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芳香酯類5LOX和MPGES1抑制劑及應用.pdf

摘要
申請專利號:

CN201210484991.6

申請日:

2012.11.23

公開號:

CN103254086B

公開日:

2015.01.07

當前法律狀態:

授權

有效性:

有權

法律詳情: 授權|||實質審查的生效IPC(主分類):C07C 205/57申請日:20121123|||公開
IPC分類號: C07C205/57; C07C69/83; C07C201/12; C07C67/08; A61K31/24; A61K31/235; A61P29/00 主分類號: C07C205/57
申請人: 北京大學
發明人: 來魯華; 劉瑩; 吳屹然; 尚爾昌; 賀沖; 何珊
地址: 100871 北京市海淀區頤和園路5號北京大學
優先權: 2012.02.20 CN 201210040199.1
專利代理機構: 北京君尚知識產權代理事務所(普通合伙) 11200 代理人: 余長江
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法律狀態
申請(專利)號:

CN201210484991.6

授權公告號:

103254086B||||||

法律狀態公告日:

2015.01.07|||2013.09.18|||2013.08.21

法律狀態類型:

授權|||實質審查的生效|||公開

摘要

本發明公開了一種作為5-脂氧合酶(5-LOX)和前列腺素E合成酶(mPGES-1)的雙功能抑制劑的芳香酯類化合物,具有式III所示結構,其中:R1、R2各自代表氫、硝基或羧基;R3、R4、R5各自代表氫、苯基、C1~C3烷基或鹵素,或者R4與R3或R5成環,聯合代表1,3-丁二烯亞基。這類化合物對5-LOX與mPGES-1的體外和全血的酶活測試,證實其5-脂氧合酶和前列腺素E合成酶的雙功能抑制劑活性,可用于制備治療和預防各種炎癥的藥物。

權利要求書

權利要求書
1.   一種芳香酯類化合物,具有如下通式的結構:

其中,R1、R2相同或不同,各自代表氫、硝基或羧基;R3、R4、R5相同或不同,各自獨立代表氫、苯基、C1~C3烷基或鹵素,或者R4與R3或R5成環,聯合代表1,3?丁二烯亞基。

2.   如權利要求1所述的芳香酯類化合物,其特征在于,所述芳香酯類化合物是下列化合物之一:3,5?二硝基苯甲酸?1?萘酯、3,5?二硝基苯甲酸苯酯、3,5?二硝基苯甲酸?3?甲基苯酯、3,5?二硝基苯甲酸?3?正丙基苯酯、3,5?二硝基苯甲酸?3?苯基苯酯、3,5?二硝基苯甲酸?4?苯基苯酯、3,5?二硝基苯甲酸?2,3?二氟苯酯、3,5?二硝基苯甲酸?2,3?二氯苯酯、3?硝基苯甲酸?1?萘酯和3?羧基苯甲酸?1?萘酯。

3.   權利要求1或2所述芳香酯類化合物的制備方法,如下反應式所示:

將式I所示的取代苯甲酸與式II所示取代酚進行酯化反應,得到式III所示的雙功能抑制劑,其中:R1、R2相同或不同,各自代表氫、硝基或羧基;R3、R4、R5相同或不同,各自獨立代表氫、苯基、C1~C3烷基或鹵素,或者R4與R3或R5成環,聯合代表1,3?丁二烯亞基。

4.   權利要求1或2所述芳香酯類化合物作為5?LOX和mPGES?1抑制劑的用途。

5.   權利要求1或2所述芳香酯類化合物在制備治療或預防炎癥的藥物中的應用。

6.   一種藥物組合物,含有權利要求1或2所述芳香酯類化合物或其藥用鹽,和藥物載體。

7.   如權利要求6所述的藥物組合物,其特征在于,所述藥用鹽為所述芳香酯類化合物與無機酸形成的鹽,所述無機酸包括鹽酸、硫酸、磷酸、硝酸。

8.   如權利要求6所述的藥物組合物,其特征在于,所述藥用鹽為所述芳香酯類化合物與有機酸形成的鹽,所述有機酸包括檸檬酸、琥珀酸、枸櫞酸、醋酸、酒石酸、甲磺酸。

9.   如權利要求6~8任一所述的藥物組合物,其特征在于,所述藥物載體包括無毒固態、半固態或液態填充劑、稀釋劑、佐劑、包裹材料。

說明書

說明書芳香酯類5?LOX和mPGES?1抑制劑及應用
技術領域
本發明涉及治療和預防各種炎癥的藥物,特別涉及作為5?脂氧合酶(5?LOX)和前列腺素E合成酶(mPGES?1)雙功能抑制劑的芳香酯類化合物,及其制備方法,以及該化合物在制備治療和預防各種炎癥藥物中的應用。
背景技術
炎癥是具有血管系統的活體組織對損傷因子所發生的防御反應,當這種防御反應過度激活或失去控制時,炎癥因子就會攻擊損傷人體自身組織,引發疾病,嚴重時可能危及生命。炎癥的產生是一個多分子參與調控的復雜過程,在藥物研發的前期考慮所選擇的藥物靶標在疾病整體網絡中的作用,研發多靶標藥物有望減少毒副作用,對于炎癥的治療有著重要意義。
花生四烯酸(AA)代謝網絡是產生炎癥因子的網絡,在AA代謝網絡中,磷脂被磷脂酶A2(PLA2)水解釋放出花生四烯酸,隨后通過兩條代謝路徑:(一)通過環氧合酶(COX)的作用生成各種前列腺素(PGs),該通路產生炎癥的關鍵酶有COX?2、前列腺素E合成酶(mPGES?1);(二)通過5?脂氧合酶(5?LOX)的作用生成白三烯(LTs)、脂質過氧化物,產生炎癥的關鍵酶有5?LOX、白三烯A4水解酶(LTA4H)。研究表明,這兩條通路間存在著相互影響,單一抑制一條通路將導致炎癥因子通過另一條通路表達。設計同時作用于該網絡中的兩條通路中的多功能抑制劑可有以下優點:
一、同時抑制兩條代謝途徑產生的炎癥因子白三烯和前列腺素,增加抗炎效果,避免了因一條代謝途徑的抑制導致另一條代謝途徑的激活的情況。
二、多功能抑制劑對單一酶的抑制效果較單功能抑制劑小,所引起的副作用也較小(例如雙功能抑制劑達布菲隆,抑制效果與已上市藥物吲哚美辛相當,已被證明不具有腸胃毒性)。
5?脂氧合酶(EC 1.13.11.34)是代謝花生四烯酸產生炎癥介質白三烯類化合物的關鍵酶(Radmark,O.;Samuelsson,B.,Regulation of 5?lipoxygenase enzyme activity.Biochem.Bioph.Res.Co.2005,338(1),102?110.)。5?LOX的調節對炎癥相關疾病的發生和發展有重要的作用,該酶被認為是抗炎藥物設計的重要靶標之一。齊留通(zileuton)是目前唯一進入臨床研究并作為處方藥使用的5?LOX抑制劑(Lehnigk,B.;Rabe,K.F.;Dent,G.;Herst,R.S.;Carpentier,P.J.;Magnussen,H.,Effects of a5?lipoxygenase inhibitor,ABT?761,on exercise?induced bronchoconstriction and urinaryLTE4in asthmatic patients.Eur.Respir.J.1998,11(3),617?623.),用于治療哮喘相關的疾病。
前列腺素E合成酶(EC 5.3.99.3)是代謝花生四烯酸產生炎癥介質前列腺素類化合物的關鍵酶(Friesen,R.W.;Mancini,J.A.,Microsomal prostaglandin E?2synthase?1(mPGES?1):A novel anti?inflammatory therapeutic target.J.Med.Chem.2008,51,(14),4059?4067.)。mPGES?1在1999年被發現,它位于前列腺素類炎癥介質產生通路的最末端,僅在炎癥誘導下才上調表達量,mPGES?1被認為是可避免毒副作用的炎癥藥物靶標,目前還沒有mPGES?1抑制劑進入臨床試驗。
發明內容
本發明的目的是提供一種芳香酯化合物,作為同時抑制5?脂氧合酶和前列腺素E合成酶的雙功能抑制劑。
本發明的另一目的在于提供上述芳香酯化合物的制備方法。
本發明的目的還在于提供上述芳香酯化合物在制備治療和預防各種炎癥藥物中的應用。
本發明建立了5?脂氧合酶(5?LOX)的比較模建模型,用分子動力學模擬和已知抑制劑的分子對接優化該模型后,在Specs化合物庫中進行5?LOX抑制劑的虛擬篩選,然后結合化合物與前列腺素E合成酶(mPGES?1)結構模型的分子對接結果,對化合物骨架進行結構優化,設計并合成了一類芳香酯化合物。并對該類芳香酯化合物進行5?LOX和mPGES?1的體外和全血的酶活測試,證實其5?脂氧合酶和前列腺素E合成酶的雙功能抑制劑活性。
本發明所提供的芳香酯類化合物具有如下結構通式:

其中,R1、R2相同或不同,各自代表氫、硝基或羧基;R3、R4、R5相同或不同,各自獨立代表氫、苯基、C1~C3烷基、鹵素,或者R4與R3或R5成環,聯合代表1,3?丁二烯亞基。
上述通式化合物的具體例子有:
1)3,5?二硝基苯甲酸?1?萘酯(PKUMDL_AAL_201):R1=R2=NO2,R5=H,R4與R3成環為1,3?丁二烯亞基;
2)3,5?二硝基苯甲酸苯酯(PKUMDL_AAL_202):R1=R2=NO2,R3=R4=R5=H;
3)3,5?二硝基苯甲酸?3?甲基苯酯(PKUMDL_AAL_203):R1=R2=NO2,R3=R5=H,R4=CH3;
4)3,5?二硝基苯甲酸?3?正丙基苯酯(PKUMDL_AAL_204):R1=R2=NO2,R3=R5=H,R4=C3H7;
5)3,5?二硝基苯甲酸?3?苯基苯酯(PKUMDL_AAL_205):R1=R2=NO2,R3=R5=H,R4=Ph;
6)3,5?二硝基苯甲酸?4?苯基苯酯(PKUMDL_AAL_206):R1=R2=NO2,R3=R4=H,R5=Ph;
7)3,5?二硝基苯甲酸?2,3?二氟苯酯(PKUMDL_AAL_207):R1=R2=NO2,R3=R4=F,R5=H;
8)3,5?二硝基苯甲酸?2,3?二氯苯酯(PKUMDL_AAL_208):R1=R2=NO2,R3=R4=Cl,R5=H;
9)3?硝基苯甲酸?1?萘酯(PKUMDL_AAL_209):R1=NO2,R2=R5=H,R3與R4成環為1,3?丁二烯亞基;
10)3?羧基苯甲酸?1?萘酯(PKUMDL_AAL_210):R1=COOH,R2=R5=H,R3與R4成環為1,3?丁二烯亞基。
本發明的芳香酯類化合物可通過如下方法制備:

將式I所示的取代苯甲酸與式II所示取代酚進行酯化反應即得到目標產物(式III),其中R1、R2相同或不同,各自代表氫、硝基或羧基;R3、R4、R5相同或不同,各自獨立代表氫、苯基、C1~C3烷基、鹵素,或者R4與R3或R5成環,聯合代表1,3?丁二烯亞基。
本發明的芳香酯類化合物在5?LOX和mPGES?1的體外和全血的酶活測試中均顯示出抑制活性,說明其為5?脂氧合酶和前列腺素E合成酶的雙功能抑制劑。
將本發明的芳香酯類化合物或其藥用鹽作為有效成分,添加常規藥物載體,可制備用于治療或預防各種炎癥的藥物。
附圖說明
圖1是化合物PKUMDL_AAL_201與5?LOX結構模型的分子對接圖。
圖2是化合物PKUMDL_AAL_201與mPGES?1結構模型的分子對接圖。
具體實施方式
以下實施例用于說明本發明,表示實踐本發明的方法,其對本發明的范圍無任何限制。本領域技術人員可能找到對于他們而言顯而易見的實現本發明的其他方法,均應認為那些方法被包括在本發明的范圍之內。
實施例1、5?LOX抑制劑的虛擬篩選和雙功能抑制劑設計
一、構建5?LOX的比較模建模型
目前沒有直接用于5?LOX抑制劑篩選的晶體結構。已知的兔源15?LOX的結構活性口袋的柔性較大,存在“open”和“close”兩種構象,其活性口袋只有“close”構象的狀態下才有足夠的空間結合小分子抑制劑。我們在兔源15?LOX(PDB entry:2POM)“close”構象的基礎上,建立了5?LOX的比較模建模型,并用分子動力學模擬和已知抑制劑的分子對接優化該模型。
二、5?LOX抑制劑的虛擬篩選
基于經過優化的比較模建模型,利用分子對接與藥效團匹配結合的方法,對包含約二十萬化合物的Specs數據庫進行虛擬篩選。將數據庫大致平均地分為四組,使用程序DOCK 6.0將所有化合物剛性對接到5?LOX模型的底物結合口袋,從每組中選出對接打分最高的9,999個分子。使用程序PSCORE從蛋白結構生成藥效團,將選出的39,996個化合物的對接構象與藥效團進行匹配,選出匹配打分最高的4,347個分子。使用程序AutoDock 4.0將這些化合物進行柔性對接(Lamarckian遺傳算法,能量評估次數25,000,000,運行20次),選出預測結合自由能最大的1,000個化合物,根據它們的預測結合構象,最后人工挑選出105個化合物。
三、5?LOX抑制劑設計
將虛擬篩選得到的化合物3,5?二硝基苯甲酸?1?萘酯(PKUMDL_AAL_201)與5?LOX的結構模型進行分子對接(見圖1),結果表明抑制劑與5?LOX具有如下相互作用:兩個芳香環系分別占據底物結合口袋的兩個疏水空腔,并由柔性鏈連接;芳香環系1為苯環,所在空腔帶有正電,芳環上柔性鏈連接原子間位的負電性基團與口袋具有庫倫吸引,并和組氨酸600產生氫鍵,形成特異性結合;芳香環系2為苯環衍生物或萘環。
四、mPGES?1抑制劑對接
將化合物PKUMDL_AAL_201與mPGES?1的結構模型進行對接(見圖2),結果顯示由于mPGES?1的口袋寬闊、疏水表面積大,能夠與抑制劑的芳香環系發生疏水相互作用,同時芳環1上的負電性基團與口袋中的精氨酸126生成氫鍵,形成特異性結合。
通過上述分子對接結果,設計如下抑制劑通式:

其中,R1、R2相同或不同,各自代表氫、硝基或羧基;R3、R4、R5相同或不同,各自獨立代表氫、苯基、C1~C3烷基、鹵素,或者R4與R3或R5成環,聯合代表1,3?丁二烯亞基。
實施例2、雙功能抑制劑的合成
下面以化合物3,5?二硝基苯甲酸?1?萘酯(PKUMDL_AAL_201)為例描述此類雙功能抑制劑的合成方法。

將0.23g(1.2mmol)1?乙基?3?(3?二甲氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(EDCI)加入到含有0.25g(1.2mmol)3,5?二硝基取代苯甲酸的15mL四氫呋喃溶液中,室溫攪拌0.5h后,依次加入0.02g 4?二甲氨基吡啶,0.14g(1mmol)1?萘酚,繼續室溫攪拌,TLC檢測,12h反應完成。減壓蒸出溶劑,殘余物用15mL水溶解,用2M鹽酸調節pH=2,析出固體完全后,抽濾,用2mL冷卻的乙酸乙酯洗滌濾餅數次,真空干燥得0.21g黃色粉末,產率65%。
采用上述方法制備其他含硝基的芳香酯化合物,所合成的其他化合物名稱如下:
PKUMDL_AAL_202:3,5?二硝基苯甲酸苯酯
PKUMDL_AAL_203:3,5?二硝基苯甲酸?3?甲基苯酯
PKUMDL_AAL_204:3,5?二硝基苯甲酸?3?正丙基苯酯
PKUMDL_AAL_205:3,5?二硝基苯甲酸?3?苯基苯酯
PKUMDL_AAL_206:3,5?二硝基苯甲酸?4?苯基苯酯
PKUMDL_AAL_207:3,5?二硝基苯甲酸?2,3?二氟苯酯
PKUMDL_AAL_208:3,5?二硝基苯甲酸?2,3?二氯苯酯
PKUMDL_AAL_209:3?硝基苯甲酸?1?萘酯
PKUMDL_AAL_210:3?羧基苯甲酸?1?萘酯
上述化合物的物理常數和光譜數據列入表1,其中在核磁共振波譜儀VarianMercury 400M(DMSO溶劑,TMS參比)上得到1H NMR光譜數據,在VG?ZAB?HS上得到質譜數據。熔點用北京泰克儀器有限公司X?4數字顯示顯微熔點測定儀測定。
表1.目標化合物的的物理常數和光譜數據

???表示未測到。
實施例3、熒光分光光度法測定5?LOX的體外活性
熒光分光光度法的測活原理是基于5?LOX的反應中間產物5?HPETE可以將熒光顯色劑H2DCFDA氧化生成高熒光活性的分子DCF,其激發波長為500nm,發射波長為520nm。測活時,先將5?LOX酶加入測活緩沖液(50mM Tris?HCl,pH 7.5,0.2mM ATP,0.1mM dithiothreitol(二硫蘇糖醇,DTT),0.1mM EDTA,0.5mM CaCl2)中,于96孔板中25℃溫育10min平衡。加入顯色劑H2DCFDA(終濃度為10μM)和花生四烯酸AA底物(終濃度為25μM)起始反應,并用熒光酶標儀監測熒光產物DCF的生成量隨時間的變化(激發波長為500nm,發射波長為520nm)。實驗采用初始速率法,以少于10%熒光顯色劑反應時的熒光強度變化率作為反應的初始速率。所有實驗均在25℃下完成,測活體系為220μl。
當測定小分子化合物對酶的抑制作用時,小分子需要用DMSO溶解,并且要先和酶一起于25℃預孵育10min后再加入底物起始反應。當體系中含有DMSO時,DMSO的終濃度(v/v)一般為5%,不能超過10%,否則會引起酶失活。測定小分子的抑制率時底物AA的濃度為25μM。
實施例4、酶聯免疫吸附法測定mPGES?1的體外活性
mPGES?1的酶活性是通過定量測定mPGES?1催化底物PGH2轉化產生的PGE2來表征的。催化產生的PGE2量使用PGE2酶聯免疫吸附試劑盒(Cayman)來測定。測定方法參見試劑盒說明書。測活時,先將底物PGH2加入到4℃恒溫的96孔板里。加入100μl酶引發反應。4℃反應1min后,加入150μl終止液(50mM FeCl2和100mM檸檬酸)終止反應。溶液經稀釋后使用PGE2酶聯免疫吸附試劑盒測定產物PGE2的含量。需要注意的是,底物PGH2高溫下不穩定容易分解,使用時要一直置于4℃恒溫環境中。
當測定小分子化合物對酶的抑制作用時,小分子需要用DMSO溶解,并且要先和酶一起于4℃預孵育15min后再加入到底物中起始反應。當體系中含有DMSO時,DMSO的終濃度(v/v)一般為2%,不能超過10%,否則會引起酶失活。測定小分子的抑制率時底物PGH2的濃度為17μM。
實施例5、化合物的全血活性測試
我們測定了化合物在人全血(Human Whole Blood,HWB)中對兩個通路的抑制活性,得到抑制劑在真實體系中的作用。在人全血活性測試中,通過在新鮮的、抗凝的人血液中加入外源性試劑刺激炎癥通路中相關酶的活性或表達,測定花生四烯酸代謝產物的量,從而表征抑制劑的活性。
一、化合物對5?LOX抑制效果的全血活性測試
5?LOX全血活性測試的原理是在新鮮的、加入抗凝劑的人血液中采用鈣離子載體A23187制備全血炎癥模型。A23187載體是一種移動性離子載體,它的功能是運輸鈣離子、鎂離子等二價陽離子。在運輸陽離子進入細胞的同時,將兩個氫離子帶至細胞外,可以刺激5?LOX通路的活性,通過酶聯接免疫吸附劑測定(Enzyme?Linked Immunosorbnent Assay,ELISA)方法測定5?LOX通路的下游代謝產物白三烯B4(LTB4)的含量,采用Cayman Chemical公司提供的LTB4的ELISA試劑盒完成。
測活時,根據需處理的血液量,事先將適量肝素(heparin)加入滅菌的EP管中,涂抹均勻,其在血液中的終濃度為10~20U.I./ml。收集兩周內未服用NSAIDs的健康志愿者的靜脈全血,以heparin抗凝,快速分裝到1.5ml的EP管中,每管500μl,EP管中事先加好2μl抑制劑的DMSO溶液或者2μl DMSO作為V0,于37℃,150轉振蕩孵育20min,再加入2μl A23187(或者DMSO作為空白),于37℃適度震蕩孵育30min,放到冰上停止反應,于4℃,3000g離心5min收集上層血漿,每管約能得到血漿200?250μl,進行下一步LTB4含量的ELISA方法測定。如果不立刻使用血漿,應于?80℃保存。
二、化合物對mPGES?1抑制效果的全血活性測試
mPGES?1全血活性測試的原理是在新鮮的、加入抗凝劑的人血液中采用脂多糖制備全血炎癥模型。脂多糖是發現于大腸桿菌外膜的一種大分子,是一種內毒素,可以誘發強烈的免疫反應。通過酶聯接免疫吸附劑測定(Enzyme?LinkedImmunosorbnent Assay,ELISA)方法測定mPGES?1的酶反應產物前列腺素E2(PGE2)的含量,采用Cayman Chemical公司提供的PGE2的ELISA試劑盒完成。
測活時,根據需處理的血液量,事先將適量heparin加入滅菌的EP管中,涂抹均勻,其在血液中的終濃度為10~20U.I./ml。收集兩周內未服用NSAIDs的健康志愿者的靜脈全血,以heparin抗凝,用排槍快速分裝到96孔板中,每孔100μl,EP管中事先加好1μl抑制劑的DMSO溶液或者1μl DMSO作為V0,于37℃,400轉振蕩孵育15min,再加入2μl脂多糖(或者40mM PBS+100mM NaCl緩沖液作為空白),于37℃適度震蕩孵育24h。放到冰上停止反應,于4℃,3000g離心5min收集上層血漿,每管約能得到血漿10?20μl,進行下一步PGE2含量的ELISA方法測定。如果不立刻使用血漿,應于?80℃保存。
針對實施例2合成得到10個5?脂氧合酶和前列腺素E合成酶的芳香酯類雙功能抑制劑,采用實施例3、4、5的方法進行5?脂氧合酶和前列腺素E合成酶的酶活測試和全血測試,每個化合物進行三次平行測試,部分結果見表2。
表2.化合物的活性測試


表2中,陽性參照zileuton是5?脂氧合酶的抑制劑,陽性參照MF63是前列腺素E合成酶的抑制劑。
從結構分析,mPGES?1活性部位在單體結合界面處,結合空間較大,需要更大的基團才能夠與其相互作用,但過大基團的引入又使得5?LOX活性降低,從活性數據可見,將疏水基團由萘環改為苯環之后,5?LOX活性保持、而mPGES?1活性降低。從對接構象可以看出整個分子中只有一個硝基起關鍵作用,實驗結果很好的印證這一點,去掉一個硝基活性與母體分子基本保持一致。因此單硝基化合物PKUMDL_AAL_209是一個有著更高原子效率的雙功能分子。
以上酶活測試和全血測試結果表明,本發明的化合物可同時抑制5?脂氧合酶和前列腺素E合成酶,是未見報道的新型5?脂氧合酶和前列腺素E合成酶的雙功能抑制劑。將本發明的芳香酯類化合物或其藥用鹽作為有效成分,添加常規藥物載體,可制備用于治療或預防各種炎癥的藥物。
本發明的芳香酯類化合物的藥用鹽是指藥學上可接受的鹽,例如與鹽酸、硫酸、磷酸、硝酸等無機酸形成的鹽,或是與檸檬酸、琥珀酸、枸櫞酸、醋酸、酒石酸、甲磺酸等有機酸形成的鹽。
常規藥物載體指無毒固態、半固態或液態填充劑、稀釋劑、佐劑、包裹材料或其他制劑輔料。根據本領域的公知技術,可以根據治療目的、給藥途徑的需要將藥物組合物制成各種劑型。

關 鍵 詞:
芳香 LOX MPGES1 抑制劑 應用
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