第一復合物中的另一個鏈互補。
借助于突出的單鏈區的序列互補性,第一復合物(101)具有適當的序列互補性,從而能夠結合第二復合物(102),這啟動了涉及6個鏈的鏈置換反應。鏈置換反應的輸出包括兩個完全退火的雙鏈體(105和106)以及一個新的雙立足點(107),該新的雙立足點具有在中部的雙鏈區以及四個獨立的單鏈區(圖6B)。
圖6B顯示輸出核酸復合物(105、106和107)處于較低能量狀態,因為存在兩個完全的雙鏈體(105)和(106)。換言之,這種鏈置換強烈地傾向于正向方向,因此不容易逆轉。
新形成的雙立足點,由和F-Y-C構成(107),隨后可啟動與圖6A中的第三核酸復合物(103)的另一個鏈置換反應(箭頭所示),從而繼續翻譯程序。類似地,從該置換反應生成的新的雙立足點可靶定第四復合物(104),依此類推。
如以上所解釋的,這種方式的鏈置換反應達到了高的產出速度,因為每個反應以比輸入核酸分子低得多的能量狀態產生輸出產物。而且,如表1所示,實驗數據顯示這種雙立足點介導的反應也可以很快。將“雙立足點”欄與“3’立足點”或“5’立足點”中的那些進行比較。
表1.單立足點和雙立足點介導的鏈置換反應的反應速度比較

根據這些發現,本發明提供大量的翻譯元件和翻譯元件群組(有時也稱作“適配元件”)。翻譯元件或翻譯元件群組利用一個核酸分子(例如單鏈核酸、完全或部分雙鏈核酸、或更復雜的核酸結構或翻譯元件)作為輸入,并進行一個或多個鏈置換反應,以產生一個或多個核酸分子作為輸出。每個輸入或輸出可作為系統內其他翻譯元件或翻譯元件群組的輸出或輸入。因此,每個翻譯元件和翻譯元件群組起到一個邏輯算子的作用,它們組合起來執行期望的計算和信息傳送。
因此,本發明的一個實施方式提供一種組合物,其包含第一核酸復合物和第二核酸復合物,每個均包含第一、第二、第三和第四核酸鏈。每個鏈按順序(即從5’至3’,連續地或用中間核苷酸隔開)第一片段、第二片段和第三片段,其中對于第一復合物的第一、第二、第三和第四鏈,核酸鏈分別被定義為:B-X-D、和F-Y-C,對于第二復合物的第一、第二、第三和第四鏈,核酸鏈分別被定義為:E-Y-D、F-Z-G、每個字母表示一個片段,以“-”連接的每個字母串表示一個鏈。
在一個方面,第一復合物和第二復合物的每一個包含形成于第一鏈的第二片段和第二鏈的第二片段之間的第一雙鏈區(在第一復合物和第二復合物中分別為和)、形成于第三鏈的第二片段和第四鏈的第二片段之間的第二雙鏈區(和)、形成于第一鏈的第三片段和第三鏈的第一片段之間的第三雙鏈區(和)、以及形成于第二鏈的第一片段和第四鏈的第三片段之間的第四雙鏈區(和)。
在第一復合物和第二復合物的每一個中,第一鏈的第一片段(在第一復合物和第二復合物中分別為B和)、第二鏈的第三片段(和D)、第三鏈的第三片段(和G)和第四鏈的第一片段(F和)都是單鏈的。
而且,第一復合物的第三鏈具有與第二復合物的第二鏈(E-Y-D)合適的序列互補性,從而允許它們在雜交條件下結合;并且第一復合物的第四鏈(F-Y-C)具有與第二復合物的第一鏈合適的序列互補性,從而允許它們在雜交條件下結合。
在一個方面,所述組合物進一步包含第三核酸復合物,其包含第一核酸鏈和第二核酸鏈,每個鏈按順序包含第一、第二和第三片段,其中第一鏈和第二鏈分別被定義為E-Z-H和其中第三核酸復合物包含形成于第一鏈的第二片段和第二鏈的第二片段之間的雙鏈區并且第一鏈的第一片段(E)和第二鏈的第三片段是單鏈的,并且其中:第二復合物的第三鏈(F-Z-G)具有與第三復合物的第二鏈合適的序列互補性,從而允許它們在雜交條件下結合;并且第二復合物的第四鏈具有與第三復合物的第一鏈(E-Z-H)合適的序列互補性,從而允許它們在雜交條件下結合。
化學修飾以避免立足點碰撞
本發明還提供了防止立足點碰撞的方法。如圖6A所示,由于暴露出的單鏈區和立足點碰撞仍可發生于例如立足點(101)和復合物(103)之間。
在一個這樣的方法中,每個可能在翻譯過程中以單鏈被暴露出來的核酸片段都經受潛在的化學修飾。除了其自然狀態(狀態N,在例如CN中以下標表示),每個這樣的片段都可被修飾而形成兩種狀態,分別為狀態R(例如右旋)和狀態L(左旋),只要這樣的修飾允許(或促進)和阻止(或抑制)特定狀態的互補鏈之間的結合,如下表2所示。
表2.化學修飾的結合目的
其中一個鏈的修飾互補鏈的修飾允許/抑制結合NN允許NR允許NL允許RR允許RL抑制LL允許
通過這樣的修飾,在一個方面,第一復合物102的第三鏈的尾部片段具有與第三復合物(104)的第一鏈的第一片段的頭部片段(ER)相反的序列互補性,但不會穩定地與其結合。同樣,在另一個方面,第一復合物(102)的第四鏈的頭部片段(FL)具有與第三復合物(104)的第一鏈的第一片段的尾部片段相反的序列互補性,但不會穩定地與其結合。因此,不會發生立足點 碰撞,并且這些修飾保證了置換反應以受控的方式進行。因此,在一個方面,術語“旋轉”是指調節隔離的修飾(L和R),而非所使用的交換反應。
如本文所使用的,術語“不會穩定地與其結合”表示兩個核酸鏈不會形成穩定的雙鏈體結構,即使它們共享序列互補性。在一些方面,“穩定的”雙鏈體結構是指能夠以非瞬時的形式存在的雙鏈體并且在反應溶液中的濃度高于每個單獨的鏈的總濃度的0.1%、或1%、或5%、或10%。
如下文進一步描述的,能夠實現表2中定義的結合目的的化學修飾是已知的。“化學修飾”在本文中并不限于在核酸分子產生后對其進行化學性的修飾;該術語還包括在產生該核酸分子期間引入經化學修飾的核苷酸。
有許多已充分研究的核酸修飾可被用來調節與天然DNA或RNA結合的熱動力學性質。它們包括對寡核苷酸的骨架、糖或核堿基的改變。這些修飾可單獨使用或彼此結合使用;即,使用經修飾的骨架并不排除在相同的鏈中使用經修飾的核堿基。
核酸骨架類似物可被用來改善能夠產生置換反應的鏈的結合。有許多不同的類似物可供使用,所有這些都提供比天然核酸更加緊密的對DNA和RNA的結合親和性。這些類似物包括但不限于具有不帶電的骨架(肽核酸或二酰胺基磷酸酯)、帶正電的骨架(胍基肽核酸)、允許預組構(pre-organization)的氫結合基團(γ肽核酸)的核酸。在一個方面,骨架包括結合了mini-PEG的絲氨酸衍生的γ-PNA,如圖7f-g所示。
某些類似物的大體結構見圖7。這些類似物都提高核酸雜交反應的熱動力學,允許更緊密的立足點結合,因而允許更快的置換。通過在邏輯網絡的特定位置使用這些類似物,與碰撞相互作用相比,可強有力地朝期望的置換反應方向進行,因而加快期望的鏈置換反應的速率。
使用經修飾的糖環也可改變寡核苷酸結合DNA或RNA的熱動力學。使用最廣泛的類似物是嗎啉代、鎖核酸(LNA)和LNA衍生物。其他經修飾的糖在文獻中被證明在改變結合熱動力學方面也可以產生類似效果。它們的例子為在1’、2’、3’或4’位具有修飾的糖以及核糖環戊烷環中的氧被不同原子取代的糖。這些類似物圖示于圖8中。
核堿基修飾也可用來實現與骨架和糖類似物相同的作用;即,改變特定雜交反應的熱動力學。這些堿基包括甲基胞嘧啶、二氨基蝶呤、G形夾和吩惡嗪(圖 9),它們均提高鏈對其反向互補序列的結合親和性。核堿基修飾存在的另一個機會涉及偽互補堿基。這類堿基類似物彼此形成弱堿基對,但與標準堿基形成強堿基對。一個這樣的堿基對是2-氨基腺嘌呤(nA)和2-硫代胸腺嘧啶(sT)。這些堿基可用于有利于一條鏈結合同時不利于另一條鏈結合,這是提高生產性結合事件幾率同時降低碰撞幾率的一個例子。
可用于改變結合相互作用的熱動力學的另一種化學修飾是引入荷電聚合物,如殼聚糖,其已在文獻中被顯示促進置換反應的速率。但是,因為這些聚合物非特異性地加速反應,所以它們必須結合上述其他修飾中的一種來應用,以能夠區別期望的和不期望的結合事件。
可使用不同的方法來合成具有上述化學修飾的分子。例如,設計經修飾的分子時可以考慮骨架化學。骨架化學用于將單個單體結合至較長的鏈中。涉及核堿基或糖但保持DNA/RNA的天然磷酸二酯骨架的修飾可以通過如用于天然單體的標準亞磷酰胺化學合成。這些方法的例子見于例如Beaucage,S.,and R.Iyer,Tetrahedron 48:2223(1992),in Brown,D.M.A,“Brief history of oligonucleotide synthesis,”20 METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY(Protocols for Oligonucleotides and Analogs)1–17(1993),in Reese,Colin B.,Organic & Biomolecular Chemistry 3:3851(2005),和Iyer,R.P.;and S.L.Beaucage,“7.05.Oligonucleotide synthesis,”7 COMPREHENSIVE NATURAL PRODUCTS CHEMISTRY(DNA and Aspects of Molecular Biology)105-52(1999)。前述公開文獻的各自內容通過引用以整體形式合并至本文中。
如果骨架以特定修飾被改變,則使用不同的化學。這種修飾化學在科學文獻中有描述。因此,肽核酸(PNA)及其衍生物依賴于酰胺鍵而使各個單體連接在一起。因此,并非利用亞磷酰胺化學,而是通過酰胺結合形成條件和偶聯劑(如HBTU)來制備這些單體的鏈。制備PNA或PNA樣寡核苷酸的方法可見于例如F.Beck,“Solid Phase Synthesis of PNA Oligomers,”METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY SERIES(Peptide Nucleic Acids),Humana Press,http://www.springerlink.com/content/mr571738x7t65067/。
這些化學修飾包括向DNA或PNA片段中引入旋向性。DNA(特別是PNA)的旋向性是一個已充分表征的特性,產生旋向性的方法也是已知的。參見例如Corradini et al.“Control of helical handedness in DNA and PNA nanostructures,” METHODS MOL BIOL.749:79-92(2011)。左旋DNA或PNA被阻止與右旋DNA或PNA結合,然而兩者都可結合至它們的天然副本。
另一種骨架修飾方法涉及嵌合寡核苷酸。這些是在相同分子中包含不同骨架化學的寡核苷酸鏈。例如,如果需要一半是PNA骨架、一半是DNA骨架的鏈,則需要一種方式來將這兩種骨架化學連接起來。制備這些嵌合鏈在本領域中通常是已知的。在上面PNA/DNA嵌合體的例子中,化學差異可通過利用修飾的NDA或PNA單體被橋接。對于DNA,5’-二甲氧基三苯甲基(DMT)保護的羥基被單甲氧基三苯甲基(MMT)保護的胺(在去保護后可以與PNA的羧酸反應)取代。對于PNA,受保護的N端氮被DMT保護的羥基(在去保護后可以與DNA上的亞磷酰胺基團反應)取代。這些方法在例如E.Uhlmann et al.,Angew.Chem.(Int’l ed.)37:2796–823(1998)中有進一步描述。
所有這些修飾,無論單獨使用或彼此結合使用,都能夠影響任意核酸網絡中的特定相互作用的熱動力學條件,從而在不改變序列組成的情況下,相對碰撞相互作用,有利于期望鏈或復合物的結合。所有這些相互作用可應用至任何分支介導的遷移反應,無論它們是3程分支遷移(如固相隔離、立足點隔離、或立足點交換)或是通過其他機制進行的分支遷移(例如四程分支遷移、四程加速分支遷移或多鏈復合物遷移)。
適配元件和翻譯元件群組
在本發明中提供的翻譯元件可被用來構建核酸計算機,其可用于醫學用途。例如,翻譯元件可“感測”到病毒核酸的存在,隨后進行一系列翻譯事件,導致調節RNA(如siRNA、反義RNA)的釋放,其可被用來啟動宿主細胞的抗病毒響應或凋亡,從而消除病毒。
I.mRNA適配元件
“感測”可實施為啟動一個或多個鏈置換反應,利用一個核酸(如病毒DNA/RNA、腫瘤DNA/RNA)作為輸入,并釋放出一個或多個立足點作為輸出。進行這樣的一個或多個鏈置換反應的翻譯元件被定義為“適配元件”。例如,在感測腫瘤mRNA的情況下,這種適配元件可被稱為“mRNA適配元件”。
圖10圖示了一個mRNA適配元件。在該mRNA(201)上有一個特別的序列,其具有一段片段或該mRNA的第一核酸復合物(202)被設計以包括兩條鏈,其中一條具有與該mRNA的互補序列(S-Q-P)。 另一條鏈,如圖10所示,與第一條鏈形成雙鏈區并且具有一個單鏈區
該mRNA適配元件中的第二復合物(203)包括至少三條鏈。第一鏈與復合物202的第二鏈部分地互補,從而與第二鏈和第三鏈形成兩個獨立的雙鏈區(和)。在缺少第一鏈的情況下,第二鏈和第三鏈以上述雙立足點的形式存在。
因此,在包含具有復合物202和203的mRNA適配元件的細胞中,一旦出現mRNA分子201,該mRNA啟動與復合物202的鏈置換反應,從而釋放出第二鏈所釋放的第二鏈隨后靶定復合物203,導致鏈置換反應,釋放出雙立足點形式的復合物(204),其包括第二鏈和第三鏈。該雙立足點(204)隨后能夠啟動如本文所述的額外鏈置換反應。參見例如圖6A。
這種“mRNA適配元件”并不僅僅感測mRNA分子。它可以感測任何單鏈核酸,包括但不限于病毒DNA和突變的病毒DNA。
因此,本發明提供一種組合物,其包含第一核酸復合物(例如圖10中的202)和第二核酸復合物(203)。該第一復合物(202)包含(a)第一鏈,按順序由第一片段(S)、第二片段(Q)、第三片段(P)和第四片段(Q)組成,和(b)第二鏈,按順序由第一片段(A)、第二片段第三片段和第四片段組成。該第一復合物包含形成于第一鏈的第二及第三片段(Q-P)和第二鏈的第三及第四片段之間的雙鏈區。
并且,該第二復合物(203)包含(a)第一鏈,按順序由第一片段(P)、第二片段(B)和第三片段組成,它們分別具有與第一復合物的第二鏈的第一片段(A)、第二片段和第三片段適當的序列互補性,從而允許它們在雜交條件下結合,(b)第二鏈,按順序由第一片段(A)、第二片段(X)和第三片段(C)組成,以及(c)第三鏈,按順序由第一片段第二片段和第三片段組成。該第二復合物(203)包含形成于第一鏈的第三片段和第二鏈的第一片段(A)之間的第一雙鏈區,形成于第一鏈的第二片段(B)和第三鏈的第三片段之間的第二雙鏈區,以及形成于第二鏈的第二片段(X)和第三鏈的第二片段之間的第三雙鏈區。
如圖10所示,可預期到對可暴露作為單鏈的核酸片段的化學修飾,以降低或避免立足點碰撞。
根據本發明的一個方面,本發明的一個實施方式提供一種組合物,其包含:(a)第一核酸復合物,包含(i)第一核酸鏈,按順序包括第一片段、第二片段和第三片段并且被定義為S-Q-P,其中每個字母表示一個片段,以“-”連接的字母串表示一個鏈,和(ii)第二鏈,按順序包括第一片段、第二片段、第三片段和第四片段并且被定義為其中第一復合物包含形成于第一鏈的第二及第三片段和第二鏈的第三及第四片段之間的雙鏈區和(b)第二核酸復合物,包含(i)第一核酸鏈,按順序包含第一片段、第二片段和第三片段并且被定義為(ii)第二核酸鏈,按順序包含第一片段、第二片段和第三片段并且被定義為A-X-C,和(iii)第三鏈,按順序包含第一片段、第二片段和第三片段并被定義為其中該第二復合物包含形成于第一鏈的第三片段和第二鏈的第一片段之間的第一雙鏈區形成于第一鏈的第一片段和第三鏈的第三片段之間的第二雙鏈區和形成于第二鏈的第二片段和第三鏈的第二片段之間的第三雙鏈區其中第一復合物的第一鏈的第一片段(S)、第一復合物的第二鏈的第一(A)和第二片段、第二復合物的第三鏈的第一片段(P)、第二復合物的第二鏈的第三片段(C)、以及第二復合物的第三鏈的第一片段是單鏈的;并且其中第一復合物的第二鏈的第一、第二和第三片段具有與第二復合物的第一鏈的第三、第二和第一片段適當的序列互補性,從而分別允許它們在雜交條件下結合。
在一個方面,第一復合物的第一鏈(S-Q-P-R)具有與病原性核酸的核酸片段適當的序列互補性,從而允許它們在雜交條件下結合。
在一個方面,病原性核酸是病毒DNA、病毒RNA、細菌DNA、細菌RNA、突變腫瘤DNA或腫瘤RNA。
II.RNAi適配元件
本發明進一步提供一種適配元件,其利用一個核酸分子作為輸入,并將RNAi(例如siRNA)分子作為輸出,因而當釋放后,該siRNA可進行預期的生物學功能。這種適配元件圖示于圖11中并包括復合物303和304。
在圖11中,復合物301代表雙立足點,其可通過上游翻譯元件產生,并且可靶定復合物302以進行鏈置換反應,從而導致新的雙立足點的釋放,該新的雙立足點包含該復合物的遠端半部的兩個核酸鏈。
復合物303類似于圖6A中的翻譯元件102-104,但與它們不同的是,復合物303包括兩個RNAi分子(和IRNA),這兩個RNAi分子在遠端(即圖中所示右側)結合至單鏈。另一方面,另一復合物(304)類似于一個雙立足點(例如圖6A中的立足點101),但區別在于在遠端包括兩個RNAi分子(和J)。
因此,當將復合物302的遠端(即右側)半部作為新的雙立足點釋放后,該新的雙立足點啟動與復合物303的鏈置換反應,導致釋放出包含該復合物的遠端部分以及RNAi鏈的復合物。這種新的復合物隨后可啟動與復合物304的鏈置換反應,導致釋放出所有的RNAi分子(IRNA,和J)。
因此,在一個實施方式中,本發明提供一種組合物,其包含第一核酸復合物,包含(a)第一、第二、第三和第四核酸鏈,每個鏈按順序包含第一、第二和第三片段,以及(b)第一和第二RNA鏈,其中第一復合物包含:(i)形成于第一鏈的第二片段和第二鏈的第二片段之間的第一雙鏈區;(ii)形成于第三鏈的第二片段和第四鏈的第二片段之間的第二雙鏈區;(iii)形成于第一鏈的第三片段和第三鏈的第一片段之間的第三雙鏈區;(iv)形成于第二鏈的第一片段和第四鏈的第三片段之間的第四雙鏈區;(v)形成于第三鏈的第三片段和第一RNA之間的第五雙鏈區;和(vi)形成于第四鏈的第一片段和第二RNA之間的第六雙鏈區,并且第一鏈的第一片段和第二鏈的第三片段(D)是單鏈的。
在一個方面,所述組合物進一步包含第二核酸復合物,包含第一和第二核酸鏈以及第一和第二RNA鏈,其中:第二復合物包含形成于第一鏈的第二片段和第二鏈的第二片段之間的第一雙鏈區、形成于第一鏈的第三片段和第一RNA鏈之間的第二雙鏈區、以及形成于第二鏈的第一片段和第二RNA鏈之間的第三雙鏈區,其中第一鏈的第一片段(E)和第二鏈的第三片段是單鏈的;第一復合物的第三鏈與第二復合物的第二鏈具有合適的序列互補性,從而允許它們在雜交條件下結合;并且第一復合物的第四鏈與第二復合物的第一鏈具有合適的序列互補性,從而允許它們在雜交條件下結合。
III.反義適配元件
適配元件也被用來接收來自上游翻譯元件的信號并釋放出反義RNA。參考圖12,復合物401代表典型的雙立足點(如上所述),復合物402類似于典型的旋轉隔離翻譯元件(如圖6A中的102-104),只是任選地,其中一個鏈具有較長的單鏈區(F)。這種較長的單鏈區(F)有助于維持翻譯元件403的穩定性,同時允許其他單鏈區足夠的短。同樣,它也允許翻譯元件402的單鏈區足夠的短,以使翻譯元件402和靶標404之間的不期望的反應最小化。
因此,當通過由立足點401啟動的鏈置換反應從復合物402釋放出后,該復合物(402)的遠端半部作為新的雙立足點靶定復合物403并釋放出包括F-Z和的部分雙鏈體。
因此,當接觸包含E-Z片段的細胞RNA分子,鏈隨后自由地結合至細胞RNA,進行鏈置換,并讓F-Z鏈留在溶液中。與細胞RNA之間的結合可導致細胞RNA的活性抑制(例如翻譯和剪切),其中片段起到了反義核酸的作用。
這種設計的獨特優點在于鏈可以很長。在反義應用中已知的是,反義核酸越長,其阻止翻譯越有效。但是,不幸的是,在常規技術中,較長的反義核酸導致更嚴重的非靶標效應(例如毒性)。這是因為這些反義核酸是單鏈的。本發明提供一種部分雙鏈體形式(即任何一條鏈或兩條鏈的一部分是單鏈的)的反義核酸(即鏈)。因此,該反義核酸即使長度很長,在該反義核酸結合至靶標細胞RNA之前,僅有小部分以單鏈形式暴露于溶液中。因此,這種減少的暴露降低了潛在的非靶標效應。
因此,在本發明中,具有大于例如30nt、35nt、40nt、45nt、50nt、55nt、60nt、65nt、70nt、80nt、90nt或100nt的長度的反義核酸可適合引入至生物學系統中。
因此,一個實施方式提供了一種組合物,其包含:(a)第一核酸復合物,包含(i)第一核酸鏈,按順序包含第一、第二和第三片段并被定義為B-X-D,(ii)第二核酸鏈,按順序包含第一、第二和第三片段并被定義為(iii)第三鏈,按順序包含第一、第二和第三片段并被定義為和(iv)第四鏈,按順序包含第一、第二和第三片段并被定義為F-Y-C,其中第一復合物包含形成于第一鏈的第二片段和第二鏈的第二片段之間的第一雙鏈區形 成于第三鏈的第二片段和第四鏈的第二片段之間的第二雙鏈區形成于第一鏈的第三片段和第三鏈的第一片段之間的第三雙鏈區以及形成于第二鏈的第一片段和第四鏈的第三片段之間的第四雙鏈區以及(b)第二核酸復合物,包含(i)第一核酸鏈,按順序包含第一、第二和第三片段并被定義為(ii)第二核酸鏈,按順序包含第一、第二和第三片段并被定義為E-Y-D,(iii)第三鏈,按順序包含第一和第二片段,并被定義為F-Z,和(iv)第四鏈,按順序包含第一和第二片段并被定義為其中第二復合物包含形成于第一鏈的第二片段和第二鏈的第二片段之間的第一雙鏈區形成于第三鏈的第二片段和第四鏈的第一片段之間的第二雙鏈區形成于第一鏈的第三片段和第三鏈的第一片段之間的第三雙鏈區以及形成于第二鏈的第一片段和第四鏈的第二片段之間的第四雙鏈區其中第一復合物的第一鏈的第一片段(B)、第二鏈的第三片段第三鏈的第三片段以及第四鏈的第一片段(F),以及第二復合物的第一鏈的第一片段和第二鏈的第三片段(D)都是單鏈的;其中第一復合物的第三鏈的第一、第二及第三片段(和)具有與第二復合物的第二鏈的第三、第二和第一片段(D、Y和E)合適的序列互補性,從而分別允許它們在雜交條件下結合;并且其中第一復合物的第四鏈的的第三、第二和第一片段(C、Y和F)具有與第二復合物的第一鏈的第一、第二和第三片段(和)合適的序列互補性,從而分別允許它們在雜交條件下結合。
在一些方面,第一復合物的第四鏈的第一片段(F)比第一復合物的第三鏈的第三片段長至少5個核苷酸(nt)、或6nt、7nt、8nt、9nt、10nt、15nt、20nt。在一些方面,第二復合物的第四鏈的第一片段的長度至少為30個核苷酸(nt)、或35nt、40nt、45nt、50nt、55nt、60nt、65nt、70nt或80nt。
IV.扇入
本發明還提供了一種“扇入(fan-in)”翻譯元件群組。一個扇入翻譯元件群組可將兩個或更多個不同的核酸輸入作為輸入信號并產生相同的輸出。換言之,扇入翻譯元件群組可執行OR操作。圖13顯示了一個扇入群組。
在所圖示的扇入翻譯元件群組中,翻譯元件502-503以及505-506每個類似于圖6A中的102-103并且彼此類似。由于序列差異,它們之間沒有干擾。但是,在翻譯元件503和506之間,它們共享相同的遠端半部這意味著,當它們的上游翻譯元件執行一系列的鏈置換反應時,翻譯元件503和506產生相同的靶定復合物507的輸出立足點。
因此,無論輸入是立足點501或504,鏈置換反應都將在翻譯元件507處被觸發。
因此,在一個實施方式中,本發明提供一種組合物,其包含第一核酸復合物和第二核酸復合物,每個復合物包含第一、第二、第三和第四核酸鏈,每個鏈按順序包含第一、第二和第三片段,其中第一復合物的第一、第二、第三和第四鏈的核酸鏈分別被定義為:B-X-D、和F-Y-C,第二復合物的第一、第二、第三和第四鏈的核酸鏈分別被定義為E-Y-D、F-Z-G、其中每個字母表示一個片段,以“-”連接的字母串表示一個鏈,并且其中:第一復合物和第二復合物的每一個都包含形成于第一鏈的第二片段和第二鏈的第二片段之間的第一雙鏈區(在第一復合物和第二復合物中分別為和)、形成于第三鏈的第二片段和第四鏈的第二片段之間的第二雙鏈區(和)、形成于第一鏈的第三片段和第三鏈的第一片段之間的第三雙鏈區(和)、以及形成于第二鏈的第一片段和第四鏈的第三片段之間的第四雙鏈區(和);在第一復合物和第二復合物的每一個中,第一鏈的第一片段(在第一復合物和第二復合物中分別為B和)、第二鏈的第三片段(和D)、第三鏈的第三片段(和G)以及第四鏈的第一片段(F和)是單鏈的;第一復合物的第三鏈具有與第二復合物的第二鏈(E-Y-D)合適的序列互補性,從而允許它們在雜交條件下結合;第一復合物的第四鏈(F-Y-C)具有與第二復合物的第一鏈合適的序列互補性,從而允許它們在雜交條件下結合;所述組合物進一步包含第三核酸復合物,其包含第一核酸鏈和第二核酸鏈,每個鏈按順序包含第一、第二和第三片段,其中第一和第二鏈分別被定義為E-Z-H和其中所述第三核酸復合物包含形成于第一鏈的第二片段和第二鏈的第二片段之間的雙鏈區并且第一鏈的第一片段(E)和第二鏈的第三片段是單鏈的,并且其中:第二復合物的第三 鏈(F-Z-G)具有與第三復合物的第二鏈合適的序列互補性,以允許它們之間在雜交條件下結合;并且第二復合物的第四鏈具有與第三復合物的第一鏈合適的序列互補性,以允許它們在雜交條件下結合;并且所述組合物進一步包含第四核酸復合物和第五核酸復合物,每個復合物包含第一、第二、第三和第四核酸鏈,每個鏈按順序包含第一、第二和第三片段,其中第四復合物的第一、第二、第三和第四鏈分別被定義為:K-R-M,和F-S-N,第五復合物的第一、第二、第三和第四鏈分別被定義為:E-S-M,F-Z-G和其中:第四復合物和第五復合物的每一個都包含形成于第一鏈的第二片段和第二鏈的第二片段之間的第一雙鏈區(在第四復合物和第五復合物中分別為和)、形成于第三鏈的第二片段和第四鏈的第二片段之間的第二雙鏈區(和)、形成于第一鏈的第三片段和第三鏈的第一片段之間的第三雙鏈區(和)、以及形成于第二鏈的第一片段和第四鏈的第三片段之間的第四雙鏈區(和);在第四復合物和第五復合物的每一個中,第一鏈的第一片段(在第一和第二復合物中分別為K和)、第二鏈的第三片段(和M)、第三鏈的第三片段(和G)以及第四鏈的第一片段(F和)都是單鏈的;第四復合物的第三鏈具有與第五復合物的第二鏈(E-S-M)合適的序列互補性,從而允許它們在雜交條件下結合;第四復合物的第四鏈(F-S-N)具有與第五復合物的第一鏈合適的序列互補性,從而允許它們在雜交條件下結合;第二復合物的第三鏈(F-Z-G)和第五復合物的第三鏈(F-Z-G)具有合適的序列同一性從而允許它們在雜交條件下結合至相同的靶標核酸;第二復合物的第四鏈和第五復合物的第四鏈具有合適的序列同一性從而允許它們在雜交條件下結合至相同的靶標核酸。
V.扇出
與扇入翻譯元件群組相反,“扇出(fan-out)”翻譯元件群組采用單個輸入并產生多個輸出核酸。在一個方面,該多個輸出核酸具有不同的序列,因而它們可進行不同的功能或下游反應。在另一個方面,該多個輸出核酸是相同的,因而該扇出翻譯元件群組可作為放大元件。
圖14A顯示了以一個立足點作為輸入并產生兩個相同的新立足點的扇出翻譯元件群組。類似地,圖14B中的扇出群組產生四個相同的新立足點。另一方面,圖14C-D表示產生兩個或更多個不同的新立足點的扇出翻譯元件群組。
在圖14A中,核酸601是如本文所述的典型雙立足點。復合物602與圖6A的翻譯元件102和103的區別在于遠端上的單鏈區更長,該單鏈區含有兩個(而不是一個)連續片段。如復合物603中可明顯看出的,每個連續片段群組(A-B)都能夠釋放新立足點,一旦釋放后,該新的立足點具有位于單獨的鏈上的兩個不同的單鏈區A和B。因此,這些新的立足點中的每一個可與翻譯元件604啟動一個新的鏈置換反應。
圖14B的翻譯元件類似于圖14A中的翻譯元件,只是翻譯元件606中的單鏈區各個都具有能夠釋放出兩個新立足點的四個連續片段。
圖14C中的翻譯元件群組可利用與圖14A-B(601和605)相同的立足點輸入(609),但翻譯元件610一旦接觸該輸入后釋放出不同于圖14A-B的立足點。如翻譯元件611中的相應鏈所反映出的,這種不同是更加明顯的。即,當接觸翻譯元件610釋放的立足點并進行鏈置換反應時,翻譯元件611釋放出兩個不同的立足點。這兩個立足點中的一個能夠啟動與翻譯元件612的新的鏈置換反應,另一個與翻譯元件613啟動新的鏈置換反應。因此,圖14B中的翻譯元件群組能夠由一個立足點輸入(609)分別產生來自翻譯元件612和613的兩個不同的新立足點輸出。
類似于圖14C中的翻譯元件群組,圖14D的翻譯元件群組也可用一個立足點(614)作為輸入并產生四個不同的新立足點作為輸出,每個分別由翻譯元件617-620釋放。
因此,本發明的一個實施方式提供一種核酸復合物,其包含第一、第二、第三、第四、第五和第六核酸鏈,其中:第一鏈按順序包含第一、第二、第三和第四片段并被定義為其中每個字母表示一個片段,以“-”相連的字母串表示一個鏈;第二鏈按順序包含第一、第二、第三和第四片段并被定義為第三鏈和第五鏈每一個按順序包含第一、第二和第三片段并被定義為A-Y-C;第四鏈和第六鏈每一個按順序包含第一、第二和第三片段并被定義為并且其中該復合物包含:形成于第一鏈的第二片段和第二鏈的第三片段之間的第一雙鏈區形成于第一鏈的第四片段和第三鏈的第一鏈之 間的第二雙鏈區形成于第一鏈的第三片段和第四鏈的第三片段之間的第三雙鏈區形成于第二鏈的第二片段和第五鏈的第一片段之間的第四雙鏈區形成于第二鏈的第一片段和第六鏈的第三片段之間的第五雙鏈區形成于第三鏈的第二片段和第四鏈的第二片段之間的第六雙鏈區和形成于第五鏈的第二片段和第六鏈的第二片段之間的第七雙鏈區并且第一鏈的第一片段第二鏈的第四片段(P)、第三和第五鏈的第三片段(C)以及第四和第六鏈的第一片段都是單鏈的。
類似地,本發明還提供了扇出兩個或更多個不同立足點的核酸復合物。
VI.復合條件性
“復合條件性”翻譯元件群組執行AND操作。復合條件性群組需要兩個單獨的輸入信號以激活和釋放出輸出核酸。
圖15顯示了一個復合條件性翻譯元件群組,其包括至少三個翻譯元件核酸復合物703、704和705。翻譯元件703以立足點701作為輸入并產生含有703的遠端半部的第一新立足點。類似地,翻譯元件704以立足點702作為輸入并產生含有704的遠端半部的第二新立足點。
翻譯元件705含有至少六條鏈,從左至右,由三個雙鏈對構成。僅當接觸由翻譯元件703釋放的第一新立足點時,翻譯元件705才能進行鏈置換反應,導致中間雙鏈的兩個單鏈區(和H)的暴露。
隨后,當與翻譯元件704產生的第二新立足點接觸時,發生另一個鏈置換反應,并釋放出作為第三新立足點的705的第三雙鏈對。該第三新立足點隨后可任選地通過例如翻譯元件706出發進一步的反應。
因此,在一個實施方式中,本發明提供一種組合物,其包含第一、第二和第三核酸復合物,其中:第一復合物包含第一、第二、第三和第四核酸鏈,每個鏈按順序包含第一、第二和第三片段并且分別被定義為B-W-D,和其中每個字母表示一個片段,每個以“-”相連的字母串表示一個鏈,并且其中第一復合物包含形成于第一鏈的第二片段和第二鏈的第二片段之間的第一雙鏈區形成于第三鏈的第二片段和第四鏈的第二片段之間的第二雙鏈區形成于第一鏈的第三片段和第三鏈的第一片段之間的第三雙鏈區和形成于第二鏈的第一片段和第四鏈的第三片段之間的 第四雙鏈區第二復合物包含第一、第二、第三和第四核酸鏈,每個鏈按順序包含第一、第二和第三片段并分別被定義為F-X-H,和J-Z-G,其中第二復合物包含形成于第一鏈的第二片段和第二鏈的第二片段之間的第一雙鏈區形成于第三鏈的第二片段和第四鏈的第二片段之間的第二雙鏈區形成于第一鏈的第三片段和第三鏈的第一片段之間的第三雙鏈區以及形成于第二鏈的第一片段和第四鏈的第三片段之間的第四雙鏈區第三復合物包含第一、第二、第三、第四、第五和第六核酸鏈,每個鏈按順序包含第一、第二、第三片段并分別被定義為I-Z-H,J-Q-M和其中第三復合物包含形成于第一鏈的第二片段和第二鏈的第二片段之間的第一雙鏈區形成于第三鏈的第二片段和第四鏈的第二片段之間的第二雙鏈區形成于第五鏈的第二片段和第六鏈的第二片段之間的第三雙鏈區形成于第一鏈的第三片段和第三鏈的第一片段之間的第四雙鏈區形成于第二鏈的第一片段和第四鏈的第三片段之間的第五雙鏈區形成于第三鏈的第三片段和第五鏈的第一片段之間的第六雙鏈區以及形成于第四鏈的第一片段和第六鏈的第三片段之間的第七雙鏈區其中,在第一復合物中,第一鏈的第一片段(B)、第二片段的第三片段第三鏈的第三片段(H)、第四鏈的第一片段是單鏈的;在第二復合物中,第一鏈的第一片段(F)、第二片段的第三片段第三鏈的第三片段和第四鏈的第一片段(J)是單鏈的;在第三復合物中,第一鏈的第一片段第二鏈的第三片段(D)、第五片段的第三片段(M)和第六鏈的第一片段是單鏈的,并且其中:第一復合物的第三鏈和第三復合物的第二鏈具有合適的序列互補性,從而允許它們在雜交條件下結合;第一復合物的第四鏈和第三復合物的第一鏈具有合適的序列互補性,從而允許它們在雜交條件下結合;第二復合物的第三鏈和第三復合物的第四鏈(I-Z-H)具有合適的序列互補性,從而允許它們在雜交條件下結合;并且第二復合物的第四鏈(J-Z-G)和第三復合物的第三鏈具有合適的序列互補性,從而允許它們在雜交條件下結合。
VII.反相元件
“反相元件”構成一個或多個翻譯元件,一旦與輸入信號接觸,其產生阻止鏈置換反應的核酸(“停止元件”),否則的話,該鏈置換反應會通過系統內不同的輸入信號啟動而發生。
如圖16所示,反相核酸復合物804由三個鏈組成,其中兩個F-Y-D和在中部片段之間形成雙鏈區第三鏈包括兩個片段C和每個與其他兩個鏈的一個片段互補。一旦接觸立足點802,將發生鏈置換反應,導致第三鏈的釋放。
核酸復合物803作為一個翻譯元件以立足點801作為輸入并產生該復合物的遠端半部作為輸出(新立足點)。該新立足點如果接觸翻譯元件805則可以進行后續的鏈置換反應,可能與翻譯元件806進行后續的反應。
但是,如果在立足點801與翻譯元件803之間的鏈置換反應發生之前,立足點802接觸了反相元件804并釋放出停止鏈801-803-805-806的信號處理路徑就不會發生。這是因為停止鏈結合至暴露的單鏈區和D,從而阻止805與由翻譯元件803產生的立足點之間的鏈置換反應。
因此,本發明的一個實施方式提供一種組合物,其包含第一和第二核酸復合物,其中:第一復合物包含第一、第二、第三和第四核酸鏈,每個鏈按順序包含第一、第二和第三片段并分別被定義為B-X-D,和J-Z-C,其中每個字母表示一個片段,每個以“-”相連的字母串表示一個鏈,其中第一復合物包含形成于第一鏈的第二片段和第二鏈的第二片段之間的第一雙鏈區形成于第三鏈的第二片段和第四鏈的第二片段的第二雙鏈區形成于第一鏈的第三片段和第三鏈的第一片段之間的第三雙鏈區和形成于第二鏈的第一片段和第四鏈的第三片段之間的第四雙鏈區第二復合物包含第一和第二核酸鏈,每個鏈按順序包含第一、第二和第三片段并且分別被定義為F-Y-D和并且包含第三核酸,其按順序包含第一和第二片段并且被定義為其中第二復合物包含形成于第一鏈的第二片段和第二鏈的第二片段之間的第一雙鏈區形成于第一鏈的第三片段和第三鏈的第一片段之間的第二雙鏈區形成于第二鏈的第一片段和第三鏈的第二片段之間的第三雙鏈區其中第一復合物的第一鏈的第一片段(B)、第一復合物的第二鏈的第三片段第一復合物的第三鏈的第三片段 第一復合物的第四鏈的第一片段(J)、第二復合物的第一鏈的第一片段(F)、第二復合物的第二鏈的第三片段是單鏈的;并且其中:第二復合物的第三鏈和第一復合物的第三鏈的第一片段及第一復合物的第四鏈的第三片段(C)的按順序的組合具有合適的序列同一性以允許它們靶定至相同的靶標核酸序列。
對于上述任何翻譯元件和翻譯元件群組,預期的是,化學修飾可被用來降低或消除立足點碰撞,即,系統內(例如細胞)立足點與任何翻譯元件的單鏈區的非預期結合。這種修飾可利用本發明提供的信息而輕易設計。而且,對于每個翻譯元件群組,響應的附圖僅提供示例性的修飾(如下標N、R和L所標注的)。這些修飾的期望的性質見表2。
在一些方面,要注意的是,如果未明確表示為雙鏈區的一部分,那么核酸片段是指單鏈的。單鏈的表示在附圖中也是明顯的。
每個核酸鏈或片段的長度可通過計算機或實驗來確定。表1顯示了長度的影響(特別是對立足點的影響)。在一個方面,每個片段為約3個堿基至約50個堿基長。或者,片段為至少約3、4、5、6、7、8、9、10、11、或12個堿基長。在另一個方面,片段不長于約50、45、40、35、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、28、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6或5個堿基。而且,以單鏈形式存在的片段(例如立足點)可相對較短,例如約3、4、5、6、7、8、9、10個堿基至約30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、28、17、16或15個堿基。在一個方面,立足點片段為至少約3、4、5、6、7、8、9、10、11或12個堿基長。在另一個方面,立足點片段不長于約20、19、28、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6或5個堿基。相反,形成翻譯元件內的雙鏈區的片段可相對較長。
方法和計算機建模
本發明進一步提供利用本發明的翻譯元件進行計算,特別是在生物學環境中傳播信息的方法。例如,mRNA適配元件可被用來檢測病原性核酸或瘤性核酸的存在并產生例如立足點形式的輸出信號。如果需要,可使用對多種核酸具有特異性的多個mRNA適配元件以確保可靠的檢測。
系統內的其他翻譯元件,例如扇入翻譯元件、扇出翻譯元件和反相翻譯元件,隨后可被用來處理mRNA適配元件生成的信號,最終導致利用相應的RNAi和 反義適配元件產生調節核酸,例如RNAi和反義RNA。通過謹慎地調整處理過程,可精確地控制這些調節RNA的嚴格序列和量。因此,生物學反應(例如凋亡和免疫響應)可通過這些調節RNA來出發,帶來治療或診斷效果。
容易意識到的是,本文所述的翻譯元件、組合物和系統可包括生物學材料,但它們也可利用計算機被數學建模。因此,本發明還提供用于執行這種建模的計算機方法、系統和程序植入介質。
因此,對應于本發明的每個翻譯元件、組合物或系統,本發明提供了一種計算機執行的方法,其中計算機被配置用來代表它們的序列、結構、合成和鏈置換反應。
本發明描述的方法可在計算機系統或網絡上執行。合適的計算機系統可包括至少一個處理器和存儲器;任選地,還包括計算機可讀介質,用于存儲處理器所執行的計算機代碼。一旦代碼被執行,計算機系統即進行所述方法。
關于這點,“處理器”是一種電子回路,其可執行計算機程序。合適的處理器的例子包括但不限于中央處理單元、微處理器、圖形處理單元、物理處理單元、數字信號處理器、網絡處理器、前端處理器、協處理器、數據處理器和音頻處理器。術語“存儲器”是指存儲數據用于存取的電子裝置。因此,在一個方面,合適的存儲器為保存數據并輔助計算的計算機單元。更廣義上來說,用于提供必需的網絡數據傳輸的合適方法和裝置是已知的。
本發明還預期到一種非瞬時性計算機可讀介質,其包括用于進行本文所述方法的可執行代碼。在某些實施方式中,該介質進一步包含該方法所需的數據或數據庫。
實施例
本發明進一步通過該實施例來闡釋,該實施例代表了本發明的旋轉隔離翻譯元件(RST)網絡的時序行為的動力學模擬結果,并將其與立足點隔離的翻譯元件(THST)網絡的動力學模擬進行并行比較,后者在以上“立足點隔離”的子標題下結合圖2和圖3提到。
生成包括系列個N翻譯的機制,稱作“階段數目”,其從Frezza,B.M.,ORCHESTRATION OF MOLECULAR INFORMATION THROUGH HIGHER ORDER CHEMICAL RECOGNITION:A THESIS PRESENTED,The Scripps Research Institute,La Jolla,California(2010),at Chapter 3中衍生得到它們的正向速率常數。該機制也包括翻 譯元件的背景“泄漏”(也具有根據Frezza(2010)的速率常數)和“碰撞”相互作用。后兩者從最鄰近的結合自由能衍生得到它們的速率常數,參見Allawi and SantaLucia,Biochemistry 36:10581-94(1997),其對于雜交使用標準正向速率常數(每秒每摩爾105)并且利用細致平衡得到反向速率常數。
對于每個模擬,對RST網絡和THST網絡進行前景信號模擬和背景信號模擬。“前景信號”是指,假設初始輸入序列與模擬中的其他翻譯元件處于相同濃度,所產生的最終輸出序列的濃度。“背景信號”表示,假設沒有初始輸入序列,所產生的最終輸出序列的濃度。
這些模擬證實了每個網絡設計在改變立足點長度、翻譯元件濃度、網絡規模(階段數量)的條件下提供的理想化的響應。
圖17A-M顯示了對于不同尺寸的立足點(3至15個核苷酸(nt)),RST和THST的前景信號和背景信號的模擬結果。所有模擬都以100nM翻譯元件進行3個階段。圖17顯示出,在極短的立足點時,RST實際上產生非常顯著的背景信號。但是,隨著立足點長度的增加,該背景下降至接近零(8nt和更長時;例如見圖17F),然而在所有情況下,THSTS具有相當一致并且相對高的背景翻譯速率,也成為“泄漏”。而且,隨著立足點長度增加超出11個nt,THST上的碰撞相互作用開始主導系統,并急劇地減慢前景活動,而RST名義上以較長的立足點速率操作(參見例如圖17I-M)。
在另一個系列的模擬中,在100nM翻譯元件濃度,對于RST和THST,8nt立足點產生相似的前景信號。該系統使用逐漸增加的網絡深度(就階段數量而言,即翻譯元件的數量)來檢驗。如圖18A-D所示,當階段數量增加時,RST和THST的背景信號都顯著增加。但是,這種增加的程度在THST的情況下嚴重得多。
另一個系列的模擬檢驗了中等規模的網絡(5個階段),使用長(13nt)和短(8nt)立足點,并顯示了它們的行為如何隨翻譯元件的濃度的變化而改變。結果顯示于圖19A-N中。較高濃度的翻譯(10μM)進行得非常快,非常低濃度的翻譯(100pM)進行得非常慢。這種行為與RST和THST系統采用二級反應動力學的事實一致,因此,達到平衡的時間取決于系統的總濃度。
在長立足點的情況下,對于RST,直至非常低的濃度時,反應時間仍保持生物學相關性,在低至100pM時其仍顯示出溫和的反應性,然而THST需要高得多的濃度(10μM)來獲得任何有意義的活性(圖19A-G)。在短立足點的情況 下,RST的表現類似,即使是具有顯著較高的背景信號(圖19H-N)。使用較短的立足點時,THST在低濃度處獲得有意義的反應性,但在高濃度時,導致THST背景信號的泄漏卻呈災難性地高。
這些數據一起證實了RST提供了設計可能性,利用較長的立足點可將背景(泄漏)活性降低至近乎不可檢測的水平,通過極端抑制而不喪失反應性,而THST卻面臨這個問題。而且,它們顯示出,RST可在巨大的動態濃度范圍內以理想的前景:背景反應性來起作用,使得它們理想地適用于生物學環境。
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