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一種板栗菌根菌人工培養方法.pdf

摘要
申請專利號:

CN201310172589.9

申請日:

2013.05.10

公開號:

CN103250564B

公開日:

2015.01.07

當前法律狀態:

終止

有效性:

無權

法律詳情: 未繳年費專利權終止IPC(主分類):A01G 1/04申請日:20130510授權公告日:20150107終止日期:20150510|||授權|||實質審查的生效IPC(主分類):A01G 1/04申請日:20130510|||公開
IPC分類號: A01G1/04 主分類號: A01G1/04
申請人: 西北農林科技大學
發明人: 季志平; 呂平會; 何佳林; 杜雙田; 劉建軍; 康永祥; 康博文
地址: 712100 陜西省西安市楊凌區邰誠路3號
優先權:
專利代理機構: 西安通大專利代理有限責任公司 61200 代理人: 蔡和平
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法律狀態
申請(專利)號:

CN201310172589.9

授權公告號:

|||103250564B||||||

法律狀態公告日:

2016.06.29|||2015.01.07|||2013.09.18|||2013.08.21

法律狀態類型:

專利權的終止|||授權|||實質審查的生效|||公開

摘要

本發明公開了一種板栗菌根菌人工培養方法,屬于菌根菌人工培養領域。包括以下步驟:1)取板栗菌根菌子實體,縱切為兩半,采集菌蓋與菌柄的交匯處,得到菌肉組織塊;2)將菌肉組織塊置于斜面培養基中,在25~28℃下培養至菌肉組織塊萌發出菌絲后,將菌絲轉管后,在25~28℃下培養至菌絲長滿斜面,獲得純菌絲;3)將純菌絲接種到擴大培養料的接種孔中,在25~28℃下培養至菌絲長滿培養容器,獲得板栗菌根菌。本發明板栗菌根菌的人工培養方法,操作簡單,利用本發明培養得到的菌種回接板栗幼苗,菌根浸染率最高可達50.3%,平均浸染率為46.5%。

權利要求書

權利要求書
1.   一種板栗菌根菌人工培養方法,其特征在于,包括以下步驟:
1)組織分離
取板栗菌根菌子實體,縱切為兩半,采集菌蓋與菌柄交匯處的菌肉組織塊;
2)菌絲培養與提純
將采集的菌肉組織塊置于斜面培養基中,在25~28℃下培養至菌肉組織塊萌發出菌絲后,將菌絲轉接至斜面培養基中,在25~28℃下培養至菌絲長滿斜面,獲得純菌絲;
所述的斜面培養基的制作為:首先,用沸水煮馬鈴薯后過濾,回收濾液得到馬鈴薯汁液;其次,將板栗枯枝落葉水煮液、根際土壤水提液和水加入馬鈴薯汁液中后,加入瓊脂,邊加熱邊攪拌至瓊脂完全融化后,再加入葡萄糖,充分混勻后冷卻;最后,調節pH值為5~6;
其中,馬鈴薯、葡萄糖和瓊脂的質量比為(10~20):(1~2):(1~1.5),板栗枯枝落葉水煮液、根際土壤水提液和水的體積比為(2~5):(1~2):(2~5);
3)菌種擴大培養
將純菌絲接種到擴大培養料中,在25~28℃下培養至菌絲長滿培養容器,獲得板栗菌根菌。

2.   根據權利要求1所述的一種板栗菌根菌人工培養方法,其特征在于,所述的用沸水煮馬鈴薯的時間為30~50min;采用lmol/L NaOH或lmol/L HCL調節pH值為5~6。

3.   根據權利要求1所述的一種板栗菌根菌人工培養方法,其特征在于,所述板栗枯枝落葉水煮液為:用沸水煮板栗枯枝落葉30~50min,靜置后過濾得到的濾液。

4.   根據權利要求1所述的一種板栗菌根菌人工培養方法,其特征在于,所述根際土壤水提液為:用沸水煮板栗根際土壤30~50min,靜置后過濾得到的濾液。

5.   根據權利要求1所述的一種板栗菌根人工培養方法,其特征在于,所述的擴大培養料由基質和營養液按質量比10:2~3配成。

6.   根據權利要求5所述的一種板栗菌根菌人工培養方法,其特征在于,所述的基質由板栗修剪枝條或栗苞的粉碎物與玉米粉按體積比(80~85):(20~15)混勻配成。

7.   根據權利要求5所述的一種板栗菌根菌人工培養方法,其特征在于,所述的營養液由水、白糖、KH2PO4、NH4Cl、CaSO4·2H2O、FeCl3按質量比80:10:3:5:1:1配制而成,調節pH值為5~6。

8.   根據權利要求5所述的一種板栗菌根菌人工培養方法,其特征在于,所述的擴大培養料的含水質量為60~65%。

9.   根據權利要求1所述的一種板栗菌根菌人工培養方法,其特征在于,所述的板栗菌根菌子實體在組織分離前還包括預處理操作,是將采集的新鮮、壯實、中等成熟的野生板栗菌根菌子實體,先經無菌保鮮劑洗滌,再經75%的酒精浸泡消毒,最后經無菌水清洗。

10.   根據權利要求9所述的一種板栗菌根菌人工培養方法,其特征在于,所述的無菌保鮮劑為:質量濃度為0.02~0.06%的抗壞血酸液和質量濃度為0.01~0.03%的檸檬酸液按體積比(1~5):(1~3)配成的混合液。

說明書

說明書一種板栗菌根菌人工培養方法
技術領域
本發明屬于菌根菌人工培養領域,具體涉及一種板栗菌根菌人工培養方法。
背景技術
菌根是土壤微生物和植物相容性最普遍的共生現象,外生菌根的形成使樹木依靠菌根菌的幫助提高對土壤中水分和養分的吸收能力。外生菌根菌分泌的有機態磷分解酶能將枯枝落葉和土壤有機質中的有機態磷分解吸收直接傳輸給樹木利用,從而起到抗旱、促生、防病的效果。外生菌根真菌侵染宿主植物根系后,一方面形成哈蒂氏網和菌套,另一方面菌絲向外延伸形成致密的菌絲網,甚至形成菌索。由于多數外生菌根真菌對寄主不具有嚴格的專一性,外延菌絲伸展過程中接觸到其它可與其共生的寄主植物的根系后也可再度侵染,形成根間的菌絲橋。菌絲橋的建立使不同植株之間形成了源庫關系,使植物間可傳遞C、N、P和水分等物質,從而使受體植物的營養狀況得到改善。
板栗根系與外生菌根菌也存在一種共生關系。在板栗園林下,可以看到不同形狀和顏色的板栗菌根菌的子實體。調查研究發現,能與板栗形成外生菌根的真菌有13屬29種,分布的優勢真菌有馬勃屬(Lycoperdon)、須腹菌屬(Rhizopogon)、禿馬勃屬(Calvatia)、紅菇屬(Russula)、牛肝菌屬(Boletus)、鵝膏屬(Amanita)、松塔牛肝菌屬(Strobilomyces)等。其中,馬勃類和須腹菌與板栗共生關系最好,其次為紅菇屬及牛肝菌屬。
外生菌根真菌對板栗的正常生長具有極其重要的作用,能提高板栗根系對土壤中水分和養分的吸收能力。如果土壤中缺少菌根菌,板栗就不能正常生長發育。板栗多生長在山區,在土壤肥力貧瘠的板栗園,土壤養分含量很低,施肥困難,因此,山區的板栗常因著生位置、株齡不同表現出植株營養狀況和生長勢很大差別。在板栗常規嫁接育苗中,由于苗床或培養基中缺乏能與板栗根系共生的菌根菌,所以,移栽到大田的常規嫁接苗,成活率低,生長發育遲緩,而且到2~3年后還會出現大樹死亡的現象。
然而,板栗根系與外生菌根菌的共生關系十分復雜,許多菌根真菌的分離培養比較困難。板栗菌根化研究已有成功報道,但接種的菌劑均采用的是外來菌種,接種效果很不理想。雖然秦嶺等人也成功從板栗產區土壤中采集多種真菌子實體,但并未分離出能成功回接的菌種。
發明內容
本發明的目的在于提供一種板栗菌根菌人工培養方法,培養得到與板栗根系有良好共生關系的板栗菌根菌。
本發明是通過以下技術方案來實現:
一種板栗菌根菌人工培養方法,包括以下步驟:
1)組織分離
取板栗菌根菌子實體,縱切為兩半,采集菌蓋與菌柄交匯處的菌肉組織塊;
2)菌絲培養與提純
將采集的菌肉組織塊置于斜面培養基中,在25~28℃下培養至菌肉組織塊萌發出菌絲后,將菌絲轉接至斜面培養基中,在25~28℃下培養至菌絲長滿斜面,獲得純菌絲;
所述的斜面培養基的制作為:首先,用沸水煮馬鈴薯后過濾,回收濾液得到馬鈴薯汁液;其次,將板栗枯枝落葉水煮液、根際土壤水提液和水加入馬鈴薯汁液中后,加入瓊脂,邊加熱邊攪拌至瓊脂完全融化后,再加入葡萄糖,充分混勻后冷卻;最后,調節pH值為5~6;
其中,馬鈴薯、葡萄糖和瓊脂的質量比為(10~20):(1~2):(1~1.5),板栗枯枝落葉水煮液、根際土壤水提液和水的體積比為(2~5):(1~2):(2~5);
3)菌種擴大培養
將純菌絲接種到擴大培養料中,在25~28℃下培養至菌絲長滿培養容器,獲得板栗菌根菌。
所述的用沸水煮馬鈴薯的時間為30~50min;采用lmol/L NaOH或lmol/L HCL調節pH值為5~6。
所述板栗枯枝落葉水煮液為:用沸水煮板栗枯枝落葉30~50min,靜置后過濾得到的濾液。
所述根際土壤水提液為:用沸水煮板栗根際土壤30~50min,靜置后過濾得到的濾液。
所述的擴大培養料由基質和營養液按質量比10:2~3配成。
所述的基質由板栗修剪枝條或栗苞的粉碎物與玉米粉按體積比(80~85):(20~15)混勻配成。
所述的營養液由水、白糖、KH2PO4、NH4Cl、CaSO4·2H2O、FeCl3按質量比80:10:3:5:1:1配制而成,調節pH值為5~6。
所述的擴大培養料的含水質量為60~65%。
所述的板栗菌根菌子實體在組織分離前還包括預處理操作,是將采集的新鮮、壯實、中等成熟的野生板栗菌根菌子實體,先經無菌保鮮劑洗滌,再經75%的酒精浸泡消毒,最后經無菌水清洗。
所述的無菌保鮮劑為:質量濃度為0.02~0.06%的抗壞血酸液和質量濃度為0.01~0.03%的檸檬酸液按體積比(1~5):(1~3)配成的混合液。
與現有技術相比,本發明具有以下有益的技術效果:
本發明的板栗菌根菌人工培養方法,利用菌根菌營養專一性的屬性,選用板栗枯枝落葉、根際土壤等獲取營養液,經過組織分離、純化、培養、繁殖,獲得能與板栗形成最佳共生關系的菌根菌種。本發明操作簡單,通過回接試驗,利用本發明培養得到的菌種回接板栗幼苗,證明效果非常好,菌根浸染率最高可達50.3%,平均浸染率為46.5%。
具體實施方式
下面結合具體的實施例對本發明做進一步的詳細說明,所述是對本發明的解釋而不是限定。
實施例1
一種板栗菌根人工培養方法,包括以下步驟:
1)野生菌根菌子實體的采集
在10齡以上的板栗園林下,采集新鮮、壯實、中等成熟的野生菌根菌子實體,除去表面雜物后,在預先制備好的無菌保鮮劑中浸泡1~2分鐘,撈出瀝干,裝入無菌保鮮袋內,密封,在48小時內帶回后在75%酒精中浸泡5秒消毒,之后再用無菌水清洗兩遍。
其中,所述的無菌保鮮劑是由質量濃度0.04%抗壞血酸液和質量濃度0.02%檸檬酸液按體積比1:1配成的混合液。
2)組織分離
在無菌條件下,將清洗、消毒后的子實體縱剖為兩半,用解剖刀切取菌蓋與菌柄交匯處,得到菌肉組織塊(綠豆大小);
3)制作斜面培養基
斜面培養基的配方為:馬鈴薯200g,葡萄糖20g,瓊脂15g,板栗枯枝落葉煮提液400ml,根際土壤煮提液200ml,自來水400ml,pH值為5;
斜面培養基的制作步驟為:
①取板栗枯枝落葉200g,加水1000ml,煮沸40min,用四層紗布過濾,得板栗枯枝落葉水煮液,備用;
②取板栗根際土壤100g,加水500ml,煮沸30min,用四層紗布過濾,得根際土壤水提液,備用;
③將馬鈴薯去皮和芽眼、切塊或切片,稱取200g,加水1000ml,煮沸30min,至馬鈴薯能被玻璃棒戳破為宜,用三層紗布過濾,得馬鈴薯汁液,備用;
④量取上述板栗枯枝落葉煮提液400ml,根際土壤煮提液200ml,自來水400ml,加入到馬鈴薯汁液中,再加入瓊脂15g,繼續加熱,邊加熱邊攪拌,至瓊脂完全溶化,再加葡萄糖20g,稍冷,再用水補足至1000ml;用lmol/L NaOH或lmol/L HCL溶液調節pH值為5;
⑤將上述配制好的培養基趁熱分裝于試管,裝入量約為試管長度的1/4;然后塞上棉塞,包扎,放入滅菌鍋,上蓋2層報紙,在121℃或0.103MPa下滅菌30分鐘,待壓力降為零時取出試管,擺成斜面,冷卻,備用;
⑥將斜面培養基試管置于28℃的恒溫箱中培養3天,如斜面仍光滑,無雜菌出現,就可作為合格斜面培養基使用。
上述組織分離制作的斜面培養基試管應盡量多,不少于50支,然后在28℃中培養。從第4天起,每隔3天檢查1次,及時刷除污染管,將未污染管繼續培養。
4)菌絲培養與提純
將菌肉組織塊置于斜面培養基中,在25℃下培養至菌肉組織塊萌發菌絲后,在無菌條件下進行轉管(新的斜面培養基中)后,移入培養箱,溫度控制在28℃,待菌絲長滿斜面后,即獲得純菌絲(一級菌種),并在純菌絲試管外貼上菌種名稱、菌株號、接種日期的標簽,以便于保存和擴大繁殖。
5)菌種擴大培養
將純菌絲接種到擴大培養料的接種孔中,稍壓實,使菌種與培養料相接觸,將待培養的菌種瓶移入培養箱或光線暗淡的培養室,在25℃下培養至菌絲長滿培養瓶,獲得擴大種(二級菌種),即板栗菌根菌。
其中,所述擴大培養料由基質和營養液按質量比10:2配成,基質由板栗修剪枝條或栗苞的粉碎物與玉米粉按體積比85:15混勻配成,營養液由水、白糖、KH2PO4、NH4Cl、CaSO4·2H2O、FeCl3按質量比80:10:3:5:1:1配制而成,調節pH值為5~6。
所述擴大培養料的制備步驟為:
①將板栗修剪枝條或栗苞粉碎物與玉米粉按體積比85:15混合均勻,再將營養液拌入基質,基質與營養液的質量比為10:2;
②基質與營養液充分混勻后,在用適量水調節培養料水分在60~65%之間(以用手握料,指縫間有水滲出為宜),拌均勻后,即可立即分裝菌種瓶;(菌種瓶可選用75ml的廣口瓶,邊裝邊壓實,菌種瓶裝好后上邊壓平實,在培養料中間打一接種孔。)
③用清水將瓶口內外清洗干凈,用一層塑料布二層報紙扎口或直接用棉花塞口,封口后立即裝鍋,在121℃滅菌,備用。
通過以上步驟1)~4)就可以獲得二級擴大菌種,根據生產需要,還可以繼續擴大獲得三級菌種。利用二級菌種或三級菌種都可以生產不同類型的菌根制劑或板栗根菌專用肥。
對本發明培養得到的板栗菌根菌進行回接效果試驗,具體試驗內容及測試結果如下:
1)試驗方法
采用隨機區組試驗設計,在板栗容器苗剛長出一對真葉時,利用固體菌劑直接接種,以不接菌為對照。固體菌劑接種量為10g/株,分3個組,重復3次,每個組重復接種30株。接種1個月后,采用番紅?淡綠染色法調查菌根侵染率。經染色后,根細胞核染成鮮紅或紫紅色,菌絲綠色或藍綠色,利用此可以分辨根浸染與否,計算侵染率。計算公式:菌根侵染率(%)=侵染根數/全部根數×100%。
待苗木根系菌根化后3個月,測定苗木的苗高、地徑、高徑比等生長指標。
2)試驗結果
①菌根侵染率,如表1所示:
表1回接菌根菌劑后板栗苗菌根浸染率
 第一組第二組第三組對照(CK)菌根浸染率(%)41.450.347.70.0
從測定結果看:利用該菌種回接板栗幼苗,菌根浸染率最高可達50.3%,平均浸染率為46.5%。
②菌根苗與普通苗生長情況對比結果,如表2所示:
表2菌根苗與普通苗生長情況對比
 苗高(cm)地徑(cm)高徑比菌根苗43.60.8153.83普通苗32.30.5360.94增長量+11.3+0.28?7.11
從測定結果看:菌根苗的苗高、地徑都比普通苗大,但苗木的高徑比要小于普通苗,說明接種菌不僅能提高苗木生長量,還有助于培育壯苗。
實施例2
一種板栗菌根人工培養方法,包括以下步驟:
1)野生菌根菌子實體的采集
在10齡以上的板栗園林下,采集新鮮、壯實、中等成熟的野生菌根菌子實體,除去表面雜物后,在預先制備好的無菌保鮮液中浸泡2分鐘,撈出瀝干,裝入無菌保鮮袋內,密封,在48小時內帶回后在75%酒精中浸泡5秒消毒,之后再用無菌水清洗兩遍。
所述的無菌保鮮劑是由質量濃度0.02%抗壞血酸液和質量濃度0.01%檸檬酸液按體積比1:3配成的混合液。
2)組織分離
在無菌條件下,將清洗、消毒后的子實體縱剖為兩半,用解剖刀切取菌蓋與菌柄交匯處,得到菌肉組織塊(綠豆大小);
3)制作斜面培養基
斜面培養基的配方為:馬鈴薯100g,葡萄糖10g,瓊脂10g,板栗枯枝落葉煮提液200ml,根際土壤煮提液100ml,自來水200ml,調節pH值為6;
斜面培養基的制作步驟為:
①取板栗枯枝落葉200g,加水1000ml,煮沸30min,用四層紗布過濾,得板栗枯枝落葉水煮液,備用;
②取板栗根際土壤100g,加水500ml,煮沸40min,用四層紗布過濾,得根際土壤水提液,備用;
③將馬鈴薯去皮和芽眼、切塊或切片,稱取100g,加水500ml,煮沸30分鐘左右,至馬鈴薯能被玻璃棒戳破為宜,用四層紗布過濾,得馬鈴薯汁液,備用;
④量取上述板栗枯枝落葉煮提液200ml,根際土壤煮提液100ml,自來水200ml,加入到馬鈴薯汁液中,再加入瓊脂10g,繼續加熱,邊加熱邊攪拌,至瓊脂完全溶化,再加葡萄糖10g,稍冷,再用水補足至500ml;用lmol/L NaOH或lmol/L HCL溶液調節pH值至6;
⑤將上述配制好的培養基趁熱分裝于試管,裝入量約為試管長度的1/4;然后塞上棉塞,包扎,放入滅菌鍋,上蓋2層報紙,在121℃或0.103MPa下滅菌30分鐘,待壓力降為零時取出試管,擺成斜面,冷卻,備用;
⑥將斜面培養基試管置于25℃的恒溫箱中培養3天,如斜面仍光滑,無雜菌出現,就可作為合格斜面培養基使用。
上述組織分離制作的斜面培養基試管應盡量多,不少于50支,然后在25℃中培養。從第4天起,每隔3天檢查1次,及時刷除污染管,將未污染管繼續培養。
4)菌絲培養與提純
將菌肉組織塊置于斜面培養基中,在27℃下培養至菌肉組織塊萌發菌絲后,在無菌條件下進行轉管(新的斜面培養基中)后,移入培養箱,溫度控制在25℃,待菌絲長滿斜面即獲得純菌絲(一級菌種),并在純菌絲試管外貼上菌種名稱、菌株號、接種日期的標簽,以便于保存和擴大繁殖。
5)菌種擴大培養
將純菌絲接種到擴大培養料的接種孔中,稍壓實,使菌種與培養料相接觸,將待培養的菌種瓶移入培養箱或光線暗淡的培養室,在25℃下培養至菌絲長滿培養瓶,獲得擴大種(二級菌種),即板栗菌根菌。
如果接種5天后仍未見菌絲萌發則應及時補接種,如發現雜菌應及時清除。同時要經常調換瓶的位置,以利于菌絲生長一致,當菌絲長滿瓶后及時使用。若暫時不用可放低溫、干燥、避光的環境條件下短期保存。
上述擴大培養料由基質和營養液按質量比10:2.5配成,基質由板栗修剪枝條或栗苞的粉碎物與玉米粉按體積比80:20混勻配成,營養液由水、白糖、KH2PO4、NH4Cl、CaSO4·2H2O、FeCl3按質量比80:10:3:5:1:1配制而成,調節pH值為5~6。
所述擴大培養料的制備步驟為:
①先將板栗修剪枝條或栗苞粉碎物、玉米粉按體積比80:20混合均勻,再將營養液拌入基質,基質與營養液的質量比例為10:2.5。
②基質與營養液充分均勻后,在用適量水調節培養料水分在60~65%之間(以用手握料,指縫間有水滲出為宜),拌均勻后,即可立即分裝菌種瓶。(菌種瓶可選用75ml的廣口瓶,邊裝邊壓實,菌種瓶裝好后上邊壓平實,在培養料中間打一接種孔。)
③用清水將瓶口內外清洗干凈,用一層塑料布二層報紙扎口或直接用棉花塞口,封口后立即裝鍋,在121℃滅菌,備用。
通過以上步驟1)~4)就可以獲得二級擴大菌種,根據生產需要,還可以繼續擴大獲得三級菌種。
實施例3
一種板栗菌根人工培養方法,包括以下步驟:
1)野生菌根菌子實體的采集
在10齡以上的板栗園林下,采集新鮮、壯實、中等成熟的野生菌根菌子實體,除去表面雜物后,在預先制備好的無菌保鮮液中浸泡1分鐘,撈出瀝干,裝入無菌保鮮袋內,密封,在48小時內帶回后在75%酒精中浸泡5秒消毒,之后再用無菌水清洗兩遍。所述的無菌保鮮劑是由質量濃度0.06%抗壞血酸液和質量濃度0.03%檸檬酸液按體積比3:2配成的混合液。
2)組織分離
在無菌條件下,將清洗、消毒后的子實體縱剖為兩半,用解剖刀切取菌蓋與菌柄交匯處,得到菌肉組織塊(綠豆大小);
3)制作斜面培養基
斜面培養基的配方為:馬鈴薯150g,葡萄糖7.5g,瓊脂10g,板栗枯枝落葉煮提液300ml,根際土壤煮提液60ml,自來水180ml,調節pH值為5~6。
所述斜面培養基的制作步驟為:
①取板栗枯枝落葉200g,加水1000ml,煮沸50min,用四層紗布過濾,得板栗枯枝落葉水煮液,備用;
②取板栗根際土壤100g,加水500ml,煮沸50min,用四層紗布過濾,得根際土壤水提液,備用;
③將馬鈴薯去皮和芽眼、切塊或切片,稱取150g,加水750ml,煮沸30分鐘左右,至馬鈴薯能被玻璃棒戳破為宜,用四層紗布過濾,得馬鈴薯汁液,備用;
④量取上述板栗枯枝落葉煮提液300ml,根際土壤煮提液60ml,自來水180ml,加入馬鈴薯汁液中,加入瓊脂10g,繼續加熱,邊加熱邊攪拌,至瓊脂完全溶化,再加葡萄糖7.5g,稍冷,再用水補足至540ml;用lmol/L NaOH或lmol/L HCL溶液調節pH值至6;
⑤將上述配制好的培養基趁熱分裝于試管,裝入量約為試管長度的1/4;然后塞上棉塞,包扎,放入滅菌鍋,上蓋2層報紙,在121℃或0.103MPa下滅菌30分鐘,待壓力降為零時取出試管,擺成斜面,冷卻,備用;將斜面培養基試管置于27℃的恒溫箱中培養3天,如斜面仍光滑,無雜菌出現,就可作為合格斜面培養基使用。
上述組織分離制作的斜面培養基試管應盡量多,不少于50支,然后在27℃中培養。從第4天起,每隔3天檢查1次,及時刷除污染管,將未污染管繼續培養。
4)菌絲培養與提純
將菌肉組織塊置于斜面培養基中,在28℃下培養至菌肉組織塊萌發菌絲后,在無菌條件下進行轉管(新的斜面培養基中)后,移入培養箱,溫度控制在27℃,待菌絲長滿斜面即獲得純菌絲(一級菌種),并在純菌絲試管外貼上菌種名稱、菌株號、接種日期的標簽,以便于保存和擴大繁殖。
5)菌種擴大培養
將純菌絲接種到擴大培養料的接種孔中,稍壓實,使菌種與培養料相接觸,將待培養的菌種瓶移入培養箱或光線暗淡的培養室,在27℃下培養至菌絲長滿培養瓶,獲得擴大種(二級菌種),即板栗菌根。
如果接種5天后仍未見菌絲萌發則應及時補接種,如發現雜菌應及時清除。同時要經常調換瓶的位置,以利于菌絲生長一致,當菌絲長滿瓶后及時使用。若暫時不用可放低溫、干燥、避光的環境條件下短期保存。
上述擴大培養料由基質和營養液按質量比10:3配成,基質由板栗修剪枝條或栗苞的粉碎物與玉米粉按體積比85:15混勻配成,營養液由水、白糖、KH2PO4、NH4Cl、CaSO4·2H2O、FeCl3按質量比80:10:3:5:1:1配制而成,調節pH值為5~6。
所述擴大培養料的制備步驟為:
①先將板栗修剪枝條或栗苞粉碎物、玉米粉按體積比85:15混合均勻,再將營養液拌入基質,基質與營養液的重量比例為10:3。
②基質與營養液充分搓和均勻后,在用適量水調節培養料水分在60~65%(以用手握料,指縫間有水滲出為宜),拌均勻后,即可立即分裝菌種瓶。(菌種瓶可選用75ml的廣口瓶,邊裝邊壓實,菌種瓶裝好后上邊壓平實,在培養料中間打一接種孔。)
③用清水將瓶口內外清洗干凈,用一層塑料布二層報紙扎口或直接用棉花塞口,封口后立即裝鍋,在121℃滅菌,備用。
通過以上步驟1)~4)就可以獲得二級擴大菌種,根據生產需要,還可以繼續擴大獲得三級菌種。
實施例4
一種板栗菌根人工培養方法,包括以下步驟:
1)野生菌根菌子實體的采集
在10齡以上的板栗園林下,采集新鮮、壯實、中等成熟的野生菌根菌子實體,除去表面雜物后,在預先制備好的無菌保鮮液中浸泡1分鐘,撈出瀝干,裝入無菌保鮮袋內,密封,在48小時內帶回后在75%酒精中浸泡5秒消毒,之后再用無菌水清洗兩遍。所述的無菌保鮮劑是由質量濃度0.04%抗壞血酸液和質量濃度0.02%檸檬酸液按體積比5:1~3配成的混合液。
2)組織分離
在無菌條件下,將清洗、消毒后的子實體縱剖為兩半,用解剖刀切取菌蓋與菌柄交匯處,得到菌肉組織塊(綠豆大小);
3)制作斜面培養基
斜面培養基的配方為:馬鈴薯150g,葡萄糖10g,瓊脂15g,板栗枯枝落葉煮提液300ml,根際土壤煮提液200ml,自來水500ml,調節pH值為6。
所述斜面培養基的制作步驟為:
①取板栗枯枝落葉200g,加水1000ml,煮沸45min,用四層紗布過濾,得板栗枯枝落葉水煮液,備用;
②取板栗根際土壤100g,加水500ml,煮沸35min,用四層紗布過濾,得根際土壤水提液,備用;
③將馬鈴薯去皮和芽眼、切塊或切片,稱取150g,加水750ml,煮沸30分鐘左右,至馬鈴薯能被玻璃棒戳破為宜,用四層紗布過濾,得馬鈴薯汁液,備用;
④量取上述板栗枯枝落葉煮提液300ml,根際土壤煮提液200ml,自來水500ml,加入馬鈴薯汁液中,加入瓊脂15g,繼續加熱,邊加熱邊攪拌,至瓊脂完全溶化,再加葡萄糖10g,稍冷,再用水補足至1000ml;用lmol/L NaOH或lmol/L HCL溶液調節pH值至6;
⑤將上述配制好的培養基趁熱分裝于試管,裝入量約為試管長度的1/4;然后塞上棉塞,包扎,放入滅菌鍋,上蓋2層報紙,在121℃或0.103MPa下滅菌30分鐘,待壓力降為零時取出試管,擺成斜面,冷卻,備用;將斜面培養基試管置于27℃的恒溫箱中培養3天,如斜面仍光滑,無雜菌出現,就可作為合格斜面培養基使用。
上述組織分離制作的斜面培養基試管應盡量多,不少于50支,然后在27℃中培養。從第4天起,每隔3天檢查1次,及時刷除污染管,將未污染管繼續培養。
4)菌絲培養與提純
將菌肉組織塊置于斜面培養基中,在28℃下培養至菌肉組織塊萌發菌絲后,在無菌條件下進行轉管(新的斜面培養基中)后,移入培養箱,溫度控制在27℃,待菌絲長滿斜面即獲得純菌絲(一級菌種),并在純菌絲試管外貼上菌種名稱、菌株號、接種日期的標簽,以便于保存和擴大繁殖。
5)菌種擴大培養
將純菌絲接種到擴大培養料的接種孔中,稍壓實,使菌種與培養料相接觸,將待培養的菌種瓶移入培養箱或光線暗淡的培養室,在27℃下培養至菌絲長滿培養瓶,獲得擴大種(二級菌種),即板栗菌根。
如果接種5天后仍未見菌絲萌發則應及時補接種,如發現雜菌應及時清除。同時要經常調換瓶的位置,以利于菌絲生長一致,當菌絲長滿瓶后及時使用。若暫時不用可放低溫、干燥、避光的環境條件下短期保存。
上述擴大培養料由基質和營養液按質量比10:3配成,基質由板栗修剪枝條或栗苞的粉碎物與玉米粉按體積比83:17混勻配成,營養液由水、白糖、KH2PO4、NH4Cl、CaSO4·2H2O、FeCl3按質量比80:10:3:5:1:1配制而成,調節pH值為5~6。
所述擴大培養料的制備步驟為:
①先將板栗修剪枝條或栗苞粉碎物、玉米粉按體積比83:17混合均勻,再將營養液拌入基質,基質與營養液的質量比例為10:3。
②基質與營養液充分搓和均勻后,在用適量水調節培養料水分在60~65%(以用手握料,指縫間有水滲出為宜),拌均勻后,即可立即分裝菌種瓶。(菌種瓶可選用75ml的廣口瓶,邊裝邊壓實,菌種瓶裝好后上邊壓平實,在培養料中間打一接種孔。)
③用清水將瓶口內外清洗干凈,用一層塑料布二層報紙扎口或直接用棉花塞口,封口后立即裝鍋,在121℃滅菌,備用。
通過以上步驟1)~4)就可以獲得二級擴大菌種,根據生產需要,還可以繼續擴大獲得三級菌種。

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一種 板栗 菌根 人工 培養 方法
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