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改善血小板聚集的藥物組合物及其以PTAFR為靶點的篩選方法.pdf

摘要
申請專利號:

CN201510158852.8

申請日:

2015.04.06

公開號:

CN104983738A

公開日:

2015.10.21

當前法律狀態:

授權

有效性:

有權

法律詳情: 授權|||實質審查的生效IPC(主分類):A61K 31/7048申請日:20150406|||公開
IPC分類號: A61K31/7048; A61P7/02; G06F19/18(2011.01)I; G01N33/50; A61K31/585(2006.01)N; A61K31/365(2006.01)N 主分類號: A61K31/7048
申請人: 安徽科技學院
發明人: 馬世堂; 王冬雨; 馮承濤
地址: 233199安徽省滁州市鳳陽縣東華路9號安徽科技學院食品藥品學院
優先權:
專利代理機構: 南京天華專利代理有限責任公司32218 代理人: 尹慧晶; 徐冬濤
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法律狀態
申請(專利)號:

CN201510158852.8

授權公告號:

||||||

法律狀態公告日:

2018.05.08|||2015.11.18|||2015.10.21

法律狀態類型:

授權|||實質審查的生效|||公開

摘要

本發明提供了一種改善血小板聚集的藥物組合物及其以PTAFR為靶點的篩選方法,該組合物可有效抑制血小板聚集,通過實驗證明組合物在抑制血小板聚集方面有顯著的療效,該組合物的劑型為片劑、膠囊、糖漿、口服液、注射液等,本發明中藥組合物具有療效顯著、無禁忌癥及不良反應等優點,可以長期使用。

權利要求書

權利要求書
1.  一種改善血小板聚集的藥物組合物,其特征在于該組合物包含以下組分:
丹參內酯、木犀草素-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、三七皂苷P和新蛇床內酯。

2.  根據權利要求1所述的改善血小板聚集的組合物,其特征在于該組合物中:
丹參內酯1-3重量份、木犀草素-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷0.6-1.8重量份、三七皂苷P1.5-4.5重量份,新蛇床內酯0.8-2.4重量份。

3.  一種以PTAFR為靶點篩選權利要求1或2所述的改善血小板聚集的組合物的方法,其特征在于包含以下步驟:
1)PTAFR蛋白三維結構的獲取;
2)采用分子對接軟件,以銀杏內酯B為中心確定PTAFR蛋白結構的活性位點區域;
3)對三七、紅花、丹參、川芎四種中藥材的小分子配體與PTAFR蛋白進行計算機虛擬篩選,根據設定的活性區域,利用分子對接軟件,將每個小分子配體與PTAFR活性位點區域進行分子對接,記錄對接得分數據;
4)根據步驟3)的對接得分結果進行排序,確定具血小板聚集的藥物組合物:丹參內酯、木犀草素-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、三七皂苷P和新蛇床內酯。

4.  根據權利要求3所述的以PTAFR為靶點篩選改善血小板聚集的組合物的方法,其特征在于在PTAFR蛋白三維結構的獲取之前,從數據庫搜尋中藥三七、紅花、丹參、川芎四種中藥材的有效化學成分,共得到240個化學成分信息,其中三七42個,紅花88個,丹參53個,川芎57個,對每個化合物應用MacroModel小分子配體前處理優化模塊進行前處理優化。

5.  根據權利要求4所述的以PTAFR為靶點篩選改善血小板聚集的組合物的方法,其特征在于對每個化合物應用MacroModel小分子配體前處理優化模塊進行前處理優化,能量閾值設定為0.5kJ·nm-1·mol-1。

6.  根據權利要求3所述的以PTAFR為靶點篩選改善血小板聚集的組合物的方法,其特征在于步驟1)中PTAFR蛋白三維結構的獲取具體是通過以下方式:通過Swiss-Prot搜尋PTAFR蛋白的一級氨基酸序列,該蛋白共有342個氨基酸殘基,以人源P2Y12受體為模板,在Swiss-Prot和NCBI蛋白質序列數據庫中檢索目標序列基礎上,選用Prime模塊,應用同源模建方式,在NCBI BLAST序列比對基礎上建立PTAFR蛋白三維結構。

7.  根據權利要求3所述的以PTAFR為靶點篩選改善血小板聚集的組合物的方法,其特征在于步驟2)所述的以銀杏內酯B為中心確定PTAFR蛋白結構的活性位點區域的具體方法是:PTAFR蛋白和銀杏內酯B分別加入到分子對接Maestro系統中,進行加氫原子、刪除水分子、處理重原子前處理,采用glide對接模塊下receptor grid generation面板,以銀杏內酯B為中心確定PTAFR蛋白結構的活性位點區域。

8.  根據權利要求3所述的以PTAFR為靶點篩選改善血小板聚集的組合物的方法,其特征在于該方法步驟1)中PTAFR蛋白三維結構的獲取后,對構建的蛋白進行模型驗證和分子動力學方式評價結構合理性。

9.  根據權利要求3所述的以PTAFR為靶點篩選改善血小板聚集的組合物的方法,其特征在于包括以下步驟:
(1)從數據庫搜尋中藥三七、紅花、丹參、川芎四種中藥材到的有效化學成分,共得到240個化學成分信息,其中三七42個,紅花88個,丹參53個,川芎57個,對每個化合物應用MacroModel小分子配體前處理優化模塊進行前處理優化;
(2)通過Swiss-Prot搜尋PTAFR蛋白的一級氨基酸序列,該蛋白共有342個氨基酸殘基,以人源P2Y12受體為模板,在Swiss-Prot和NCBI蛋白質序列數據庫中檢索目標序列基礎上,選用Prime模塊,應用同源模建方式,在NCBI BLAST序列比對基礎上建立PTAFR蛋白三維結構;
(3)將步驟(2)得到的PTAFR蛋白和銀杏內酯B分別加入到分子對接Maestro系統中,進行加氫原子、刪除水分子、處理重原子前處理,采用glide對接模塊下receptor grid generation面板,以銀杏內酯B為中心確定PTAFR蛋白結構的活性位點區域;將步驟(1)得到的四味中藥的240個化合物分子導入分子對接Maestro系統中,PTAFR蛋白和小分子物質間距離設定為1.0/0.8;將進行三七、紅花、丹參、川芎四味中藥材的240個化合物小分子分別引入到PTAFR蛋白結構的活性位點區域,與PTAFR蛋白進行虛擬篩選工作,每個化合物與PTAFR活性位點區域進行分子對接,記錄對接得分數據;根據對接得分進行排序,確定具血小板聚集的藥物組合物:丹參內酯、木犀草素-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、三七皂苷P和新蛇床內酯;
(4)通過實體藥理實驗進行生物活性驗證。

10.  根據權利要求9所述的以PTAFR為靶點篩選改善血小板聚集的組合物的方法,其特征在于藥理實驗步驟為:
(1)取體重18-22g的ICR小鼠,分別給予相對應的藥物,尾靜脈注射給藥,連續給藥7 天,末次給藥結束后1.5-2.5小時內摘取小鼠眼球取血,肝素鈉抗凝,5000轉/分鐘離心取上清液得到含藥血漿;
(2)選用小鼠血小板活化因子酶聯免疫分析試劑盒,應用雙抗體夾心法測定標本中小鼠血小板活化因子水平,用酶標儀在450nm波長下測定吸光度,通過標準曲線計算樣品中小鼠血小板活化因子濃度分別對上述的含藥血漿進行檢測;
(3)將每個測得值與空白對照組的差值除以空白對照組的測得值,即得PTAFR抑制率評價四個化合物組合抑制PTAFR藥效特征。

說明書

說明書改善血小板聚集的藥物組合物及其以PTAFR為靶點的篩選方法
技術領域
本發明涉及中藥技術領域,具體涉及一種以PTAFR為靶點篩選的具血小板聚集的組合物。
背景技術
血小板活化因子(platelet activating factor,PAF)是體內一種重要的多功能磷脂遞質,PAF主要由中性粒細胞、血小板、肥大細胞、內皮細胞和巨噬細胞等產生,有廣泛的生物活性,PAF通過與PAF受體(PTAFR)結合可引起很多生理、病理反應,如血栓形成、低血壓、支氣管痙攣、內臟器官損傷、神經損傷、急性胰腺炎、哮喘等。PTAFR拮抗劑能阻斷這些效應的發生,有很大的應用價值,能促進血小板活化,抑制血栓形成;能抑制哮喘病人接觸抗原后的早期支氣管收縮;抑制特異質個體接觸抗原后的遲發性皮膚過敏;對腦缺血及腦炎性損傷有保護作用,對PAF誘導的心血管疾病具有很好的治療和預防作用。故尋找與發展新型、高效、安全、低毒、方便的藥物組合具有重要意義。
發明內容
針對現有技術的不足,本發明提供一種以PTAFR為靶點的改善血小板聚集的中藥組合物。
本發明的另一目的是提供一種通過計算機輔助藥物設計分子對接,以PTAFR為靶點篩選該中藥組合物的方法,或者再和實體實驗驗證相結合。
本發明的目的是通過以下方式實現的:
一種改善血小板聚集的組合物,該組合物包含以下組分:丹參內酯、木犀草素-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、三七皂苷P和新蛇床內酯。
優選該組合物丹參內酯1-3重量份、木犀草素-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷0.6-1.8重量份、三七皂苷P 1.5-4.5重量份,新蛇床內酯0.8-2.4重量份。
最優選丹參內酯1重量份、木犀草素-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷0.6重量份、三七皂苷 P 1.5重量份,新蛇床內酯0.8重量份。
以PTAFR為靶點篩選上述改善血小板聚集的組合物的方法,包含以下步驟:
1)PTAFR蛋白三維結構的獲取;
2)采用分子對接軟件,以銀杏內酯B為中心確定PTAFR蛋白結構的活性位點區域;
3)對三七、紅花、丹參、川芎四種中藥材的小分子配體與PTAFR蛋白進行計算機虛擬篩選,根據設定的活性區域,利用分子對接軟件,將每個小分子配體與PTAFR活性位點區域進行分子對接,記錄對接得分數據;
4)根據步驟3)的對接得分結果進行排序,確定具血小板聚集的藥物組合物:丹參內酯、木犀草素-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、三七皂苷P和新蛇床內酯。
上述方法中,在PTAFR蛋白三維結構的獲取之前,從數據庫搜尋中藥三七、紅花、丹參、川芎四種中藥材的有效化學成分,共得到240個化學成分信息,其中三七42個,紅花88個,丹參53個,川芎57個,對每個化合物應用MacroModel小分子配體前處理優化模塊進行前處理優化。
上述方法中,對每個化合物應用MacroModel小分子配體前處理優化模塊進行前處理優化,能量閾值設定為0.5kJ·nm-1·mol-1。
上述方法步驟1)中,PTAFR蛋白三維結構的獲取具體是通過以下方式:通過Swiss-Prot搜尋PTAFR蛋白的一級氨基酸序列,該蛋白共有342個氨基酸殘基,具體以人源P2Y12受體(PDB ID 4NTJ的A鏈)為模板,在Swiss-Prot和美國國立生物技術信息中心NCBI蛋白質序列數據庫中檢索目標序列基礎上,選用Prime模塊,應用同源模建方式,在NCBI BLAST序列比對基礎上建立蛋白三維結構。
上述方法步驟1)中,PTAFR蛋白三維結構的獲取后,對構建的蛋白進行模型驗證和分子動力學方式評價結構合理性。
上述方法步驟2)中所述的以銀杏內酯B為中心確定PTAFR蛋白結構的活性位點區域的具體方法是:PTAFR蛋白和銀杏內酯B分別加入到分子對接Maestro系統中,進行加氫原子、刪除水分子、處理重原子前處理,采用glide對接模塊下receptor grid generation面板,以銀杏內酯B為中心確定PTAFR蛋白結構的活性位點區域。
上述以PTAFR為靶點篩選改善血小板聚集的組合物的方法具體包括以下步驟:
1)從數據庫搜尋中藥三七、紅花、丹參、川芎四種中藥材的有效化學成分,共得到240個化學成分信息,其中三七42個,紅花88個,丹參53個,川芎57個,對每個化合物應用MacroModel小分子配體前處理優化模塊進行前處理優化;
2)通過Swiss-Prot搜尋PTAFR蛋白的一級氨基酸序列,該蛋白共有342個氨基酸殘基,以人源P2Y12受體(PDB ID 4NTJ的A鏈)為模板,在Swiss-Prot和NCBI蛋白質序列數據庫中檢索目標序列基礎上,選用Prime模塊,應用同源模建方式,在NCBI BLAST序列比對基礎上建立PTAFR蛋白三維結構;
3)將2)步驟得到的PTAFR蛋白和銀杏內酯B分別加入到分子對接Maestro系統中,進行加氫原子、刪除水分子、處理重原子前處理,采用glide對接模塊下receptor grid generation面板,以銀杏內酯B為中心確定PTAFR蛋白結構的活性位點區域;將1)步驟得到的四味中藥的240個化合物分子導入分子對接Maestro系統中,PTAFR蛋白和小分子物質間距離設定為1.0/0.8;精度方面選擇標準精度,將進行三七、紅花、丹參、川芎四味中藥材的240個化合物小分子分別引入到PTAFR蛋白結構的活性位點區域,與PTAFR蛋白進行虛擬篩選工作,每個化合物與PTAFR活性位點區域進行分子對接,記錄對接得分數據;根據對接得分進行排序,確定具血小板聚集的藥物組合物:丹參內酯、木犀草素-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、三七皂苷P和新蛇床內酯。
4)通過實體藥理實驗進行生物活性驗證。
本發明對上述以PTAFR為靶點篩選改善血小板聚集的組合物的方法進行如下具體實體藥理實驗驗證:
1)取體重18-22g的ICR小鼠,分別給予相對應的藥物,尾靜脈注射給藥,連續給藥7天,末次給藥結束后1.5-2.5小時內摘取小鼠眼球取血,肝素鈉抗凝,5000轉/分鐘離心取上清液得到含藥血漿;
2)選用小鼠血小板活化因子(PAF)酶聯免疫分析(ELISA)試劑盒,應用雙抗體夾心法測定標本中小鼠血小板活化因子(PAF)水平,用酶標儀在450nm波長下測定吸光度(OD值),通過標準曲線計算樣品中小鼠血小板活化因子(PAF)濃度分別對上述的含藥血漿進行檢測;
3)將每個測得值與空白對照組的差值除以空白對照組的測得值,即得PTAFR抑制率評價四個化合物丹參內酯,木犀草素-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷,三七皂苷P和新蛇床內酯組合抑制PTAFR藥效特征。
本發明方法篩選得到的組合物混合后可與藥學可接受的輔料制備成制劑,劑型可以為片劑、膠囊、糖漿、口服液、注射液等。本發明中藥組合物具有無毒副作用、療效顯著、無禁忌癥及不良反應等優點,可以長期使用。
與現有技術比較本發明的有益效果:
(1)本發明篩選以丹參內酯、木犀草素-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、三七皂苷P和新蛇床內酯為組合物的血小板聚集抑制劑,化合物來源于中藥材,無明顯毒副作用、療效顯著、無禁忌癥及不良反應,可以長期使用。
(2)本發明提供了以PTAFR為靶點,通過計算機輔助藥物設計分子對接方法和實體實驗驗證相結合的方式,篩選該具有抗血小板聚集作用的中藥組合物,精度高,結果準確可靠。
(3)本發明首先采用分子對接技術從三七、紅花、丹參、川芎中藥材中篩選了對以PTAFR靶點最優異的化合物單體,然后將篩選的四種單體進行組合配比,具有明顯的抗血小板聚集作用,且協同增效。本發明組合物采用的藥物配比是經過大量實驗驗證出來的,任何藥物的用量過低或過高均會影響抗血小板聚集功效。
附圖說明
圖1 PTAFR蛋白與模板蛋白P2Y12序列比對結果圖
圖2優化后的PTAFR蛋白
圖3應用PROCHECK工具對優化后的PTAFR評價結果
具體實施方式
以下通過實施例對本發明進行進一步解釋說明:
實施例1:
(1)從數據庫(中國中科院中藥與化學成分數據庫)搜尋中藥三七、紅花、丹參、川芎四種中藥材的有效化學成分,共得到240個化學成分信息,其中丹參53個(所包括的化合物名稱詳見表1),紅花88個(所包括的化合物名稱詳見表2),三七42個(所包括的化合物名稱詳見表3),川芎57個(所包括的化合物名稱詳見表4),對每個化合物應用MacroModel小分子配體前處理優化模塊對活性組分數據庫進行前處理優化,能量閾值設定為0.5kJ·nm-1·mol-1。
(2)通過歐洲生物信息學研究所蛋白質序列數據庫Swiss-Prot搜尋PTAFR蛋白的一級氨基酸序列(P25105),該蛋白共有342個氨基酸殘基,以人源P2Y12受體(即PDB ID4NTJ的A鏈)為模板,在Swiss-Prot和美國國立生物技術信息中心NCBI蛋白質序列數據庫中檢索目標序列基礎上,選用Prime模塊,應用同源模建方式,在NCBI BLAST序列比對基礎上建立蛋白三維結構,見圖1。再進行常規的分子動力學方式優化蛋白結構,優化 后的蛋白結構詳見圖2。選用Procheck工具對優化后蛋白結構合理性進行評價,結果詳見圖3,結果表明構建的蛋白結構僅有3.2%處于不合理區(要求90%以上處于合理區即可)。
(3)將步驟(2)同源模建得到的PTAFR蛋白和銀杏內酯B分別導入到分子對接Maestro系統中,進行加氫原子、刪除水分子、處理重原子相關前處理,采用glide對接模塊下receptor grid generation面板,以銀杏內酯B為中心確定PTAFR蛋白結構的活性位點區域;(PTAFR蛋白和小分子物質間距離設定為1.0/0.8,精度方面選擇“標準精度”,將銀杏內酯B與PTAFR活性位點區域進行分子對接,記錄總對接得分,結果得到銀杏內酯B與PTAFR對接得分為-7.9402,以該得分為閾值判斷四味中藥材與PTAFR的作用效應),將步驟(1)得到的240個化合物小分子分別引入到PTAFR蛋白結構的活性位點區域,與PTAFR蛋白進行虛擬篩選工作,記錄對接得分數據(對接得分數據主要由小分子化合物與PTAFR蛋白之間的親脂性、氫鍵、金屬配位體、不合適的鍵的旋轉和原子的空間排斥綜合構成),結果發現丹參中丹參內酯(tanshinlactone,詳見表1,對接得分-8.4922)、紅花中木犀草素-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(Luteolin-7-O-β-D-glucopyranoside,詳見表2,對接得分-8.1321)、三七中三七皂苷P(notoginsenoside-P,詳見表3,對接得分-7.9924)、川芎中新蛇床內酯(neocnidilide,詳見表4,對接得分-7.9450)與PTAFR得分最高,在銀杏內酯B設定的閾值以上(即各對接得分絕對值與銀杏內酯B的對接得分的絕對值進行比較),故選擇丹參內酯、木犀草素-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、三七皂苷P、新蛇床內酯進行化合物組合配比。
表1丹參與血小板活化因子PTAFR分子對接結果


表2紅花與血小板活化因子PTAFR分子對接結果



表3三七與血小板活化因子PTAFR分子對接結果

表4川芎與血小板活化因子PTAFR分子對接結果


以下對上述以PTAFR為靶點篩選具血小板聚集的組合物的方法進行如下實體實驗驗證:
(1)ICR小鼠120只,體重18-22g,由上海杰思捷實驗動物有限公司生產配送,隨機分為24組,每組5只,分別給予表5中1-24組相對應的丹參內酯、木犀草素-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、三七皂苷P、新蛇床內酯的單體或組合物(每組給予的藥物種類及計量詳見表5),每組藥物事先用生理鹽水按照相應的劑量溶解,尾靜脈注射給藥,連續給藥7天,末次給藥結束后1.5-2.5小時內摘取ICR小鼠眼球取血,肝素鈉抗凝,5000轉每分鐘離心機離心取上清液得到含藥血漿,備用。
表5 PTAFR試劑盒檢測結果


A:丹參內酯;B:木犀草素-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷;C:三七皂苷P;D:新蛇床內酯;*P<0.05,與空白對照組相比較,有統計學差異;aP<0.05,與第4組(丹參內酯3mg kg-1)相比較,有統計學差異;bP<0.05,與第14組(丹參內酯3mg kg-1+木犀草素-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷1.8mg kg-1)相比較,有統計學差異;cP<0.05,與第20組(丹參內酯2mg kg-1+木犀草素-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷1.2mg kg-1+三七皂苷P 3mg kg-1)相比較,有統計學差異。
(2)選用上海科敏生物科技有限公司提供的小鼠血小板活化因子(PAF)酶聯免疫分析(ELISA)試劑盒,參照說明書應用雙抗體夾心法測定標本中小鼠血小板活化因子(PAF)水平,用Synergy2美國伯騰多功能酶標儀在450nm波長下測定吸光度(OD值),通過標準曲線計算樣品中小鼠血小板活化因子(PAF)濃度分別對上述的含藥血漿進行檢測。
(3)將每個測得值與空白對照組的差值除以空白對照組的測得值,即得PTAFR抑制率,詳細結果見表5。結果顯示第24組(丹參內酯1mg kg-1、木犀草素-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷0.6mg kg-1、三七皂苷P 1.5mg kg-1、新蛇床內酯0.8mg kg-1)與空白組、四個化合物單一 物低、中、高三個劑量組的最高值(第4組)、四個化合物兩個組合物的最高值(第14組)、四個化合物三個組合物最高值(第20組)相比較,有統計學差異,表明本發明四個化合物組合丹參內酯、木犀草素-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、三七皂苷P、新蛇床內酯四個化合物在對PTAFR有較好的抑制率。
實施例2
丹參內酯1重量份、木犀草素-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷1.2重量份、三七皂苷P 3.5重量份、新蛇床內酯2重量份;
將上述組分與顆粒劑輔料混合,按照常規的制劑方法制備得到顆粒劑。
實施例3
丹參內酯3重量份、木犀草素-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷1.8重量份、三七皂苷P 2重量份、新蛇床內酯1.5重量份;
將上述組分與片劑輔料混合,按照常規的制劑方法壓制得到片劑。
實施例4
丹參內酯2重量份、木犀草素-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷1重量份、三七皂苷P 4.5重量份、新蛇床內酯2.4重量份;
將上述組分混合后,按照常規的口服液制備方法制備得到口服液。

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改善 血小板 聚集 藥物 組合 及其 PTAFR 篩選 方法
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