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一種癌細胞靶向性結構分子及其應用.pdf

摘要
申請專利號:

CN201310069367.4

申請日:

2013.03.05

公開號:

CN103232531B

公開日:

2015.01.07

當前法律狀態:

授權

有效性:

有權

法律詳情: 授權|||實質審查的生效IPC(主分類):C07K 7/64申請日:20130305|||公開
IPC分類號: C07K7/64; A61K47/48; A61K48/00; A61P35/00 主分類號: C07K7/64
申請人: 武漢澤智生物醫藥有限公司; 南方醫科大學珠江醫院
發明人: 季愛民; 裘志勇
地址: 430079 湖北省武漢市東湖新技術開發區高新大道666號
優先權:
專利代理機構: 廣州科粵專利商標代理有限公司 44001 代理人: 劉明星
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法律狀態
申請(專利)號:

CN201310069367.4

授權公告號:

103232531B||||||

法律狀態公告日:

2015.01.07|||2013.09.04|||2013.08.07

法律狀態類型:

授權|||實質審查的生效|||公開

摘要

本發明公開了一種癌細胞靶向性結構分子及其應用。它是將如式(Ⅰ)所示的分子與含有羧基結構和馬來酐亞胺基團的連接分子反應,使氨基和羧基脫水縮合,而得到癌細胞靶向性結構分子。本發明提供的癌細胞靶向性結構分子,能與含巰基(-SH)修飾的核苷酸分子相連,可經血管途徑直接給藥,特異性結合表達整合素家族αvβ3受體的腫瘤細胞,或腫瘤組織內新生血管內皮細胞,通過受體介導內吞有效地穿透細胞膜,將核苷酸分子送入細胞質內。式(Ⅰ),其中n為1~10。

權利要求書

權利要求書
1.   一種癌細胞靶向性結構分子,其特征在于,是將如式(Ⅰ)所示的分子與含有羧基結構和馬來酐亞胺基團的連接分子反應,使氨基和羧基脫水縮合,而得到癌細胞靶向性結構分子

式(Ⅰ)
其中n為1~10。

2.   根據權利要求1所述的癌細胞靶向性結構分子,其特征在于,所述的癌細胞靶向性結構分子,其結構式如式(Ⅱ)所示:

式(Ⅱ)
其中n為1~10。

3.   根據權利要求2所述的癌細胞靶向性結構分子,其特征在于,所述的n為1。

4.   權利要求1、2或3所述的癌細胞靶向性結構分子在制備腫瘤靶向性治療藥物或示蹤劑中的應用。

5.   根據權利要求4所述的應用,其特征在于,是將權利要求1、2或3所述的癌細胞靶向性結構分子的馬來酐亞胺基團與巰基乙醇、巰基丙醇、巰基丁醇、巰基戊醇或巰基己醇的巰基反應形成硫醚鍵,再將巰基乙醇、巰基丙醇、巰基丁醇、巰基戊醇或巰基己醇上的羥基與核苷酸類分子的3’端的核苷酸單元內戊糖2位的磷酸基團反應連接形成的分子用于制備腫瘤靶向性治療藥物或示蹤劑。

說明書

說明書一種癌細胞靶向性結構分子及其應用
技術領域:
本發明屬于生物醫藥技術領域,具體涉及一種癌細胞靶向性結構分子及其應用。
背景技術:
由于小干擾RNA(siRNA)分子可以通過沉默靶mRNA表達而抑制特異性靶蛋白的功能,因而利用siRNAs有望成為多種因基因突變或過表達引起疾病的新治療策略(Davidson BL,McCray PB Jr.Current prospects for RNA interference?based therapies.Nat Rev Genet.2011;12(5):329?40)。然而,缺乏有效的遞送系統限制了siRNA分子進入靶細胞內發揮作用而應用于臨床。最近,進行優化設計和化學修飾,顯著降低了siRNA分子的免疫應答,減少了脫靶效應,增加了對核苷酶的穩定性(D.V.Morrissey,J.A.Lockridge,L.Shaw,K.Blanchard,K.Jensen,W.Breen,K.Hartsough,L.Machemer,S.Radka,V.Jadhav,N.Vaish,S.Zinnen,C.Vargeese,K.Bowman,C.S.Shaffer,L.B.Jeffs,A.Judge,I.MacLachlan,B.Polisky,Potent and persistent in vivo anti?HBV activity of chemically modified siRNAs,Nat.Biotechnol.2005;23:1002–1007.)。一些化學修飾的siRNAs已經進入I?II期臨床試驗的研究,臨床適應癥為粘膜組織、眼部、呼吸道病毒(RSV)感染和腎性疾病(P.K.Kaiser,R.C.A.Symons,S.M.Shah,E.J.Quinlan,H.Tabandeh,D.V.Do,G.Reisen,J.A.Lockridge,B.Short,R.Guerciolini,Q.D.Nguyen,RNAi?based treatment for neo?vascular age?related macular degeneration by Sirna?027,Am.J.Ophthalmol.2010;150:33–39;M.E.Kleinman,K.Yamada,A.Takeda,V.Chandrasekaran,M.Nozaki,J.Z.Baf fi,R.J.C.Albuquerque,S.Yamasaki,M.Itaya,Y.Z.Pan,B.Appukuttan,D.Gibbs,Z.L.Yang,K.Kariko,B.K.Ambati,T.A.Wilgus,L.A.DiPietro,E.Sakurai,K.Zhang,J.R.Smith,E.W.Taylor,J.Ambati,Sequence?and target?independent angiogenesis suppression by siRNA via TLR3,Nature2008;452:591?5U1;J.DeVincenzo,R.Lambkin?Williams,T.Wilkinson,J.Cehelsky,S.Nochur,E.Walsh,R.Meyers,J.Gollob,A.Vaishnaw,A randomi zed,double?blind,placebo?controlled study of an RNAi?based therapy directed against respiratory syncytial virus,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.2010;107:8800–8805;M.R.Zamora,M.Budev,M.Rolfe,J.Gottlieb,A.Humar,J.DeVincenzo,A.Vaishnaw,J.Cehelsky,G.Albert,S.Nochur,J.A.Gollob,A.R.Glanville,RNA interference therapy in lung transplant patients infected with respiratory syncytial virus,Am.J.Respir.Crit.Care Med2011;183:531–538)。初步的臨床試驗結果表明,基于RNAi技術的藥物有可能成為一種新的治療方案,廣泛用于臨床治療因基因突變或過表達引起的疾病。
新生血管在腫瘤的生長和增殖中起著至關重要的作用(Folkman J.Tumor angiogenesis:therapeutic implications.N Engl J Med1971;285:1182–6.)。而整合素αvβ3受體在血管生成和腫瘤細胞轉移中有主要作用,目前被認為是治療腫瘤的一個有效靶點。含Arg?Gly?Asp(RGD)模體的結構分子對高表達整合素受體的新生血管內皮細胞有高的親和力(Ruoslahti E.RGD and other recognition sequences for integrins.Annu Rev Cell Dev.1996;12:697?715)。RGD肽和腫瘤相關的整合素αvβ3受體之間的高親和力作用使得RGD肽做為配體在整合素靶點藥物開發和siRNA遞送中得到了廣泛的應用(Han HD,Mangala LS,Lee JW,Shahzad MM,Kim HS,Shen D,Nam EJ,Mora EM,Stone RL,Lu C,Lee SJ,Roh JW,Nick AM,Lopez?Berestein G,Sood AK.Targeted gene silencing using RGD?labeled chitosan nanoparticles.Clin Cancer Res.2010;16(15):3910?22;Yonenaga N,Kenjo E,Asai T,Tsuruta A,Shimizu K,Dewa T,Nango M,Oku N.RGD?based active targeting of novel polycation liposomes bearing siRNA for cancer treatment.J Control Release.2011Oct13)。
在腫瘤的治療中,血管內皮細胞生長因子受體2(VEGFR2、也被稱為KDR、FLK1)是備受關注的治療靶點。目前化學合成的多種小分子VEGFR2抑制劑已被應用于臨床試驗中(Hurwitz H,Fehrenbacher L,Novotny W,Cartwright T,Hainsworth J,Heim W,et al.Bevacizumab plus irinotecan,fluorouracil,and leucovorin for metastatic colorectal cancer.N Engl J Med2004;350(23):2335–42;Sandler A,Gray R,Perry MC,Brahmer J,Schiller JH,Dowlati A,et al.Paclitaxel?carboplatin alone or with bevacizumab for non?small?cell lung cancer.N Engl J Med2006;355(24):2542–50)。VEGFR2是一種酪氨酸激酶受體,包括三個部分:胞外結構域,跨膜結構域和胞質內酪氨酸激酶結構域。VEGFR2結合VEGF后激活下游多條信號傳導途徑:促分裂原活化蛋白激酶(MAPKs)、磷酸肌醇3?激酶(PI3K)、AKT、磷脂酶Cγ、小GTP酶類等而發揮促血管生成作用(Brown,L.F.,Detmar,M.,Claffey,K.,Nagy,J.A.,Feng,D.,Dvorak,A.M.,Dvorak,H.F.Vascular permeability factor/vascular endothelial growth factor:a multifunctional angiogenic cytokine.EXS1997;79,233?269;Herbert,S.P.,Stainier,D.Y.Molecular control of endothelial cell behaviour during blood vessel morphogenesis.Nat Rev Mol Cell Biol2011;12,551?564),這些激酶在血管的生成中均有著重要作用。因而,設計靶向VEGFR2的小干擾RNA分子并且有效的沉默VEGFR2基因的表達,可阻斷VEGF/VEGFR2通路,有效地抑制腫瘤內新生血管的生成,在腫瘤的治療中有著光明的應用前景。
有效發揮siRNA分子體內療效的瓶頸問題:限制siRNA應用于臨床的關鍵技術是在體內可以有效地穿透細胞膜進入胞漿內發揮作用。研究表明即使在毫摩爾的濃度下,裸siRNA也不能穿透細胞膜進入細胞質(Whitehead,K.A.,Langer,R.&Anderson,D.G.Knocking down barriers:advances in siRNA delivery.Nat.Rev.Drug Discov.2009;8,129–138)。這主要是由siRNA分子的物理化學特性所決定:較大的分子量(~14,000Da)、陰性電荷和親水性,阻止其通過被動擴散穿透多種類型的細胞膜進入細胞質發揮RNAi的作用(Semple SC,Akinc A,Chen J,Sandhu AP,Mui BL et al.Rational design of cationic lipids for siRNA delivery.Nat Biotechnol.2010;28(2):172?176;Behlke,M.A.Chemical modification of siRNAs for in vivo use.Oligonucleotides2008;18,305–320)。目前的解決方法包括:陽離子脂質體及病毒載體囊化包裹、高壓注射以及對siRNA分子的直接修飾(如化學、脂質、類固醇、抗體?魚精蛋白、聚合物等的修飾),然而這些方法還存在制備困難或靶向性差等缺陷。在體內應用siRNA,一個必須考慮的因素就是靶向性,如靶向性給予siRNA分子進入特定的細胞類型,如腫瘤細胞,減少了非特異性細胞的結合和治療所必須的劑量,限制臨床應用的副作用。(McNamara JO 2nd,Andrechek ER,Wang Y,Viles KD,Rempel RE,et al.Cell type–specific delivery of siRNAs with aptamer?siRNA chimeras.Nat Biotechnol.2006;24(8):1005?1015;Eguchi A,Meade BR,Chang YC,Fredrickson CT,Willert K,Puri N,Dowdy SF.Efficient siRNA delivery into primary cells by a peptide transduction domain–dsRNA binding domain fusion protein.Nat Biotechnol.2009;27(6):567?571)。
發明內容:
本發明的第一個目的是提供一種能連接含巰基(?SH)修飾的核苷酸分子,高效、穩定、靶向性進入癌細胞的靶向性結構分子。
本發明的癌細胞靶向性結構分子,其特征在于,是將如式(Ⅰ)所示的分子與含有羧基結構和馬來酐亞胺基團的連接分子反應,使氨基和羧基脫水縮合,而得到癌細胞靶向性結構分子

式(Ⅰ)
其中n為1~10。
所述的癌細胞靶向性結構分子,優選,其結構式如式(Ⅱ)所示:

式(Ⅱ)
其中n為1~10。
進一步優選,所述的n為1。
優選,是將上述的癌細胞靶向性結構分子的馬來酐亞胺基團與巰基乙醇、巰基丙醇、巰基丁醇、巰基戊醇或巰基己醇的巰基反應形成硫醚鍵,再將巰基乙醇HO?CH2?CH2?SH、巰基丙醇HO?CH2?CH2?CH2?SH、巰基丁醇HO?CH2?CH2?CH2?CH2?SH、巰基戊醇HO?CH2?CH2?CH2?CH2?CH2?SH或巰基己醇HO?CH2?CH2?CH2?CH2?CH2?CH2?SH上的羥基與核苷酸類分子的3’端的核苷酸單元內戊糖2位的磷酸基團反應連接形成的分子用于制備腫瘤靶向性治療藥物或示蹤劑。
本發明的癌細胞靶向性結構分子能與含巰基(?SH)(巰基乙基?CH2?CH2?SH、巰基丙基?CH2?CH2?CH2?SH、巰基丁基?CH2?CH2?CH2?CH2?SH、巰基戊基?CH2?CH2?CH2?CH2?CH2?SH或巰基己基?CH2?CH2?CH2?CH2?CH2?CH2?SH修飾)修飾的核苷酸分子,通過巰基和馬來酐亞胺基團反應形成硫醚鍵從而使癌細胞靶向性結構分子能與含巰基修飾的核苷酸分子連接。所述的核苷酸分子包括siRNA和單鏈寡核苷酸分子;單鏈寡核苷酸分子包括反義寡核苷酸、miRNA、以及其他可以和核酸類結構分子結合后起調控功能的核酸類似物。
所述的含RGD模體的寡肽cyclo(?Arg?Gly?Asp?D?Phe?Lys?),該含RGD模體的寡肽cyclo(?Arg?Gly?Asp?D?Phe?Lys?)能特異性結合表達整合素家族αvβ3受體的細胞,如腫瘤細胞,不結合正常組織細胞表面,因此可以特異性結合表達整合素家族αvβ3受體的腫瘤細胞,或腫瘤組織內新生血管內皮細胞,通過受體介導內吞有效地穿透細胞膜,通過將含巰基(?SH)修飾的核苷酸分子與本發明的癌細胞靶向性結構分子相連,從而將核苷酸分子送入細胞質內,在腫瘤診斷、腫瘤治療、及靶向性給藥載體設計方面,可得到廣泛的應用,因此可將本發明的癌細胞靶向性結構分子在制備抗腫瘤藥物中應用。
針對不同的靶標基因設計不同的siRNA,從而沉默靶標基因,本領域技術人員可根據本領域的公知常識將針對不同靶標基因的siRNA連入本發明的癌細胞靶向性結構分子中,用于沉默靶標基因。
因此,本發明的第二個目的是提供上述癌細胞靶向性結構分子在制備治療腫瘤藥物中的應用。
本發明提供的癌細胞靶向性結構分子,能與含巰基(?SH)修飾的核苷酸分子相連,可經血管途徑直接給藥,特異性結合表達整合素家族αvβ3受體的腫瘤細胞,或腫瘤組織內新生血管內皮細胞,通過受體介導內吞有效地穿透細胞膜,將核苷酸分子送入細胞質內。癌細胞靶向性結構分子與含巰基(?SH)修飾的核苷酸分子相連的分子,可抗生物體內核苷酸酶的降解,增加了在生物體內的穩定性;癌細胞靶向性結構分子與含巰基(?SH)修飾的核苷酸分子相連的分子的分子量適中,避免了siRNA分子因分子量小在生物體內被迅速代謝的缺陷,延長了作用時間。癌細胞靶向性結構分子與含巰基(?SH)修飾的核苷酸分子相連的分子細胞轉染效率高。整合素αvβ3為腫瘤新生血管內皮細胞表面特異性表達的受體,其配體RGD小分子肽可靶向性結合到該受體上,并介導整個分子被內吞進表達整合素αvβ3受體的新生血管內皮細胞或腫瘤細胞內,該分子結構不需要穿過血管壁即可到達靶細胞,提高了siRNA分子組織細胞的靶向性和轉染效率。癌細胞靶向性結構分子與含巰基(?SH)修飾的核苷酸分子相連的分子體內副作用小。利用本發明的癌細胞靶向性結構分子與含巰基(?SH)修飾的核苷酸分子相連的分子,避免了使用病毒類和常見陽離子脂等轉染劑的毒副作用。整個分子結構合成簡單、穩定,容易大量制備。該分子結構可較易進入臨床應用。本發明設計的癌細胞靶向性結構分子,RGD已被實驗證明無免疫原性,MPA結構類似于PEG,PEG早已獲得臨床使用批準,整個分子結構從理論上看應無大的副作用,避免了陽離子脂、病毒或納米粒介導siRNA分子轉染用于人體時,必需先獲批所用載體的臨床使用證明及通過相關規定等的煩瑣。
所以,本發明提供的癌細胞靶向性結構分子,可用于經系統途徑給藥,使得其能攜帶核酸類結構分子靶向性進入細胞,發揮核酸類結構分子對基因的調控或沉默功能,可直接進行疾病的治療。
附圖說明:
圖1.是實施例1的癌細胞靶向性結構分子(RGD?PEG?MPA)的合成路線圖,以及將本發明的癌細胞靶向性結構分子與含巰基(?SH)修飾的核苷酸分子相連的合成路線圖;
圖2.是合成的癌細胞靶向性結構分子(RGD?PEG?MPA)的純化和鑒定結果圖。
A?C:由美國Peptide International公司提供的對RGD?PEG?MPA結構進行純化和鑒定的結果圖。
圖3.是凝膠電泳分析RGD?PEG?MPA?siRNA VEGFR2以及RGD?PEG?MPA?siRNA VEGFR2結構鑒定結果圖。
A:合成的RGD?PEG?MPA?ssRNA的電泳圖。Lane1:RGD?PEG?MPA與意義鏈RNA反應后溶液的電泳圖;Lane2:沒有加RGD?PEG?MPA的意義鏈RNA按Lane1相同處理后的溶液的電泳圖;
B:純化并形成雙鏈后的RGD?PEG?MPA?siRNA VEGFR2的聚丙烯酰胺凝膠電泳圖。RNA在20%的聚丙烯酰胺凝膠中的電泳,并用花青染料SYBR Gold染色。
C:未修飾巰基RNA的高相液相圖譜。
D:RGD?PEG?MPA?siRNA VEGFR2的高相液相圖譜。
E:RGD?PEG?MPA?siRNA VEGFR2(小鼠VEGFR2)的質譜分析。
圖4.用激光共聚焦顯微鏡觀察RGD?PEG?MPA?siRNA VEGFR2(Cy5標記的siRNA)細胞的靶向性。
A:MS1;B:HUVEC。
圖5.是流式細胞儀檢測MS1細胞和HUVEC細胞表面αvβ3受體的表達。
A:MS1?實驗組;B:MS1?RGD競爭組;C:HUVEC?實驗組;D:HUVEC?RGD競爭組。
圖6.檢測RGD?PEG?MPA?siRNA VEGFR2細胞毒性。
1,RGD?PEG?MPA?siRNA VEGFR2處理組;2RGD?PEG?MPA?control siRNA處理組;3:Lipofectamine2000/si VEGFR2處理組;4:未加入任何物質的對照組。
圖7.RGD?PEG?MPA?siRNA VEGFR2介導的細胞水平基因沉默.
A:RT?qPCR檢測轉染RGD?PEG?MPA?siRNA VEGFR2后MS1細胞中VEGFR2m RNA的表達水平。1:未處理組;2:Control siRNA處理組;3:lipofectamine2000/siVEGFR2complexes(小鼠)處理組;4:RGD?PEG?MPA?siRNA VEGFR2(小鼠)處理組。
B:RT?qPCR檢測轉染RGD?PEG?MPA?siRNA VEGFR2后HUVEC細胞中VEGFR2m RNA的表達水平。1:未處理組;2:control siRNA處理組;3:lipofectamine2000/siVEGFR2complexes(人)處理組;4:RGD?PEG?MPA?siRNA VEGFR2(人)處理組。
C:Western Blot。1:未處理組;2:control siRNA處理組;3:lipofectamine2000/siVEGFR2complexes(人)處理組;4:RGD?PEG?MPA?siRNA VEGFR2(人)處理組。
D:Western Blot檢測轉染RGD?PEG?MPA?siRNA VEGFR2(人)后HUVEC細胞中VEGFR2蛋白的表達水平。1:未處理組;2:control siRNA處理組;3:lipofectamine2000/siVEGFR2complexes(人)處理組;4:RGD?PEG?MPA?siRNA VEGFR2(人)處理組。
圖8.RGD?PEG?MPA?siRNA VEGFR2分子(斑馬魚)能夠靶向抑制斑馬魚新生血管的發育和生成。
A:ddH2O;B:Control siRNA;C:siRNA VEGFR2(斑馬魚);D:RGD?PEG?MPA?siRNA VEGFR2(斑馬魚)。其中DA:背主動脈;PCV:后主靜脈;ISV:體節間血管;DLAV:背部縱向血管;PAV:脊索旁血管。
圖9.斑馬魚新生血管發育和生成情況(相對熒光強度分析)。
1:ddH2O;2:Control siRNA;3:siRNA VEGFR2(斑馬魚);4:RGD?PEG?MPA?siRNA VEGFR2(斑馬魚)。
圖10.RGD?PEG?MPA?siRNA VEGFR2分子在腫瘤裸鼠內的腫瘤組織靶向性。
A:系統給藥后RGD?PEG?MPA?siRNA VEGFR2?Cy5(小鼠)分子在腫瘤裸鼠內的組織靶向分布;
B:系統給藥后RGD?PEG?MPA?siRNA VEGFR2?Cy5(小鼠)分子在裸鼠組織器官中的分布。
圖11.經尾靜脈給藥后RGD?PEG?MPA?siRNA VEGFR2(小鼠)分子對腫瘤生長的抑制作用。
A:腫瘤生長曲線變化。
B:Luciferase表達量變化(腫瘤體積以及腫瘤細胞活性越強,Luciferase熒光強度越強)。
圖12.經尾靜脈給藥后RGD?PEG?MPA?siRNA VEGFR2介導腫瘤內的基因沉默。
A:RT?qPCR檢測腫瘤組織中VEGFR2mRNA的表達水平。
1:RGD?MPA處理組;2:RGD?PEG?MPA?siRNA VEGFR2處理組;3:Saline處理組。
B:Western Blot。1:RGD?MPA處理組;2:RGD?PEG?MPA?siRNA VEGFR2處理組;3:Saline處理組。
C:量化腫瘤組織中VEGFR2蛋白的表達水平。
1:RGD?MPA處理組;2:RGD?PEG?MPA?siRNA VEGFR2處理組;3:Saline處理組。
圖13:ELISA測定RGD?PEG?MPA?siRNA VEGFR2分子系統給藥后小鼠血清中細胞因子的水平。
A:給藥后24h血清中INF?α和IL?6的水平。
B:治療結束后血清中INF?α和IL?6的水平
具體實施方式:
以下實施例是對本發明的進一步說明,而不是對本發明的限制。
實施例1:
1、合成RGD?PEG?MPA?siRNA VEGFR2分子。
合成路線如圖1所示,具體步驟如下:
1.1、RGD?PEG?MPA(腫瘤靶向性結構分子)
RGD?PEG?MPA的合成步驟如圖1所示,其是由含RGD模體的寡肽cyclo(?Arg?Gly?Asp?D?Phe?Lys?(圖1中的A)的Lys上的氨基與8?氨基?3,6?二氧雜辛酸(圖1中的B,PEG)的羧基脫水縮合,得到RGD?PEG(圖1中的C),然后RGD?PEG的氨基與3?Maleimidopropionic Acid(簡稱MPA,圖1中的D)的羧基脫水縮合,得到RGD?PEG?MPA(圖1中的E,即腫瘤靶向性結構分子)。RGD?PEG?MPA的具體合成委托美國Peptide International公司合成(簽有保密協議)。其鑒定和純化如圖2A?C。
1.2、合成巰基(?SH)修飾的意義鏈RNA
其中siRNA為特異性抑制小鼠或人血管內皮生長因子受體2(VEGFR2,Kdr)基因的siRNA,所述針對小鼠的siRNA對應的靶序列是小鼠血管內皮細胞生長因子受體2(VEGFR2)基因,沉默VEGFR2基因的特異性siRNA(siRNA mVEGFR2,或者siVEGFR2)序列如下:
有義鏈:5'?CGGAGAAGAAUGUGGUUAA dTdT?3'
反義鏈:3'?dTdT GCCUCUUCUUACACCAAUU?5'
小鼠陰性對照siRNA序列:
有義鏈:5’?CGUGAUUGCGAGACUCUGAdTdT?3’
反義鏈:3'?dTdTGCACUAACGCUCUGAGACU?5'
沉默人血管內皮細胞生長因子受體2(VEGFR2)基因的特異性siRNA(siRNA hVEGFR2)序列如下:
有義鏈:5’?GGUAAAGAUUGAUGAAGAAdTdT?3’
反義鏈:3?‘dTdT CCAUUUCUAACUACUUCUU?5’
人陰性對照siRNA序列:
有義鏈:5’?CCUGGAGAAUCAGACGACAAGUAUU?3’
反義鏈:3’?GGACCUCUUAGUCUGCUGUUCAUAA?5’
以本專業公知的方法在siRNA意義鏈3’端的核苷酸單元內戊糖2位的磷酸基團上通過巰基己醇HO?CH2?CH2?CH2?CH2?CH2?CH2?SH修飾巰基己基?CH2?CH2?CH2?CH2?CH2?CH2?SH(圖1中的F)。
由此得到巰基(?SH)修飾的有義鏈RNA。
siRNA分子委托廣州銳博生物科技有限公司合成。
1.3、合成RGD?PEG?MPA?siRNA VEGFR2分子:
步驟1.2的3’?巰基修飾的有義鏈RNA(20nm)同過量的步驟1.1的RGD?PEG?MPA(400nm20eq)溶于1ml0.1M HEPES緩沖溶液中,4℃均勻混合震蕩12小時。經20%聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測,溶液中巰基修飾的有義鏈RNA轉化為RGD?PEG?MPA?ssRNA,其電泳圖如圖3A所示。超濾濃縮后反相色譜純化,凍干后得到白色粉末狀固體RGD?PEG?MPA?ssRNA。
等量反義鏈RNA(50μM)和RGD?PEG?MPA?ssRNA(50μM),溶于退火緩沖液(10mMTris?HCl pH7.4,50mM NaCl,and1mM EDTA),95℃加熱3分鐘,恢復至室溫,經超濾除去過量鹽分,凍干得RGD?PEG?MPA?siRNA VEGFR2(如圖1中的G,RGD?PEG?MPA?siRNA)分子,其電泳圖如圖3B所示。
按照上述方法分別合成針對小鼠血管內皮細胞生長因子受體2(VEGFR2)基因和人血管內皮細胞生長因子受體2(VEGFR2)基因的RGD?PEG?MPA?siRNA VEGFR2分子,即為本實施例的細胞靶向性分子修飾的PLN結構分子。
1.4、RGD?PEG?MPA?siRNA VEGFR2分子結構的鑒定
通過SDS?PAGE方法鑒定純化所得RGD?PEG?MPA?siRNA VEGFR2分子的純度,純度達到99%以上,見圖3B;
通過HPLC色譜法鑒定RGD?PEG?MPA?siRNA VEGFR2分子的。色譜條件:流動相A:0.1M TEA A緩沖液(PH=7.4);流動相;B:100%乙腈;0?30min流動相B0-50%;色譜柱:Agela Venusil ASB C84*250mm;流速1ml/min。如圖3C所示為未修飾巰基RNA,保留時間(RT)=15.133分鐘;圖3D所示為RGD?PEG?MPA?siRNA VEGFR2,保留時間=22.273。
通過MS方法鑒定RGD?PEG?MPA?siRNA VEGFR2分子的結構,從MS結果得到的分子量可以判斷,合成得到的產物同理論設計的RGD?PEG?MPA?siRNA VEGFR2結構一致,計算分子量為7976.4,實測分子量為7977.9,見圖3E。
以下實驗中,針對人臍靜脈內皮細胞(HUVEC)是針對人血管內皮細胞生長因子受體2(VEGFR2)基因的RGD?PEG?MPA?siRNA VEGFR2分子,而針對小鼠胰島血管內皮細胞MS1則是針對小鼠血管內皮細胞生長因子受體2(VEGFR2)基因的RGD?PEG?MPA?siRNAVEGFR2分子。
2、RGD?PEG?MPA?siRNA VEGFR2分子的細胞靶向性
常規方法培養表達αvβ3受體的人臍靜脈內皮細胞(HUVEC)和胰島血管內皮細胞MS1。
實驗組:取上述兩種細胞懸液100μl(1×105個細胞/ml),分別加入LM609(1μl,1mg/ml),孵育30min,PBS離心洗滌后重懸為100μl,加入1μl,0.5mg/ml羊抗小鼠FITC熒光標記物(針對MS1細胞)(MULTISCIENCES,GAM0041)或1μl,1mg/ml羊抗大鼠PE熒光標記物(針對HUVEC細胞)(RD,AAFO02)。4℃孵育1h,離心洗滌后用美國B&D公司FACSVantageSE產流式細胞儀檢測細胞表面αvβ3受體的表達。
RGD競爭組:分別取上述的兩種細胞懸液100μl(1×105個細胞/ml),先加入10倍濃度(1μl,20mg/ml)的RGD?PEG?MPA?siRNA VEGFR2分子,37℃孵育30min。然后每個組再加入LM609(1μl,1mg/ml),孵育30min,PBS離心洗滌后,加入1μl,0.5mg/ml羊抗小鼠FITC熒光標記物(針對MS1細胞)或1μl,1mg/ml羊抗大鼠PE熒光標記物(針對HUVEC細胞)。4℃孵育1h,離心洗滌后用美國B&D公司FACSVantageSE流式細胞儀檢測細胞表面αvβ3受體的表達。
結果顯示,在MS1細胞中,實驗組有3.33%的整合素αvβ3受體,圖5?A,而加入RGD?PEG?MPA?siRNA VEGFR2的RGD競爭組則陽性表達率下降為2.18%,圖5?B;在HUVEC細胞中,實驗組整合素αvβ3受體的表達高達97.98%,圖5?C,而加入RGD?PEG?MPA?siRNA VEGFR2的RGD競爭組則陽性表達率下降為1.29%,圖5?D。結果說明了RGD?PEG?MPA?siRNA VEGFR2分子可以有效地與細胞膜表面的整合素αvβ3受體結合。且在HUVEC細胞膜表面含有豐富的整合素αvβ3受體表達。
常規方法培養表達αvβ3受體的人臍靜脈內皮細胞HUVEC和胰島血管內皮細胞MS1。分別接種2×105個HUVEC或3×105個MS1細胞至共聚焦培養皿中,補加含10%FBS的DMEM至2ml,37℃,5%CO2孵育箱過夜。次日,再分別往其中加入10μl體積、濃度為20μM的RGD?PEG?MPA?siRNA VEGFR2?cy5分子(cy5標記的RGD?PEG?MPA?siRNA VEGFR2分子),然后在培養箱中繼續培養12h,離心洗滌細胞后用DAPI染色,甲醇固定。共聚焦顯微鏡下觀察RGD?PEG?MPA?siRNA VEGFR2?cy5在MS1和HUVEC細胞漿中均勻分布。結果如圖4所示,結果說明了RGD?PEG?MPA?siRNA VEGFR2?cy5可以有效地結合靶細胞,通過受體介導進入胞漿中。
3、CCK?8檢測細胞毒性檢測
在96孔板中常規培養MS1細胞,每孔100μl細胞培養液且含有約6×103個細胞于37℃,5%CO2孵育箱過夜。次日加入1μl,濃度為20μM的RGD?PEG?MPA?siRNA VEGFR2分子;用lipofectamine2000為陽性對照組,轉染相同量的裸siRNA VEGFR2分子。培養一定時間后,向各孔中加入10μl的CCK?8溶液,孵育后用酶標儀(Bio?RAD,USA)測定450nm處的OD值。以未加入任何物質的MS1細胞按照相同處理方法的OD值作為空白對照(Untreated),RGD?PEG?MPA?control siRNA(按照RGD?PEG?MPA?siRNA VEGFR2相同方法處理的,只是siRNA不同,siRNA陰性對照見1.2)處理組為陰性對照組。
結果如圖6所示,從圖6可以看出,與對照組lipofectamine2000/siRNA VEGFR2復合物相比,RGD?PEG?MPA?siRNA VEGFR2細胞毒性低,細胞活力好,而lipofectamine2000/siRNA VEGFR2復合物組細胞毒性較大,細胞的活力較低。
4、RGD?PEG?MPA?siRNA VEGFR2分子的基因沉默效率
4.1RT?qPCR
常規方法培養表達αvβ3受體的人臍靜脈內皮細胞(HUVEC)和小鼠胰島血管內皮細胞MS1。分別接種2×105個HUVEC或3×105個MS1細胞至共聚焦培養皿中,補加含10%FBS的DMEM至2ml,37℃,5%CO2孵育箱過夜。次日,分別往其中加入10μl體積的濃度為20μM的RGD?PEG?MPA?siRNA VEGFR2,培養箱中繼續培養48h。用lipofectamine2000轉染組為陽性對照組,轉染等量的裸siRNA VEGFR2分子。按Trizol(Invitrogen)試劑說明書方案提取細胞總RNA,按TOYOBO公司試劑說明書方案進行RT?PCR反應。
使用針對小鼠VEGFR2cDNA的引物序列為:
mVEGFR2?F:5’?AGAATGCGGGCTCCTGACTA?3’
mVEGFR2?R:5’?CCATGCTCAGTGTCTCTGACA?3’
18s rRNA?F:5’?CCTGGATACCGCAGCTAGGA?3’
18s rRNA?R:5’?GCGGCGCAATACGAATGCCCC?3’
PCR反應條件:95℃5min;95℃15s、60℃15s、72℃32s讀板,40cycles;
融解曲線分析:溫度60℃?95℃。
針對人VEGFR2cDNA的引物序列以及PCR條件為:
hVEGFR2?F:5’?GCCAGTCTTCTAGGCATATCC?3’
hVEGFR2?R:5’?CTCCCCAGGTACTGCTACTT?3’
GAPDH?F:5’?AACGGATTTGGTCGTATTGG?3’
GAPDH?R:5’?GATCTCGCTCCTGGAAGATG?3’
PCR反應條件:95℃10min;95℃30s、95℃5s、60℃30s讀板,40cycles;
融解曲線分析:溫度60℃?95℃。
定量PCR用的SYBR Green PCR Master Mix,購自TOYOBO公司
定量PCR儀:7500Sequence Detection System。
結果顯示:RGD?PEG?MPA?siRNA VEGFR2分子處理組基因沉默為67%,而陽性對照組脂質體lipo2000基因沉默效率約為80%,如圖7?A。沉默效率較低的原因可能與MS1細胞膜表達αvβ3受體數量低有關。在HUVEC細胞中轉染RGD?PEG?MPA?siRNA VEGFR2(靶向人siRNA)后,靶基因沉默效率為80%,如圖7?B。因為RGD?PEG?MPA?siRNA VEGFR2進入細胞質發揮作用是通過細胞膜表面的αvβ3受體介導的,αvβ3的受體表達量較低直接影響RGD?PEG?MPA?siRNA VEGFR2進入細胞質的量,決定了基因沉默效率的高低。
4.2Western Blot
4.2.1提取HUVEC細胞總蛋白:
4.2.2測定蛋白含量(BCA法)
4.2.3Western Blot
制備SDS?PAGE凝膠(10%分離膠,5%積層膠)。采用半干法轉膜,調電壓至15V,轉膜4.5h。4℃5%脫脂牛奶封閉過夜,加一抗(CST,1:500倍,4℃過夜),二抗(Abmart,1:5000,37℃搖床中孵育1h),顯影(ECL法)。
結果顯示:對膠片中各組VEGFR2和GAPDH條帶進行灰度掃描,以VEGFR2和GAPDH的灰度比值作為各組VEGFR2蛋白的相對表達量。將空白轉染組的VEGFR2蛋白的相對表達量設為100。RGD?PEG?MPA?siRNA VEGFR2組和lipofectamine2000/siVEGFR2組VEGFR2蛋白下調約75%。證明了RGD?PEG?MPA?siRNA VEGFR2和lipofectamine2000/siVEGFR2一樣可以有效地介導基因沉默和蛋白質表達水平的下調,如圖7C、7D。
5、RGD?PEG?MPA?siRNA VEGFR2(斑馬魚)分子抑制斑馬魚體內血管生成和發育
沉默斑馬魚血管內皮細胞生長因子受體2(VEGFR2)基因的特異性siRNA(siRNA hVEGFR2)序列如下:
有義鏈:5'?CUGAAAACAAUGUUGUGAA dTdT?3'
反義鏈:3'?dTdTGACUUUUGUUACAACACUU?5
按照上述方法制備RGD?PEG?MPA?siRNA VEGFR2(斑馬魚)
由南方醫科大學生命科學研究院斑馬魚平臺提供綠色熒光蛋白標記血管的轉基因(Flk1:GFP)斑馬魚。根據Wester field方法養殖:照明14h/黑暗10h交替進行,雌雄分開喂養,定時給予飼料。將其與去色素(Albino)斑馬魚交配,以免黑色素的形成而方便觀察。取卵前一天,雌雄以1:1的比例放入交配缸內,次日晨取胚胎。
受精卵發育到4.3小時,在體式顯微鏡下挑選發育正常的胚胎,移入6孔板中,每孔20枚卵。實驗分為四個組:ddH2O,siRNA VEGFR2,siRNA control和RGD?PEG?MPA?siRNA VEGFR2(斑馬魚)組。通過顯微注射給予不同的藥物(約為2nl)。置于28.5攝氏度培養箱內繼續培養。每天換水兩次,剔除死卵,并計數。在受精卵發育到72小時,存活的胚胎已孵出仔魚,通過共聚焦顯微鏡觀察斑馬魚血管發育情況。
用激光掃描共聚焦顯微鏡檢測斑馬魚血管生成情況。將72hpf的斑馬魚仔魚先用麻醉劑MS?222(0.02%)麻醉,用鑷子嚴格將魚按側面朝上的位置撥正,再包埋到1.2%低熔點膠中。待膠冷卻后,加入含有0.02%的MS?222的Hank’s溶液,以防拍攝過程中魚自發運動。采用蔡司(Zeiss)公司的LSM510META激光共聚焦顯微進行拍攝。拍攝時,首先使用5倍空氣鏡,尋找視野;之后,使用20倍水鏡,波長為488nm的單光子,按照激光強度最佳為原則,行X,Y,Z三個方向的逐層掃描,拍攝目的血管的連續圖像(圖8),拍攝的層間距為3μm,拍攝斑馬魚8至12體節血管。每組取幼魚3條觀察統計。
采用強度為20%的激光掃描,其余方法同前。以Adobe Photoshop7.0軟件記錄多層掃描投射熒光集合(Z?stack Projection)。以灰度平均值記為熒光亮度,結果以各組熒光亮度與對照組之比進行統計分析
結果顯示:通過激光掃描共聚焦顯微鏡觀測了RGD?PEG?MPA?siRNA VEGFR2分子對斑馬魚軀干部血管的影響。選擇觀察這一區域,是因為相比頭面部血管,軀干部血管比較簡單和規則,對這些血管的研究也比較透徹(圖8?A)。顯微注射RGD?PEG?MPA?siRNA VEGFR2分子處理組,軀干部的主要血管都受到廣泛的影響(圖8?D),表現為PAV以及ISV血管的特異性消失以及斑馬魚發育畸形。而control siRNA處理組和siRNA VEGFR2處理組均無明顯的變化(圖8?B和8?C)。通常PAV血管以及ISV血管在受精后36小時左右形成。本實驗中,我們選擇受精后72h的斑馬魚觀測,避免了該血管延遲生長的可能性。與其他實驗組相比,我們觀測到受精后72h,RGD?PEG?MPA?siRNA VEGFR2分子處理組的斑馬魚PAV血管部分或者完全喪失,如圖8?D示。同時對熒光強度的統計也有類似的結果,圖9。因此,我們推測RGD?PEG?MPA?siRNA VEGFR2分子可以特異性地抑制了PAV和ISV血管的生成。
6、RGD?PEG?MPA?siRNA VEGFR2在腫瘤裸鼠體內的靶向性
6.1建立小鼠腫瘤模型。培養腫瘤細胞系表達熒光素酶luc+的非小細胞肺癌A549細胞,收集指數生長期細胞,用PBS重懸細胞后經裸鼠皮下接種,建立非小細胞肺癌移植小鼠瘤模型。
6.2RGD?PEG?MPA?siRNA VEGFR2?Cy5分子(針對小鼠胰島血管內皮細胞MS1的)在裸鼠體內的分布以及藥物代謝動力學研究。經肺癌移植瘤裸鼠尾靜脈給予1nmRGD?PEG?MPA?siRNA VEGFR2?Cy5分子(溶解于150μl的生理鹽水中),采用吸入麻醉劑麻醉裸鼠,經腹腔內給予腫瘤裸鼠150mg/kg的luciferin?D,觀察腫瘤的存在部位以及腫瘤生長狀況。然后在不同時間點(10min、0.5h、1h)采用IVIS Spectrum Imaging System將動物成像,觀察Cy5標記的RGD?PEG?MPA?siRNA VEGFR2?Cy5分子在體內分布情況。24小時后,處死裸鼠,并取出各個臟器(心臟、脾臟、腎臟、肺、肝臟、肌肉以及腦),在活體成像儀下觀察RGD?PEG?MPA?siRNA VEGFR2?Cy5分子在體內組織器官中的分布情況。
結果顯示:經小鼠尾靜脈給予RGD?PEG?MPA?siRNA VEGFR2?Cy5分子后,RGD?PEG?MPA?siRNA VEGFR2?Cy5分子可特異性靶向腫瘤部位,見圖10?A和10?B。在腎臟和肝臟組織中也有分布,這與RGD?PEG?MPA?siRNA VEGFR2?Cy5分子本身在體內的代謝過程特性有關;在心臟、腦、肺、肌肉中未見標記的RGD?PEG?MPA?siRNA VEGFR2?Cy5分子分布。
7、RGD?PEG?MPA?siRNA VEGFR2經尾靜脈后抑制腫瘤的生長
7.1實驗分組以及給藥。同6.1建立小鼠腫瘤模型,實驗分為3組,RGD?PEG?MPA?siRNA VEGFR2組8只(每三天給藥(RGD?PEG?MPA?siRNA VEGFR2分子)一次,每次給藥劑量為2nm,溶解于150μl的生理鹽水),RGD?MPA組5只(每三天給藥(RGD?MPA分子,2mg/ml)一次,每次給藥劑量為150μl),untreated組5只(每三天給予生理鹽水一次,每次給藥劑量為150μl)。
7.2測量腫瘤體積以及荷瘤鼠體重變化。待腫瘤生長到可觸摸時用游標卡尺定期測量腫瘤體積,當體積長到約為50mm3時開始給藥。每3天給藥一次,一共6次。定期測量荷瘤鼠體重和腫瘤體積,體積計算公式:V=ab2×0.5(a為長直徑,b為短直徑)。
結果顯示:從NSCLC移植物裸鼠模型治療結果來看,如圖11,RGD?PEG?MPA?siRNA VEGFR2(圖11中的RGD?MPA?siRNA)組經尾靜脈給藥后,接種的腫瘤體積顯著減小,證明了RGD?PEG?MPA?siRNA VEGFR2分子可以顯著抑制腫瘤的生長,各組動物腫瘤體積減少程度的結果見表1。
表1:不同給藥組的腫瘤體積(Mean±SD)

**vs.untreated group,P<0.001
8.RGD?PEG?MPA?siRNA VEGFR2分子經尾靜脈給藥后介導的腫瘤內的基因沉默
8.1RT?qPCR
最后一次給藥后48小時,處死各給藥組(saline,RGD?MPA,RGD?PEG?MPA?siRNAVEGFR2組)裸鼠,獲得腫瘤組織后提取組織總RNA,經紫外分光光度計測定OD值檢測符合RNA質量要求后進行RT?qPCR實驗。
結果顯示:RGD?PEG?MPA?siRNA VEGFR2(圖12中的RGD?MPA?si VEGFR2)可以有效地介導腫瘤內的VEGFR2mRNA表達量下調,如圖12A所示。
8.2Western Blot
最后一次給藥兩天后,處死各給藥組(saline,RGD?MPA,RGD?PEG?MPA?siRNA VEGFR2(圖12中的RGD?MPA?si VEGFR2)組)裸鼠,獲得腫瘤組織后提取組織總蛋白,經Western Blot和ECL發光顯影得到如圖12?B、C所示結果。
結果顯示:RGD?PEG?MPA?siRNA VEGFR2可以有效地介導腫瘤內的VEGFR2蛋白表達量下調,如圖12B、C所示。
9ELISA測定血清中細胞因子的水平
取9只4?6周齡體重約為20g的BALB/c nu/nu,分別給予生理鹽水(n=3);RGD(~0.045mg/kg;n=3);RGD?PEG?MPA?siVEGFR2(~0.71mg/kg(1nmol);n=3)分別經尾靜脈給藥,24小時后,取血,靜置后3000轉15min離心取血清,用ELISA測定血清中INF?α和IL?6的水平。腫瘤裸鼠最后給予藥物后48小時,處死小鼠并取血,靜置后3000轉15min離心取血清,用ELISA測定血清中INF?α和IL?6的水平。
結果顯示:給予藥物24小時后,RGD?PEG?MPA?siRNA VEGFR2(圖13中的RGD?MPA?siRNA)組與RGD?MPA以及saline組血清中細胞因子INF?α和IL?6的水平相比無顯著性差異,說明RGD?PEG?MPA?siRNA VEGFR2無免疫刺激性,證明了RGD?PEG?MPA?siRNA VEGFR2體內應用的安全性,如圖13A所示。最后一次給藥后48小時,RGD?MPA組血清中INF?α和IL?6的水平,與正常裸鼠對照組相比無差異,說明RGD?MPA長期給藥也不會引起免疫刺激。而saline組血清中INF?α和IL?6兩個細胞因子含量較高,預測可能腫瘤發展后期引起自身的免疫應答。RGD?PEG?MPA?siRNA VEGFR2給藥組血清中INF?α和IL?6含量與前兩組之間相比有差異,可能是由于長期給藥后刺激免疫系統進一步抑制腫瘤的生長有關,如圖13B所示。
實施例中的各圖中的RGD?MPA?siRNA、RGD?MPA?siRNA VEGFR2均為RGD?PEG?MP A?siRNA VEGFR2組。

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