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抗菌生物活性支架及其制備方法.pdf

摘要
申請專利號:

CN201210558913.6

申請日:

2012.12.20

公開號:

CN103007345B

公開日:

2015.01.07

當前法律狀態:

授權

有效性:

有權

法律詳情: 授權|||實質審查的生效IPC(主分類):A61L 27/24申請日:20121220|||公開
IPC分類號: A61K38/18; A61L27/24; A61L27/22; A61L27/20; A61L27/04; A61L27/60; A61L27/54 主分類號: A61K38/18
申請人: 深圳清華大學研究院
發明人: 李小麗; 佘振定; 譚榮偉; 王明波; 劉偉強
地址: 518000 廣東省深圳市南山區高新技術工業村
優先權:
專利代理機構: 深圳瑞天謹誠知識產權代理有限公司 44340 代理人: 張佳
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法律狀態
申請(專利)號:

CN201210558913.6

授權公告號:

103007345B||||||

法律狀態公告日:

2015.01.07|||2013.05.01|||2013.04.03

法律狀態類型:

授權|||實質審查的生效|||公開

摘要

本發明涉及一種抗菌生物活性支架及其制備方法,所述方法的步驟為:制備明膠微球;制備多孔明膠微球;獲得載有活性因子的明膠微球;制備抗菌支架,向醋酸或丙二酸中加入膠原、殼聚糖和絲素蛋白中的至少一種以及納米銀粒子,制得混合溶液,將混合溶液注入平鋪有實心明膠微球的模具中后迅速把模具放入超低溫冰箱里冷凍處理,再冷凍干燥得到抗菌支架;制備抗菌生物活性支架步驟,將載有活性因子的明膠微球置于生理鹽水中配制成懸浮液,將懸浮液注入抗菌支架中,室溫干燥后得到抗菌生物活性支架。本發明以純天然高分子為原料并復合納米銀粒子和生物活性因子制得支架,支架具有生物活性和抗菌能力,能有效促進新生組織的血管化,可用于皮膚損傷修復。

權利要求書

權利要求書一種抗菌生物活性支架,其特征在于,其原料包括支架主體材料、抗菌成分和活性因子,所述支架主體材料為如下材料成分中的至少一種:明膠、膠原、殼聚糖和絲素蛋白;所述抗菌成分為納米銀離子;所述活性因子為如下生長因子中的至少一種:堿性成纖維細胞生長因子、血管內皮生長因子、血小板衍生因子和轉化生長因子。
 如權利要求1所述的抗菌生物活性支架,其特征在于,抗菌生物活性支架還包括透明質酸和硫酸軟骨素中的至少一種。
 一種如權利要求1或2所述的抗菌生物活性支架的制備方法,其特征在于,包括如下步驟:
制備明膠微球步驟,制備實心明膠微球;
加載活性因子步驟,將濃度為0.01?150ug/ul的活性因子水溶液滴加到明膠微球上,然后在室溫下靜置,使活性因子溶液充分浸漬到干燥的微球上,獲得載有活性因子的明膠微球;
制備抗菌支架步驟,向成分為醋酸或丙二酸的溶劑中加入膠原、殼聚糖和絲素蛋白中的至少一種以及納米銀粒子,制得混合溶液,然后,將實心明膠微球平鋪在模具中,用蒸汽熏蒸10?30min,再按照實心明膠微球與膠原、殼聚糖和絲素蛋白三者用量總和的質量比為:3?5:1的比例將混合溶液注入模具中,并迅速把模具放入超低溫冰箱里冷凍24?48h,再冷凍干燥得到抗菌支架;以及
制備抗菌生物活性支架步驟,將載有活性因子的明膠微球置于生理鹽水中配制成懸浮液,然后將懸浮液注入抗菌支架中,室溫干燥后得到抗菌生物活性支架。
 如權利要求3所述的抗菌生物活性支架制備方法,其特征在于,制備明膠微球步驟的具體操作如下:將明膠加入蒸餾水中,在40?50℃恒溫水浴中溶解1h,配制質量百分比為2?40%的明膠溶液,同時取200?400ml油放在40?50℃恒溫水浴中;然后在200?500 rp/min轉速下把明膠溶液滴入到油中形成均勻的混合乳液,再把混合乳液從恒溫水浴的溫度階梯式逐漸降溫到0℃,每降10℃恒溫15min,再加入80?200ml 4℃的丙酮,轉速250?800rp/min下繼續攪拌1h,用丙酮清洗后3000?4000rp/min離心收集,最后用1,4?環氧乙烷浸泡2天,一天換三次溶劑,再用去離子水洗滌后,冷凍干燥2天,最后用篩子篩選粒徑為80?400μm的實心明膠微球。
 如權利要求3或4所述的抗菌生物活性支架制備方法,其特征在于,所述方法還包括制備多孔明膠微球步驟,以將實心明膠微球制成多孔明膠微球后再進行加載活性因子步驟,制備多孔明膠微球步驟的具體操作如下:將實心明膠微球浸漬在質量百分比濃度為0.1?2%的戊二醛和吐溫80的混合溶液中,在25℃? 0℃的溫度條件下交聯8?24h,混合溶液中,吐溫80的質量百分比濃度為0.05?2%,然后置入含有質量百分比濃度為0.05?2%的甘氨酸的和質量百分比濃度為0.05?2%的吐溫80的混合溶液中,在37℃的條件下靜置15?30分鐘后取出明膠微球,再用質量百分比0.1%吐溫80溶液于4000 rpm/min離心處理5分鐘,然后在4℃下洗滌后冷凍干燥,獲得多孔明膠微球。
 如權利要求3所述的抗菌生物活性支架制備方法,其特征在于,制備抗菌支架步驟中,制得的混合溶液中,所加入的膠原、殼聚糖和絲素蛋白的總質量百分比濃度為0.01?1%,納米銀粒子質量百分比濃度為40?100ppm。
 如權利要求3或6所述的抗菌生物活性支架制備方法,其特征在于,制備抗菌支架步驟中,混合溶液中還加入質量百分比濃度為0.05?2.5%透明質酸和濃度為5mg/ml?40 mg/ml硫酸軟骨素兩者中的至少一種。
 如權利要求3所述的抗菌生物活性支架制備方法,其特征在于,制備抗菌支架步驟之后先進行交聯步驟獲得具有良好力學性能的抗菌支架后再進行制備抗菌生物活性支架步驟,交聯步驟包括化學交聯工藝,化學交聯工藝具體如下:以戊二醛、京尼平、碳化二亞胺中的一種或多種溶于水中配制出質量百分比濃度為0.1?1%的交聯劑溶液,把制備好的抗菌支架浸漬在交聯劑溶液中進行室溫交聯8?24h,然后依次用生理鹽水和蒸餾水浸泡清洗除去殘留的交聯劑,清洗后的抗菌支架再依次經過零下20?80℃的冷凍處理和零下40?60℃條件下的冷凍干燥。
 如權利要求8所述的抗菌生物活性支架制備方法,其特征在于,交聯步驟還包括高溫交聯工藝,高溫交聯工藝具體如下:將抗菌支架放置在真空干燥箱中,在真空條件下,溫度為105℃,高溫交聯24小時后恢復至室溫。
 如權利要求3所述的抗菌生物活性支架制備方法,其特征在于,制備抗菌生物活性支架步驟中,按照0.5?2mg載有活性因子的明膠微球置于0.2?1ml生理鹽水的比例配制成懸浮液,采用注射器將懸浮液注入抗菌支架。

說明書

說明書抗菌生物活性支架及其制備方法
技術領域
本發明涉及醫用生物材料技術領域,尤其是指一種抗菌生物活性支架及其制備方法。
背景技術
在日常生活、工作中,人體皮膚受到損傷時有發生。目前,皮膚的修復主要依靠血管內皮細胞和成纖維細胞的遷移、增殖和結締組織的形成來修復真皮層,這一過程常需要通過植皮或人工皮膚的輔助才能完成。盡管皮膚移植能治愈創面,但在取皮部位卻留下了新的創傷,常常導致疤痕增生,甚至因取皮過深,供皮區難以自愈,形成水皰,反復潰瘍等不利因素。
膠原是皮膚、韌帶、肌腱等組織及其它結締組織的主要成分,同時也是細胞外基質(ECM)的主要成分。由于膠原具有無抗原性、良好的生物相容性、可參與組織愈合過程等特點,并且其纖維狀結構利于組織培養中的細胞粘附增殖,可作為皮膚組織和骨組織的替代材料誘導組織再生修復,是理想的膜材料。但由于膠原的力學性能、降解性能、生物活性等問題,單一的膠原材料不能滿足性能要求,所以膠原基復合材料成為生物材料領域研究的主要方向。
目前,利用膠原為原料的皮膚替代物產品主要有Integra?、Biobrane?等人造皮膚。Integra?是由硅、牛膠原蛋白和鯊魚軟骨組成,其用處相當于一個支架,支持人體自身細胞并促使皮膚組織的再生。Biobrane?是雙層膜狀物,外層是薄的硅凝膠膜,內層整合有大量的膠原顆粒,可以迅速與創面緊密貼附。國內人工皮膚產品也有突破性進展,第四軍醫大學金巖教授項目組開發的組織工程化人工皮膚產品進入了產業化,該人工皮膚已于2007年獲得醫療器械產品注冊證書,正式進入臨床階段。但是,現有的支架材料功能單一,在抗菌性和生物活性方面往往無法兼顧。
發明內容
本發明所要解決的技術問題在于,提供一種抗菌生物活性支架,其同時具有抗菌能力和生物活性,能有效促進創面愈合。
本發明進一步所要解決的技術問題在于,提供一種抗菌生物活性支架制備方法,能以簡便的步驟制備出具有抗菌能力和生物活性,并能有效促進創面愈合的生物活性支架。
為解決上述技術問題,本發明提供如下技術方案:一種抗菌生物活性支架,其原料包括支架主體材料、抗菌成分和活性因子,所述支架主體材料為如下材料成分中的至少一種:明膠、膠原、殼聚糖和絲素蛋白;所述抗菌成分為納米銀離子;所述活性因子為如下生長因子中的至少一種:堿性成纖維細胞生長因子、血管內皮生長因子、血小板衍生因子和轉化生長因子。
進一步地,抗菌生物活性支架還包括透明質酸和硫酸軟骨素中的至少一種。
另一方面,本發明還提供一種如上所述的抗菌生物活性支架的制備方法,包括如下步驟:
制備明膠微球步驟,制備實心明膠微球;
制備多孔明膠微球步驟,將實心明膠微球制成多孔明膠微球;
加載活性因子步驟,將濃度為0.01?150ug/ul的活性因子水溶液滴加到多孔明膠微球上,然后在室溫下靜置,使活性因子溶液充分浸漬到干燥的微球上,獲得載有活性因子的明膠微球;
制備抗菌支架步驟,向成分為醋酸或丙二酸的溶劑中加入膠原、殼聚糖和絲素蛋白中的至少一種以及納米銀粒子,制得混合溶液,然后,將實心明膠微球平鋪在模具中,用蒸汽熏蒸10?30min,再按照實心明膠微球與膠原、殼聚糖和絲素蛋白三者用量總和的質量比為:3?5:1的比例將混合溶液注入模具中,并迅速把模具放入超低溫冰箱里冷凍24?48h,再冷凍干燥得到抗菌支架;以及
制備抗菌生物活性支架步驟,將載有活性因子的明膠微球置于生理鹽水中配制成懸浮液,然后將懸浮液注入抗菌支架中,室溫干燥后得到抗菌生物活性支架。
進一步地,制備明膠微球步驟的具體操作如下:將明膠加入蒸餾水中,在40?50℃恒溫水浴中溶解1h,配制質量百分比為2?40%的明膠溶液,同時取200?400ml油放在40?50℃恒溫水浴中;然后在200?500 rp/min轉速下把明膠溶液滴入到油中形成均勻的混合乳液,再把混合乳液從恒溫水浴的溫度階梯式逐漸降溫到0℃,每降10℃恒溫15min,再加入80?200ml 4℃的丙酮,轉速250?800rp/min下繼續攪拌1h,用丙酮清洗后3000?4000rp/min離心收集,最后用1,4?環氧乙烷浸泡2天,一天換三次溶劑,再用去離子水洗滌后,冷凍干燥2天,最后用篩子篩選粒徑為80?400μm的實心明膠微球。
進一步地,所述方法還包括制備多孔明膠微球步驟,以將實心明膠微球制成多孔明膠微球后再進行加載活性因子步驟,制備多孔明膠微球步驟的具體操作如下:將實心明膠微球浸漬在質量百分比濃度為0.1?2%的戊二醛和吐溫80的混合溶液中,在25℃? 0℃的溫度條件下交聯8?24h,混合溶液中,吐溫80的質量百分比濃度為0.05?2%,然后置入含有質量百分比濃度為0.05?2%的甘氨酸的和質量百分比濃度為0.05?2%的吐溫80的混合溶液中,在37℃的條件下靜置15?30分鐘后取出明膠微球,再用質量百分比0.1%吐溫80溶液于4000 rpm/min離心處理5分鐘,然后在4℃下洗滌后冷凍干燥,獲得多孔明膠微球。
進一步地,制備抗菌支架步驟中,制得的混合溶液中,所加入的膠原、殼聚糖和絲素蛋白的總質量百分比濃度為0.01?1%,納米銀粒子質量百分比濃度為40?100ppm。
進一步地,制備抗菌支架步驟中,混合溶液中還加入質量百分比濃度為0.05?2.5%透明質酸和濃度為5mg/ml?40 mg/ml硫酸軟骨素兩者中的至少一種。
進一步地,制備抗菌支架步驟之后先進行交聯步驟獲得具有良好力學性能的抗菌支架后再進行制備抗菌生物活性支架步驟,交聯步驟包括化學交聯工藝,化學交聯工藝具體如下:以戊二醛、京尼平、碳化二亞胺中的一種或多種溶于水中配制出質量百分比濃度為0.1?1%的交聯劑溶液,把制備好的抗菌支架浸漬在交聯劑溶液中進行室溫交聯8?24h,然后依次用生理鹽水和蒸餾水浸泡清洗除去殘留的交聯劑,清洗后的抗菌支架再依次經過零下20?80℃的冷凍處理和零下40?60℃條件下的冷凍干燥。
進一步地,交聯步驟還包括高溫交聯工藝,高溫交聯工藝具體如下:將抗菌支架放置在真空干燥箱中,在真空條件下,溫度為105℃,高溫交聯24小時后恢復至室溫。
進一步地,制備抗菌生物活性支架步驟中,按照0.5?2mg載有活性因子的明膠微球置于0.2?1ml生理鹽水的比例配制成懸浮液,采用注射器將懸浮液注入抗菌支架。
采用上述技術方案后,本發明至少具有如下有益效果:本發明以純天然高分子為原料并復合納米銀粒子制備出支架,而且還加載有生物活性因子,使制得的支架具有充分的生物活性,能有效促進新生組織的血管化,而且還具有足夠的抗菌能力,可用于皮膚損傷修復。而通過加入制孔劑控制多孔明膠微球的微孔孔徑大小以及交聯處理可提高支架的力學性能。
附圖說明
圖1是本發明抗菌生物活性支架制備方法的流程圖。
具體實施方式
下面結合附圖和具體實施例對本發明作進一步詳細說明。需要說明的是,在不沖突的情況下,本申請中的實施例及實施例中的特征可以相互結合。
請參考圖1所示,本發明提供一種抗菌生物活性支架,其原料包括支架主體材料、抗菌成分和活性因子,所述支架主體材料為如下材料成分中的至少一種:明膠、膠原、殼聚糖和絲素蛋白;所述抗菌成分為納米銀離子;所述活性因子為如下生長因子中的至少一種:堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)、血管內皮生長因子(VEGF)、血小板衍生因子(PDGF)和轉化生長因子(TGFβ)。此外,抗菌生物活性支架還可包括透明質酸和硫酸軟骨素中的至少一種。
另一方面,本發明還提供上述抗菌生物活性支架的制備方法,包括如下步驟:
制備明膠微球步驟,制備實心明膠微球;
制備多孔明膠微球步驟,將實心明膠微球制成多孔明膠微球;
加載活性因子步驟,將濃度為0.01?150ug/ul的活性因子水溶液滴加到多孔明膠微球上,活性因子水溶液的滴加量優選為每2mg多孔明膠微球滴加20ul含有活性因子水溶液,滴加完成后在室溫下靜置,使活性因子溶液充分浸漬到干燥的微球上,獲得載有活性因子的明膠微球;
制備抗菌支架步驟,向成分為醋酸或丙二酸的溶劑中加入膠原、殼聚糖和絲素蛋白中的至少一種以及納米銀粒子,制得混合溶液,優選地,所加入的膠原、殼聚糖和絲素蛋白的總質量百分比濃度為0.01?1%,納米銀粒子質量百分比濃度為40?100ppm,此外,還可根據需要選擇性地加入質量百分比濃度為0.05?2.5%透明質酸和濃度為5mg/ml?40 mg/ml硫酸軟骨素兩者中的至少一種,然后,將實心明膠微球平鋪在模具中,用蒸汽熏蒸10?30min,再按照實心明膠微球與膠原、殼聚糖和絲素蛋白三者用量總和的質量比為:3?5:1的比例將混合溶液注入模具中,并迅速把模具放入超低溫冰箱里冷凍24?48h,再冷凍干燥得到抗菌支架;
交聯步驟,可以采用化學交聯工藝或者化學交聯和高溫交聯的組合進行處理,化學交聯工藝具體如下:以戊二醛、京尼平、碳化二亞胺中的一種或多種溶于水中配制出質量百分比濃度為0.1?1%的交聯劑溶液,把制備好的抗菌支架浸漬在交聯劑溶液中進行室溫交聯8?24h,然后依次用生理鹽水和蒸餾水浸泡清洗除去殘留的交聯劑,清洗后的抗菌支架再依次經過零下20?80℃的冷凍處理和零下40?60℃條件下的冷凍干燥。高溫交聯工藝具體如下:將抗菌支架放置在真空干燥箱中,在真空條件下,溫度為105℃,高溫交聯24小時后恢復至室溫。本步驟主要目的是使明膠與膠原形成相互貫穿的網絡結構,得到具有良好力學性能的抗菌支架,獲得力學性能良好的抗菌支架,對于在力學性能方面沒有很高要求的支架產品也可以不進行本步驟;以及
制備抗菌生物活性支架步驟,將載有活性因子的明膠微球置于生理鹽水中配制成懸浮液,優選地,按照0.5?2mg載有活性因子的明膠微球置于0.2?1ml生理鹽水的比例配制成懸浮液,然后將懸浮液注入抗菌支架中,具體可采用注射器將懸浮液注入抗菌支架,室溫干燥后得到抗菌生物活性支架。
其中,本發明制備明膠微球步驟的具體操作如下:將明膠加入蒸餾水中,在40?50℃恒溫水浴中溶解1h,配制質量百分比為2?40%的明膠溶液,同時取200?400ml油放在40?50℃恒溫水浴中,所述的油優選植物油或者硅油;然后在200?500 rp/min轉速下把明膠溶液滴入到油中,攪拌約10min即可形成均勻的混合乳液,再把混合乳液從恒溫水浴的溫度階梯式逐漸降溫到0℃,每降10℃恒溫15min,再加入80?200ml 4℃的丙酮,轉速250?800rp/min下繼續攪拌1h,用丙酮清洗后3000?4000rp/min離心收集,最后用1,4?環氧乙烷浸泡2天,一天換三次溶劑,再用去離子水洗滌后,冷凍干燥2天,最后用篩子篩選粒徑為80?400μm的實心明膠微球。
本發明制備多孔明膠微球步驟的具體操作如下:將實心明膠微球浸漬在質量百分比濃度為0.1?2%的戊二醛和吐溫80的混合溶液中,在25℃? 0℃的溫度條件下交聯8?24h,混合溶液中,吐溫80的質量百分比濃度為0.05?2%,然后置入含有質量百分比濃度為0.05?2%的甘氨酸的和質量百分比濃度為0.05?2%的吐溫80的混合溶液中,在37℃的條件下靜置15~30分鐘后取出明膠微球,再用質量百分比0.1%吐溫80溶液于4000 rpm/min離心處理5分鐘,然后在4℃下洗滌后冷凍干燥,獲得多孔明膠微球。
應當理解,制備明膠微球及對明膠微球進行多孔化處理而獲得多孔明膠微球方面已有相當成熟的技術,本發明可采用現有各種技術來獲得多孔明膠微球。
本發明的支架中含有納米銀粒子,可使支架具有良好的抗菌性;而加載有活性生長因子,而可使制得的支架具有充分的生物活性,能有效促進新生組織的血管化;而采用多孔明膠微球,更有利于載生物因子;明膠及膠原等天然高分子通過交聯劑處理后,力學性能得到提高,同時明膠微球再清洗過程中不可能完全清洗干凈,有部分殘留,在交聯過程中與膠原等天然高分子形成網絡貫穿的結構,這樣更能提高力學性能。由于明膠無毒,生物相容性好,它的殘留更有利于細胞的粘附及增值。4)硫酸軟骨素和透明質酸作為輔助性的添加物,根據需要而加入到混合溶液中,由于他們都是細胞外基質的必要成分,也是細胞的營養成分,這樣更加模擬了細胞的生長環境。
下面通過幾個具體實施例來詳細說明本發明制備方法的具體過程。
實施例1
1、明膠微球的制備
取兩份質量的明膠,加入八份質量的蒸餾水,配制成質量百分比濃度為20%的明膠,在42℃恒溫水浴中溶解1h,同時取300ml大豆油放在42℃的水浴中,然后在450 rp/min轉速下把明膠溶液滴入到油中,攪拌10min形成水/油乳液,再把混合乳液從42℃逐漸降溫到0℃,每降10℃恒溫15min,再加入200ml、4℃的丙酮,轉速調到600rp/min,繼續攪拌1h,用丙酮清洗在3200rp/min離心收集,最后用1,4?環氧乙烷浸泡2天,一天換三次溶劑,再用去離子水洗滌后,然后冷凍干燥2天,最后用篩子篩選粒徑為80?400μm的明膠微球。
2、多孔明膠微球的制備
把制備好的明膠微球浸漬在溶質的總質量百分比濃度為1%的戊二醛/吐溫80的混合溶液中,其中吐溫80的質量百分比為0.1%,交聯溫度為4℃,交聯時間為12h。然后加入一定量的甘氨酸/吐溫80混合溶液,甘氨酸的質量百分比為1%,其中吐溫80的質量百分比為0.1%。在37℃的條件下靜置一段時間,用質量百分比0.1%吐溫80溶液于4000 rpm/min,離心5分鐘,在4℃下洗滌兩次,并冷凍干燥。
3、加載堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)
滴加20ul濃度為100ug/uL,含有bFGF的水溶液到2mg凍干的明膠微球上,然后在室溫下靜置30min,讓因子溶液充分浸漬到干燥的微球上,獲得活性因子溶液浸漬明膠微球。
4、抗菌膠原/透明質酸支架的制備
用醋酸配制濃度為0.6%的膠原溶液,然后配制濃度為0.1%透明質酸溶液,混合兩種溶液,使混合液的粘度系數在2500cp,并加入濃度為40?100ppm納米銀粒子。取一定量的實心明膠微球平鋪在模具中,用蒸汽熏蒸30min后將配制好的混合溶液注入模具中,按照明膠與膠原的質量比為4.5:1的比例注入混合溶液,然后迅速把模具放入超低溫冰箱里冷凍24h,然后冷凍干燥,得到抗菌支架。
5、交聯處理
配制交聯劑的濃度為1%的戊二醛溶液,把制備好的抗菌支架浸漬在交聯劑溶液中進行室溫交聯12h,然后再生理鹽水中浸泡24小時,不斷清洗,最后用蒸餾水進行清洗24小時,不斷換水;除去樣品中殘留的交聯劑。再進行清洗完樣品后在零下20?80℃冷凍2小時,然后在零下40?60℃條件下冷凍干燥得具有良好力學性能的抗菌支架。
6、載bFGF生長因子抗菌膠原生物活性支架的制備
把0.5mg載bFGF的明膠微球置于1ml的生理鹽水中,配制載因子明膠微球的懸浮液,然后用2ml注射器把懸浮液注入到抗菌支架中,然后室溫干燥24h。
實施例2
1、明膠微球的制備
取四份質量的明膠,加入六份質量的蒸餾水,配制成質量百分比為40%的明膠溶液,在50℃恒溫水浴中溶解1h,同時取300ml硅油放在50℃的水浴中,然后在450 rp/min轉速下把明膠溶液滴入到油中,攪拌10min形成水/油乳液,再把混合乳液從50℃逐漸降溫至0℃,每降10℃恒溫15min,再加入200ml、4℃的丙酮,轉速調到600rp/min,繼續攪拌1h,用丙酮清洗在3200rp/min離心收集,最后用1,4?環氧乙烷浸泡2天,一天換三次溶劑;再用去離子水洗滌后,然后冷凍干燥2天,最后用篩子篩選粒徑為80?400μm的明膠微球。
2、加載血管內皮細胞生長因子(VEGF)
滴加20ul濃度為50ug/uL含有VEGF的水溶液到2mg凍干的明膠微球上,然后在室溫下靜置30min,讓因子溶液充分浸漬到干燥的微球上,最終可獲得活性因子溶液浸漬明膠微球。
3、抗菌膠原/透明質酸/硫酸軟骨素支架的制備
用醋酸配制濃度為0.8%的膠原溶液,配制濃度0.1%為透明質酸溶液,同時配制濃度為5mg/ml的硫酸軟骨素溶液,混合三種溶液使混合液的粘度系數在2000cp,并加入濃度為40?100ppm納米銀粒子;將一定量的實心明膠微球平鋪在模具中,然后用蒸汽熏蒸30min,然后將配制好的混合溶液注入模具中,按照明膠與膠原的質量比為4:1的比例注入混合溶液,迅速把模具放入超低溫冰箱里冷凍24h,然后冷凍干燥得到抗菌支架。
4、交聯處理
把制備的支架放置在真空干燥箱中,在真空條件下,溫度為105℃,高溫交聯24小時;然后配制交聯劑的濃度為0.5%的京尼平溶液,把制備好的支架材料浸漬在交聯劑溶液中進行室溫化學交聯12h,然后再生理鹽水中浸泡24小時,不斷清洗,最后用蒸餾水進行清洗24小時,不斷換水;除去樣品中殘留的交聯劑。再進行清洗完樣品后在零下20?80℃冷凍2小時,然后在零下40?60℃條件下冷凍干燥得抗菌生物活性支架。
5、載VEGF生長因子抗菌膠原生物活性支架的制備
把1mg載VEGF的明膠微球置于1ml的生理鹽水中,配制載因子明膠微球的懸浮液,然后用2ml注射器把懸浮液注入到抗菌支架中,然后室溫干燥24h。
實施例3
制備明膠微球及多孔明膠微球的具體實施步驟同實施例1中的步驟。其他步驟如下:
1、加載轉化生長因子(TGFβ)
滴加20ul濃度為50ug/uL含有TGFβ的水溶液到2mg凍干的明膠微球上,然后在室溫下靜置30min,讓因子溶液充分浸漬到干燥的微球上,獲得活性因子溶液浸漬明膠微球。
2、抗菌絲素蛋白復合硫酸軟骨素支架的制備
用醋酸配制濃度為1%的絲素蛋白溶液,同時配制濃度為5mg/ml的硫酸軟骨素溶液,混合三種溶液使混合液的粘度系數在2500cp,并加入濃度為40?100ppm納米銀粒子。將一定量的實心明膠微球平鋪在模具中,然后用蒸汽熏蒸30min,然后將配制好的混合溶液注入模具中,迅速把模具放入超低溫冰箱里冷凍24h,然后冷凍干燥,其中明膠與絲素蛋白質量比為5:1。
3、交聯處理
把制備的支架放置在真空干燥箱中,在真空條件下,溫度為105℃,高溫交聯24小時;然后配制交聯劑的濃度為1%的戊二醛溶液,把制備好的支架材料浸漬在交聯劑溶液中進行室溫化學交聯12h,然后再生理鹽水中浸泡24小時,不斷清洗,最后用蒸餾水進行清洗24小時,不斷換水;除去樣品中殘留的交聯劑。再進行清洗完樣品后在零下20?80℃冷凍2小時,然后在零下40?60℃條件下冷凍干燥得抗菌生物活性支架。
4、載血轉化生長因子(TGFβ)生長因子抗菌膠原生物活性支架的制備
把1mg載TGFβ因子的明膠微球置于0.5ml的生理鹽水中,配制載因子明膠微球的懸浮液,然后用2ml注射器把懸浮液注入到抗菌支架中,然后室溫干燥24h。
實施例4
制備明膠微球及多孔明膠微球的具體實施步驟同實施例1中的步驟。其他步驟如下:
1、加載血小板衍生因子(PDGF)和轉化生長因子(TGFβ)
滴加20ul濃度為50ug/uL含有PDGF和TGFβ(PDGF:TGFβ=1:1)的水溶液到2mg凍干的明膠微球上,然后在室溫下靜置30min,讓因子溶液充分浸漬到干燥的微球上,獲得活性因子溶液浸漬明膠微球。
2、抗菌膠原?殼聚糖復合硫酸軟骨素支架的制備
用丙二酸配制濃度為0.8%的膠原溶液和濃度為2%的殼聚糖溶液,同時配制濃度為5mg/ml的硫酸軟骨素溶液,混合三種溶液使混合液的粘度系數在2000cp,并加入濃度為40?100ppm納米銀粒子;將一定量的實心明膠微球平鋪在模具中,然后用蒸汽熏蒸30min,然后按照明膠與膠原?殼聚糖的質量比為4.5:1的比例將配制好的混合溶液注入模具中,迅速把模具放入超低溫冰箱里冷凍24h,然后冷凍干燥得到抗菌支架。
3、交聯處理
配制交聯劑的濃度為1%的戊二醛溶液,把制備好的支架材料浸漬在交聯劑溶液中進行室溫化學交聯12h,然后再生理鹽水中浸泡24小時,不斷清洗,最后用蒸餾水進行清洗24小時,不斷換水,以除去樣品中殘留的交聯劑;樣品清洗完后在零下20?80℃冷凍2小時,然后在零下40?60℃條件下冷凍干燥。然后再將冷凍干燥后的抗菌支架放置在真空干燥箱中,在真空條件下,溫度為105℃,高溫交聯24小時后恢復至室溫,即得到具有良好力學性能的抗菌支架。
4、載血小板衍生因子(PDGF)和轉化生長因子(TGFβ)生長因子抗菌膠原生物活性支架的制備
把2mg載PDGF 和TGFβ的明膠微球置于0.2ml的生理鹽水中配制懸浮液,然后用2ml注射器把懸浮液注入到抗菌支架中,然后室溫干燥24h。
盡管已經示出和描述了本發明的實施例,對于本領域的普通技術人員而言,可以理解在不脫離本發明的原理和精神的情況下可以對這些實施例進行多種變化、修改、替換和變型,本發明的范圍由所附權利要求及其等同范圍限定。

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抗菌 生物 活性 支架 及其 制備 方法
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