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一種黑平菇提取物及其應用.pdf

摘要
申請專利號:

CN201310147956.X

申請日:

2013.04.25

公開號:

CN103202864B

公開日:

2014.12.24

當前法律狀態:

授權

有效性:

有權

法律詳情: 授權|||實質審查的生效IPC(主分類):A61K 36/07申請日:20130425|||公開
IPC分類號: A61K36/07; A61P37/04; A23L1/28; A23L1/29 主分類號: A61K36/07
申請人: 北京市農林科學院
發明人: 燕繼曄; 李興紅; 劉建華; 嚴紅; 趙爽; 周瑩; 張瑋; 喬廣行
地址: 100097 北京市海淀區曙光中路9號
優先權:
專利代理機構: 北京紀凱知識產權代理有限公司 11245 代理人: 關暢;王慧鳳
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法律狀態
申請(專利)號:

CN201310147956.X

授權公告號:

103202864B||||||

法律狀態公告日:

2014.12.24|||2013.08.14|||2013.07.17

法律狀態類型:

授權|||實質審查的生效|||公開

摘要

本發明公開了一種黑平菇提取物及其應用。本發明所提供的黑平菇提取物的制備方法,按照包括如下步驟的方法制備:1)黑平菇干粉與體積百分比濃度為70%-90%的乙醇溶液混合,加熱去除單糖和雙聚糖等小分子物質,過濾,收集濾渣;2)將濾渣與蒸餾水按照比例為1g:10-100ml的比例混合,在70-100℃水浴中提取1-2小時,過濾,分別收集濾液和濾渣;重復此步驟的操作1-4次,合并所有的濾液;3)向濾液中加入三氯乙酸,去除其中的蛋白,離心,收集上清液;4)向上清液里加入雙氧水進行脫色,濃縮,得含黑平菇提取物的溶液。本發明可以用于制備增強免疫功能的藥物或者食品,制備方法簡單,原料易得,成本較低,適于生產和應用。

權利要求書

權利要求書
1.   一種黑平菇提取物的制備方法,按照包括如下步驟的方法制備:
1)黑平菇干粉與體積百分比濃度為70%?90%的乙醇溶液混合,加熱去除單糖和雙聚糖等小分子物質,過濾,收集濾渣;
2)將步驟1)獲得的濾渣與蒸餾水按照比例為1g:10?100ml的比例混合,在70?100℃水浴中提取1?2小時,過濾,分別收集濾液和濾渣;重復此步驟的操作1?4次,合并所有的濾液;
3)向步驟2)中得到的濾液中加入三氯乙酸,去除其中的蛋白,離心,收集上清液;
4)向步驟4)中的上清液里加入雙氧水進行脫色,濃縮,得含黑平菇提取物的溶液。

2.   根據權利要求1所述的方法,其特征在于:所述方法還包括將步驟4)獲得的含黑平菇提取物的溶液與體積百分比濃度為80?100%的乙醇溶液按照體積比為1:2?4混合,靜置沉淀,離心,收集沉淀,取上清液重復此步驟1?4次,合并沉淀,將沉淀烘干獲得黑平菇提取物粉末;所述此步驟中的乙醇溶液的體積百分比濃度優選為95%。

3.   根據權利要求1或2所述的方法,其特征在于:所述步驟1)中,加熱去除單糖和雙聚糖等小分子物質的步驟是在50?70℃水浴中回流提取30?60分鐘;所述水浴溫度優選為60℃;所述提取時間優選為45分鐘。

4.   根據權利要求1?3中任意一項所述的方法,其特征在于:所述步驟1)中所述乙醇溶液的體積百分比濃度為85%;所述黑平菇干粉與乙醇溶液的比例為1g:100?300ml。

5.   根據權利要求1?4中任意一項所述的方法,其特征在于:所述步驟2)中,所述濾渣與蒸餾水的比例為1g:30ml;所述的水浴溫度為95℃;所述提取的時間為1小時;重復所述步驟2)的操作的次數為3次。

6.   根據權利要求1?5中任意一項所述的方法,其特征在于:所述步驟3)中,所述三氯乙酸的添加終質量百分比濃度為15?25%,優選為20%。

7.   根據權利要求1?6中任意一項所述的方法,其特征在于:所述步驟4)中,所述雙氧水的添加終質量百分比濃度為10?20%,優選為15%;所述濃縮后,原溶液與濃縮液的體積比例為2?5:1,優選為4:1。

8.   根據權利要求1?6中任意一項所述的方法,其特征在于:所述烘干獲得黑平菇提取物粉末中的烘干溫度為40?70℃,優選為60℃。

9.   權利要求1?8中任意一項所述的方法獲得的黑平菇提取物。

10.   權利要求9所述的黑平菇提取物在制備增強免疫功能的藥物或者食品中的應用。

說明書

說明書一種黑平菇提取物及其應用
技術領域
本發明涉及一種黑平菇提取物及其應用。
背景技術
提高免疫力是我國衛生部倡導的健康生活中重要的部分,機體增強對疾病的抵抗力、抗感染、抗腫瘤和維持自身生理平衡具有重要意義。預防和改善免疫功能低下的疾病和免疫缺陷癥的有效方法是通過營養學中改善膳食結構來實現的,但在臨床上應用的免疫增強劑多來源于化學合成類藥物,其中大多存在著毒副作用或成本高的問題,應用上存在一定的局限性。而天然食品提取物往往存在著低毒、低副作用的優勢,因此,篩選對人體安全性高,成本低廉的天然活性成分是解決這一問題的有效途徑。研究顯示,天然產物中存在多種具有生物活性的成分,其中展現免疫調節活性的成分多為多糖和糖蛋白類物質。
多糖廣泛存在于動物、植物、微生物中,從20世紀70年代開始人們逐漸發現多糖具有多方面的藥理作用,主要包括:增強免疫、抗腫瘤、降血壓、降血脂、降血糖、抗衰老、增強骨髓造血機能、抗輻射、對肝腎等主要臟器的保護作用等。由于多糖多種的生物活性以及在保健、疾病治療領域的廣泛使用,使多糖生物資源的開發利用和研究成為天然藥物、生物化學、生命科學的研究熱點。
食用菌多糖是目前被認為臨床效果較為確切的一類低毒并且免疫活性強的物質。它們是一種非特異性免疫促進劑,能提高、調整機體免疫功能。其作用機制多為通過各種信號傳導路徑激活巨噬細胞對癌癥細胞以及病原菌的細胞毒性,增大巨噬細胞的吞噬能力,刺激其分泌多種細胞分裂因子和化學干擾因子等,從而增強機體的免疫功能;或是通過不同的途徑激活補體系統,在宿主防御機制中起重要作用,發揮其免疫調節的重要作用。
平菇(Pleurotus ostreatus),屬擔子菌亞門(Basidiomycotina),側耳屬(Pleurotus)。黑平菇是平菇的一個菌株,其子實體顏色為深黑色,色澤的深淺隨溫度的變化而有變化,栽培簡易,深層發酵生物量高,品質好。到目前為止,國內外尚未有關于黑平菇菌株多糖增強免疫力的任何報道。相比較其他食用菌多糖,黑平菇更容易大量獲得其多糖。
發明內容
本發明的目的是提供一種黑平菇提取物及其制備方法。
本發明所提供的一種黑平菇提取物的制備方法,按照包括如下步驟的方法制備:
1)黑平菇干粉與體積百分比濃度為70%?90%的乙醇溶液混合,加熱去除單糖和雙聚糖等小分子物質,過濾,收集濾渣;
2)將步驟1)獲得的濾渣與蒸餾水按照比例為1g:10?100ml的比例混合,在70?100℃水浴中提取1?2小時,過濾,分別收集濾液和濾渣;重復此步驟的操作1?4次,合并所有的濾液;
3)向步驟2)中得到的濾液中加入三氯乙酸,去除其中的蛋白,離心,收集上清液;
4)向步驟4)中的上清液里加入雙氧水進行脫色,濃縮,得含黑平菇提取物的溶液。
所述方法還包括將步驟4)獲得的含黑平菇提取物的溶液與體積百分比濃度為80?100%的乙醇溶液按照體積比為1:2?4(優選為1:3)混合,靜置沉淀,離心,收集沉淀,取上清液重復此步驟1?4次(優選為3次),合并沉淀,將合并后的沉淀烘干獲得黑平菇提取物粉末;所述此步驟中的乙醇溶液的體積百分比濃度優選為95%。
所述步驟1)中,加熱去除單糖和雙聚糖等小分子物質的步驟是在50?70℃水浴中回流提取30?60分鐘;所述水浴溫度優選為60℃;所述提取時間優選為45分鐘。
所述步驟1)中所述乙醇溶液的體積百分比濃度為85%;所述黑平菇干粉與乙醇溶液的比例為1g:100?300ml,優選為1g:100ml。
所述步驟2)中,所述濾渣與蒸餾水的比例為1g:30ml;所述的水浴溫度為95℃;所述提取的時間為1小時;重復所述步驟2)的操作的次數為3次。
所述步驟3)中,所述三氯乙酸的終質量百分比濃度為15%?25%,優選為20%。
所述步驟4)中,所述雙氧水的終質量百分比濃度為10%?20%,優選為15%;所述濃縮后,原溶液與濃縮液的體積比例為2?5:1,優選為4:1。
所述烘干獲得黑平菇提取物粉末中的烘干溫度為40?70℃,優選為60℃。
本發明所提供的黑平菇提取物是上述方法獲得的黑平菇提取物。
黑平菇由于其是人類常用食物,其中本發明提取的黑平菇提取物主要含有黑平菇多糖,安全可靠,對人體無毒副作用,可以用于制備增強免疫功能的藥物或者食品。
本發明還保護本發明提取的黑平菇提取物在制備增強免疫功能的藥物或者食品中的應用。所述增強免疫功能為提高碳粒廓清能力和/或提高胸腺重量和/或脾臟重量。
其中,提高碳粒廓清能力體現在提高碳粒廓清系數,其檢測方法如實施例4所示。提高胸腺重量和/或脾臟重量(提高免疫器官重量)體現在提高免疫器官系數,具體檢測方法如實施例5所示。
本發明具有的優點和有益效果:(1)本發明黑平菇提取物的作用效果明顯,以15、30、60mg/kg的給藥劑量進行實驗,給藥14天后,均可明顯提高小鼠碳粒廓清指數,與對照差異顯著(P<0.01),同時上述給藥劑量實驗中可顯著提高胸腺系數,與對照差異顯著(P<0.05?0.01)。表明本發明對小鼠碳粒廓清指數(K值)、胸腺系數具有明顯的提高作用,能夠增強小鼠的免疫功能。
(2)本發明黑平菇提取物制備原料易得,成本較低,適于生產和應用。
(3)本發明提取工藝簡單,提取率高,穩定性好。
具體實施方式
下述實施例中所述的方法,如無特別說明,均為常規方法。下述實施例中所示的百分含量,如無特別說明,液體溶液含量均為體積百分含量;固體溶液含量均為質量百分含量。
實施例1、本發明黑平菇提取物的制備
黑平菇提取物的制備按照如下方法進行:
1)將黑平菇在30~40℃下烘干后打碎成粉,過60~200目篩篩子獲得黑平菇干粉2g與體積百分濃度為85%的乙醇溶液200ml混合,在60℃水浴中回流提取45分鐘,去除單糖和雙聚糖等小分子物質,過濾,收集濾渣;
2)向上述濾渣中加入蒸餾水,固液比例為1g:30ml,在95℃水浴中回流提取1小時,過濾,分別收集濾液和濾渣;取濾渣重復此步驟三次,合并所有的濾液。
3)向步驟2)中得到的濾液中加入三氯乙酸(TCA)(使其終質量百分濃度為20%)去除其中的蛋白,離心,收集上清液;
4)向步驟3)中的上清液里加入雙氧水(使其終質量百分濃度為15%)進行脫色,低壓濃縮,濃縮體積與原體積比例為4:1,得黑平菇提取物的濃縮液;
5)向上述濃縮液中加入體積百分濃度為95%的乙醇溶液,濃縮液與乙醇溶液的體積比例為1:3,靜置(室溫(25℃)靜置至不再有沉淀析出),離心,收集沉淀;取上清液重復此步驟3次,合并沉淀;
6)將上述沉淀烘干(60℃干燥)得到精制黑平菇提取物。該提取物主要成分為黑平菇多糖成分。
實施例2、本發明黑平菇提取物的制備
黑平菇提取物的制備按照如下方法進行:
1)菌株黑平菇干粉(黑平菇干粉的制備同實施例1)2g與體積百分濃度為70%的乙醇溶液600ml混合,在50℃水浴中回流提取60分鐘,去除單糖和雙聚糖等小分子物質,過濾,收集濾渣;
2)向上述濾渣中加入蒸餾水,固液比例為1g:100ml,在70℃水浴中回流提取2小時,過濾,分別收集濾液和濾渣;取濾渣重復此步驟4次,合并所有的濾液。
3)向步驟2)中得到的濾液中加入三氯乙酸(TCA)(使其終質量百分濃度為15%)去除其中的蛋白,離心,收集上清液;
4)向步驟3)中的上清液里加入雙氧水(使其終質量百分濃度為10%)進行脫色,低壓濃縮,濃縮體積與原體積比例為2:1,得黑平菇提取物的濃縮液;
5)向上述濃縮液中加入體積百分比濃度為80%的乙醇溶液,濃縮液與乙醇溶液的體積比例為1:4,,靜置(室溫(25℃)靜置至不再有沉淀析出),離心,收集沉淀;取上清液重復此步驟1次,合并沉淀;
6)將上述沉淀烘干(60℃干燥)得到精制黑平菇提取物。該提取物主要成分為黑平菇多糖成分。
實施例3、本發明黑平菇提取物的制備
黑平菇提取物的制備按照如下方法進行:
1)菌株黑平菇干粉(黑平菇干粉的制備同實施例1)2g與體積百分濃度為90%的乙醇溶液200ml混合,在70℃水浴中回流提取30分鐘,去除單糖和雙聚糖等小分子物質,過濾,收集濾渣;
2)向上述濾渣中加入蒸餾水,固液比例為1g:10ml,在100℃水浴中回流提取1小時,過濾,分別收集濾液和濾渣;取濾渣重復此步驟1次,合并所有的濾液。
3)向步驟2)中得到的濾液中加入三氯乙酸(TCA)(使其終質量百分濃度為25%)去除其中的蛋白,離心,收集上清液;
4)向步驟3)中的上清液里加入雙氧水(使其終質量百分濃度為20%)進行脫色,低壓濃縮,濃縮體積與原體積比例為2:1,得黑平菇提取物的濃縮液;
5)向上述濃縮液中加入乙醇,濃縮液與乙醇的體積比例為1:2,靜置(室溫(25℃)靜置至不再有沉淀析出),離心,收集沉淀;取上清液重復此步驟4次,合并沉淀;
6)將上述沉淀烘干(60℃干燥)得到精制黑平菇提取物。該提取物主要成分為黑平菇多糖成分。
實施例4黑平菇提取物影響小鼠碳粒廓清指數的增強免疫功能實驗
1、實驗動物的篩選:選擇健康體重在20?22g范圍內的昆明種小鼠(購自承德醫學院)40只,隨機分為4組,每組10只,采取自由取食的方式飼養,實驗前12小時禁食,飲水不限。
2、藥物灌胃:將實施例1制備的黑平菇提取物用蒸餾水溶解稀釋成不同濃度藥劑,按照表1的劑量分別進行灌胃給藥,空白對照組給予等體積的蒸餾水,連續給藥14天,每天灌胃一次,取食、飲水不限。
3、碳粒檢測:最后一次給藥40分鐘后,從小鼠尾靜脈以0.05ml/10g的比例注射印度墨汁。注射后2分鐘和20分鐘時間點上,分別從眶后靜脈叢取血20μl,溶于2ml0.1%Na2CO3溶液中搖勻,測定溶液在600?800nm下的吸光值。
4、廓清指數計算:測定吸光值后,根據文獻方法獲得廓清指數公式:
廓清指數(K)=(LogA20?LogA2)/(20?2)
A20、A2指步驟3中20分鐘和2分鐘時間點上測得的吸光值。
通過公式計算得出不同濃度黑平菇提取物溶液的K值。
表1黑平菇提取物對小鼠碳粒廓清指數的影響(x±s)的數據)

與空白比較**P﹤0.01
結果從表1可以看出黑平菇提取物處理組小鼠的碳粒廓清指數均顯著增高,與對照組比較差異顯著(P﹤0.01),影響度在提取物劑量達到60mg/kg時,呈現出較大的增高。
實施例5、黑平菇提取物對小鼠免疫器官的影響實驗
實驗動物的篩選:選擇體重在20?22g范圍內的昆明種小鼠80只,隨機分為8組,每組10只,采取自由取食的方式飼養,實驗前12小時禁食,飲水不限。
藥物灌胃:將實施例1制備的黑平菇提取物用蒸餾水溶解稀釋成不同濃度藥劑,按照表2、表3的劑量,分別進行灌胃給藥,空白對照組給予等體積的蒸餾水,連續給藥14天,每天灌胃一次,取食、飲水不限。
免疫器官重量測定:最后一次給藥后,禁食12小時,測量小鼠體重,麻醉處死小鼠,解剖取其胸腺和脾臟,用濾紙吸干表面組織液,精密稱重,按下式計算器官系數。
器官系數=器官質量(mg)/體重(10g)
表2黑平菇提取物對小鼠胸腺系數的影響(x±s)

與空白比較*P﹤0.05,**P﹤0.01
表3黑平菇提取物對小鼠脾臟系數的影響(x±s)

結果從表2、3可以看出黑平菇提取物處理組小鼠的胸腺系數顯著增高,與對照組比較差異顯著(P﹤0.05?0.01),而黑平菇提取物在各劑量處理中對小鼠的脾臟系數均無明顯影響。
從上述結果來看,黑平菇提取物具有提高免疫力的功效。

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一種 黑平菇 提取物 及其 應用
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