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灰黃青霉、由其產生的抗菌活性化合物及應用.pdf

摘要
申請專利號:

CN201210034285.1

申請日:

2012.02.15

公開號:

CN103255061B

公開日:

2014.11.26

當前法律狀態:

授權

有效性:

有權

法律詳情: 授權|||實質審查的生效IPC(主分類):C12N 1/14申請日:20120215|||公開
IPC分類號: C12N1/14; C12P17/18; C07D493/04; A61K31/365; A61P31/04; C12R1/80(2006.01)N 主分類號: C12N1/14
申請人: 中國醫學科學院醫藥生物技術研究所
發明人: 余利巖; 王莉寧; 張志明; 張濤; 游雪甫; 胡辛欣; 劉紅宇; 魏玉珍
地址: 100050 北京市西城區南緯路2號院
優先權:
專利代理機構: 北京路浩知識產權代理有限公司 11002 代理人: 王朋飛;王加嶺
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法律狀態
申請(專利)號:

CN201210034285.1

授權公告號:

103255061B||||||

法律狀態公告日:

2014.11.26|||2013.09.18|||2013.08.21

法律狀態類型:

授權|||實質審查的生效|||公開

摘要

本發明提供了一種灰黃青霉(Penicillium?griseofulvum)CPCC400528,其保藏號為CGMCC?NO.5752,由其發酵制備產生的抗菌活性化合物,其分子式為C7H6O4,結構如式(I)所示:式(I)該化合物對多種革蘭氏陽性病原菌,革蘭氏陰性病原菌具有較好的生長抑制作用,隨著濃度增加,其抑制作用逐漸增強;同時對多種耐藥菌株也具有良好的抑制作用。本發明的菌株易于發酵培養,產量高,活性化合物的制備工藝簡單易控,制備的化合物抗菌活性明顯,為抗菌新藥的研發奠定了基礎,具有十分廣闊的市場前景。

權利要求書

權利要求書
1.   灰黃青霉(Penicillium griseofulvum)CPCC 400528,其保藏號為CGMCC NO.5752。

2.   由權利要求1所述的灰黃青霉CPCC 400528發酵產生的抗菌活性化合物,其分子式為C7H6O4,結構如式(I)所示:
式(I)。

3.   權利要求2所述抗菌活性化合物的制備方法,其特征在于,包括步驟:
1)將活化后的灰黃青霉CPCC 400528接種到發酵培養基中進行發酵培養;
2)用乙酸乙酯?甲醇體積比為17∶3作為萃取劑萃取步驟1)所得的發酵液,過濾,濾液經真空濃縮,得到褐色浸膏;
3)以水溶解步驟2)中得到的褐色浸膏,然后用乙酸乙酯浸提,并用RP?18反相硅膠柱分離浸提液,以甲醇的水溶液進行洗脫,收集洗脫液,濃縮后用正相硅膠柱分離,以氯仿和甲醇的混合液進行梯度洗脫,當氯仿∶甲醇體積比為20∶1時,即得目標化合物。

4.   根據權利要求3所述的方法,其特征在于,步驟1)中發酵培養的溫度為25~28℃,培養時間為3~7d;步驟2)中萃取時間為12~24h,真空濃縮的溫度為40~45℃。

5.   權利要求2所述的抗菌活性化合物在制備廣譜抗菌藥物中的應用。

6.   含有權利要求2所述抗菌活性化合物的廣譜抗菌藥物。

7.   根據權利要求6所述的廣譜抗菌藥物,其為抗金黃色葡菌球菌、表皮葡萄球菌、糞腸球菌、屎腸球菌、結核分枝桿菌的藥物。

8.   根據權利要求6所述的廣譜抗菌藥物,其為抗耐藥的金黃色葡菌球菌、表皮葡萄球菌、糞腸球菌、屎腸球菌的藥物。

9.   根據權利要求6所述的廣譜抗菌藥物,其為抗大腸埃希氏菌、肺炎克雷伯桿菌、銅綠假單胞菌、鮑曼不動桿菌、陰溝腸桿菌、產氣腸桿菌、粘質沙雷氏菌、摩根摩根氏菌、雷極普魯菲登桿菌、普通變形桿菌、奇異變形桿菌、傷寒沙門菌、弗勞地枸櫞酸菌的藥物。

10.   根據權利要求6所述的廣譜抗菌藥物,其為抗耐藥的大腸埃希氏菌、肺炎克雷伯桿菌、銅綠假單胞菌、鮑曼不動桿菌的藥物。

說明書

說明書灰黃青霉、由其產生的抗菌活性化合物及應用
技術領域
本發明屬于微生物和制藥領域,具體地說,涉及一株灰黃青霉、由其產生的抗菌活性化合物及應用。
背景技術
天然抗菌藥物和合成抗菌藥物等的出現使有效治療各種細菌感染成為可能,為保障人類健康做出了卓越貢獻。但隨著抗生素的廣泛應用,也出現了細菌耐藥性逐年增加,致使一些抗生素療效降低、甚至無效的情況。過去已獲控制的一些傳染性疾病(如結核病等)出現了再次流行的趨勢;一些非致病菌成為條件致病菌,如變形桿菌、綠膿桿菌等;尤其是超級細菌的出現,更是讓醫學界擔心“后抗菌藥物時代”的到來。因此,迫切要求不斷地研發新型抗菌藥物。
在蛋白質的生物合成過程中,氨酰?tRNA合成酶起了至關重要的作用,它催化氨基酸與相應的tRNA合成氨酰?tRNA,是遺傳信息通過蛋白質形式得以表達所必需的一個組分,是各類生物體生存所必不可少的一類酶。對于病原菌而言,一旦它的某種氨酰?tRNA合成酶受到抑制失去功能,就會導致其蛋白質的生物合成中斷以及許多重要的生理過程受影響,病原菌的生長繁殖也就隨之終止。因此,氨酰?tRNA合成酶適于作為新型抗菌藥物的作用靶點。
苯丙氨酰?tRNA合成酶(PheRS)作為藥物篩選的靶點具有其獨特的優點。PheRS與其它氨酰?tRNA合成酶在結構以及催化特性方面的差異將有利于避免交叉耐藥的問題。另外,PheRS在不同細菌中的序列比較保守,而且與真核生物的同種功能的蛋白之間不具有相關性,有利于篩選到對多種病原菌都有效的廣譜抗生素,而且所篩選到的化合物對人體的毒性也會很小。
微生物及其代謝產物的多樣性,為新抗菌藥物的篩選提供了豐富來源。目前,已從青霉菌中發現了大量具有新穎化學結構和特異生理功能的化合物,其中許多具有良好的抗菌、抗病毒、抗腫瘤等活性,青霉菌通過人工條件發酵培養,可以提供穩定的天然產物來源。
發明內容
本發明的目的是提供一株灰黃青霉CPCC 400528。
本發明的另一目的是提供由灰黃青霉CPCC 400528產生的具有廣譜抗菌作用的化合物及其應用。
為了實現本發明目的,本發明的灰黃青霉(Penicillium griseofulvum)CPCC 400528,其分離自新疆喀納斯湖畔的土壤樣品中,現已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心,地址:北京市朝陽區北辰西路1號院3號中國科學院微生物研究所,保藏日期2012年2月13日,保藏號CGMCC NO.5752。
灰黃青霉CPCC 400528的菌落在察氏培養基(CA)上25℃培養7天,產生大量的放射狀皺紋,中心有臍狀突起;質地通常絨狀,帶輕微絮狀;菌絲體,邊緣通常呈現白色,而中部面上往往呈現淡灰黃色;分生孢子結構大量產生,分生孢子梗發生在孢梗束和束絲之中,帚狀分枝比較復雜,多是四輪生,少三輪生,叉開,分枝點通常2?3或更多,分生孢子呈現寬橢圓形,分生孢子鏈呈現較緊密而叉開的近圓柱狀。
本發明還提供由灰黃青霉CPCC 400528發酵產生的抗菌活性化合物??異棒曲霉素,其分子式為C7H6O4,結構如式(I’)所示:
式(I’)
其中1~7為碳原子的編號,該抗菌活性化合物為無色油狀物,易溶于甲醇、水等溶劑中。
本發明還提供上述抗菌活性化合物的制備方法,包括步驟:
1)將活化后的灰黃青霉CPCC 400528接種到發酵培養基中進行發酵培養;2)發酵結束后,用體積比為17∶3的乙酸乙酯?甲醇作為萃取劑萃取發酵液(萃取至少1次),過濾,濾液經真空濃縮,得到褐色浸膏;3)以水溶解步驟2)中得到的褐色浸膏,然后用乙酸乙酯浸提,并用RP?18反相硅膠柱分離浸提液,以甲醇的水溶液進行洗脫,收集洗脫液,濃縮后用正相硅膠柱分離,以氯仿和甲醇的混合液進行梯度洗脫,當氯仿?甲醇體積比為20∶1時,即得目標化合物。
在步驟1)中,發酵培養的溫度為25~28℃,培養時間為3~7d。
在步驟2)中,萃取時間為12~24h,真空濃縮的溫度為40~45℃。
對所得化合物進行熒光檢測,熒光顯暗黑色,碘顯色,硫酸顯淡黃色,用氯仿?甲醇(體積比6∶1)溶劑體系展開Rf值為0.62。
本發明還提供上述制備的抗菌活性化合物在制備廣譜抗菌藥物中的應用。
本發明所涉及的活性化合物具有廣譜抗菌效果,特別是抗G+和G?菌效果顯著;化合物在0?128μg/ml濃度范圍內能夠有效抑制:(1)金黃色葡菌球菌、表皮葡萄球菌、糞腸球菌、屎腸球菌的標準菌株以及它們的耐藥株;(2)結核分枝桿菌等G+菌;(3)大腸埃希氏菌、肺炎克雷伯桿菌、銅綠假單胞菌、鮑曼不動桿菌標準菌株和它們的耐藥株;(4)陰溝腸桿菌、產氣腸桿菌、粘質沙雷氏菌、摩根摩根氏菌、雷極普魯菲登桿菌、普通變形桿菌、奇異變形桿菌、傷寒沙門菌、弗勞地枸櫞酸菌標準菌株等G?菌的生長。抗菌機制為:對細菌生長所必需的PheRS酶具有抑制活性,并呈現一定的量效關系。
本發明進一步提供含有上述抗菌活性化合物的廣譜抗菌藥物。優選地,所述廣譜抗菌藥物為抗金黃色葡菌球菌、表皮葡萄球菌、糞腸球菌、屎腸球菌、結核分枝桿菌的藥物;所述廣譜抗菌藥物為抗耐藥的金黃色葡菌球菌、表皮葡萄球菌、糞腸球菌、屎腸球菌的藥物;所述廣譜抗菌藥物為抗大腸埃希氏菌、肺炎克雷伯桿菌、銅綠假單胞菌、鮑曼不動桿菌、陰溝腸桿菌、產氣腸桿菌、粘質沙雷氏菌、摩根摩根氏菌、雷極普魯菲登桿菌、普通變形桿菌、奇異變形桿菌、傷寒沙門菌、弗勞地枸櫞酸菌的藥物;所述廣譜抗菌藥物為抗耐藥的大腸埃希氏菌、肺炎克雷伯桿菌、銅綠假單胞菌、鮑曼不動桿菌的藥物。
本發明首次從灰黃青霉菌CPCC 400528發酵提取物中分離具有抗菌活性的化合物。具有灰黃青霉菌株易于發酵培養,由其制備的化合物工藝過程簡單易控,化合物產量高,制備的化合物抗菌活性明顯等特點,為抗菌新藥的研發奠定了基礎,具有十分廣闊的市場前景。
附圖說明
圖1為由本發明灰黃青霉菌CPCC 400528發酵產生的活性化合物的制備流程圖。
圖2為本發明活性化合物的1H?NMR(600MHz)譜圖。
圖3為本發明活性化合物的1C?NMR(125MHz)譜圖。
具體實施方式
以下實施例用于說明本發明,但不用來限制本發明的范圍。若未特別指明,實施例中所用的技術手段為本領域技術人員所熟知的常規手段,所用原料均為市售商品。
實施例1灰黃青霉菌CPCC 400528的發酵及抗菌活性化合物的制備
本發明的灰黃青霉(Penicillium griseofulvum)CPCC 400528分離自新疆喀納斯湖畔的土壤樣品中,現已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心,保藏號CGMCC NO.5752。
A.培養基配方:(斜面培養基配方)


B.發酵培養基配方:

發酵工藝:斜面培養:按上述斜面培養基配方配制培養基,分裝試管,121℃滅菌30min后,制斜面。將保存的灰黃青霉CPCC 400528菌種轉接至斜面培養基上,28℃下培養5d。挑取菌絲塊接種于液體發酵培養基中,28℃下培養2d,即為種子培養物。
將60ml種子培養物接種到裝有1000ml的發酵培養基中,28℃振蕩培養4d。
抗菌活性化合物(異棒曲霉素)的提取:發酵結束后,將液體發酵液用乙酸乙酯∶甲醇(v∶v)=17∶3的溶液體系萃取3次,每次24h,浸提液用棉花過濾,真空濃縮得到浸膏。
異棒曲霉素的分離精制:上述褐色浸膏以水溶解,等體積乙酸乙酯浸提,RP?18反相硅膠柱分離,以甲醇和水洗脫,收集5%甲醇洗脫的組分,濃縮后用正相硅膠柱層析分離,氯仿?甲醇梯度洗脫,收集組分,當氯仿∶甲醇(v∶v)=20∶1時,得到目標化合物??異棒曲霉素,其為無色油狀物,分子式為C7H6O4,結構如式(I)所示:
式(I)
該抗菌活性化合物易溶于甲醇、水等溶劑中。
對所得化合物進行熒光檢測,熒光顯暗黑色,碘顯色,硫酸顯淡黃色,用氯仿?甲醇(體積比6∶1)溶劑體系展開Rf值為0.62。
波譜數據:1H NMR(600MHz,cd3od)δ5.99?5.94(m,2H),5.90(s,1H),4.58(dd,J=17.3,2.5Hz,2H),4.31(dd,J=17.2,3.6Hz,2H),3.27?3.23(m,1H).13C NMR(151MHz,cd3od)δ170.79,153.45,147.83,110.99,109.64,89.87,60.27。(圖2和圖3)
本發明灰黃青霉菌CPCC 400528發酵產生的活性化合物的制備流程如圖1所示。
實施例2抗菌活性化合物(異棒曲霉素)的活性測試
I.化合物抗菌活性測試:用瓊脂稀釋法測定實施例1中制備的活性化合物的體外抗菌活性。
1、待測菌株:
如表1所示的G+菌金黃色葡菌球菌、表皮葡萄球菌、糞腸球菌、屎腸球菌的標準菌株以及它們的耐藥株;結核分枝桿菌以及G?菌大腸埃希氏菌、肺炎克雷伯桿菌、銅綠假單胞菌、鮑曼不動桿菌標準菌株和它們的耐藥株、陰溝腸桿菌、產氣腸桿菌、粘質沙雷氏菌、摩根摩根氏菌、雷極普魯菲登桿菌、普通變形桿菌、奇異變形桿菌、傷寒沙門菌和弗勞地枸櫞酸菌標準菌株。
2、待測樣品和培養基的制備:
(1)培養基使用Mueller?Hinton(MH)或7H11瓊脂培養基,按本領域常規方法進行配制,pH7.2~7.4。
(2)檢定菌株的培養:檢定菌株于37℃過夜培養或生長至OD600為1.5~2.0。
(3)含藥平板的制備:以實施例1制得的化合物為樣品,以抗菌藥利福平為對照品,將不同濃度(μg/ml)的樣品及對照品分別加入MH瓊脂或7H11瓊脂培養基中(45~50℃),充分混勻后傾倒各滅菌平皿。
(4)接種物制備與接種:制備濃度相當于0.5麥氏標準比濁管的菌懸液,再1∶10稀釋,以多點接種器吸取制備好的菌液(約1~2μl)接種于各瓊脂平板表面,每點菌數約為104CFU,形成直徑為5~8mm的菌斑。接種后置37℃孵育16~48小時,對于結核分枝桿菌,接種后需置37℃孵育3?4周。
(5)結果判斷:與生長對照比較,將平板上完全抑制細菌生長的最低藥物濃度作為MIC。結果如表1所示。
表1化合物樣品及對照藥左氧氟沙星的體外抗菌作用(MIC:μg/ml)


II.PheRS酶活抑制檢測
1、PheRS酶活測定體系:

2、樣品制備
化合物樣品:將實施例1中制備的化合物溶解在DMSO中,濃度為2mM,作為混合物樣品溶液。
3、樣品活性檢測
分別向反應體系中添加各組分:
A.陰性對照組(化合物):向PheRS酶活測定體系中加入1μlDMSO溶劑,反應體系的總體積為100μl。
B.陽性對照組:按照上述PheRS酶活測定體系,配制不含PheRS的PheRS酶活測定體系,反應體系的總體積為100μl。
C.樣品實驗組(化合物):取1μl化合物樣品溶液加入到PheRS酶活測定體系中,使化合物的終濃度為20μM,反應體系的總體積為100μl;
將上述各反應組的反應體系分別混勻后加入同一塊96孔板中(每孔反應體系總體積為100μl),置于PerkinElmer公司的EnVision酶標儀內,開啟溫控為37℃進行反應。以反應起始時間為0時刻,每隔2分鐘檢測一次各孔反應體系在340nm波長處的吸光值OD340,連續檢測50min(25次)。
4、結果分析:
分別計算各孔的ΔOD340/min,再按照以下公式計算各孔的抑制率:
<mrow><MI>IR</MI> <MO>=</MO> <MFRAC><MROW><MI>ΔN</MI> <MO>-</MO> <MI>ΔS</MI> </MROW><MROW><MI>ΔN</MI> <MO>-</MO> <MI>ΔP</MI> </MROW></MFRAC><MO>×</MO> <MN>100</MN> <MO>%</MO> </MROW>]]&gt;</MATH></MATHS> <BR>其中: <BR>ΔN是陰性對照孔平均每分鐘吸光值的變化量; <BR>ΔP是陽性對照孔平均每分鐘吸光值的變化量; <BR>ΔS是樣品實驗孔平均每分鐘吸光值的變化量。 <BR>結果如表2所示,本發明的活性化合物對細菌PheRS酶的活性具有一定的抑制作用,并呈現出一定的量效關系。 <BR>表2不同濃度的本發明的活性化合物對細菌PheRS的酶活性抑制情況 <BR></TABLES> <BR>雖然,上文中已經用一般性說明及具體實施方案對本發明作了詳盡的描述,但在本發明基礎上,可以對之作一些修改或改進,這對本領域技術人員而言是顯而易見的。因此,在不偏離本發明精神的基礎上所做的這些修改或改進,均屬于本發明要求保護的范圍。</p> </div> </div> </div> </div> <div class="page_view" id="pageContainer" oncontextmenu="return false"> <script language="javascript"> $(document).ready(function() { initPage(); $("#loading").hide(); });</script> <!--end documenttopic--> </div> <div id="outer_page_more" style="margin-bottom:20px;background-color:#FFF; overflow:hidden;"> <div class="inner_page_more" id="page_more" style="width: 917px; overflow:hidden;border:solid 1px #ccc;box-shadow:0 1px 5px #ccc; height: 260px; 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src='http://www.rgyfuv.icu/fileroot1/2018-1/24/e09f7001-2bbc-48a5-b7a0-1a9f535cc4f9/pic1.gif' alt="建筑排水出戶管防沉降保護器.pdf" onerror="this.src='images/d_pdf.png'"> 建筑排水出戶管防沉降保護器.pdf </a></h3></li> <li><h3><a href="http://www.rgyfuv.icu/p-103596.html" target="_parent" title="工程機械的液壓裝置.pdf"> <img src='http://www.rgyfuv.icu/fileroot1/2018-1/24/d8ed175a-a575-4a43-a914-c60d1ac0276f/pic1.gif' alt="工程機械的液壓裝置.pdf" onerror="this.src='images/d_pdf.png'"> 工程機械的液壓裝置.pdf </a></h3></li> <li><h3><a href="http://www.rgyfuv.icu/p-103597.html" target="_parent" title="電加熱抽油裝置.pdf"> <img src='http://www.rgyfuv.icu/fileroot1/2018-1/24/5dc1097a-5645-4879-a2b1-06862171fe63/pic1.gif' alt="電加熱抽油裝置.pdf" onerror="this.src='images/d_pdf.png'"> 電加熱抽油裝置.pdf </a></h3></li> <li><h3><a href="http://www.rgyfuv.icu/p-103598.html" target="_parent" title="牙輪鉆頭牙爪軸頸膏劑滲硼法.pdf"> <img src='http://www.rgyfuv.icu/fileroot1/2018-1/24/d54fb286-40d0-4d76-bb30-e425f5e7f86d/pic1.gif' alt="牙輪鉆頭牙爪軸頸膏劑滲硼法.pdf" onerror="this.src='images/d_pdf.png'"> 牙輪鉆頭牙爪軸頸膏劑滲硼法.pdf </a></h3></li> <li><h3><a href="http://www.rgyfuv.icu/p-103599.html" target="_parent" title="雙水位抽水馬桶沖洗裝置.pdf"> <img src='http://www.rgyfuv.icu/fileroot1/2018-1/24/5b7962dd-158e-4efe-87e6-f4d213e9d6f1/pic1.gif' alt="雙水位抽水馬桶沖洗裝置.pdf" onerror="this.src='images/d_pdf.png'"> 雙水位抽水馬桶沖洗裝置.pdf </a></h3></li> <li><h3><a href="http://www.rgyfuv.icu/p-103600.html" target="_parent" title="交通安全用綠化景觀槽.pdf"> <img src='http://www.rgyfuv.icu/fileroot1/2018-1/24/0b2050c2-b09c-49b7-9cd0-f1c1403911d2/pic1.gif' alt="交通安全用綠化景觀槽.pdf" onerror="this.src='images/d_pdf.png'"> 交通安全用綠化景觀槽.pdf </a></h3></li> <li><h3><a href="http://www.rgyfuv.icu/p-103601.html" target="_parent" title="平衡窗戶控制器.pdf"> <img src='http://www.rgyfuv.icu/fileroot1/2018-1/24/85782d4b-bcf2-4087-968a-ea3f25d0ed40/pic1.gif' alt="平衡窗戶控制器.pdf" onerror="this.src='images/d_pdf.png'"> 平衡窗戶控制器.pdf </a></h3></li> <li><h3><a href="http://www.rgyfuv.icu/p-103602.html" target="_parent" title="地層測試器推靠器緊急回縮裝置.pdf"> <img src='http://www.rgyfuv.icu/fileroot1/2018-1/24/639cd507-4ce8-4876-9911-798fd09d1d27/pic1.gif' alt="地層測試器推靠器緊急回縮裝置.pdf" onerror="this.src='images/d_pdf.png'"> 地層測試器推靠器緊急回縮裝置.pdf </a></h3></li> <li><h3><a href="http://www.rgyfuv.icu/p-105176.html" target="_parent" title="一種斜井沉井方法.pdf"> <img src='http://www.rgyfuv.icu/fileroot1/2018-1/24/f8decb5d-0573-477b-9350-3fdf6e14a8e9/pic1.gif' alt="一種斜井沉井方法.pdf" onerror="this.src='images/d_pdf.png'"> 一種斜井沉井方法.pdf </a></h3></li> <li><h3><a href="http://www.rgyfuv.icu/p-105177.html" target="_parent" title="安全門鎖.pdf"> <img src='http://www.rgyfuv.icu/fileroot1/2018-1/24/ebe1e712-6143-4b70-82e8-62e4705169ce/pic1.gif' alt="安全門鎖.pdf" onerror="this.src='images/d_pdf.png'"> 安全門鎖.pdf </a></h3></li> <li><h3><a href="http://www.rgyfuv.icu/p-105178.html" target="_parent" title="地錨的錨頭部結構.pdf"> <img src='http://www.rgyfuv.icu/fileroot1/2018-1/24/e7ac5ef5-61dd-4da5-ac5a-ceed8bafc68f/pic1.gif' alt="地錨的錨頭部結構.pdf" 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src='http://www.rgyfuv.icu/fileroot2/2018-8/11/23764282-b1f6-430b-935c-df635c40f903/pic1.gif' alt="護欄活動連接件.pdf" onerror="this.src='images/d_pdf.png'"> 護欄活動連接件.pdf </a></h3></li> <li><h3><a href="http://www.rgyfuv.icu/p-4008202.html" target="_parent" title="一種便攜式絕緣折疊梯.pdf"> <img src='http://www.rgyfuv.icu/fileroot2/2018-8/11/ae6d299c-ff8a-4291-aebf-662dca40944c/pic1.gif' alt="一種便攜式絕緣折疊梯.pdf" onerror="this.src='images/d_pdf.png'"> 一種便攜式絕緣折疊梯.pdf </a></h3></li> <li><h3><a href="http://www.rgyfuv.icu/p-4008203.html" target="_parent" title="一種污水二次利用裝置.pdf"> <img src='http://www.rgyfuv.icu/fileroot2/2018-8/11/20abc34b-cf41-478a-8c8f-5f139bbd97d9/pic1.gif' alt="一種污水二次利用裝置.pdf" onerror="this.src='images/d_pdf.png'"> 一種污水二次利用裝置.pdf </a></h3></li> <li><h3><a href="http://www.rgyfuv.icu/p-4008204.html" target="_parent" title="敞開式硬巖掘進機人字形溜渣系統.pdf"> <img src='http://www.rgyfuv.icu/fileroot2/2018-8/11/cc323291-5e5e-4ac4-867d-dc932e4f7021/pic1.gif' alt="敞開式硬巖掘進機人字形溜渣系統.pdf" 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target="_blank"> 小米磚</a><img style="height:15px; width:20px; overflow:hidden; margin-right:10px;background:url(images/bg_index_ie6_781d95ab.png) no-repeat -185px 4px;display:none" src="images/s.gif" alt="企業認證" title="企業認證"/></div> <div class="author-level-bar"> <span class="mr5 author-grade author-grade5" title="會員等級"></span> </div></td></tr></table> <div class="fl" style="width: 240px;"> <p class="kh_cpZl"> 編號: cj20190705231651747474</p> <p class="kh_cpZl"> 類型: 共享資源</p> <p class="kh_cpZl"> 格式: PDF</p> <p class="kh_cpZl"> 大小: 463.50KB</p> <p class="kh_cpZl"> 上傳時間: 2019-07-06</p> </div> </div> </div> <div class="box hot-keywords mt10" style="height: 380px; overflow: hidden;" id="relatebox"> <div class="boxHd" style="padding-bottom: 0px;"> <div class="fl keywords-ico mr5 ml13 ico"> </div> <h2 class="fl font-normal font16 font-yahei" style="font-size: 16px; font-weight: 100; margin-left: 0px; margin-top: 3px; font-family: 微軟雅黑"> 相關資源</h2> </div> <div id="author-works-list" class="author-works-list bgF" style="height: 314px; overflow: auto"> <li> <h2><img alt="控制水稻穗大小基因、其突變體及應用.pdf" class="pdf" src="Images/s.gif" /><a target="_parent" href="http://www.rgyfuv.icu/p-6420565.html" title="控制水稻穗大小基因、其突變體及應用.pdf">控制水稻穗大小基因、其突變體及應用.pdf</a></h2> </li> <li> <h2><img alt="靶向治療結核的RELA切割并TLR7激活基序修飾的鎖核酸脫氧核酶及其應用.pdf" class="pdf" src="Images/s.gif" /><a target="_parent" href="http://www.rgyfuv.icu/p-6419964.html" title="靶向治療結核的RELA切割并TLR7激活基序修飾的鎖核酸脫氧核酶及其應用.pdf">靶向治療結核的RELA切割并TLR7激活基序修飾的鎖核酸脫氧核酶及其應用.pdf</a></h2> </li> <li> <h2><img alt="短小芽孢桿菌E14及其培養方法與用途.pdf" class="pdf" src="Images/s.gif" /><a target="_parent" href="http://www.rgyfuv.icu/p-6419955.html" title="短小芽孢桿菌E14及其培養方法與用途.pdf">短小芽孢桿菌E14及其培養方法與用途.pdf</a></h2> </li> <li> <h2><img alt="一種解淀粉芽胞桿菌及制備方法和應用.pdf" class="pdf" src="Images/s.gif" /><a target="_parent" href="http://www.rgyfuv.icu/p-6419938.html" title="一種解淀粉芽胞桿菌及制備方法和應用.pdf">一種解淀粉芽胞桿菌及制備方法和應用.pdf</a></h2> </li> <li> <h2><img alt="一種發形霞水母硫氧還蛋白及其編碼基因與應用.pdf" 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青霉</em></span></a> <a target="_blank" href="search.html?p=0&q=%e4%ba%a7%e7%94%9f" class="tag-item ico" title="產生" hidefocus="true"><span class="ico"><em> 產生</em></span></a> <a target="_blank" href="search.html?p=0&q=%e6%8a%97%e8%8f%8c" class="tag-item ico" title="抗菌" hidefocus="true"><span class="ico"><em> 抗菌</em></span></a> <a target="_blank" href="search.html?p=0&q=%e6%b4%bb%e6%80%a7" class="tag-item ico" title="活性" hidefocus="true"><span class="ico"><em> 活性</em></span></a> <a target="_blank" href="search.html?p=0&q=%e5%8c%96%e5%90%88%e7%89%a9" class="tag-item ico" title="化合物" hidefocus="true"><span class="ico"><em> 化合物</em></span></a> <a target="_blank" href="search.html?p=0&q=%e5%ba%94%e7%94%a8" class="tag-item ico" title="應用" hidefocus="true"><span class="ico"><em> 應用</em></span></a> <input name="ctl00$Content$hiddenCategoryID" type="hidden" id="Content_hiddenCategoryID" value="68" /> </div> </div> <div class="ad268 mt10"> <a 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