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抗FGFR3抗體及其使用方法.pdf

摘要
申請專利號:

CN201080013816.8

申請日:

2010.03.24

公開號:

CN102378767B

公開日:

2015.01.14

當前法律狀態:

有效性:

法律詳情: 授權|||專利申請權的轉移IPC(主分類):C07K 16/28變更事項:申請人變更前權利人:霍夫曼-拉羅奇有限公司變更后權利人:健泰科生物技術公司變更事項:地址變更前權利人:瑞士巴塞爾變更后權利人:美國加利福尼亞登記生效日:20130312|||實質審查的生效IPC(主分類):C07K 16/28申請日:20100324|||公開
IPC分類號: C07K16/28; A61K39/395 主分類號: C07K16/28
申請人: 健泰科生物技術公司
發明人: 阿維·阿什克納濟; 青婧; 克里斯蒂安·維斯曼; 吳雁
地址: 美國加利福尼亞
優先權: 2009.03.25 US 61/163,222
專利代理機構: 中科專利商標代理有限責任公司 11021 代理人: 程金山
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法律狀態
申請(專利)號:

CN201080013816.8

授權公告號:

102378767B|||||||||

法律狀態公告日:

2015.01.14|||2013.04.03|||2012.05.09|||2012.03.14

法律狀態類型:

授權|||專利申請權、專利權的轉移|||實質審查的生效|||公開

摘要

本發明提供了FGFR3抗體,和包含這些抗體的組合物和使用這些抗體的方法。

權利要求書

1: 一種分離的抗 -FGFR3 拮抗劑抗體, 其中所述抗體以 1X10-8 或更強的 Kd 結合人 FGFR3, 其中所述抗體抑制 FGFR3 受體與另一單位的所述受體的二聚作用, 從而抑制所述受 體的活化, 并且其中所述抗體具有抗體 - 依賴性細胞介導的細胞毒性活性。
2: 權利要求 1 所述的抗 -FGFR3 拮抗劑抗體, 其中所述抗體能夠殺傷包含 t(4 ; 14) 易 位的多發性骨髓瘤細胞。
3: 前述權利要求中任一項所述的抗 -FGFR3 拮抗劑抗體, 其中所述抗體不誘導實質性 的 FGFR3 下調。
4: 前述權利要求中任一項所述的抗 -FGFR3 拮抗劑抗體, 其中所述抗體的二價形式不 具有實質性的激動劑功能。
5: 前 述 權 利 要 求 中 任 一 項 所 述 的 抗 -FGFR3 拮 抗 劑 抗 體, 其中所述抗體結合這 樣 的 多 肽, 所 述 多 肽 包 含 與 氨 基 酸 序 列 LAVPAANTVRFRCPA(SEQ ID NO : 179) 和 / 或 SDVEFHCKVYSDAQP(SEQ ID NO : 180) 具有至少 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%的序 列同一性或相似性的氨基酸序列。
6: 前述權利要求中任一項所述的抗 -FGFR3 拮抗劑抗體, 其中所述抗體結合 FGFR3IIIb 的 殘 基 154, 155, 158, 159, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 177, 202, 205, 207, 210, 212, 214, 216, 217, 241, 246, 247, 248, 278, 279, 280, 281, 282, 283, 314, 315, 316, 317 和 / 或 318 中的至少一個、 兩個、 三個、 四個或至多達全部的任意 個殘基。
7: 前述權利要求中任一項所述的抗 -FGFR3 拮抗劑抗體, 其中所述抗體抑制組成型 FGFR3 活性。
8: 權利要求 7 所述的抗 -FGFR3 拮抗劑抗體, 其中組成型 FGFR3 活性是配體 - 依賴性 FGFR3 活性。
9: 權利要求 7 所述的抗 -FGFR3 拮抗劑抗體, 其中組成型 FGFR3 活性是配體 - 不依賴性 組成型 FGFR3 活性。
10: 前 述 權 利 要 求 中 任 一 項 所 述 的 抗 -FGFR3 拮 抗 劑 抗 體, 其 中 所 述 抗 -FGFR3 抗 R248C K652E Y375C 體 抑 制 (a)FGFR3-IIIb 和 (b)FGFR3-IIIb , FGFR3-IIIb , FGFR3-IIIbS249C,和 FGFR3-IIIbG372C 中的一種或多種。
11: 前述權利要求中任一項所述的抗 -FGFR3 拮抗劑抗體, 其中所述抗體包含 : (i)HVR-L3, 其包含序列 QQX1X2X3X4X5X6T(SEQ ID NO : 148), 其中 X1 是 G, S 或 T, X2 是 T, Y 或 A, X3 是 G, S, T, 或 A, X4 是 A, H, D, T, 或 N, X5 是 Q, P 或 S, X6 是 S, Y, L, P 或 Q, (ii)HVR-H2, 其包含序列 GRIYPX1X2X3X4X5X6YADSVKG(SEQ IDNO : 150), 其中 X1 是 Y, A, L, S, 或 T, X2 是 A, Q, D, G, Y, S, N 或 F, X3 是 A, D, 或 G, X4 是 T 或 S, X5 是 K, F, T, 或 S, X6 是 Y, H, N 或 I, 和 (iii)HVR-H3, 其包含序列 ARTYGIYDLYVDYTEYVMDY(SEQ IDNO : 151)。
12: 前述權利要求中任一項所述的抗 -FGFR3 拮抗劑抗體, 其中所述抗體包含 : (i)HVR-L1, 其包含序列 RASQX1X2X3X4X5X6A(SEQ ID NO : 146), 其中 X1 是 V 或 D, X2 是 V 或 I, X3 是 D, E 或 S, X4 是 T 或 I, X5 是 A 或 S, 且 X6 是 V 或 L, (ii)HVR-L2, 其包含序列 X1ASFLX2S(SEQ ID NO : 147), 其中 X1 是 S 或 G 且 X2 是 A 或 Y, 和 2 (iii)HVR-L3, 其包含序列 QQX1X2X3X4X5X6T(SEQ ID NO : 148), 其中 X1 是 G, S 或 T, X2 是 T, Y 或 A, X3 是 G, S, T, 或 A, X4 是 A, H, D, T, 或 N, X5 是 Q, P 或 S, X6 是 S, Y, L, P 或 Q。
13: 權利要求 1 或 12 所述的抗 -FGFR3 拮抗劑抗體, 其中所述抗體包含 : (i)HVR-H1, 其包含序列 GFX1FX2X3TGIS(SEQ ID NO : 149), 其中 X1 是 S 或 T, X2 是 W, Y, S 或 T, X3 是 S, G, 或 T, (ii)HVR-H2, 其包含序列 GRIYPX1X2X3X4X5X6YADSVKG(SEQ IDNO : 150), 其中 X1 是 Y, A, L, S, 或 T, X2 是 A, Q, D, G, Y, S, N 或 F, X3 是 A, D, 或 G, X4 是 T 或 S, X5 是 K, F, T, 或 S, X6 是 Y, H, N 或 I, 和 (iii)HVR-H3, 其包含序列 ARTYGIYDLYVDYTEYVMDY(SEQ IDNO : 151)。
14: 權 利 要 求 12 所 述 的 抗 -FGFR3 拮 抗 劑 抗 體,其 中 HVR-L1 包 含 序 列 RASQX1VX2X3X4VA(SEQ ID NO : 152), 其中 X1 是 V 或 D, X2 是 D 或 S, X3 是 T 或 I, X4 是 A 或 S。
15: 權 利 要 求 12 所 述 的 抗 -FGFR3 拮 抗 劑 抗 體,其 中 HVR-L3 包 含 序 列 QQX1X2X3X4X5X6T(SEQ ID NO : 153), 其中 X1 是 S, G, 或 T, X2 是 Y, T, 或 A, X3 是 T 或 G, X4 是 T, H 或 N, X5 是 P 或 S, X6 是 P, Q, Y, 或 L。
16: 權 利 要 求 13 所 述 的 抗 -FGFR3 拮 抗 劑 抗 體,其 中 HVR-H2 包 含 序 列 GRIYPX1X2GSTX3YADSVKG(SEQ ID NO : 154), 其中 X1 是 T 或 L, X2 是 N, Y, S, G, A, 或Q; X3 是 N 或 H。
17: 前述權利要求中任一項所述的抗 -FGFR3 拮抗劑抗體, 其中所述抗體包含重鏈可變 區和輕鏈可變區, 所述重鏈可變區包含 SEQ ID NO : 132 且所述輕鏈可變區包含 SEQ ID NO : 133。
18: 前述權利要求中任一項所述的抗 -FGFR3 拮抗劑抗體, 其中構架序列的至少一部分 是人共有構架序列。
19: 權利要求 18 所述的抗 -FGFR3 拮抗劑抗體, 其中所述抗體包含人 κ 亞組共有構架 序列。
20: 權利要求 18 所述的抗 -FGFR3 拮抗劑抗體, 其中所述抗體包含重鏈人亞組 III 共有 構架序列。
21: 前述權利要求中任一項所述的抗 -FGFR3 拮抗劑抗體, 其中所述抗體是單克隆抗 體。
22: 前述權利要求中任一項所述的抗 -FGFR3 拮抗劑抗體, 其中所述抗體選自由嵌合抗 體、 人源化抗體、 親和力成熟抗體、 人抗體、 雙特異性抗體和抗體片段組成的組。
23: 編碼前述權利要求中任一項所述的抗體的多核苷酸。
24: 包含權利要求 23 所述的多核苷酸的載體。
25: 權利要求 24 所述的載體, 其中所述載體是表達載體。
26: 包含權利要求 24 或 25 所述的載體的宿主細胞。
27: 權利要求 26 所述的宿主細胞, 其中所述宿主細胞是原核細胞。
28: 權利要求 26 所述的宿主細胞, 其中所述宿主細胞是真核細胞。
29: 權利要求 26 所述的宿主細胞, 其中所述宿主細胞是哺乳動物細胞。
30: 一種制備抗 -FGFR3 抗體的方法, 所述方法包括培養包含編碼權利要求 1-22 中任一 項所述的抗體的多核苷酸的宿主細胞, 從而表達所述多核苷酸, 和任選地, 從培養物中回收 3 所述抗體。
31: 權利要求 30 所述的方法, 其中所述宿主細胞是原核細胞。
32: 權利要求 30 所述的方法, 其中所述宿主細胞是真核細胞。
33: 一種藥物制劑, 所述藥物制劑包含權利要求 1-22 中任一項所述的抗體和藥用載 體。
34: 權利要求 1-22 中任一項所述的抗 -FGFR3 拮抗劑抗體, 其用作藥物。
35: 權利要求 1-22 中任一項所述的抗 -FGFR3 拮抗劑抗體, 其用于治療癌癥。
36: 權利要求 1-22 中任一項所述的抗 -FGFR3 拮抗劑抗體, 其用于抑制細胞增殖或消除 多發性骨髓瘤細胞。
37: 權利要求 1-22 中任一項所述的抗 -FGFR3 拮抗劑抗體在制備藥物中的用途。
38: 權利要求 37 所述的用途, 其中所述藥物用于治療癌癥。
39: 權利要求 37 所述的用途, 其中所述藥物用于抑制細胞增殖或消除多發性骨髓瘤細 胞。

說明書


抗 -FGFR3 抗體及其使用方法

    相關申請的交叉引用
     本申請要求于 2009 年 3 月 25 日提交的美國專利申請號 61/163,222 的優先權, 該 申請的內容通過引用合并于本文。
     發明領域
     本發明總體上涉及分子生物學領域。更具體地, 本發明涉及抗 -FGFR3 抗體及其用 途。
     發明背景
     成纖維細胞生長因子 (FGFs) 和它們的受體 (FGFRs) 在胚胎發育、 組織內環境穩定 和代謝過程中具有關鍵性的作用 (1-3)。在人類中, 存在 22 種 FGFs(FGF1-14, FGF16-23) 和 4 種具有酪氨酸激酶結構域的 FGF 受體 (FGFR1-4)。FGFR 由具有兩個或三個免疫球蛋白 樣結構域 (IgD1-3) 的細胞外配體結合區, 單次跨膜區和細胞質的分開的酪氨酸激酶結構 域組成。FGFR1, 2 和 3 各自具有兩個主要的選擇性剪接同種型, 稱為 IIIb 和 IIIc。這些 同種型在后半個 IgD3 中有約 50 個氨基酸的差異, 并且具有截然不同的組織分布和配體特 異性。通常, IIIb 同種型見于上皮細胞中, 而 IIIc 在間充質細胞中表達。在與硫酸乙酰肝 素蛋白聚糖 (heparan sulfateproteoglycans) 協同結合 FGF 后, FGFR 二聚化并且在特定 的酪氨酸殘基處磷酸化。這有助于募集關鍵性的銜接蛋白 (adaptor protein), 諸如 FGFR 底物 2α(FRS2α), 導致多個信號傳導級聯的激活, 包括促分裂原活化蛋白激酶 (MAPK) 和 PI3K-AKT 途徑 (1, 3, 4)。 因此, FGF 和它們的同源受體以前后相關 (context-dependent) 的 方式調節眾多的細胞過程, 包括增殖、 分化、 遷移和存活。
     異常激活的 FGFRs 已經被認為與特定的人惡性腫瘤有關 (1, 5)。特別地, t(4 ; 14) (p16.3 ; q32) 染色體易位發生在約 15-20%的多發性骨髓瘤患者中, 導致 FGFR3 的過度表達 并且與較短的總存活時間相關 (6-9)。FGFR3 也與賦予培養中的骨髓瘤細胞系以化學抗性 有關 (10), 這與 t(4 ; 14)+ 患者對常規化療的臨床反應差相一致 (8)。突變活化的 FGFR3 的 過度表達足以誘導造血干細胞和成纖維細胞 (11-14, 15)、 轉基因小鼠模型 (16)、 和鼠骨髓 移植模型 (16, 17) 中的癌性轉化。因此, FGFR3 已經被提議作為多發性骨髓瘤中的潛在治 療靶標。實際上, 靶向 FGFRs 的幾種小分子抑制劑, 盡管對 FGFR3 沒有選擇性并且針對某些 其他激酶具有交叉抑制活性, 但已經證明針對培養中和小鼠模型中的 FGFR3- 陽性骨髓瘤 細胞具有細胞毒性 (18-22)。
     還已經記載了在大部分膀胱癌癥中存在 FGFR3 過度表達 (23, 24)。此外, 已經 在 60-70 %的乳頭狀膀胱癌和 16-20 %的肌肉侵襲性膀胱癌中鑒定到 FGFR3 的體細胞激 活突變 (24, 25)。在細胞培養實驗中, RNA 干擾 (11, 26) 或 FGFR3 單鏈 Fv 抗體片段抑制 膀胱癌細胞增殖 (27)。近來的研究證明 FGFR3 抗體 - 毒素綴合物通過 FGFR3- 介導的毒 素遞送至腫瘤而減弱膀胱癌細胞系的異種移植物的生長 (28)。然而, 仍然不清楚 FGFR3 信號傳導是否的確是膀胱腫瘤體內生長的致癌驅動力。此外, 基于體內模型還沒有明確 在膀胱癌中靶向 FGFR3 的治療可能性。涉及 FGFR3 和抗 -FGFR3 抗體的出版物包括美國專 利 公 開 號 2005/0147612 ; Rauchenberger 等, J BiolChem( 生 物 化 學 雜 志 )278(40) : 38194-38205(2003) ; WO2006/048877 ; Martinez-Torrecuadrada 等, (2008)Mol Cancer Ther( 分 子 癌 癥 治 療 )7(4) : 862-873 ; WO2007/144893 ; Trudel 等 .(2006)107(10) : 4039-4046 ; Martinez-Torrecuadrada 等 (2005)Clin Cancer Res( 臨床癌癥研究 )11(17) : 6280-6290 ; Gomez-Roman 等 (2005)Clin Cancer Res( 臨 床 癌 癥 研 究 )11 : 459-465 ; Direnzo, R 等 (2007)Proceedings of AACR Annual Meeting(AACR 年 會 進 展 ),摘 要 No.2080 ; WO2010/002862。
     很明顯持續存在著對具有臨床屬性的藥劑的需求, 所述藥劑最適于開發為治療 劑。本文所述的發明滿足此需求并且提供其他益處。
     本文引用的所有參考文獻, 包括專利申請和出版物的全部內容通過引用合并。
     發明概述
     本發明部分地基于多種 FGFR3 結合劑 ( 諸如抗體, 及其片段 ) 的鑒定。FGFR3 呈 現了重要的和有利的治療靶標, 并且本發明基于所述試劑與 FGFR3 的結合提供了組合物和 方法。本發明的 FGFR3 結合劑, 如本文所述, 提供了用于靶向與 FGFR3 信號傳導途徑的表達 和 / 或活性相關的病理學狀況的重要的治療劑和診斷劑。因此, 本發明提供了與 FGFR3 結 合相關的方法、 組合物、 試劑盒和制品。 本發明提供了與 FGFR3 結合的抗體。在一個方面, 本發明的特征在于與 FGFR3 結 合的分離抗體。在一些實施方案中, 所述抗體結合 FGFR3IIIb 同種型和 / 或 FGFR3IIIc 同 種型。在一些實施方案中, 所述抗體結合突變的 FGFR3( 例如, FGFR3 IIIb R248C, S249C, G372C, Y375C, K652E, 中的一種或多種和 / 或 FGFR3 IIIc R248C, S249C, G370C, Y373C, K650E 中的一種或多種 )。在一些實施方案中, 所述抗體結合單體的 FGFR3( 例如, 單體的 FGFR3IIIb 和 / 或 IIIc 同種型 )。在一些實施方案中, 所述抗體促進單體 FGFR3 的形成, 諸 如通過穩定與二聚體 FGFR3 形式相關的單體 FGFR3 形式。
     在一個方面, 本發明提供了分離的抗 -FGFR3 抗體, 其中所述抗體的全長 IgG 形式 -7 以 1x10 或更強的 Kd 結合人 FGFR3。如本領域中眾所周知的那樣, 配體與其受體的結合親 合力可以使用多種測定中的任一種來測定, 并且可以按照多種定量值來表示。因此, 在一 個實施方案中, 結合親合力表示為 Kd 值并且反映固有的結合親合力 ( 例如, 具有最小化的 抗體親抗原性效應 (avidity effect))。通常和優選地, 結合親合力在體外測量, 無論是在 無細胞的環境中還是在細胞相關的環境中測量。本領域中已知的許多測定中的任一種, 包 括本文所述的那些, 可以用來獲得結合親合力測量值, 包括, 例如, Biacore, 放射免疫測定 -8 (RIA), 和 ELISA。在一些實施方案中, 所述抗體的全長 IgG 形式以 1x10 或更強的 Kd, 以 -9 -10 1x10 或更強的 Kd, 或以 1x10 或更強的 Kd 結合人 FGFR3。
     通常, 本發明的抗 -FGFR3 抗體是拮抗劑抗體。因此, 在一個方面, 所述抗 -FGFR3 抗體抑制 FGFR3 活性 ( 例如, FGFR3-IIIb 和 / 或 FGFR3-IIIc 活性 )。在一些實施方案中, 抗 -FGFR3 抗體 ( 通常以二價形式 ) 不具有實質的 FGFR3 激動劑功能。在一些實施方案中, 抗 -FGFR3 拮抗劑抗體 ( 通常以二價形式 ) 具有很少或沒有 FGFR3 激動劑功能。 在一個實施 方案中, 本發明的抗體 ( 通常以二價形式 ) 不顯示超出本底水平的有統計學顯著性的 FGFR3 激動劑活性水平。
     在一個方面, 所述抗體與 FGFR3 的結合可以抑制所述受體與另一單位的所述受體
     的二聚作用, 從而抑制所述受體的激活 ( 至少部分由于缺乏受體二聚作用導致 )。 抑制可以 是直接的或間接的。
     在一個方面, 本發明提供了抗 -FGFR3 抗體, 其不具有實質的凋亡活性 ( 例如, 不誘 導細胞的凋亡, 所述細胞例如, 移行性細胞癌細胞或多發性骨髓瘤細胞, 諸如包含 FGFR3 易 位, 諸如 t(4 ; 14) 易位的多發性骨髓瘤細胞 )。在一些實施方案中, 抗 -FGFR3 抗體擁有很 少或沒有凋亡功能。在一些實施方案中, 所述 FGFR3 抗體不顯示超出本底水平的有統計學 顯著性的凋亡功能。
     在一個方面, 本發明提供了抗 -FGFR3 抗體, 其不誘導實質的 FGFR3 下調。在一些 實施方案中, 抗 -FGFR3 抗體誘導很少的或不誘導受體下調。在一些實施方案中, FGFR3 抗 體不誘導超出本底水平的有統計學顯著性的受體下調。
     在一個方面, 本發明提供了抗 -FGFR3 抗體, 其擁有效應子功能。在一個實施方 案中, 效應子功能包括抗體 - 依賴性細胞介導的細胞毒性 (ADCC)。在一個實施方案中, 抗 -FGFR3 抗體 ( 在一些實施方案中, 裸抗 -FGFR3 抗體 ) 能夠殺死細胞, 在一些實施方案中, 殺死多發性骨髓瘤細胞 ( 例如, 包含易位, 例如 t(4 ; 14) 易位的多發性骨髓瘤細胞 )。在一 些實施方案中, 抗 -FGFR3 抗體能夠殺死每個細胞表達約 10,000 或更多個 FGFR3 分子 ( 諸 如每個細胞約 11,000, 約 12,000, 約 13,000, 約 14,000, 約 15,000, 約 16,000, 約 17,000, 約 18,000 或更多個 FGFR3 分子 ) 的細胞。 在其他實施方案中, 所述細胞每個細胞表達約 2000, 約 3000, 約 4000, 約 5000, 約 6000, 約 7000, 約 8000, 或更多個 FGFR3 分子。 在一個方面, 本發明的抗 -FGFR3 抗體抑制組成型 FGFR3 活性。 在一些實施方案中, 組成型 FGFR3 活性是配體依賴性 FGFR3 組成型活性。在一些實施方案中, 組成型 FGFR3 活 性是配體不依賴性組成型 FGFR3 活性。
     在一個方面, 抗 -FGFR3 抗體抑制包含對應于 FGFR3-IIIbR248C 的突變的 FGFR3。如 本文所使用的術語 “包含對應于 FGFR3-IIIbR248C 的突變”理解為包涵 FGFR3-IIIbR248C 和 FGFR3-IIIcR248C, 以及另外的包含在對應于 FGFR3-IIIb R248 的位置處的 R 至 C 突變的 FGFR3 形式。本領域普通技術人員理解如何比對 FGFR3 序列從而鑒定各個 FGFR3 序列之間的對應 殘基, 例如, 比對 FGFR3-IIIc 序列與 FGFR3-IIIb 序列以鑒定 FGFR3 中對應 FGFR3-IIIb 中 的 R248 位置的位置。在一些實施方案中, 所述抗 -FGFR3 抗體抑制 FGFR3-IIIbR248C 和 / 或 FGFR3-IIIcR248C。
     在一個方面, 抗 -FGFR3 抗體抑制包含對應于 FGFR3-IIIbK652E 的突變的 FGFR3。為 了方便起見, 術語 “包含對應于 FGFR3-IIIbK652E 的突變″理解為包涵 FGFR3-IIIbK652E 和 FGFR3-IIIcK650E, 以及另外的包含在對應于 FGFR3-IIIb K652 的位置處的 K 至 E 突變的 FGFR3 形式。本領域普通技術人員理解如何比對 FGFR3 序列從而鑒定各個 FGFR3 序列之間的對應 殘基, 例如, 比對 FGFR3-IIIc 序列與 FGFR3-IIIb 序列以鑒定 FGFR3 中的對應 FGFR3-IIIb 中 的 K652 位置的位置。在一些實施方案中, 所述抗 -FGFR3 抗體抑制 FGFR3-IIIbK652E 和 / 或 FGFR3-IIIcK650E。
     在一個方面, 抗 -FGFR3 抗體抑制包含對應于 FGFR3-IIIbS249C 的突變的 FGFR3。為 了方便起見, 術語 “包含對應于 FGFR3-IIIbS249C 的突變″理解為包涵 FGFR3-IIIb S249C 和 FGFR3-IIIc S249C, 以及另外的包含在對應于 FGFR3-IIIb S249 的位置處的 S 至 C 突變的 FGFR3 形式。 在一些實施方案中, 所述抗 -FGFR3 抗體抑制 FGFR3-IIIbS249C 和 / 或 FGFR3-IIIc
     7102378767 A CN 102378777S249C說明書4/107 頁。在一個方面, 抗 -FGFR3 抗體抑制包含對應于 FGFR3-IIIbG372C 的突變的 FGFR3。為 了方便起見, 術語 “包含對應于 FGFR3-IIIbG372C 的突變″理解為包涵 FGFR3-IIIb G372C 和 FGFR3-IIIc G370C, 以及另外的包含在對應于 FGFR3-IIIb G372 的位置處的 G 至 C 突變的 FGFR3 形式。 在一些實施方案中, 所述抗 -FGFR3 抗體抑制 FGFR3-IIIbG372C 和 / 或 FGFR3-IIIc G370C 。
     在一個方面, 抗 -FGFR3 抗體抑制包含對應于 FGFR3-IIIbY375C 的突變的 FGFR3。為 了方便起見, 術語 “包含對應于 FGFR3-IIIbY375C 的突變″理解為包涵 FGFR3-IIIbY375C 和 FGFR3-IIIcY373C, 以及另外的包含在對應于 FGFR3-IIIb S249 的位置處的 S 至 C 突變的 FGFR3 形式。在一些實施方案中, 所述抗 -FGFR3 抗體抑制 FGFR3-IIIbY375C 和 / 或 FGFR3-IIIcY373C。
     在 一 個 方 面, 抗 -FGFR3 抗 體 抑 制 (a)FGFR3-IIIbK652E 和 (b)FGFR3-IIIbR248C, FGFR3-IIIbY375C, FGFR3-IIIbS249C, 和 FGFR3IIIb G372C 中的一種或多種。
     在 一 個 方 面, 抗 -FGFR3 抗 體 抑 制 (a)FGFR3-IIIcK650E 和 (b)FGFR3-IIIcR248C, FGFR3-IIIcY373C, FGFR3-IIIcS249C, 和 FGFR3IIIc G370C 中的一種或多種。
     在 一 個 方 面, 抗 -FGFR3 抗 體 抑 制 (a)FGFR3-IIIbR248C 和 (b)FGFR3-IIIbK652E, FGFR3-IIIbY375C, FGFR3-IIIbS249C, 和 FGFR3-IIIbG372C 中的一種或多種。
     在 一 個 方 面, 抗 -FGFR3 抗 體 抑 制 (a)FGFR3-IIIcR248C 和 (b)FGFR3-IIIcK650E, FGFR3-IIIcY373C, FGFR3-IIIcS249C, 和 FGFR3-IIIcG370C 中的一種或多種。
     在 一 個 方 面, 抗 -FGFR3 抗 體 抑 制 (a)FGFR3-IIIbG372C 和 (b)FGFR3-IIIbK652E, FGFR3-IIIbY375C, FGFR3-IIIbS249C, 和 FGFR3-IIIbR248C 中的一種或多種。
     在 一 個 方 面, 抗 -FGFR3 抗 體 抑 制 (a)FGFR3-IIIcG370C 和 (b)FGFR3-IIIcK650E, FGFR3-IIIcY373C, FGFR3-IIIcS249C, 和 FGFR3-IIIcR248C 中的一種或多種。
     在一個方面, 抗 -FGFR3 抗體抑制 FGFR3-IIIbR248C, FGFR3-IIIbK652E, FGFR3-IIIbY375C, FGFR3-IIIb S249C, 和 FGFR3-IIIb G372C。
     在一個方面, 抗 -FGFR3 抗體抑制 FGFR3-IIIcR248C, FGFR3-IIIcK650E, FGFR3-IIIcY373C, FGFR3-IIIc S249C, 和 FGFR3-IIIc G370C。
     在一個方面, 本發明提供了分離的抗 -FGFR3 抗體, 其包含 :
     (a) 至少一個、 兩個、 三個、 四個或五個高變區 (HVR) 序列, 所述高變區序列選自 :
     (i)HVR-L1, 其包含序列 A1-A11, 其中 A1-A11 是 RASQDVDTSLA(SEQ ID NO : 87),
     (ii)HVR-L2, 其包含序列 B1-B7, 其中 B1-B7 是 SASFLYS(SEQ IDNO : 88),
     (iii)HVR-L3, 其包含序列 C1-C9, 其中 C1-C9 是 QQSTGHPQT(SEQ ID NO : 89),
     (iv)HVR-H1, 其包含序列 D1-D10, 其中 D1-D10 是 GFTFTSTGIS(SEQ ID NO : 84),
     (v)HVR-H2, 其包含序列 E1-E18, 其中 E1-E18 是 GRIYPTSGSTNYADSVKG(SEQ ID NO : 85), 和
     (vi)HVR-H3, 其包含序列 F1-F20, 其中 F1-F20 是 ARTYGIYDLYVDYTEYVMDY(SEQ ID NO : 86) ; 和
     (b) 至少一個變體 HVR, 其中所述變體 HVR 序列包含 SEQ IDNOS : 1-18, 48-131 和 140-145 中所示的序列的至少一個殘基 ( 至少兩個殘基, 至少三個或更多個殘基 ) 的修飾。 所述修飾合意的是置換、 插入或缺失。
     在一些實施方案中, HVR-L1 變體包含下列位置的任意組合中的 1-6 個 (1, 2, 3, 4, 5, 或 6 個 ) 置換 : A5(V 或 D), A6(V 或 I), A7(D, E 或 S), A8(T 或 I), A9(A 或 S) 和 A10(V 或 L)。在一些實施方案中, HVR-L2 變體包含下列位置的任意組合中的 1-2 個 (1 或 2 個 ) 置 換: B1(S 或 G), B4(F 或 S 或 T) 和 B6(A 或 Y)。在一些實施方案中, HVR-L3 變體包含下列 位置的任意組合中的 1-6 個 (1, 2, 3, 4, 5, 或 6 個 ) 置換 : C3(G 或 S 或 T), C4(T 或 Y 或 A), C5(G 或 S 或 T 或 A), C6(A 或 H 或 D 或 T 或 N), C7(Q 或 P 或 S), 和 C8(S 或 Y 或 L 或 P 或 Q)。 在一些實施方案中, HVR-H1 變體包含下列位置的任意組合中的 1-3 個 (1, 2, 或 3 個 ) 置換 : D3(S 或 T), D5(W 或 Y 或 S 或 T), D6(S 或 G 或 T)。在一些實施方案中, HVR-H2 變體包含下 列位置的任意組合中的 1-6 個 (1, 2, 3, 4, 5, 或 6) 置換 : E2(R 或 S), E6(Y 或 A 或 L 或 S 或 T), E7(A 或 Q 或 D 或 G 或 Y 或 S 或 N 或 F), E8(A 或 D 或 G), E9(T 或 S), E10(K 或 F 或 T 或 S), E11(Y 或 H 或 N 或 I)。
     在一個方面, 本發明提供了分離的抗 -FGFR3 抗體, 其包含 :
     (a) 至少一個、 兩個、 三個、 四個或五個高變區 (HVR) 序列, 所述高變區序列選自 :
     (i)HVR-L1, 其包含序列 RASQX1X2X3X4X5X6A, 其中 X1 是 V 或 D, X2 是 V 或 I, X3 是 D, E 或 S, X4 是 T 或 I, X5 是 A 或 S, 和 X6 是 V 或 L(SEQID NO : 146),
     (ii)HVR-L2, 其包含序列 X1ASFLX2S, 其中 X1 是 S 或 G 且 X2 是 A 或 Y(SEQ ID NO : 147),
     (iii)HVR-L3, 其包含序列 QQX1X2X3X4X5X6T, 其中 X1 是 G, S 或 T, X2 是 T, Y 或 A, X3 是 G, S, T, 或 A, X4 是 A, H, D, T, 或 N, X5 是 Q, P 或 S, X6 是 S, Y, L, P 或 Q(SEQ ID NO : 148),
     (iv)HVR-H1, 其包含序列 GFX1FX2X3TGIS, 其中 X1 是 S 或 T, X2 是 W, Y, S 或 T, X3 是 S, G, 或 T(SEQ ID NO : 149),
     (v)HVR-H2, 其包含序列 GRIYPX1X2X3X4X5X6YADSVKG, 其中 X1 是 Y, A, L, S, 或 T, X2 是 A, Q, D, G, Y, S, N 或 F, X3 是 A, D, 或 G, X4 是 T 或 S, X5 是 K, F, T, 或 S, X6 是 Y, H, N 或 I(SEQ ID NO : 150), 和
     (vi)HVR-H3, 其包含序列 ARTYGIYDLYVDYTEYVMDY(SEQ IDNO : 151)。
     在一些實施方案中, HVR-L1 包含序列 RASQX1VX2X3X4VA, 其中 X1 是 V 或 D, X2 是 D, E 或 S, X3 是 T 或 I, X4 是 A 或 S(SEQ ID NO : 152)。在一些實施方案中, HVR-L3 包含序列 QQX1X2X3X4X5X6T, 其中 X1 是 S, G, 或 T, X2 是 Y, T, 或 A, X3 是 T 或 G, X4 是 T, H 或 N, X5 是 P 或 S, X6 是 P, Q, Y, 或 L(SEQ ID NO : 153)。 在一些實施方案中, HVR-H2 包含序列 GRIYPX1X2GSTX3YADSVKG, 其中 X1 是 T 或 L, X2 是 N, Y, S, G, A, 或Q; X3 是 N 或 H(SEQ ID NO : 154)。
     在另一個方面, 本發明的特征在于分離的抗 -FGFR3 抗體, 所述分離的抗 -FGFR3 抗 體包含一個、 兩個、 三個、 四個、 五個或六個 HVR, 其中各個 HVR 包含選自下列的序列, 由選自 下列的序列組成, 或基本上由選自下列的序列組成 : SEQ ID NOS : 1-18, 48-131 和 140-145, 并且其中 SEQID NO : 1, 7, 13, 48, 54, 60, 66, 72, 78, 84, 90, 96, 102, 108, 114, 120, 126 或 143 對應于 HVR-H1, SEQ ID NO : 2, 8, 14, 49, 55, 61, 67, 73, 79, 85, 91, 97, 103, 109, 115, 121, 127 或 144 對 應 于 HVR-H2, SEQ ID NO : 3, 9, 15, 50, 56, 62, 68, 74, 80, 86, 92, 98, 104, 110, 116, 122, 128 或 145 對應于 HVR-H3, SEQ ID NO : 4, 10, 16, 51, 57, 63, 69, 75, 81, 87, 93, 99, 105, 111, 117, 123, 129 或 140 對應于 HVR-L1, SEQ ID NO : 5, 11, 17, 52, 58, 64, 70, 76, 82, 88, 94, 100, 106, 112, 118, 124, 130 或 141 對應于 HVR-L2, 且 SEQ ID NO : 6, 12, 18, 53, 59, 65, 71, 77,83, 89, 95, 101, 107, 113, 119, 125, 131 或 142 對應于 HVR-L3。
     在一個方面, 本發明提供包含 HVR-H1 的抗 -FGFR3 抗體, 所述 HVR-H1 包含 SEQ ID NO : 1, 7, 13, 48, 54, 60, 66, 72, 78, 84, 90, 96, 102, 108, 114, 120, 126 或 143 的序列。
     在一個方面, 本發明提供包含 HVR-H2 的抗 -FGFR3 抗體, 所述 HVR-H2 包含 SEQ ID NO : 2, 8, 14, 49, 55, 61, 67, 73, 79, 85, 91, 97, 103, 109, 115, 121, 127 或 144 的序列。
     在一個方面, 本發明提供包含 HVR-H3 的抗 -FGFR3 抗體, 所述 HVR-H3 包含 SEQ ID NO : 3, 9, 15, 50, 56, 62, 68, 74, 80, 86, 92, 98, 104, 110, 116, 122, 128 或 145 的序列。
     在一個方面, 本發明提供包含 HVR-L1 區的抗 -FGFR3 抗體, 所述 HVR-L1 區包含 SEQ ID NO : 4, 10, 16, 51, 57, 63, 69, 75, 81, 87, 93, 99, 105, 111, 117, 123, 129 或 140 的序列。
     在一個方面, 本發明提供包含 HVR-L2 區的抗 -FGFR3 抗體, 所述 HVR-L2 區包含 SEQ ID NO : 5, 11, 17, 52, 58, 64, 70, 76, 82, 88, 94, 100, 106, 112, 118, 124, 130 或 141 的序列。
     在一個方面, 本發明提供包含 HVR-L3 區的抗 -FGFR3 抗體, 所述 HVR-L3 區包含 SEQ ID NO : 6, 12, 18, 53, 59, 65, 71, 77, 83, 89, 95, 101, 107, 113, 119, 125, 131 或 142 的序列。
     在一個方面, 抗 -FGFR3 抗體包含重鏈可變區和 / 或輕鏈可變區, 所述重鏈可變區 包含 HVR-H1, HVR-H2, HVR-H3, 其中各個按順序地包含 SEQ ID NO : 1, 2, 3, 所述輕鏈可變區 包含 HVR-L1, HVR-L2, 和 HVR-L3, 其中各個按順序地包含 SEQ ID NO : 4, 5, 6。 在另一個方面, 抗 -FGFR3 抗體包含重鏈可變區和 / 或輕鏈可變區, 所述重鏈可變 區包含 HVR-H1, HVR-H2, HVR-H3, 其中各個按順序地包含 SEQ ID NO : 7, 8, 9, 所述輕鏈可變 區包含 HVR-L1, HVR-L2, 和 HVR-L3, 其中各個按順序地包含 SEQ ID NO : 10, 11, 12。
     在另一個方面, 抗 -FGFR3 抗體包含重鏈可變區和 / 或輕鏈可變區, 所述重鏈可變 區包含 HVR-H1, HVR-H2, HVR-H3, 其中各個按順序地包含 SEQ ID NO : 13, 14, 15, 所述輕鏈可 變區包含 HVR-L1, HVR-L2, 和 HVR-L3, 其中各個按順序地包含 SEQ ID NO : 16, 17, 18。
     在另一個方面, 抗 -FGFR3 抗體包含重鏈可變區和 / 或輕鏈可變區, 所述重鏈可變 區包含 HVR-H1, HVR-H2, HVR-H3, 其中各個按順序地包含 SEQ ID NO : 48, 49, 50, 所述輕鏈可 變區包含 HVR-L1, HVR-L2, 和 HVR-L3, 其中各個按順序地包含 SEQ ID NO : 51, 52, 53。
     在另一個方面, 抗 -FGFR3 抗體包含重鏈可變區和 / 或輕鏈可變區, 所述重鏈可變 區包含 HVR-H1, HVR-H2, HVR-H3, 其中各個按順序地包含 SEQ ID NO : 54, 55, 56, 所述輕鏈可 變區包含 HVR-L1, HVR-L2, 和 HVR-L3, 其中各個按順序地包含 SEQ ID NO : 57, 58, 59。
     在另一個方面, 抗 -FGFR3 抗體包含重鏈可變區和 / 或輕鏈可變區, 所述重鏈可變 區包含 HVR-H1, HVR-H2, HVR-H3, 其中各個按順序地包含 SEQ ID NO : 60, 61, 62, 63, 所述輕 鏈可變區包含 HVR-L1, HVR-L2, 和 HVR-L3, 其中各個按順序地包含 SEQ ID NO : 63, 64, 65。
     在另一個方面, 抗 -FGFR3 抗體包含重鏈可變區和 / 或輕鏈可變區, 所述重鏈可變 區包含 HVR-H1, HVR-H2, HVR-H3, 其中各個按順序地包含 SEQ ID NO : 66, 67, 68, 所述輕鏈可 變區包含 HVR-L1, HVR-L2, 和 HVR-L3, 其中各個按順序地包含 SEQ ID NO : 69, 70, 71。
     在另一個方面, 抗 -FGFR3 抗體包含重鏈可變區和 / 或輕鏈可變區, 所述重鏈可變 區包含 HVR-H1, HVR-H2, HVR-H3, 其中各個按順序地包含 SEQ ID NO : 72, 73, 74, 所述輕鏈可 變區包含 HVR-L1, HVR-L2, 和 HVR-L3, 其中各個按順序地包含 SEQ ID NO : 75, 76, 77。
     在另一個方面, 抗 -FGFR3 抗體包含重鏈可變區和 / 或輕鏈可變區, 所述重鏈可變 區包含 HVR-H1, HVR-H2, HVR-H3, 其中各個按順序地包含 SEQ ID NO : 78, 7980, 所述輕鏈可
     變區包含 HVR-L1, HVR-L2, 和 HVR-L3, 其中各個按順序地包含 SEQ ID NO : 81, 82, 83。
     在另一個方面, 抗 -FGFR3 抗體包含重鏈可變區和 / 或輕鏈可變區, 所述重鏈可變 區包含 HVR-H1, HVR-H2, HVR-H3, 其中各個按順序地包含 SEQ ID NO : 84, 85, 86, 所述輕鏈可 變區包含 HVR-L1, HVR-L2, 和 HVR-L3, 其中各個按順序地包含 SEQ ID NO : 87, 88, 89。
     在另一個方面, 抗 -FGFR3 抗體包含重鏈可變區和 / 或輕鏈可變區, 所述重鏈可變 區包含 HVR-H1, HVR-H2, HVR-H3, 其中各個按順序地包含 SEQ ID NO : 90, 91, 92, 所述輕鏈可 變區包含 HVR-L1, HVR-L2, 和 HVR-L3, 其中各個按順序地包含 SEQ ID NO : 93, 94, 95。
     在另一個方面, 抗 -FGFR3 抗體包含重鏈可變區和 / 或輕鏈可變區, 所述重鏈可變 區包含 HVR-H1, HVR-H2, HVR-H3, 其中各個按順序地包含 SEQ ID NO : 96, 97, 98, 所述輕鏈可 變區包含 HVR-L1, HVR-L2, 和 HVR-L3, 其中各個按順序地包含 SEQ ID NO : 99, 100, 101。
     在另一個方面, 抗 -FGFR3 抗體包含重鏈可變區和 / 或輕鏈可變區, 所述重鏈可變 區包含 HVR-H1, HVR-H2, HVR-H3, 其中各個按順序地包含 SEQ ID NO : 102, 103, 104, 所述輕鏈 可變區包含 HVR-L1, HVR-L2, 和 HVR-L3, 其中各個按順序地包含 SEQ ID NO : 105, 106, 107。
     在另一個方面, 抗 -FGFR3 抗體包含重鏈可變區和 / 或輕鏈可變區, 所述重鏈可變 區包含 HVR-H1, HVR-H2, HVR-H3, 其中各個按順序地包含 SEQ ID NO : 108, 109, 110, 所述輕鏈 可變區包含 HVR-L1, HVR-L2, 和 HVR-L3, 其中各個按順序地包含 SEQ ID NO : 111, 112, 113。 在另一個方面, 抗 -FGFR3 抗體包含重鏈可變區和 / 或輕鏈可變區, 所述重鏈可變 區包含 HVR-H1, HVR-H2, HVR-H3, 其中各個按順序地包含 SEQ ID NO : 114, 115, 116, 所述輕鏈 可變區包含 HVR-L1, HVR-L2, 和 HVR-L3, 其中各個按順序地包含 SEQ ID NO : 117, 118, 119。
     在另一個方面, 抗 -FGFR3 抗體包含重鏈可變區和 / 或輕鏈可變區, 所述重鏈可變 區包含 HVR-H1, HVR-H2, HVR-H3, 其中各個按順序地包含 SEQ ID NO : 120, 121, 122, 所述輕鏈 可變區包含 HVR-L1, HVR-L2, 和 HVR-L3, 其中各個按順序地包含 SEQ ID NO : 123, 124, 125。
     在另一個方面, 抗 -FGFR3 抗體包含重鏈可變區和 / 或輕鏈可變區, 所述重鏈可變 區包含 HVR-H1, HVR-H2, HVR-H3, 其中各個按順序地包含 SEQ ID NO : 126, 127, 128, 所述輕鏈 可變區包含 HVR-L1, HVR-L2, 和 HVR-L3, 其中各個按順序地包含 SEQ ID NO : 129, 130, 131。
     在另一個方面, 抗 -FGFR3 抗體包含重鏈可變區和 / 或輕鏈可變區, 所述重鏈可變 區包含 HVR-H1, HVR-H2, HVR-H3, 其中各個按順序地包含 SEQ ID NO : 140, 141, 142, 所述輕鏈 可變區包含 HVR-L1, HVR-L2, 和 HVR-L3, 其中各個按順序地包含 SEQ ID NO : 143, 144, 145。
     SEQ ID NOs : 1-18, 48-131 和 140-145 的氨基酸序列關于如圖 1 中所示的單個 HVR( 即, H1, H2 或 H3) 進行編號, 所述編號與如下所述的 Kabat 編號系統一致。
     在另一個方面, 抗 -FGFR3 抗體包含重鏈可變區和輕鏈可變區, 所述重鏈可變區包 含 SEQ ID NO : 132。
     在另一個方面, 抗 -FGFR3 抗體包含輕鏈可變區和重鏈可變區, 所述輕鏈可變區包 含 SEQ ID NO : 133。
     在另一個方面, 抗 -FGFR3 抗體包含重鏈可變區和輕鏈可變區, 所述重鏈可變區包 含 SEQ ID NO : 132, 所述輕鏈可變區包含 SEQ ID NO : 133。
     在另一個方面, 抗 -FGFR3 抗體包含重鏈可變區和輕鏈可變區, 所述重鏈可變區包 含 SEQ ID NO : 134。
     在另一個方面, 抗 -FGFR3 抗體包含輕鏈可變區和重鏈可變區, 所述輕鏈可變區包
     含 SEQ ID NO : 135。
     在另一個方面, 抗 -FGFR3 抗體包含輕鏈可變區和重鏈可變區, 所述輕鏈可變區包 含 SEQ ID NO : 139。
     在另一個方面, 抗 -FGFR3 抗體包含重鏈可變區和輕鏈可變區, 所述重鏈可變區包 含 SEQ ID NO : 134, 所述輕鏈可變區包含 SEQ ID NO : 135。
     在另一個方面, 抗 -FGFR3 抗體包含重鏈可變區和輕鏈可變區, 所述重鏈可變區包 含 SEQ ID NO : 136。
     在另一個方面, 抗 -FGFR3 抗體包含輕鏈可變區和重鏈可變區, 所述輕鏈可變區包 含 SEQ ID NO : 137。
     在另一個方面, 抗 -FGFR3 抗體包含重鏈可變區和輕鏈可變區, 所述重鏈可變區包 含 SEQ ID NO : 136, 所述輕鏈可變區包含 SEQ ID NO : 137。
     在另一個方面, 抗 -FGFR3 抗體包含重鏈可變區和輕鏈可變區, 所述重鏈可變區包 含 SEQ ID NO : 138。
     在另一個方面, 抗 -FGFR3 抗體包含輕鏈可變區和重鏈可變區, 所述輕鏈可變區包 含 SEQ ID NO : 139。 在另一個方面, 抗 -FGFR3 抗體包含重鏈可變區和輕鏈可變區, 所述重鏈可變區包 含 SEQ ID NO : 138, 所述輕鏈可變區包含 SEQ ID NO : 139。
     在一個方面, 本發明提供抗 -FGFR3 抗體, 所述抗 -FGFR3 抗體包含 : 至少一個、 兩 個、 三個、 四個、 五個或六個高變區 (HVR) 序列, 所述高變區序列選自由下列各項組成的組 :
     (a)HVR-L1, 其包含序列 SASSSVSYMH(SEQ ID NO : 155), SASSSVSYMH(SEQ ID NO : 156) 或 LASQTIGTWLA(SEQ ID NO : 157),
     (b)HVR-L2, 其包含序列 TWIYDTSILAS(SEQ ID NO : 158), RWIYDTSKLAS(SEQ ID NO : 159), 或 LLIYAATSLAD(SEQ ID NO : 160),
     (c)HVR-L3, 其 包 含 序 列 QQWTSNPLT(SEQ ID NO : 161), QQWSSYPPT(SEQ ID NO : 162), 或 QQLYSPPWT(SEQ ID NO : 163),
     (d)HVR-H1, 其包含序列 GYSFTDYNMY(SEQ ID NO : 164), GYVFTHYNMY(SEQ ID NO : 165), 或 GYAFTSYNMY(SEQ ID NO : 166),
     (e)HVR-H2 , 其 包 含 序 列 WIGYIEPYNGGTSYNQKFKG(SEQ IDNO : 167) , WIGYIEPYNGGTSYNQKFKG(SEQ ID NO : 168), 或 WIGYIDPYIGGTSYNQKFKG(SEQ ID NO : 169), 和
     (f)HVR-H3 包含序列 ASPNYYDSSPFAY(SEQ ID NO : 170), ARGQGPDFDV(SEQ ID NO : 171), 或 ARWGDYDVGAMDY(SEQ IDNO : 172)。
     在一個方面, 本發明提供抗 -FGFR3 抗體, 其包含 : 至少一個、 兩個、 三個、 四個、 五 個或六個高變區 (HVR) 序列, 所述高變區序列選自由下列各項組成的組 :
     (a)HVR-L1, 其包含序列 SASSSVSYMH(SEQ ID NO : 155),
     (b)HVR-L2, 其包含序列 TWIYDTSILAS(SEQ ID NO : 158),
     (c)HVR-L3, 其包含序列 QQWTSNPLT(SEQ ID NO : 161),
     (d)HVR-H1, 其包含序列 GYSFTDYNMY(SEQ ID NO : 164),
     (e)HVR-H2, 其包含序列 WIGYIEPYNGGTSYNQKFKG(SEQ IDNO : 167), 和
     (f)HVR-H3, 其包含序列 ASPNYYDSSPFAY(SEQ ID NO : 170)。
     在一個方面, 本發明提供抗 -FGFR3 抗體, 其包含 : 至少一個、 兩個、 三個、 四個、 五 個或六個高變區 (HVR) 序列, 所述高變區序列選自由下列各項組成的組 :
     (a)HVR-L1, 其包含序列 SASSSVSYMH(SEQ ID NO : 156),
     (b)HVR-L2, 其包含序列 RWIYDTSKLAS(SEQ ID NO : 159),
     (c)HVR-L3, 其包含序列 QQWSSYPPT(SEQ ID NO : 162),
     (d)HVR-H1, 其包含序列 GYVFTHYNMY(SEQ ID NO : 165),
     (e)HVR-H2, 其包含序列 WIGYIEPYNGGTSYNQKFKG(SEQ IDNO : 168), 和
     (f)HVR-H3, 其包含序列 ARGQGPDFDV(SEQ ID NO : 171).
     在一個方面, 本發明提供抗 -FGFR3 抗體, 其包含 : 至少一個、 兩個、 三個、 四個、 五 個或六個高變區 (HVR) 序列, 所述高變區序列選自由下列各項組成的組 :
     (a)HVR-L1, 其包含序列 LASQTIGTWLA(SEQ ID NO : 157),
     (b)HVR-L2, 其包含序列 LLIYAATSLAD(SEQ ID NO : 160),
     (c)HVR-L3, 其包含序列 QQLYSPPWT(SEQ ID NO : 163),
     (d)HVR-H1, 其包含序列 GYAFTSYNMY(SEQ ID NO : 166),
     (e)HVR-H2, 其包含序列 WIGYIDPYIGGTSYNQKFKG(SEQ IDNO : 169), 和
     (f)HVR-H3, 其包含序列 ARWGDYDVGAMDY(SEQ ID NO : 172)。
     在一個方面, 本發明提供抗 -FGFR3 抗體, 所述抗 -FGFR3 抗體包含 : (a) 輕鏈, 所述 輕鏈包含 : (i)HVR-L1, 其包含序列 SASSSVSYMH(SEQ IDNO : 155) ; (ii)HVR-L2, 其包含序列 TWIYDTSILAS(SEQ ID NO : 158) ; 和 (iii)HVR-L3, 其包含序列 QQWTSNPLT(SEQ ID NO : 161) ; 和 / 或 (b) 重鏈, 所述重鏈包含 : (i)HVR-H1, 其包含序列 GYSFTDYNMY(SEQ IDNO : 164) ; (ii) HVR-H2, 其包含序列 WIGYIEPYNGGTSYNQKFKG(SEQID NO : 167) ; 和 (iii)HVR-H3, 其包含序列 ASPNYYDSSPFAY(SEQ IDNO : 170)。
     在一個方面, 本發明提供抗 -FGFR3 抗體, 所述抗 -FGFR3 抗體包含 : (a) 輕鏈, 其包含: (i)HVR-L1, 其 包 含 序 列 SASSSVSYMH(SEQ IDNO : 156) ; (ii)HVR-L2, 其包含序 列 RWIYDTSKLAS(SEQ ID NO : 159) ; 和 (iii)HVR-L3, 其包含序列 QQWSSYPPT(SEQ ID NO : 162) ; 和 / 或 (b) 重鏈, 其包含 : (i)HVR-H1 包含序列 GYVFTHYNMY(SEQ ID NO : 165) ; (ii) HVR-H2, 其包含序列 WIGYIEPYNGGTSYNQKFKG(SEQ ID NO : 168) ; 和 (iii)HVR-H3, 其包含序 列 ARGQGPDFDV(SEQ ID NO : 171)。
     在一個方面, 本發明提供抗 -FGFR3 抗體, 所述抗 -FGFR3 抗體包含 : (a) 輕鏈, 其包含 : (i)HVR-L1, 其包含序列 LASQTIGTWLA(SEQ IDNO : 157) ; (ii)HVR-L2, 其包含序列 LLIYAATSLAD(SEQ ID NO : 160) ; 和 (iii)HVR-L3, 其包含序列 QQLYSPPWT(SEQ ID NO : 163) ; 和 / 或 (b) 重 鏈, 其包含 : (i)HVR-H1, 其 包 含 序 列 GYAFTSYNMY(SEQ ID NO : 166) ; (ii) HVR-H2, 其包含序列 WIGYIDPYIGGTSYNQKFKG(SEQ ID NO : 169) ; 和 (iii)HVR-H3, 其包含序 列 ARWGDYDVGAMDY(SEQ ID NO : 172)。本發明的抗體的一些實施方案包含如下面 SEQ ID NO : 173 中所示的人源化 4D5 抗體 (huMAb4D5-8)( Genentech, Inc., South SanFrancisco, CA, USA)( 也在美國專利號 6,407,213 和 Lee 等 ., J.Mol.Biol.( 分子生物 學雜志 )(2004), 340(5) : 1073-1093 中提及 ) 的輕鏈可變結構域。
     I Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
     Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val13Thr Ala102378767 A CN 102378777
     說明書10/107 頁Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro GluAsp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Thr Thr Pro Pro Thr
     Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 107(SEQ ID NO : 173)
     (HVR 殘基被下劃線 )
     在一個實施方案中, huMAb4D5-8 輕鏈可變結構域序列在位置 30, 66, 和 91( 分別 如上面以粗體 / 斜體所示的 Asn, Arg, 和 His) 中的一個或多個處被修飾。在具體的實施方 案中, 修飾的 huMAb4D5-8 序列包含位置 30 中的 Ser, 位置 66 中的 Gly, 和 / 或位置 91 中的 Ser。 因此, 在一個實施方案中, 本發明的抗體包含輕鏈可變結構域, 所述輕鏈可變結構域包 含下面 SEQ ID NO : 174 中所示的序列 :
     I Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
     Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Thr Ala
     Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
     Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
     Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Thr Thr Pro Pro ThrPhe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 107(SEQ ID NO : 174)
     (HVR 殘基被下劃線 )
     關于 huMAb4D5-8 的置換殘基以粗體 / 斜體指示。
     本發明的抗體可以包含任何合適的構架可變結構域序列, 條件是基本上保留與 FGFR3 的結合活性。例如, 在一些實施方案中, 本發明的抗體包含人亞組 III 重鏈構架共有 序列。在這些抗體的一個實施方案中, 構架共有序列包含位置 71, 73, 和 / 或 78 處的置換。 在這些抗體的一些實施方案中, 位置 71 是 A, 73 是 T 和 / 或 78 是 A。在一個實施方案中, 這些抗體包含 huMAb4D5-8( Genentech, Inc., South San Francisco, CA, USA)( 也在美國專利號 6,407,213 和 5,821,337, 和 Lee 等 ., J.Mol.Biol.( 分子生物學雜 志 )(2004), 340(5) : 1073-1093 中提及 ) 的重鏈可變結構域構架序列。在一個實施方案中, 這些抗體還包含人 κI 輕鏈構架共有序列。在具體的實施方案中, 這些抗體包含如美國專 利號 6,407,213 和 5,821,337 中所述的 huMAb4D5-8 的輕鏈 HVR 序列。在一個實施方案中, 這些抗體包含 huMAb4D5-8( Genentech, Inc., South San Francisco, CA, USA)( 也在美國專利號 6,407,213 和 5,821,337, 和 Lee 等 ., J.Mol.Biol.( 分子生物學雜 志 )(2004), 340(5) : 1073-1093 中提及 ) 的輕鏈可變結構域序列。
     在一個實施方案中, 本發明的抗體包含重鏈可變結構域, 其中構架序列包含 SEQ ID NOS : 19 和 203-205, 20 和 206-208, 21 和 209-211, 22 和 212-214, 23 和 215-217, 24 和 218-220, 25 和 221-223, 26 和 224-226, 27 和 227-229, 28 和 230-232, 29 和 233-235, 30 和 236-238, 31 和 239-241, 32 和 242-244, 33 和 245-247, 34 和 248-250, 35 和 251-253, 36 和 254-256, 和 / 或 37 和 257-259 的序列, 并且 HVR H1, H2, 和 H3 序列分別是 SEQ IDNOS : 13, 14 和 / 或 15。在另一個實施方案中, 所述構架序列包含 SEQ IDNOS : 19 和 203-205, 20 和 206-208, 21 和 209-211, 22 和 212-214, 23 和 215-217, 24 和 218-220, 25 和 221-223, 26 和224-226, 27 和 227-229, 28 和 230-232, 29 和 233-235, 30 和 236-238, 31 和 239-241, 32 和 242-244, 33 和 245-247, 34 和 248-250, 35 和 251-253, 36 和 254-256, 和 / 或 37 和 257-259 的序列, 并且 HVR H1, H2, 和 H3 序列分別是 SEQ ID NOS : 48, 49 和 / 或 50。還在另一個實施 方案中, 所述構架序列包含 SEQ ID NOS : 19 和 203-205, 20 和 206-208, 21 和 209-211, 22 和 212-214, 23 和 215-217, 24 和 218-220, 25 和 221-223, 26 和 224-226, 27 和 227-229, 28 和 230-232, 29 和 233-235, 30 和 236-238, 31 和 239-241, 32 和 242-244, 33 和 245-247, 34 和 248-250, 35 和 251-253, 36 和 254-256, 和 / 或 37 和 257-259 的序列, 并且 HVR H1, H2, 和 H3 序列分別是 SEQ ID NOS : 84, 85, 和 / 或 86。在進一步的實施方案中, 所述構架序列包含 SEQ ID NOS : 19 和 203-205, 20 和 206-208, 21 和 209-211, 22 和 212-214, 23 和 215-217, 24 和 218-220, 25 和 221-223, 26 和 224-226, 27 和 227-229, 28 和 230-232, 29 和 233-235, 30 和 236-238, 31 和 239-241, 32 和 242-244, 33 和 245-247, 34 和 248-250, 35 和 251-253, 36 和 254-256, 和 / 或 37 和 257-259 的序列, 并且 HVR H1, H2, 和 H3 序列分別是 SEQ IDNOS : 108, 109, 和 / 或 110。
     在具體的實施方案中, 本發明的抗體包含輕鏈可變結構域, 其中構架序列包含 SEQ ID NOS : 38 和 260-262, 39 和 263-265, 40 和 266-268, 和 / 或 41 和 269-271 的序列, 并且 HVR L1, L2, 和 L3 序列分別是 SEQ IDNOS : 16, 17, 和 / 或 18。在另一個實施方案中, 本發明的抗 體包含輕鏈可變結構域, 其中構架序列包含 SEQ ID NOS : 38 和 260-262, 39 和 263-265, 40 和 266-268, 和 / 或 41 和 269-271 的序列, 并且 HVR L1, L2, 和 L3 序列分別是 SEQ ID NOS : 51, 52 和 / 或 53。在另外的實施方案中, 本發明的抗體包含輕鏈可變結構域, 其中構架序列 包含 SEQ ID NOS : 38 和 260-262, 39 和 263-265, 40 和 266-268, 和 / 或 41 和 269-271 的序 列, 并且 HVR L1, L2, 和 L3 序列分別是 SEQ ID NOS : 87, 88 和 / 或 89。還在另一個實施方案 中, 本發明的抗體包含輕鏈可變結構域, 其中構架序列包含 SEQ ID NOS : 38 和 260-262, 39 和 263-265, 40 和 266-268, 和 / 或 41 和 269-271 的序列, 并且 HVR L1, L2, 和 L3 序列分別 是 SEQ ID NOS : 111, 112, 和 / 或 113。
     在另一個方面, 本發明的抗體包含重鏈可變結構域和 / 或輕鏈可變結構域, 所述 重鏈可變結構域包含 SEQ ID NO : 132 的序列, 所述輕鏈可變結構域包含 SEQ ID NO : 133 的 序列。在另一個方面, 本發明的抗體包含重鏈可變結構域和 / 或輕鏈可變結構域, 所述重鏈 可變結構域包含 SEQ IDNO : 134 的序列, 所述輕鏈可變結構域包含 SEQ ID NO : 135 的序列。 在另一個方面, 本發明的抗體包含重鏈可變結構域和 / 或輕鏈可變結構域, 所述重鏈可變 結構域包含 SEQ ID NO : 136 的序列, 所述輕鏈可變結構域包含 SEQ ID NO : 137 的序列。在 另一個方面, 本發明的抗體包含重鏈可變結構域和 / 或輕鏈可變結構域, 所述重鏈可變結 構域包含 SEQ ID NO : 138 的序列, 所述輕鏈可變結構域包含 SEQ ID NO : 139 的序列。
     在一個方面, 本發明提供結合多肽的抗 -FGFR3 抗體, 所述多肽包含下列的氨基酸 序列, 基本上由下列的氨基酸序列組成或由下列的氨基酸序列組成 : LAVPAANTVRFRCPA(SEQ ID NO : 179) 和 / 或 SDVEFHCKVYSDAQP(SEQ ID NO : 180)。
     在一些實施方案中, 所述抗體結合多肽, 所述多肽包含成熟的人 FGFR3 氨基酸序 列的氨基酸數 164-178 和 / 或 269-283, 基本上由成熟的人 FGFR3 氨基酸序列的氨基酸數 164-178 和 / 或 269-283 組成或由成熟的人 FGFR3 氨基酸序列的氨基酸數 164-178 和 / 或 269-283 組成。在 一 個 實 施 方 案 中,本 發 明 的 抗 -FGFR3 抗 體 特 異 性 地 結 合 與 序 列 LAVPAANTVRFRCPA(SEQ ID NO : 179) 和 / 或 SDVEFHCKVYSDAQP(SEQ ID NO : 180) 具有至少 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%序列同一性或相似性的氨基酸序列。
     在一個方面, 本發明的抗 -FGFR3 抗體與 FGFR3IIIb 多肽的殘基 154, 155, 158, 159, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 177, 202, 205, 207, 210, 212, 214, 216, 217, 241, 246, 247, 248, 278, 279, 280, 281, 282, 283, 314, 315, 316, 317 和 / 或 318, 或 FGFR3IIIc 多肽的等效殘基中的至少一個、 兩個、 三個、 四個或至多達全部的任 意數目個殘基結合。本領域普通技術人員理解如何比對 FGFR3 序列從而鑒定各個 FGFR3 序 列之間的對應殘基。 兩個或多個殘基的組合可以包括 FGFR3IIIb 多肽的殘基 154, 155, 158, 159, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 177, 202, 205, 207, 210, 212, 214, 216, 217, 241, 246, 247, 248, 278, 279, 280, 281, 282, 283, 314, 315, 316, 317 和 / 或 318, 或 FGFR3IIIc 多肽的等效殘基中的任一個。在一些實施方案中, 抗 -FGFR3 抗 體 與 FGFR3IIIb 多 肽 的 殘 基 158, 159, 169, 170, 171, 173, 175, 205, 207, 和 / 或 315, 或 FGFR3IIIc 多肽的等效殘基中的至少一個、 兩個、 三個、 四個或至多達全部的任意數目個殘 基結合。在一些實施方案中, 抗 -FGFR3 抗體與 FGFR3IIIb 多肽的殘基 158, 170, 171, 173, 175, 和 / 或 315, 或 FGFR3IIIc 多肽的等效殘基中的至少一個、 兩個、 三個、 四個或至多達全 部的任意數目個殘基結合。 在一個方面, 本發明提供了抗 -FGFR3 抗體, 所述抗 -FGFR3 抗體與上面提及的抗體 中的任一個競爭與 FGFR3 的結合。 在一個方面, 本發明提供了抗 -FGFR3 抗體, 所述抗 -FGFR3 抗體結合與上面提及的抗體中的任一個所結合的相同或相似的 FGFR3 上的表位。
     如本領域中已知的那樣, 以及如下文更詳細描述的那樣, 對抗體的高變區劃界的 抗體的氨基酸位置 / 邊界可以根據具體情況和本領域中已知的各種定義 ( 如下所述 ) 而變 化。可變結構域內的一些位置可以視為雜合的超變位置, 因為根據一組標準這些位置可以 視為處于高變區內, 而根據不同組的標準這些位置可以被視為在高變區之外。這些位置中 的一個或多個也可見于擴展的高變區中 ( 如下面進一步定義 )。
     在一些實施方案中, 所述抗體是單克隆抗體。 在其他實施方案中, 所述抗體是多克 隆抗體。在一些實施方案中, 所述抗體選自由嵌合抗體、 親和力成熟抗體、 人源化抗體和人 抗體組成的組。在某些實施方案中, 所述抗體是抗體片段。在一些實施方案中, 所述抗體是 Fab, Fab′, Fab′ -SH, F(ab′ )2, 或 scFv。
     在一些實施方案中, FGFR3 抗體是包含 Fc 區的單臂抗體 ( 即, 重鏈可變結構域和 輕鏈可變結構域形成單個抗原結合臂 ), 其中 Fc 區包含第一和第二 Fc 多肽, 其中第一和第 二 Fc 多肽以復合體存在并形成 Fc 區, 所述 Fc 區與包含所述抗原結合臂的 Fab 分子相比增 加所述抗體片段的穩定性。參見, 例如, WO2006/015371。
     在一個實施方案中, 所述抗體是嵌合抗體, 例如, 包含移植至異源的非人、 人或人 源化序列 ( 例如, 構架和 / 或恒定結構域序列 ) 的來自非人供體的抗原結合序列的抗體。 在 一個實施方案中, 所述非人供體是小鼠。在進一步的實施方案中, 抗原結合序列是合成的, 例如, 通過誘變獲得 ( 例如, 噬菌體展示篩選等 )。 在具體的實施方案中, 本發明的嵌合抗體 具有鼠的 V 區和人的 C 區。在一個實施方案中, 鼠輕鏈 V 區與人 κ 輕鏈融合。在另一個實 施方案中, 鼠重鏈 V 區與人 IgG1C 區融合。
     本發明的人源化抗體包括在構架區 (FR) 中具有氨基酸置換的那些和在移植的 CDR 中有改變的親和力成熟變體。CDR 或 FR 中被置換的氨基酸不限于存在于供體或受體抗 體中的那些。在其他的實施方案中, 本發明的抗體還包含 Fc 區中的氨基酸殘基改變, 所述 改變導致提高的效應子功能, 包括增強的 CDC 和 / 或 ADCC 功能和 B- 細胞殺傷作用。 本發明 的其他抗體包括具有改善穩定性的特異性改變的那些。在其他實施方案中, 本發明的抗體 包含 Fc 區中的氨基酸殘基改變, 所述改變導致降低的效應子功能, 例如降低的 CDC 和 / 或 ADCC 功能和 / 或減小的 B- 細胞殺傷作用。 在一些實施方案中, 本發明的抗體的特征在于與 自然殺傷 (NK) 細胞上的人補體因子 C1q 和 / 或人 Fc 受體的結合減少 ( 諸如缺乏結合 )。 在一些實施方案中, 本發明的抗體的特征在于與人 FcγRI, FcγRIIA, 和 / 或 FcγRIIIA 的 結合減少 ( 諸如缺乏結合 )。在一些實施方案中, 本發明的抗體是 IgG 類 ( 例如, IgG1 或 IgG4) 并且包含 E233, L234, G236, D265, D270, N297, E318, K320, K322, A327, A330, P331, 和 / 或 P329( 根據 EU 指數編號 ) 中的至少一個突變。在一些實施方案中, 所述抗體包含突 變 L234A/L235A 或 D265A/N297A。
     在抗體包含 Fc 區的情況下, 與其結合的糖類可以改變。例如, 具有成熟的糖結 構 ( 所述糖結構缺少與抗體的 Fc 區連接的巖藻糖 ) 的抗體記述在美國專利申請號 US 2003/0157108(Presta, L.) 中。還參見 US2004/0093621(Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd)。 在與抗體的 Fc 區連接的糖中具有平分型 N- 乙酰氨基葡糖胺 (GlcNAc) 的抗體參見 WO 2003/011878, Jean-Mairet 等和美國專利號 6,602,684, Umana 等。在與抗體的 Fc 區連接 的寡糖中具有至少一個半乳糖殘基的抗體在 WO 1997/30087, Patel 等中報道。還參見, WO 1998/58964(Raju, S.) 和 WO 1999/22764(Raju, S.), 它們涉及與抗體的 Fc 區連接的糖發生 改變的抗體。還參見 US 2005/0123546(Umana 等 ), 其關于具有改變的糖基化作用的抗原 結合分子。在一個方面, 本發明提供了 FGFR3 結合多肽, 所述多肽包含本文提供的任一個抗 原結合序列, 其中所述 FGFR3 結合多肽特異性地結合 FGFR3, 例如, 人和 / 或犬和 / 或小鼠 FGFR3。
     本 發 明 的 抗 體 結 合 ( 諸 如 特 異 性 結 合 )FGFR3( 例 如, FGFR3-IIIb 和 / 或 FGFR3-IIIc), 并且在一些實施方案中, 可以調節 ( 例如, 抑制 )FGFR3 信號傳導 ( 諸如 FGFR3 磷酸化 ) 中的一個或多個方面和 / 或破壞任何生物學相關的 FGFR3 和 / 或 FGFR3 配體生物 學途徑, 和 / 或治療和 / 或預防腫瘤、 細胞增生性病癥或癌癥 ; 和 / 或治療或預防與 FGFR3 表達和 / 或活性 ( 諸如增加的 FGFR3 表達和 / 或活性 ) 相關的病癥。在一些實施方案中, FGFR3 抗體特異性結合由 FGFR3( 例如, 人或小鼠 FGFR3) 組成或基本上由 FGFR3( 例如, 人或 小鼠 FGFR3) 組成的多肽。在一些實施方案中, 所述抗體以 1x10-7M 或更強的 Kd 特異性結 合 FGFR3。
     在一些實施方案中, 本發明的抗 -FGFR3 抗體不是 : 美國專利公開號 2005/0147612 中 所 述 的 抗 -FGFR3 抗 體 ( 例 如, 抗 體 MSPRO2, MSPRO12, MSPRO59, MSPRO11, MSPRO21, MSPRO24 ,MSPRO26 ,MSPRO28 ,MSPRO29 ,MSPRO43 ,MSPRO55) ,Rauchenberger 等,J Biol Chem( 生 物 化 學 雜 志 )278(40) : 38194-38205(2003) 中 所 述 的 抗 體 ; PCT 公 開 號 WO2006/048877 中 所 述 的 抗 體 ( 例 如, 抗 體 PRO-001), Martinez-Torrecuadrada 等, Mol Cancer Ther( 分子癌癥治療 )(2008)7(4) : 862-873 中所述的抗體 ( 例如, scFvαFGFR3 3C), Direnzo, R 等 (2007)Proceedings of AACR Annual Meeting(AACR 年會進展 ), 摘要No.2080 中所述的抗體 ( 例如, D11), 或 WO 2010/002862 中所述的抗體 ( 例如, 抗體 15D8, 27H2, 4E7, 2G4, 20B4)。
     在一個方面, 本發明提供包含載體和本發明的一種或多種抗體的組合物。在一個 實施方案中, 所述載體是藥用的。
     在另一個方面, 本發明提供編碼本發明的 FGFR3 抗體的核酸。
     還在另一個方面, 本發明提供包含本發明的核酸的載體。
     在進一步的方面, 本發明提供包含載體和本發明的一種或多種核酸的組合物。在 一個實施方案中, 所述載體是藥用的。
     在一個方面, 本發明提供包含本發明的核酸或載體的宿主細胞。載體可以是任何 類型, 例如, 重組載體諸如表達載體。可以使用多種宿主細胞中的任一種。在一個實施方案 中, 宿主細胞是原核細胞, 例如, 大腸桿菌 (E.coli)。 在另一個實施方案中, 宿主細胞是真核 細胞, 例如, 哺乳動物細胞, 諸如中國倉鼠卵巢 (CHO) 細胞。
     在進一步的方面, 本發明提供制備本發明的抗體的方法。例如, 本發明提供制備 抗 -FGFR3 抗體的方法 ( 所述抗 -FGFR3 抗體如本文所定義其包括全長抗體及其片段 ), 所述 方法包括在合適的宿主細胞表達編碼所述抗體的本發明的重組載體, 并回收所述抗體。在 一些實施方案中, 所述方法包括培養包含編碼所述抗體的核酸的宿主細胞, 使得所述核酸 得以表達。在一些實施方案中, 所述方法進一步包括從所述宿主細胞培養物中回收所述抗 體。在一些實施方案中, 所述抗體從所述宿主細胞培養基中回收。在一些實施方案中, 所述 方法進一步包括將回收的抗體與藥用載體、 賦形劑或載體組合從而制備包含所述人源化抗 體的藥物制劑。
     在一個方面, 本發明提供一種包含容器的制品 ; 和包含在容器內的組合物, 其中所 述組合物包含本發明的一種或多種 FGFR3 抗體。在一個實施方案中, 所述組合物包含本發 明的核酸。 在另一個實施方案中, 包含抗體的組合物還包含載體, 在一些實施方案中所述載 體是藥用的。在一個實施方案中, 本發明的制品還包含用于將所述組合物 ( 例如, 所述抗 體 ) 施用于個體的說明書 ( 諸如用于本文所述的任一種方法的說明書 )。
     在另一個方面, 本發明提供一種包含第一容器和第二容器的試劑盒, 所述第一容 器包含組合物, 所述組合物包含本發明的一種或多種抗 -FGFR3 抗體 ; 所述第二容器包含緩 沖劑。在一個實施方案中, 所述緩沖劑是藥用的。在一個實施方案中, 包含抗體的組合物還 包含載體, 在一些實施方案中所述載體是藥用的。 在另一個實施方案中, 試劑盒還包含用于 將所述組合物 ( 例如, 所述抗體 ) 施用于個體的說明書。
     在進一步的方面, 本發明提供了本發明的抗 -FGFR3 抗體, 所述抗 -FGFR3 抗體用作 藥物。
     在進一步的方面, 本發明提供本發明的抗 -FGFR3 抗體, 所述抗 -FGFR3 抗體用于治 療或預防病癥, 諸如與 FGFR3 激活和 / 或表達 ( 在一些實施方案中, 過表達 ) 相關的病理學 狀況。在一些實施方案中, 所述病癥是癌癥、 腫瘤和 / 或細胞增生性病癥。在一些實施方案 中, 所述癌癥、 腫瘤和 / 或細胞增生性病癥是多發性骨髓瘤或膀胱癌癥 ( 例如, 移行性細胞 癌 ), 乳腺癌或肝癌。
     在 進 一 步 的 方 面, 本 發 明 提 供 本 發 明 的 抗 -FGFR3 抗 體, 所 述 抗 -FGFR3 抗 體 用于治療或預防病癥諸如骨骼病癥。在一些實施方案中, 所述病癥是軟骨發育不全(achondroplasia)、 軟 骨 發 育 不 良 (hypochondroplasia)、 侏 儒 癥 (dwarfism)、 致死性 發 育 不 全 (thantophoricdysplasia)(TD ; 臨 床 形 式 TD1 和 TDII) 或 顱 縫 早 閉 綜 合 癥 (craniosynostosissyndrome)。
     在進一步的方面, 本發明提供本發明的抗 -FGFR3 抗體, 所述抗 -FGFR3 抗體用于減 少細胞增殖。
     在進一步的方面, 本發明提供本發明的抗 -FGFR3 抗體, 所述抗 -FGFR3 抗體用于殺 傷細胞。在一些實施方案中, 所述細胞是多發性骨髓瘤細胞。在一些實施方案中, 所述細胞 被 ADCC 殺傷。在一些實施方案中, 所述抗體是裸抗體。在一些實施方案中, 所述細胞過表 達 FGFR3。
     在進一步的方面, 本發明提供本發明的抗 -FGFR3 抗體, 所述抗 -FGFR3 抗體用于清 除細胞, 諸如多發性骨髓瘤細胞。在一些實施方案中, 所述細胞被 ADCC 殺傷。在一些實施 方案中, 所述抗體是裸抗體。在一些實施方案中, 所述細胞過表達 FGFR3。
     在進一步的方面, 本發明提供本發明的抗 -FGFR3 抗體在制備用于治療性和 / 或預 防性治療病癥的藥物中的用途, 所述病癥諸如與 FGFR3 激活和 / 或表達 ( 在一些實施方案 中, 過表達 ) 相關的病理學狀況。在一些實施方案中, 所述病癥是癌癥、 腫瘤和 / 或細胞增 生性病癥。在一些實施方案中, 所述癌癥、 腫瘤和 / 或細胞增生性病癥是多發性骨髓瘤或膀 胱癌 ( 例如, 移行性細胞癌 ), 乳腺癌或肝癌。在一些實施方案中, 所述病癥是骨骼病癥, 例 如, 軟骨發育不全、 軟骨發育不良、 侏儒癥、 致死性發育不全 (TD ; 臨床形式 TD1 和 TDII) 或 顱縫早閉綜合癥。
     在一個方面, 本發明提供本發明的核酸在制備用于治療性和 / 或預防性治療病癥 的藥物中的用途, 所述病癥諸如與 FGFR3 激活和 / 或表達 ( 在一些實施方案中, 過表達 ) 相 關的病理學狀況。在一些實施方案中, 所述病癥是癌癥、 腫瘤和 / 或細胞增生性病癥。在 一些實施方案中, 所述癌癥、 腫瘤和 / 或細胞增生性病癥是多發性骨髓瘤或膀胱癌 ( 例如, 移行性細胞癌 ), 乳腺癌或肝癌。在一些實施方案中, 所述病癥是骨骼病癥, 例如, 軟骨發育 不全、 軟骨發育不良、 侏儒癥、 致死性發育不全 (TD ; 臨床形式 TD1 和 TDII) 或顱縫早閉綜合 癥。
     在另一個方面, 本發明提供本發明的表達載體在制備用于治療性和 / 或預防性治 療病癥的藥物中的用途, 所述病癥諸如與 FGFR3 激活和 / 或表達 ( 在一些實施方案中, 過表 達 ) 相關的病理學狀況。 在一些實施方案中, 所述病癥是癌癥、 腫瘤和 / 或細胞增生性病癥。 在一些實施方案中, 所述癌癥、 腫瘤和 / 或細胞增生性病癥是多發性骨髓瘤或膀胱癌 ( 例 如, 移行性細胞癌 ), 乳腺癌或肝癌。 在一些實施方案中, 所述病癥是骨骼病癥, 例如, 軟骨發 育不全、 軟骨發育不良、 侏儒癥、 致死性發育不全 (TD ; 臨床形式 TD1 和 TDII) 或顱縫早閉綜 合癥。
     還在另一個方面, 本發明提供本發明的宿主細胞在制備用于治療性和 / 或預防性 治療病癥的藥物中的用途, 所述病癥諸如與 FGFR3 激活和 / 或表達 ( 在一些實施方案中, 過 表達 ) 相關的病理學狀況。在一些實施方案中, 所述病癥是癌癥、 腫瘤和 / 或細胞增生性病 癥。在一些實施方案中, 所述癌癥、 腫瘤和 / 或細胞增生性病癥是多發性骨髓瘤或膀胱癌 ( 例如, 移行性細胞癌 ), 乳腺癌或肝癌。在一些實施方案中, 所述病癥是骨骼病癥, 例如, 軟 骨發育不全、 軟骨發育不良、 侏儒癥、 致死性發育不全 (TD ; 臨床形式 TD1 和 TDII) 或顱縫早閉綜合癥。
     在進一步的方面, 本發明提供本發明的制品在制備用于治療性和 / 或預防性治療 病癥的藥物中的用途, 所述病癥諸如與 FGFR3 激活和 / 或表達 ( 在一些實施方案中, 過表 達 ) 相關的病理學狀況。 在一些實施方案中, 所述病癥是癌癥、 腫瘤和 / 或細胞增生性病癥。 在一些實施方案中, 所述癌癥、 腫瘤和 / 或細胞增生性病癥是多發性骨髓瘤或膀胱癌 ( 例 如, 移行性細胞癌 ), 乳腺癌或肝癌。 在一些實施方案中, 所述病癥是骨骼病癥, 例如, 軟骨發 育不全、 軟骨發育不良、 侏儒癥、 致死性發育不全 (TD ; 臨床形式 TD1 和 TDII) 或顱縫早閉綜 合癥。
     在進一步的方面, 本發明提供本發明的試劑盒制備用于治療性和 / 或預防性治療 病癥的藥物中的用途, 所述病癥諸如與 FGFR3 激活和 / 或表達 ( 在一些實施方案中, 過表 達 ) 相關的病理學狀況。 在一些實施方案中, 所述病癥是癌癥、 腫瘤和 / 或細胞增生性病癥。 在一些實施方案中, 所述癌癥、 腫瘤和 / 或細胞增生性病癥是多發性骨髓瘤或膀胱癌 ( 例 如, 移行性細胞癌 ), 乳腺癌或肝癌。 在一些實施方案中, 所述病癥是骨骼病癥, 例如, 軟骨發 育不全、 軟骨發育不良、 侏儒癥、 致死性發育不全 (TD ; 臨床形式 TD1 和 TDII) 或顱縫早閉綜 合癥。
     在進一步的方面, 本發明提供本發明的抗 -FGFR3 抗體在制備用于抑制細胞增殖 的藥物中的用途。在進一步的方面, 本發明提供本發明的抗 -FGFR3 抗體在制備用于細胞殺 傷的藥物中的用途。在一些實施方案中, 所述細胞是多發性骨髓瘤細胞。在一些實施方案 中, 所述細胞被 ADCC 殺傷。在一些實施方案中, 所述抗體是裸抗體。在一些實施方案中, 所 述細胞過表達 FGFR3。
     在進一步的方面, 本發明提供本發明的抗 -FGFR3 抗體在制備用于清除細胞 ( 諸如 多發性骨髓瘤細胞 ) 的藥物中的用途。在一些實施方案中, 所述細胞被 ADCC 殺傷。在一些 實施方案中, 所述抗體是裸抗體。在一些實施方案中, 所述細胞過表達 FGFR3。
     本發明提供可用于調節與 FGFR3 的表達和 / 或信號傳導, 諸如增加表達和 / 或信 號傳導或不合乎需要的表達和 / 或信號傳導相關的病癥的方法和組合物。
     本發明的方法可以用來影響任何合適的病理學狀態。示例性的病癥如本文所 述, 并且包括選自由下列各項組成的組的癌癥 : 非小細胞肺癌 (non-small cell lung cancer), 卵 巢 癌, 甲 狀 腺 癌, 睪 丸 癌 (testicularcancer), 子 宮 內 膜 癌 (endometrial cancer), 頭頸癌, 腦癌 ( 例如, 神經母細胞瘤 (neuroblastoma) 或腦膜瘤 (meningioma)), 皮膚癌 ( 例如, 黑色素瘤, 基底細胞癌 (basal cell carcinoma) 或鱗狀細胞癌 ), 膀胱癌 ( 例如, 移行性細胞癌 ), 乳腺癌, 胃癌, 結直腸癌 (CRC), 肝細胞癌, 子宮頸癌, 肺癌, 胰腺癌, 前列腺癌和惡性血液病 ( 例如, T- 細胞急性淋巴細胞白血病 (T-ALL), B- 細胞急性淋巴細 胞白血病 (B-ALL), 急性髓細胞白血病 (AML), B- 細胞惡性腫瘤, 霍奇金淋巴瘤 (Hodgkin lymphoma) 和多發性骨髓瘤 )。在一些實施方案中, 所述病癥是侵襲性移行性細胞癌。在一 些實施方案中, 所述病癥是多發性骨髓瘤。 其他的示例性病癥包括骨骼病癥, 諸如軟骨發育 不全、 軟骨發育不良、 侏儒癥、 致死性發育不全 (TD ; 臨床形式 TD1 和 TDII) 或顱縫早閉綜合 癥。
     在某些實施方案中, 所述癌癥表達 FGFR3, 擴增的 FGFR3, 易位的 FGFR3, 和 / 或突變 的 FGFR3。 在某些實施方案中, 所述癌癥表達激活的 FGFR3。 在某些實施方案中, 所述癌癥表達易位的 FGFR3( 例如, t(4 ; 14) 易位 )。在某些實施方案中, 所述癌癥表達組成型 FGFR3。 在一些實施方案中, 組成型 FGFR3 包括酪氨酸激酶結構域和 / 或近膜結構域和 / 或配體結 合結構域中的突變。 在某些實施方案中, 所述癌癥表達配體不依賴性 FGFR3。 在一些實施方 案中, 所述癌癥表達配體依賴性 FGFR3。
     在一些實施方案中, 所述癌癥表達包含對應于 FGFR3-IIIbS248C 的突變的 FGFR3。 在 S248C S248C 一些實施方案中, 所述癌癥表達 FGFR3-IIIb 和 / 或 FGFR3-IIIc 。
     在一些實施方案中, 所述癌癥表達包含對應于 FGFR3-IIIbK652E 的突變的 FGFR3。 在 K652E K650E 一些實施方案中, 所述癌癥表達 FGFR3-IIIb 和 / 或 FGFR3-IIIc 。 S249C
     FGFR3 包含對應于 FGFR3-IIIb 的突變。在一些實施方案中, 所述癌癥表達 S249C S249C FGFR3-IIIb 和 / 或 FGFR3-IIIc 。
     在一個方面, 所述癌癥表達包含對應于 FGFR3-IIIbG372C 的突變的 FGFR3。 在一些實 G372C G370C 施方案中, 所述癌癥表達 FGFR3-IIIb 和 / 或 FGFR3-IIIc 。 Y375C
     在一個方面, 所述癌癥表達包含對應于 FGFR3-IIIb 的突變的 FGFR3。 在一些實 Y375C Y373C 施方案中, 所述癌癥表達 FGFR3-IIIb 和 / 或 FGFR3-IIIc 。
     在 一 些 實 施 方 案 中, 所 述 癌 癥 表 達 (a)FGFR3-IIIbK652E 和 (b)FGFR3-IIIbR248C, FGFR3-IIIbY375C, FGFR3-IIIbS249C, 和 FGFR3IIIb G372C 中的一種或多種。
     在 一 些 實 施 方 案 中, 所 述 癌 癥 表 達 (a)FGFR3-IIIbR248C 和 (b)FGFR3-IIIbK652E, FGFR3-IIIbY375C, FGFR3-IIIbS249C, 和 FGFR3-IIIbG372C 中的一種或多種。
     在 一 些 實 施 方 案 中, 所 述 癌 癥 表 達 (a)FGFR3-IIIbG372C 和 (b)FGFR3-IIIbK652E, FGFR3-IIIbY375C, FGFR3-IIIbS249C, 和 FGFR3-IIIbR248C 中的一種或多種。
     在 一 些 實 施 方 案 中,所 述 癌 癥 表 達 FGFR3-IIIbR248C, FGFR3-IIIbK652E, FGFR3-IIIbY375C, FGFR3-IIIb S249C, 和 FGFR3-IIIb G372C。
     在某些實施方案中, 所述癌癥表達相對于對照樣品 ( 例如, 正常組織的樣品 ) 或水 平增加水平的磷酸 -FGFR3, 磷酸 -FRS2 和 / 或磷酸 -MAPK。
     在一些實施方案中, 所述癌癥表達 ( 例如, 在細胞表面上 ) 約 10,000 個 FGFR3 分 子 / 細胞或更多 ( 諸如 11,000, 12,000, 13,000, 14,000, 15,000, 16,000, 17,000, 18,000 或 更多個 FGFR3 受體 )。在一些實施方案中, 所述癌癥表達約 13000 個 FGFR3 分子。在其他 實施方案中, 所述癌癥表達約 5000, 6000, 7000, 8000, 或更多個 FGFR3 分子。在一些實施方 案中, 所述癌癥表達小于約 4000, 3000, 2000, 1000, 或更少個 FGFR3 分子。在一些實施方案 中, 所述癌癥表達小于約 1000 個 FGFR3 分子。
     在一個實施方案中, 在本發明的方法中被靶向的細胞是癌細胞。例如, 癌細胞可 以是選自由下列各項組成的組的一種 : 乳腺癌細胞, 結直腸癌細胞, 肺癌細胞 ( 例如, 非 小細胞肺癌細胞 ), 甲狀腺癌細胞, 多發性骨髓瘤細胞, 睪丸癌細胞, 乳頭狀癌 (papillary carcinoma) 細胞, 結腸癌細胞, 胰腺癌細胞, 卵巢癌細胞, 宮頸癌細胞, 中樞神經細胞癌細 胞, 骨源性肉瘤 (osteogenic sarcoma) 細胞, 腎癌細胞, 肝細胞癌細胞, 膀胱癌細胞 ( 例如, 移行性細胞癌細胞 ), 胃癌細胞, 頭頸鱗狀癌細胞, 黑色素瘤細胞, 白血病細胞, 多發性骨髓 瘤細胞 ( 例如, 包含 t(4 ∶ 14)FGFR3 易位的多發性骨髓瘤細胞 ) 和結腸腺瘤細胞。在一個 實施方案中, 在本發明的方法中被靶向的細胞是過度增生和 / 或增生的細胞。在另一個實 施方案中, 在本發明的方法中被靶向的細胞是異常增生細胞 (dysplastic cell)。 還在另一個實施方案中, 在本發明的方法中被靶向的細胞是轉移細胞。
     在一個方面, 本發明提供抑制受試者中的細胞增殖的方法, 所述方法包括向所述 受試者施用有效量的抗 -FGFR3 抗體以減少細胞增殖。
     在一個方面, 本發明提供殺傷受試者中的細胞的方法, 所述方法包括向所述受試 者施用有效量的抗 -FGFR3 抗體以殺傷細胞。在一些實施方案中, 所述細胞是多發性骨髓瘤 細胞。在一些實施方案中, 所述細胞被 ADCC 殺傷。在一些實施方案中, 所述抗體是裸抗體。 在一些實施方案中, 所述細胞過表達 FGFR3。
     在一個方面, 本發明提供清除受試者中的細胞 ( 諸如多發性骨髓瘤細胞 ) 的方法, 所述方法包括向所述受試者施用有效量的抗 -FGFR3 抗體以殺傷細胞。在一些實施方案中, 所述細胞被 ADCC 殺傷。在一些實施方案中, 所述抗體是裸抗體。在一些實施方案中, 所述 細胞過表達 FGFR3。
     在一個方面, 本發明提供治療或預防骨骼病癥的方法。 在一些實施方案中, 所述病 癥是軟骨發育不全、 軟骨發育不良、 侏儒癥、 致死性發育不全 (TD ; 臨床形式 TD1 和 TDII) 或 顱縫早閉綜合癥。
     本發明的方法可以進一步包括附加的治療步驟。 例如, 在一個實施方案中, 一種方 法進一步包括一個步驟, 在所述步驟中被靶向的細胞和 / 或組織 ( 例如, 癌細胞 ) 暴露于放 射治療或化療劑。 在一個方面, 本發明提供了下述方法, 所述方法包括施用有效量的抗 -FGFR3 抗體 結合有效量的另一種治療劑 ( 諸如抗 - 血管生成劑, 另一種抗體, 化療劑, 細胞毒性劑, 免 疫抑制劑, 前藥, 細胞因子, 細胞毒性放射治療, 皮質類固醇, 止吐劑, 癌癥疫苗, 止痛劑, 或 生長抑制劑 )。例如, 抗 -FGFR3 抗體與抗癌劑或抗血管生成劑聯合使用以治療多種腫瘤 或非腫瘤病癥。在具體的實例中, 抗 -FGFR3 抗體與下列聯合使用 : 萬珂 (velcade), 來那 度胺 (revlimid), 他莫昔芬 (tamoxifen), 來曲唑 (letrozole), 依西美坦 (exemestane), 阿 那 曲 唑 (anastrozole), 伊 立 替 康 (irinotecan), 西 妥 昔 單 抗 (cetuximab), 氟維司 群 (fulvestrant), 長 春 瑞 濱 (vinorelbine), 貝 伐 珠 單 抗 (bevacizumab), 長春新堿 (vincristine), 順鉑 (cisplain), 吉西他濱 (gemcitabine), 甲氨蝶呤 (methotrexate), 長 春堿 (vinblastine), 卡鉑 (carboplatin), 紫杉醇 (paclitaxel), 多西他賽 (docetaxel), 培 美 曲 塞 (pemetrexed), 5- 氟 尿 嘧 啶 (5-fluorouracil), 多 柔 比 星 (doxorubicin), 硼 替 佐 米 (bortezomib), 來 那 度 胺 (lenalidomide), 地 塞 米 松 (dexamethasone), 馬 法 蘭 (melphalin), 潑 尼 松 (prednisone), 長 春 新 堿 (vincristine) 和 / 或 沙 利 度 胺 (thalidomide)。
     取決于待治療的具體癌癥適應證, 本發明的聯合療法可以與附加的治療劑諸如化 療劑, 或附加的療法諸如放療或手術結合。許多已知的化療劑可以用于本發明的聯合療法 中。優選使用為用于治療所述具體適應證的標準的那些化療劑。要聯合使用的每種治療劑 的劑量或頻次優選與當不使用其他一種或多種藥劑時相應治療劑的劑量或頻次相同, 或小 于相應治療劑的劑量或頻次。
     在另一個方面, 本發明提供本文所述的任一種抗 -FGFR3 抗體, 其中所述抗 -FGFR3 抗體包含可檢測的標記物。
     在另一個方面, 本發明提供本文所述的任一種抗 -FGFR3 抗體和 FGFR3 的復合體。
     在一些實施方案中, 所述復合體在體內或體外。在一些實施方案中, 所述復合體包含癌細 胞。在一些實施方案中, 抗 -FGFR3 抗體被可檢測地標記。
     附圖簡要說明
     圖 1A, 1B 和 1C : 抗 -FGFR3 抗體的重鏈和輕鏈 HVR 環序列。所述附圖顯示重鏈 HVR 序列, H1, H2 和 H3, 以及輕鏈 HVR 序列, L1, L2, 和 L3。序列編號如下 :
     克隆 184.6(HVR-H1 是 SEQ ID NO : 1; HVR-H2 是 SEQ ID NO : 2; HVR-H3 是 SEQ ID NO : 3; HVR-L1 是 SEQ ID NO : 4; HVR-L2 是 SEQ IDNO : 5; HVR-L3 是 SEQ ID NO : 6) ;
     克隆 184.6.1(HVR-H1 是 SEQ ID NO : 7; HVR-H2 是 SEQ ID NO : 8; HVR-H3 是 SEQ ID NO : 9; HVR-L1 是 SEQ ID NO : 10 ; HVR-L2 是 SEQ IDNO : 11 ; HVR-L3 是 SEQ ID NO : 12)
     克隆 184.6.58(HVR-H1 是 SEQ ID NO : 13 ; HVR-H2 是 SEQ ID NO : 14 ; HVR-H3 是 SEQ ID NO : 15 ; HVR-L1 是 SEQ ID NO : 16 ; HVR-L2 是 SEQ IDNO : 17 ; HVR-L3 是 SEQ ID NO : 18)
     克隆 184.6.62(HVR-H1 是 SEQ ID NO : 48 ; HVR-H2 是 SEQ ID NO : 49 ; HVR-H3 是 SEQ ID NO : 50 ; HVR-L1 是 SEQ ID NO : 51 ; HVR-L2 是 SEQ IDNO : 52 ; HVR-L3 是 SEQ ID NO : 53)
     克隆 184.6.21(HVR-H1 是 SEQ ID NO : 54 ; HVR-H2 是 SEQ ID NO : 55 ; HVR-H3 是 SEQ ID NO : 56 ; HVR-L1 是 SEQ ID NO : 57 ; HVR-L2 是 SEQ IDNO : 58 ; HVR-L3 是 SEQ ID NO : 59)
     克隆 184.6.49(HVR-H1 是 SEQ ID NO : 60 ; HVR-H2 是 SEQ ID NO : 61 ; HVR-H3 是 SEQ ID NO : 62 ; HVR-L1 是 SEQ ID NO : 63 ; HVR-L2 是 SEQ IDNO : 64 ; HVR-L3 是 SEQ ID NO : 65)
     克隆 184.6.51(HVR-H1 是 SEQ ID NO : 66 ; HVR-H2 是 SEQ ID NO : 67 ; HVR-H3 是 SEQ ID NO : 68 ; HVR-L1 是 SEQ ID NO : 69 ; HVR-L2 是 SEQ IDNO : 70 ; HVR-L3 是 SEQ ID NO : 71)
     克隆 184.6.52(HVR-H1 是 SEQ ID NO : 72 ; HVR-H2 是 SEQ IDNO : 73 ; HVR-H3 是 SEQ ID NO : 74 ; HVR-L1 是 SEQ ID NO : 75 ; HVR-L2 是 SEQ ID NO : 76 ; HVR-L3 是 SEQ ID NO : 77)
     克隆 184.6.92(HVR-H1 是 SEQ ID NO : 78 ; HVR-H2 是 SEQ IDNO : 79 ; HVR-H3 是 SEQ ID NO : 80 ; HVR-L1 是 SEQ ID NO : 81 ; HVR-L2 是 SEQ ID NO : 82 ; HVR-L3 是 SEQ ID NO : 83)
     克隆 184.6.1.N54S(HVR-H1 是 SEQ ID NO : 84 ; HVR-H2 是 SEQ IDNO : 85 ; HVR-H3 是 SEQ ID NO : 86 ; HVR-L1 是 SEQ ID NO : 87 ; HVR-L2 是 SEQ ID NO : 88 ; HVR-L3 是 SEQ ID NO : 89)
     克隆 184.6.1.N54G(HVR-H1 是 SEQ ID NO : 90 ; HVR-H2 是 SEQ IDNO : 91 ; HVR-H3 是 SEQ ID NO : 92 ; HVR-L1 是 SEQ ID NO : 93 ; HVR-L2 是 SEQ ID NO : 94 ; HVR-L3 是 SEQ ID NO : 95)
     克隆 184.6.1.N54A(HVR-H1 是 SEQ ID NO : 96 ; HVR-H2 是 SEQ IDNO : 97 ; HVR-H3 是 SEQ ID NO : 98 ; HVR-L1 是 SEQ ID NO : 99 ; HVR-L2 是 SEQ ID NO : 100 ; HVR-L3 是 SEQ ID NO : 101)
     克隆 184.6.1.N54Q(HVR-H1 是 SEQ ID NO : 102 ; HVR-H2 是 SEQID NO : 103 ; HVR-H3 是 SEQ ID NO : 104 ; HVR-L1 是 SEQ ID NO : 105 ; HVR-L2 是 SEQ ID NO : 106 ; HVR-L3 是 SEQ ID NO : 107)
     克隆 184.6.58.N54S(HVR-H1 是 SEQ ID NO : 108 ; HVR-H2 是 SEQID NO : 109 ; HVR-H3 是 SEQ ID NO : 110 ; HVR-L1 是 SEQ ID NO : 111 ; HVR-L2 是 SEQ ID NO : 112 ; HVR-L3 是 SEQ ID NO : 113)
     克隆 184.6.58.N54G(HVR-H1 是 SEQ ID NO : 114 ; HVR-H2 是 SEQID NO : 115 ; HVR-H3是 SEQ ID NO : 116 ; HVR-L1 是 SEQ ID NO : 117 ; HVR-L2 是 SEQ ID NO : 118 ; HVR-L3 是 SEQ ID NO : 119)
     克隆 184.6.58.N54A(HVR-H1 是 SEQ ID NO : 120 ; HVR-H2 是 SEQID NO : 121 ; HVR-H3 是 SEQ ID NO : 122 ; HVR-L1 是 SEQ ID NO : 123 ; HVR-L2 是 SEQ ID NO : 124 ; HVR-L3 是 SEQ ID NO : 125)
     克隆 184.6.58.N54Q(HVR-H1 是 SEQ ID NO : 126 ; HVR-H2 是 SEQID NO : 127 ; HVR-H3 是 SEQ ID NO : 128 ; HVR-L1 是 SEQ ID NO : 129 ; HVR-L2 是 SEQ ID NO : 130 ; HVR-L3 是 SEQ ID NO : 131)。
     克 隆 184.6.1.NS D30E(HVR-H1 是 SEQ ID NO : 143 ; HVR-H2 是 SEQ ID NO : 144 ; HVR-H3 是 SEQ ID NO : 145 ; HVR-L1 是 SEQ ID NO : 140 ; HVR-L2 是 SEQ ID NO : 141 ; HVR-L3 是 SEQ ID NO : 142)。
     氨基酸位置根據下述 Kabat 編號系統進行編號。
     圖 2A 和 2B : 描繪了 (A) 抗 -FGFR3 抗體 184.6.1.N54S, 184.6.58, 和 184.6.62 的 重鏈可變區和輕鏈可變區的氨基酸序列 ; 和 (B) 抗 -FGFR3 抗體 1G6, 6G1, 和 15B2 的高變區。
     圖 3A, 3B, 和4: 描繪了示例性的接納體 (acceptor) 人共有構架序列, 其用于使用 如下的序列標識符實施本發明 :
     可變重鏈 (VH) 共有構架 ( 圖 3A, 3B)
     人 VH 亞組 I 共有構架減去 Kabat CDRs(SEQ ID NOS : 19 和 203-205)
     人 VH 亞 組 I 共 有 構 架 減 去 延 伸 的 高 變 區 (SEQ ID NOS : 20 和 206-208, 21 和 209-211, 22 和 212-214)
     人 VH 亞組 II 共有構架減去 Kabat CDRs(SEQ ID NOS : 23 和 215-217)
     人 VH 亞組 II 共有構架減去延伸的高變區 (SEQ ID NOS : 24 和 218-220, 25 和 221-223, 26 和 224-226)
     人 VH 亞組 II 共有構架減去延伸的
     人 VH 亞組 III 共有構架減去 Kabat CDRs(SEQ ID NOS : 27 和 227-229)
     人 VH 亞組 III 共有構架減去延伸的高變區 (SEQ ID NOS : 28 和 230-232, 29 和 233-235, 30 和 236-238)
     人 VH 接納體構架減去 Kabat CDRs(SEQ ID NOS : 31 和 239-241)
     人 VH 接納體構架減去延伸的高變區 (SEQ ID NOS : 32 和 242-244, 33 和 2245-247)
     人 VH 接納體 2 構架減去 Kabat CDRs(SEQ ID NOS : 34 和 248-250)
     人 VH 接納體 2 構架減去延伸的高變區 (SEQ ID NOS : 35 和 251-253, 36 和 254-256, 37 和 257-259)
     可變輕鏈 (VL) 共有構架 ( 圖 4)
     人 VLκ 亞組 I 共有構架 (SEQ ID NO : 38 和 260-262)
     人 VLκ 亞組 II 共有構架 (SEQ ID NO : 39 和 263-265)
     人 VLκ 亞組 III 共有構架 (SEQ ID NO : 40 和 266-268)
     人 VLκ 亞組 IV 共有構架 (SEQ ID NO : 41 和 269-271)
     圖5: 描繪了 huMAb4D5-8 輕鏈 (SEQ ID NOS : 42-45) 和重鏈 (SEQ IDNOS : 46, 47, 175, 176) 的構架區序列。上標 / 粗體中的數字表示按照 Kabat 的氨基酸位置。圖6 : 描繪了 huMAb4D5-8 輕鏈 (SEQ ID NOS : 42, 43, 177, 45) 和重鏈 (SEQ ID NOS : 46, 47, 178, 和 176) 的修飾 / 變體的構架區序列。上標 / 粗體中的數字表示按照 Kabat 的 氨基酸位置。上標 / 粗體中的數字表示按照 Kabat 的氨基酸位置。
     圖7 : 在膀胱癌細胞 RT112 中敲低 FGFR3 抑制增殖并在體外誘導 G1 細胞周期停滯, 并在體內抑制腫瘤生長。將三種不同的 FGFR3shRNA 克隆進 Tet- 可誘導型表達載體中。使 用嘌呤霉素選擇建立穩定表達 FGFR3shRNAs 或對照 shRNA 的 RT112 細胞。 (A) 在選擇的用強 力霉素處理或未用強力霉素 (Dox, 0, 0.1 和 1μg/ml, 從左至右 ) 處理的克隆中顯示 FGFR3 3 表達的代表性印跡 .(B)RT112 穩定細胞的 [ H]- 胸苷的摻入。 將 RT112 穩定的克隆用或不用 3 1μg/ml 強力霉素培養 3 天, 然后與 [ H]- 胸苷 (1μCi/ 孔 ) 溫育 16 小時。摻入的 [3H]- 胸 苷的計數針對來自沒有使用強力霉素誘導的細胞的計數進行標準化。 誤差條代表 SEM。 (C) RT112 穩定細胞的 DNA 熒光流式細胞儀直方圖。表達對照 shRNA 或 FGFR3 shRNA4 的 RT112 克隆用或不用 1μg/ml 強力霉素培養 72 小時, 并用碘化丙啶 (PI) 染色細胞核。對 FGFR3 shRNA2 和 6 獲得類似的結果 ( 圖 16)。(D) 表達對照 shRNA( 每個處理組 n = 9) 或 FGFR3 shRNA4( 每個處理組 n = 11) 的 RT112 細胞在小鼠中的生長。小鼠單獨給予 5%蔗糖或補 充以 1mg/ml 強力霉素, 并且一周測量腫瘤大小兩次。誤差條代表 SEM。對 FGFR3shRNA2 和 6 獲得類似的結果 ( 圖 16)。下部圖片 : 從對照 shRNA 或 FGFR3shRNA4 穩定細胞異種移植物 組織中提取的腫瘤裂解產物中 FGFR3 蛋白的表達。
     圖8: R3Mab 阻斷 FGF/FGFR3 相互作用。(A)R3Mab 對人 FGFR3 的選擇性結合。人 FGFR1-4Fc 嵌合蛋白被固定并與漸增量的 R3Mab 溫育。使用抗 - 人 Fab 抗體檢測特異性 結合。(B-C)R3Mab 阻斷 FGF1 與人 FGFR3-IIIb(B) 或 IIIc(C) 的結合。使用生物素化的 FGF1- 特異性多克隆抗體檢測特異性結合。(D-E)R3Mab 阻斷 FGF9 與人 FGFR3-IIIb(D) 或 IIIc(E) 的結合。使用生物素化的 FGF9- 特異性多克隆抗體檢測特異性結合。誤差條代表 平均值的標準誤差 (SEM) 并且有時小于符號。
     圖9 : R3Mab 抑制由野生型和突變的 FGFR3 驅動的 Ba/F3 細胞增殖。 (A)R3Mab 對表 達野生型人 FGFR3-IIIb 的 Ba/F3 細胞的活力的抑制作用。細胞在不含 FGF1( 無 FGF1) 的 培養基中培養, 或在單獨的 10ng/ml FGF1 加 10μg/ml 肝素 (FGF1) 的存在下培養, 或結合 對照抗體 (Control) 或 R3Mab 培養。在與抗體溫育 72 小時后用 CellTiter-Glo(Promega) 評價細胞活力。(B) 在 Ba/F3-FGFR3-IIIbWT 穩定的細胞中 R3Mab 對 FGFR3 和 MAPK 磷酸化 的抑制。將細胞用 15ng/ml FGF1 和 10μg/ml 肝素 (+) 或單獨肝素 (-) 處理 10 分鐘, 然后 與對照 Ab(Ctrl), 遞減量的 PBS 中的 R3Mab( 分別為 1, 0, 2, 0.04μg/ml), 或單獨 PBS( 模擬 653/654 Thr202/Tyr204 (Mock)) 預溫育 3 小時。裂解產物用分別針對 pFGFRY 和 pMAPK 的抗體進行免 疫印跡以評價 FGFR3 和 p44/42MAPK 的磷酸化。(C) 基于發表的數據的膀胱癌中 FGFR3 突變 熱點和頻次的示意性圖示 ( 繪制的序列編號基于 FGFR3IIIb 同種型氨基酸序列 )(32)。 TM, 跨膜結構域 ; TK1 和 TK2, 酪氨酸激酶結構域 1 和 2。(D-H)R3Mab 對表達癌相關 FGFR3 突變 體的 Ba/F3 細胞的活力的抑制作用。G372C 來自 IIIc 同種型, 且其余的來自 IIIb 同種型。 對于所有突變體的序列編號基于 FGFR3IIIb 同種型氨基酸序列 ( 包括 G372C 突變體, 其將 基于 FGFR3IIIc 同種型氨基酸序列編號為 G370C)。如 (A) 中所述在與抗體溫育 72 小時后 評價細胞活力。誤差條表示 SEM。
     圖 10 : R3Mab 的表位作圖以及 R3Mab Fab 片段和人 FGFR3-IIIb 的 IgD2-D3 之間的復合體的晶體結構。(A) 通過跨越人 FGFR3 的 IgD2-D3 的 13 個肽與 R3Mab 的結合確定 的表位。每個生物素化的肽被俘獲在鏈霉抗生物素蛋白 (streptavidin) 包被的微量滴定 孔上并與 R3Mab 溫育。使用山羊抗人 IgG 抗體檢測特異性結合的 R3Mab。(B) 人 FGFR3 肽 3(LAVPAANTVRFRCPA(SEQ ID NO : 179) 和 11(SDVEFHCKVYSDAQP(SEQ ID NO : 180) 與人 FGFR1 的細胞外區段 ( 肽 3 : HAVPAAKTVKFKCPS(SEQ ID NO : 181) ; 肽 11 : SNVEFMCKVYSDPQP(SEQ ID NO : 182)) 的序列比對。參與初級 FGF2-FGFR1 相互作用、 肝素結合、 和受體 - 受體締合的 FGFR1 殘基分別以粗體、 斜體和下劃線的字體顯示。FGFR1 殘基的功能比對基于 Plotnikov 等 (34)。(C) 與人 FGFR3IgD2-D3( 顯示在分子表面, 白色 ) 形成復合體的 R3Mab Fab( 顯 示為絲帶 - 螺旋, 輕鏈灰色, 重鏈黑色 ) 的結構。參與配體結合和二聚作用的受體殘基基 于 Plotnikov 等 (34) 分別以灰色 / 陰影交叉線和深灰色著色。(D) 晶體結構的特寫顯 示 來 自 Fab 的 CDR-H3 和 -H2 構 成 與 FGFR3 的 IgD2 和 IgD3 的 主 要 相 互 作 用 位 點。(E) FGFR3-IIIc-FGF1 復合體 (PDB 代碼 1RY7) 與 FGFR3-IIIb-Fab 復合體的重疊。FGFR3-IIIc 和 FGF1 分別以灰色和深灰色著色。FGFR3-IIIb 以白色顯示, 且 Fab 以淺灰色顯示輕鏈, 深 灰色顯示重鏈。IgD2 用作用于重疊的錨。注意當被 R3Mab 結合時來自兩個結構的重疊良好 的 IgD2 和 FGFR3-IIIb 的 IgD3 所采取的新構象。(F)FGFR3-IIIc-FGF1 復合體 (PDB 代碼 1RY7) 與 FGFR3-IIIb-Fab 復合體重疊的另一圖示。FGFR3-IIIc 和 FGF1 顯示為分子表面, 它們分別是灰色 / 網狀構造和深灰色 / 斑點構造。FGFR3-IIIb 顯示為白色且 Fab 以灰色顯 示輕鏈, 黑色顯示重鏈。IgD2 用作用于重疊的錨。注意當被 R3Mab 結合時來自兩個結構的 重疊良好的 IgD2 和 FGFR3-IIIb 的 IgD3 所采取的新構象。
     圖 11 : R3Mab 抑制表達野生型或突變的 FGFR3S249C 的膀胱癌細胞中的增殖、 克隆性 3 生長和 FGFR3 信號傳導。(A) 在膀胱癌細胞系 RT112 中 R3Mab 抑制 [ H]- 胸苷摻入。誤差 條代表 SEM。 (B) 在膀胱癌細胞系 RT112 中與單獨處理培養基 (Mock) 或對照抗體 (Ctrl) 相 比較, R3Mab(15μg/ml) 阻斷 FGF1- 激活的 FGFR3 信號傳導。細胞裂解物用抗 -FGFR3 抗體 免疫沉淀并用抗磷酸 - 酪氨酸抗體 (4G10) 評價 FGFR3 磷酸化。將裂解物免疫印跡以檢測 AKT(pAKTS473) 和 p44/42MAPK(pMAPKThr202/Tyr204) 的磷酸化。 (C) 在膀胱癌細胞系 UMUC-14( 攜帶 S249C FGFR3 ) 中與單獨處理培養基 (Mock) 或對照抗體 (Ctrl) 相比較, R3Mab(10μg/ml) 抑制 克隆性生長。 (D)(C) 中研究的定量, 從 12 個孔的復孔報告每孔直徑大于 120μm 的集落數。 -9 誤差條代表 SEM。P < 3.4X10 相對于 Mock 或 Ctrl。(E) 在 UMUC-14 細胞中 R3Mab(15μg/ ml) 抑制 FGFR3 磷酸化。如 (B) 中那樣分析 FGFR3 磷酸化。注意在此細胞系中 FGFR3 的組 成型磷酸化。
     圖 12 : R3Mab 通過將二聚體 - 單體平衡朝向單體狀態驅動來減少二硫化物連接的 S249C FGFR3 二聚體的穩態水平。(A) 在 UMUC-14 細胞中 R3Mab 對 FGFR3S249C 二聚體的作用。將 細胞與 R3Mab(15μg/ml) 或對照抗體 (Ctrl) 溫育 3 小時, 且通過在非還原和還原條件下的 免疫印跡來分析全細胞裂解物。 (B) 在 UMUC-14 細胞中游離巰基阻斷劑 DTNB 對 FGFR3S249C 二 聚體 - 單體平衡的作用。 將 UMUC-14 細胞用漸增濃度的 DTNB 處理 3 小時, 如 (A) 中那樣分析 S249C 細胞裂解物。(C) 在體外 R3Mab 對純化的重組 FGFR3 二聚體的作用。由 IgD2-D3 構成的 S249C FGFR3 二聚體通過尺寸排阻柱純化, 并與 PBS(Mock), 對照抗體 (Ctrl), 或 R3Mab 在 37℃ 下溫育。在指定的時間收集樣品用于在非還原條件下進行免疫印跡分析。使用抗 -FGFR3 雜交瘤抗體 6G1(A-C) 檢測 FGFR3 二聚體 - 單體。圖 13 : R3Mab 抑制膀胱癌細胞的異種移植物生長和 Ba/F3-FGFR3S249C 的同種異體移 植物生長。(A) 與賦形劑 (vehicle) 對照相比, R3Mab 對預先形成的 RT112 膀胱癌異種移植 物的生長的作用。每組 n = 10。(B)R3Mab 抑制 RT112 腫瘤組織中的 FGFR3 信號傳導。在 獨立的實驗中, 收集用 15mg/kg 對照抗體 (Ctrl) 或 R3Mab 處理 48 小時或 72 小時的 RT112 異種移植物腫瘤 ( 每組 n = 3), 勻漿并通過免疫印跡分析 FRS2α 和 MAPK 激活。(C)R3Mab S249C 對預先形成的 Ba/F3-FGFR3 同種異體移植物的生長的作用。每組 n = 10。(D)R3Mab 對 預先形成的 UMUC-14 膀胱異種移植物的生長的作用, 每組 n = 10。(E) 在 UMUC-14 腫瘤組 S249C 織中 R3Mab 對 FGFR3 二聚體和信號傳導的作用。收集用 30mg/kg 對照抗體 (Ctrl) 或 R3Mab 處理 24 小時或 72 小時的 UMUC-14 異種移植物腫瘤 ( 每組 n = 3), 勻漿并通過免疫 S249C 印跡分析 FGFR3 二聚體 - 單體以及 MAPK 激活。使用抗 -FGFR3 兔多克隆抗體 sc9007 檢 測 FGFR3 二聚體 - 單體以避免來自腫瘤裂解物中小鼠 IgG 的干擾。誤差條代表 SEM。
     圖 14 : 在 t(4 ; 14) 陽性多發性骨髓瘤模型中, ADCC 有助于 R3Mab 的抗 - 腫瘤功效。 (A-B)R3Mab 對預先形成的 OPM2(A) 和 KMS11(B) 骨髓瘤異種移植物的生長的作用。每組 n = 10。(C-F) 在細胞培養中 R3Mab 誘導的骨髓瘤細胞系 OPM2(C) 和 KMS11(D), 或膀胱癌細 胞系 RT112(E) 和 UMUC-14(F) 的細胞裂解。骨髓瘤或膀胱癌細胞與新鮮分離的人 PBMC 在 R3Mab 或對照抗體的存在下溫育。細胞毒性通過測量上清液中釋放的 LDH 來測定。(G-H) R3Mab 或其 DANA 突變體對預先形成的 OPM2(G) 和 KMS11(H) 骨髓瘤異種移植物的生長的作 用。每組 n = 10。誤差條代表 SEM 并且有時小于符號。
     圖 15 : 用 siRNA 敲低 FGFR3 抑制膀胱癌細胞系的細胞增殖。在 Genentech 設計和 合成 6-7 種不同的 FGFR3 siRNAs 和三種非特異性對照 siRNA。將膀胱癌細胞系 RT112(A), SW780(B), RT4(C) 和 UMUC-14(D) 接種至 96 孔板 (3000 細胞 / 孔 ) 中并使其貼壁過夜, 并且 3 用與 RNAiMax(Invitrogen) 形成復合體的 25nM siRNA 瞬時轉染。轉染后 72hr, 將 [ H]- 胸 3 苷 (1μCi/ 孔 ) 加入至培養物 (A, C, 和 D) 中進行另外 16 小時溫育。摻入的 [ H]- 胸苷用 TopCount 定量。數據針對來自用單獨 RNAiMax 轉染的細胞 (Mock) 的數據進行標準化。誤 差條代表 SEM。下部圖片 : 顯示 siRNA 轉染的細胞中 FGFR3 表達的代表性印跡。(B) 轉染后 96 小時用 CellTiter-Glo(Promega) 測量細胞活力。誤差條代表 SEM。
     圖 16 : 在膀胱癌細胞系 RT112 中敲低 FGFR3 在體外誘導 G1 細胞周期停滯, 并在體 內抑制腫瘤生長。設計三種不同的 FGFR3RNA 并克隆至 Tet- 誘導型 shRNA 表達逆轉錄病 毒載體中。采用嘌呤霉素選擇建立表達 FGFR3shRNA 或對照 shRNA 的 RT112 穩定的克隆。 (A) 在用或不用 1μg/ml 強力霉素處理 72 小時后從表達 FGFR3shRNA2 或 shRNA6 的 RT112 穩定的細胞獲得的碘化丙啶 (PI)- 染色的細胞核的 DNA 熒光流式細胞儀直方圖。(B) 表達 FGFR3shRNA2-4( 每個處理組 n = 11) 或 FGFR3shRNA6-16( 每個處理組 n = 10) 的 RT112 穩定的細胞在 nu/nu 小鼠中的生長。荷瘤小鼠接受僅 5%蔗糖 ( 實心圓圈 ) 或 5%蔗糖加 1mg/ml 強力霉素 ( 實心方形 ), 并且用測徑器測量腫瘤一周兩次。誤差條代表 SEM。
     圖 17 : 抗 -FGFR3 雜交瘤抗體 16G, 6G1 和 15B2 對由野生型和突變的 FGFR3 驅動的 Ba/F3 細胞增殖的作用。抗 -FGFR3 雜交瘤抗體通過用人 FGFR3-IIIb/Fc 或人 FGFR3-IIIc/ Fc 嵌 合 體 免 疫 BALB/c 小 鼠 產 生。 在 來 自 雜 交 瘤 選 擇 試 劑 盒 (StemCell Technologies, Inc., Vancouver, BC, Canada) 的培養基 D 中使用次黃嘌呤 - 氨基喋呤 - 胸 苷選擇來選擇融合的雜交瘤細胞。相繼地通過 ELISA 篩選雜交瘤抗體結合 FGFR3-IIIb 和FGFR3-IIIc 的能力并通過 FACS 識別細胞表面 FGFR3。然后將選擇的雜交瘤通過有限稀釋 克隆。類似于圖 9A 中所述, 16G, 6G1 和 15B2 是用來評價對表達野生型或突變的 FGFR3 的 Ba/F3 細胞增殖的作用的克隆。誤差條代表 SEM。
     圖 18 : 通過肽譜和晶體結構分析確定的 R3Mab 表位的比較。(A) 由與人 FGFR3 的 細胞外 IgD2-D3 區段形成復合體的 R3Mab Fab 片段的結構揭示的表位。與 Fab 重鏈和輕鏈 接觸的 FGFR3 殘基分別用黑色和灰色著色。(B)FGFR3 上肽 3 和 11 的位置。
     圖 19 : 在包含野生型或突變的 FGFR3S249C 的膀胱癌細胞中, R3Mab 抑制增殖和 FGFR3 信號傳導。(A) 在膀胱癌細胞系 RT4 中 R3Mab 抑制細胞活力。在與抗體溫育 96hr 后用 CellTiter-Glo(Promega) 評價細胞活力。誤差條代表 SEM。(B) 在膀胱癌細胞系 RT4 中 R3Mab(15ug/ml) 阻斷 FGF1- 激活的 FGFR3 信號傳導。(C) 在膀胱癌細胞系 RCC-97-7( 包 含 FGFR3S249C) 中, R3Mab 抑制 [3H]- 胸苷摻入。誤差條代表 SEM。(D) 在 TCC-97-7 細胞中, R3Mab(15ug/ml) 抑制 FGFR3 磷酸化。(E) 與對照抗體 (Ctrl) 相比, 在與 R3Mab(15ug/ml) S249C 溫育 3 小時后 TCC-97-7 細胞中的 FGFR3 二聚體減少。
     圖 20 : 在 UMUC-14 細胞中, 胞吞作用抑制劑對 R3Mab 和 FGFR3S249C 二聚體的內在化 的作用。(A) 胞吞作用抑制劑對 R3Mab 的內在化的作用。將用各種胞吞作用抑制劑或 DMSO 在 37℃下預處理 1 小時的 UMUC-14 細胞與 R3Mab(15ug/ml) 在 37℃下溫育 3 小時以允許內 在化。使用低 pH 洗滌來移除細胞表面 R3Mab 從而使內在化的抗體可視化。固定細胞并用 Alexa 488- 標記的抗 - 人 IgG 染色細胞。使用共聚焦顯微鏡攝取圖像。(B) 在用 R3Mab 處 理的 UMUC-14 細胞中, 胞吞作用抑制劑對 FGFR3S249C 二聚體的作用。將用各種胞吞作用抑制 劑或 DMSO 在 37℃下預處理 1 小時的 UMUC-14 細胞與載體對照 (mock)(1 道 ), 對照抗體 (2 道 ), 或 R3Mab(15ug/ml, 3 道 ) 在 37℃下溫育 3 小時。細胞裂解物在非還原或還原條件下 通過免疫印跡分析 FGFR3 蛋白。注意氯丙嗪 ( 網格蛋白介導的胞吞作用的抑制劑 ) 和染料 木素 ( 胞吞作用的 pan- 抑制劑 (pan-inhibitor)) 阻斷 R3Mab 內在化, 但對 R3Mab 誘導的 S249C FGFR3 二聚體減少沒有作用。
     圖 21 : 不同抗 -FGFR3 抗體在非還原條件下針對單體和二聚體 FGFR3S249C 的檢測靈 敏度。在用 R3Mab(1 道 ), 對照 IgG1(2 道 ), 或 PBS(3 道 ) 處理 3 小時后, 將 UMUC-14 細胞 裂解, 并將細胞裂解物在還原或非還原條件下進行免疫印跡分析。注意 6G1( 在 Genentech 產生的鼠雜交瘤抗體 ) 檢測 FGFR3S249C 二聚體和單體兩者, 而 sc9007( 兔多克隆抗體, SantaCruz Biotechnology) 或 sc13121( 鼠雜交瘤抗體, Santa Cruz Biotechnology) 優先 S249C 地檢測二聚體 FGFR3 。
     圖 22 : R3Mab 對 t(4 ; 14)+ 多發性骨髓瘤細胞的增殖的作用。 (A)R3Mab 對 UTMC-2 細 3 胞的 [ H]- 胸苷摻入的抑制作用。 UTMC-2 細胞在包含 R3Mab 或對照抗體的培養基中在 25ng/ ml FGF9 和 5ug/ml 肝素或單獨肝素 ( 無 FGF9) 的存在下生長。溫育 6 天后, 加入 [3H]- 胸 苷溫育 16hr。數據針對來自在缺少 FGF9 和抗體的條件下生長的細胞的數據進行標準化。 (B-C)R3Mab 對 OPM2(B) 和 KMS11(C) 細胞的 [3H]- 胸苷摻入的作用。生長在 1.5 % FBS 培 養基中的細胞用 R3Mab 或對照抗體處理 6 天。數據針對來自未處理的細胞的數據進行標準 化。誤差條代表 SEM。
     圖 23 : 骨髓瘤和膀胱癌細胞中 FGFR3 的細胞表面表達水平。(A) 通過 FACS 分析 評估的骨髓瘤細胞和膀胱癌細胞中的細胞表面 FGFR3 表達。細胞用藻紅蛋白 - 綴合的針對人 FGFR3 的小鼠 mAb(FAB766P, R&DSystems) 或藻紅蛋白 - 綴合的同種型對照小鼠 IgG1(BD Pharmingen) 染色。(B) 骨髓瘤細胞和膀胱癌細胞中 FGFR3 密度的 Scatchard 分析。R3Mab 被放射性碘化并與細胞在含有過量未標記的抗體的懸浮液中溫育。在 RT 下溫育 2 小時后, 細胞通過離心沉淀, 并洗滌兩次。測定特異性結合的 125I。受體密度和結合親合力 (Kd) 代 表兩次結合實驗的平均值。
     圖 24 : R3Mab 或其 DANA 突變體對膀胱癌細胞的異種移植物生長的作用。(A)R3Mab 和其 DANA 突變體 ( 各自 50mg/kg) 對預先形成的 RT112 腫瘤的生長的作用。(B)R3Mab 和其 DANA 突變體 ( 各自 50mg/kg) 對預先形成的 UMUC-14 腫瘤的生長的作用。誤差條代表 SEM。
     發明詳述
     本發明在本文中提供可用于例如, 治療或預防與 FGFR3 的表達和 / 或活性, 諸如增 加的表達和 / 或活性或不合乎需要的表達和 / 或活性相關的疾病狀態的抗 -FGFR3 抗體。 在 一些實施方案中, 本發明的抗體用來治療腫瘤、 癌癥和 / 或細胞增生性病癥。
     在另一個方面, 本發明的抗 -FGFR3 抗體具有用作檢測和 / 或分離 FGFR3, 諸如在多 種組織和細胞類型中檢測 FGFR3 的試劑的用途。
     本發明進一步提供制備和使用抗 -FGFR3 抗體、 和編碼抗 -FGFR3 抗體的多核苷酸 的方法。
     通用技術
     本文所述或參考的技術和方法通常是本領域技術人員充分了解的并且使用常 規方法普遍地采用的, 諸如例如, 在下述參考文獻中所述廣泛使用的方法 : Sambrook 等, 分子克隆: 實 驗 室 手 冊 (Molecular Cloning : ALaboratory Manual), 第 3 版 (2001) 冷 泉 港 實 驗 室 出 版 社, 冷 泉 港, N.Y. 現 代 分 子 生 物 學 實 驗 技 術 (CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULARBIOLOGY)(F.M.Ausubel, 等 . 編 輯, (2003)) ; 酶 學 方 法 (Methods INENZYMOLOGY) 系列 ( 學術出版社公司 ) : PCR 2 : 實用方法 (PCR 2 : APRACTICAL APPROACH) (M.J.MacPherson, B.D.Hames 和 G.R.Taylor 編 輯 (1995)), Harlow 和 Lane, 編 輯 (1988) 抗 體, 實 驗 室 手 冊, 和 動 物 細 胞 培 養 (ANTIBODIES, A LABORATORY MANUAL, and ANIMAL CELLCULTURE)(R.I.Freshney, 編輯 (1987))。
     定義
     “分離的” 抗體指已經鑒定且與其天然環境的成分分離和 / 或從其回收的抗體。 抗體的天然環境的污染性成分是將會干擾其診斷或治療用途的物質, 并且可包括酶、 激素、 和其它蛋白質性或非蛋白質性的溶質。在優選實施方案中, 將抗體純化至 (1) 通過例如 Lowry 法確定, 超過 95 重量%的抗體, 并且最優選超過 99 重量%的抗體, (2) 足以通過使 用轉杯式測序儀 (spinning cup sequenator) 獲得至少 15 個殘基的 N- 末端或內部氨基酸 序列的程度, 或 (3) 通過使用例如考馬斯藍或優選銀染色, 在還原性或非還原性條件下的 SDS-PAGE( 十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳 ), 達到同質。既然抗體的天然環境的至少 一種成分不會存在, 那么分離的抗體包括重組細胞內的原位抗體。 然而, 分離的抗體通常通 過至少一個純化步驟來制備。
     “分離的” 核酸分子是這樣的核酸分子, 其被鑒定并與至少一種污染性核酸分子分 離, 其與所述至少一種污染性核酸分子通常在所述核酸的天然來源中締合。分離的核酸分 子不同于其在自然界中被發現時的形式或環境。因此, 分離的核酸分子不同于存在于天然細胞中的核酸分子。然而, 分離的核酸分子包括包含在通常表達核酸分子的細胞中的核酸 分子 ( 例如, 編碼抗體的核酸 ), 其中, 例如, 所述核酸分子存在的染色體位置與天然細胞的 染色體位置不同。
     術語 “依照 Kabat 的可變結構域殘基編號方式” 或 “依照 Kabat 的氨基酸位置編號 方式” 及其變化形式指 Kabat 等, Sequences of Proteins ofImmunological Interest( 免 疫學感興趣的蛋白的序列 ), 第 5 版, PublicHealth Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD.(1991) 中的用于抗體編制的重鏈可變結構域或輕鏈可變結構域的編 號系統。使用此編號系統, 實際的線性氨基酸序列可包含較少或另外的氨基酸, 對應于可 變結構域 FR 或 CDR 的縮短或插入。例如, 重鏈可變結構域可包含 H2 的殘基 52 后的單一 氨基酸插入物 ( 依照 Kabat 為殘基 52a) 及重鏈 FR 殘基 82 后的多個插入殘基 ( 例如依照 Kabat 為殘基 82a、 82b 和 82c 等 )。給定抗體的 Kabat 殘基編號方式可通過將抗體序列與 “標準” Kabat 編號序列的同源區進行比對來確定。
     術語 “基本相似” 或 “基本不同, ” 用于本文時, 是指在兩個數值 ( 通常一個與本發 明的抗體相關, 而另一個與參照 / 比較抗體相關 ) 之間的足夠高程度的相似性, 從而使本領 域技術人員認為在通過所述值 ( 例如, Kd 值 ) 測量的生物學特征的背景下, 在兩個值之間 的差異是具有很少或沒有生物學和 / 或統計學顯著性的。在所述兩個值之間的差異作為參 照 / 比較抗體的值的函數優選小于約 50%, 優選小于約 40%, 優選小于約 30%, 優選小于約 20%, 和 / 或優選小于約 10%。
     “結合親合力” 通常指分子 ( 例如抗體 ) 的單一結合位點與其結合配偶體 ( 例如抗 原 ) 之間全部非共價相互作用總和的強度。除非另有說明, 在用于本文時, “結合親合力” 指 反映結合對 ( 例如抗體與抗原 ) 的成員之間 1 ∶ 1 相互作用的固有結合親合力。分子 X 對 其配偶體 Y 的親合力通常可用解離常數 (Kd) 來表述。合乎需要的是 Kd 為 1x10-7, 1x10-8, 5x10-8, 1x10-9, 3x10-9, 5x10-9, 或甚至 1x10-10 或更強。親合力可通過本領域知道的常用方法 來測量, 包括本文中所描述的那些方法。低親合力抗體通常緩慢的結合抗原且趨于容易解 離, 而高親合力抗體通常更快速的結合抗原且趨于保持更長時間的結合。本領域知道測量 結合親合力的多種方法, 其中任一種都可用于本發明的目的。具體說明型實施方案在下文 中描述。
     在一個實施方案中, 根據本發明的 “Kd” 或 “Kd 值” 通過如在下面測定法中所述用 目的抗體的 Fab 形式和其抗原進行的放射性標記的抗原結合測定法 (RIA) 測量 : 所述測定 法測量 Fabs 對抗原的溶液結合親合力, 這通過在存在滴定系列的未標記抗原時, 用最小濃 125 度的 ( I)- 標記的抗原來平衡 Fab, 接著用抗 -Fab 抗體 - 包被的板捕獲結合的抗原來進行 (Chen, 等, (1999) 分子生物學雜志 (J.Mol.Biol.)293 : 865-881)。 為了確定測定的條件, 將 微量滴定板 (Dynex) 用 5μg/ml 的在 50mM 碳酸鈉 (pH 9.6) 中的捕獲抗 -Fab 抗體 (Cappel Labs) 包被過夜, 并隨后用 PBS 中的 2% (w/v) 牛血清白蛋白在室溫 ( 約 23℃ ) 封閉 2-5 小 時。在非吸附板 (Nunc#269620) 中, 將 100pM 或 26pM[125I]- 抗原與目的 Fab 的系列稀釋物 混合 ( 例如, 與在 Presta 等, (1997) 癌癥研究 (Cancer Res).57 : 4593-4599 中的抗 -VEGF 抗體, Fab-12 的評價一致 )。 接著, 將目的 Fab 溫育過夜 ; 然而溫育可以持續更長的階段 ( 例 如 65 小時 ) 從而確保達到平衡。 隨后, 將混合物轉移到捕獲板中來在室溫進行溫育 ( 例如, 1 小時 )。接著, 去除溶液, 并將所述板用在 PBS 中的 0.1%吐溫 -20 洗滌 8 次。當所述板已經干燥時, 加入 150μl/ 孔的閃爍劑 (MicroScint-20 ; Packard), 并將所述板在 Topcountγ 計數器 (Packard) 上計數 10 分鐘。選擇提供少于或等于 20%的最大結合的每種 Fab 的濃 度用在競爭性結合測定法中。 根據另一個實施方案, Kd 或 Kd 值是通過使用表面等離振子共 TM TM 振測定法使用 BIAcore -2000 或 BIAcore -3000(BIAcore, Inc., Piscataway, NJ) 在 25℃ 使用固定化抗原 CM5 芯片以約 10 個響應單位 (RU) 測量的。 簡言之, 依照供應商的說明書用 鹽酸 N- 乙基 -N’ -(3- 二甲基氨基丙基 )- 碳化二亞胺 (N-ethyl-N’ -(3-dimethylaminoprop yl)-carbodiimide hydrochloride)(EDC) 和 N- 羥基琥珀酰亞胺 (N-hydroxysuccinimide) (NHS) 活化羧甲基化葡聚糖生物傳感器芯片 (CM5, BIAcore Inc.)。用 10mM 乙酸鈉 pH4.8 將抗原稀釋至 5μg/ml( 約 0.2μM), 然后以 5μl/ 分鐘的流速注入以獲得約 10 個響應單 位 (RU) 的偶聯蛋白質。注入抗原后, 注入 1M 乙醇胺以封閉未反應的基團。為了進行動力 學測量, 將 Fab 的兩倍連續稀釋液 (0.78nM 至 500nM) 在 25℃以約 25μl/ 分鐘的流速注入 在含 0.05%吐溫 20 的 PBS(PBST) 中。 在一些實施方案中, 下列的改進用于表面等離振子共 振測定法 : 將抗體固定在 CM5 生物傳感器芯片以達到大約 400RU, 并用于動力學測量, 靶蛋 白 ( 例如, FGFR3-IIIb 或 -IIIc) 的兩倍系列稀釋液 ( 從 67nM 開始 ) 在 25℃以約 30ul/ 分 鐘的流速注入至 PBST 緩沖液中。 使用簡單一對一朗格繆爾結合模型 (one-to-oneLangmuir binding model)(BIAcore 評價軟件 3.2 版 (BIAcore EvaluationSoftware version 3.2)) 通過同時擬合締合和解離傳感圖來計算締合速率 (kon) 和解離速率 (koff)。平衡解離常數 (Kd) 以比率 koff/kon 計算。參見例如 Chen 等, (1999)J.Mol.Biol.( 分子生物學雜志 )293 : 865-881。如果根據上文表面等離振子共振測定法, 締合速率 (on-rate) 超過 106M-1S-1, 則 締合速率可使用熒光淬滅技術來測定, 即如在分光計諸如配備了斷流裝置的分光光度計 (Aviv Instruments) 或 8000 系列 SLM-Aminco 分光光度計 (ThermoSpectronic) 中用攪拌 比色杯 (stirred cuvette) 測量, 在存在漸增濃度的抗原的條件下, 測量 PBS, pH 7.2 中的 20nM 抗 - 抗原抗體 (Fab 形式 ) 在 25℃的熒光發射強度 ( 激發= 295nm ; 發射= 340nm, 16nm 通帶 ) 的升高或降低。
     根據本發明的 “締合速率” (on-rate, 或 rate of association, 或 association TM TM rate) 或 “kon”也可使用 BIAcore -2000 或 BIAcore -3000(BIAcore, Inc., Piscataway, NJ) 采用上述相同的表面等離振子共振技術, 在 25℃利用固定的抗原 CM5 芯片以約 10 個響 應單位 (RU) 來測定。簡言之, 依照供應商的說明書用鹽酸 N- 乙基 -N’ -(3- 二甲基氨基丙 基 )- 碳化二亞胺 (EDC) 和 N- 羥基 - 琥珀酰亞胺 (NHS) 活化羧甲基化葡聚糖生物傳感器芯 片 (CM5, BIAcore Inc.)。用 10mM 乙酸鈉 pH4.8 將抗原稀釋至 5μg/ml( 約 0.2μM), 然后 以 5μl/ 分鐘的流速注入至獲得約 10 個響應單位 (RU) 的偶聯蛋白質。注入抗原后, 注入 1M 乙醇胺以封閉未反應的基團。為了進行動力學測量, 在 25℃以約 25μl/ 分鐘的流速在 含 0.05%吐溫 20 的 PBS(PBST) 中注入 Fab(0.78nM 至 500nM) 的兩倍連續稀釋液。在一些 實施方案中, 下列的改進用于表面等離振子共振測定法 : 將抗體固定在 CM5 生物傳感器芯 片以達到大約 400RU, 并對于動力學測量, 靶蛋白 ( 例如, FGFR3-IIIb 或 -IIIc) 的兩倍連續 稀釋液 ( 從 67nM 開始 ) 在 25℃以約 30ul/ 分鐘的流速注入至 PBST 緩沖液中。使用簡單一 對一朗格繆爾 (Langmuir) 結合模型 (BIAcore Evaluation Software version 3.2) 通過 同時擬合締合和解離 S 型曲線計算締合速率 (kon) 和解離速率 (koff)。平衡解離常數 (Kd) 以比率 koff/kon 計算。參見例如 Chen, Y. 等, (1999)J.Mol.Biol.( 分子生物學雜志 )293 :865-881。然而, 如果根據上文表面等離振子共振測定法, 締合速率超過 106M-1S-1, 那么締 合速率優選地使用熒光淬滅技術來測定, 即根據分光計諸如配備了斷流裝置的分光光度計 (stop-flow equippedspectrophometer)(Aviv Instruments) 或 8000 系列 SLM-Aminco 分 光光度計 (ThermoSpectronic) 中用攪拌比色杯的測量, 在存在濃度漸增的抗原的條件下, 測量 PBS, pH 7.2 中的 20nM 抗 - 抗原抗體 (Fab 形式 ) 在 25℃的熒光發射強度 ( 激發= 295nm ; 發射= 340nm, 16nm 帶通 ) 的升高或降低。
     當用于本文時, 術語 “載體” 意在指能夠運送已經與其連接的另一核酸的核酸分 子。一種類型的載體是 “質粒” , 其指環狀雙鏈 DNA 環, 另外的 DNA 區段可以連接在該環狀雙 鏈 DNA 環中。另一種類型的載體是噬菌體載體。另一種類型的載體是病毒載體, 其中另外 的 DNA 區段可以連接至病毒基因組中。某些載體能夠在已經引入它們的宿主細胞中自主復 制 ( 例如, 具有細菌復制起始點的細菌載體和附加型哺乳動物載體 )。其他載體 ( 例如, 非 附加型哺乳動物載體 ) 在引入至宿主細胞中時可以整合至宿主細胞的基因組中, 并且因此 它們與宿主基因組一起復制。 此外, 某些載體能夠指導與它們可操作地連接的基因的表達。 這樣的載體在本文中稱為 “重組表達載體” ( 或簡單地, “重組載體” )。通常, 用于重組 DNA 技術中的表達載體經常是質粒的形式。在本說明書中, “質粒” 和 “載體” 可以互換使用, 因 為質粒是最普遍使用的載體形式。 “多核苷酸” 或 “核酸” 當在本文中可互換使用時, 是指任意長度的核苷酸的聚合 物, 包括 DNA 和 RNA。核苷酸可以是脫氧核糖核苷酸、 核糖核苷酸、 修飾的核苷酸或堿基、 和 / 或它們的類似物、 或可以通過 DNA 或 RNA 聚合酶、 或通過合成反應摻入至聚合物中的任何 基質。多核苷酸可以包含修飾的核苷酸, 諸如甲基化的核苷酸和它們的類似物。如果存在, 可以在所述聚合物組裝之前或之后施加對核苷酸結構的修飾作用。核苷酸的序列可以被 非核苷酸成分中斷。多核苷酸可以在合成后進一步被修飾, 諸如通過與標記物綴合。其他 類型的修飾作用包括, 例如, “帽 (caps)” , 一個或多個天然存在的核苷酸被類似物的置換, 核苷酸間修飾諸如, 例如, 具有不帶電荷的鍵的那些 ( 例如, 膦酸甲酯, 膦酸三酯, 氨基磷酸 酯 (phosphoamidates), 氨基甲酸酯, 等 ) 和具有帶電荷鍵的那些 ( 例如, 硫代磷酸酯, 二硫 代磷酸酯, 等 ), 包含側基結構部分的那些, 諸如, 例如, 蛋白質 ( 例如, 核酸酶, 毒素, 抗體, 信號肽, 聚 -L- 賴氨酸, 等 ), 具有嵌入劑的那些 ( 例如, 吖啶, 補骨脂素 (psoralen), 等 ), 包含螯合劑的那些 ( 例如, 金屬, 放射性金屬, 硼, 氧化性金屬, 等 ), 包含烷化劑的那些, 具 有修飾的鍵的那些 ( 例如, α 異頭核酸, 等 ), 以及一種或多種未修飾形式的多核苷酸。此 外, 通常存在于糖中的任一個羥基可以被例如膦酸酯基團、 磷酸酯基團置換, 被標準的保護 基團保護, 或被活化以制備與另外的核苷酸連接的另外的鍵, 或可以與固體或半固體的支 持體綴合。5’ 和 3’ 末端 OH 可以被磷酸化或被胺或 1-20 個碳原子的有機封端基團結構部 分取代。其他羥基也可以被衍生為標準的保護基團。多核苷酸也可以包含本領域中普遍已 知的核糖或脫氧核糖糖類的類似形式, 包括, 例如, 2’ -O- 甲基 -, 2’ -O- 烯丙基, 2’ -氟-或 2’ - 疊氮基 - 核糖, 碳環糖類似物, α- 異頭糖, 差向異構糖諸如阿拉伯糖, 木糖或來蘇糖, 吡 喃糖, 呋喃糖, 景天庚酮糖 (sedoheptulose), 無環類似物和堿性核苷類似物諸如甲基核糖 核苷。一個或多個磷酸二酯鍵可以被可選的連接基團置換。這些可選的連接基團包括, 但 ), P(S)S(“二硫代酯 (dithioate)” ), 不限于, 其中磷酸酯被 P(O)S(“硫代酯 (thioate)” (O)NR2(“酰胺化物” ), P(O)R, P(O)OR’ , CO 或 CH2(“甲縮醛 (formacetal)” ) 置換的實施
     方案, 其中每個 R 或 R’ 獨立地是 H 或取代的或未取代的烷基 (1-20C), 任選地包含醚 (-O-) 鍵, 芳基, 烯基, 環烷基, 環烯基或 araldyl。多核苷酸中的所有鍵沒有必要是相同的。前面 的描述適用于本文提及的所有多核苷酸, 包括 RNA 和 DNA。
     “寡核苷酸, ” 當用于本文中時, 通常是指短的、 - 般是單鏈的、 - 般是合成的多核苷 酸, 其通常, 但非必要地, 長度小于約 200 個核苷酸。術語 “寡核苷酸” 和 “多核苷酸” 不互 斥。上面對于多核苷酸的描述同樣和完全地適用于寡核苷酸。
     關于肽或多肽序列的 “百分比 (% ) 氨基酸序列同 - 性” , 定義為將候選序列與具體 肽或多肽序列在進行序列比對 ( 并在必要時導入空隙 ) 以獲取最大百分比序列同 - 性, 且 不將任何保守置換視為序列同 - 性的部分之后, 候選序列中的氨基酸殘基與所述具體肽或 多肽序列中的氨基酸殘基相同的百分數。 可使用本領域技術內的各種方法進行序列比對以 便測定氨基酸序列同 - 性百分比, 例如, 使用公眾可得到的計算機軟件如 BLAST、 BLAST-2、 ALIGN 或 Megalign(DNASTAR) 軟件。 本領域技術人員可以決定測量比對的適宜參數, 包括對 所比較的序列全長獲得最大比對所需的任何算法。然而, 為此目的, 氨基酸序列同 - 性%值 使用序列比較計算機程序 ALIGN-2 產生, 其中用于 ALIGN-2 程序的全部源代碼在下面的表 A 中提供。ALIGN-2 序列比對計算機程序的作者是 Genentech, Inc., 該源代碼已經隨用戶 文檔提交至美國版權局 (Washington D.C., 20559), 其美國版權注冊登記號為 TXU510087。 公眾可通過 Genentech, Inc.(South SanFrancisco, 加利福尼亞 ) 得到 ALIGN-2 程序, 或者 可以從例如 WO2007/001851 中提供的源代碼進行編譯。 ALIGN-2 程序應當為在 UNIX 操作系 統, 優選在數字 UNIX V4.0D 上使用而進行編譯。ALIGN-2 程序設定了所有序列比對參數并 且不變。
     在 ALIGN-2 應用于氨基酸序列比較的情況中, 給定氨基酸序列 A 相對于 (to)、 與 (with)、 或針對 (against) 給定氨基酸序列 B 的氨基酸序列同 - 性% ( 或者這樣說 : 給定氨 基酸序列 A 具有或含有相對于、 與或針對給定氨基酸序列 B 的某 -%氨基酸序列同 - 性 ) 如 下計算 :
     X/Y 比值乘以 100,
     其中 X 是用序列比對程序 ALIGN-2 在該程序的 A 和 B 比對中評分為相同匹配的氨 基酸殘基數, 且其中 Y 是 B 中的氨基酸殘基總數。可以理解, 當氨基酸序列 A 與氨基酸序列 B 的長度不相等時, A 相對于 B 的氨基酸序列同 - 性%將不等于 B 相對于 A 的氨基酸序列 同 - 性%。
     在 - 些實施方案中, 兩個或多個氨基酸序列至少 50%, 60%, 70%, 80%, 或 90%相 同。在 - 些實施方案中, 兩個或多個氨基酸序列至少 95%, 97%, 98%, 99%, 或甚至 100% 相同。除非另外特別指出, 使用 ALIGN-2 計算機程序如在緊接的前面段落中所述獲得在本 文中所用的所有的%氨基酸序列同 - 性的值。
     術語 “FGFR3, ” 當在本文中使用時, 除非具體或另外根據上下文指示, 是指任何天 然或變體 ( 不論天然或合成的 )FGFR3 多肽 ( 例如, FGFR3-IIIb 同種型或 FGFR3-IIIc 同種 型 )。術語 “天然序列” 具體包涵天然存在的截短形式 ( 例如, 細胞外結構域序列或跨膜亞 基序列 ), 天然存在的變體形式 ( 例如, 選擇性拼接形式 ) 和天然存在的等位基因變體。術 語 “野生型 FGFR3” 通常是指包含天然存在的 FGFR3 蛋白的氨基酸序列的多肽。術語 “野生 型 FGFR3 序列” 通常是指存在于天然存在的 FGFR3 中的氨基酸序列。術語 “FGFR3 配體, ” ( 可互換地稱為 “FGF” ) 當在本文中使用時, 除非具體或另外根 據上下文指示, 是指任何天然或變體 ( 不論天然或合成的 )FGFR3 配體 ( 例如, FGF1, FGF2, FGF4, FGF8, FGF9, FGF17, FGF18, FGF23) 多肽。術語 “天然序列” 具體地包涵天然存在的截 短形式 ( 例如, 細胞外結構域序列或跨膜亞基序列 ), 天然存在的變體形式 ( 例如, 選擇性拼 接形式 ) 和天然存在的等位基因變體。術語 “野生型 FGFR3 配體” 通常是指包含天然存在 的 FGFR3 配體蛋白的氨基酸序列的多肽。術語 “野生型 FGFR3 配體序列” 通常是指存在于 天然存在的 FGFR3 配體中的氨基酸序列。
     “FGFR3 激活” 是指 FGFR3 受體的激活或磷酸化。一般而言, FGFR3 激活導致信號轉 導 ( 例如, 由 FGFR3 受體的胞內激酶結構域磷酸化 FGFR3 或底物多肽中的酪氨酸殘基所導 致 )。FGFR3 激活可由 FGFR 配體結合目的 FGFR3 受體介導。結合 FGFR3 的 FGFR3 配體 ( 例 如, 諸如 FGF1 或 FGF9) 可激活 FGFR3 的激酶結構域, 從而導致 FGFR3 中的酪氨酸殘基的磷 酸化和 / 或另外的一種或多種底物多肽中的酪氨酸殘基的磷酸化。
     術語 “組成型” 當用于本文中時, 當例如應用于受體激酶活性時, 是指受體的連續 信號傳導活性, 該活性不依賴于配體或其他激活分子的存在。 取決于受體的性質, 所有活性 可以是組成型的或受體的活性可以進一步被其他分子 ( 例如, 配體 ) 的結合激活。導致受 體的激活的細胞事件對于本領域普通技術人員是公知的。例如, 激活可以包括低聚化 ( 例 如, 二聚化, 三聚化等 ) 成為更高級的受體復合物。復合物可以包含單一的蛋白物種, 即, 均 聚復合物 (homomeric complex)。 備選地, 復合物可以包含至少兩種不同的蛋白物種, 即, 異 聚復合物 (heteromeric complex)。 復合物形成可以由例如, 正常或突變體形式的受體在細 胞表面上的過表達導致。復合物形成也可以由受體中一個或多個特定的突變導致。
     術語 “配體 - 不依賴性” 當用于本文中時, 當例如應用于受體信號傳導活性時, 是 指不依賴于配體的存在的信號傳導活性。具有配體 - 不依賴性激酶活性的受體沒有必要排 除用于產生另外的激酶活性激活的配體與該受體的結合。
     術語 “配體 - 依賴性” 當用于本文中時, 當例如應用于受體信號傳導活性時, 是指 依賴于配體的存在的信號傳導活性。
     短語″基因擴增″是指這樣的過程, 通過該過程在特定細胞或細胞系中形成多拷 貝的基因或基因片段。被復制的區 ( 一段擴增的 DNA) 常常被稱為 “擴增子” 。通常, 所產生 的信使 RNA(mRNA) 的量, 即基因表達的水平, 也與被表達的該特定基因產生的拷貝數成比 例地增加。
     ″酪氨酸激酶抑制劑″是這樣的分子, 其在一些程度上抑制酪氨酸激酶如 FGFR3 受體的酪氨酸激酶活性。
     “顯示 FGFR3 表達、 擴增或激活” 的癌癥或生物學樣品是在診斷檢測中, 表達 ( 包括 過表達 )FGFR3, 具有擴增的 FGFR3 基因, 和 / 或以其他方式證明 FGFR3 的激活或磷酸化的癌 癥或生物學樣品。
     ″顯示 FGFR3 激活″的癌癥或生物學樣品是在診斷測試中, 證明 FGFR3 的激活或 磷酸化的癌癥或生物學樣品。此類激活可直接確定 ( 例如通過 ELISA 測量 FGFR3 磷酸化 ) 或間接確定。
     ″顯示 FGFR3 激活″的癌癥或生物學樣品是在診斷檢測中, 表現出 FGFR3 的組成 型激活或磷酸化的癌癥或生物學樣品。 此類激活可直接確定 ( 例如通過 ELISA 測量 c-FGFR3磷酸化 ) 或間接確定。
     ″顯示 FGFR3 擴增″的癌癥或生物學樣品是在診斷檢測中具有擴增的 FGFR3 基因 的癌癥或生物學樣品。
     ″顯示 FGFR3 易位″的癌癥或生物學樣品是在診斷檢測中具有易位的 FGFR3 基因 的癌癥或生物學樣品。FGFR3 易位的實例是 t(4 ; 14) 易位, 其發生在一些多發性骨髓瘤腫 瘤中。
     “磷酸 -ELISA 測定 (phospho-ELISA assay)” 在本文中是其中在酶聯免疫吸附測 定法 (ELISA) 中評估一種或多種 FGFR3、 底物或下游信號傳導分子的磷酸化的測定, 該測定 使用試劑, 通常是抗體, 檢測磷酸化的 FGFR3、 底物或下游信號傳導分子。在一些實施方案 中, 使用檢測磷酸化的 FGFR3 或 pMAPK 的抗體。該測定可對細胞裂解物、 優選來自新鮮的或 冷凍的生物學樣品的細胞裂解物進行。
     ″顯示配體 - 不依賴性 FGFR3 激活″的癌癥或生物學樣品是在診斷檢測中, 表現 出 FGFR3 的配體 - 不依賴性激活或磷酸化的癌癥或生物學樣品。此類激活可直接確定 ( 例 如通過 ELISA 測量 FGFR3 磷酸化 ) 或間接確定。
     ″顯示配體 - 依賴性 FGFR3 激活″的癌癥或生物學樣品是在診斷檢測中, 表現出 FGFR3 的配體 - 依賴性激活或磷酸化的癌癥或生物學樣品。此類激活可直接確定 ( 例如通 過 ELISA 測量 FGFR3 磷酸化 ) 或間接確定。
     ″顯示配體 - 不依賴性 FGFR3 激活″的癌癥或生物學樣品是在診斷檢測中, 表現 出 FGFR3 的配體 - 不依賴性激活或磷酸化的癌癥或生物學樣品。此類激活可直接確定 ( 例 如通過 ELISA 測量 FGFR3 磷酸化 ) 或間接確定。
     具有 “FGFR3 過表達或擴增” 的癌細胞指與同一組織類型的非癌細胞相比, 具有顯 著更高的 FGFR3 蛋白質或基因水平的癌細胞。此類過表達可以是由基因擴增或者轉錄或翻 譯增加引起。可在診斷或預后測定中通過評估細胞表面上存在的增加的 FGFR3 蛋白質水平 ( 例如通過免疫組化測定, IHC) 來測定 FGFR3 的過表達或擴增。備選地, 或另外地, 可測量 細胞中編碼 FGFR3 的核酸的水平, 例如通過熒光原位雜交 (FISH ; 參見 1998 年 10 月公布的 WO98/45479)、 Southern 印跡或聚合酶鏈式反應 (PCR) 技術, 諸如定量實時 PCR(qRT-PCR)。 在上述測定法之外, 熟練從業人員還可利用多種體內測定法。 例如, 可將患者體內細胞暴露 于任選用可檢測標記物例如放射性同位素標記的抗體, 并且可評估該抗體與患者體內細胞 的結合, 例如通過外部掃描放射性或通過分析取自事先已暴露于所述抗體的患者的活組織 檢查。
     術語 “突變” 在本文中使用時指特定蛋白質或核酸 ( 基因, RNA) 分別相對于野生型 蛋白質或核酸的氨基酸或核酸序列的差異。 突變的蛋白質或核酸可以由基因的一個等位基 因 ( 雜合的 ) 或兩個等位基因 ( 純合的 ) 表達或者在其中找到, 而且它可以是體細胞的或 種系的。在本發明中, 突變一般是體細胞的。突變包括序列重排, 諸如插入、 缺失、 和點突變 ( 包括單核苷酸 / 氨基酸多態性 )。
     “抑制” 是與參照相比降低或減少活性、 功能, 和 / 或量。
     當一種藥劑模擬目的多肽 ( 例如, FGFR 配體, 諸如 FGF1 或 FGF9) 的至少一種功能 性活性時, 其具有 “激動劑活性或功能” 。
     “激動劑抗體” 在本文中使用時是模擬目的多肽 ( 例如, FGFR 配體, 諸如 FGF1 或FGF9) 的至少一種功能性活性的抗體。
     蛋白質 “表達” 指基因中所編碼的信息轉換成信使 RNA(mRNA), 然后轉換成蛋白質。
     在本文中, “表達” 目的蛋白質 ( 諸如 FGF 受體或 FGF 受體配體 ) 的樣品或細胞指 這樣的樣品或細胞, 在所述樣品或細胞中確定存在有編碼該蛋白質的 mRNA, 或蛋白質 ( 包 括其片段 )。
     “免疫綴合物” ( 可互換地稱為 “抗體 - 藥物綴合物” 或 “ADC” ), 是指與一種或多 種細胞毒性劑綴合的抗體, 所述細胞毒性劑諸如化療劑、 藥物、 生長抑制劑、 毒素 ( 例如蛋 白毒素, 細菌、 真菌、 植物或動物來源的酶活性毒素, 或其片段 ) 或放射性同位素 ( 即放射綴 合物 )。
     術語 “Fc 區” 用于本文時一般是指包含免疫球蛋白重鏈 C 末端的多肽序列的二聚 體復合物, 其中 C 末端多肽序列是可以通過木瓜蛋白酶消化完整抗體獲得的序列。Fc 區可 以包括天然或變體 Fc 序列。雖然免疫球蛋白重鏈 Fc 序列的邊界可以變化, 但是人 IgG 重 鏈 Fc 序列通常定義為 Fc 序列自大約 Cys226 位置或大約 Pro230 位置的氨基酸殘基至羧基 末端的區段。免疫球蛋白的 Fc 序列一般包含兩個恒定結構域, 即 CH2 結構域和 CH3 結構 域, 任選包含 CH4 結構域。Fc 區的 C- 末端賴氨酸 ( 依照 EU 編號系統的殘基 447) 可以被移 除, 例如, 在抗體的純化期間或通過編碼所述抗體的核酸的重組改造。因此, 根據本發明包 含具有 Fc 區的抗體的組合物可以包含具有 K447 的抗體、 所有 K447 均被移除的抗體、 或具 有 K447 殘基的抗體和沒有 K447 殘基的抗體的混合物。
     本文中 “Fc 多肽” 的意思是構成 Fc 區的多肽之一。Fc 多肽可從任何適當的免疫 球蛋白 ( 如 IgG1, IgG2, IgG3, 或 IgG4 亞型, IgA, IgE, IgD 或 IgM) 獲得。在一些實施方案中, Fc 多肽包含部分或全部野生型鉸鏈序列 ( 一般在其 N 末端 )。在一些實施方案中, Fc 多肽 不包含功能的或野生型鉸鏈序列。
     “封閉” 抗體或抗體 “拮抗劑” 是抑制或降低其結合的抗原的生物學活性的抗體。優 選的封閉抗體或拮抗性抗體完全抑制抗原的生物學活性。
     “裸抗體 (naked antibody)” 是沒有綴合異源分子 ( 如細胞毒性結構部分或放射 性標記 ) 的抗體。
     具有指定抗體的 “生物學特征” 的抗體指具有該指定抗體區別于結合相同抗原的 其它抗體的一項或多項生物學特征的抗體。
     為了篩選這樣的抗體, 其結合由目的抗體結合的抗原的表位, 可以實施常規交叉 阻斷測定法, 諸如抗體, 實驗室手冊 (Antibodies, A Laboratory Manual), 冷泉港實驗室, Ed Harlow 和 David Lane(1988) 中所記載的。
     為增加包含本發明的氨基酸序列的抗體或多肽的半衰期, 可將拯救受體 (salvage receptor) 結合表位連接到抗體 ( 尤其是抗體片段 ), 如例如美國專利 5,739,277 所述。例 如, 可將編碼拯救受體結合表位的核酸分子與編碼本發明多肽序列的核酸符合閱讀框地連 接, 從而使改造的核酸分子所表達的融合蛋白包含所述拯救受體結合表位和本發明的多肽 序列。本文所用的術語 “拯救受體結合表位” 指 IgG 分子 ( 例如 IgG 1, IgG2, IgG3, 或 IgG4) 的 Fc 區的表位, 其負責增加 IgG 分子的體內血清半衰期 ( 例如 Ghetie 等, Ann.Rev.Immunol. ( 免疫學年評 )18 : 739-766(2000), 表 1)。在其 Fc 區具有取代并且血清半衰期增加的抗 體 也 見 于 WO00/42072, WO 02/060919 ; Shields 等, 生 物 化 學 雜 志 (J.Biol.Chem.)276 :6591-6604(2001) ; Hinton, 生物化學雜志 (J.Biol.Chem.)279 : 6213-6216(2004)) 的描述。 在另一個實施方案中, 例如通過連接其它多肽序列, 也可以增加血清半衰期。例如, 本發明 的方法中有用的抗體或其它多肽可與血清白蛋白或血清白蛋白的結合 FcRn 受體的部分 或血清白蛋白結合肽連接, 從而使所述血清白蛋白結合所述抗體或多肽, 例如這樣的多肽 序列見于 WO01/45746 的公開。在一個優選的實施方案中, 所連接的血清白蛋白肽包含氨 基酸序列 DICLPRWGCLW(SEQID NO : 183)。在另一個實施方案中, Fab 的半衰期是通過這些 方法增加的。血清白蛋白結合肽序列也見 Dennis 等, 生物化學雜志 (J.Biol.Chem.)277 : 35035-35043(2002)。
     “片段” 意指優選包含參照核酸分子或多肽的完整長度的至少 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 或更多的多肽或核酸分子的部分。片段可以包含 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 或 100, 200, 300, 400, 500, 600, 或更多個核苷酸或 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 140, 160, 180, 190, 200 個氨基酸或更多個氨基酸。
     關于本發明的抗體的短語 “很少至沒有激動劑功能” 在本文中使用時是指例如, 在 施用于受試者時, 所述抗體不引發有生物學意義的量的激動劑活性。 如本領域中所理解的, 活性的量可以定量地或定性地確定, 只要在本發明的抗體和參照副本之間可以作出比較。 所述活性可以根據本領域已知的任何測定或技術來測量或檢測, 包括, 例如, 本文所述的那 些。本發明的抗體及其參照副本的活性的量可以平行地確定或在單獨的運行中確定。在一 些實施方案中, 本發明的二價抗體不具有實質的激動劑功能。
     術語 “凋亡” 和 “凋亡活性” 以廣義使用, 并且是指哺乳動物中細胞死亡的有秩序 或可控形式, 其典型地伴有一種或多種特征性細胞改變, 包括細胞質的凝聚, 質膜微絨毛的 損失, 細胞核的分裂 (segmentation), 染色體 DNA 的降解或線粒體功能的喪失。 此活性可以 使用本領域中已知的技術確定和測量, 例如, 通過細胞活力測定, FACS 分析或 DNA 電泳, 和 更具體地通過膜聯蛋白 V(annexin V) 的結合, DNA 的片段化, 細胞收縮, 內質網的擴張, 細 胞片段化, 和 / 或膜囊泡的形成 ( 稱為凋亡小體 ) 確定和測量。
     術語 “抗體” 和 “免疫球蛋白” 以最廣義可互換使用, 并且包括單克隆抗體 ( 例如, 全長或完整的單克隆抗體 )、 多克隆抗體、 多價抗體、 多特異性抗體 ( 例如雙特異性抗體, 只 要它們顯示所需的生物學活性 ), 并且還可以包括某些抗體片段 ( 如本文中更詳細地描述 的那樣 )。抗體可以是人的、 人源化的和 / 或親和力成熟的。
     術語 “可變的” 指可變結構域中的某些部分在抗體間序列差異廣泛且用于每種特 定抗體對其特定抗原的結合和特異性的事實。然而, 變異性并非均勻分布于抗體的整個可 變結構域。它集中于輕鏈和重鏈可變結構域中稱作互補性決定區 (CDRS) 或高變區的三個 區段。可變結構域中更加高度保守的部分被稱作構架 (FR)。天然重鏈和輕鏈的可變結構 域各自包含四個 FR 區, 它們大多采取 β- 折疊構象, 通過形成環狀連接且在有些情況中形 成 β- 折疊結構一部分的三個 CDRs 連接。每條鏈中的 CDRs 通過 FR 區非常接近的保持在 一起, 并與另一條鏈的 CDRs 一起促成抗體的抗原結合位點的形成 ( 參見 Kabat 等, 免疫學 感興趣的蛋白的序列 (Sequences of Proteins of Immunological Interest), 第 5 版, 國 立衛生研究所 (National Institute of Health), Bethesda, MD.(1991))。恒定結構域不 直接參與抗體與抗原的結合, 但展現出多種效應子功能, 諸如抗體在抗體依賴性細胞毒性 中的參與。抗體的木瓜蛋白酶消化產生兩個相同的抗原結合片段, 稱為 “Fab”片段, 所述 “Fab” 片段每個具有單抗原結合位點, 并且產生殘余的 “Fc” 片段, 其名稱反映其容易結晶的 能力。胃蛋白酶處理產生 F(ab’ )2 片段, 所述片段具有兩個抗原組合位點, 并且仍舊能夠交 聯抗原。
     “Fv” 是包含完整抗原識別和結合位點的最小抗體片段。在雙鏈 Fv 種類中, 此區由 一個重鏈可變結構域和一個輕鏈可變結構域以緊密的、 非共價締合的二聚體組成。在單鏈 Fv 種類中, 一個重鏈可變結構域和一個輕鏈可變結構域可以通過柔性肽接頭共價連接從而 使輕鏈和重鏈可以以類似于雙鏈 Fv 種類的 “二聚體” 結構締合。在這種構型中, 每個可變 結構域的三個 CDRs 相互作用從而限定在 VH-VL 二聚體的表面上的抗原結合位點。總而言 之, 六個 CDRs 將抗原結合特異性賦予抗體。然而, 即使是單個可變結構域 ( 或只包含對抗 原特異的三個 CDRs 的半個 Fv) 也具有識別和結合抗原的能力, 然而親和性低于完整結合位 點。
     Fab 片段還包含輕鏈的恒定結構域和重鏈的第一恒定結構域 (CH1)。Fab’ 片段與 Fab 片段的不同之處在于在重鏈 CH1 結構域的羧基端加入幾個殘基, 包括來自抗體鉸鏈區 的一個或多個半胱氨酸。Fab’ -SH 是本文關于 Fab’ 的名稱, 其中恒定結構域的半胱氨酸殘 基具有游離巰基。F(ab’ )2 抗體片段最初作為在它們之間具有鉸鏈半胱氨酸的 Fab’ 片段 對產生。還已知抗體片段的其它化學偶聯。
     基于抗體 ( 免疫球蛋白 ) 的恒定結構域的氨基酸序列, 可以將來自任何脊椎動物 物種的抗體 ( 免疫球蛋白 ) 的 “輕鏈” 分為兩種清楚區分的類型之一, 稱為 kappa(κ) 和 lambda(λ)。
     取決于免疫球蛋白的重鏈的恒定結構域的氨基酸序列, 可以將免疫球蛋白分為不 同的種類。存在五種主要的免疫球蛋白類別 : IgA, IgD, IgE, IgG, 和 IgM, 并且這些中的一 些可以進一步分為亞類 ( 同種型 ), 例如 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, 和 IgA2。對應于不同 類別的免疫球蛋白的重鏈恒定結構域分別被稱為 α, δ, ε, γ, 和 μ。不同類別的免疫球 蛋白的亞基結構和三維構型是眾所周知的。 “抗體片段” 僅包含完整抗體的一部分, 其中所 述部分優選地保留與該部分存在于完整抗體中時正常相關的至少一種、 優選大多數或全部 功能。抗體片段的實例包括 Fab、 Fab′、 F(ab′ )2 和 Fv 片段 ; 雙抗體 ; 線性抗體 ; 單鏈抗 體分子 ; 和由抗體片段形成的多特異性抗體。 在一個實施方案中, 抗體片段包含完整抗體的 抗原結合位點, 并且因此保留了結合抗原的能力。在另一個實施方案中, 抗體片段, 例如包 含 Fc 區的抗體片段保留了與 Fc 區存在于完整抗體中時正常相關的至少一種生物學功能, 抗體片段是 諸如 FcRn 結合, 抗體半衰期調節, ADCC 功能和補體結合。在一個實施方案中, 單價抗體, 其在體內的半衰期基本上類似于完整的抗體。 例如, 這樣的抗體片段可以在與 Fc 連接的抗原結合臂上包含能夠賦予該片段以體內穩定性的序列。
     術語 “高變區” 、 “HVR”或 “HV”在用于本文時指抗體可變結構域中序列上高度 可變和 / 或形成結構上限定的環的區域。通常, 抗體包含六個高變區 : 三個在 VH 中 (H1、 H2、 H3), 三個在 VL 中 (L1、 L2、 L3)。本文中使用且涵蓋許多高變區的敘述。Kabat 互補 性決定區 (CDR) 是以序列變異性為基礎的, 而且是最常用的 (Kabat 等, 免疫學感興趣的 蛋白的序列 (Sequences of Proteins of Immunological Interest), 第 5 版 . 公眾健康 服務 (Public Health Service), 國立衛生研究所 (National Institutes of Health),Bethesda, MD.(1991))。相反, Chothia 指結構環的位置 (Chothia 和 Lesk, 分子生物學雜志 (J.Mol.Biol.)196 : 901-917(1987))。AbM 高變區代表 Kabat CDRs 與 Chothia 結構環之間 的折衷, 而且由 Oxford Molecular 的 AbM 抗體建模軟件使用。 “接觸 (contact)” 高變區是 以對可獲得的復合物晶體結構的分析為基礎的。下文記錄了這些高變區中每一個的殘基。
     高變區可包括如下的 “延 伸 的 高 變 區” : VL 中 的 24-36 或 24-34(L1)、 46-56 或 50-56(L2) 和 89-97(L3) 及 VH 中 的 26-35(H1)、 50-65 或 49-65(H2) 和 93-102、 94-102 或 95-102(H3)。對于這些定義中的每一個, 可變結構域殘基是依照 Kabat 等, 見上文編號的。
     “構架” 或 “FR” 殘基指除本文中所定義的高變區殘基之外的那些可變結構域殘基。
     非人 ( 例如鼠 ) 抗體的 “人源化” 形式是包含衍生自非人免疫球蛋白的最少序列的 嵌合抗體。對于大多數部分, 人源化抗體是人免疫球蛋白 ( 接受體抗體 ), 其中接受體的高 變區殘基用具有期望特異性、 親和性和 / 或能力的非人物種 ( 供體抗體 )( 諸如小鼠、 大鼠、 兔或非人靈長類動物 ) 的高變區殘基替換。在有些情況中, 將人免疫球蛋白的構架區 (FR) 殘基用相應的非人殘基替換。此外, 人源化抗體可包含在接受體抗體中或在供體抗體中沒 有發現的殘基。 進行這些修飾是為了進一步改進抗體的性能。 一般而言, 所述人源化抗體將 包含基本上全部的至少一個、 典型地兩個可變結構域, 其中所有或基本上所有高變環對應 于非人免疫球蛋白的高變環, 且所有或基本上所有 FR 是人免疫球蛋白序列的 FR。 人源化抗 體任選還將包含至少部分免疫球蛋白恒定區 (Fc), 典型地是人免疫球蛋白的恒定區。更多 細節參見 Jones 等, 自然 (Nature)321 : 522-525(1986) ; Riechmann 等, 自然 (Nature)332 : 323-329(1988) ;及 Presta,現 代 結 構 生 物 學 觀 點 (Curr.Op.Struct.Biol.)2 : 593-596(1992)。還參見下面的綜述文章和其中引用的參考文獻 : Vaswani 和 Hamilton, Ann.Allergy, Asthma & Immunol.( 變 態 反 應、 哮 喘 和 免 疫 學 年 報 )1 : 105-115(1998) ; Harris, Biochem.Soc.Transactions( 生 物 化 學 會 會 刊 )23 : 1035-1038(1995) ; Hurle 和 Gross, Curr.Op.Biotech.( 生物技術現代評論 )5 : 428-433(1994)。
     “嵌合” 抗體 ( 免疫球蛋白 ) 具有與衍生自特定物種或屬于特定抗體類別或亞類的 抗體中的相應序列相同或同源的一部分重鏈和 / 或輕鏈 ( 而一條或多條鏈的剩余部分與衍
     生自另一物種或屬于另一抗體類別或亞類的抗體中的相應序列相同或同源 ), 以及此類抗 體的片段, 只要它們展現出期望的生物學活性 ( 美國專利號 4,816,567 和 Morrison 等, 美 國國家科學院學報 (Proc.Nat.Acad.Sci.USA)81 : 6851-6855(1984))。人源化抗體當在本 文中使用時是嵌合抗體的亞組。
     “單鏈 Fv” 或 “scFv”抗體片段包含抗體的 VH 和 VL 結構域, 其中這些結構域以 單多肽鏈存在。一般地, 所述 scFv 多肽在 VH 和 VL 結構域之間還包含多肽接頭, 所述接 頭使 scFv 形成對于抗原結合需要的結構。關于 scFv 的綜述參見例如 Pluckthun 于 The Pharmacology of MonoclonalAntibodies( 單 克 隆 抗 體 藥 理 學 ), 卷 113, Rosenburg 和 Moore 編輯, Springer-Verlag, New York, pp.269-315(1994) 中。
     “抗原” 是抗體可以選擇性結合的預定抗原。靶抗原可以是多肽, 碳水化合物, 核 酸, 半抗原或其他天然存在的或合成的化合物。優選地, 靶抗原是多肽。
     術語 “雙抗體 (diabodies)” 指具有兩個抗原結合位點的小抗體片段, 所述片段在 相同的多肽鏈 (VH-VL) 中包含與輕鏈可變結構域 (VL) 連接的重鏈可變結構域 (VH)。通過 使用太短所以不能在相同鏈上的兩個結構域之間配對的接頭, 迫使所述結構域與另一條鏈 的互補結構域配對從而產生兩個抗原結合位點。雙抗體更充分地描述于例如 EP 404,097 ; WO 93/11161 ; 和 Hollinger 等, 美 國 國 家 科 學 院 學 報 (Proc.Natl.Acad.Sci.USA)90 : 6444-6448(1993) 中。
     “人抗體” 指這樣的抗體, 其具有與由人生成的抗體的氨基酸序列對應的氨基酸序 列和 / 或使用本文所公開的用于生成人抗體的任何技術產生。人抗體的這種定義明確排除 包含非人抗原結合殘基的人源化抗體。
     “親和力成熟的” 抗體指在抗體的一個或多個 CDRs 中具有一處或多處改變的抗 體, 所述改變導致該抗體對抗原的親和性與沒有這些改變的親本抗體相比有所提高。優 選的親和力成熟的抗體將具有納摩爾或甚至皮摩爾量級的對靶抗原的親和性。親和力成 熟的抗體通過一些本領域已知方法來生成。Marks 等, 生物 / 技術 (Bio/Technology)10 : 779-783(1992) 記載了通過 VH 和 VL 結構域改組進行的親和性成熟。以下文獻記載了 CDR 和 / 或構架殘基的隨機誘變 : Barbas 等, 美國國家科學院學報 (Proc Nat.Acad.Sci, USA)91 : 3809-3813(1994) ; Schier 等, 基因 (Gene)169 : 147-155(1995) ; Yelton 等, 免疫學 雜志 (J.Immunol.)155 : 1994-2004(1995) ; Jackson 等, 免疫學雜志 (J.Immunol.)154(7) : 3310-9(1995) ; 及 Hawkins 等, 分子生物學雜志 (J.Mol.Biol.)226 : 889-896(1992)。
     抗體 “效應子功能” 指那些可歸于抗體 Fc 區 ( 天然序列 Fc 區或氨基酸序列變體 Fc 區 ) 且隨抗體同種型而變化的生物學活性。抗體效應子功能的實例包括 : C1q 結合和補 體依賴性細胞毒性 ; Fc 受體結合 ; 抗體依賴性細胞介導的細胞毒性 (ADCC) ; 吞噬作用 ; 細 胞表面受體 ( 例如 B 細胞受體 ) 下調 ; 和 B 細胞活化。
     “抗體依賴性細胞介導的細胞毒性” 或 “ADCC” 指其中結合到某些細胞毒性細胞 ( 例如天然殺傷 (NK) 細胞、 嗜中性粒細胞和巨噬細胞 ) 上存在的 Fc 受體 (FcR) 上的分泌 型 Ig 使得這些細胞毒性效應細胞能夠特異性結合攜帶抗原的靶細胞, 隨后用細胞毒素殺 死靶細胞的細胞毒性形式。抗體 “武裝” 細胞毒性細胞并且對于這種殺傷是絕對必需的。 介導 ADCC 的主要細胞即 NK 細胞只表達 FcγRIII, 而單核細胞表達 FcγRI、 FcγRII 和 FcγRIII。Ravetch 和 Kinet, 免疫學年評 (Annu.Rev.Immunol.)9 : 457-92(1991) 第 464 頁表 3 總結了造血細胞上的 FcR 表達。為了評估目的分子的 ADCC 活性, 可進行體外 ADCC 測 定法, 諸如美國專利號 5,500,362 或 5,821,337 或 Presta 美國專利號 6,737,056 中所記載 的。可用于此類測定法的效應細胞包括外周血單核細胞 (PBMC) 和天然殺傷 (NK) 細胞。備 選地或另外地, 可在體內評估目的分子的 ADCC 活性, 例如在動物模型中, 諸如 Clynes 等, PNAS(USA)95 : 652-656(1998) 中所公開的。
     “人效應細胞” 指表達一種或多種 FcR 并行使效應子功能的白細胞。優選該細胞至 少表達 FcγRIII 并行使 ADCC 效應子功能。介導 ADCC 的人白細胞的實例包括外周血單核 細胞 (PBMC)、 天然殺傷 (NK) 細胞、 單核細胞、 細胞毒性 T 細胞和嗜中性粒細胞, 優選 PBMCs 和 NK 細胞。效應細胞可以從天然來源 ( 例如從血液 ) 分離。
     “Fc 受體” 或 “FcR” 描述結合抗體 Fc 區的受體。優選 FcR 是天然序列人 FcR。此 外, 優選的 FcR 是結合 IgG 抗體的 FcR(γ 受體 ), 包括 FcγRI、 FcγRII 和 FcγRIII 亞類的 受體, 包括這些受體的等位基因變體和選擇性剪接形式。FcγRII 受體包括 FcγRIIA( “激 活受體” ) 和 FcγRIIB(“抑制受體” ), 它們具有相似的氨基酸序列, 區別主要在于其胞質結 構域。 活化受體 FcγRIIA 在其胞質結構域中包含免疫受體基于酪氨酸的活化基序 (ITAM)。 抑制受體 FcγRIIB 在其胞質結構域中包含免疫受體基于酪氨酸的抑制基序 (ITIM)( 參 見, , 免疫學年評 (Annu.Rev.Immunol.)15 : 203-234(1997) 中的綜述 )。FcR 的綜 述參見 Ravetch 和 Kinet, 免疫學年評 (Annu.Rev.Immunol.)9 : 457-92(1991) ; Capel 等, 免疫方法 (Immunomethods)4 : 25-34(1994) ; 及 de Haas 等, 實驗室臨床醫學雜志 (J.Lab. Clin.Med.)126 : 330-41(1995)。 術語 “FcR” 在本文中涵蓋其它 FcR, 包括未來將會鑒定的那 些。該術語還包括新生兒受體, FcRn, 它負責將母體 IgG 轉移給胎兒 (Guyer 等, 免疫學雜志 (J.Immunol.)117 : 587(1976) 和 Kim 等, 免疫學雜志 (J.Immunol.)24 : 249(1994)) 并調節 免疫球蛋白的體內穩態。WO00/42072(Presta) 描述了與 FcRs 的結合改善或減少的抗體變 Shields 等, J.Biol.Chem. 體。該專利公開的內容具體地通過引用合并于本文中。還參見, ( 生物化學雜志 )9(2) : 6591-6604(2001)。
     測量對 FcRn 的結合的方法是已知的 ( 參見, 例如, Ghetie 1997, Hinton2004)。可 測定人 FcRn 高親和性結合多肽與人 FcRn 的體內結合和血清半衰期, 例如在表達人 FcRn 的 轉基因小鼠或經轉染的人細胞系中, 或者在施用抑 Fc 變體多肽的靈長類動物中。
     “補體依賴性細胞毒性” 或 “CDC” 指存在補體時對靶細胞的裂解。經典補體途徑的 激活是由補體系統第一組分 (C1q) 結合 ( 適宜亞類的 ) 抗體起始的, 該抗體已結合至其關 聯抗原。為了評估補體激活, 可進行 CDC 測定法, 例如如 Gazzano-Santoro 等, 免疫方法雜 志 (J.Immunol.Methods)202 : 163(1996) 中所記載的。 具有改變的 Fc 區氨基酸序列及提高或降低的 C1q 結合能力的多肽變體記載于例 如美國專利號 6,194,551B1 和 WO 99/51642。那些專利公開的內容具體地通過引用合并于 本文中。還可參見 Idusogie 等, 免疫學雜志 (J.Immunol.)164 : 4178-4184(2000)。
     術語 “包含 Fc 區的多肽” 是指包含 Fc 區的多肽, 諸如抗體或免疫粘附素。例如, 在抗體純化過程中或通過重組改造編碼所述多肽的核酸, 可以去除 Fc 區的 C- 末端賴氨酸 ( 依照 EU 編號系統的殘基 447)。因此, 根據本發明的包含具有 Fc 區的多肽的組合物可以 包含具有 K447 的多肽, 所有 K447 均被去除的多肽, 或具有和不具有 K447 殘基的多肽的混 合物。
     用于本文目的的 “接納體人構架” 是包含衍生自人免疫球蛋白構架, 或衍生自人共 有構架的 VL 或 VH 構架的氨基酸序列的構架。 “衍生自” 人免疫球蛋白構架或人共有構架 的接納體人構架可以包含其相同的氨基酸序列, 或其可以包含預先存在的氨基酸序列的變 化。當存在預先存在的氨基酸變化時, 優選存在不多于 5 個和優選 4 個以下, 或 3 個以下的 預先存在的氨基酸變化。如果在 VH 中存在預先存在的氨基酸變化, 優選地那些變化僅在 位置 71H, 73H, 和 78H 中的三個、 兩個或一個位置處 ; 例如, 在那些位置的氨基酸殘基可以是 71A, 73T, 和 / 或 78A。在一個實施方案中, VL 接納體人構架的序列與 VL 人免疫球蛋白構架 序列或人共有構架序列相同。
     “人共有構架” 是在人免疫球蛋白 VL 或 VH 構架序列的選擇中代表最常見的氨基酸 殘基的構架。 一般地, 人免疫球蛋白 VL 或 VH 序列的選擇物來自可變結構域序列的亞組。 一 般地, 序列的亞組是在 Kabat 等中的亞組。在一個實施方案中, 關于 VL, 亞組是如在 Kabat 等中的亞組 κI。在一個實施方案中, 關于 VH, 亞組是如在 Kabat 等中的亞組 III。
     “VH 亞組 III 共有構架” 包含獲自在 Kabat 等的可變重鏈亞組 III 中的氨基酸序 列的共有序列。在一個實施方案中, VH 亞組 III 共有構架氨基酸序列包含下列序列的每個 的至少一部分或全部 :
     EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS(SEQ ID NO : 184)-HI-WVRQAPGKGLEWV(SEQ ID NO : 185)-H2-RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYC(SEQ ID NO : 186)-H3-WGQGTLVTVSS(SEQ ID NO : 187)
     “VL 亞組 I 共有構架” 包含獲自在 Kabat 等的可變輕鏈 κ 亞組 I 的氨基酸序列的 共有序列。在一個實施方案中, VH 亞組 I 共有構架氨基酸序列包含下列序列的每個的至少 一部分或全部 :
     DIQMTQSPSSLSASVGDRVTTTC(SEQ ID NO : 188)-LI-WYQQKPGKAPKLLIY(SEQ ID NO : 189)-L2-GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC(SEQ ID NO : 190)-L3-FGQGTKVEIK(SEQ ID NO : 191)
     當用于本文時, “抗體突變體” 或 “抗體變體” 指抗體的氨基酸序列變體, 其中所述 物種依賴型抗體的一個或多個氨基酸殘基已被修飾。 所述突變體必須與所述物種依賴型抗 體具有小于 100%的序列同一性或相似性。 在一個實施方案中, 所述抗體突變體與所述物種 依賴型抗體的重鏈可變結構域或輕鏈可變結構域任一個的氨基酸序列具有至少 75%的氨 基酸序列同一性或相似性, 更優選至少 80%、 更優選至少 85%、 更優選至少 90%、 且最優選 至少 95%的氨基酸序列同一性或相似性。 關于這一序列的同一性或相似性在本文中定義為 在比對序列且在需要時引入缺口 ( 以獲得最大百分比的序列同一性 ) 后, 候選序列中與物 種依賴型抗體殘基相同 ( 即, 相同殘基 ) 或相似 ( 即, 基于共有側鏈特性, 來自于同一組的 氨基酸殘基, 見下 ) 的氨基酸殘基的百分比。在可變結構域外抗體序列中的 N 端、 C 端、 或 內部延伸、 缺失或插入無一應該被解釋為影響序列的同一性或相似性。
     “病癥 (disorder)” 或 “疾病 (disease)” 是將從用本發明的物質 / 分子或方法進 行治療獲益的任何病況。這包括慢性和急性病癥或疾病, 包括使所述哺乳動物易感目的病 癥的病理性狀況的那些。在本文中要治療的病癥的非限制性實例包括惡性和良性腫瘤 ; 癌 癥, 母細胞瘤和肉瘤。
     “治療” 是指治療性處理和預防性或預防措施。需要治療的那些包括已經患有良性、 癌前的 (pre-cancerous) 或非轉移性腫瘤的那些以及其中要預防癌癥的發生或復發的 那些。
     術語 “治療有效量” 是指在哺乳動物中治療劑治療或預防疾病或病癥的量。在癌 癥的情況下, 治療劑的治療有效量可減少癌細胞的數量 ; 減小原發性腫瘤大小 ; 抑制 ( 即減 慢到一定程度并優選停止 ) 癌細胞浸潤到周圍器官中 ; 抑制 ( 即減慢到一定程度并優選停 止 ) 腫瘤轉移 ; 在一定程度抑制腫瘤生長 ; 和 / 或在一定程度上緩解一或多種與病癥相關 的癥狀。在達到藥物可以預防現存癌細胞生長和 / 或殺死現存癌細胞的程度時, 其可為細 胞生長抑制性和 / 或細胞毒性的。對于癌癥治療, 體內效力可以通過, 例如評價存活時間、 疾病進展時間 (TTP)、 反應率 (RR)、 反應持續時間、 和 / 或生活質量來測量。
     術語 “癌癥” 和 “癌性” 是指或者描述哺乳動物中典型地特征在于不可調控的細 胞生長的生理學狀態。包含于這種定義中的是良性和惡性癌癥。 “早期癌癥” 或 “早期腫 瘤” 是指沒有侵襲或轉移的癌癥或被分類為 0、 I 或 II 期癌癥的癌癥。癌癥的例子包括, 但不限于, 癌 (carcinoma)、 淋巴瘤、 母細胞瘤 ( 包括髓母細胞瘤 (medulloblastoma) 和視 網膜母細胞瘤 (retinoblastoma))、 肉瘤 ( 包括脂肪肉瘤 (liposarcoma) 和滑膜細胞肉 瘤 (synovial cell sarcoma)), 神經內分泌腫瘤 (neuroendocrine tumors)( 包括類癌瘤 (carcinoid tumors), 胃泌素瘤 (gastrinoma), 和胰島細胞癌 (islet cellcancer)), 間皮 瘤 (mesothelioma), 神經鞘瘤 (schwannoma)( 包括聽神經瘤 (acoustic neuroma)), 腦膜 瘤 (meningioma), 腺癌 (adenocarcinoma), 黑色素瘤 (melanoma), 和白血病或淋巴惡性腫 瘤 (lymphoid malignancies)。 這類癌癥的更具體的例子包括鱗狀細胞癌 ( 例如, 上皮鱗狀 細胞癌 ), 肺癌, 包括小細胞肺癌 (SCLC)、 非小細胞肺癌 (NSCLC)、 肺腺癌和肺鱗狀癌, 腹膜 癌, 肝細胞癌, 胃的或胃癌 (gastric or stomach cancer), 包括胃腸癌 (gastrointestinal cancer), 胰腺癌, 成膠質細胞瘤 (glioblastoma), 子宮頸癌, 卵巢癌, 肝癌, 膀胱癌, 肝細胞 瘤 (hepatoma), 乳腺癌 ( 包括轉移性乳腺癌 ), 結腸癌, 直腸癌, 結腸直腸癌, 子宮內膜或子 宮癌, 唾液腺癌, 腎癌 (kidneyor renal cancer), 前列腺癌, 外陰癌, 甲狀腺癌, 肝癌, 肛門 癌, 陰莖癌, 睪丸癌, 食管癌, 膽道腫瘤, 以及頭頸部癌癥和多發性骨髓瘤。
     術語 “癌前的” 是指典型地在癌癥之前或發展成為癌癥的狀態或生長。 “癌前的” 生長具有以異常的細胞周期調控、 增殖或分化為特征的細胞, 其可以通過細胞周期調控、 細 胞增殖或分化的標志物來確定。
     “發育異常 (dysplasia)” 是指組織、 器官或細胞的任何異常生長或發育。優選發 育異常是高分級的或癌前的。
     “轉移” 意指癌癥由其初始部位向身體的其它位置擴散。癌細胞可以脫離原代腫 瘤, 滲透到淋巴和血管中, 通過血流循環, 并且在身體中其它位置的正常組織中的遠端病灶 中生長 ( 轉移 )。轉移可以是局部的或遠端的。轉移是一個序貫的過程, 在脫離原代腫瘤的 腫瘤細胞上偶然發生, 通過血流移行, 并且在遠端部位停止。在新的部位, 細胞建立血液供 應, 并且可以生長形成威脅生命的團塊 (mass)。
     腫瘤細胞內的刺激性和抑制性分子途徑調控這一行為, 并且在遠端部位中腫瘤細 胞和宿主細胞之間的相互作用也是重要的。 “非轉移性” 是指良性的癌癥或保持在原發部位中并且沒有滲透至淋巴或血管系 統中或沒有滲透至原發部位以外的組織中的癌癥。通常, 非轉移性癌癥是為 0、 I 或 II 期癌
     癥的任一種癌癥, 并且偶爾是 III 期癌癥。
     “原發腫瘤” 或 “原發癌癥” 是指初始的癌癥并且不是位于該受試者體內另一組織、 器官或位置中的轉移病灶。
     “良性腫瘤” 或 “良性癌癥” 是指仍然位于起源部位并且不具有浸潤、 侵襲或轉移至 遠端部位的能力的腫瘤。
     “腫瘤負荷 (tumor burden)” 是指機體內癌細胞的數目、 腫瘤的大小或癌的量。腫 瘤負荷也稱為腫瘤負荷量 (tumor load)。
     “腫瘤數” 是至腫瘤的數目。
     “受試者” 意指哺乳動物, 包括但不限于, 人或非人哺乳動物, 諸如牛、 馬、 犬、 羊或 貓。優選地, 所述受試者是人。
     術語 “抗癌治療” 是指有效用于治療癌癥的治療。抗癌治療劑的實例包括, 但不限 于, 例如, 化療劑、 生長抑制劑、 細胞毒性試劑、 放射性治療中所有的試劑、 抗血管發生劑、 凋 亡劑、 抗微管蛋白劑、 和其它治療癌癥的試劑、 抗 -CD20 抗體、 血小板衍生生長因子抑制劑 TM ( 例如, Gleevec 甲磺酸伊馬替尼 (Imatinib Mesylate)), COX-2 抑制劑 ( 例如, 塞來考昔 (celecoxib)), 干擾素, 細胞因子, 結合下述一種或多種靶標的拮抗劑 ( 例如, 中和抗體 ) : ErbB2, ErbB3, ErbB4, PDGFR-β, BlyS, APRIL, BCMA 或 VEGF 受體, TRAIL/Apo2, 和其它生物 活性和有機化學劑等。它們的組合也包含在本發明中。
     術語 “細胞毒性劑” 用在本發明中指抑制或防止細胞功能和 / 或引起細胞破壞的 物質。該術語意欲包括放射性同位素 ( 例如 L131, L125, Y90 和 Re186), 化療劑, 和毒素如細菌、 真菌、 植物或動物來源的酶學活性毒素, 或其片段。
     “化療劑” 是有效用于治療癌癥的化合物。化療劑的實例包括有效用于治療癌 癥的化合物。化療劑的實例包括烷化劑類 (alkylating agents), 如塞替哌 (thiotepa) 和 環 磷 酰 胺 (cyclosphosphamide) ; 烷 基 磺 酸 酯 (alkyl sulfonates) 如 白 消 安 (busulfan), 英 丙 舒 凡 (improsulfan) 和 哌 泊 舒 凡 (piposulfan) ; 吖丙啶類 (aziridines) 如 苯 佐 替 派 (benzodopa)、 卡 波 醌 (carboquone)、 美 妥 替 哌 (meturedopa) 和烏瑞替哌 (uredopa) ; 乙烯亞胺 (ethylenimines) 和甲基蜜胺類 (methylamelamines), 包 括 六 甲 蜜 胺 (altretamine)、 曲 他 胺 (triethylenemelamine)、 三亞乙基磷酰胺 (triethylenephosphoramide)、 三 乙 撐 硫 代 磷 酰 胺 (triethylenethiophosphoramide) 和 三 羥 甲 蜜 胺 (trimethylolomelamine) ; 多 聚 乙 酰 類 (acetogenins)( 特 別 是 布 拉 他 辛 (bullatacin) 和 布 拉 他 辛 酮 (bullatacinone)) ; 喜 樹 堿 (camptothecin)( 包 括 合 成 的 類 似 物 托 泊 替 康 (topotecan)) ; 苔 蘚 抑 素 (bryostatin) ; callystatin ; CC-1065( 包 括 其 阿 多 來 新 (adozelesin)、 卡 折 來 新 (carzelesin) 和 比 折 來 新 (bizelesin) 合 成類似物 ) ; 隱 藻 素 類 (cryptophycins)( 特 別 是 隱 藻 素 1 和 隱 藻 素 8) ; 多拉司他汀 (dolastatin) ; 倍 癌 霉 素 (duocarmycin)( 包 括 合 成 的 類 似 物、 KW-2189 和 CB1-TM1) ; 艾 榴 素 (eleutherobin) ; pancratistatin ; 匍 枝 珊 瑚 醇 (sarcodictyin) ; 海 綿 素 (spongistatin) ; 氮 芥 (nitrogen mustards) 如 苯 丁 酸 氮 芥 (chlorambucil)、萘 氮 芥 (chlornaphazine)、 膽 磷 酰 胺 (cholophosphamide)、 雌 莫 司 汀 (estramustine)、 異 環 磷 酰 胺 (ifosfamide)、氮 芥 (mechlorethamine)、鹽 酸 氧 氮 芥 (mechlorethamine oxide hydrochloride)、美 法 侖 (melphalan)、新 氮 芥 (novembichin)、苯 芥 膽 甾醇 (phenesterine)、 潑 尼 莫 司 汀 (prednimustine)、 曲 磷 胺 (trofosfamide)、 尿嘧啶 氮 芥 (uracil mustard) ; 亞 硝 脲 類 (nitrosureas) 如 卡 莫 司 汀 (carmustine)、 氯脲 菌 素 (chlorozotocin)、福 莫 司 汀 (fotemustine)、洛 莫 司 汀 (lomustine)、尼 莫 司 汀 (nimustine) 和 雷 莫 司 汀 (ranimnustine) ; 抗 生 素 類, 如 烯 二 炔 類 (enediyne) 抗 生 素 ( 例 如, 加 利 車 霉 素 (calicheamicin)、 特 別 是 加 利 車 霉 素 γ1I 和 加 利 車 霉 素 ωI1( 參 見,例 如, Agnew, Chem Intl.Ed.Engl., 33 : 183-186(1994)) ;烯 二 炔 蒽 環 類 抗 生 素 (dynemicin), 包 括 烯 二 炔 蒽 環 類 抗 生 素 A(dynemicin A) ; 二膦酸鹽類 (diphosphonates), 如 氯 膦 酸 鹽 (clodronate) ; 埃 斯 波 霉 素 (esperamicin) ; 以及新制 癌 菌 素 (neocarzinostatin) 發 色 團 和 相 關 色 蛋 白 烯 二 炔 類 抗 生 素 發 色 團、 阿克拉霉 素 (aclacinomysins)、 放 線 菌 素 (actinomycin)、 安 曲 霉 素 (anthramycin)、 偶氮絲氨 酸 (azaserine)、 博 來 霉 素 (bleomycins)、 放 線 菌 素 C(cactinomycin)、 carabicin、 洋 紅 霉 素 (carminomycin)、 嗜 癌 霉 素 (carzinophilin)、 色 霉 素 (chromomycinis)、 放線 菌 素 D(dactinomycin)、 柔 紅 霉 素 (daunorubicin)、 地 托 比 星 (detorubicin)、 6- 重 氮 基 -5- 氧 -L- 正 亮 氨 酸 (6-diazo-5-oxo-L-norleucine)、 多柔比星 (doxorubicin)( 包括嗎啉代 - 多柔比星 (morpholino-doxorubicin)、 氰基嗎啉代 - 多柔比 星 (cyanomorpholino-doxorubicin)、 2- 吡咯啉代 - 多柔比星 (2-pyrrolino-doxorubicin) 和脫氧多柔比星 (deoxydoxorubicin))、 表柔比星 (epirubicin)、 依索比星 (esorubicin)、 伊 達 比 星 (idarubicin)、 馬 塞 羅 霉 素 (marcellomycin)、 絲 裂 霉 素 類 (mitomycins) 如 絲 裂 霉 素 C、 麥 考 酚 酸 (mycophenolic acid)、 諾 拉 霉 素 (nogalamycin)、 橄欖霉 素 (olivomycins)、培 洛 霉 素 (peplomycin)、 potfiromycin、嘌 呤 霉 素 (puromycin)、 三 鐵 阿 霉 素 (quelamycin)、 羅 多 比 星 (rodorubicin)、 鏈 黑 霉 素 (streptonigrin)、 鏈 佐 星 (streptozocin)、 殺 結 核 菌 素 (tubercidin)、 烏 苯 美 司 (ubenimex)、 凈司他丁 (zinostatin)、 佐柔比星 (zorubicin) ; 抗代謝物如甲氨喋呤 (methotrexate) 和 5- 氟尿 嘧啶 (5-fluorouracil)(5-FU) ; 葉酸類似物如二甲葉酸 (denopterin)、 甲氨喋呤、 喋羅呤 (pteropterin)、 三甲曲沙 (trimetrexate) ; 嘌呤類似物, 如氟達拉濱 (fludarabine)、 6- 巰 基嘌呤 (6-mercaptopurine)、 硫咪嘌呤 (thiamiprine)、 硫鳥嘌呤 (thioguanine) ; 嘧啶類 似物, 如安西他濱 (ancitabine)、 阿扎胞苷 (azacitidine)、 6- 氮尿苷 (6-azauridine)、 卡 莫 氟 (carmofur)、 阿 糖 胞 苷 (cytarabine)、 雙 脫 氧 尿 苷 (dideoxyuridine)、 去氧 氟 尿 苷 (doxifluridine)、 依 諾 他 濱 (enocitabine)、 氟 尿 苷 (floxuridine) ; 雄激素 類, 諸 如 卡 魯 睪 酮 (calusterone)、 丙 酸 屈 他 雄 酮 (dromostanolone propionate)、 環 硫 雄 醇 (epitiostanol)、 美 雄 烷 (mepitiostane)、 睪 內 酯 (testolactone) ; 抗腎上腺 藥 (anti-adrenals), 如 氨 魯 米 特 (aminoglutethimide)、 米 托 坦 (mitotane)、 曲洛司 坦 (trilostane) ; 葉 酸 補 充 劑, 如 亞 葉 酸 (folinic acid) ; 醋 葡 醛 內 酯 (aceglatone) ; aldophosphamide glycoside ; 5- 氨 基 酮 戊 酸 (aminolevulinicacid) ;恩 尿 嘧 啶 (eniluracil) ; 安 吖 啶 (amsacrine) ; bestrabucil ; 比 生 群 (bisantrene) ; 依達曲 沙 (edatraxate) ; defofamine ;秋 水 仙 胺 (demecolcine) ;地 吖 醌 (diaziquone) ; elfornithine ; 依利醋銨 (elliptinium acetate) ; epothilone ; 依托格魯 (etoglucid) ; 硝 酸 鎵 (gallium nitrate) ; 羥 脲 (hydroxyurea) ; 香 菇 多 糖 (lentinan) ; 氯尼達明 (lonidainine) ; 美 登 木 素 生 物 堿 類 (maytansinoids), 如 美 登 素 (maytansine) 和 安 絲菌 素 (ansamitocins) ; 米 托 胍 腙 (mitoguazone) ; 米 托 蒽 醌 (mitoxantrone) ; 莫哌達醇 (mopidanmol) ; 尼曲吖啶 (nitraerine) ; 噴司他丁 (pentostatin) ; 異丙嗪 (phenamet) ; 吡 柔 比 星 (pirarubicin) ; 洛 索 蒽 醌 (losoxantrone) ; 鬼 臼 酸 (podophyllinic acid) ; 2- 乙 基 酰 肼 (2-ethylhydrazide) ; 丙 卡 巴 肼 (procarbazine) ; 多 糖 復 合 物 (JHS NaturalProducts(JHS 天然產品 ), Eugene, OR) ; 雷佐生 (razoxane) ; 利索新 (rhizoxin) ; 西佐喃 (sizofiran) ; 鍺螺胺 (spirogermanium) ; 細交鏈孢菌酮酸 (tenuazonicacid) ; 三 亞胺醌 (triaziquone) ; 2, 2’ , 2” - 三氯三乙胺 (2, 2’ , 2” -trichlorotriethylamine) ; 單端 孢霉烯族化合物 (trichothecenes)( 特別是 T-2 毒素、 verracurin A、 桿孢菌素 A(roridin A) 和 anguidine) ; 烏拉坦 (urethan) ; 長春地辛 (vindesine) ; 達卡巴嗪 (dacarbazine) ; 甘露莫司汀 (mannomustine) ; 二溴甘露醇 (mitobronitol) ; 二溴衛矛醇 (mitolactol) ; 哌 泊溴烷 (pipobroman) ; gacytosine ; 阿拉伯糖苷 (arabinoside)(“Ara-C” ); 環磷酰胺 ; 塞替哌 (thiotepa) ; 紫杉烷類化合物 (taxoids), 例如, 紫杉醇 (Bristol-Myers TM Squibb Oncology, Princeton, 新澤西 ), ABRAXANE 無克列莫佛 (Cremophor-free)、 紫杉醇 的白蛋白改造的納米顆粒制劑 (American Pharmaceutical Partners, Schaumberg, 伊利諾 伊州 ) ; 和 多西他賽 (doxetaxel)( -Poulenc Rorer, Antony, 法國 ) ; chloranbucil ; 吉 西 他 濱 (gemcitabine) ; 6- 硫 鳥 嘌 呤 (6-thioguanine) ; 巰 嘌 呤 (mercaptopurine) ; 甲 氨 喋 呤; 鉑 類 似 物,如 順 鉑 (cisplatin) 和 卡 鉑 (carboplatin) ; 長春堿 (vinblastine) ; 鉑; 依托泊苷 (etoposide)(VP-16) ; 異環磷酰胺 (ifosfamide) ; 米 托 蒽 醌 (mitoxantrone) ; 長 春 新 堿 (vincristine) ; 長 春 瑞 濱 (vinorelbine) ; 諾 安 托 (novantrone) ; 替 尼 泊 苷 (teniposide) ; 依達曲沙 (edatrexate) ; 柔紅霉素 (daunomycin) ; 氨基喋呤 (aminopterin) ; 希羅達 (xeloda) ; 伊 班膦酸鹽 (ibandronate) ; 伊立替康 (irinotecan)(Camptosar, CPT-11)( 包括伊立替康 與 5-FU 和亞葉酸 (leucovorin) 的治療方案 ) ; 拓撲異構酶抑制劑 RFS 2000 ; 二氟甲基 鳥 氨 酸 (difluoromethylornithine)(DMFO) ; 維 甲 類 (retinoids), 如 視 黃 酸 (retinoic acid) ; 卡 培 他 濱 (capecitabine) ; 康 普 瑞 汀 (combretastatin) ; VELCADE 硼 替 佐 米 (bortezomib) ; REVLIMID 來 那 度 胺 (lenalidomide) ; 亞 葉 酸 (leucovorin)(LV) ; 奧沙利 鉑 (oxaliplatin), 包括奧沙利鉑治療方案 (FOLFOX) ; 下列的抑制劑 : PKC-α, Raf, H-Ras, TM EGFR( 例如, 厄洛替尼 (erlotinib)(Tarceva )) 和 VEGF-A, 所述抑制劑減少細胞增殖, 以及 上述任一種的藥用鹽、 酸或衍生物。
     抗激素試劑也包含在這一定義中, 其起作用調控或抑制激素對腫瘤的作用, 如 抗 雌 激 素 和 選 擇 性 雌 激 素 受 體 調 節 劑 (SERMs), 其 包 括, 例 如, 他 莫 昔 芬 (tamoxifen) ( 包括 他 莫 昔 芬 ), 雷 洛 昔 芬 (raloxifene), 屈 洛 昔 芬 (droloxifene), 4- 羥 基 他 莫 昔 芬 (4-hydroxytamoxifen),曲 沃 昔 芬 (trioxifene), keoxifene, LY117018, 奧 那 司 酮 (onapristone), 和 FARESTON· 托 瑞 米 芬 (toremifene) ; 抑制芳 香酶的芳香酶抑制劑, 其調節腎上腺中的雌激素生產, 諸如例如, 4(5)- 咪唑, 氨魯米特 (aminoglutethimide), 醋酸甲地孕酮 (megestrolacetate), 依 西 美 坦 (exemestane), 福 美 坦 (formestanie), 法 倔 唑 (fadrozole), 伏 氯 唑 (vorozole), 來 曲 唑 (letrozole),和 阿那曲 唑 (anastrozole) ; 和 抗 雄 激 素 類, 如 氟 他 胺 (flutamide), 尼 魯 米 特 (nilutamide),比 卡 魯 胺 (bicalutamide), 亮 丙 立 德 (leuprolide), 和 戈 舍 瑞 林 (goserelin) ; 以 及 曲 沙 他 濱 (troxacitabine)(1, 3- 二 氧 戊 環 核 苷 胞 嘧 啶 類 似 物 (1, 3-dioxolane nucleosidecytosine analog)) ; 反義寡核苷酸, 特別是抑制異常細胞增殖中所涉及的信 號傳導途徑中的基因 ( 諸如例如, PKC-α, Raf 和 H-Ras) 表達的那些 ; 核酶如 VEGF 表達 抑制劑 ( 例如, 核酶 ) 和 HER2 表達抑制劑 ; 疫苗如基因治療疫苗, 例 如, 疫 苗, 疫 苗, 和 疫苗 ; rIL-2 ; 拓撲異構酶1抑制劑; rmRH ; 長春瑞濱 (Vinorelbine) 和埃斯波霉素 (Esperamicins)( 參見美國專利號 4,675,187), 以及上述任 一種的藥用鹽、 酸或衍生物。
     術語 “前藥” 用在本申請中是指藥物活性物質的前體或衍生物形式, 其較親本藥 物對腫瘤細胞的細胞毒性更小并且能夠被酶活化或轉化為更具活性的親本形式。參見, 例 如, Wilman,″ Prodrugs in CancerChemotherapy( 癌癥化療中的前藥 )″ Biochemical Society Transactions( 生 物 化 學 學 會 學 報 ), 14,第 375-382 頁, 615th Meeting Belfast(1986) 和 Stella 等, ″ Prodrugs : A Chemical Approach to Targeted Drug Delivery, ( 前藥 : 靶向藥物遞送的化學方法 )″ Directed Drug Delivery( 定向藥物遞 送 ), Borchardt 等, ( 編輯 ), 第 247-267 頁, Humana Press(1985)。本發明的前藥包括, 但 不限于, 含磷酸鹽的前藥, 含硫代磷酸鹽的前藥, 含硫酸鹽的前藥, 含肽的前藥, D- 氨基酸修 飾的前藥, 糖基化前藥, 含 β- 內酰胺的前藥, 含任選取代的苯氧基乙酰胺的前藥或含任選 取代的苯基乙酰胺的前藥, 可以被轉化為更具活性的無細胞毒性的藥物的 5- 氟胞嘧啶和 其它 5- 氟尿嘧啶前藥。可以被衍生成用于本發明的前藥形式的細胞毒性藥物的實例包括, 但不限于, 上述那些化療劑。
     “放射性治療” 意指使用定向的 γ 射線或 β 射線誘導充分的細胞損害, 從而限 制其正常行使功能的能力或完全破壞細胞。應該理解, 本領域中存在已知的多種方式來確 定治療的劑量和持續時間。典型的治療提供為一次施用并且典型的劑量在 10-200 單位 (Grays)/ 天范圍內。
     ″生物學樣品″ ( 可相互替換地稱為 “樣品” 或 “組織或細胞樣品” ) 涵蓋從個體 獲得的多種樣品類型并可用于診斷或監測測定中。 該定義涵蓋生物學來源的血和其它液體 樣品, 實體組織樣品如活組織檢查樣品或組織培養物或由其衍生的細胞, 以及其后代。 該定 義也包括在它們獲得后以任何方式操作的樣品, 如用試劑處理, 增溶, 或富集某些成分如蛋 白或多核苷酸, 或包埋在半固體或固體基質中用于切片的目的。術語″生物學樣品″涵蓋 臨床樣品, 并也包括培養物中的細胞、 細胞上清液、 細胞裂解物、 血清、 血漿、 生物學液體和 組織樣品。生物學樣品的來源可以是實體組織, 來自于新鮮、 冷凍和 / 或儲存的器官或組織 樣品或活組織檢查或抽吸 ; 血液或任何血液成分 ; 體液如腦脊液、 羊水、 腹水或間質液 ; 來 自于個體孕育或發育中的任何時間的細胞。在一些實施方案中, 生物學樣品從原發性或轉 移腫瘤中獲得。 生物學樣品可含有本身與組織不天然混合的化合物如防腐劑、 抗凝劑、 緩沖 劑、 固定劑、 營養素、 抗生素等。
     為了本文的目的, 組織樣品的 “切片” 是指組織樣品的單一部分或片, 例如, 從組織 樣品切取的組織薄片或細胞。要理解可以取組織樣品的多個切片并根據本發明進行分析。 在一些實施方案中, 組織樣品的同一切片在形態學和分子水平兩者上進行分析, 或關于蛋白和核酸兩者進行分析。
     詞語 “標記物” 當在本文中使用時是指直接或間接與試劑諸如核酸探針或抗體綴 合或融合并促進與其綴合或融合的試劑的檢測的化合物或組合物。 所述標記物可以本身是 可檢測的 ( 例如, 放射同位素標記物或熒光標記物 ), 或者, 在酶標記物的情形中, 可以催化 可檢測的底物化合物或組合物的化學改變。
     本發明的組合物和方法
     本發明涵蓋組合物, 包括藥物組合物, 它們包含抗 -FGFR3 抗體 ; 并且涵蓋包含 編碼抗 -FGFR3 抗體的序列的多核苷酸。當在本文中使用時, 組合物包含一種或多種結合 FGFR3 的抗體, 和 / 或一種或多種包含編碼一種或多種結合 FGFR3 的抗體的序列的多核苷 酸。這些組合物可以進一步包含合適的載體, 諸如藥用賦形劑, 所述藥用賦形劑包括緩沖 劑, 它們在本領域中是公知的。
     本發明還涵蓋分離的抗體和多核苷酸實施方案。 本發明還涵蓋基本上純的抗體和 多核苷酸實施方案。
     本發明還涵蓋使用抗 -FGFR3 抗體 ( 如本文所述或如本領域中已知的 ) 治療病癥, 例如多發性骨髓瘤或過渡期癌癥 ( 例如, 侵襲性過渡期癌癥 ) 的方法。
     組合物
     本發明的抗 -FGFR3 抗體優選是單克隆的。還涵蓋在本發明的范圍內的有本文提 供的抗 -FGFR3 抗體的 Fab, Fab′, Fab′ -SH 和 F(ab′ )2 片段。這些抗體片段可以通過傳 統手段形成, 諸如酶消化, 或可以通過重組技術生成。 這樣的抗體片段可以是嵌合的或人源 化的。這些片段可用于下面給出的診斷和治療目的。
     單克隆抗體從基本上同質的抗體的群體獲得, 即, 包含該單一抗體的群體除了可 能天然存在的突變以外均是相同的, 所述天然存在的突變可能以微量存在。因此, 修飾語 “單克隆” 表示抗體的特征不是毫無聯系的抗體的混合物。
     本發明的抗 -FGFR3 單克隆抗體可以使用最初由 Kohler 等, Nature( 自然 ), 256 : 495(1975) 描述的雜交瘤法制備, 或可以通過重組 DNA 方法 ( 美國專利號 4,816,567) 制備。
     在雜交瘤方法中, 將小鼠或其它適當的宿主動物 ( 如倉鼠 ) 免疫以激發產生或能 夠產生特異性結合用于免疫的蛋白的抗體的淋巴細胞。針對 FGFR3 的抗體可以在動物中通 過多次皮下 (sc) 或腹膜內 (ip) 注射 FGFR3 和佐劑來產生。 FGFR3 可以使用本領域中公知的 方法來制備, 在本文中進一步描述這些方法中的一些。例如, 下面描述人和鼠 FGFR3 的重組 產生。 在一個實施方案中, 將動物用與免疫球蛋白重鏈的 Fc 部分融合的 FGFR3 免疫。 在優選 的實施方案中, 將動物用 FGFR3-IgG1 融合蛋白免疫。動物通常針對 FGFR3 與單磷酰基脂質 A(MPL)/ 海藻糖 dicrynomycolate(trehalose dicrynomycolate)(TDM)(Ribi Immunochem. Research, Inc., Hamilton, MT) 的免疫原性綴合物或衍生物免疫并且將該溶液在多個部位 皮內注射。兩周后將動物加強免疫。7 至 14 天后, 將動物放血并且測定血清的抗 -FGFR3 效 價。將動物加強免疫直至效價達到穩定期。
     備選地, 淋巴細胞可以在體外免疫。 然后, 使用適當的融合劑, 如聚乙二醇, 將淋巴 細胞與骨髓瘤細胞融合, 以形成雜交瘤細胞 (Goding, Monoclonal Antibodies : Principles and Practice( 單克隆抗體 : 原理與實踐 ), 第 59-103 頁 (Academic Press, 1986))。
     將這樣制備的雜交瘤接種和生長在適當的培養基中, 所述培養基優選地包含一種或多種抑制未融合的親本骨髓瘤細胞的生長或存活的物質。例如, 如果親本骨髓瘤細胞缺 少這樣的酶, 即次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖基轉移酶 (HGPRT 或 HPRT), 則用于雜交瘤的培養 基典型地將包括次黃嘌呤、 氨基蝶呤、 和胸苷 (HAT 培養基 ), 所述物質防止 HGPRT- 缺陷型細 胞生長。
     優選的骨髓瘤細胞是有效融合、 支持所選擇的生產抗體的細胞的穩定的高水平 抗體生產、 并且對諸如 HAT 培養基的培養基敏感的那些細胞。其中, 優選的骨髓瘤細胞系 是鼠骨髓瘤株系, 諸如來源于 MOPC-21 和 MPC-11 小鼠腫瘤的那些, 其可從美國加利福尼亞 州圣地亞哥的 Salk 細胞配送中心研究所 (Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, California USA) 獲得, 以及 SP-2 或 X63-Ag8-653 細胞, 其可從美國馬里蘭州 Rockville 的美國典型培養物保藏中心 (American Type CultureCollection, Rockville, Maryland USA) 獲得。也記述了人骨髓瘤和小鼠 - 人異源骨髓瘤細胞系, 其用于生產人單 克隆抗體 (Kozbor, J.Immunol.( 免疫學雜志 ), 133 : 3001(1984) ; Brodeur 等, Monoclonal Antibody ProductionTechniques and Applications( 單克隆抗體生產技術和應用 ), 第 51-63 頁 (Marcel Dekker, Inc., 紐約, 1987))。
     測定其中雜交瘤細胞正在生長的培養基中針對 FGFR3 的單克隆抗體的產生。優選 地, 通過免疫沉淀或通過體外結合測定, 諸如放射性免疫測定 (RIA) 或酶聯免疫吸附測定 (ELISA), 來確定由雜交瘤細胞生產的單克隆抗體的結合特異性。
     單克隆抗體的結合親合力可以, 例如, 通過 Munson 等, Anal.Biochem.( 分析生物 化學 ), 107 : 220(1980) 的 Scatchard 分析測定。
     在鑒定了生產具有所需要的特異性、 親和性和 / 或活性的抗體的雜交瘤細胞 后, 可以通過有限的稀釋步驟亞克隆該克隆, 并且通過標準方法 (Goding, Monoclonal Antibodies : Principles and Practice( 單 克 隆 抗 體 : 原 理 和 實 踐 ), 第 59-103 頁 (Academic Press, 1986)) 生長。適用于該目的的培養基包括, 例如, D-MEM 或 RPMI-1640 培 養基。另外, 雜交瘤細胞可以在動物中作為腹水瘤體內生長。
     通過常規免疫球蛋白純化方法, 諸如例如, 蛋白質 A- 瓊脂糖、 羥磷灰石層析、 凝膠 電泳、 透析、 或親和層析, 適當地從培養基、 腹水液、 或血清中分離由亞克隆分泌的單克隆抗 體。
     可以通過使用組合文庫篩選具有所需的一種或多種活性的合成抗體克隆來制備 本發明的抗 FGFR3 抗體。原則上, 通過篩選包含這樣的噬菌體的噬菌體文庫來選擇合成 的抗體克隆, 所述噬菌體展示融合于噬菌體外殼蛋白的抗體可變區 (Fv) 的各種片段。所 述噬菌體文庫通過針對需要的抗原的親和層析法進行淘選。將表達能夠結合需要的抗原 的 Fv 片段的克隆吸附到抗原上, 并且由此與在文庫中未結合的克隆分離。接著從抗原上 洗脫結合的克隆, 并且可以進一步通過另外的抗原吸附 / 洗脫循環富集。本發明的任一種 抗 -FGFR3 抗體可以通過下述獲得 : 設計適合的抗原篩選方法以選擇目的噬菌體克隆, 隨后 使用來自目的噬菌體克隆的 Fv 序列和在 Kabat 等, 免疫學感興趣的蛋白的序列 (Sequence of Proteins ofImmunological Interest),第 5 版, NIH 出 版 物 91-3242, Bethesda MD(1991), 卷 1-3 中所述的適合的恒定區 (Fc) 序列構建全長抗 -FGFR3 抗體克隆。
     抗體的抗原結合結構域由約 110 個氨基酸的兩個可變 (V) 區形成, 每個分別來自 輕鏈 (VL) 和重鏈 (VH), 并且都具有三個高變環或互補性決定區 (CDRs)。可變結構域可以功能上展示在噬菌體上, 或者作為單鏈 Fv(scFv) 片段展示, 其中 VH 和 VL 通過短的柔性肽 共價連接, 或作為 Fab 片段展示, 其中它們分別融合于恒定結構域并且非共價地相互作用, 如在 Winter 等, Ann.Rev.Immunol.( 免疫學年度綜述 ), 12 : 433-455(1994) 中所述。用于 本文時, 編碼 scFv 的噬菌體克隆和編碼 Fab 的噬菌體克隆統稱為 “Fv 噬菌體克隆” 或″ Fv 克隆″。
     VH 和 VL 基因的所有組成成分可以通過聚合酶鏈式反應 (PCR) 單獨克隆并且隨 機重組在噬菌體文庫中, 其接著可以關于抗原結合克隆被探究, 如在 Winter 等, Ann.Rev. Immunol.( 免疫學年度綜述 ), 12 : 433-455(1994) 中所述。來自免疫來源的文庫提供針對 免疫原的高親和性抗體, 而不需要構建雜交瘤。 備選地, 可以克隆天然的所有組成成分從而 在無需任何免疫的條件下提供針對廣泛范圍的非自體抗原以及自體抗原的人抗體的單一 來源, 如在 Griffiths 等, EMBO J, 12 : 725-734(1993) 中所述。最終, 還可以通過從干細胞 克隆未重排的 V- 基因區段, 并使用包含隨機序列的 PCR 引物來編碼高度可變的 CDR3 區并 實現體外重排來合成制備天然文庫, 如由 Hoogenboom 和 Winter, 分子生物學雜志 (J.Mol. Biol.), 227 : 381-388(1992) 所述。
     將絲狀噬菌體用于通過融合于較小的外殼蛋白 pIII 來展示抗體片段。所述抗體 片段可以作為單鏈 Fv 片段展示, 其中 VH 和 VL 結構域在相同的多肽鏈上通過柔性多肽間 隔臂連接, 例如如由 Marks 等, 分子生物學雜志 (J.Mol.Biol.), 222 : 581-597(1991) 所述, 或作為 Fab 片段展示, 其中一條鏈融合于 pIII, 而另一條鏈分泌到細菌宿主細胞周質中, 其 中組裝 Fab- 外殼蛋白結構, 其通過取代一些野生型外殼蛋白而展示在噬菌體表面上, 如在 Hoogenboom 等, 核酸研究 (Nucl.Acids Res)., 19 : 4133-4137(1991) 中所述。
     一般地, 編碼抗體基因片段的核酸獲自從人或動物中收集的免疫細胞。如果需要 偏向有利于抗 -FGFR3 克隆的文庫, 用 FGFR3 來免疫個體從而產生抗體反應, 并且回收脾細 胞和 / 或循環 B 細胞、 其它的外周血淋巴細胞 (PBLs) 用于文庫構建。在一個優選的實施方 案中, 在攜帶功能性人免疫球蛋白基因陣列 ( 并且缺乏功能性內源抗體生產系統 ) 的轉基 因小鼠中通過產生抗 -FGFR3 抗體反應來獲得偏向有利于抗 -FGFR3 克隆的人抗體基因片段 文庫, 從而使 FGFR3 免疫提供產生針對 FGFR3 的人抗體的 B 細胞。在下面描述生產人抗體 的轉基因小鼠的產生。
     可以通過使用適合的篩選方法來分離表達 FGFR3- 特異性膜結合抗體的 B 細胞來 獲得對抗 -FGFR3 反應性細胞群體的另外的富集, 例如通過使用 FGFR3 親和層析法分離細胞 或將細胞吸附到熒光染料標記的 FGFR3, 隨后進行流式激活的細胞分選 (flow-activated cell sorting)(FACS) 而進行。
     備選地, 應用來自未被免疫的供體的脾細胞和 / 或 B 細胞或其它 PBLs 提供可能的 抗體所有組成成分的更好的呈現, 并且還允許使用任何其中 FGFR3 不是抗原性的動物 ( 人 或非人 ) 物種來構建抗體文庫。對于體外結合抗體基因的文庫構建, 從個體中收集干細胞 從而提供編碼未重排的抗體基因區段的核酸。可以從多種動物物種, 如人、 小鼠、 大鼠、 兔 類、 luprine、 犬、 貓、 豬、 牛、 馬和禽類物種等獲得目的免疫細胞。
     從目的細胞中回收編碼抗體可變基因區段 ( 包括 VH 和 VL 區段 ) 的核酸, 并且進 行擴增。在重排的 VH 和 VL 基因文庫的情形中, 可以通過從淋巴細胞中分離基因組 DNA 或 mRNA, 隨后用匹配重排 VH 和 VL 基因的 5′和 3′端的引物進行聚合酶鏈式反應 (PCR) 來獲得需要的 DNA, 如在 Orlandi 等, 美國國家科學院學報 (Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)), 86 : 3833-3837(1989) 中所述, 由此制備多樣的 V 基因所有組成成分進行表達。可以從 cDNA 和 基因組 DNA 擴增 V 基因, 其中反向引物 (back primers) 在編碼成熟 V- 結構域的外顯子 5′ 端, 而正向引物基于 J- 區段中, 如在 Orlandi 等 (1989) 和 Ward 等, 自然 (Nature), 341 : 544-546(1989) 中所述。然而, 對于從 cDNA 中擴增, 反向引物也可以基于前導外顯子中, 如 在 Jones 等, 生物技術 (Biotechnol.), 9: 88-89(1991) 中所述, 而正向引物在恒定區內, 如 在 Sastry 等, 美國國家科學院學報 (Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)), 86 : 5728-5732(1989) 中 所述。 為了使互補性最大化, 可以將簡并性結合在引物中, 如在 Orlandi 等 (1989) 或 Sastry 等 (1989) 中所述。優選地, 通過使用靶向每個 V 基因家族的 PCR 引物以擴增在免疫細胞 核酸樣品中存在的所有可獲得的 VH 和 VL 排列來使文庫多樣性最大化, 例如在 Marks 等, 分子生物學雜志 (J.Mol.Biol.), 222 : 581-597(1991) 的方法中所述, 或如在 Orum 等, 核酸 研究 (Nucleic Acids Res.), 21 : 4491-4498(1993) 的方法中所述。關于將擴增的 DNA 克 隆到表達載體中, 可以將稀有的限制性酶切位點作為在一端的標記引入 PCR 引物中, 如在 Orlandi 等 (1989) 中所述, 或通過用標記的引物進一步進行 PCR 擴增, 如在 Clackson 等, 自 然 (Nature), 352 : 624-628(1991) 中所述。
     合成的重排的 V 基因的所有組成成分可以在體外來自 V 基因區段。已經對大部 分的人 VH- 基因區段進行克隆和測序 ( 在 Tomlinson 等, 分子生物學雜志 (J.Mol.Biol.), 227 : 776-798(1992) 中報道 ), 并進行作圖 ( 在 Matsuda 等, 自然遺傳學 (Nature Genet.), 3: 88-94(1993) 中報道 ) ; 可以將這些克隆的區段 ( 包括 H1 和 H2 環的所有主要的構象 ) 用于用編碼多樣序列和長度的 H3 環的 PCR 引物產生多樣的 VH 基因的所有組成成分, 如在 Hoogenboom 和 Winter, 分子生物學雜志 (J.Mol.Biol.), 227 : 381-388(1992) 中所述。VH 所有組成成分還可以用集中在單一長度的長 H3 環中的所有的序列多樣性進行制備, 如在 Barbas 等, 美國國家科學院學報 (Proc.Natl.Acad.Sci.USA), 89 : 4457-4461(1992) 中所 述。 已經對人 Vκ 和 Vλ 區段進行克隆和測序 ( 在 Williams 和 Winter, 歐洲免疫雜志 (Eur. J.Immunol.), 23 : 1456-1461(1993) 中報道 ), 并且可以用于制備合成的輕鏈所有組成成 分。 基于一系列 (a range of)VH 和 VL 折疊, 和 L3 和 H3 長度的合成的 V 基因所有組成成分 將編碼具有相當多結構多樣性的抗體。 在擴增編碼 V- 基因的 DNA 后, 可以根據 Hoogenboom 和 Winter, 分子生物學雜志 (J.Mol.Biol.), 227 : 381-388(1992) 的方法, 將種系 V- 基因區 段在體外進行重排。
     抗體片段的所有組成成分可以通過以數種方式將 VH 和 VL 基因的所有組成成分組 合在一起而構建。 每個所有組成成分可以在不同的載體中產生, 所述載體可以在體外重組, 例如如在 Hogrefe 等, 基因 (Gene), 128 : 119-126(1993) 中所述, 或可以通過組合感染在體 內重組, 例如通過在 Waterhouse 等, 核酸研究 (Nucl.Acids Res)., 21 : 2265-2266(1993) 中 所述的 loxP 系統。體內重組方法應用 Fab 片段的雙鏈性質來克服由大腸桿菌轉化效率對 文庫大小所施加的限制。將天然 VH 和 VL 所有組成成分單獨克隆, 一個克隆到噬菌粒中, 并 且另一個克隆到噬菌體載體中。 接著將兩種文庫通過對包含噬菌粒的細菌的噬菌體感染進 行組合從而使每個細胞包含不同的組合, 并且文庫大小僅由存在的細胞數量 ( 約 1012 個克 隆 ) 限制。兩種載體包含體內重組信號從而可以將 VH 和 VL 基因重組到單一復制子上并且 共同包裝到噬菌體病毒體中。 這些巨大的文庫提供大量的具有良好親和性 (Kd-1 約為 10-8M)的多種抗體。
     備選地, 可以將所有組成成分順序地克隆到同一載體中, 例如如在 Barbas 等, 美 國 國 家 科 學 院 學 報 (Proc.Natl.Acad.Sci.USA, )88 : 7978-7982(1991) 中 所 述, 或通 過 PCR 裝 配 在 一 起, 并 且 接 著 進 行 克 隆, 例 如 如 在 Clackson 等, 自 然 (Nature), 352 : 624-628(1991) 中所述。還可以將 PCR 裝配 (PCR assembly) 用于將 VH 和 VL DNA 與編碼 柔性肽間隔臂的 DNA 連接在一起形成單鏈 Fv(scFv) 所有組成成分。在其它的技術中, 將 “在細胞中的 PCR 裝配 (in cell PCR assembly)” 用于將 VH 和 VL 基因通過 PCR 組合在淋 巴細胞中, 并且接著克隆連接的基因的所有組成成分, 如在 Embleton 等, 核酸研究 (Nucl. AcidsRes.), 20 : 3831-3837(1992) 中所述。
     由天然文庫 ( 自然的或合成的 ) 產生的抗體可以具有中度親和性 (Kd-1 為約 106 到 107M-1), 但是親和力成熟也可以通過構建次級文庫并且再次從所述文庫中選擇來在體外 進行模擬, 如在 Winter 等 (1994), 見上文中所述。例如, 可以在 Hawkins 等, 分子生物學 雜志 (J.Mol.Biol.), 226 : 889-896(1992) 的方法或 Gram 等, 美國國家科學院學報 (Proc. Natl.Acad.Sci USA), 89 : 3576-3580(1992) 的方法中使用易錯聚合酶 ( 在 Leung 等, 技術 (Technique), 1: 11-15(1989) 中報道 ), 在體外隨機引入突變。 另外可以如下進行親和力成 熟: 例如使用由引物 ( 攜帶跨越目的 CDR 的隨機序列 ) 進行的 PCR 在選定的個體 Fv 克隆 中隨機突變一個或多個 CDR, 并且篩選具有更高親和性的克隆。WO 96/07754( 公開于 1996 年 3 月 14 日 ) 描述了一種在免疫球蛋白輕鏈的互補性決定區中誘導突變發生從而產生輕 鏈基因的文庫的方法。另一種有效方法是將通過噬菌體展示選擇的 VH 或 VL 結構域與獲自 未免疫的供體的天然存在的 V 結構域變體的所有組成成分重組并且在數輪鏈改組中關于 更高的親和性進行篩選, 如在 Marks 等, 生物技術 (Biotechnol.), 10 : 779-783(1992) 中所 -9 述。該技術允許產生具有 10 M 范圍內的親和性的抗體和抗體片段。
     FGFR3 核酸和氨基酸序列在本領域中是已知的。編碼 FGFR3 的核酸序列可以使 用 FGFR3 的所需區的氨基酸序列來設計。如本領域中所公知的, 存在兩種主要的 FGFR3 的 剪接同種型, 即 FGFR3IIIb 和 FGFR3IIIc。FGFR3 序列在本領域中是公知的, 并且可能包括 UniProKB/Swiss-Prot 登記號 P22607(FGFR3IIIc) 或 P22607_2(FGFR3IIIb) 的序列。 FGFR3 突變已經得以鑒定并且在本領域中是眾所周知的, 并且包括下列突變 ( 參照 UniProKB/ Swiss-Prot 登記號 P22607(FGFR3IIIc) 或 P22607_2(FGFR3IIIb) 中顯示的序列 ) :
     編碼 FGFR3 的核酸可以通過本領域中已知的多種方法制備。這些方法包括, 但不 限于, 通過 Engels 等 ., Agnew.Chem.Int.Ed.Engl., 28 : 716-734(1989) 中所述的任意方法
     化學合成, 所述方法諸如三酯、 亞磷酸酯、 亞磷酰胺和 H- 膦酸酯法。在一個實施方案中, 表 達宿主細胞優選的密碼子用于編碼 FGFR3 的 DNA 的設計中。備選地, 編碼 FGFR3 的 DNA 可 以從基因組或 cDNA 文庫中分離。
     在構建編碼 FGFR3 的 DNA 分子后, 該 DNA 分子可操作地連接至表達載體 ( 諸如質 粒 ) 中的表達控制序列, 其中所述控制序列被用該載體轉化的宿主細胞識別。通常, 質粒載 體包含復制和控制序列, 它們來源于與該宿主細胞相容的物種。 該載體通常攜帶復制位點, 以及編碼能夠在轉化的細胞中提供表型選擇的蛋白的序列。 用于在原核和真核宿主細胞中 表達的合適載體是本領域中公知的, 并且一些進一步在本文中描述。可以使用真核生物諸 如酵母, 或來源于多細胞生物體諸如哺乳動物的細胞。
     任選地, 編碼 FGFR3 的 DNA 可操作地連接至分泌前導序列, 導致表達產物被宿主細 胞分泌至培養基中。分泌前導序列的實例包括 stII, ecotin, lamB, 皰疹 GD, lpp, 堿性磷酸 酶, 轉化酶和 α 因子。還適合用于本文中的有蛋白 A 的 36 個氨基酸前導序列 (Abrahmsen 等 ., EMBO J., 4: 3901(1985))。
     宿主細胞用上述本發明的表達或克隆載體轉染和優選轉化, 并且在根據情況適當 改良的常規營養培養基中培養以誘導啟動子、 選擇轉化體, 或擴增編碼所需序列的基因。
     轉染是指由宿主細胞攝取表達載體, 無論是否實際表達任何編碼序列。大量的轉 染方法是普通技術人員所公知的, 例如, CaPO4 沉淀和電穿孔。通常當在宿主細胞中出現此 載體工作的任何指征時識別成功的轉染。轉染的方法在本領域中是公知, 并且在本文中進 一步描述其中的一些。
     轉化的含義是將 DNA 引入至生物體中使得 DNA 是可復制的, 或作為染色體外元件 或通過染色體整合體復制。取決于使用的宿主細胞, 使用適合于此類細胞的標準技術完成 轉化。轉化的方法在本領域中是公知, 并且在本文中進一步描述其中的一些。
     用來產生 FGFR3 的原核宿主細胞可以如通常在 Sambrook 等 ., 見上文中所述進行 培養。
     用來產生 FGFR3 的哺乳動物宿主細胞可以在多種培養基中培養, 所述培養基在本 領域中是公知的, 并且在本文中描述其中的一些。
     本公開中提及的宿主細胞涵蓋體外培養的細胞以及在宿主動物內的細胞。
     FGFR3 的純化可以使用本領域公認的方法來實現, 本文描述其中的一些。
     純化的 FGFR3 可以附著至合適的基質諸如瓊脂糖珠, 丙烯酰胺珠, 玻璃珠, 纖維 素, 各種丙烯酸共聚物, 甲基丙烯酸羥基酯凝膠, 聚丙烯酸和聚甲基丙烯酸共聚物, 尼龍, 中 性和離子載體, 等等, 從而用于噬菌體展示克隆的親合層析分離中。FGFR3 蛋白附著到基質 上可以通過 Methodsin Enzymology( 酶學方法 ), vol.44(1976) 中所述的方法來實現。普 遍被采用用于將蛋白配體附著于多糖基質 ( 例如, 瓊脂糖, 葡聚糖或纖維素 ) 的技術涉及用 鹵化氰活化載體, 隨后將肽配體的伯脂族或芳族胺與活化的基質偶聯。
     備選地, FGFR3 用于包被吸附板的孔, 并且在粘附于吸附板的宿主細胞上表達或用 于細胞分選, 或綴合于生物素從而用鏈霉抗生物素蛋白包被的珠進行捕獲, 或用在任何對 噬菌體展示文庫進行淘選的其它本領域公知的方法中。
     在適合將噬菌體顆粒的至少一部分與吸附劑結合的條件下, 將噬菌體文庫樣品與 固定的 FGFR3 接觸。在正常情況下, 選擇所述條件, 包括 pH, 離子強度, 溫度等來模擬生理條件。對結合于固相的噬菌體進行洗滌并且接著用酸洗脫, 例如如在 Barbas 等, 美國國家 科學院學報 (Proc.Natl.Acad.Sci USA), 88 : 7978-7982(1991) 中所述, 或用堿洗脫, 例如 如在 Marks 等, 分子生物學雜志 (J.Mol.Biol.), 222 : 581-597(1991) 中所述, 或通過 FGFR3 抗原競爭洗脫, 例如以類似于 Clackson 等, 自然 (Nature), 352 : 624-628(1991) 的抗原競爭 方法的方法進行。可以將噬菌體在單輪選擇中富集 20-1,000 倍。而且可以將富集的噬菌 體生長在細菌培養物中并且進行另幾輪的選擇。
     選擇的效率取決于許多因素, 包括在洗滌過程中解離的動力學, 以及在單個噬菌 體上的多種抗體片段是否可以同時與抗原結合 (engage)。可以通過使用短暫洗滌, 多價 噬菌體展示以及抗原在固相中的高度包被密度保持具有快速解離動力學 ( 以及弱的結 合親和性 ) 的抗體。高密度不僅通過多價相互作用穩定所述噬菌體, 而且有利于解離的 噬菌體的再次結合。可以通過使用長時間洗滌, 和如在 Bass 等, 蛋白質 (Proteins), 8: 309-314(1990) 和在 WO 92/09690 中所述的單價噬菌體展示, 以及在 Marks 等, 生物技術 (Biotechnol)., 10 : 779-783(1992) 中所述的低包被密度的抗原來促進對具有緩慢解離動 力學 ( 和良好結合親和性 ) 的抗體的選擇。
     可以在對于 FGFR3 具有不同親和性 ( 甚至具有稍稍不同的親和性 ) 的噬菌體抗體 之間進行選擇。然而, 選定的抗體的隨機突變 ( 例如, 如在上述親和力成熟技術中的一些中 進行的 ) 可能產生了許多突變體, 大部分與抗原結合, 并且其中一些具有更高的親和性。以 FGFR3 為限制條件, 只有極少的高親和性噬菌體可以競爭勝出。 為了保留所有的更高親和性 的突變體, 噬菌體可以用過量的生物素化的 FGFR3 溫育, 但是所述生物素化的 FGFR3 的濃度 低于關于 FGFR3 的靶摩爾親和性常數的摩爾濃度。接著, 所述高親和性結合的噬菌體被鏈 霉抗生物素蛋白包被的順磁珠 (paramagnetic beads) 捕獲。所述 “平衡捕獲” 允許抗體根 據它們的結合親和性進行選擇, 其敏感性允許從大量過量的具有較低親和性的噬菌體中分 離少至兩倍更高親和性的突變體克隆。 還可以對在洗滌結合于固相的噬菌體中所用的條件 進行操作以基于解離動力學進行區分。
     可以通過活性來選擇 FGFR3 克隆。在一個實施方案中, 本發明提供這樣的 FGFR3 抗體, 其阻斷 FGFR3 受體及其配體 ( 諸如 FGF1 和 / 或 FGF9) 之間的結合。可以通過下述來 選擇對應于所述 FGFR3 抗體的 Fv 克隆 : (1) 從如上所述的噬菌體文庫中分離 FGFR3 克隆, 并且任選地通過在適合的細菌宿主中增殖所述群體擴增分離的噬菌體克隆群體 ; (2) 選擇 針對其分別需要阻斷和不阻斷活性的 FGFR3 和第二蛋白 ; (3) 將抗 -FGFR3 噬菌體克隆吸附 于固定的 FGFR3 ; (4) 使用過量的第二蛋白洗脫任何識別這樣的 FGFR3- 結合決定簇的不需 要的克隆, 所述決定簇與第二蛋白的結合決定簇重疊或共享 ; 和 (5) 在步驟 (4) 之后, 洗脫 保持被吸附的克隆。任選地, 可以通過重復本文所述的選擇方法一次或多次來進一步富集 具有需要的封閉 / 不封閉性質的克隆。
     編碼本發明的雜交瘤來源的單克隆抗體或噬菌體展示 Fv 克隆的 DNA 容易使用常 規方法進行分離和測序 ( 例如通過使用設計用來特異性擴增來自雜交瘤或噬菌體 DNA 模 板的目的重鏈和輕鏈編碼區的寡核苷酸引物 )。一旦分離, 可以將所述 DNA 置于表達載體 中, 將其接著轉染到宿主細胞如大腸桿菌 (E.coli) 細胞中, 猿猴 COS 細胞中, 中國倉鼠卵巢 (CHO) 細胞中, 或不另外產生免疫球蛋白的骨髓瘤細胞中, 從而在重組宿主細胞中獲得需 要的單克隆抗體的合成。關于在細菌中重組表達編碼抗體的 DNA 的綜述文獻包括 Skerra等, 現代免疫學觀點 (Curr.Opinion inImmunol.), 5: 256(1993) 和 Pluckthun, 免疫學綜述 (Immunol.Revs), 130 : 151(1992)。
     可以將編碼本發明的 Fv 克隆的 DNA 與編碼重鏈和 / 或輕鏈恒定區的已知 DNA 序 列 ( 例如可以獲自 Kabat 等, 見上文的適合的 DNA 序列 ) 組合從而形成編碼全長或部分長 度的重鏈和 / 或輕鏈的克隆。 要理解的是, 任何同種型的恒定區可以用于該目的, 包括 IgG, IgM, IgA, IgD, 和 IgE 恒定區, 并且所述恒定區可以獲自任何人或動物物種。來自一種動物 ( 如人 ) 物種的可變結構域 DNA 的 Fv 克隆并接著與另一種動物物種的恒定區 DNA 融合從 而形成關于 “雜合” 全長重鏈和 / 或輕鏈的編碼序列, 這包含在本文所用的 “嵌合體” 和 “雜 合” 抗體的定義中。在優選實施方案中, 將衍生自人可變 DNA 的 Fv 克隆與人恒定區 DNA 融 合從而形成關于全部人的全長或部分長度的重鏈和 / 或輕鏈的編碼序列。
     例如, 還可以通過用人重鏈和輕鏈恒定結構域的編碼序列取代來自雜交瘤克隆 的同源鼠序列來修飾衍生自本發明的雜交瘤的編碼抗 -FGFR3 抗體的 DNA( 例如, 如在 Morrison 等, 美國國家科學院學報 (Proc.Natl.Acad.Sci.USA), 81 : 6851-6855(1984) 的方 法中 )。可以通過將免疫球蛋白編碼序列共價連接于非免疫球蛋白多肽的全部或部分編碼 序列來進一步修飾編碼雜交瘤或 Fv 克隆來源的抗體或片段的 DNA。以這種方式, 制備這樣 的 “嵌合” 或 “雜合” 抗體, 其具有本發明的 Fv 克隆或雜交瘤克隆衍生的抗體的結合特異性。
     抗體片段
     本發明涵蓋抗體片段。 在某些情形中, 存在使用抗體片段, 而不是使用完整抗體的 益處。更小的片段大小容許快速清除, 并且可以導致提高的對實體瘤的接近。
     已經開發了用于生成抗體片段的多種技術。傳統上, 通過蛋白水解消化完整 抗體來衍生這些片段 ( 參見例如 Morimoto 等, 生物化學和生物物理方法雜志 (Journal of Biochemical and Biophysical Methods)24 : 107-117(1992) ; 和 Brennan 等,科 學 (Science)229 : 81(1985))。然而, 現在可直接由重組宿主細胞生成這些片段。Fab, Fv 和 ScFv 抗體片段都可以在大腸桿菌中表達并且分泌, 由此導致容易產生大量的這些片段。可 從上文討論的抗體噬菌體文庫中分離抗體片段。或者, 可直接從大腸桿菌回收 Fab’ -SH 片 段 并 化 學 偶 聯 以 形 成 F(ab’ )2 片 段 (Carter 等, 生 物 / 技 術 (Bio/Technology)10 : 163-167(1992))。根據另一種方法, 可以直接從宿主細胞培養物中分離 F(ab’ )2 片段。包 含補救受體結合表位殘基具有增加的體內半衰期的 Fab 和 F(ab’ )2 片段在美國專利號 5,869,046 中描述。用于生成抗體片段的其它技術對于熟練從業人員將是顯而易見的。在 其他實施方案中, 選擇的抗體是單鏈 Fv 片段 (scFv)( 參見, 例如, WO93/16185 ; 美國專利號 5,571,894 及 5,587,458)。Fv 和 sFv 是具有完整結合位點、 缺少恒定區的唯一類型 ; 如此, 它們適于在體內使用時降低非特異性結合。可構建 sFv 融合蛋白以產生效應子蛋白質在 sFv 的氨基末端或羧基末端的融合。參見抗體改造 (Antibody Engineering), Borrebaeck 編, 見上文。抗體片段還可以是 “線性抗體” , 例如如美國專利號 5,641,870 中所記載的。此 類線性抗體片段可以是單特異性的或雙特異性的。
     人源化的抗體
     本發明涵蓋人源化抗體。在本領域中已知用于人源化非人抗體的各種方法。例 如, 人源化抗體可以具有一個或多個從非人來源引入的氨基酸殘基。這些非人氨基酸殘基 常常稱作 “輸入” 殘基, 它們典型的取自 “輸入” 可變結構域。人源化可基本上遵循 Winter及其同事的方法 (Jones 等, (1986) 自然 (Nature)321 : 522-525 ; Riechmann 等 (1988), 自 然 (Nature)332 : 323-327 ; Verhoeyen 等 (1988), 科學 (Science)239 : 1534-1536), 通過用 高變區序列取代相應的人抗體序列而進行。因而, 此類 “人源化” 抗體是嵌合抗體 ( 美國專 利號 4,816,567), 其中基本上少于完整的人可變結構域用來自非人物種的相應序列置換。 在實踐中, 人源化抗體典型的是其中一些高變區殘基和可能的一些 FR 殘基用來自嚙齒類 抗體中類似位點的殘基置換的人抗體。
     用于制備人源化抗體的人可變結構域 ( 輕鏈和重鏈二者 ) 的選擇對于降低抗原性 非常重要。依照所謂的 “最適” (best-fit) 方法, 針對已知的人可變結構域序列的整個文庫 篩選嚙齒類抗體的可變結構域序列。 然后接受與嚙齒類最接近的人序列作為人源化抗體的 人構架。(Sims 等 (1993), 免疫學雜志 (J.Immunol.)151 : 2296 ; Chothia 等 (1987), 分子生 物學雜志 (J.Mol.Biol.)196 : 901)。另一種方法使用由特定輕鏈或重鏈亞組的所有人抗體 的共有序列衍生的特定構架。同一構架可用于數種不同的人源化抗體 (Carter 等 (1992), 美國國家科學院學報 (Proc.Natl.Acad Sci.USA)89 : 4285 ; Presta 等 (1993), 免疫學雜志 (J.Immunol.)151 : 2623。
     更重要的是, 抗體在人源化后保持對抗原的高親和性及其它有利的生物學特性。 為了實現這一目標, 依照一種方法, 通過使用親本和人源化序列的三維模型分析親本序列 和各種概念性人源化產物的方法來制備人源化抗體。三維免疫球蛋白模型是公眾可獲得 的, 且為本領域技術人員所熟悉。可獲得圖解和顯示所選候選免疫球蛋白序列的可能三維 構象結構的計算機程序。 檢查這些顯示圖像容許分析殘基在候選免疫球蛋白序列的功能行 使中的可能作用, 即分析影響候選免疫球蛋白結合其抗原的能力的殘基。 以這種方式, 可從 接受體和輸入序列中選出 FR 殘基并進行組合, 從而獲得期望的抗體特征, 如對于靶抗原增 加的親和性。一般而言, 高變區殘基直接且最實質地參與影響對抗原的結合。
     人抗體
     本發明的人抗 -FGFR3 抗體可以通過組合選自人來源的噬菌體展示文庫的 Fv 克 隆可變結構域序列和如上所述的已知人恒定結構域序列構建。備選地, 本發明的人單克隆 抗 -FGFR3 抗體可以通過雜交瘤方法制備。用于產生人單克隆抗體的人骨髓瘤和小鼠 - 人 異骨髓瘤 (heteromyeloma) 細胞系已經在例如 Kozbor 免疫學雜志 (J.Immunol.), 133 : 3001(1984) ; Brodeur 等, 單克隆產生技術和應用 (Monoclonal Production Techniques andApplications), 第 51-63 頁 (Marcel Dekker, Inc., 紐約, 1987) ; 和 Boerner 等, 免疫學 雜志 (J.Immunol.), 147 : 86(1991) 中進行描述。
     現在有可能產生在缺乏內源免疫球蛋白生成的情況下能夠在免疫后生成人抗體 完整全集的轉基因動物 ( 例如小鼠 )。例如, 已經記載了嵌合和種系突變小鼠中抗體重鏈 連接區 (JH) 基因的純合缺失導致內源抗體生成的完全抑制。在此類種系突變小鼠中轉移 人種系免疫球蛋白基因陣列將導致在抗原攻擊后生成人抗體。參見例如 Jakobovits 等, 美 國 國 家 科 學 院 學 報 (Proc.Natl.Acad.Sci.USA)90 : 2551(1993) ; Jakobovits 等, 自然 (Nature)362 : 255(1993) ; Bruggermann 等, Year in Immunol., 7: 33(1993)。
     還可以將基因改組用于從非人, 例如嚙齒類動物抗體衍生人抗體, 其中人抗體具 有與起始的非人抗體相似的親和性和特異性。根據該方法, 其也稱為 “表位印刻 (epitope imprinting)” , 將通過如上所述的噬菌體展示技術獲得的非人抗體片段的重鏈或輕鏈可變區用人 V 結構域基因的所有組成部分取代, 產生非人鏈 / 人鏈 scFv 或 Fab 嵌合體的群體。 用抗原進行選擇導致非人鏈 / 人鏈嵌合 scFv 或 Fab 的分離, 其中人鏈恢復了在初級噬菌體 展示克隆中去除了相應的非人鏈之后被破壞的抗原結合位點, 即表位支配 ( 印刻 ) 人鏈配 偶體的選擇。當重復所述方法從而取代余下的非人鏈時, 獲得人抗體 ( 見在 1993 年 4 月 1 日公開的 PCT WO 93/06213)。不像通過 CDR 移植對非人抗體進行的傳統人源化, 這種技術 提供完整的人抗體, 其不具有非人來源的 FR 或 CDR 殘基。
     雙特異性抗體
     雙特異性抗體是對于至少兩種不同的抗原具有結合特異性的單克隆抗體, 優選是 人抗體或人源化抗體。在這種情況下, 一種結合特異性是關于 FGFR3 的, 而另一種是關于任 何其它抗原的。示例性的雙特異性抗體可以結合 FGFR3 的兩種不同的表位。還可以將雙特 異性抗體用于將細胞毒性藥劑定位到表達 FGFR3 的細胞。 這些抗體具有 FGFR3- 結合臂和結 合細胞毒性藥劑的臂 ( 所述細胞毒性藥劑例如, 肥皂草毒蛋白 (saporin)、 抗 - 干擾素 -α、 長春花生物堿、 蓖麻毒蛋白 A 鏈、 甲氨蝶呤或放射性同位素半抗原 )。可以將雙特異性抗體 制備為全長抗體或抗體片段 ( 例如, F(ab′ )2 雙特異性抗體 )。
     用于生成雙特異性抗體的方法是本領域已知的。傳統上, 雙特異性抗體的重組生 產基于兩對免疫球蛋白重鏈 - 輕鏈的共表達, 其中兩條重鏈具有不同的特異性 (Milstein 和 Cuello, 自然 (Nature)305 : 537(1983))。由于免疫球蛋白重鏈和輕鏈的隨機分配, 這些 雜交瘤 ( 四源雜交瘤 (quadroma)) 生成 10 種不同抗體分子的潛在混合物, 其中只有 - 種具 有正確的雙特異性結構。 通常通過親和層析步驟進行的正確分子的純化相當麻煩且產物產 量低。類似的方法披露于在 1993 年 5 月 13 日公開的 WO 93/08829 及 Traunecker 等, EMBO J.10 : 3655(1991)。
     依照一種不同且更優選的方法, 將具有期望的結合特異性 ( 抗體 - 抗原結合位點 ) 的抗體可變結構域與免疫球蛋白恒定結構域序列融合。融合體優選具有包含至少部分鉸 鏈、 CH2 和 CH3 區的免疫球蛋白重鏈恒定結構域。優選在至少一種融合體中存在包含輕鏈 結合所必需的位點的第一重鏈恒定區 (CH1)。將編碼免疫球蛋白重鏈融合物和需要時的編 碼免疫球蛋白輕鏈的 DNA 插入分開的表達載體, 并共轉染入合適的宿主生物體。在用于構 建的三種多肽鏈比例不等時提供最佳產量的實施方案中, 這為調整三種多肽片段的相互比 例提供了很大的靈活性。然而, 在至少兩種多肽鏈以相同比例表達導致高產量時或在該比 例沒有特別意義時, 有可能將兩種或所有三種多肽鏈的編碼序列插入一個表達載體中。
     在該方法的一個優選實施方案中, 雙特異性抗體由一個臂上具有第一結合特異性 的雜合免疫球蛋白重鏈, 和另一個臂上的雜合免疫球蛋白重鏈 - 輕鏈對 ( 提供第二結合特 異性 ) 構成。由于免疫球蛋白輕鏈僅在半個雙特異性分子中的存在提供了便利的分離途 徑, 因此發現這種不對稱結構便于將想要的雙特異性化合物與不想要的免疫球蛋白鏈組合 分開。該方法披露于 WO 94/04690。關于生成雙特異性抗體的進一步詳情參見例如 Suresh 等, 酶學方法 (Methods in Enzymology)121 : 210(1986)。
     依照另一種方法, 可改造一對抗體分子間的界面, 以將從重組細胞培養物回收的 異二聚體的百分比最大化。該優選界面包含抗體恒定結構域的至少部分 CH3 結構域。在該 方法中, 將第一抗體分子界面的一個或多個小氨基酸側鏈用較大側鏈 ( 例如酪氨酸或色氨 酸 ) 置換。通過將大氨基酸側鏈用較小氨基酸側鏈 ( 例如丙氨酸或蘇氨酸 ) 置換, 在第二抗體分子的界面上產生與大側鏈大小相同或相似的補償性 “空腔” 。 這提供了較之其它不想 要的終產物 ( 諸如同二聚體 ) 提高異二聚體產量的機制。
     雙特異性抗體包括交聯的或 “異源綴合的” 抗體。例如, 在異源綴合抗體中的一種 抗體可以與抗生物素蛋白偶聯, 另一種抗體可以與生物素偶聯。所述抗體已經例如被提議 靶向免疫系統細胞到不想要的細胞 ( 美國專利號 4,676,980), 并且用于治療 HIV 感染 (WO 91/00360, WO 92/00373, 和 EP 03089)。可以使用任何便利的交聯方法制備異源綴合抗體。 適合的交聯試劑是本領域中公知的, 并且連同許多交聯技術在美國專利號 4,676,980 中公 開。
     文獻中還記載了由抗體片段生成雙特異性抗體的技術。例如, 可使用化學連接來 制備雙特異性抗體。Brennan 等, 科學 (Science)229 : 81(1985) 記載了通過蛋白水解切割 完整抗體以生成 F(ab’ )2 片段的方法。將這些片段在存在二硫醇絡合劑亞砷酸鈉時還原, 以穩定鄰近的二硫醇并防止分子間二硫鍵的形成。然后將產生的 Fab’ 片段轉變為硫代硝 基苯甲酸酯 (TNB) 衍生物。然后將 Fab’ -TNB 衍生物之一通過巰基乙胺的還原重新恢復成 Fab’ - 硫醇, 并與等摩爾量的另一種 Fab’ -TNB 衍生物混合, 以形成雙特異性抗體。產生的 雙特異性抗體可用作酶的選擇性固定化試劑。
     最新的進展便于從大腸桿菌直接回收 Fab’ -SH 片段, 這些片段可化學偶聯以形成 雙特異性抗體。Shalaby 等, J.Exp.Med.( 實驗醫學雜志 )175 : 217-225(1992) 記載了完全 人源化的雙特異性抗體 F(ab’ )2 分子的生成。由大腸桿菌分別分泌每種 Fab’ 片段, 并在體 外進行定向化學偶聯以形成雙特異性抗體。 如此形成的雙特異性抗體能夠結合過表達 HER2 受體的細胞和正常人 T 細胞, 以及觸發人細胞毒性淋巴細胞針對人乳瘤靶標的裂解活性。
     還記載了從重組細胞培養物直接生成和分離雙特異性抗體片段的多種技術。例 如, 已使用亮氨酸拉鏈生成雙特異性抗體。Kostelny 等, 免疫學雜志 (J.Immunol.)148(5) : 1547-1553(1992)。將來自 Fos 和 Jun 蛋白的亮氨酸拉鏈肽通過基因融合與兩種不同抗體 的 Fab’ 部分連接。抗體同型二聚體在鉸鏈區還原以形成單體, 然后重新氧化以形成抗體 異二聚體。這種方法也可用于生成抗體同型二聚體。Hollinger 等, 美國國家科學院學報 (Proc.Natl.Acad.Sci.USA)90 : 6444-6448(1993) 記載的 “雙抗體” 技術提供了生成雙特異 性抗體片段的替代機制。該片段包含通過接頭相連的重鏈可變結構域 (VH) 和輕鏈可變結 構域 (VL), 所述接頭太短使得同一條鏈上的兩個結構域之間不能配對。 因而, 迫使一個片段 上的 VH 和 VL 結構域與另一個片段上的互補 VL 和 VH 結構域配對, 由此形成兩個抗原結合 位點。還報道了通過使用單鏈 Fv(sFv) 二聚體生成雙特異性抗體片段的另一種策略。參見 Gruber 等, 免疫學雜志 (J.Immunol.), 152 : 5368(1994)。
     涵蓋具有超過二價的抗體。例如, 可制備三特異性抗體。Tutt 等, 免疫學雜志 (J.Immunol.)147 : 60(1991)。
     多價抗體
     多價抗體可以比二價抗體更快的受到表達該抗體所結合抗原的細胞的內在化 ( 和 / 或異化 (catabolized))。本發明的抗體可以是可容易的通過重組表達編碼抗體多肽 鏈的核酸而生成的、 具有三個或更多抗原結合位點 ( 例如四價抗體 ) 的多價抗體 ( 除 IgM 類 別以外的 )。多價抗體可包含二聚化結構域和三個或更多抗原結合位點。優選的二聚化結 構域包含 ( 或由其組成 )Fc 區或鉸鏈區。在這種情況中, 抗體將包含 Fc 區及 Fe 區氨基末端的三個或更多抗原結合位點。本文優選的多價抗體包含 ( 或由其組成 ) 三個至約八個, 但優選四個抗原結合位點。 多價抗體包含至少一條多肽鏈 ( 和優選兩條多肽鏈 ), 其中所述 多肽鏈包含兩個或更多可變結構域。例如, 多肽鏈可包含 VD1-(X1)n-VD2-(X2)n-Fc, 其中 VD1 是第一可變結構域, VD2 是第二可變結構域, Fc 是 Fc 區的一條多肽鏈, X1 和 X2 代表氨 基酸或多肽, 而 n 是 0 或 1。例如, 多肽鏈可包含 : VH-CH1- 柔性接頭 -VH-CH1-Fc 區鏈 ; 或 VH-CH1-VH-CH1-Fc 區鏈。 本文中的多價抗體優選進一步包含至少兩條 ( 和優選四條 ) 輕鏈 可變結構域多肽。本文中的多價抗體可包含例如約兩條至約八條輕鏈可變結構域多肽。本 文涵蓋的輕鏈可變結構域多肽包含輕鏈可變結構域, 且任選進一步包含 CL 結構域。
     抗體變體
     在一些實施方案中, 預期本文所述的抗體的氨基酸序列修飾。 例如, 可能需要提高 抗體的結合親合力和 / 或其它生物學性質。通過將適合的核苷酸變化引入抗體核酸, 或通 過肽合成來制備抗體的氨基酸序列變體。所述修飾包括, 例如在抗體的氨基酸序列中缺失 殘基和 / 或插入殘基, 和 / 或置換殘基。進行缺失、 插入和置換的任何組合從而得到最終的 構建體, 條件是最終的構建體具有需要的特征。 在制備該序列時, 可以將氨基酸改變引入目 標抗體氨基酸序列。
     用于鑒定對于突變發生是優選位置的抗體的某些殘基或區域的有用方法被稱為 “丙氨酸分區誘變法 (alanine scanning mutagenesis)” , 如 Cunningham 和 Wells(1989) 科 學 (Science), 244 : 1081-1085 所述。在此處, 鑒定了一種殘基或一組靶殘基 ( 例如帶電荷 的殘基如 arg, asp, his, lys, 和 glu), 并且用中性或帶負電荷氨基酸 ( 最優選丙氨酸或聚 丙氨酸 ) 置換從而影響氨基酸與抗原的相互作用。然后, 通過在置換位點或關于置換位點 引入另外的或其它變體來精選顯示對置換的功能敏感性的那些氨基酸位置。因此, 當預先 確定引入氨基酸序列變化的位點時, 突變本身的性質不需要被預先確定。 例如, 為了分析在 給定位點的突變的性能, 在靶密碼子或靶區進行丙氨酸分區誘變或隨機誘變并且關于需要 的活性篩選表達的免疫球蛋白。
     氨基酸序列插入包括氨基和 / 或羧基端融合, 長度范圍在 1 個殘基到包含一百個 以上殘基的多肽, 以及單一氨基酸殘基或多個氨基酸殘基的序列內插入。末端插入的實例 包括具有 N- 端甲硫氨酰殘基的抗體或與細胞毒性多肽融合的抗體。抗體分子的其它插入 變體包括抗體的 N 端或 C 端與增加抗體的血清半衰期的酶 ( 例如, 關于 ADEPT) 或多肽的融 合。
     多肽的糖基化典型地是 N- 連接或 O- 連接的。N- 連接指糖結構部分與天冬酰胺 殘基的側鏈的連接。其中 X 是除了脯氨酸之外的任何氨基酸的三肽序列天冬酰胺 -X- 絲氨 酸和天冬酰胺 -X- 蘇氨酸, 是關于將糖結構部分酶促連接于天冬酰胺側鏈的識別序列。因 此, 在多肽中這些三肽序列中任一個的存在產生潛在的糖基化位點。O- 連接的糖基化指將 糖 N- 乙酰基半乳糖胺、 半乳糖或木糖之一連接于羥基氨基酸, 最常見連接于絲氨酸或蘇氨 酸, 盡管也可以使用 5- 羥基脯氨酸或 5- 羥基賴氨酸。
     常規情況下, 在抗體上加入糖基化位點通過改變氨基酸序列完成, 使得其包含一 個或多個上述三肽序列 ( 關于 N- 連接的糖基化位點 )。 還可以通過將一個或多個絲氨酸或 蘇氨酸殘基加入至起始抗體序列或通過置換一個或多個絲氨酸或蘇氨酸殘基來進行所述 改變 ( 對于 O- 連接的糖基化位點 )。如果抗體包含 Fc 區, 那么可以改變其連接的糖。例如, 在美國專利申請號 US 2003/0157108(Presta, L.) 中記述了具有成熟的糖結構的抗體, 其缺少連接在抗體 Fc 區 上的巖藻糖。還參見 US 2004/0093621(KyowaHakko Kogyo Co., Ltd)。在連接到抗體 Fc 區上的糖中具有平分型 N- 乙酰葡糖胺 (N-acetylglucosamine)(GlcNAc) 的抗體參見 WO 2003/011878, Jean-Mairet 等和美國專利號 6,602,684, Umana 等。WO 1997/30087, Patel 等報道了在連接到抗體 Fc 區上的寡糖中具有至少一個半乳糖殘基的抗體。還參見 WO 1998/58964(Raju, S.) 和 WO 1999/22764(Raju, S.), 其關于具有連接到抗體 Fc 區上的改變 的糖的抗體。 還參見 US 2005/0123546(Umana 等 ), 其關于具有改變的糖基化的抗原結合分 子。
     本文優選的糖基化變體包含 Fc 區, 其中與 Fc 區連接的糖結構缺少巖藻糖。這樣 的變體具有改善的 ADCC 功能。任選地, Fc 區中進一步包含一個或多個氨基酸置換, 所述 置換進一步改善 ADCC, 例如, Fc 區的位置 298, 333, 和 / 或 334 處 ( 殘基的 Eu 編號 ) 的置 換。涉及 “脫巖藻糖基化” 或 “缺少巖藻糖的” 抗體的公開物的實例包括 : US 2003/0157108 ; WO2000/61739 ; WO 2001/29246 ; US 2003/0115614 ; US 2002/0164328 ; US2004/0093621 ; US 2004/0132140 ; US 2004/0110704 ; US 2004/0110282 ; US2004/0109865 ; WO 2003/085119 ; WO 2003/084570 ; WO 2005/035586 ; WO2005/035778 ; WO2005/053742 ; Okazaki 等 .J.Mol. Biol.( 分子生物學雜志 )336 : 1239-1249(2004) ; Yamane-Ohnuki 等 .Biotech.Bioeng.( 生 物技術和生物工程 )87 : 614(2004)。產生脫巖藻糖基化抗體的細胞系的實例包括蛋白質 巖藻糖基化缺陷的 Lec13CHO 細胞 (Ripka 等 .Arch.Biochem.Biophys.( 生物化學和生物 物理學集刊 )249 : 533-545(1986) ; 美國專利申請號 US2003/0157108A1, Presta, L; 和 WO 2004/056312A1, Adams 等 ., 特別是實施例 11), 和敲除的細胞系, 諸如 α-1, 6- 巖藻糖基轉 移酶基因 FUT8 敲除的 CHO 細胞 (Yamane-Ohnuki 等 .Biotech.Bioeng.( 生物技術和生物工 程 )87 : 614(2004))。
     另一種類型的變體是氨基酸置換變體。 這些變體在抗體分子中具有被不同的殘基 置換的至少一個氨基酸 ( 至少兩個, 至少三個, 至少 4 個以上 ) 殘基。用于置換誘變的最感 興趣的位點包括高變區, 但是也預期 FR 改變。保守性置換在 “優選的置換” 的標題下在表 1 中顯示。如果這樣的置換導致生物活性的改變, 則可以引入在表 1 中稱為 “示例性置換” 或 在下面參照氨基酸類別進一步描述的更多實質性的改變, 并篩選產物。
     表1
     抗體的生物學性質中的實質性修飾通過選擇這樣的置換來進行, 所述置換在它們 對下列的作用方面有顯著差異 : (a) 保持在置換區域中的多肽主鏈的結構, 例如, 作為折疊 或螺旋構象, (b) 保持在靶位點處的分子的電荷或疏水性, 或 (c) 保持側鏈的體積。將天然 存在的殘基基于常見的側鏈性質分為數組 :
     (1) 疏水性 : 正亮氨酸, met, ala, val, leu, ile ;
     (2) 中性親水性 : Cys, Ser, Thr, Asn, Gln ;
     (3) 酸性 : asp, glu ;
     (4) 堿性 : his, lys, arg ;
     (5) 影響鏈取向的殘基 : gly, pro ; 和
     (6) 芳族的 : trp, tyr, phe。
     非保守性置換需要將這些類別中之一的成員交換為另一類。
     一種類型的置換變體包括置換親本抗體 ( 例如人源化或人抗體 ) 的一個或多個高 變區殘基。一般地, 關于進一步發展所選擇的得到的一種或多種變體相對于它們產生自其 中的親本抗體具有提高的生物學性質。 一種產生這樣的置換變體的便利方式涉及使用噬菌 體展示的親和力成熟。 簡言之, 對一些高變區位點 ( 例如, 6-7 個位點 ) 突變從而在每個位點 產生所有可能的氨基酸置換。由此產生的抗體作為在每個顆粒中包裝的與 M13 的基因 III 產物的融合體而由絲狀噬菌體顆粒展示。 接著如本文公開的那樣篩選噬菌體展示的變體的 生物學活性 ( 例如, 結合親合力 )。為了鑒定用于修飾的候選高變區位點, 可以進行丙氨酸 分區誘變從而鑒定對抗原結合有顯著貢獻的高變區殘基。備選地, 或另外地, 分析抗原 - 抗 體復合體的晶體結構從而鑒定抗體和抗原之間的接觸點可以是有益的。 根據本文闡述的技 術, 所述接觸殘基和鄰近殘基是用于置換的候選物, 包括在本文中闡釋的那些。 一旦產生了 所述變體, 該組變體如本文所述進行篩選, 并且可以選擇在一個或多個相關測定法中具有 較佳性質的抗體用于進一步開發。
     編碼抗體的氨基酸序列變體的核酸分子通過本領域已知的多種方法進行制備。 這 些方法包括, 但不限于 : 從自然來源分離 ( 在天然存在的氨基酸變體的情形中 ) 或通過早期 制備的抗體的變體或非變體形式的寡核苷酸 - 介導 ( 或位點定向 ) 的誘變, PCR 誘變, 和盒 誘變進行制備。
     可能需要將一個或多個氨基酸修飾引入本發明的免疫球蛋白多肽的 Fc 區, 由此 產生 Fc 區變體。所述 Fc 區變體可以包含這樣的人 Fc 區序列 ( 例如人 IgG1, IgG2, IgG3 或 IgG4Fc 區 ), 所述 Fc 區序列在一個或多個氨基酸位置包含氨基酸修飾 ( 例如置換 ), 包含鉸 鏈半胱氨酸的氨基酸修飾。
     根據該說明書以及本領域的教導, 預期在一些實施方案中, 在本發明的方法中使 用的抗體與野生型對應體抗體比較可以包含一個或多個改變, 例如在 Fc 區中包含一個或 多個改變。然而, 這些抗體仍舊基本保留與它們的野生型對應體相同的治療應用所需要 的特征。例如, 認為可以在 Fc 區中進行某些改變, 所述改變將導致改變的 ( 即, 提高的或 減少的 )C1q 結合和 / 或補體依賴性細胞毒性 (CDC), 例如如在 WO 99/51642 中所述。還 見 Duncan & Winter, 自然 (Nature)322 : 738-40(1988) ; 美國專利號 5,648,260 ; 美國專 利號 5,624,821 ; 和 WO94/29351, 其涉及 Fc 區變體的其它實例。WO00/42072(Presta) 和 WO 2004/056312(Lowman) 描述了具有提高的或減少的與 FcRs 結合的抗體變體。這些專 利出版物的內容特別通過引用結合在本文中。還見, Shields 等, 生物化學雜志 (J.Biol. Chem.)9(2) : 6591-6604(2001)。 在 US2005/0014934A1(Hinton 等 ) 中 描 述 了 具 有 增 加 的半衰期并且對于新生兒 Fc 受體 (FcRn) 具有提高的結合的抗體, 其負責將母體 IgGs 轉 移 給 胎 兒 (Guyer 等, 免 疫 學 雜 志 (J.Immunol)117 : 587(1976) 和 Kim 等, 免疫學雜志 (J.Immunol.)24 : 249(1994))。這些抗體包含在其中具有一個或多個置換的 Fc 區, 所述 置換提高 Fc 區與 FcRn 的結合。在美國專利號 6,194,551B1, WO99/51642 中描述了具有 改變的 Fc 區氨基酸序列和增加的或減少的 C1q 結合能力的多肽變體。將這些專利出版物的內容特別通過引用結合在本文。還見, Idusogie 等, 免疫學雜志 (J.Immunol.)164 : 4178-4184(2000)。
     抗體衍生物
     可以對本發明的抗體進一步修飾以包含本領域已知并且容易獲得的另外的非蛋 白質性的結構部分。優選地, 適合抗體的衍生作用的結構部分是水溶性聚合物。水溶性聚 合物的非限制性實例包括, 但不限于 : 聚乙二醇 (PEG), 乙二醇 / 丙二醇的共聚物, 羧甲基纖 維素, 葡聚糖, 聚乙烯醇, 聚乙烯吡咯烷酮, 聚 -1, 3- 二氧戊環, 聚 -1, 3, 6- 三噁烷, 乙烯 / 馬 來酸酐共聚物, 聚氨基酸 ( 同聚物或隨機共聚物 ), 和葡聚糖或聚 (n- 乙烯基吡咯烷酮 ) 聚 乙二醇, 丙二醇同聚物, 聚環氧丙烷 / 氧化乙烯共聚物, 聚氧乙基化的多元醇 ( 例如甘油 ), 聚乙烯醇, 及其混合物。由于其在水中的穩定性, 聚乙二醇丙醛可以在生產中具有優勢。聚 合物可以具有任何分子量, 并且可以是分支或不分支的。與抗體連接的聚合物的數目可以 變化, 并且如果連接多于一個聚合物, 它們可以是相同或不同的分子。一般地, 用于衍生化 的聚合物的數目和 / 或類型可以基于這樣的考慮來確定, 所述考慮包括, 但不限于, 待提高 的抗體的具體性質或功能, 抗體衍生物是否將在限定的條件下用于治療中等。
     篩選具有所需性質的抗體
     本發明的抗體可以通過本領域中已知的多種測定法 ( 它們中的一些公開在本文 中 ) 來表征它們的物理 / 化學性質和生物學功能。在一些實施方案中, 抗體關于下列中的 任一種或多種進行表征 : FGF( 諸如 FGF1 和 / 或 FGF9) 結合的減少或阻斷, FGFR3 激活的減 少或阻斷, FGFR3 下游分子信號傳導的減少或阻斷, FGFR3 與配體 ( 例如, FGF1, FGF9) 結合 的破壞或阻斷, FGFR3 二聚作用的減少或阻斷, 促進單體 FGFR3 的形成, 與單體 FGFR3 的結 合, 和 / 或治療和 / 或預防腫瘤、 細胞增生性病癥或癌癥 ; 和 / 或治療或預防與 FGFR3 表達 和 / 或活性 ( 諸如增加的 FGFR3 表達和 / 或活性 ) 相關的病癥的。在一些實施方案中, 對 抗體篩選增加的 FGFR3 激活, 增加的 FGFR3 下游分子信號傳導, 凋亡活性, FGFR3 下調, 和效 應子功能 ( 例如, ADCC 活性 )。
     純化的抗體可以進一步通過一系列測定進行表征, 所述測定包括, 但不限于, N- 末 端測序, 氨基酸分析, 非變性尺寸排阻高壓液相色譜法 (HPLC), 質譜法, 離子交換色譜法和 木瓜蛋白酶消化。
     在本發明的某些實施方案中, 分析本文制備的抗體的生物學活性。在一些實施方 案中, 測試本發明的抗體的抗原結合活性。本領域已知的且可以在本文中使用的抗原結合 測定法包括但不限于任何直接的或競爭性的結合測定法, 所述測定法使用諸如 western 印 跡, 放射免疫測定, ELISA( 酶聯免疫吸附測定 ), “夾心” 免疫測定, 免疫沉淀測定, 熒光免疫 測定和蛋白 A 免疫測定的技術。示例性的抗原結合和其他測定在下面的實施例章節中提 供。
     如果需要抑制細胞生長的抗 -FGFR3 抗體, 則候選抗體可以在體外和 / 或體內 測定中測試, 所述測定測量對細胞生長的抑制。如果需要促進或不促進凋亡的抗 -FGFR3 抗體, 則候選抗體可以在測量凋亡的測定中測試。用于檢驗癌細胞生長和 / 或增殖的 方法, 或測定癌細胞的凋亡的方法在本領域中是公知的, 并且一些在本文中描述和例 證。用于測定細胞生長和 / 或增殖和 / 或凋亡的示例性方法包括, 例如, BrdU 摻入測 定, MTT, [3H]- 胸苷摻入 ( 例如, TopCount 測定 (PerkinElmer)), 細胞活力測定 ( 例如,CellTiter-Glo(Promega)), DNA 片段化測定, 胱天蛋白酶 (caspase) 激活測定, 臺盼藍拒染 (tryptan blue exclusion), 染色質形態測定等等。
     在一個實施方案中, 本發明設想了具有效應子功能的抗體。 在某些實施方案中, 測 量的抗體的 Fc 活性。可以進行體外和 / 或體內細胞毒性測定法從而證實 CDC 和 / 或 ADCC 活性的減少 / 消除。例如, 可以進行 Fc 受體 (FcR) 結合測定法從而確保抗體缺乏 FcγR 結 合 ( 因此可能缺乏 ADCC 活性 ), 但是保留 FcRn 結合能力。用于介導 ADCC 的主要細胞, 即 NK 細胞僅表達 FcγRIII, 而單核細胞表達 FcγRI, FcγRII 和 FcγRIII。在 Ravetch 和 Kinet, Annu.Rev.Immunol.9 : 457-92(1991) 的第 464 頁上的表 3 中總結在造血細胞上的 FcR 表達。 評估目的分子的 ADCC 活性的體外測定法的實例描述在美國專利號 5,500,362 或 5,821,337 中。在本文中也舉例說明了一種檢測 ADCC 活性的測定。用于所述測定法的有用 效應細胞包括外周血單核細胞 (PBMC) 和天然殺傷 (NK) 細胞。備選地或另外地, 目的分子 的 ADCC 活性可以在體內評估, 例如在諸如 Clynes 等 PNAS(USA)95 : 652-656(1998) 中公開 的動物模型中評估。還可以進行 C1q 結合測定法從而證實抗體不能結合 C1q 并且因此缺乏 CDC 活性。為了評估補體激活, 可以進行 CDC 測定法, 例如, 如在 Gazzano-Santoro 等, 免疫 學方法雜志 (J.Immunol.Methods)202 : 163(1996) 中所述。 還可以使用本領域已知的方法, 例如, 實施例章節中所述的那些方法, 進行 FcRn 結合和體內清除 / 半衰期測定。
     如果需要結合單體 FGFR3 的抗 -FGFR3 抗體, 則候選抗體可以在測量與單體 FGFR3 的結合和促進單體 FGFR3 形成的測定 ( 諸如體外測定 ) 中測試。此類測定在本領域中是已 知的, 并且在本文中描述和舉例說明一些測定。
     如果需要抑制 FGFR3 二聚作用的抗 -FGFR3 抗體, 則候選抗體可以在二聚作用測定 中測試, 例如, 所述測定如本文所述和例證。
     在一些實施方案中, 測定候選抗體的 FGFR3 激動劑功能。用于評估 FGFR3 抗體的 激動劑功能或活性的方法在本領域中是已知的, 并且一些也在本文中描述和例證。
     在一些實施方案中, 測定 FGFR3 抗體促進 FGFR3 受體下調的能力, 例如, 使用本文 描述和例證的方法進行。在一個實施方案中, FGFR3 抗體與合適的測試細胞, 例如, 膀胱癌 細胞系 ( 例如, RT112) 溫育, 并且在合適的時間段后, 收獲細胞裂解物, 并檢驗總 FGFR3 水 平。FACS 分析也可以用來檢驗與候選 FGFR3 抗體溫育后的表面 FGFR3 受體水平。
     載體、 宿主細胞和重組方法
     為了重組產生本發明的抗體, 分離編碼它的核酸, 并將其插入可復制載體, 用于進 一步克隆 (DNA 擴增 ) 或表達。可使用常規流程容易地分離并測序編碼抗體的 DNA( 如使用 能夠與編碼抗體重鏈和輕鏈的基因特異結合的寡核苷酸探針 )。可利用許多載體。載體的 選擇部分取決于將要使用的宿主細胞。通常, 優選的宿主細胞是原核或真核 ( 通常是哺乳 動物 ) 來源的。要理解的是任何同種型的恒定區可以用于此目的, 包括 IgG, IgM, IgA, IgD, 和 IgE 恒定區, 并且這樣的恒定區可以獲自任何人或動物物種。
     a. 使用原核宿主細胞產生抗體 :
     i. 載體構建
     可使用標準重組技術來獲得編碼本發明抗體的多肽成分的多核苷酸序列。 可從抗 體生成細胞諸如雜交瘤細胞分離期望的多核苷酸序列并測序。或者, 可使用核苷酸合成儀 或 PCR 技術合成多核苷酸。一旦得到, 將編碼多肽的序列插入能夠在原核宿主中復制并表達異源多核苷酸的重組載體。為了本發明的目的, 可使用本領域可獲得的且已知的許多載 體。 適宜載體的選擇將主要取決于將要插入載體的核酸的大小和將要用該載體轉化的具體 宿主細胞。根據其功能 ( 擴增或表達異源多核苷酸, 或二者兼之 ) 及其與它在其中駐留的 具體宿主細胞的相容性, 每種載體含有多種構件。載體構件通常包括但不限于 : 復制起點、 選擇標志基因、 啟動子、 核糖體結合位點 (RBS)、 信號序列、 異源核酸插入片段、 和轉錄終止 序列。
     一般而言, 與宿主細胞一起使用的質粒載體包含衍生自與這些宿主細胞相容的物 種的復制子和控制序列。載體通常攜帶復制位點, 以及能夠在轉化細胞中提供表型選擇的 標志序列。例如, 通常用衍生自大腸桿菌物種的質粒 pBR322 轉化大腸桿菌。pBR322 包含 編碼氨芐青霉素 (Amp) 和四環素 (Tet) 抗性的基因, 由此提供輕松鑒定轉化細胞的手段。 pBR322、 其衍生物、 或其它微生物質粒或噬菌體還可包含或經修飾而包含可被微生物生物 體用于表達內源蛋白質的啟動子。Carter 等人, 美國專利號 5,648,237 中詳細記載了用于 表達特定抗體的 pBR322 衍生物的實例。
     另外, 可將包含與宿主微生物相容的復制子和控制序列的噬菌體載體用作這些宿 主的轉化載體。例如, 可使用噬菌體諸如 λGEM.TM.-11 來構建可用于轉化易感宿主細胞 ( 諸如大腸桿菌 LE392) 的重組載體。
     本發明的表達載體可包含兩種或多種啟動子 - 順反子對, 它們編碼每一種多肽成 分。啟動子是位于順反子上游 (5′ ) 的非翻譯調控序列, 它調控順反子的表達。原核啟動 子通常分成兩類, 誘導型的和組成型的。誘導型啟動子指響應培養條件的變化 ( 如營養物 的存在與否或溫度變化 ) 而啟動受其控制的順反子的升高水平轉錄的啟動子。
     眾所周知受到多種潛在宿主細胞識別的大量啟動子。通過限制酶消化切下源 DNA 中的啟動子并將分離的啟動子序列插入本發明的載體, 由此可將選擇的啟動子與編碼輕鏈 或重鏈的順反子 DNA 可操作性連接。天然啟動子序列和許多異源啟動子都可用于指導靶基 因的擴增和 / 或表達。在有些實施方案中, 使用異源啟動子, 因為與天然靶多肽啟動子相 比, 它們通常容許所表達的靶基因的更高轉錄和更高產量。
     適用于原核宿主的啟動子包括 PhoA 啟動子、 β- 半乳糖苷酶 (β-galactamase) 和 乳糖啟動子系統、 色氨酸 (trp) 啟動子系統、 和雜合啟動子諸如 tac 或 trc 啟動子。 然而, 在 細菌中有功能的其它啟動子 ( 諸如其它已知的細菌或噬菌體啟動子 ) 也是合適的。它們的 核苷酸序列已經發表, 由此熟練工作人員能夠使用提供任何所需限制位點的接頭或銜接頭 將它們與編碼靶輕鏈和重鏈的順反子可操作性連接 (Siebenlist 等 (1980)Cell( 細胞 )20 : 269)。
     在本發明的一個方面, 重組載體內的每個順反子都包含指導所表達的多肽穿膜轉 運的分泌信號序列構件。 一般而言, 信號序列可以是載體的構件, 或者它可以是插入載體的 靶多肽 DNA 的一部分。為了本發明而選擇的信號序列應當是受到宿主細胞識別并加工 ( 即 被信號肽酶切除 ) 的信號序列。對于不識別并加工異源多肽的天然信號序列的原核宿主細 胞, 將信號序列用選自例如由下列各項組成的組的原核信號序列替代 : 堿性磷酸酶、 青霉素 酶、 Ipp、 或熱穩定的腸毒素 II(STII) 前導序列、 LamB、 PhoE、 PelB、 OmpA 和 MBP。在本發明的 一個實施方案中, 表達系統的兩個順反子中都使用的信號序列是 STII 信號序列或其變體。
     在另一方面, 依照本發明的免疫球蛋白的生成可在宿主細胞的細胞質中發生, 因此不需要在每個順反子內存在分泌信號序列。在那一點上, 免疫球蛋白輕鏈和重鏈在細 胞質內表達、 折疊和裝配而形成功能性免疫球蛋白。某些宿主菌株 ( 如大腸桿菌 trxB- 菌 株 ) 提供有利于二硫鍵形成的細胞質條件, 從而容許所表達蛋白質亞基的正確折疊和裝 配。Proba 和 Pluckthun Gene( 基因 ), 159 : 203(1995)。
     適于表達本發明抗體的原核宿主細胞包括古細菌 (Archaebacteria) 和真細菌 (Eubacteria), 諸如革蘭氏陰性或革蘭氏陽性生物體。有用細菌的實例包括埃希氏菌屬 (Escherichia)( 如大腸埃希氏菌 (E.coli))、 芽孢桿菌屬 (Bacilli)( 如枯草芽孢桿菌 (B.subtilis))、 腸桿菌屬 (Enterobacteria)、 假單胞菌屬物種 (Pseudomonas species) ( 如銅綠假單胞菌 (P.aeruginosa))、 鼠傷寒沙門氏菌 (Salmonella typhimurium)、 粘質 沙雷氏菌 (Serratia marcescans)、 克雷伯氏菌屬 (Klebsiella)、 變形菌屬 (Proteus)、 志賀氏菌屬 (Shigella)、 根瘤菌屬 (Rhizobia)、 透明顫菌屬 (Vitreoscilla) 或副球菌屬 (Paracoccus)。在一個實施方案中, 使用革蘭氏陰性細胞。在一個實施方案中, 使用大腸桿 菌細胞作為本發明的宿主。大腸桿菌菌株的實例包括菌株 W3110(Bachmann, Cellular and Molecular Biology( 細胞和分子生物學 ), vol.2(Washington, D.C. : American Society for Microbiology( 美國微生物學學會 ), 1987), 第 1190-1219 頁 ; ATCC 保藏號 27,325) 及其衍生物, 包括菌株 33D3, 其具有基因型 W3110 ΔfhuA(ΔtonA)ptr3 lac Iq lacL8 ΔompTΔ(nmpc-fepE)degP41 kanR( 美國專利號 5,639,635)。其它菌株及其衍生物, 諸 如大腸桿菌 294(ATCC 31,446)、 大腸桿菌 B、 大腸桿菌 λ1776(ATCC 31,537) 和大腸桿菌 RV308(ATCC 31,608) 也是合適的。 這些實例只是例示而非限制。 本領域已知用于構建具有 指定基因型的任何上述細菌衍生物的方法, 并且描述在例如 Bass 等, Proteins( 蛋白質 ), 8: 309-314(1990) 中。通常必需考慮復制子在細菌細胞中的可復制性來選擇適當的細菌。 例如, 在使用眾所周知的質粒諸如 pBR322、 pBR325、 pACYC177 或 pKN410 來提供復制子時, 大 腸桿菌、 沙雷氏菌屬 (Serratia)、 或沙門氏菌屬 (Salmonella) 物種可適當的用作宿主。通 常, 宿主細胞應當分泌最小量的蛋白水解酶, 而且可能希望在細胞培養中摻入額外的蛋白 酶抑制劑。
     ii 抗體產生
     用上述表達載體轉化宿主細胞, 并在為了誘導啟動子、 選擇轉化子或擴增編碼期 望序列的基因而適當改良的常規營養培養基中進行培養。
     轉化意即將 DNA 導入原核宿主, 使得 DNA 能夠進行復制, 或是作為染色體外元件或 是通過染色體整合進行。 根據所用的宿主細胞, 使用適于這些細胞的標準技術進行轉化。 采 用氯化鈣的鈣處理通常用于具有堅固細胞壁屏障的細菌細胞。 另一種轉化方法采用聚乙二 醇 /DMSO。使用的另一種技術是電穿孔。
     在本領域已知的且適于培養選定的宿主細胞的培養基中生長用于生成本發明 多肽的原核細胞。合適培養基的實例包括添加了必需營養補充物的 LB 培養基 (Luria broth)。 在有些實施方案中, 培養基還含有根據表達載體的構建而選擇的選擇劑, 以選擇性 容許包含所述表達載體的原核細胞生長。例如, 向用于培養表達氨芐青霉素抗性基因的細 胞的培養基中添加氨芐青霉素。
     除了碳、 氮和無機磷酸鹽來源以外, 還可含有適當濃度的任何必需補充物, 或是單 獨加入或是作為與另一種補充物或培養基的混合物, 諸如復合氮源。 任選的是, 培養基可含有一種或多種選自下組的還原劑 : 谷胱甘肽、 半胱氨酸、 胱胺 (cystamine)、 巰基乙酸鹽 / 酯 (thioglycollate)、 二硫赤蘚糖醇 (dithioerythritol) 和二硫蘇糖醇。
     在合適的溫度培養原核宿主細胞。例如, 對于培養大腸桿菌, 優選溫度范圍為約 20℃至約 39℃、 更優選約 25℃至約 37℃、 甚至更優選約 30℃。主要取決于宿主生物體, 培 養基的 pH 可以是范圍為約 5 至約 9 的任何 pH。對于大腸桿菌, pH 優選約 6.8 至約 7.4, 更 優選約 7.0。
     如果本發明的表達載體中使用誘導型啟動子, 那么在適于激活啟動子的條件下 誘導蛋白質表達。在本發明的一個方面, 使用 PhoA 啟動子來控制多肽的轉錄。因此, 為 了誘導, 在磷酸鹽限制培養基中培養經過轉化的宿主細胞。優選地, 磷酸鹽限制培養基是 C.R.A.P 培養基 ( 參見, 例如, Simmons 等, J.Immunol.Methods( 免疫學方法雜志 )(2002), 263 : 133-147)。根據所采用的載體構建體, 可采用多種其它誘導物, 正如本領域所知道的。
     在一個實施方案中, 所表達的本發明的多肽分泌到宿主細胞的周質中并從中回 收。蛋白質回收通常涉及破壞微生物, 通常通過諸如滲透壓休克、 超聲處理或裂解等手段。 一旦細胞遭到破壞, 可通過離心或過濾清除細胞碎片或整個細胞。可以通過例如親和樹脂 層析進一步純化蛋白質。或者, 蛋白質可能被轉運到培養液中并從中分離。可從培養液清 除細胞, 并且可以將培養物上清液過濾和濃縮, 用于進一步純化所生成的蛋白質。 可使用普 遍已知的方法諸如聚丙烯酰胺凝膠電泳 (PAGE) 和 Western 印跡測定來進一步分離和鑒定 所表達的多肽。
     在本發明的一個方面, 通過發酵過程大量進行抗體生產。多種大規模補料 - 分 批發酵流程可用于生產重組蛋白。大規模發酵具有至少 1000 升的容量, 優選約 1,000 至 100,000 升的容量。 這些發酵罐使用攪拌器葉輪來分配氧和養分, 尤其是葡萄糖 ( 優選的碳 源 / 能源 )。 小規模發酵通常指在體積容量不超過約 100 升的發酵罐中進行的發酵, 范圍可 以是約 1 升至約 100 升。
     在 發 酵 過 程 中, 通 常 在 將 細 胞 在 合 適 條 件 下 培 養 至 期 望 密 度 ( 如 OD550 約 180-220, 在此階段細胞處于早期穩定期 ) 后啟動蛋白質表達的誘導。根據所采用的載體構 建體, 可使用多種誘導物, 正如本領域知道的和上文描述的。 可在誘導前將細胞培養較短的 時間。通常將細胞誘導約 12-50 小時, 但是可使用更長或更短的誘導時間。
     為了提高本發明多肽的產量和質量, 可以修改多項發酵條件。例如, 為了改 善所分泌抗體多肽的正確裝配和折疊, 可使用過度表達伴侶蛋白諸如 Dsb 蛋白 (DsbA, DsbB, DsbC, DsbD 和 / 或 DsbG) 或 FkpA( 具有伴侶活性的一種肽基脯氨酸順反異構酶 ) 的另外的載體來共轉化宿主原核細胞。已經證明伴侶蛋白促進在細菌宿主細胞中生成 的異源蛋白質的正確折疊和溶解度。Chen 等 (1999)J.Bio.Chem.( 生物化學雜志 )274 : 19601-19605 ; Georgiou 等, 美國專利號 6,083,715 ; Georgiou 等, 美國專利號 6,027,888 ; Bothmann 和 Pluckthun(2000)J.Biol.Chem.( 生 物 化 學 雜 志 )275 : 17100-17105 ; Ramm 和 Pluckthun(2000)J.Biol.Chem.( 生物化學雜志 )275 : 17106-17113 ; Arie 等, (2001)Mol. Microbiol.( 分子微生物學 )39 : 199-210。
     為了將所表達異源蛋白質 ( 尤其是對蛋白水解敏感的異源蛋白質 ) 的蛋白水解降 至最低, 可將蛋白水解酶缺陷的某些宿主菌株用于本發明。例如, 可修飾宿主細胞菌株, 在 編碼已知細菌蛋白酶的基因中進行遺傳突變, 所述細菌蛋白酶諸如蛋白酶 III, OmpT, DegP,Tsp, 蛋白酶 I, 蛋白酶 Mi, 蛋白酶 V, 蛋白酶 VI, 及其組合。可以獲得一些大腸桿菌蛋白酶缺 陷型菌株, 例如, 在 Joly 等 (1998), 見上文 ; Georgiou 等, 美國專利號 5,264,365 ; Georgiou 等, 美國專利號 5,508,192 ; Hara 等, Microbial Drug Resistance( 微生物耐藥性 ), 2: 63-72(1996) 中所述。
     在一個實施方案中, 使用蛋白水解酶缺陷且用過表達一種或多種伴侶蛋白的質粒 轉化的大腸桿菌菌株作為在本發明的表達系統中的宿主細胞。
     iii. 抗體純化
     可采用本領域已知的標準蛋白質純化方法。下面的流程是合適純化流程的例示 : 免疫親和或離子交換柱上的分級、 乙醇沉淀、 反相 HPLC、 硅土或陽離子交換樹脂諸如 DEAE 上的層析、 層析聚焦、 SDS-PAGE、 硫酸銨沉淀、 和使用例如 Sephadex G-75 的凝膠過濾。
     在一個方面, 將固定在固相上的蛋白 A 用于本發明全長抗體產物的免疫親和純 化。蛋白 A 是來自金黃色葡萄球菌 (Staphylococcus aureas) 的 41kD 細胞壁蛋白質, 它 以高親合力結合抗體 Fc 區。Lindmark 等 (1983)J.Immunol.Meth.( 免疫學方法雜志 )62 : 1-13。蛋白 A 固定其上的固相優選是具有玻璃或硅石表面的柱子, 更優選是可控孔徑玻璃 柱或硅酸柱。在有些應用中, 柱子以諸如甘油等試劑包被, 試圖防止污染物的非特異粘附。
     作為純化的第一個步驟, 來源于如上所述的細胞培養物的制劑應用到固定有蛋白 A 的固相上從而允許目的抗體與蛋白 A 的特異性結合。然后清洗固相以清除與固相非特異 結合的污染物。最后通過洗脫從固相回收目的抗體。
     b. 使用真核宿主細胞產生抗體 :
     載體構件通常包括但不限于如下一種或多種 : 信號序列、 復制起點、 一種或多種標 志基因、 增強子元件、 啟動子、 轉錄終止序列。
     (i) 信號序列構件
     在真核宿主細胞中使用的載體還可以包含信號序列或在成熟的目的蛋白質或多 肽的 N 端處具有特異切割位點的其它多肽。優選選擇的異源信號序列是受到宿主細胞識別 并加工 ( 即被信號肽酶切除 ) 的異源信號序列。在哺乳動物細胞表達中, 可利用哺乳動物 信號序列以及病毒分泌前導序列, 例如單純皰疹病毒 gD 信號。
     將這些前體區的 DNA 連接到編碼抗體的 DNA 的閱讀框中。
     (ii) 復制起點
     通常, 哺乳動物表達載體不需要復制起始點構件。例如, 典型地可以使用 SV40 起 點, 這只是因為其包含早期啟動子。
     (iii) 選擇基因構件
     表達和克隆載體可包含選擇基因, 也稱為可選擇標志。典型的選擇基因編碼如下 蛋白質 : (a) 賦予對抗生素或其它毒素的抗性, 如氨芐青霉素、 新霉素、 甲氨蝶呤或四環素 ; (b) 在相關時, 補充營養缺陷性缺陷 ; 或 (c) 提供不能從復合培養基獲得的關鍵營養物。
     選擇方案的一個實例利用藥物來阻滯宿主細胞的生長。 經異源基因成功轉化的那 些細胞生成賦予藥物抗性的蛋白質, 因而幸免于選擇方案。此類顯性選擇的實例使用藥物 新霉素、 霉酚酸 (mycophenolic acid) 和潮霉素。
     適于哺乳動物細胞的選擇標志的另一個實例是能夠鑒定有能力攝取抗體核酸的 細胞的選擇標志, 諸如 DHFR、 胸苷激酶、 金屬硫蛋白 I 和 II, 優選靈長類金屬硫蛋白基因、 腺苷脫氨酶、 鳥氨酸脫羧酶等。
     例如, 首先通過將所有轉化子在含有甲氨蝶呤 (Mtx, DHFR 的一種競爭性拮抗劑 ) 的培養基中進行培養來鑒定經 DHFR 選擇基因轉化的細胞。在采用野生型 DHFR 時, 適宜的 宿主細胞是 DHFR 活性缺陷的中國倉鼠卵巢 (CHO) 細胞系 ( 例如 ATCC CRL-9096)。
     或者, 可通過在含有針對選擇標志的選擇劑諸如氨基糖苷抗生素 ( 如卡那霉素、 新霉素或 G418) 的培養基中培養細胞來選擇用編碼抗體、 野生型 DHFR 蛋白、 和另一種選擇 標志 ( 諸如氨基糖苷 3′ - 磷酸轉移酶 (APH)) 的 DNA 序列轉化或共轉化的宿主細胞 ( 特別 是包含內源 DHFR 的野生型宿主 )。參見美國專利號 4,965,199。
     (iv) 啟動子構件
     表達和克隆載體通常包含受到宿主生物體識別的啟動子, 且與抗體多肽核酸可操 作連接。 用于真核細胞的啟動子序列是已知的。 事實上, 所有真核基因都具有富含 AT 區, 它 位于起始轉錄的位點上游約 25 至 30 個堿基處。在許多基因的轉錄起點上游 70 至 80 個堿 基處發現的另一種序列是 CNCAAT 區, 其中 N 可以是任何核苷酸。在大多數真核基因的 3′ 端是 AATAAA 序列, 它可能是向編碼序列的 3′端添加聚腺苷酸 (polyA) 尾的信號。所有這 些序列合適地插入至真核表達載體中。
     在哺乳動物宿主細胞中由載體轉錄抗體多肽受到例如從病毒 ( 諸如多瘤病毒、 禽 痘病毒、 腺病毒 ( 諸如 2 型腺病毒 )、 牛乳頭瘤病毒、 禽類肉瘤病毒、 巨細胞病毒、 逆轉錄病 毒、 乙肝病毒、 和猿猴病毒 40(SV40)) 基因組獲得的啟動子、 來自異源哺乳動物啟動子 ( 如 肌動蛋白啟動子或免疫球蛋白啟動子 )、 來自熱休克啟動子的啟動子的控制, 條件是這些啟 動子與宿主細胞系統相容。
     方便的以 SV40 限制性片段的形式獲得 SV40 病毒的早期和晚期啟動子, 該片段還 包含 SV40 病毒復制起點。方便的以 HindIII E 限制性片段的形式獲得人巨細胞病毒的即 時早期啟動子。美國專利號 4,419,446 中公開了使用牛乳頭瘤病毒作為載體在哺乳動物宿 主中表達 DNA 的系統。美國專利號 4,601,978 中記載了該系統的修改。備選地, 可使用勞 氏肉瘤病毒長末端重復作為啟動子。
     (v) 增強子元件構件
     常常通過在載體中插入增強子序列來提高高等真核生物對編碼本發明抗體多肽 的 DNA 的轉錄。現在已知來自哺乳動物基因 ( 球蛋白、 彈性蛋白酶、 白蛋白、 α- 胎蛋白和 胰島素 ) 的許多增強子序列。然而, 通常使用來自真核細胞病毒的增強子。實例包括 SV40 復制起點晚期側的增強子 (bp100-270)、 巨細胞病毒早期啟動子增強子、 多瘤病毒復制起 點晚期側的增強子、 和腺病毒增強子。關于激活真核啟動子的增強元件還可參見 Yaniv, Nature( 自然 )297 : 17-18(1982)。增強子可剪接到載體中, 位于抗體多肽編碼序列的 5′ 或 3′位置, 但是優選位于啟動子的 5′位點。
     (vi) 轉錄終止構件
     典型地, 在真核宿主細胞中使用的表達載體還包含終止轉錄和穩定 mRNA 所必需 的序列。此類序列通常可從真核或病毒 DNA 或 cDNA 的非翻譯區的 5′端和偶爾的 3′端獲 得。這些區域包含在編碼抗體的 mRNA 的非翻譯區中轉錄成聚腺苷酸化片段的核苷酸區段。 一種有用的轉錄終止構件是牛生長激素聚腺苷酸化區。參見 WO94/11026 及其中公開的表 達載體。(vii) 宿主細胞的選擇和轉化
     適于克隆或表達本文載體中的 DNA 的宿主細胞包括本文描述的高等真核細 胞, 包括脊椎動物宿主細胞。脊椎動物細胞在培養 ( 組織培養 ) 中的繁殖已經成為常 規流程。有用的哺乳動物宿主細胞系的實例有經 SV40 轉化的猴腎 CV1 系 (COS-7, ATCC CRL 1651) ; 人 胚 腎 系 (293 細 胞 或 為 懸 浮 培 養 生 長 而 亞 克 隆 的 293 細 胞, Graham 等, J.Gen.Virol.( 遺傳病毒學雜志 )36 : 59(1977)) ; 幼倉鼠腎細胞 (BHK, ATCC CCL 10) ; 中 國 倉 鼠 卵 巢 細 胞 /-DHFR(CHO, Urlaub 等, Proc.Natl.Acad.Sci.USA( 美 國 國 家 科 學 院 學 報 )77 : 4216(1980)) ; 小 鼠 塞 托 利 (sertoli) 細 胞 (TM4, Mather, Biol.Reprod.23 : 243-251(1980)) ; 猴腎細胞 (CV1, ATCC CCL 70) ; 非洲綠猴腎細胞 (VERO-76, ATCC CRL 1587) ; 人宮頸癌細胞 (HELA, ATCC CCL 2) ; 犬腎細胞 (MDCK, ATCC CCL 34) ; 布法羅鼠 (buffalo rat) 肝細胞 (BRL 3A, ATCC CRL 1442) ; 人肺細胞 (W138, ATCC CCL 75) ; 人肝細 胞 (Hep G2, HB 8065) ; 小鼠乳瘤 (MMT 060562, ATCC CCL 51) ; TRI 細胞 (Mather 等, Annals N.Y.Acad.Sci.383 : 44-68(1982)) ; MRC 5 細 胞 ; FS4 細 胞 ; 和 人 肝 細 胞 瘤 (hepatoma) 系 (Hep G2)。
     為了生成抗體, 用上文所述表達載體或克隆載體轉化宿主細胞, 并在為了誘導啟 動子、 選擇轉化子或擴增編碼期望序列的基因而適當改良的常規營養培養基中進行培養。
     (viii) 宿主細胞的培養
     可在多種培養基中培養用于生成本發明抗體的宿主細胞。商品化培養基諸如 Ham’ s F10(Sigma)、 極限必需培養基 ((MEM), Sigma)、 RPMI-1640(Sigma)、 和 Dulbecco 改 良 Eagle 培養基 ((DMEM), Sigma) 適于培養宿主細胞。另外, 可使用下列文獻中記載的任 何培養基作為宿主細胞的培養基 : Ham 等, Meth.Enz.( 酶學方法 )58 : 44(1979), Barnes 等, Anal.Biochem.( 分析生物化學 )102 : 255(1980), 美國專利號 4,767,704 ; 4,657,866 ; 4,927,762 ; 4,560,655 ; 或 5,122,469 ; WO 90/03430 ; WO 87/00195 ; 或美國再頒專利 30,985。任何這些培養基可根據需要補充激素和 / 或其它生長因子 ( 諸如胰島素、 運鐵蛋 白或表皮生長因子 )、 鹽 ( 諸如氯化鈉、 鈣、 鎂和磷酸鹽 )、 緩沖劑 ( 諸如 HEPES)、 核苷酸 ( 諸 TM 如腺苷和胸苷 )、 抗生素 ( 諸如 GENTAMYCIN 藥物 )、 痕量元素 ( 定義為通常以微摩爾范圍 的終濃度存在的無機化合物 )、 和葡萄糖或等效能源。 還可以適宜濃度含有本領域技術人員 已知的任何其它必需補充物。培養條件諸如溫度、 pH 等即為表達而選擇的宿主細胞先前所 用的培養條件, 這對于普通技術人員是顯而易見的。
     (ix) 抗體的純化
     在使用重組技術時, 抗體可在細胞內生成, 或者直接分泌到培養基中。如果在細 胞內生成抗體, 那么首先需要通過例如離心或超濾清除微粒碎片, 即宿主細胞或裂解片 段。如果抗體分泌到培養基中, 那么通常首先使用商品化蛋白質濃縮濾器 ( 例如 Amicon 或 Millipore Pellicon 超濾部件 ) 濃縮來自這些表達系統的上清液。 可在任何上述步驟中包 括蛋白酶抑制劑諸如 PMSF 以抑制蛋白水解, 而且可包括抗生素以防止外來污染物的生長。
     可使用例如羥磷灰石層析、 凝膠電泳、 透析和親和層析來純化從細胞制備的抗體 組合物, 親和層析是優選的純化技術。蛋白 A 作為親和配體的適宜性取決于抗體中存在的 任何免疫球蛋白 Fc 結構域的種類和同種型。蛋白 A 可用于純化基于人 γ1、 γ2 或 γ4 重 鏈的抗體 (Lindmark 等, J.Immunol.Meth.( 免疫學方法雜志 )62 : 1-13(1983))。蛋白 G 推薦用于所有小鼠同種型和人 γ3(Guss 等, EMBO J.5 : 15671575(1986))。親和配體所附著 的基質最常用的是瓊脂糖, 但是可使用其它基質。物理穩定的基質諸如可控孔徑玻璃或聚 ( 苯乙烯二乙烯基 ) 苯能獲得比瓊脂糖更快的流速和更短的處理時間。若抗體包含 CH3 結 構域, 則可使用 Bakerbond ABXTM 樹脂 (J.T.Baker, Phillipsburg, NJ) 進行純化。根據待回 收的抗體, 也可使用其它蛋白質純化技術諸如離子交換柱上的分級、 乙醇沉淀、 反相 HPLC、 TM 硅土上的層析、 肝素 SEPHAROSE 上的層析、 陰離子或陽離子交換樹脂 ( 諸如聚天冬氨酸柱 ) 上的層析、 層析聚焦、 SDS-PAGE 和硫酸銨沉淀。
     在任何初步純化步驟之后, 可將含有目的抗體和污染物的混合物進行低 pH 疏水 相互作用層析, 使用 pH 約 2.5-4.5 的洗脫緩沖液, 優選在低鹽濃度 ( 例如約 0-0.25M 鹽 ) 進行。
     免疫綴合物
     本發明還提供免疫綴合物 ( 可互換地稱為 “抗體 - 藥物綴合物” 或 “ADC” ), 其包含 與細胞毒性劑綴合的本文所述的任一種抗 FGFR3 抗體, 所述細胞毒性劑諸如化療劑、 藥物、 生長抑制劑、 毒素 ( 例如細菌、 真菌、 植物或動物來源的酶活性毒素或其片段 ) 或放射性同 位素 ( 即放射綴合物 )。
     在癌癥治療中, 用于局部遞送細胞毒性劑或細胞生長抑制劑 ( 即殺死或抑制腫 瘤 細 胞 的 藥 物 ) 的 抗 體 - 藥 物 綴 合 物 的 使 用 (Syrigos 和 Epenetos(1999)Anticancer Researchy( 抗 癌 研 究 )19 : 605-614 ; Niculescu-Duvaz andSpringer(1997)Adv.Drg. Del.Rev.26 : 151-172 ; 美 國 專 利 號 4,975,278) 允 許 將 藥 物 部 分 靶 向 遞 送 至 腫 瘤, 并 在其中細胞內積累, 而這些未經綴合的藥劑的全身施用可導致對正常細胞以及試圖消 除 的 腫 瘤 細 胞 的 不 可 接 受 的 毒 性 水 平 (Baldwin 等, (1986)Lancet( 柳 葉 刀 )pp.(1986 年 3 月 15 日 ) : 603-05 ; Thorpe, (1985)“Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents InCancer Therapy : AReview( 腫瘤治療中細胞毒性劑的抗體載體 : 綜述 ), ” 在 Monoclonal Antibodies ′ 84 : Biological And Clinical Applications( 單克隆抗體′ 84 : 生物學 和臨床應用 ), A.Pinchera 等編輯, 第 475-506 頁中 )。由此尋求最大功效且具有最小 毒性。多克隆抗體和單克隆抗體皆有報道可用于這些策略 (Rowland 等, (1986)Cancer Immunol.Immunother.( 癌癥免疫學和免疫療法 ), 21 : 183-87)。這些方法中所使用的藥 物包括道諾霉素 (daunomycin)、 多柔比星 (doxorubicin)、 甲氨蝶呤 (methotrexate) 和 長 春 地 辛 (vindesine)(Rowland 等, 1986, 見 上 文 )。 抗 體 - 毒 素 綴 合 物 中 所 使 用 的 毒 素包括細菌毒素諸如白喉毒素、 植物毒素諸如蓖麻毒蛋白、 小分子毒素諸如格爾德霉素 (geldanamycin)(Mandler 等 (2000)Jour.of the Nat.CancerInst.( 國家癌癥研究所雜 志 )92(19) : 1573-1581 ; Mandler 等, (2000)Bioorganic&Med.Chem.Letters( 生 物 有 機 和醫學化學通訊 )10 : 1025-1028 ; Mandler 等, (2002)Bioconjugate Chem.( 生物綴合化 學 )13 : 786-791), 美登木素生物堿類 (maytansinoids)(EP 1391213 ; Liu 等, (1996)Proc. Natl.Acad.Sci.USA( 美國科學院學報 )93 : 8618-8623), 和加利車霉素 (calicheamicin) (Lode 等, (1998)Cancer Res.( 癌癥研究 )58 : 2928 ; Hinman 等, (1993)Cancer Res.( 癌癥 研究 )53 : 3336-3342)。毒素可通過包括微管蛋白結合、 DNA 結合或拓撲異構酶抑制的機制 影響其細胞毒性和細胞生長抑制作用。 有些細胞毒性藥物在與大的抗體或蛋白質受體配體 綴合時趨于失活或活性降低。( 替 伊 莫 單 抗 (ibritumomab tiuxetan), Biogen/Idec) 是 由 針 對在正常和惡性 B 淋巴細胞表面上發現的 CD20 抗原的鼠 IgG1κ 單克隆抗體與通過硫 脲接頭 - 螯合劑所結合的 111In 或 90Y 放射性同位素構成的抗體 - 放射性同位素綴合物 (Wiseman 等, (2000)Eur.Jour.Nucl.Med.27(7) : 766-77 ; Wiseman 等, (2002)Blood( 血 液 )99(12) : 4336-42 ; Witzig 等, (2002)J.Clin.Oncol.( 臨 床 腫 瘤 學 雜 志 )20(10) : 2453-63 ; Witzig 等, (2002)J.Clin.Oncol.( 臨 床 腫 瘤 學 雜 志 )20(15) : 3262-69)。 盡 管 ZEVALIN 具有針對 B 細胞非霍奇金淋巴瘤 (NHL) 的活性, 然而施藥在大多數患者中導致嚴 TM 重且長時間的血細胞減少。MYLOTARG ( 吉妥珠單抗奧佐米星 (gemtuzumab ozogamicin), Wyeth Pharmaceuticals), 即由 hu CD33 抗體與加利車霉素連接而構成的抗體 - 藥物綴 合物, 在 2000 年批準用于經注射治療急性骨髓性白血病 (Drugs of the Future( 未來 藥 物 )(2000)25(7) : 686 ; 美 國 專 利 號 4,970,198 ; 5,079,233 ; 5,585,089 ; 5,606,040 ; 5,6937,62 ; 5,739,116 ; 5,767,285 ; 5,773,001)。美坎珠單抗 (Cantuzumab mertansine) (Immunogen, Inc.), 即由 huC242 抗體經二硫化物接頭 SPP 與美登木素生物堿類藥物結構 部分 DM1 連接而構成的抗體藥物綴合物, 正在進行用于治療表達 CanAg 的癌癥諸如結腸 癌、 胰腺癌、 胃癌和其它癌的 II 期試驗。MLN-2704(Millennium Pharm., BZL Biologics, Immunogen Inc.), 即由抗前列腺特異性膜抗原 (PSMA) 單克隆抗體與美登木素生物堿類藥 物結構部分 DM1 連接而構成的抗體藥物綴合物, 正在進行用于前列腺腫瘤潛在治療的開 發。將多拉司他汀 (dolastatin) 的合成類似物 auristatin 肽, 即 auristatin E(AE) 和單 甲基 auristatin(MMAE) 與嵌合單克隆抗體 cBR96( 對癌上的 Lewis Y 特異 ) 和 cAC10( 對 惡性血液腫瘤上的 CD30 特異 ) 綴合 (Doronina 等, (2003)Nature Biotechnology.( 自然 生物技術 )21(7) : 778-784), 且正在進行治療性開發。
     本文 ( 例如上文 ) 描述了可用于生成此類免疫綴合物的化療劑。可使用的酶活 性毒素及其片段包括白喉毒素 A 鏈、 白喉毒素的非結合活性片段、 外毒素 A 鏈 ( 來自銅綠 假單胞菌 (Pseudomonas aeruginosa))、 蓖麻毒蛋白 (ricin)A 鏈、 相思豆毒蛋白 (abrin)A 鏈、 蒴蓮根毒蛋白 (modeccin)A 鏈、 α- 帚曲霉素 (α-sarcin)、 油桐 (Aleutites fordii) 蛋白、 香石竹毒蛋白 (dianthinprotein)、 美洲商陸 (Phytolaca americana) 蛋白 (PAPI、 PAPII 和 PAP-S)、 苦瓜 (Momordica charantia) 抑制劑、 麻瘋樹毒蛋白 (curcin)、 巴豆毒蛋 白 (crotin)、 肥皂草 (sapaonaria officinalis) 抑制劑、 白樹毒蛋白 (gelonin)、 絲林霉素 (mitogellin)、 局限曲菌素 (restrictocin)、 酚霉素 (phenomycin)、 依諾霉素 (enomycin) 和單端孢菌素 (trichothecenes)。參見例如 1993 年 10 月 28 日公開的 WO 93/21232。多種 131 131 90 放射性核素可用于生成放射綴合抗體。實例包括 212Bi、 I、 In、 Y、 和 186Re。抗體和細胞 毒性劑的綴合物可使用多種雙官能蛋白質偶聯劑來制備, 諸如 N- 琥珀酰亞胺基 -3-(2- 吡 啶基二硫代 ) 丙酸酯 (SPDP)、 亞氨基硫烷 (iminothiolane)(IT)、 亞氨酸酯的雙官能衍生 物 ( 諸如二甲基己二亞酰胺鹽酸化物 (dimethyl adipimidate HCl))、 活性酯類 ( 諸如辛 二酸二琥珀酰亞胺基酯 )、 醛類 ( 諸如戊二醛 )、 雙疊氮化合物 ( 諸如雙 ( 對 - 疊氮苯甲酰 基 ) 己二胺 )、 雙重氮衍生物 ( 諸如雙 ( 對 - 重氮苯甲酰基 ) 己二胺 )、 二異氰酸酯 ( 諸如 甲苯 2, 6- 二異氰酸酯 )、 和雙活性氟化合物 ( 諸如 1, 5- 二氟 -2, 4- 二硝基苯 )。例如, 可 如 Vitetta 等, Science( 科學 )238 : 1098(1987) 中所述制備蓖麻毒蛋白免疫毒素。碳 -14 標記的 1- 異硫氰酸苯甲基 -3- 甲基二亞乙基三胺五乙酸 (MX-DTPA) 是用于將放射性核苷酸與抗體綴合的例示性螯合劑。參見 WO 94/11026。
     本文還設想了抗體與一種或多種小分子毒素諸如加利車霉素 (calicheamicin)、 美登木素生物堿類 (maytansinoids)、 多拉司他汀 (dolastatins)、 aurostatins、 單端孢霉 素 (trichothecene) 和 CC1065 及這些毒素具有毒素活性的片段的綴合物。
     i. 美登素 (Maytansine) 和美登木素生物堿類
     在一些實施方案中, 免疫綴合物包含與一個或多個美登木素生物堿類分子綴合的 本發明的抗體 ( 全長或片段 )。
     美登木素生物堿類是通過抑制微管蛋白多聚化來發揮作用的有絲分裂抑制 劑。美登素最初從東非灌木齒葉美登木 (Maytenus serrata) 分離得到 ( 美國專利號 3,896,111)。隨后發現某些微生物也生成美登木素生物堿類, 諸如美登醇和 C-3 美登醇酯 ( 美國專利號 4,151,042)。例如下列美國專利公開了合成的美登醇及其衍生物和類似物 : Nos.4,137,230 ; 4,248,870 ; 4,256,746 ; 4,260,608 ; 4,265,814 ; 4,294,757 ; 4,307,016 ; 4,308,268 ; 4,308,269 ; 4,309,428 ; 4,313,946 ; 4,315,929 ; 4,317,821 ; 4,322,348 ; 4,331,598 ; 4,361,650 ; 4,364,866 ; 4,424,219 ; 4,450,254 ; 4,362,663 ; 和 4,371,533。
     在抗體藥物綴合物中, 美登木素生物堿類藥物結構部分是有吸引力的藥物結構部 分, 因為它們 : (i) 相對易于通過發酵或化學修飾、 從發酵產物衍生而制備, (ii) 易于用適 于通過非二硫化物接頭綴合至抗體的官能團衍生化, (iii) 在血漿中穩定, 和 (iv) 針對多 種腫瘤細胞系有效。
     已經公開了含有美登木素生物堿類的免疫綴合物、 其制備方法及其治療用途, 例 如, 公開在美國專利 Nos.5,208,020, 5,416,064 及歐洲專利 EP0425235B1 中, 明確將其公 開內容通過引用并入本文。Liu 等, Proc.Natl.Acad.Sci.USA( 美國國家科學院學報 )93 : 8618-8623(1996) 記載了包含與針對人結腸直腸癌的單克隆抗體 C242 連接的稱為 DM1 的 美登木素生物堿類的免疫綴合物。發現該綴合物具有針對培養的結腸癌細胞的高度細胞 毒性, 而且在體內腫瘤生長測定法中顯示抗腫瘤活性。Chari 等, CancerResearch( 癌癥研 究 )52 : 127-131(1992) 記載了其中美登木素生物堿類經二硫化物接頭與結合人結腸癌細 胞系上抗原的鼠抗體 A7 或結合 HER-2/neu 癌基因的另一種鼠單克隆抗體 TA.1 綴合的免疫 綴合物。在體外在人乳癌細胞系 SK-BR-3 上測試了 TA.1- 美登木素生物堿類綴合物的細胞 毒性, 該細胞系每個細胞表達 3x105 個 HER-2 表面抗原。 藥物綴合物達到了與游離美登木素 生物堿類藥物相似的一定程度的細胞毒性, 這可通過增加每個抗體分子綴合的美登木素生 物堿類分子數目來提高。A7- 美登木素生物堿類綴合物在小鼠中顯示低系統性細胞毒性。
     抗體 - 美登木素生物堿類綴合物可通過將抗體與美登木素生物堿類分子化學連 接且不顯著削弱抗體或美登木素生物堿類分子的生物學活性來制備。參見例如, 美國專 利 No.5,208,020( 其公開內容通過引用明確并入本文 )。每個抗體分子綴合平均 3-4 個美 登木素生物堿類分子已在增強針對靶細胞的細胞毒性中顯示功效, 且對抗體的功能或溶解 度沒有負面影響, 盡管預計甚至一個分子的毒素 / 抗體也將較之使用裸抗體而增強細胞毒 性。美登木素生物堿類在本領域是眾所周知的, 而且可通過已知技術合成或從天然來源分 離。例如美國專利 5,208,020 和上文提及的其它專利及非專利發表物中公開了合適的美登 木素生物堿類。 優選的美登木素生物堿類是美登醇和在美登醇分子的芳香環或其它位置經 過修飾的美登醇類似物, 諸如各種美登醇酯。本領域已知許多連接基團可用于制備抗體 - 美登木素生物堿類綴合物, 包括例如 美國專利 No.5,208,020 或歐洲專利 0425235B1, Chari 等, Cancer Research( 癌癥研究 )52 : 127-131(1992), 和 2004 年 10 月 8 日提交的美國專利申請 No.10/960,602 中所公開的, 其公 開內容通過引用明確并入本文。 可如 2004 年 10 月 8 日提交的美國專利申請 No.10/960,602 所公開的制備包含接頭成分 SMCC 的抗體 - 美登木素生物堿類綴合物。連接基團包括二硫 化物基團、 硫醚基團、 酸不穩定基團、 光不穩定基團、 肽酶不穩定基團、 或酯酶不穩定基團, 正如上文所述專利中所公開的, 二硫化物和硫醚基團是優選的。另外的連接基團在本文進 行了描述和例示。
     可使用多種雙官能蛋白質偶聯劑來制備抗體和美登木素生物堿類的綴合物, 諸如 N- 琥珀酰亞胺基 -3-(2- 吡啶基二硫代 ) 丙酸酯 (SPDP)、 琥珀酰亞胺基 -4-(N- 馬來酰亞氨 基甲基 ) 環己烷 -1- 羧酸酯 (SMCC)、 亞氨基硫烷 (IT)、 亞氨酸酯的雙官能衍生物 ( 諸如二 甲基己二亞酰胺鹽酸化物 )、 活性酯類 ( 諸如辛二酸二琥珀酰亞胺基酯 )、 醛類 ( 諸如戊二 醛 )、 雙疊氮化合物 ( 諸如雙 ( 對 - 疊氮苯甲酰基 ) 己二胺 )、 雙重氮衍生物 ( 諸如雙 ( 對 - 重 氮苯甲酰基 )- 乙二胺 )、 二異氰酸酯 ( 諸如甲苯 2, 6- 二異氰酸酯 )、 和雙活性氟化合物 ( 諸 如 1, 5- 二氟 -2, 4- 二硝基苯 )。特別優選的偶聯劑包括 N- 琥珀酰亞胺基 -3-(2- 吡啶基二 硫代 ) 丙酸酯 (SPDP)(Carlsson 等, Biochem.J.( 生物化學雜志 )173 : 723-737(1978)) 和 N- 琥珀酰亞氨基 -4-(2- 吡啶基硫代 ) 戊酸酯 (SPP), 從而提供二硫鍵連接。
     根據連接的類型, 可將接頭連接于美登木素生物堿類分子的多個位置。 例如, 可使 用常規偶聯技術通過與羥基的反應來形成酯鍵。反應可發生在具有羥基的 C-3 位置、 經羥 甲基修飾的 C-14 位置、 經羥基修飾的 C-15 位置、 和具有羥基的 C-20 位置。在一個優選實 施方案中, 在美登醇或美登醇類似物的 C-3 位置形成連接鍵。
     ii.Auristatin 和多拉司他汀
     在一些實施方案中, 免疫綴合物包含與多拉司他汀 (dolastatin) 或多拉司他 汀肽類似物和衍生物, auristatins 綴合的本發明的抗體 ( 美國專利 Nos.5,635,483 和 5,780,588)。多拉司他汀類和 auristatins 已經顯示出干擾微管動力學、 GTP 水解、 及 核 和 細 胞 分 裂 (Woyke 等 (2001)Antimicrob.Agentsand Chemother.( 抗 微 生 物 劑 和 化 療 )45(12) : 3580-3584) 且具有抗癌 (U.S. 專利號 5,663,149) 和抗真菌活性 (Pettit 等, (1998)Antimicrob.AgentsChemother.( 抗微生物劑和化療 )42 : 2961-2965)。多拉司他汀 或 auristatin 藥物結構部分可經由肽藥物結構部分的 N( 氨基 ) 末端或 C( 羧基 ) 末端連 接于抗體 (WO 02/088172)。
     例示性的 auristatin 實施方案包括 N- 末端連接的單甲基 auristatin 藥物結構 部 分 DE 和 DF, 披 露 于 2004 年 11 月 5 日 提 交 的 “MonomethylvalineCompounds Capable of Conjugation to Ligands( 能 綴 合 至 配 體 的 單 甲 基 纈 氨 酸 化 合 物 )” , 美國序列號 10/983,340, 通過引用明確將其公開內容完整合并入本文。
     典型的是, 基于肽的藥物結構部分可通過在兩個或多個氨基酸和 / 或肽片段之 間形成肽鍵來制備。此類肽鍵可依照例如肽化學領域眾所周知的液相合成法來制備 ( 參 見 E. 和 K.Lübke, “The Peptides( 肽 ), ” 第 1 卷, 第 76-136 頁, 1965, Academic Press)。Auristatin/ 多拉司他汀藥物結構部分可依照以下文獻中的方法來制備 : U.S. 專 利 號 5,635,483 和 5,780,588 ; Pettit 等, (1989)J.Am.Chem.Soc.( 美 國 化 學 學 會 雜志 )111 : 5463-5465 ; Pettit 等, (1998)Anti-Cancer Drug Design( 抗 癌 藥 物 設 計 )13 : 243-277 ; Pettit, G.R.,等, Synthesis( 合 成 ), 1996, 719-725 ;和 Pettit 等, (1996) J.Chem.Soc.Perkin Trans.15 : 859-863。 也 見 Doronina(2003)Nat.Biotechnol.( 自 然 : 生物技術 )21(7) : 778-784 ; “MonomethylvalineCompounds Capable of Conjugation to Ligands( 能綴合至配體的單甲基纈氨酸化合物 )” , 2004 年 11 月 5 日提交的美國序列號 No.10/983,340, , 將其通過引用完整收入本文 ( 披露了例如制備綴合至接頭的單甲基纈氨 酸化合物 ( 諸如 MMAE 和 MMAF) 的接頭和方法 )。
     iii. 加利車霉素
     在其它實施方案中, 免疫綴合物包含與一個或多個加利車霉素分子綴合的本發 明的抗體。加利車霉素抗生素家族能夠在亞皮摩爾濃度產生雙鏈 DNA 斷裂。關于加利車 霉素家族綴合物的制備參見美國專利號 5,712,374, 5,714,586, 5,739,116, 5,767,285, 5,770,701, 5,770,710, 5,773,001, 和 5,877,296( 都屬于 American Cyanamid Company)。 可用的加利車霉素結構類似物包括但不限于 γ1I, α2I, α3I, N- 乙酰基 -γ1I, PSAG 和 I θ 1(Hinman 等, Cancer Research( 癌 癥 研 究 )53 : 3336-3342(1993), Lode 等, Cancer Research( 癌 癥 研 究 )58 : 2925-2928(1998) ; 及 上 述 屬 于 American Cyanamid 的 美 國 專 利 )。可與抗體綴合的另一種抗腫瘤藥物是 QFA, 它是一種抗葉酸藥物。加利車霉素和 QFA 都具有胞內作用位點, 且不易穿過質膜。 因此, 這些試劑經由抗體介導的內在化的細胞攝取 大大增強了它們的細胞毒性效果。
     iv. 其它細胞毒性劑
     可與本發明的抗體綴合的其它抗腫瘤劑包括 BCNU、 鏈佐星 (streptozoicin)、 長 春新堿 (vincristine) 和 5- 氟尿嘧啶、 美國專利號 5,053,394 和 5,770,710 記載的統稱為 LL-E33288 復合體的試劑家族、 及埃斯波霉素類 (esperamicins)( 美國專利號 5,877,296)。
     可用的酶活性毒素及其片段包括白喉毒素 A 鏈、 白喉毒素的非結合活性片段、 外 毒素 A 鏈 ( 來自銅綠假單胞菌 )、 蓖麻毒蛋白 (ricin)A 鏈、 相思豆毒蛋白 (abrin)A 鏈、 蒴蓮根毒蛋白 (modeccin)A 鏈、 α- 帚曲霉素 (α-sarcin)、 油桐 (Aleutites fordii) 蛋 白、 香石竹毒蛋白 (dianthin protein)、 美洲商陸 (Phytolaca americana) 蛋白 (PAPI、 PAPII 和 PAP-S)、 苦瓜 (Momordicacharantia) 抑制劑、 麻瘋樹毒蛋白 (curcin)、 巴豆毒蛋 白 (crotin)、 肥皂草 (sapaonaria officinalis) 抑制劑、 白樹毒蛋白 (gelonin)、 絲林霉素 (mitogellin)、 局限曲菌素 (restrictocin)、 酚霉素 (phenomycin)、 依諾霉素 (enomycin) 和單端孢菌素 (trichothecenes)。參見例如 1993 年 10 月 28 日公開的 WO93/21232。
     本發明還考慮了以下免疫綴合物, 其在抗體和具有核酸降解活性的化合物 ( 如核 糖核酸酶或 DNA 內切核酸酶, 諸如脫氧核糖核酸酶 ; DNA 酶 ) 之間形成。
     為了選擇性破壞腫瘤, 抗體可包含高度放射性原子。多種放射性同位素可用于生 成放射綴合的抗體。實例包括 At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212 和 Lu 的 放射性同位素。 在將綴合物用于檢測時, 可包含用于閃爍照相研究的放射性原子, 例如 tc99m 或 I123, 或是包含用于核磁共振 (NMR) 成像 ( 也稱為磁共振成像, mri) 的自旋標記物, 諸如 同樣是碘 -123、 碘 -131、 銦 -111、 氟 -19、 碳 -13、 氮 -15、 氧 -17、 釓、 錳或鐵。
     可以已知方式將放射性或其它標記物摻入綴合物。例如, 可生物合成肽, 或是通 過化學氨基酸合成法合成肽, 其中使用包括例如氟 -19 代替氫的合適的氨基酸前體。可經肽中的半胱氨酸殘基來連接標記物, 諸如 tc99m 或 I123, Re186, Re188 和 In111。可以經賴氨 酸殘基來連接釔 -90。IODOGEN 法 (Fraker 等 (1978)Biochem.Biophys.Res.Commun.( 生 物化學和生物物理學研究通訊 )80 : 49-57) 可用于摻入碘 -123。 “MonoclonalAntibodies inImmunoscintigraphy( 免疫閃爍成像中的單克隆抗體 )” (Chatal, CRC Press1989) 詳細 記載了其它方法。
     抗體和細胞毒性劑的綴合物可使用多種雙官能蛋白質偶聯劑來制備, 諸如 N- 琥 珀酰亞胺基 -3-(2- 吡啶基二硫代 ) 丙酸酯 (SPDP)、 琥珀酰亞胺基 -4-(N- 馬來酰亞氨甲基 ) 環己烷 -1- 羧酸酯 (SMCC)、 亞氨基硫烷 (IT)、 亞氨酸酯的雙官能衍生物 ( 諸如二甲基己二 亞酰胺鹽酸化物 )、 活性酯類 ( 諸如辛二酸二琥珀酰亞胺基酯 )、 醛類 ( 諸如戊二醛 )、 雙疊 氮化合物 ( 諸如雙 ( 對 - 疊氮苯甲酰基 ) 己二胺 )、 雙重氮衍生物 ( 諸如雙 ( 對 - 重氮苯甲 酰基 ) 己二胺 )、 二異氰酸酯 ( 諸如甲苯 2, 6- 二異氰酸酯 )、 和雙活性氟化合物 ( 諸如 1, 5- 二氟 -2, 4- 二硝基苯 )。例如, 可如 Vitetta 等, Science( 科學 )238 : 1098(1987) 中所述 制備蓖麻毒蛋白免疫毒素。 碳 -14 標記的 1- 異硫氰酸苯甲基 -3- 甲基二亞乙基三胺五乙酸 (MX-DTPA) 是用于將放射性核苷酸與抗體綴合的例示性螯合劑。 參見 WO 94/11026。 接頭可 以是便于在細胞中釋放細胞毒性藥物的 “可切割接頭” 。 例如, 可使用酸不穩定接頭、 肽酶敏 感接頭、 光不穩定接頭、 二甲基接頭、 或含二硫化物的接頭 (Chari 等, Cancer Research( 癌 癥研究 )52 : 127-131(1992) ; 美國專利 No.5,208,020)。
     本發明的化合物明確涵蓋但不限于用下列交聯劑制備的 ADC : 商品化 ( 如購自 Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL., 美國 ) 的 BMPS、 EMCS、 GMBS、 HBVS、 LC-SMCC、 MBS、 MPBH、 SBAP、 SIA、 SIAB、 SMCC、 SMPB、 SMPH、 硫 代 -EMCS、 硫 代 -GMBS、 硫 代 -KMUS、 硫 代 -MBS、 硫代 -SIAB、 硫代 -SMCC、 和硫代 -SMPB、 和 SVSB( 琥珀酰亞氨基 -(4- 乙烯基砜 ) 苯 甲酸酯 )。 見 2003-2004 年度應用手冊和產品目錄 (Applications Handbook and Catalog) 第 467-498 頁。
     v. 抗體藥物綴合物的制備
     在本發明的抗體藥物綴合物 (ADC) 中, 將抗體 (Ab) 經接頭 (L) 與一個或多個藥物 結構部分 (D) 綴合, 例如每個抗體綴合約 1 個至約 20 個藥物結構部分。可采用本領域技術 人員已知的有機化學反應、 條件和試劑通過數種路徑來制備通式 I 的 ADC, 包括 : (1) 抗體 的親核基團與二價接頭試劑反應, 以通過共價鍵形成 Ab-L, 隨后與藥物結構部分 D 反應 ; 和 (2) 藥物結構部分的親核基團與二價接頭試劑反應, 以通過共價鍵形成 D-L, 隨后與抗體的 親核基團反應。本文描述了用于制備 ADC 的另外的方法。
     Ab-(L-D)p I
     接頭可由一個或多個接頭構件構成。示例性接頭構件包括 6- 馬來酰亞胺己酰 基 (6-maleimidocaproyl, “MC” )、 馬 來 酰 亞 胺 基 丙 酰 基 (maleimidopropanoyl, “MP” )、 纈氨酸 - 瓜氨酸 (“val-cit” )、 丙氨酸 - 苯丙氨酸 (“ala-phe” )、 對 - 氨基苯甲氧基羰 基 (p-aminobenzyloxycarbonyl, “PAB” )、 N- 琥珀酰亞胺基 -4-(2- 吡啶基硫代 ) 戊酸酯 (“SPP” )、 N- 琥珀酰亞胺基 -4-(N- 馬來酰亞氨甲基 ) 環己烷 -1- 羧酸酯 (“SMCC’ )、 和 N- 琥珀酰亞胺基 (4- 碘 - 乙酰基 ) 氨基苯甲酸酯 ( “SIAB” )。 另外的接頭構件是本領域已知 的, 有些在本文進行了描述。 也見 “Monomethylvaline Compounds Capable ofConjugation to Ligands( 能綴合至配體的單甲基纈氨酸化合物 ), ” 2004 年 11 月 5 日提交的美國序列號 No.10/983,340, 其全文內容通過引用并入本文。
     在一些實施方案中, 接頭可包含氨基酸殘基。 示例性的氨基酸接頭構件包括二肽、 三肽、 四肽、 或五肽。 示例性的二肽包括 : 纈氨酸 - 瓜氨酸 (vc 或 val-cit)、 丙氨酸 - 苯丙氨 酸 (af 或 ala-phe)。示例性的三肽包括 : 甘氨酸 - 纈氨酸 - 瓜氨酸 (gly-val-cit) 和甘氨 酸 - 甘氨酸 - 甘氨酸 (gly-gly-gly)。包含氨基酸接頭構件的氨基酸殘基包括天然存在的 那些, 以及稀有氨基酸 (minor amino acid) 和非天然存在的氨基酸類似物, 如瓜氨酸。可 以設計氨基酸接頭構件并且最優化其選擇性以用于通過特定的酶 ( 如腫瘤相關的蛋白酶, 組織蛋白酶 B、 C 和 D, 或纖溶酶蛋白酶 ) 進行酶切割。
     抗體上的親核基團包括但不限于 : (i)N 末端胺基 ; (ii) 側鏈胺基, 如賴氨酸 ; (iii) 側鏈巰基, 如半胱氨酸 ; 和 (iv) 糖基化抗體中糖的羥基或氨基。胺基、 巰基、 和羥基 是親核的, 能夠與接頭結構部分和接頭試劑上的親電子基團反應而形成共價鍵, 而接頭結 構部分和接頭試劑包括 : (i) 活性酯類, 諸如 NHS 酯、 HOBt 酯、 鹵代甲酸酯、 和酸性鹵化物 ; (ii) 烷基和苯甲基鹵化物, 諸如鹵代乙酰胺 ; (iii) 醛類、 酮類、 羧基和馬來酰亞胺基團。 某 些抗體具有可還原的鏈間二硫鍵, 即半胱氨酸橋。可通過用還原劑諸如 DTT( 二硫蘇糖醇 ) 處理使抗體具有與接頭試劑綴合的反應活性。 每個半胱氨酸橋理論上將形成兩個反應性硫 醇親核體。可經由賴氨酸與 2- 亞氨基硫烷 (Traut 氏試劑 ) 的反應, 導致胺轉變為硫醇, 從 而將額外的親核基團引入抗體。通過引入一個、 兩個、 三個、 四個、 或更多半胱氨酸殘基 ( 例 如制備包含一個或多個非天然半胱氨酸氨基酸殘基的突變抗體 ) 可將反應性巰基引入抗 體。
     還可通過修飾抗體引入可與接頭試劑或藥物上的親核取代基反應的親電子結構 部分來生成本發明的抗體藥物綴合物。可用例如高碘酸鹽氧化劑氧化糖基化抗體的糖, 從 而形成可與接頭試劑或藥物結構部分的胺基團反應的醛或酮基團。 所得亞胺希夫堿基可形 成穩定的連接鍵, 或者可用例如硼氫化物試劑還原而形成穩定的胺連接鍵。在一個實施方 案中, 糖基化抗體的糖部分與半乳糖氧化酶或偏高碘酸鈉的反應可在蛋白質中生成羰 ( 醛 和酮 ) 基團, 它可與藥物上的適當基團反應 (Hermanson, BioconjugateTechniques)。在 另一個實施方案中, 包含 N 末端絲氨酸或蘇氨酸殘基的蛋白質可與偏高碘酸鈉反應, 導致 在第一個氨基酸處生成醛 (Geoghegan&Stroh, (1992)Bioconjugate Chem.( 生物綴合物化 學 )3 : 138-146 ; U.S. 專利號 5,362,852)。此類醛可與藥物結構部分或接頭親核體反應。
     同樣, 藥物結構部分上的親核基團包括但不限于 : 胺、 硫醇、 羥基、 酰肼、 肟、 肼、 縮 氨基硫脲 (thiosemicarbazone)、 肼羧酸酯、 和芳基酰肼基團, 它們能夠與接頭部分和接頭 試劑上的親電子基團反應而形成共價鍵, 而接頭部分和接頭試劑包括 : (i) 活性酯類, 諸如 NHS 酯、 HOBt 酯、 鹵代甲酸酯、 和酸性鹵化物 ; (ii) 烷基和苯甲基鹵化物, 諸如鹵代乙酰胺 ; (iii) 醛類、 酮類、 羧基、 和馬來酰亞胺基團。
     或者, 可通過例如重組技術或肽合成來制備包含抗體和細胞毒性劑的融合蛋白。 DNA 的長度可包含各自編碼綴合物兩個部分的區域, 其或彼此毗鄰或由編碼接頭肽的區域 分開, 該接頭肽不破壞綴合物的期望特性。
     在又一個實施方案中, 可將抗體與 “受體” ( 諸如鏈霉抗生物素蛋白 ) 綴合從而用 于腫瘤預先靶向, 其中對個體施用抗體 - 受體綴合物, 接著使用清除劑由循環中清除未結 合的綴合物, 然后施用與細胞毒性劑 ( 如放射性核苷酸 ) 綴合的 “配體” ( 如抗生物素蛋白 )。 使用抗 -FGFR3 抗體的方法
     本發明的特征在于將 FGFR3 抗體用作具體治療方案的一部分, 所述治療方案預期 由該治療劑提供有益的作用。本發明尤其可用于治療處于各種階段的各種類型的癌癥。
     術語癌癥包括一組增殖性病癥, 包括但不限于癌前生長、 良性腫瘤、 和惡性腫瘤。 良性腫瘤維持局限在原始位點并且沒有浸潤、 侵襲或轉移至遠端位點的能力。惡性腫瘤將 侵襲并破壞其周圍的其它組織。 它們也獲得了從原始位點剝離并擴散至身體其它部分的能 力 ( 轉移 ), 通常通過血流或通過淋巴結所在的淋巴系統轉移。 原發腫瘤通過它們所發生的 組織類型進行分類 ; 轉移瘤通過癌細胞所來源的組織類型進行分類。 經過一段時間, 惡性腫 瘤的細胞變得更加異常并顯得更不像正常細胞。這種癌細胞的外觀變化稱為腫瘤分級, 并 且癌細胞被描述為良好分化的 ( 低級別 (low grade))、 中度分化的、 較差分化的或未分化 的 ( 高級別 (high grade))。良好分化的細胞顯得非常正常并且類似于它們所來源的正常 細胞。未分化的細胞是變得如此異常以至于不能確定該細胞的來源的細胞。
     癌癥分期系統描述了癌癥在解剖學上擴散多遠并試圖將具有相似預后和治療的 患者放在相同的分期組中。可進行數種測試以協助進行癌癥分期, 包括組織活檢和某些顯 影測試如胸部 X 線、 乳房 X 線照片、 骨掃描、 CT 掃描和 MRI 掃描。還使用血液測試和臨床評 價來評價患者的總體健康并檢測癌癥是否擴散到某些器官。
     為對癌癥分期, 美國癌癥聯合委員會 (American Joint Committee onCancer) 首 次使用 TNM 分類系統將癌癥特別是實體瘤以字母類別排列。癌癥被指定為字母 T( 腫瘤大 小 )、 N( 可觸及淋巴結 )、 和 / 或 M( 轉移 )。T1, T2, T3, 和 T4 描述了原發損害的大小增加 ; N0, N1, N2, N3 表明涉及淋巴結的進行性進展 ; M0 和 M1 反映了遠端轉移的不存在或存在。
     在第二種分期方法中, 也已知為總體分期分組 (Overall Stage Grouping) 或羅馬 數字分期 (Roman Numeral Staging), 癌癥被分為 0 至 IV 期, 包括原發損害的大小以及淋巴 結擴散和遠端轉移的存在。在這種系統中, 病例分組到由羅馬數字 I 到 IV 表示的四個期, 或分類為 “復發” 。對一些癌癥, 0 期被稱為 “原位” 或 “Tis” , 如對于乳腺癌的原位導管癌或 原位小葉癌。高級別腺瘤也可分類為 0 期。一般而言, I 期癌癥是通常可治愈的小的局限 性癌癥, 而 IV 期通常代表不可手術或轉移的癌癥。II 期和 III 期癌癥通常是局部進展和 / 或表現出局部淋巴結的參與。一般而言, 更高分期數字表示更大面積的疾病, 包括更大的 腫瘤大小和 / 或癌癥擴散到附近淋巴結和 / 或原發腫瘤鄰近的器官。這些分期是精確定義 的, 但該定義對每種癌癥不同并且是本領域技術人員已知的。
     許多癌癥登記, 諸如國立癌癥研究所的監測、 流行病學和遠期結果計劃 (NCI’ s Surveillance, Epidemiology, and End Results Program(SEER)) 使用概括分期 (summary staging)。這種系統用于所有類型的癌癥。它將癌癥病例分成五個主要類型的組 :
     原位 (In situ) 是早期癌, 其僅在其發生的細胞層中存在。
     局部 (Localized) 是局限于其發生的器官的癌癥, 無擴散跡象。
     區域 (Regional) 是已經從最初 ( 原發 ) 位點擴散到附近淋巴結或器官和組織的 癌癥。
     遠處 (Distant) 是已經從原發位點擴散到遠處器官或遠處淋巴結的癌癥。
     未知 (Unknown) 用于描述對于該病例沒有足夠的信息表明分期的病例。
     此外, 癌癥通常在原發腫瘤已經去除后數個月或數年復發。在所有可見的腫瘤切 除后癌癥復發稱為復發性疾病。在原發腫瘤區域復發的疾病是局部復發, 作為轉移復發的 疾病稱為遠端復發。
     腫瘤可以是實體瘤或非實體瘤或軟組織腫瘤。軟組織腫瘤的實例包括白血病 ( 例如, 慢性髓細胞性白血病 (chronic myelogenous leukemia)、 急性髓細胞性白血病 (acute myelogenous leukemia)、 成人急性淋巴細胞白血病 (adult acute lymphoblastic leukemia)、 急 性 髓 性 白 血 病 (acute myelogenousleukemia)、 成熟 B 細胞急性淋巴細 胞 白 血 病 (mature B-cell acutelymphoblastic leukemia)、 慢性淋巴細胞白血病 (chronic lymphocyticleukemia)、 polymphocytic 白 血 病 (polymphocytic leukemia)、 或毛細胞白血病 (hairy cell leukemia)) 或淋巴瘤 (lymphoma)( 例如, 非霍奇金淋巴瘤 (non-Hodgkin′ s lymphoma)、 皮膚 T 細胞淋巴瘤 (cutaneous T-celllymphoma)、 或霍奇森 病 (Hodgkin′ s disease))。實體瘤包括除血液、 骨髓、 或淋巴系統之外的任何身體組織的 癌癥。實體瘤可進一步分為上皮細胞來源的那些和非上皮細胞來源的那些。上皮細胞實體 瘤的實例包括胃腸道、 結腸、 乳腺、 前列腺、 肺、 腎、 肝、 胰腺、 卵巢、 頭和頸、 口腔、 胃、 十二指 腸、 小腸、 大腸、 肛門、 膽囊、 陰唇、 鼻咽、 皮膚、 子宮、 男性生殖器、 泌尿器官、 膀胱及皮膚的腫 瘤。非上皮來源的實體瘤包括肉瘤 (sarcomas)、 腦腫瘤 (brain tumors)、 和骨腫瘤 (bone tumors)。腫瘤的其他實例描述在定義章節中。
     在一些實施方案中, 對本文的患者進行診斷測試, 例如在治療前和 / 或治療中和 / 或治療后。一般而言, 如果進行診斷測試, 可從需要治療的患者獲得樣品。當受試者患有 癌癥時, 該樣品可以是腫瘤樣品, 或其它生物學樣品, 如生物學液體, 包括但不限于血液、 尿 液、 唾液、 腹水或衍生物如血清和血漿等等。
     本文的生物學樣品可以是固定的樣品, 例如福爾馬林固定的、 石蠟包埋 (FFPE) 的 樣品或冷凍的樣品。
     用于測定 mRNA 或蛋白質表達的方法有多種, 包括但不限于基因表達譜、 聚合酶鏈 式反應 (PCR)( 包括定量實時 -PCR(qRT-PCR))、 微陣列分析、 基因表達系列分析 (serial analysis of gene expression, SAGE)、 MassARRAY、 通 過 大 量 平 行 簽 名 測 序 (Massive Parallel SignitureSequencing, MPSS) 進行的基因表達分析、 蛋白質組學、 免疫組化 (IHC) 等。優選對 mRNA 定量。所述 mRNA 分析優選使用聚合酶鏈式反應 (PCR) 技術或通過微陣列 分析來進行。若采用 PCR, 則優選的 PCR 形式是定量實時 PCR(qRT-PCR)。在一個實施方案 中, 如果上文提到的一種或多種基因的表達處于中值或高于中值, 例如與相同腫瘤類型的 其它樣品相比, 那么認為其是陽性表達。 可以在與測量基因表達的同時測定中值表達水平, 或者可以事先測定。
     多篇已發表的期刊論文 ( 例如 Godfrey 等 J.Molec.Diagnostics( 分子診斷雜 志 )2 : 84-91(2000) ; Specht 等, Am.J.Pathol.( 美國病理學雜志 )158 : 419-29(2001)) 中給 出了使用固定的、 石蠟包埋的組織作為 RNA 來源的代表性基因表達概況分析方案的步驟 : 包括 mRNA 分離、 純化、 引物延伸和擴增。簡單的說, 一種代表性方法首先將石蠟包埋的腫瘤 組織樣品切成約 10 微米厚的切片。 然后提取 RNA 并除去蛋白質和 DNA。 分析 RNA 濃度后, 如 果需要可以包括 RNA 修復和 / 或擴增步驟, 并使用基因特異性啟動子逆轉錄 RNA, 然后 PCR。 最后分析數據, 根據所檢驗腫瘤樣品中鑒定的特征性基因表達模式來確定患者可用的最佳治療選項。
     基因或蛋白表達的檢測可以直接或間接確定。
     人們可以測定癌癥中的 FGFR3 的表達或易位或擴增 ( 直接地或間接地測定 )。對 此, 可利用多種診斷 / 預后測定法。 在一個實施方案中, 可通過 IHC 來分析 FGFR3 的過表達。 可將來自腫瘤組織活檢的石蠟包埋組織切片進行 IHC 測定法并對照如下 FGFR3 蛋白質染色 強度標準 :
     得分 0 : 未觀察到染色或者在少于 10%的腫瘤細胞中觀察到膜染色。
     得分 1+ : 在超過 10%的腫瘤細胞中檢測到微弱的 / 剛剛可察覺的膜染色。所述細 胞只在其部分膜中有染色。
     得分 2+ : 在超過 10%的腫瘤細胞中觀察到微弱至中等的完全膜染色。
     得分 3+ : 在超過 10%的腫瘤細胞中觀察到中等至強烈的完全膜染色。
     在一些實施方案中, 那些 FGFR3 過表達評估得分為 0 或 1+ 的腫瘤可表征為未過表 達 FGFR3, 而那些得分為 2+ 或 3+ 的腫瘤可表征為過表達 FGFR3。
     在一些實施方案中, 過表達 FGFR3 的腫瘤可根據對應于每個細胞表達的 FGFR3 分 子拷貝數的免疫組化得分進行定級, 并且可通過生化方法測定 :
     0 = 0-90 個拷貝 / 細胞,
     1+ =至少約 100 個拷貝 / 細胞,
     2+ =至少約 1000 個拷貝 / 細胞,
     3+ =至少約 10,000 個拷貝 / 細胞。
     備選地, 或另外地, 可對福爾馬林固定、 石蠟包埋的腫瘤組織進行 FISH 測定法來 測定腫瘤中 FGFR3 擴增或易位的存在或和 / 或程度 ( 如果有的話 )。
     FGFR3 激活可直接測定 ( 例如通過磷酸 -ELISA 測試或其它檢測磷酸化受體的方 法 ) 或間接測定 ( 例如通過檢測激活的下游信號傳導途徑組分, 檢測受體二聚物 ( 例如同 二聚體、 異二聚體 ), 檢測基因表達概況等 )。
     相似地, 組成型 FGFR3 和 / 或配體不依賴性或配體依賴性的 FGFR3 可直接或間接 檢測 ( 例如通過檢測與組成型活性相關的受體突變、 通過檢測與組成型活性相關的受體擴 增等 )。
     檢測核酸突變的方法是本領域公知的。 通常, 盡管不是必需的, 擴增樣品中的靶核 酸以提供所希望的材料量, 來確定是否存在突變。擴增技術是本領域公知的。例如, 擴增產 物可以涵蓋或不涵蓋所有編碼目的蛋白質的核酸序列, 只要該擴增產物包含懷疑突變所在 的特定氨基酸 / 核酸序列位置。
     在一個實施例中, 可以通過將來自樣品的核酸與能夠與編碼突變核酸的核酸特異 性雜交的核酸探針接觸, 并檢測所述雜交, 由此確定突變的存在。在一個實施方案中, 探針 3 32 33 被可檢測的標記, 例如用放射性同位素 ( H, P, P 等 )、 熒光劑 ( 若丹明、 熒光素等 ) 或發 色劑標記。在一些實施方案中, 探針是反義寡聚物, 例如 PNA、 嗎啉代 - 氨基磷酸酯、 LNA 或 2′ - 烷氧基烷氧基。探針可以有約 8 個核苷酸至約 100 個核苷酸、 或約 10 個至約 75 個、 或約 15 個至約 50 個、 或約 20 個至約 30 個。在另一個方面, 本發明的核酸探針提供在試劑 盒中, 用以鑒定樣品中的 FGFR3 突變, 所述試劑盒包含特異雜交于或鄰近于編碼 FGFR3 的核 酸中的突變位點的寡核苷酸。試劑盒可進一步包括根據使用試劑盒的雜交測試的結果, 用FGFR3 拮抗劑治療患包含 FGFR3 突變的腫瘤的患者的說明書。
     也可通過比較擴增的核酸的電泳遷移率和相應編碼野生型 FGFR3 的核酸的電泳 遷移率, 由此來檢測突變。遷移率差異表明擴增的核酸序列中存在突變。可通過任何合適 的分子分離技術, 例如在聚丙烯酰胺凝膠上, 來確定電泳遷移率。
     利 用 酶 突 變 檢 測 (EMD), 也 可 分 析 核 酸 來 檢 測 突 變 (Del Tito 等, Clinical Chemistry( 臨床化學 )44 : 731-739, 1998)。EMD 使用噬菌體解離酶 T4 內切核酸酶 VII, 其 掃描雙鏈 DNA 直到它檢測并切割了由堿基對錯配造成的結構變形, 所述錯配由核酸改變諸 如點突變、 插入和缺失造成。例如通過凝膠電泳, 檢測到兩個由解離酶切割形成的短片段, 表明存在突變。 EMD 方法的益處是以單個方案直接從擴增反應中鑒定出所檢驗的點突變、 缺 失、 和插入, 不需要純化樣品, 縮短了雜交時間, 并提高了信噪比。包含比正常至多過量 20 倍的大小至多 4kb 的核酸和片段的混合樣品可進行測試。 可是, EMD 掃描不能鑒定在突變陽 性樣品中發生的特定堿基改變, 所以如果需要, 通常要額外的測序步驟來鑒定特定的突變。 如美國專利 No.5,869,245 所證實的, 相似地可用 CEL I 酶替代解離酶 T4 內切核酸酶 VII。
     另 一 種 用 于 檢 測 突 變 的 簡 單 試 劑 盒 是 反 向 雜 交 測 試 條, 其 與 用 于 檢 測 HFE、 TFR2 和 FPN1 基因中造成血色病 (Haemochromatosis) 的多重突變的 Haemochromatosis StripAssayTM(Viennalabshttp://www.bamburghmarrsh.com/pdf/4220.pdf) 相似。這種測 試基于 PCR 擴增后的序列特異性雜交。對于單突變測試, 可使用基于微量板的檢測系統, 而 對于多重突變測試, 可使用測試條作為 “宏陣列 (macro-arrays)” 。試劑盒可包括可供樣品 制備、 擴增和突變檢測即時使用的試劑。 多重擴增方案提供了便利, 并允許以非常有限的體 積來測試樣品。利用直接 StripAssay 形式, 可以在小于 5 小時內完成二十個以上突變的測 試, 而無需昂貴設備。 從樣品中分離 DNA 并體外擴增靶核酸 ( 例如通過 PCR), 并用生物素標 記, 一般可在單個 (“多重” ) 擴增反應中進行。然后, 擴增產物選擇性地與固定在諸如測試 條的固體支持物上的寡核苷酸探針 ( 野生型和突變體特異的 ) 雜交, 其中探針固定為平行 線或條帶。利用鏈霉抗生物素蛋白 - 堿性磷酸酶和有色底物, 來檢測結合的生物素化的擴 增子。這樣的測試能檢測本發明的所有突變或其任意子集。對于特定的突變體探針條帶, 三種信號傳導模式之一是有可能的 : (i) 僅針對野生型探針的條帶, 其表明是正常的核酸 序列, (ii) 針對野生型和突變體探針的條帶, 其表明是雜合基因型, 和 (iii) 僅針對突變體 探針的條帶, 其表明是純合突變體基因型。因此, 在一個方面, 本發明提供了檢測本發明突 變的方法, 其包括從樣品中分離和 / 或擴增靶 FGFR3 核酸序列, 使得擴增產物包含配體, 使 擴增產物與包含針對該配體的可檢測結合配偶體的探針接觸, 而且該探針能夠與本發明的 突變特異性雜交, 然后檢測所述探針與所述擴增產物的雜交。 在一個實施方案中, 配體是生 物素, 而結合配偶體包括抗生物素蛋白或鏈霉抗生物素蛋白。 在一個實施方案中, 結合配偶 體包括鏈霉抗生物素蛋白 - 堿性磷酸酶, 其可用有色底物檢測。在一個實施方案中, 例如, 探針固定于測試條上, 其中與不同突變互補的探針彼此分開。 可選地, 擴增的核酸用放射性 同位素標記, 在該情況中, 探針不必包含可檢測的標記物。
     野生型基因的改變涵蓋所有形式的突變, 諸如插入、 倒位、 缺失、 和 / 或點突變。在 一個實施方案中, 突變是體細胞的。體細胞突變是僅發生于某些組織中 ( 例如在腫瘤組織 中 ) 且不在種系中遺傳的那些。種系突變可以在任何身體組織中找到。
     包含靶核酸的樣品可通過本領域公知的方法獲得, 而且它們適于特定類型和位置的腫瘤。組織活檢通常用于獲得有代表性的腫瘤組織片。可選地, 可以已知或認為包含目 的腫瘤細胞的組織 / 流體的形式間接獲取腫瘤細胞。例如, 肺癌損傷的樣品可通過切除術、 支氣管鏡檢、 細針抽吸、 支氣管刷檢、 或從痰、 胸膜液或血液中獲得。 可從腫瘤或從其它身體 樣品諸如尿、 痰或血清中檢測出突變的基因或基因產物。上述討論的用于檢測腫瘤樣品中 突變的靶基因或基因產物的同樣技術可用于其它身體樣品。癌細胞從腫瘤上脫落下來, 并 出現在這些身體樣品中。通過篩選這些身體樣品, 可實現對于諸如癌癥的疾病的簡單早期 診斷。 另外, 通過對這些身體樣品測試突變的靶基因或基因產物, 可更容易地監測治療的進 展。
     用于富集腫瘤細胞的組織制備物的手段是本領域已知的。例如, 可以從石蠟或低 溫恒溫保存的切片中分離組織。 癌細胞也可通過流式細胞術或激光捕捉顯微解剖而與正常 細胞分開。這些以及其它分離腫瘤和正常細胞的技術是本領域公知的。如果腫瘤組織被正 常細胞高度污染, 那么檢測突變可能更困難, 盡管最小化污染和 / 或假陽性 / 陰性結果的技 術是已知的, 其中一些在下文有描述。例如, 也可以對樣品評估生物標志物 ( 包括突變 ) 的 存在情況, 所述標志物已知與目的腫瘤細胞有關而與相應的正常細胞無關, 反之亦然。
     可通過用本領域公知的技術來分子克隆靶核酸并測序該核酸, 由此來完成靶核酸 中點突變的檢測。可選地, 諸如聚合酶鏈式反應 (PCR) 的擴增技術可用于直接從腫瘤組織 的基因組 DNA 制備物中擴增出靶核酸序列。然后確定擴增序列的核酸序列并鑒定其突變。 擴增技術是本領域公知的, 例如描述于 Saiki 等, Science( 科學 )239 : 487, 1988 ; 美國專利 Nos.4,683,203 和 4,683,195 中的聚合酶鏈式反應。
     應當注意, 設計并選擇合適的引物是本領域中充分確定的技術。
     本 領 域已 知的連接 酶鏈式反應也可 用于 擴增靶核酸 序列。 參 見例如 Wu 等, Genomics( 基因組學 ), Vol.4, pp.560-569(1989)。 另外, 也可使用稱為等位基因特異性 PCR 的技術。參見例如 Ruano 和 Kidd, Nucleic AcidsResearch( 核酸研究 ), Vol.17, p.8392, 1989。根據該技術, 使用的引物在其 3′端與特定靶核酸突變雜交。如果不存在特定的突 變, 那么不會觀察到擴增產物。也可以使用耐擴增突變系統 (Amplification Refractory MutationSystem, ARMS), 其如歐洲專利申請公開號 0332435 和 Newton 等, NucleicAcids Research( 核酸研究 ), Vol.17, p.7, 1989 所公開的。基因的插入和缺失也可通過克隆、 測 序和擴增來檢測。另外, 基因或周圍標志基因的限制性片段長度多態性 (RFLP) 探針可用于 對等位基因的改變或多態性片段中的插入來評分。也可用單鏈構象多態性 (SSCP) 分析來 檢測等位基因的堿基變化變體。參見例如 Orita 等, Proc.Natl.Acad.Sci.USA( 美國國家 科學院學報 )Vol.86, pp.2766-2770, 1989, 和 Genomics( 基因組學 ), Vol.5, pp.874-879, 1989。也可用其它用于檢測插入和缺失的本領域已知技術。
     根據基因野生型表達產物的改變, 也可檢測野生型基因的改變。這些表達產物包 括 mRNA 以及蛋白質產物。通過擴增和測序 mRNA 或分子克隆由 mRNA 制備的 cDNA, 來檢測點 突變。利用本領域公知的 DNA 測序技術, 可以確定克隆的 cDNA 的序列。cDNA 也可以通過聚 合酶鏈式反應 (PCR) 來測序。
     錯配是沒有 100%互補性的雜交核酸雙鏈。缺乏完全的互補性可以是因為缺失、 插入、 倒位、 置換或移碼突變造成的。可用錯配檢測來檢測靶核酸中的點突變。盡管這些技 術可能不如測序靈敏, 然而對大量組織樣品來說更容易實施。錯配裂解技術的實例是 RNA酶保護方法, 其在 Winter 等, Proc.Natl.Acad.Sci.USA( 美國國家科學院學報 ), Vol.82, p.7575, 1985, 和 Meyers 等, Science( 科學 ), Vol.230, p.1242, 1985 中有詳細描述。例如, 本發明的方法可包括使用標記的核糖核酸探針 (riboprobe), 其與人野生型靶核酸互補。 衍 生自組織樣品的核糖核酸探針和靶核酸在一起退火 ( 雜交 ), 然后用 RNA 酶 A 消化, 其能夠 檢測雙鏈 RNA 結構中的一些錯配。如果 RNA 酶 A 檢測到錯配, 那么它在錯配位點裂解。因 此, 當在電泳凝膠基質上分離退火的 RNA 制備物時, 如果 RNA 酶 A 檢測到錯配并裂解, 那么 將見到比核糖核酸探針與 mRNA 或 DNA 的全長雙鏈 RNA 小的 RNA 產物。考慮到它涵蓋了懷 疑突變了的位置, 核糖核酸探針不需要是靶核酸 mRNA 或基因的全長, 但可以是靶核酸的一 部分。如果核糖核酸探針僅包含靶核酸 mRNA 或基因的一個區段, 如果需要, 那么可能希望 使用大量這些探針來篩選整個靶核酸序列的錯配。
     以相似的方式, 可用 DNA 探針檢測錯配, 例如通過酶或化學裂解進行。參見例如 Cotton 等, Proc.Natl.Acad.Sci.USA( 美國國家科學院學報 ), Vol.85, 4397, 1988 ; 和 Shenk 等, Proc.Natl.Acad.Sci.USA( 美國國家科學院學報 ), Vol.72, p.989, 1975。可選地, 通過 錯配雙鏈體相對于匹配雙鏈體的電泳遷移率變化, 可檢測錯配。參見例如 Cariello, Human Genetics( 人類遺傳學 ), Vol.42, p.726, 1988。用核糖核酸探針或 DNA 探針, 可以在雜交前 擴增可能包含突變的靶核酸 mRNA 或 DNA。 尤其是如果改變是總的重排, 諸如缺失和插入, 那 么利用 Southern 雜交也可檢測靶核酸 DNA 中的改變。
     擴增出的靶核酸 DNA 序列也可用等位基因特異性探針篩選。這些探針是核酸寡聚 物, 每一個都包含靶核酸基因中包含已知突變的區域。 例如, 一個寡聚物的長度可以為約 30 個核苷酸, 對應于部分靶基因序列。 通過使用一組這樣的等位基因特異性探針, 可篩選靶核 酸擴增產物, 以鑒定靶基因中以前鑒定出的突變的存在。可以例如在尼龍濾器上進行等位 基因特異性探針與擴增的靶核酸序列的雜交。 在嚴格雜交條件下與特定探針的雜交表明腫 瘤組織中存在與等位基因特異性探針中相同的突變。
     通過篩選相應野生型蛋白的改變, 可檢測野生型靶基因的改變。 例如, 與靶基因產 物有免疫反應性的單克隆抗體可用于篩選組織, 例如用已知與基因產物 ( 蛋白質 ) 的特定 突變位置結合的抗體。例如, 所用的抗體可以是結合缺失的外顯子的抗體或結合包含靶蛋 白缺失部分的構象表位的抗體。缺少關聯抗原將表示有突變。突變等位基因產物的特異性 抗體也可用于檢測突變基因產物。可以從噬菌體展示文庫中鑒定抗體。這些免疫學測定法 可以以本領域已知的任何便利形式進行。這些包括 Western 印跡、 免疫組織化學測定法和 ELISA 測定法。任何檢測改變的蛋白質的方法都可用于檢測野生型靶基因的改變。
     利用核酸擴增技術, 諸如聚合酶鏈式反應, 引物對可用于確定靶核酸的核苷酸序 列。 單鏈 DNA 引物對可以與靶核酸序列之內或周圍的序列退火, 從而引發靶序列的擴增。 也 可使用等位基因特異性引物。該引物僅與特定的突變靶序列退火, 因此僅在存在突變的靶 序列作為模板的情況下才會擴增出產物。為了便于接下來克隆擴增的序列, 引物可具有限 制酶位點序列, 該序列附加在這些引物的末端。這些酶和位點是本領域公知的。可以用本 領域公知的技術來合成引物本身。 一般而言, 可用寡核苷酸合成儀制造引物, 所述儀器可從 商業渠道獲得。設計特定引物完全在本領域技術范圍內。
     核酸探針可用于許多目的。它們可用于對基因組 DNA 的 Southern 雜交中, 并可用 于 RNA 酶保護方法中以檢測上文已經討論過的點突變。探針可用于檢測靶核酸擴增產物。利用其它技術, 它們也可用于檢測野生型基因或 mRNA 的錯配。利用酶 ( 例如 S1 核酸酶 )、 化學藥品 ( 例如羥胺或四氧化鋨和哌啶 )、 或錯配雜交體相對于完全匹配雜交體的電泳遷 移率變化, 可檢測錯配。這些技術是本領域已知的。參見 Novack 等, Proc.Natl.Acad.Sci. USA( 美國國家科學院學報 ), Vol.83, p.586, 1986。一般而言, 探針與激酶結構域外的序列 互補。整組核酸探針可用于組成試劑盒來檢測靶核酸中的突變。試劑盒容許進行對目的靶 序列的大區域的雜交。探針可彼此交疊或毗鄰。
     如果用核糖核酸探針來檢測與 mRNA 的錯配, 那么它一般與靶基因的 mRNA 互補。 因 此, 核糖核酸探針是反義探針, 因為由于它與有義鏈互補, 它不編碼相應的基因產物。核糖 核酸探針一般會用放射性、 比色、 或熒光材料來標記, 這可以通過任何本領域已知方法來實 現。如果用核糖核酸探針來檢測與 DNA 的錯配, 它可以是任一極性, 即有義的或反義的。相 似地, 也可用 DNA 探針來檢測錯配。
     在一些情況下, 癌癥過表達或不過表達 FGFR3。可在診斷或預后測定中通過評估 細胞表面上存在的受體蛋白質水平的升高 ( 例如通過免疫組化測定, IHC) 來測定受體的過 表達。備選地, 或者另外地, 可測量細胞中編碼受體的核酸的水平, 例如通過熒光原位雜交 (FISH ; 參見 1998 年 10 月公布的 WO98/45479)、 southern 印跡或聚合酶鏈式反應 (PCR) 技 術, 諸如實時定量 PCR(RT-PCR)。在上述測定法之外, 熟練從業人員還可利用多種體內測定 法。 例如, 可將患者體內細胞暴露于任選用可檢測標記物例如放射性同位素標記的抗體, 并 且可評估該抗體與患者內細胞的結合, 例如通過外部掃描放射性或通過分析取自事先已暴 露于所述抗體的患者的活組織檢查。
     化療劑
     本發明的聯合療法可以進一步包含一種或多種化療劑。 聯合給藥包括使用單獨的 制劑或單一的藥物制劑的共同施用或同時施用, 和以任意的順序連續施用, 其中優選在兩 種 ( 或所有 ) 活性劑同時發揮它們的生物活性時存在一定的時間段。
     如果施用的話, 化療劑通常以其已知的劑量施用, 或任選地由于藥物的聯合作用 或歸因于抗代謝物化療劑的施用所引起的不良副作用而以降低的劑量施用。 對于此類化療 劑的制備和給藥方案可以根據生產商的說明書或由專業從業人員通過經驗確定來使用。
     在本文中公開了可以聯合的多種化療劑。
     在 一 些 實 施 方 案 中, 待聯合的化療劑選自由下列各項組成的組 : 來那度胺 (REVLIMID), 蛋白體抑制劑 ( 諸如硼替佐米 (VELCADE) 和 PS342), 紫杉烷 (bora taxoid) ( 包 括 多 西 他 賽 (docetaxel) 和 紫 杉 醇 (paclitaxel)), 長春花屬 ( 諸如長春瑞濱 (vinorelbine) 或長春堿 (vinblastine)), 鉑化合物 ( 諸如卡鉑 (carboplatin) 或順鉑 (cisplatin)), 芳香酶抑制劑 ( 諸如來曲唑 (letrozole), 阿那曲唑 (anastrazole), 或依西 美坦 (exemestane)), 抗雌激素 ( 例如, 氟維司群 (fulvestrant) 或他莫昔芬 (tamoxifen)), 依 托 泊 苷 (etoposide), 塞 替 哌 (thiotepa), 環 磷 酰 胺 (cyclophosphamide), 培美曲塞 (pemetrexed), 甲氨蝶呤 (methotrexate), 多柔比星脂質體 (liposomal doxorubicin), 聚 乙 二 醇 化 多 柔 比 星 脂 質 體, 卡 培 他 濱 (capecitabine), 吉 西 他 濱 (gemcitabine), melthalin, 多 柔 比 星 (doxorubicin), 長 春 新 堿 (vincristine), COX-2 抑 制 劑 ( 例 如, 塞 來 考 昔 (celecoxib)), 或 類 固 醇 ( 例 如, 地 塞 米 松 (dexamethasone) 和 潑 尼 松 (prednisone))。 在一些實施方案中 ( 例如涉及治療 t(4 ; 14)+ 多發性骨髓瘤的實施方案 ),聯合地塞米松和來那度胺, 或地塞米松, 或硼替佐米, 或長春新堿, 多柔比星和地塞米松, 或 來那度胺和地塞米松, 或多柔比星脂質體, 長春新堿和地塞米松, 或來那度胺和地塞米松, 或硼替佐米和地塞米松, 或硼替佐米, 多柔比星, 和地塞米松。在一些實施方案中 ( 例如, 涉 及膀胱癌的實施方案 ), 吉西他濱和順鉑, 或紫杉烷 ( 例如, 紫杉醇, 多西他賽 ), 或培美曲 塞, 或甲氨蝶呤, 長春堿, 多柔比星和順鉑, 或卡鉑, 或絲裂霉素 C 結合 5- 氟尿嘧啶, 或順鉑, 或順鉑和 5- 氟尿嘧啶相聯合。
     制劑、 劑量和施用
     可以與優良醫學實踐一致的方式配制、 劑量給藥和施用本發明中使用的治療劑。 在這種情形中考慮的因素包括所治療的具體病癥、 所治療的具體受試者、 患者個體的臨床 狀態、 病癥的起因、 投遞藥劑的部位、 施藥的方法、 施藥的日程安排、 將要組合的藥劑的藥 物 - 藥物相互作用和醫學從業人員已知的其它因素。
     治療用制劑可通過將具有期望純度的活性成分與任選的生理學上可接受的載體、 賦形劑或穩定劑混合使用本領域已知的標準方法而制備 (Remington′ s Pharmaceutical Sciences( 雷明頓制藥科學 )( 第 20 版 ), 編輯 A.Gennaro, 2000, Lippincott, Williams & Wilkins, Philadelphia, PA)。 可接受的載體包括鹽水或緩沖劑, 諸如磷酸鹽、 檸檬酸鹽和其 它有機酸 ; 抗氧化劑, 包括抗壞血酸 ; 低分子量 ( 少于約 10 個殘基 ) 多肽 ; 蛋白質, 諸如血 清白蛋白、 明膠或免疫球蛋白 ; 親水性聚合物, 諸如聚乙烯吡咯烷酮 ; 氨基酸, 諸如甘氨酸、 谷氨酰胺、 天冬酰胺、 精氨酸或賴氨酸 ; 單糖、 二糖和其它糖類, 包括葡萄糖、 甘露糖或糊精 ; 螯合劑, 諸如 EDTA ; 糖醇, 諸如甘露醇、 或山梨醇 ; 成鹽平衡離子, 諸如鈉 ; 和 / 或非離子表 TM TM 面活性劑, 諸如 TWEEN 、 PLURONICS 或 PEG。
     任選地, 但優選地, 制劑含有藥用鹽, 優選為氯化鈉, 且優選大約為生理濃度。 任選 地, 本發明的制劑可包含藥用防腐劑。 在一些實施方案中, 防腐劑濃度范圍在 0.1 至 2.0%, 典型地為 v/v。適當的防腐劑包括制藥領域已知的那些。優選的防腐劑是苯甲醇、 酚、 間甲 酚、 對羥基苯甲酸甲酯和對羥基苯甲酸丙酯。任選地, 本發明的制劑可包含濃度為 0.005 至 0.02%的藥用表面活性劑。
     本文中的制劑還可含有超過一種所治療具體適應癥所必需的活性化合物, 優選活 性互補且彼此沒有不利影響的那些。合適的是, 此類分子以對于預定目的有效的量組合。
     活性成分還可包載于例如通過凝聚技術或通過界面聚合制備的微膠囊中 ( 例如 分別是羥甲基纖維素或明膠微膠囊和聚 ( 甲基丙烯酸甲酯 ) 微膠囊 )、 包載在膠狀藥物投 遞系統中 ( 例如脂質體、 白蛋白微球體、 微乳劑、 納米顆粒和納米膠囊 )、 或包載在粗滴乳狀 液 (macroemulsion) 中。此類技術披露于 Remington′ s Pharmaceutical Sciences, 見上 文。
     可制備緩釋制劑。 緩釋制劑的合適例子包括含有抗體的固體疏水性聚合物的半透 性基質, 該基質是定型產品的形式, 例如薄膜或微膠囊。緩釋基質的例子包括聚酯、 水凝膠 ( 例如聚 (2- 羥乙基 - 甲基丙烯酸酯 ) 或聚 ( 乙烯醇 ))、 聚交酯 ( 美國專利 No.3,773,919)、 L- 谷氨酸與 γ 乙基 -L- 谷氨酸酯的共聚物、 不可降解的乙烯 - 乙酸乙烯酯、 可降解的乳 TM 酸 - 乙醇酸共聚物諸如 LUPRON DEPOT ( 由乳酸 - 乙醇酸共聚物和醋酸亮丙立德構成的可 注射微球體 ) 及聚 -D-(-)-3- 羥基丁酸。雖然諸如乙烯 - 乙酸乙烯酯和乳酸 - 乙醇酸的聚 合物能夠釋放分子達 100 天以上, 但是某些水凝膠釋放蛋白質的時間較短。當封裝的抗體在體內長時間維持時, 它們可能由于暴露于 37℃的潮濕環境而變性或聚集, 導致生物學活 性損失和可能的免疫原性改變。可以根據相關機制來設計合理的穩定化策略。例如, 如果 發現聚集機制是經由硫代 - 二硫化物互換的分子間 S-S 鍵形成, 那么可通過修飾巰基殘基、 由酸性溶液凍干、 控制濕度、 采用適當添加劑和開發特定聚合物基質組合物來實現穩定。
     本發明的治療劑依照已知的方法施用給人患者, 諸如, 作為推注或通過一段時間 的連續輸注的靜脈內施用, 通過肌肉內的、 腹膜內的、 腦脊內的、 皮下的、 關節內的、 滑膜內 的、 鞘內的、 口腔的、 局部的、 或吸入途徑。離體 (ex vivo) 策略也可在治療性應用中使用。 離體策略涉及通過編碼 FGFR3 拮抗劑的多核苷酸轉染或轉導從受試者獲得的細胞。該轉染 或轉導的細胞然后回輸至受試者。該細胞可以是許多類型的任一種, 包括但不限于造血細 胞 ( 例如骨髓細胞、 巨噬細胞、 單核細胞、 樹突細胞、 T 細胞或 B 細胞 )、 成纖維細胞、 上皮細 胞、 內皮細胞、 角質細胞或肌細胞。
     例如, 如果 FGFR3 拮抗劑是抗體, 該抗體通過任何合適的手段施用, 所述手段包括 腸胃外、 皮下、 腹膜內、 肺內和鼻內途徑, 并且如果希望局部免疫抑制治療, 進行損傷內施 用。腸胃外輸注包括肌內、 靜脈內、 動脈內、 腹膜內或者皮下施用。此外, 通過脈沖輸注, 尤 其使用降低劑量的抗體合適地施用抗體。 優選地, 給藥通過注射給予, 最優選地通過靜脈內 或皮下注射給予, 這部分取決于施用是短期還是長期的。
     在另一個實例中, 當病癥或腫瘤的位置允許時, FGFR3 拮抗劑化合物局部施用, 例 如通過直接注射, 并且該注射可周期性地重復。 FGFR3 拮抗劑也可系統投遞給受試者或直接 投遞至腫瘤細胞, 例如投遞至腫瘤或手術切除腫瘤后的瘤床, 以預防或降低局部復發或轉 移。
     組合施用治療劑典型地在限定的時間期間 ( 根據所選的組合通常數分鐘、 數小 時、 數天或數周 ) 進行。聯合療法意圖涵蓋以連續的方式施用這些治療劑, 即其中每種治療 劑在不同時間施用, 以及涵蓋以基本同時的方式施用這些治療劑, 或至少該治療劑中的兩 種。
     治療劑可通過相同的途徑或不同的途徑施用。例如組合中的抗 FGFR3 抗體可通過 靜脈內注射施用, 而組合中的化療劑可口服施用。 備選地, 例如, 兩種治療劑均可口服施用, 或兩種治療劑均可通過靜脈內注射施用, 這取決于具體治療劑。治療劑施用的順序也根據 具體藥劑而變化。
     取決于疾病的類型和嚴重性, 約 1μg/kg 至 100mg/kg 的每種治療劑是施用于患者 的初始候選劑量, 例如, 無論通過一次或多次單獨的給藥, 或通過連續輸注。典型的日劑量 可以在約 1μg/kg 至約 100mg/kg 以上的范圍內, 這取決于上面提及的因素。對于在幾天 或更長時間內的反復給藥, 取決于病況, 持續治療直至癌癥被治療, 如上述方法所測量的那 樣。然而, 可以使用其他給藥方案。
     本申請設想通過基因療法來施用 FGFR3 抗體。關于使用基因療法來產生胞內抗 體, 參見例如 1996 年 3 月 14 日公開的 WO 96/07321。
     制品
     在本發明的另一個方面中, 提供了包含可用于治療、 預防和 / 或診斷上文所述病 癥的物質的制品。所述制品包括容器和在容器上或與其相關的標簽或包裝插頁。合適的 容器包括例如瓶 (bottle)、 藥瓶 (vial)、 注射器等。所述容器可以用多種材料制成, 諸如玻璃或塑料。所述容器裝有組合物, 其本身存在或當與有效治療、 預防和 / 或診斷所述病況 的另一種或多種組合物組合時, 可以具有無菌存取口 ( 例如所述容器可以是帶有皮下注射 針可刺穿的塞子的靜脈內溶液袋或藥瓶 )。在所述組合物中的至少一種活性劑是本發明的 抗體。標簽或包裝插頁指明該組合物用于治療所選擇的病況, 諸如癌癥。而且, 所述制品可 以包含 (a) 具有包含在其中的組合物的第一容器, 其中所述組合物包含本發明的抗體 ; 和 (b) 具有包含在其中的組合物的第二容器, 其中所述組合物包含另外的細胞毒性藥劑。在 本發明的該實施方案中的制品還可以包含包裝插頁, 其說明可以將第一和第二抗體組合物 用于治療特定病況, 例如癌癥。備選地, 或另外地, 所述制品還可以包含第二 ( 或第三 ) 容 器, 其包含藥用緩沖液, 如用于注射的抑菌水 (BWFI)、 磷酸緩沖鹽溶液、 林格氏溶液和葡萄 糖 (dextrose) 溶液。其可進一步包括從商業和用戶立場出發所需要的其它物質, 包括其它 緩沖劑、 稀釋劑、 濾器、 針頭和注射器。
     下述是本發明的方法和組合物的實例。 應當理解考慮上文提供的一般描述可以實 施多種其它實施方案。 實施例 材料和方法
     細胞和細胞培養
     細 胞 系 RT4 獲 自 美 國 典 型 培 養 物 保 藏 中 心 (American Type Cell CultureCollection)。 細胞系 RT112, OPM2 和 Ba/F3 購自德國微生物和細胞培養物培養物保 藏中心 (German Collection of Microorganisms and Cell Cultures)(DSMZ, (Germany))。 多發性骨髓瘤細胞系 KMS 11 由川崎醫學院 (KawasakiMedical School)( 日本 ) 的 Takemi Otsuki 博士饋贈。膀胱癌細胞系 TCC-97-7 由圣詹姆斯大學醫院 (St James’ s University Hospital(Leeds, UK)) 的 Margaret Knowles 博士饋贈。 UMUC-14 細胞系獲自 H.B.Grossman 博士 ( 目前在得克薩斯大學安德森癌癥中心 (University of Texas M.D.AndersonCancer Center), TX)。細胞用補充了 10%胎牛血清 (FBS)(Sigma), 100U/ml 青霉素, 0.1mg/ml 鏈霉 素和 L- 谷氨酰胺的 RPMI 培養基在 5% CO2 的條件下在 37℃維持生長。
     FGFR3S249C 二聚作用研究
     UMUC-14 細 胞 生 長 在 無 半 胱 氨 酸 培 養 基 中, 用 R3Mab 或 DTNB 處 理 3hr, 并將 細胞裂解物在還原或非還原條件下進行免疫印跡分析。對于體外二聚作用研究, 將 S249C FGFR3-IIIb ( 殘基 143-374) 克隆至 pAcGP67A 載體中, 并在 T.ni Pro 細胞中表達。通過 Ni-NTA 柱, 然后通過 Superdex S200 柱純化重組蛋白。二聚體 FGFR3S249C 在 25mM Tris(pH 7.5) 和 300mMNaCl 中洗脫。R3Mab(1μM) 與 FGFR3S249C 二聚體 (0.1μM) 在 37℃下在下列的 條件下溫育 : 100mM KH2PO4(pH 7.5), 25μM DTT, 1mM EDTA 和 0.75mg/ml BSA。在指定的時 間點獲取反應物的等分試樣, 并且通過添加不含 β- 巰基乙醇的樣品緩沖液終止反應。通 過免疫印跡分析二聚體 - 單體。
     異種移植物研究
     所 有 研 究 得 到 Genentech 機 構 動 物 管 理 和 使 用 委 員 會 (Genentech’ sInstitutional Animal Care and Use Committee) 的批準。6-8 周齡雌性 nu/nu 小鼠或 CB17 嚴重聯合免疫缺陷 (SCID) 小鼠購自 Charles River 實驗室 (Hollister,
     CA)。 雌 性 無 胸 腺 裸 鼠 獲 自 國 立 癌 癥 學 會 - 弗 雷 德 里 克 癌 癥 中 心 (National Cancer Institute-Frederick Cancer Center)。小鼠在無特殊病原體條件下飼養。RT112 shRNA 穩定的細胞 (7x106), RT112(7x106), Ba/F3-FGFR3S249C(5x106), OPM2(15x106), 或 KMS11 細胞 6 (20x10 ) 以在 HBSS/ 基質膠 (matrigel)(1 ∶ 1v/v, BD Biosciences) 中的 0.2ml 體積皮下 植入至小鼠的側腹中。植入不含基質膠的 UMUC-14 細胞 (5x106)。使用測徑器測量腫瘤每 周兩次, 并且使用下面的公式計算腫瘤體積 : V = 0.5axb2, 其中 a 和 b 分別是腫瘤的長度和 3 寬度。當平均腫瘤體積達到 150-200mm 時, 將小鼠隨機化分到每組 10 只的各組中, 并且腹 膜內 (i.p) 注射 HBSS 中稀釋的 R3Mab(0.3-50mg/kg) 或對照人 IgG1, 每周處理兩次。對照 動物只給予賦形劑 (HBSS)。
     統計學
     匯總的數據表示為均值 +/-SEM。對于兩組間的比較使用非配對斯氏 t 檢驗 ( 雙 尾 )。在所有試驗中 P < 0.05 的值被認為是統計學顯著的。
     FGFR3shRNA 穩定細胞的生成
     將三種獨立的 FGFR3shRNA 如 (1) 所述克隆進 pHUSH 載體中。在本研究中使用的 FGFR3 shRNA 的序列如下 : shRNA2 : 5’ GATCCCCGCATCAAGCTGCGGCATCATTCAAGAGATGATGCCGCA GCTTGATGCTTTTTTGGAAA(SEQ ID NO : 192) ; shRNA4 : 5’ -GATCCCCTGCACAACCTCGACTACTATTCAA GAGATAGTAGTCGAGGTTGTGCATTTTTTGGAAA-3’ (SEQ ID NO : 193) ; shRNA6 : 5’ -GATCCCCAACCTCGA CTACTACAAGATTCAAGAGATCTTGTAGTAGTCGAGGTTTTTTTTGGAAA-3’ (SEQ ID NO : 194)。 所有構建 體均通過測序確認。 EGFP 對照 shRNA 描述在我們先前的研究中 (50)。 包含 shRNA 的逆轉錄 病毒通過用 VSV-G(Clontech Laboratories) 和 pHUSH-FGFR3shRNA 構建體共轉染 GP2-293 包裝細胞 (Clontech Laboratories, MountainView, CA) 來產生, 并且在轉染后 72hr 收獲病 毒上清液, 并通過離心清除細胞碎片用于轉導實驗。
     RT112 細胞在包含無四環素 FBS(Clontech Laboratories) 的 RPMI 1640 培養基中 維持生長, 并用逆轉錄病毒上清液在存在 4μg/ml 聚凝胺的條件下轉導。感染 72 小時后, 向培養基中加入 2μg/ml 嘌呤霉素 (ClontechLaboratories) 以選擇表達 shRNA 的穩定克 隆。分離穩定的細胞, 用 0.1 或 1μg/ml 強力霉素 (Clontech Laboratories) 處理 4 天, 通 過 Western 印跡分析評估 FGFR3 蛋白表達的可誘導性敲低。如 (51) 所述進行細胞周期分 析。
     選擇對 FGFR3 特異的噬菌體抗體
     在選擇的互補決定區 (H1, H2, H3, L3) 中具有合成多樣性的模擬人 IgG 所有組成成 分 (repertoire) 的天然多樣性的人噬菌體抗體文庫用于淘選。Fab 片段雙價地展示在 M13 噬菌體顆粒的表面上 (52)。 將人 FGFR3-IIIb 和 IIIc 的 His- 標記的 IgD2-D3 用作抗原。 96 孔 MaxiSorp 免疫測定板 (Nunc) 用 FGFR3-IIIb-His 蛋白或 FGFR3-IIIC-His 蛋白 (10μg/ ml) 在 4℃下包被過夜并用補充了 1% BSA 的 PBST 緩沖液 ( 含 0.05%吐溫 20 的 PBS) 封閉 1 小時。加入抗體噬菌體文庫并在室溫 (RT) 下溫育過夜。用 PBST 緩沖液洗滌測定板, 用 50mM HCl 和 500mM NaCl 洗脫結合的噬菌體 30 分鐘, 并用等體積的 1M Tris 堿中和。回收 的噬菌體在大腸桿菌 XL-1blue 細胞中擴增。在隨后的選擇輪次中, 噬菌體抗體的溫育時間 減少至 2 小時, 測定板洗滌的嚴格性逐漸增加 (53)。通過噬菌體 ELISA 和 DNA 測序鑒定與 FGFR3 的 IIIb 和 IIIc 同種型兩者均結合的獨特的和特異的噬菌體抗體。在篩選的 400 個克隆中, 選擇出 4 個通過分別將各個克隆的 VL 和 VH 區克隆至 LPG3 和 LPG4 載體中來重新 格式化成全長 IgG, 在哺乳動物細胞中瞬時表達, 并用蛋白 A 柱純化 (54)。選擇克隆 184.6 用于親和力成熟。
     對于親和力成熟, 在 M13 噬菌體的表面上展示單價 Fab 的噬菌粒 (52) 充當移植噬 菌體 Ab 的輕鏈 (VL) 和重鏈 (VH) 可變結構域的文庫模板。 將終止密碼子結合在 CDR-L3 中。 如 (53) 所述對于親和力成熟采用簡單 (soft) 隨機化策略。選擇 CDR 環的兩個不同組合, H1/H2/L3, H3/L3, 或 L1/L2/L3 進行隨機化。為了選擇親和力成熟的克隆, 針對 FGFR3IIIb 或 IIIc-His 蛋白分選噬菌體文庫, 如 (52) 所述進行第一輪測定板分選, 然后進行四輪溶液 相分選。5 輪淘選后, 如 (55) 所述使用高通量單點競爭性噬菌體 ELISA 來快速篩選高親和 力克隆。選擇在存在 10nM FGFR3-His 的條件下與缺少 FGFR3-His 的條件下 450nm 處吸光 度的比率低的克隆用于進一步表征。
     克隆 184.6.1, 184.6.21, 184.6.49, 184.6.51, 184.6.58, 184.6.62 和 184.6.92 顯 著降低了 Ba/F3-FGFR3-IIIb, Ba/F3-FGFR3-IIIc 和 Ba/F3-FGFR3-S249C 細胞系的活力, 且 克隆 184.6.52 顯著降低了 Ba/F3-FGFR3-S249C 細胞系的活力。根據測定的細胞系不同, 增加的抑制活性范圍為親代克隆 184.6 的約 50 倍 ( 克隆 184.6.52) 至約 100 倍 ( 克隆 184.6.1, 184.6.21, 184.6.49, 184.6.51, 184.6.58, 184.6.62 和 184.6.92)。使用 BIAcore 如下測定克隆 184.6.1, 184.6.58, 和 184.6.62 與 FGFR3-IIIb 和 FGFR3-IIIc 的結合動力 學:
     克隆 184.6.1, 184.6.58, 和 184.6.62 也顯示對 Ba/F3-FGFR3 細胞、 RT112 細胞和 OPM2 細胞中 FGFR3 下游信號傳導的抑制提高。
     選擇克隆 184.6.1。將一個序列修飾 N54S 在殘基 54 處引入至 HVR H2 以提高可制 造性, 形成克隆 184.6.1N54S。克隆 184.6.1 和 184.6.1N54S 顯示相當的結合動力學 ( 在 Biacore 測定中測量 ) 和在 Ba/F3 細胞活力測定中相當的活性。生成另外的 HVR H2 變體 : 將 N54S 引入至克隆 184.6.58 中, 并將 N54G, N54A, 或 N54Q 引入至克隆 184.6.1 和 184.6.58 中。這些克隆在 Ba/F3 細胞活力測定中顯示與親代克隆 184.6.1 或 184.6.58 相當的活性。
     將 另 一 個 序 列 修 飾 D30E 引 入 至 克 隆 184.6.1N54S 的 HVR L1 中, 形成克隆 184.6.1NSD30E。 克 隆 184.6.1NSD30E 和 克 隆 184.6.1N54S 顯 示 與 親 代 克 隆 184.6.1 或 184.6.58 相當的結合動力學和在 BA/F3 細胞活力測定中顯示相當的活性。
     當用于本文時, “R3Mab” 是指抗 -FGFR3 抗體克隆 184.6.1N54S, 184.6.1, 或 184.6。 克隆 184.6.1N54S 用在提及 “R3Mab” 的附圖和試驗中, 例外是得到下列附圖中顯示的結 果的試驗 ( 其使用的抗體顯示在括號中 ) : 圖 9B( 克隆 184.6.1), 10( 克隆 184.6), 11A 和
     B( 克隆 184.6), 13( 克隆 184.6.1), 14A( 克隆 184.6.1), 14B, G, 和 H( 克隆 184.6), 19( 克 隆 184.6.1), 和 22B 和 C( 克隆 184.6.1)。
     測定抗體結合親和力的 BIAcore/ 表面等離振子共振 (SRP) 分析
     R3Mab 與 FGFR3 的結合親和力通過 Biacore/SRP 使用 BIAcoreTM-3000 儀器如 (52) 所述采用下列的改良測量。將 R3Mab 直接包被在 CM5 生物傳感器芯片上以達到大約 400 響 應單位 (RU)。對于動力學測量, FGFR3-IIIb 或 IIIc-His 蛋白的兩倍連續稀釋液 ( 從 67nM 起始 ) 在 25℃以 30μl/min 的流速注入 PBST 緩沖液中。使用簡單一對一朗格繆爾結合模 型 (BIAcore 評價軟件 3.2 版 (BIAcore Evaluation Software version 3.2)) 計算結合速 率 (Kon, per mol/s) 和解離速率 (Koff, per s)。平衡解離常數 (Kd, permol) 以 Koff/Kon 的比率計算。
     如下通過 Biacore/SRP 測量針對 FGFR3 的小鼠雜交瘤抗體的結合親和力。將人 FGFR3-IIIb 或 IIIc 偶聯至 BIACORETM CM5 傳感器芯片的三個不同的流動池 (flow cell, FC), FC2, FC3 和 FC4 以達到約 50RU 的響應單位 (RU)。使用生產商提供的試驗方案通過氨 基的隨機偶聯實現固定化。通過以 30μl/min 的流速注射 250nM-0.48nM 的范圍內以 2 倍 增量增加的系列溶液, 記錄在 25℃下雜交瘤來源的抗 FGFR3 鼠 IgG 或 Fab 片段與這些表面 結合的傳感圖。 在每次注射之間, 10mM 甘氨酸 -HCl pH 1.7 充當緩沖液以再生傳感器芯片。 從在 FC2, FC3 和 FC4 處觀察到的傳感圖中減去來自參照池 (FC1) 的信號。通過數據的非 線性回歸擬合根據 1 ∶ 1 朗格繆爾結合模型使用 BIAcore 評價軟件 (3.2 版 )( 由制造商提 供 ) 計算動力學常數。
     ELISA 結合研究
     將編碼人 FGFR1-IIIb, IIIc, FGFR2-IIIb 和 IIIc, FGFR3-IIIb 和 IIIc, 和 FGFR4 的 細胞外結構域 (ECD) 的 cDNA 克隆至基于 pRK 的載體中生成人 FGFR- 人 Fc 嵌合蛋白。通過 瞬時轉染中國倉鼠卵巢 (CHO) 細胞產生重組蛋白, 并經由蛋白 A 親和層析純化。 為了測試抗 體與人 FGFR 的結合, 將 Maxisorp 96 孔板 (Nunc) 用 50μl 2μg/ml 的 FGFR ECD- 人 Fc 嵌 合蛋白在 4℃下包被過夜。用磷酸鹽緩沖鹽水 (PBS)/3% BSA 封閉后, 加入 FGFR3 抗體并在 RT 下溫育 2 小時。使用 HRP- 綴合的抗 - 人 Fab 和 TMB 過氧化物酶產色底物 (colorigenic substrate)(KPL, Gaithersburg, MD) 檢測特異性結合的 FGFR3 抗體。
     為了測試針對 FGFR3 的抗體對 FGF/FGFR3 相互作用的效用, 將 FGFR3-Fc 嵌合蛋 白俘獲在包被以抗 - 人免疫球蛋白 Fcγ 片段特異性抗體 (Jackson Immunoresearch, West Grove, PA) 的 Maxisorp 測定板上。洗滌后, 將漸增量的 FGFR3 抗體加入至測定板并溫育 30 分鐘。然后, 加入 FGF1 或 FGF9 和肝素, 在 RT 下溫育 2 小時。洗滌測定板, 并與生物素化的 FGF1- 特異性多克隆抗體 (BAF232) 或生物素化 FGF9 抗體 (BAF273, R&DSystems) 溫育 1 小 時, 然后用鏈霉抗生物素蛋白 -HR 和 TMB 檢測。
     Ba/F3-FGFR3 穩定細胞的生成
     將 編 碼 全 長 人 FGFR3IIIb 或 IIIc 的 cDNA 克 隆 至 pQCXIP 載 體 (Clontech Laboratories, Mountain View, CA) 中 以 生 成 pQCXIP-FGFR3-IIIb 或 IIIc。 特 異 性 突 變, 即, 將 R248C, S249C, G372C, Y375C 和 K652E 經 QuickChange(Stratagene, La Jolla, CA) 引入至 cDNA 中。為了生成表達野生型或突變 FGFR3 的 Ba/F3 穩定的細胞, 將多種 pQCXIP-FGFR3 構建體與 VSV-G 質粒 (Clontech Laboratories) 共轉染至包裝細胞 GP2-293中。在用 2μg/ml 嘌呤霉素選擇 2 周后, 將表達野生型或突變 FGFR3 的細胞用藻紅蛋白 綴合的抗 - 人 FGFR3mAb(FAB766P, R&D Systems) 染色, 并通過熒光激活細胞分選 (FACS) 選擇用于功能測定。對于在 96 孔微量滴定板中的細胞增殖測定, 使用下列的細胞密度 : 對于表達野生型 FGFR3-IIIb 和 FGFR3-K652E 的細胞 : 5,000 細胞 / 孔 ; 對于其余的細胞 : 10,000 細 胞 / 孔。 細 胞 接 種 在 補 充 了 10 % 胎 牛 血 清, 10ng/ml FGF1 和 10μg/ml 肝 素 (Sigma-Aldrich, St.Louis, MO) 的 RPMI 1640 培養基中。R3Mab 以指定的濃度加入, 并且 小鼠雜交瘤 FGFR3 抗體在 FGFR3-IIIb 實驗中以 2000-0.49ng/ml( 以 4 倍連續稀釋液 ) 加 入, 在 FGFR3-IIIc 實驗中以 5000-1.2ng/ml( 以 4 倍連續稀釋液 ) 加入。溫育 72 小時后, 用 CellTiter-Glo(Promega, Madison, WI) 評價細胞活力。
     細胞增殖測定
     對 于 RT112, RT4 和 TCC-97-7 細 胞 的 增 殖 測 定, 將 3000 細 胞 / 孔 接 種 至 96 孔 微量滴定板中并使其貼壁過夜。然后用含有指定濃度的對照或 R3Mab 的低血清培養基 (0.5% FBS) 更換培養基。 溫育 4 天后, 向每孔中加入 1μCi[ 甲基 -3H] 胸苷 (PerkinElmer, Waltham, MA), 并另外溫育 16 小時。使用 Packard Filtermate Harvester 將細胞轉移 至 UniFilters, 并使用 TopCount(PerkinElmer) 測量摻入至生長細胞的基因組 DNA 中的 3 [ H]- 胸苷。在一些情況下, 在與抗體溫育 4 天后用 CellTiter-Glo(Promega) 評價細胞活 力。值表示為四次實驗的均值 +/-SE。
     克隆生長測定
     根據前述的試驗方案 (50) 評價 R3Mab 對細胞克隆形成能力的作用。簡言之, 400 個 UMUC-14 細胞接種至 6 孔板中補充了 10%胎牛血清的 DMEM 培養基中, 使其貼壁過夜。然 后加入在 0.1% BSA 培養基中稀釋的 R3Mab 或對照抗體至 10μg/ml 的終濃度。僅使用等體 積的 0.1% BSA 培養基 ( 模擬 (Mock)) 用作另一對照。細胞孵育約 12 天直至對照組中的細 胞形成足夠大的集落。集落用 0.5%結晶紫染色, 使用 GelCount(Oxford, UK) 定量集落的 數目和大小。直徑大于 120μm 的集落的數目表示為均值 +/-SEM(n = 12)。
     免疫沉淀和免疫印跡分析
     為了研究抗體對 FGFR3 信號傳導的作用, 將細胞在無血清培養基中饑餓過夜, 然 后開始處理。細胞與在 0.1% BSA(w/v), RPMI 1640 培養基中稀釋的任一種抗體, 或與僅 0.1% BSA 培養基 ( 模擬 ) 溫育。在 37℃下 3 小時后, 將 FGF1( 終濃度為 15ng/ml) 和肝素 ( 終濃度為 5-10μg/ml) 加入至一半樣品中。作為對照, 僅將相似體積的肝素加入至另一 半樣品中。繼續溫育 10min。通過抽吸移除上清液, 并用冰冷的 PBS 洗滌細胞, 然后在補充 了 1mM 原釩酸鈉和完全蛋白酶抑制劑混合物 (Roche Applied Science, Indianapolis, IN) 的 RIPA 緩沖液 (Upstate, Charlottesville, VA) 中裂解。通過離心清除裂解物中的不溶物 質。
     使 用 兔 多 克 隆 抗 體 (sc-123, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) 免 疫 沉 淀 FGFR3 并 通 過 十 二 烷 基 磺 酸 鈉 - 聚 丙 烯 酰 胺 凝 膠 電 泳 (SDS-PAGE) 和 Western 印跡進行分析。用針對磷酸 - 酪氨酸的單克隆抗體 (4G10, Upstate) 評價磷酸 化 FGFR3。 用 針 對 FGFR3 的 單 克 隆 抗 體 (sc-13121, Santa CruzBiotechnology) 探 測 總 FGFR3。使用下列的抗體探測 FGFR3 信號傳導途徑的磷酸化和激活 : 抗 -FGFRY653/654, 抗 -FRS2αY196, 抗 - 磷 酸 -p44/42MAPKT202/Y204, 抗 - 總 p44/42MAPK 和 抗 -AKTS473 獲 自 CellSignalingTechnology( 細胞信號傳導技術 )(Danvers, MA) ; 和抗 - 總 FRS2α(sc-8318) 購 自 Santa Cruz Biotechnology(Santa Cruz 生物技術 )(Santa Cruz, CA)。印跡使用化學 發光底物 (ECL Plus, Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ) 顯色。
     抗體表位作圖
     為了確定 R3Mab 的表位, 合成 13 種重疊肽 ( 每種的長度為 15 個氨基酸 ) 以覆蓋人 FGFR3 從殘基 138 至 310 的細胞外結構域。所述肽在 C- 端被生物素化, 并且在鏈霉抗生物 素蛋白板 (Pierce, Rockford, IL) 上俘獲過夜。在用 PBS/3% BSA 封閉后, 所述板與 R3Mab 溫育, 并使用 HRP- 綴合的抗 - 人 IgG(Jackson Immunoresearch) 和 TMB 過氧化物酶產色底 物 (KPL, Gaithersburg, MD) 檢測。
     小鼠抗人 FGFR3 雜交瘤抗體 1G6, 6G1, 和 15B2 在 ELISA 測定中測試以鑒定它們的 結合表位。1G6, 6G1 和 15B2 結合人 FGFR3IgD2-IgD3(IIIb 和 IIIc 同種型兩者 ), 而 5B8 僅 結合人 FGFR3-IIIb 的 IgD2-IgD3。在競爭測定中, 1G6, 6G1 和 15B2 彼此競爭與人 FGFR3 的 結合, 表明 1G6, 6G1 和 15B2 具有重疊的表位。沒有一種雜交瘤抗體與噬菌體抗體 184.6 競 爭, 表明該雜交瘤抗體具有與 184.6 不同的一個或多個表位。
     小鼠抗 -FGFR3 抗體 1G6, 6G1, 和 15B2 的制備和分子克隆
     將 BALB/c 小鼠用懸浮在單磷酰基脂質 A/ 海藻糖 dicrynomycolate(trehalose dicrynomycolate) 佐劑 (Corixa, Hamilton, MT) 中的 2.0μgFGFR3-IIIb(rhFGFR3(IIIB)/ Fc 嵌 合 體 ( 獲 自 R&D Systems, catalog#1264-FR, lot#CYH025011), 或 用 2.0μg FGFR3-IIIc(rhFGFR3(IIIc)/Fc 嵌 合 體 ( 獲 自 R&D Systems, catalog#766-FR, lot#CWZ055041) 在每只后足墊中一周兩次免疫 12 次。最后一次強化免疫后 3 天, 將腘 淋巴結與小鼠骨髓瘤細胞系 P3X63Ag.U.1 經電融合 (Hybrimune, Cyto Pulse Sciences, GlenBurnie, Maryland) 融 合。 使 用 在 來 自 雜 交 瘤 選 擇 試 劑 盒 (StemCell Technologies, Inc., Vancouver, BC, Canada) 的培養基 D 中的次黃嘌呤 - 氨基蝶呤 - 胸苷 (HAT) 選擇從未融合的腘淋巴結或骨髓瘤細胞中選擇融合的雜交瘤細胞。通過 ELISA 初步 篩選培養上清液結合 FGFR3-IIIb 和 FGFR3-IIIc 的能力, 隨后通過 FACS 篩選目的雜交瘤對 轉染的 FGFR3-IIIb 的 Ba/F 細胞和對照 Ba/F 染色的能力, 以及抗體阻斷活性。然后將選擇 的雜交瘤通過有限稀釋進行克隆。
     使用 RNeasy Mini 試劑盒 (Qiagen, 德國 ) 從產生小鼠抗人 FGFRIII 單克隆抗體 1G6 和 15B2 的雜交瘤細胞中提取總 RNA。使用 RT-PCR 采用下列的簡并引物擴增可變輕鏈 (VL) 和可變重鏈 (VH) 結構域 :
     1G6 :
     輕鏈 (LC) 正向 : 5’ -GTCAGATATCGTKCTSACMCARTCTCCWGC-3’ (SEQ ID NO : 195)
     重鏈 (HC) 正向 :
     5’ -GATCGACGTACGCTGAGATCCARYTGCARCARTCTGG-3’ (SEQ ID NO : 196)
     6G1 :
     輕鏈 (LC) 正向 : 5’ -GTCAGATATCGTGCTGACMCARTCTCC-3’ (SEQ ID NO : 197)
     重鏈 (HC) 正向 :
     5’ -GATCGACGTACGCTGAGATCCARYTGCARCARTCTGG-3’ (SEQ ID NO : 198)
     15B2 :輕鏈 (LC) 正向 : 5’ -GTACGATATCCAGATGACMCARTCTCC-3’ (SEQID NO : 199)
     重鏈 (HC) 正向 :
     5’ -GATCGACGTACGCTGAGATCCARYTGCARCARTCTGG-3’ (SEQ ID NO : 200)
     對于所有三種克隆的輕鏈和重鏈反向引物如下 :
     輕鏈反向 : 5’ -TTTDAKYTCCAGCTTGGTACC-3’ (SEQ ID NO : 201)
     重鏈反向 :
     5’ -ACAGTGGGCCCTTGGTGGAGGCTGMRGAGACDGTGASHRDRGT-3’ (SEQ ID NO : 202)。
     正向引物對 VL 和 VH 區的 N- 端氨基酸序列特異。LC 和 HC 反向引物設計用于分別 與恒定輕鏈 (CL) 和恒定重鏈結構域 1(CH1) 中的區域退火, 它們在物種間是高度保守的。
     將 擴 增 的 VL 克 隆 至 包 含 人 κ 恒 定 結 構 域 的 pRK 哺 乳 動 物 細 胞 表 達 載 體 中 (Shields 等, (2000)J.Biol.Chem.( 生物化學雜志 )276 : 659)。將擴增的 VH 插入至編碼全 長人 IgG1 恒定結構域的 pRK 哺乳動物細胞表達載體中。使用常規方法確定重鏈和輕鏈的 序列。
     結晶、 結構測定和修正
     將人 FGFR3-IIIb ECD( 殘基 143-374) 克隆至 pAcGP67A 載體 (BDBioscience, San Jose, CA) 中, 在 T.ni Pro 細胞中生產并使用 Ni-NTA 柱然后用尺寸排阻層析純化。R3Mab Fab 在大腸桿菌中表達并經蛋白 G 親和柱、 SP 瓊脂糖柱和 Superdex 75 柱連續純化。通過 將 Fab 與過量的 FGFR3ECD 溫育產生 Fab-FGFR3 復合體, 然后該復合體脫糖基化并在 20mM TrisClpH 7.5 和 200mM NaCl 緩沖液中經 Superdex-200 尺寸分離柱 (sizing column) 純 化。匯集包含復合體的級分并濃縮至 20mg/ml, 并用于結晶試驗中。結構測定中使用的晶 體在 4℃下使用蒸汽擴散法從下列條件中生長 : 0.1M 二甲基砷酸鈉 pH 6.5, 40% MPD 和 5% PEG8000。 數據使用 HKL2000 和 Scalepack 處理 (56)。 使用程序 Phaser(57) 和 1RY3(FGFR3) 和 1N8Z(Fab 片段 ) 的坐標采用分子置換解析結構。使用程序 Coot(58) 完成建模, 使用程 序 Refmac(59) 將結構修正為 20.4% /24.3%的 R/Rfree。坐標和結構因子以登錄代碼 3GRW 存放在蛋白數據庫 (Protein Data Bank) 并且還公開在于 2009 年 3 月 25 日提交的 USSN 61/163,222 中, 兩者的內容通過引用合并入本文中。
     ADCC 測定
     人 PBMC 通過肝素化血液的蔗聚糖 (Ficoll) 梯度離心分離, 并且使用作為靶標 的多發性骨髓瘤細胞系 OPM2 或 KMS11 或膀胱癌細胞系 RT112 或 UMUC-14 和作為效應細 胞 的 PBMC 以 1 ∶ 100 的 靶 標 ∶ 效 應 子 比 率 測 量 ADCC。 靶 細 胞 (10,000 細 胞 / 孔 ) 用 R3Mab 或用對照人 IgG1 在 37℃下處理 4 小時。通過使用 CytoTox-ONE 均質膜完整性測定 (HomogeneousMembrane Integrity Assay) 根據生產商 (Promega, Madison, WI) 的說明書通 過測量 LDH 釋放來測定細胞毒性。結果使用下述公式表示為特定細胞裂解的百分比 : 細胞 毒性 (% ) = [( 實驗性裂解 - 實驗性自發裂解 )/( 靶標最大裂解 - 靶標自發裂解 )]x100, 其 中自發裂解是在缺少抗體的條件下的非特異性細胞裂解, 并且靶標最大裂解由 1% Triton X-100 誘發。
     結果
     FGFR3 的可誘導 shRNA 敲低減少了體內膀胱癌生長
     作為評價 FGFR3 對體內腫瘤生長的重要性的開端, 我們檢驗了體外 FGFR3 敲低的作用。在表達 WT(RT112, RT4, SW780) 或突變的 (UMUC-14, S249C 突變 )FGFR3 的膀胱癌細 胞系中, 幾種 FGFR3 小干擾 (si)RNA 有效下調 FGFR3。在所有四種細胞系中 FGFR3 敲低顯著 地抑制培養物的增殖 ( 圖 15)。下一步, 我們產生了表達強力霉素 - 可誘導性 FGFR3shRNA 的穩定的 RT112 細胞系。強力霉素對三種獨立的 FGFR3shRNA 的誘導消除了 FGFR3 表達, 而 靶向 EGFP 的對照 shRNA 的誘導沒有作用 ( 圖 7A)。在缺少外源性 FGF 的條件下, 強力霉素 3 處理減少了表達不同 FGFR3shRNA 的細胞的 [ H]- 胸苷摻入, 但對對照 shRNA 的細胞無作用 ( 圖 7B), 這證實 FGFR3 敲低抑制增殖。對數生長的 RT112 細胞的進一步分析表明用強力霉 素處理 72hr 的 FGFR3 敲低顯著地和特異性地減少了處于細胞周期的 S 和 G2 期的細胞的百 分比, 而伴有處于 G1 期的細胞增加 ( 圖 7C)。使用兩種其他 FGFR3shRNA 觀察到相似的作用 ( 圖 16A)。沒有檢測到顯著數目的具有亞二倍體 DNA 含量的細胞, 表明凋亡水平沒有變化。 因此, FGFR3 敲低對 RT112 細胞的增殖的抑制作用主要歸因于細胞周期進程的減緩。
     我們下一步評價了 FGFR3 敲低對在小鼠中預先建立的 RT112 腫瘤異種移植物的生 長的作用。FGFR3 敲低實質上和特異性地抑腫瘤生長 ( 圖 7D, 上部圖片和圖 16B)。45 天腫 瘤樣品的分析證實了與對照 shRNA 相比 FGFR3shRNA 的強力霉素誘導后的有效 FGFR3 敲低 ( 圖 7D, 底部圖片 )。這些結果證明 FGFR3 在體外和體內對于 RT112 膀胱癌細胞的生長均是 至關重要的。
     阻斷抗 -FGFR3 單克隆抗體的生成
     為了進一步檢驗 FGFR3 在腫瘤生長中的重要性并探究該受體作為治療靶標的可 能性, 我們使用噬菌體展示方法開發了一種拮抗性抗 -FGFR3 單克隆抗體 ( 稱為 R3Mab)。 我 們基于其阻斷 FGFR3 的配體結合和二聚作用兩者的能力, 和其不僅抑制 WT FGFR3 而且抑 制該受體的最普遍的癌癥相關突變體的特有能力選擇了該特殊抗體 ( 見下 )。R3Mab 靶向 FGFR3 的細胞外 IgD2 和 IgD3 結構域, 它們對于 FGF 結合是必需的且是足夠的 (4)。R3Mab 結合人 FGFR3 的 IIIb 和 IIIc 兩種同種型, 而沒有顯示與 FGFR1, FGFR2 或 FGFR4 的可檢測 到的結合 ( 圖 8A)。Biacore 分析表明 R3Mab 與鼠、 食蟹猴和人 FGFR3-IIIc 具有類似的表 觀親和力 ( 未顯示的數據 )。R3Mab 對人 FGFR3 的親和力顯示在表 2 中。
     表 2. 通過 BIAcore 分析測定的 R3Mab 對人 FGFR3 的親和力。
     我們下一步測試了 R3Mab 阻斷 FGFR3 與 FGF1 和 FGF9 結合的能力。 R3Mab 強力地抑 制 FGF1 與 FGFR3-IIIb 和 -IIIc 的結合, 其半最大抑制濃度 (IC50) 分別為 0.3nM 和 1.7nM( 圖 8B, C)。同樣, R3Mab 有效阻斷 FGF9 與 FGFR3-IIIb 和 -IIIc 的結合, 其 IC50 分別為 1.1nM 和 1.3nM( 圖 8D, E)。
     R3Mab 抑制 WT FGFR3 和其最普遍的癌癥相關突變變體
     為了檢驗 R3Mab 是否抑制由 WT 或突變的 FGFR3 驅動的細胞增殖, 我們利用了下面
     的觀察結果, 即鼠原 -B 細胞 Ba/F3 中的異位 FGFR3 表達賦予白介素 (IL)-3- 不依賴性的、 FGF1 依賴性的增殖和存活 (29)。在缺少 FGF1 和 IL-3 的條件下, 穩定表達 WT FGFR3 的 Ba/ F3 細胞不能成活, 而 FGF1 極大地增強了它們的增殖 ( 圖 9A)。R3Mab 以劑量依賴性方式特 異性地阻斷 FGF1- 刺激的 Ba/F3-FGFR3 細胞增殖 ( 圖 9A)。我們下一步評價了在這些細胞 中 R3Mab 對 FGFR3 信號傳導的影響。FGF1 誘導 FGFR3 的磷酸化和激活, 伴有 p44/42MAPK 的 激活, 而 R3Mab 有效地抑制兩種分子的激活 ( 圖 9B)。
     在膀胱癌中, FGFR3 的體細胞激活突變集中在 IgD2 和 IgD3 之間的連接區、 細胞外 近膜結構域、 或激酶結構域內 ( 圖 9C)。細胞外錯義置換最常見地導致未配對的半胱氨酸, 導致 FGFR3 的配體不依賴性二聚作用。這些突變顯著地導致不同水平的組成型 FGFR3 激 活, 可能歸因于對細胞質激酶結構域的取向的差異性影響 (30, 31)。最頻繁發生的突變是 S249C, Y375C, R248C, G372C, 和 K652E, 它們總共占膀胱癌中所有 FGFR3 突變的 98% (32)。 我們推斷最適治療劑應當不僅阻斷 WT FGFR3 蛋白 ( 其在某些癌癥中過表達 ), 而且還阻斷 最多見的腫瘤相關的 FGFR3 突變體。為了進一步評價 R3Mab, 我們生成了穩定表達 5 種最 常見 FGFR3 突變變體的每一種的 Ba/F3 細胞系。所有突變體在細胞表面以相似的水平表 達, 并且半胱氨酸突變體在沒有配體的情況下自發地二聚化 ( 未顯示的數據 )。表達不同 半胱氨酸突變體的細胞系顯示對 FGF1 的生長反應是可變的, 這與早先的發現相符合 (30, R248C 31)。如以前所報道的 (33), 表達 FGFR3 的細胞顯示組成型的、 配體不依賴性的增殖, 并 S249C 且對 FGF1 沒有反應 ( 圖 9D)。同樣, 最頻繁發生的突變 FGFR3 , 賦予配體不依賴性的增 殖 ( 圖 9E)。R3Mab 顯著地抑制由任一種突變體驅動的組成型增殖 ( 圖 9D, E)。表達近膜 G372C Y375C 結構域突變 FGFR3 ( 圖 9F) 或 FGFR3 ( 圖 9G) 的細胞的增殖需要 FGF1, 并且它們的生 K652E 長被 R3Mab 完全阻斷。表達 FGFR3 的細胞顯示弱的配體不依賴性增殖和響應于 FGF1 的 K652E 明顯生長 (33)。R3Mab 不影響 FGFR3 的弱基礎活性 ( 未顯示的數據 ), 但幾乎消除了由 該突變體介導的配體誘導的增殖 ( 圖 9H)。因此, R3Mab 具有抑制 WT FGFR3 和 FGFR3 的常 見的癌癥相關突變體兩者的獨特能力。此外, R3Mab 不顯示可檢測到的激動劑活性。
     作為單獨的嘗試, 我們生成和表征了多種鼠 - 抗 - 人 FGFR3 雜交瘤抗體。沒有一 種雜交瘤抗體可以抑制我們測試的所有癌相關 FGFR3 突變體 ( 圖 17), 它們也不與 R3Mab 共 享重疊表位。
     此外, 所有雜交瘤抗體顯示激動劑活性, 強烈地刺激癌相關的 FGFR3 突變體 R248C 和 S249C 的增殖, 并顯示對突變體 Y375C 和 G370C 的增殖的一些刺激。這些雜交瘤抗體顯 示有差別水平的拮抗和激動作用, 這取決于所測試的 FGFR3 突變體, 如下所示 :
     1G6 FGFR3-IIIb 野生型 FGFR3-IIIb R248C FGFR3-IIIb S249C FGFR3-IIIb Y375C 抑制 2X 刺激 2X 刺激 1.2-1.5X 刺激 6G1 抑制 4-5X 刺激 4-5X 刺激 1.2-1.5X 刺激 15B2 抑制 3-4X 刺激 4-5X 刺激 1.2-1.5X 刺激95102378767 A CN 102378777 FGFR3-IIIb K652E FGFR3-IIIc FGFR3-IIIc G370C
     50%抑制 抑制 無作用說明書60-70%抑制 抑制 20-30%抑制 抑制 抑制 10-2-%抑制92/107 頁因此, 所述雜交瘤抗體顯示了對由不同 FGFR3 變體驅動的 Ba/F3 細胞細胞增殖的 不可預測的差別作用。
     小鼠 - 抗 - 人 FGFR3 雜交瘤抗體的表征
     小鼠抗 - 人 FGFR3 雜交瘤抗體進一步表征如下 :
     (1) 在測試抗 -FGFR3 鼠雜交瘤抗體抑制 FGF1 與人 FGFR3-IIIb 和 IIIc 同種型結合 的能力的測定中, 抗體 1G6, 6G1 和 15B2 能夠以劑量依賴性方式阻斷 FGF1 與人 FGFR3-IIIb 和 IIIc 同種型的結合。當在約 2000 至 0.49ng/ml 的抗體濃度范圍內測試時, 抗體 1G6, 6G1 和 15B2 以 0.69, 0.87 和 0.72nM 的 IC50 值阻斷 FGF1 與 FGFR3-IIIb 的結合。當在約 5000 至 1.2ng/ml 的抗體濃度范圍內測試時, 抗體 1G6, 6G1 和 15B2 分別以 0.57, 3.4 和 0.7nM 的 IC50 值阻斷 FGF1 與 FGFR3-IIIc 的結合。
     (2) 在 測 試 抗 -FGFR3 鼠 雜 交 瘤 抗 體 抑 制 FGF9 與 人 FGFR3-IIIb 和 IIIc 同 種 型結合的能力的測定中, 抗體 1G6, 6G1 和 15B2 以劑量依賴性方式有效地阻斷 FGF1 與人 FGFR3-IIIb 和 IIIc 同種型的結合。當在約 2000 至 0.49ng/ml 的抗體濃度范圍內測試時, 抗體 1G6, 6G1 和 15B2 分別以 0.13, 0.16, 和 0.07nM 的 IC50 值阻斷 FGF9 與 FGFR3-IIIb 的 結合。當在約 5000 至 1.2ng/ml 的抗體濃度范圍內測試時, 抗體 1G6, 6G1 和 15B2 分別以 0.13, 0.11, 和 0.07nM 的 IC50 值阻斷 FGF9 與 FGFR3-IIIc 的結合。
     (3) 使用 Biacore 分析測定全長抗 -FGFR3 鼠雜交瘤抗體 1G6, 6G1 和 15B2 的結合 親和力。這一分析的結果顯示在表 3 中。
     表 3.
     (4) 在測試抗 -FGFR3 鼠雜交瘤抗體抑制由人 FGFR3-IIIb 或 IIIc 驅動的 Ba/F3 細 胞增殖的能力的測定中, 抗體 1G6, 6G1 和 15B2 能夠以劑量依賴性方式阻斷由人 FGFR3-IIIb 或 IIIc 驅動的 Ba/F3 細胞增殖。當在約 0.01 至 100ug/ml 的抗體濃度范圍內測試時, 抗體 1G6, 6G1 和 15B2 分別以 3-5nM, 3nM, 和 6-8nM 的 IC50 值阻斷由 FGFR3-IIIb 驅動的 Ba/F3 細胞增殖, 并且分別以 10-35nM, 24nM, 和 60nM 的 IC50 值阻斷由 FGFR3-IIIc 驅動的 Ba/F3
     細胞增殖。
     (5) 在測試抗 -FGFR3 鼠雜交瘤抗體抑制表達人 FGFR3-IIIb 的 Ba/F3 細胞中的 FGF1- 誘導的信號傳導的能力的測定中, 當在約 0.25 至 6.75ug/ml 的抗體濃度范圍內測試 時, 抗體 1G6, 6G1 和 15B2 能夠以劑量依賴性方式阻斷表達人 FGFR3-IIIb 的 Ba/F3 細胞中 的 FGF1- 誘導的信號傳導。在該實驗中使用 25ng/ml 的 FGF1。在缺少 FGF1 的條件下, 抗體 處理對 FGFR3 激活沒有作用。
     (6) 在測試抗 -FGFR3 鼠雜交瘤抗體抑制表達人 FGFR3-IIIc 的 Ba/F3 細胞中的 FGF1- 誘導的信號傳導的能力的測定中, 當在約 0.25 至 6.75ug/ml 的抗體濃度范圍內測試 時, 抗體 1G6, 6G1 和 15B2 能夠以劑量依賴性方式阻斷表達人 FGFR3-IIIc 的 Ba/F3 細胞中 的 FGF1- 誘導的信號傳導。在該實驗中使用 25ng/ml 的 FGF1。在缺少 FGF1 的條件下, 抗體 處理對 FGFR3 激活沒有作用。
     R3Mab 與 FGFR3 相互作用的結構基礎
     為了了解 R3Mab 與 FGFR3 相互作用的模式, 我們合成了一組跨越 FGFR3-IIIb IgD2 和 D3 區的 13 個重疊肽, 并測試了它們與 R3Mab 的結合。肽 3( 殘基 164-178) 和 11( 殘 基 269-283) 顯示與 R3Mab 的特異性結合, 其中肽 3 具有較強的相互作用 ( 圖 10A), 這表明 FGFR3 上的相應區對于 R3Mab 的識別是至關重要的。以前對與 FGF2 形成復合體的 FGFR1 的 結晶學研究鑒定了參與與 FGF 和肝素直接結合以及受體二聚作用的關鍵性受體殘基 (34)。 FGFR3 肽 3 和 11 與 FGFR1 中功能上重要的位點的比對揭示了這些肽涵蓋對于直接 FGF2 結 合、 受體二聚作用以及與肝素的相互作用至關重要的相應 FGFR1 殘基 ( 圖 10B)。這些數據 表明在 FGFR3 上 R3Mab 的表位與參與配體締合和受體 - 受體相互作用的受體殘基重疊。
     我們下一步結晶了 R3Mab 的 Fab 片段和人 FGFR3-IIIb 的細胞外 IgD2-D3 區之間的 復合體, 并以 和 解析度測定了 X- 線結構 ( 圖 10C, D; 表 4)。在該復合體中, 約的溶劑可及表面積分別包埋在 FGFR3 和 Fab 中。約 80 %被包埋的界面涉及IgD2, 而其余的限定在接頭和 IgD3 區。在復合體的 Fab 側, 約 40%被包埋的界面涉及互補 決定區 (CDR)-H3, 20%涉及 CDR-H2, 20%涉及 CDR-L2, 較少的貢獻來自其他 CDRs 和構架殘 基。值得注意的是, 來自 CDR-H3 的氨基酸 (AAs) 形成兩個 β- 鏈, 其延長了 IgD2 的 β- 折 疊 ( 圖 10D)。Fab 與構成 FGFR3 的 FGF 結合位點的 AAs 和形成受體二聚化界面的殘基相互 作用, 如以前在多種二聚體 FGF : FGFR 復合體 ( 例如, PDB 代碼 1CVS, (34) ; 和圖 10C, 灰色 / 陰影交叉線和深灰色的區域 ) 中所鑒定的那樣。通過結晶學鑒定的相互作用界面與基于肽 的數據完全一致 ( 圖 18A, B)。總之, 這些結果揭示了 R3Mab 如何抑制配體結合, 并且進一 步表明 R3Mab 與 FGFR3 的結合可能防止受體二聚化。接觸 R3Mab 的 FGFR3 氨基酸顯示在表 5 中。對該結構的結晶學坐標以登錄代碼 3GRW 保存在蛋白質數據庫 (Protein Data Bank) 中。
     表4: 結晶學分析的概述
     a b cRsym =∑ |I-|/ ∑ I。 是獨特反射的對稱相關觀測的平均強度。 括號中的數字是指最高的解析度對象 (resolution shell)。R =∑ |Fo-Fc|/ ∑ Fo。Rfree 作為 R 計算, 但用于從所有修正中剔除的 5%的反射。 表5: FGFR3 中與 R3Mab 接觸的殘基 殘基 界面中殘基的被包埋的表面 THR ARG ARG MET LYS LYS 154 155 158 159 161 162 0.10 16.50 105.40 6.00 52.50 1.70LEU 163 12.30
     LEU 164 55.10
     ALA 165 10.10
     VAL 166 10.60
     PRO 167 45.50
     ALA 168 22.60
     ALA 169 63.60
     ASN 170 75.40
     THR 171 83.00
     VAL 172 1.70
     ARG 173 91.70
     PHE 174 1.50
     ARG 175 95.60
     PRO 177 15.90
     GLY 202 2.10
     LYS 205 63.40
     ARG 207 67.60
     GLN 210 31.60
     SER 212 0.40
     VAL 214 26.40
     GLU 216 48.90
     SER 217 1.80
     TYR 241 15.90
     LEU 246 3.10
     GLU 247 1.80
     ARG 248 46.90
     TYR 278 32.20
     SER 279 1.80
     ASP 280 19.80
     ALA 281 3.00
     GLN 282 24.80
     PRO 283 0.50
     SER 314 1.20
     GLU 315 82.60
     SER 316 33.20
     VAL 317 56.60
     GLU 318 51.50
     我們將 R3Mab-FGFR3 結構與以前發表的與 FGF1 形成復合體的 FGFR3-IIIc 的結構 (4, 35) 進行了比較 ( 圖 10E, 10F)。抗體 - 受體和配體 - 受體復合體的重疊揭示了除了區分 FGFR3-IIIc 與 FGFR3-IIIb 的區域以外, 在各個受體結構域內沒有顯著的構象差異 ; 然 而, IgD3 相對于 IgD2 的定向極大地不同 ( 圖 10E, 白色和灰色 ; 圖 10F, 白色和灰色的網 )。 由于 IgD2 和 IgD3 的相對位置對于配體結合是至關重要的, 因此在 R3Mab 結合時 IgD3 所采 取的交替構象可能提供防止配體與 FGFR3 相互作用的另外的機制。
     R3Mab 抑制膀胱癌細胞中的內源性 WT 和突變的 FGFR3
     為了評價 R3Mab 是否能夠抑制膀胱癌細胞中的 FGFR3 功能, 我們首先檢驗了 RT112 和 RT4 細胞系, 它們表達 WT FGFR3。R3Mab 強力地抑制 RT112 細胞的 [3H]- 胸苷摻入 ( 圖 11A) 并且發揮明顯的但較為適度的對 RT4 細胞增殖的抑制 ( 圖 19A)。為了研究 R3Mab 對 FGFR3 激活的作用, 我們檢驗了 RT112 細胞中 FGFR3 的磷酸化。與 Ba/F3-FGFR3 細胞中的結 果 ( 圖 9B) 一致, R3Mab 顯著地減少了 FGF1- 誘導的 FGFR3 磷酸化 ( 圖 11B)。我們下一步 檢驗了 FRS2α, AKT, 和 p44/42MAPK 的磷酸化, 它們三個是 FGFR3 信號傳導的下游介質。在 RT112 細胞中 FGF1 強力地激活這些分子, 而 R3Mab 顯著地消除這種激活 ( 圖 11B)。同樣, 在 RT4 細胞中 R3Mab 抑制 FGF1- 誘導的 FGFR3 和 MAPK 的磷酸化 ( 圖 19B)。
     我們下一步研究了 R3Mab 是否能夠在人膀胱癌細胞中抑制內源性突變的 FGFR3 的 激活。在膀胱癌中 S249C 是最常見的 FGFR3 突變 ( 圖 9C)。兩種可獲得的細胞系 UMUC-14 和 TCC-97-7 攜帶突變的 FGFR3S249C 等位基因 ( 參考文獻 36 和未顯示的數據 )。盡管 R3Mab 不影響培養的 UMUC-14 細胞的對數生長 ( 未顯示的數據 ), 但其明顯地減少了這些細胞的克 隆生長 ( 圖 11C)。具體地, 與對照抗體相比, R3Mab 減少了直徑大于 120μm 的集落數目大 約 77% ( 圖 11D)。此外, R3Mab 抑制培養的 TCC-97-7 細胞的 [3H]- 胸苷摻入 ( 圖 19C)。
     據報道 S249C 突變導致 FGFR3 的配體不依賴性激活 (26, 30)。實際上, 在 UMUC-14 S249C 細胞和 TCC-97-7 細胞中, FGFR3 被組成型地磷酸化, 無論是否用 FGF1 處理, 而在兩種細 S249C 胞系中與對照抗體相比, R3Mab 減少了 FGFR3 的組成型磷酸化 ( 圖 11E, 19D)。 S249C
     R3Ma 抑制 FGFR3 的二聚體形成
     考慮到突變體 FGFR3S249C 可能經歷二硫化物連接的配體不依賴性二聚作用, R3Mab S249C 抑制膀胱癌細胞中組成型 FGFR3 信號傳導和增殖的能力是令人驚奇的 (26, 30)。為了 S249C 探尋 R3Mab 如何抑制 FGFR3 , 我們在 UMUC-14 細胞中檢驗了 R3Mab 對該突變體的低聚 體狀態的作用。在還原條件下, FGFR3S249C 作為~ 97kDa 的單一條帶遷移, 與單體大小一致 ( 圖 12A)。在非還原條件下, 在用對照抗體處理的細胞中, 一個大的 FGFR3S249C 級分作為~ 200kDa 的條帶出現, 無論是否添加 FGF1, 這表示組成型的二聚體狀態 ( 圖 12A)。R3Mab 處 理實質上地減少了二聚體的量, 伴有單體的增加 ( 圖 12A)。與此相一致地, 在 TCC-97-7 細 S249C 胞中 R3Mab 減少了 FGFR3 二聚體的水平, 無論是否用 FGF1 處理 ( 圖 19E)。
     在膀胱癌細胞中 R3Mab 如何減少 FGFR3S249C 二聚體水平?一種可能的解釋是其通 過抗體誘導的 FGFR3 內在化和通過內體或溶酶體運輸而破壞了 FGFR3S249C 二聚體。我們通 過藥理學干預胞吞作用來測試了這種可能性。但 R3Mab 在用多種胞吞作用抑制劑預處理的 UMUC-14 細胞中仍然降低了二聚體的量, 盡管基本上阻斷了 FGFR3S249C 內在化 ( 圖 20A, B)。 S249C 因此, R3Mab 的二聚體破壞不依賴于胞吞作用。另一種可能的解釋是細胞的 FGFR3 可能 S249C 以動態的單體 - 二聚體平衡存在 ; 因此, R3Mab 與單體 FGFR3 的結合可能阻止了二聚體 形成并且因此使該平衡朝向單體狀態改變。為了檢驗這種可能性, 我們使用了非細胞通透 劑 5, 5’ 二硫代雙 2- 硝基苯甲酸 (DTNB), 其選擇性地與未配對的半胱氨酸的游離巰基反應并阻斷該游離的巰基 (37)。用 DTNB 處理 UMUC-14 細胞導致 FGFR3S249C 單體的積聚而二聚體 減少 ( 圖 12B), 表明 FGFR3S249C 以單體和二聚體之間的動態平衡存在。
     為了測試 R3Mab 是否影響該平衡, 我們生成了一種包含 FGFR3S249C 的 IgD2-D3 結構 域的可溶性重組蛋白, 并且通過尺寸排阻層析分離了該二聚體。我們將該二聚體與緩沖液 或抗體在存在非常低濃度的還原劑 (25μMof DTT) 的條件下溫育, 并通過 SDS-PAGE 在非還 原條件下分析該受體的低聚體狀態。與模擬 (mock) 或抗體對照相比, R3Mab 顯著地加速了 S249C 代表單體 FGFR3 的~ 25kDa 條帶的出現, 同時減少了~ 50kDa 二聚體 ( 圖 12C) ; 實際上, 在 R3Mab 的存在下, 到 2hr 時基本上更完全地減少了二聚體。這些結果表明 R3Mab 以利于 單體的方向改變了 FGFR3S249C 的單體和二聚體狀態之間的平衡。
     R3Mab 不促進 FGFR3 下調
     我們通過分析 FGFR3 抗體處理的細胞中 FGFR3 內在化和降解來檢驗 R3Mab( 克隆 184.6.1) 和抗 -FGFR3 雜交瘤抗體對 FGFR3 下調的作用。將表達野生型 FGFR3(RT112) 或突 變的 FGFR3(TCC97-7 中的 S249C) 的膀胱癌細胞系用 R3Mab 或雜交瘤抗體 1G6 或 6G1 處理 4 至 24 小時, 然后收獲細胞裂解物用于總 FGFR3 水平的 western 印跡分析。用 R3Mab 處理 不減少 FGFR3 水平, 而用雜交瘤 mabs 1G6 和 6G1 處理顯著地降低 FGFR3 水平。這些結果提 示 R3Mab 不促進 FGFR3 下調而 mabs 1G6 和 6G1 的確促進 FGFR3 受體內在化和下調。 在單獨 的實驗中, 使用 FACS 分析檢驗表面 FGFR3 水平。R3Mab( 克隆 184.6.1) 處理 UMUC-14 細胞 ( 包含 FGFR3S249C 突變 )24 小時后, 細胞表面 FGFR3 水平輕微升高。這些結果證明 R3Mab 處理不促進 FGFR3 下調。
     在多個腫瘤模型中 R3Mab 抑制生長和 FGFR3 信號傳導
     下一步, 我們檢驗了 R3Mab 在體內對膀胱癌細胞的生長的作用。我們用 RT112 細 胞 ( 其表達 WT FGFR3) 注射 nu/nu 小鼠, 使腫瘤生長至~ 150mm3 的平均體積, 并對動物給 予賦形劑或 R3Mab 一周兩次。在 27 天時與賦形劑對照相比, 以 5 或 50mg/kg 的 R3Mab 處理 分別抑制腫瘤生長約 41%或 73% ( 圖 13A)。處理后 48hr 或 72hr 采集的腫瘤裂解物的分 析顯示 R3Mab 顯著降低磷酸化 FRS2α 的水平 ( 圖 13B)。有趣的是, 在 R3Mab- 處理的腫瘤 中, 總 FRS2α 蛋白水平也較低, 提示抑制 FGFR3 可以進一步導致 FRS2α 的下調。R3Mab 還 降低腫瘤中磷酸化 MAPK 的量, 而不影響總 MAPK 水平 ( 圖 13B)。因此, R3Mab 抑制 RT112 腫 瘤異種移植物的生長并阻斷由 WT FGFR3 引起的信號傳導。
     我們下一步研究了 R3Mab 對表達突變 FGFR3 的異種移植物的生長的作用。 R3Mab 處 S249C 理極大地延緩了 Ba/F3-FGFR3 腫瘤的進展 ( 圖 13C)。此外, R3Mab 顯著地抑制 UMUC-14 膀胱癌異種移植物的生長 ( 圖 13D)。為了評價 R3Mab 是否在體內影響 FGFR3S249C 激活, 我 S249C 們評估了處理后 24hr 或 72hr 采集的腫瘤裂解物中的 FGFR3 二聚體水平。在非還原條 S249C 件下, 與對照組相比, 在 R3Mab 處理的腫瘤中 FGFR3 二聚體的量大量降低, 而通過在還原 S249C 條件下檢測到的量判斷, 總 FGFR3 水平顯示很小的變化 ( 圖 13E)。 與細胞培養中的結果 S249C 相反, 在腫瘤裂解物中沒有觀察到明顯的 FGFR3 單體的積聚 ( 圖 13E vs.12A)。這可能 是因為在非還原條件下本研究中使用的兔多克隆抗 -FGFR3 抗體對單體 FGFR3 的檢測靈敏 度較弱的緣故 ( 圖 21)。重要的是, R3Mab 還顯著地抑制 UMUC-14 腫瘤中 MAPK 的磷酸化和 激活 ( 圖 13E), 提示 R3Mab 在體內抑制 FGFR3S249C 的活性。在任一項體內研究中我們均沒有 觀察到顯著的體重減輕或其他顯著的異常。 此外, 在小鼠中進行的安全性研究中, 與人和鼠FGFR3 兩者以類似的親和性結合的 R3Mab 在任何器官 ( 包括膀胱 ) 中均沒有顯示任何可分 辨的毒性 ( 未顯示的數據 )。 總之, 這些數據表明在小鼠中可良好地耐受對 R3Mab 的多次暴 露。
     R3Mab 在多發性骨髓瘤異種移植物模型中的抗腫瘤活性涉及 ADCC
     為了評估 R3Mab 是否可能具有對多發性骨髓瘤的治療潛力, 我們首先測試了 R3Mab 對三種培養的 t(4 ; 14)+ 細胞系的增殖和存活的作用。 UTMC-2 細胞攜帶 WT FGFR3, 而 OPM2 和 KMS11 分別帶有 K650E 和 Y373C 置換 (7)。在培養中, R3Mab 完全消除了 FGF9- 誘 導的 UTMC-2 細胞的增殖 ( 圖 22A)。R3Mab 適度地抑制了 OPM2 細胞的生長, 但對 KMS11 細 胞的增殖沒有明顯作用 ( 圖 22B, C)。由于 UTMC-2 細胞在小鼠中不形成腫瘤, 我們評價了 R3Mab 針對 OPM2 和 KMS11 腫瘤的功效。R3Mab 幾乎完成消除了兩種細胞系的異種移植物腫 瘤生長 ( 圖 14A, B)。
     R3Mab 在體外和體內針對 OPM2 和 KMS11 腫瘤細胞的活性的顯著差異提示 R3Mab 可 能能夠支持 Fc- 介導的針對這些過表達 FGFR3 的腫瘤的免疫效應子功能的可能性。兩種細 胞系均表達高水平的 CD55 和 CD59( 未顯示的數據 ), 它們是補體途徑的兩種抑制劑 ; 因此, 沒有觀察到補體依賴的細胞毒性 ( 未顯示的數據 )。然后, 我們集中于 ADCC。當抗體在靶 細胞上與其抗原結合時發生 ADCC, 并且經由其 Fc 區, 連接免疫效應細胞上表達的 Fcγ 受 體 (FcγRs)(38)。為了在體外測試 ADCC, 我們將 KMS11 或 OPM2 細胞與剛分離的人外周血 單核細胞 (PBMC) 在存在 R3Mab 或對照抗體的條件下溫育。 R3Mab 介導針對兩種骨髓瘤細胞 系的顯著的 PBMC 細胞裂解活性 ( 圖 14C, D)。相反, R3Mab 不支持膀胱癌 RT112 或 UMUC-14 細胞的細胞裂解 ( 圖 14E, F)。當通過 Scatchard 分析測量時, 多發性骨髓瘤細胞比膀胱癌 細胞系表達實質上更多的細胞表面 FGFR3( ~ 5-6 倍多的受體 / 細胞 ; 圖 23A, B)。
     為 了 了 解 ADCC 對 R3Mab 的 體 內 活 性 的 貢 獻, 我 們 將 以 前 表 征 的 D265A/ N297A(DANA) 突變引入至抗體的 Fc 結構域中。抗體的 Fc 結構域中的這種雙重置換消除了 其與 FcγRs 的結合 (39), 阻止了對免疫效應細胞的募集。DANA 突變不改變 R3Mab 與 FGFR3 的結合或在體外對 FGFR3 活性的抑制, 也不改變小鼠中 R3Mab 的藥代動力學 ( 未顯示的數 據); 然而, 其基本上消除了針對 OPM2 或 KMS11 異種移植物的體內活性 ( 圖 14G, H)。相反, DANA 突變不改變 R3Mab 針對 RT112 和 UMUC-14 膀胱癌異種移植物的抗 - 腫瘤活性 ( 圖 24A, B)。總之, 這些結果提示 Fc- 依賴性的 ADCC 在 R3Mab 針對 OPM2 和 KMS11 多發性骨髓瘤異 種移植物的功效中具有重要的作用。
     其他異種移植物研究
     R3Mab( 克隆 184.6.1N54S) 進一步如下表征 :
     (a) 基本上如上所述, 使用基于肝癌細胞系 (Huh7) 的腫瘤異種移植物模型測試 R3Mab 的體內功效。當以 5mg/kg 和 30mg/kg 的抗體濃度測試時, R3Mab 在體內顯著抑制腫 瘤生長。與對照動物中的腫瘤生長相比, 腫瘤生長被抑制約 50%。
     (b) 基本上如上所述, 使用基于乳腺癌細胞系 (Cal-51)( 其表達 FGFR3) 的腫瘤異 種移植物模型測試 R3Mab 的體內功效。 來自該功效研究的結果表明當以約 1mg/kg 至 100mg/ kg 范圍內的抗體濃度測試時, R3Mab 能夠在體內抑制腫瘤。與對照動物中的腫瘤生長相比, 腫瘤生長被抑制約 30%。
     討論在 t(4 ; 14)+ 多發性骨髓瘤患者中 FGFR3 過表達與預后差的關聯性和在幾個實驗 模型中激活的 FGFR3 的轉化活性已經將 FGFR3 確定為這種血液惡性腫瘤中的一個重要致癌 驅動物且因此是潛在的治療靶標。相反, 盡管在膀胱癌中報道有高頻率的 FGFR3 突變和 / 或過表達 (24, 25, 40), 但在體內還沒有確定 FGFR3 信號傳導在這種上皮惡性腫瘤中的關鍵 作用。此外, 抑制 FGFR3 在膀胱癌中的治療潛力還有待確定。在此我們顯示遺傳或藥理學 干預 FGFR3 抑制小鼠中幾種人膀胱癌異種移植物的生長。這些結果證明 FGFR3 功能在這種 背景中對于腫瘤生長是至關重要的, 強調了該受體作為膀胱癌中的致癌驅動物和治療靶標 的潛在重要性。FGFR3 功能的阻斷以類似的方式抑制表達 WT 或突變 FGFR3 的異種移植物 的生長, 提示該受體的兩種形式可以顯著地促進膀胱腫瘤的進展。雖然不及在膀胱癌中頻 繁, 但 FGFR3 突變或過表達在其他實體惡性腫瘤中也已經被鑒定到, 包括子宮頸癌 (40), 肝 細胞癌 (41) 和非小細胞肺癌 (42, 43), 提示了 FGFR3 對其他類型上皮癌的潛在貢獻。
     FGFR3 在各種惡性腫瘤中的明顯參與使該受體被鑒定為靶向治療的一個吸引人的 候選物。盡管已經記載了可以抑制 FGFR3 激酶活性的小分子化合物 (18-22, 44), 但 FGFR 家族內激酶結構域的密切同源性已經妨礙了 FGFR3- 選擇性抑制劑的開發。已報道的抑制 劑缺少選擇性使得難以辨別 FGFR3 對特定癌癥類型的生物學的相對貢獻度 ; 此外, 其可能 帶有安全性責任, 有最大劑量水平的限制, 并且因此限制了對 FGFR3 的最適抑制。因此, 為 了實現對 FGFR3 的選擇性和特異性靶向, 我們轉向了基于抗體的策略。我們的理由是最適 的治療性抗體應當能夠不僅阻斷 WT 而且能夠阻斷 FGFR3 的常見癌癥相關突變體。此外, 已知 FGFR3 的二聚作用對于其激活是至關重要的, 不僅阻斷配體結合而且干預受體二聚作 用的抗體可能是較佳的。其他所需的性質將包括支持 Fc 介導的效應子功能的能力和全長 抗體的天然構架所賦予的長血清半衰期。我們將我們的篩選和改造工作集中于鑒定結合 了所有這些特征的抗體分子, 從而產生了 R3Mab。結合研究證明 R3Mab 與 FGF 配體競爭與 FGFR3 的 IIIb 和 IIIc 同種型兩者的相互作用的能力。使用轉染的 BaF/3 細胞系的更多實 驗證實了 R3Mab 阻斷 WT 和常見的癌癥相關 FGFR3 突變體的卓越能力。另外, R3Mab 在表達 S249C WT FGFR3 或 FGFR3 ( 其是這種疾病中該受體的最常見突變體 ) 的膀胱癌的幾種異種移 植物模型中發揮了明顯的抗 - 腫瘤活性。藥效學研究提示 R3Mab 在這些模型中的抗腫瘤活 性基于對 FGFR3 信號傳導的抑制, 這顯然是通過消除其下游調控劑 FRS2α 和 MAPK 的磷酸 化。這些數據進一步強化了這樣的結論, 即 FGFR3 是膀胱腫瘤進展所必需的, 如通過我們的 FGFR3shRNA 研究所證明的那樣。
     膀胱癌中的 FGFR3 突變代表了實體惡性腫瘤中蛋白激酶最頻繁發生的致癌變化 之一, 使人想起了黑色素瘤中 B-Raf 的常見突變 (45)。 FGFR3 中的大多數激活的突變產生未 配對的半胱氨酸, 導致配體不依賴性的受體二聚作用, 并且導致各種程度的組成型激活。 以 前使用單價抗 -FGFR3Fab 片段的研究表明針對特定 FGFR3 突變體的差別性抑制活性 (46) ; 然而, 并沒有研究這種可變作用的分子基礎。 與單價抗體片段相比, 二價抗體具有誘導抗原 聚集的能力, 并且在受體酪氨酸激酶的情況下, 可以導致受體低聚化和激活。 盡管其全長的 二價構象, R3Mab 顯示對 WT FGFR3 和廣譜 FGFR3 突變體的普遍抑制, 包括這樣的變體, 它們 G372C Y375C R248C S249C 是配體依賴的 (FGFR3 , FGFR3 ), 組成型活性的 (FGFR3 , FGFR3 ), 或具有兩種性 K652E 質 (FGFR3 )。這些結果提出了這樣的問題 : R3Mab 如何對抗 WT 和各種 FGFR3 突變體 ( 包 括二硫化物連接的變體 ) ?基于與 FGFR1 的序列比對, 被 R3Mab 識別的肽表位與參與結合配體和肝素以及受 體二聚作用的 FGFR3 殘基重疊。該結論通過 R3Mab 與 FGFR3 的細胞外區之間的復合體的結 晶學研究的證實。 X- 線結構揭示所述抗體結合 IgD2 和 IgD3 的區域, 所述區域對于配體 - 受 體相互作用以及受體 - 受體接觸是至關重要的。因此, R3Mab 可以通過競爭配體結合并通 過阻止受體二聚作用來阻斷 WT FGFR3。R3Mab 可以采用類似的機制來抑制 FGFR3K652E, 后者 具有低組成型活性, 但需要配體用于完全激活。此外, R3Mab 的結合改變了 FGFR3IgD3 相對 于 IgD2 的相對方向。這個發現提出了這樣一種形式上的可能性, 即該抗體也可以通過強迫 形成不導致信號轉導的構象 ( 這種想法需要進一步研究 ) 來抑制受體激活。
     為了更好地了解 R3Mab 如何阻斷具有未配對的半胱氨酸的 FGFR3 變體, 我們更詳 S249C 細地分析了最常見的突變體 FGFR3 。使用游離巰基阻斷劑 DTNB 的實驗表明 FGFR3S249C 的單體和二聚體狀態之間的動態平衡。對于 NMDA 受體已經報道了通過內源性氧化還原調 節劑調控氧化和還原狀態之間的類似平衡 (46)。將表達 FGFR3S249C 的膀胱癌細胞與 R3Mab 溫育導致受體二聚體量的減少并伴有單體水平的增加。此外, 純化的 FGFR3S249C 的 IgD2-D3 片段在溶液中形成二聚體 ; 當與 R3Mab 溫育時, 二聚體不斷地消失, 而單體 FGFR3S249C 積聚。 綜合結構分析, 這些結果提示 R3Mab 俘獲單體 FGFR3S249C 并阻礙其二聚化。隨著時間推移, R3Mab 使平衡朝向單體狀態遷移, 阻斷組成型受體活性。 這一機制也可以解釋 R3Mab 如何抑 制 FGFR3 的其他半胱氨酸突變體。
     該研究的另一重要發現是在體內 R3Mab 針對 t(4 ; 14)+ 多發性骨髓瘤細胞系 OPM2 和 KMS11 的有效抗腫瘤活性。 相反, R3Mab 對培養中的這些細胞的增殖或存活具有中度至最 小的影響。OPM2 和 KMS11 細胞表達相對高水平的細胞表面 FGFR3( 比 RT112 和 UMUC-14 膀 胱癌細胞高 4-5 倍 )。這些較高的抗原密度可以允許 R3Mab 支持有效募集攜帶 FcγR 的免 疫效應細胞并激活 ADCC。實際上, 在人 PBMC 的存在下, R3Mab 介導 OPM2 和 KMS11 細胞的細 胞裂解, 但不介導 RT112 或 UMUC-14 膀胱癌細胞的細胞裂解。此外, R3Mab 的 DANA 突變形 式不能夠結合 FcγR, 其在體內對 KMS11 或 OPM2 的生長沒有作用, 但仍然與 R3Mab 相似地抑 制 RT112 和 UMUC-14 腫瘤的生長。總之, 這些數據表明 R3Mab 具有抗腫瘤活性的雙重機制 : (a) 在表達較低表面水平的 WT 或突變 FGFR3 的細胞中, 其阻斷配體依賴性或組成型信號傳 導; (b) 在表達相對高的表面 FGFR3 水平的細胞中, 其誘導 ADCC。
     我們的結果還提出了一些新的問題。首先, 還不知道在此研究中測試的膀胱癌細 胞系為什么顯示對 R3Mab 的可變敏感性。這種差別性的反應對于靶向治療是普遍的, 其可 能反映了每種腫瘤的顯著不同的基因組成。實際上, Her2- 陽性乳腺癌細胞顯示對抗 -Her2 抗體的可變敏感性 (48), 正如多種癌細胞對抗 -EGFR 抗體的反應那樣 (49)。 在這種情形下, 急切需要開發另外的具有 WT 和突變 FGFR3 的膀胱癌的體內模型以在動物中評估對 FGFR3 分子的敏感性。此外, 對預測性生物標志物的闡明可以有助于識別可能從 FGFR3 靶向治療 中最適宜受益的患者。其次, 因為在我們檢驗的模型中 R3Mab 不誘導腫瘤消退, 因此未來的 研究應該探尋 R3Mab 是否可以與已確定的治療劑協同作用。
     總之, 我們的發現暗示 WT 和突變 FGFR3 兩者對于膀胱癌生長是重要的, 因此將該 受體的體內致癌參與作用從血液惡性腫瘤擴展至上皮惡性腫瘤。此外, 我們的結果證明可 以使用全長抗體在腫瘤中有效地靶向 WT 和突變 FGFR3 兩者, 所述全長抗體綜合了阻斷配體 結合、 受體二聚作用和信號傳導以及促進通過 ADCC 裂解腫瘤細胞的能力。這些結果為在與FGFR3 相關的多種多樣的惡性腫瘤中研究基于抗體的靶向 FGFR3 的治療提供了強有力的基 本原理。
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     本申請要求于 2009 年 3 月 25 日提交的美國專利申請號 61/163,222 的優先權, 該 申請的內容通過引用合并于本文。
    【發明領域】
     本發明總體上涉及分子生物學領域。更具體地, 本發明涉及抗 -FGFR3 抗體及其用 途。
     發明背景
     成纖維細胞生長因子 (FGFs) 和它們的受體 (FGFRs) 在胚胎發育、 組織內環境穩定 和代謝過程中具有關鍵性的作用 (1-3)。在人類中, 存在 22 種 FGFs(FGF1-14, FGF16-23) 和 4 種具有酪氨酸激酶結構域的 FGF 受體 (FGFR1-4)。FGFR 由具有兩個或三個免疫球蛋白 樣結構域 (IgD1-3) 的細胞外配體結合區, 單次跨膜區和細胞質的分開的酪氨酸激酶結構 域組成。FGFR1, 2 和 3 各自具有兩個主要的選擇性剪接同種型, 稱為 IIIb 和 IIIc。這些 同種型在后半個 IgD3 中有約 50 個氨基酸的差異, 并且具有截然不同的組織分布和配體特 異性。通常, IIIb 同種型見于上皮細胞中, 而 IIIc 在間充質細胞中表達。在與硫酸乙酰肝 素蛋白聚糖 (heparan sulfateproteoglycans) 協同結合 FGF 后, FGFR 二聚化并且在特定 的酪氨酸殘基處磷酸化。這有助于募集關鍵性的銜接蛋白 (adaptor protein), 諸如 FGFR 底物 2α(FRS2α), 導致多個信號傳導級聯的激活, 包括促分裂原活化蛋白激酶 (MAPK) 和 PI3K-AKT 途徑 (1, 3, 4)。 因此, FGF 和它們的同源受體以前后相關 (context-dependent) 的 方式調節眾多的細胞過程, 包括增殖、 分化、 遷移和存活。
     異常激活的 FGFRs 已經被認為與特定的人惡性腫瘤有關 (1, 5)。特別地, t(4 ; 14) (p16.3 ; q32) 染色體易位發生在約 15-20%的多發性骨髓瘤患者中, 導致 FGFR3 的過度表達 并且與較短的總存活時間相關 (6-9)。FGFR3 也與賦予培養中的骨髓瘤細胞系以化學抗性 有關 (10), 這與 t(4 ; 14)+ 患者對常規化療的臨床反應差相一致 (8)。突變活化的 FGFR3 的 過度表達足以誘導造血干細胞和成纖維細胞 (11-14, 15)、 轉基因小鼠模型 (16)、 和鼠骨髓 移植模型 (16, 17) 中的癌性轉化。因此, FGFR3 已經被提議作為多發性骨髓瘤中的潛在治 療靶標。實際上, 靶向 FGFRs 的幾種小分子抑制劑, 盡管對 FGFR3 沒有選擇性并且針對某些 其他激酶具有交叉抑制活性, 但已經證明針對培養中和小鼠模型中的 FGFR3- 陽性骨髓瘤 細胞具有細胞毒性 (18-22)。
     還已經記載了在大部分膀胱癌癥中存在 FGFR3 過度表達 (23, 24)。此外, 已經 在 60-70 %的乳頭狀膀胱癌和 16-20 %的肌肉侵襲性膀胱癌中鑒定到 FGFR3 的體細胞激 活突變 (24, 25)。在細胞培養實驗中, RNA 干擾 (11, 26) 或 FGFR3 單鏈 Fv 抗體片段抑制 膀胱癌細胞增殖 (27)。近來的研究證明 FGFR3 抗體 - 毒素綴合物通過 FGFR3- 介導的毒 素遞送至腫瘤而減弱膀胱癌細胞系的異種移植物的生長 (28)。然而, 仍然不清楚 FGFR3 信號傳導是否的確是膀胱腫瘤體內生長的致癌驅動力。此外, 基于體內模型還沒有明確 在膀胱癌中靶向 FGFR3 的治療可能性。涉及 FGFR3 和抗 -FGFR3 抗體的出版物包括美國專 利 公 開 號 2005/0147612 ; Rauchenberger 等, J BiolChem( 生 物 化 學 雜 志 )278(40) : 38194-38205(2003) ; WO2006/048877 ; Martinez-Torrecuadrada 等, (2008)Mol Cancer Ther( 分 子 癌 癥 治 療 )7(4) : 862-873 ; WO2007/144893 ; Trudel 等 .(2006)107(10) : 4039-4046 ; Martinez-Torrecuadrada 等 (2005)Clin Cancer Res( 臨床癌癥研究 )11(17) : 6280-6290 ; Gomez-Roman 等 (2005)Clin Cancer Res( 臨 床 癌 癥 研 究 )11 : 459-465 ; Direnzo, R 等 (2007)Proceedings of AACR Annual Meeting(AACR 年 會 進 展 ),摘 要 No.2080 ; WO2010/002862。
     很明顯持續存在著對具有臨床屬性的藥劑的需求, 所述藥劑最適于開發為治療 劑。本文所述的發明滿足此需求并且提供其他益處。
     本文引用的所有參考文獻, 包括專利申請和出版物的全部內容通過引用合并。
     發明概述
     本發明部分地基于多種 FGFR3 結合劑 ( 諸如抗體, 及其片段 ) 的鑒定。FGFR3 呈 現了重要的和有利的治療靶標, 并且本發明基于所述試劑與 FGFR3 的結合提供了組合物和 方法。本發明的 FGFR3 結合劑, 如本文所述, 提供了用于靶向與 FGFR3 信號傳導途徑的表達 和 / 或活性相關的病理學狀況的重要的治療劑和診斷劑。因此, 本發明提供了與 FGFR3 結 合相關的方法、 組合物、 試劑盒和制品。 本發明提供了與 FGFR3 結合的抗體。在一個方面, 本發明的特征在于與 FGFR3 結 合的分離抗體。在一些實施方案中, 所述抗體結合 FGFR3IIIb 同種型和 / 或 FGFR3IIIc 同 種型。在一些實施方案中, 所述抗體結合突變的 FGFR3( 例如, FGFR3 IIIb R248C, S249C, G372C, Y375C, K652E, 中的一種或多種和 / 或 FGFR3 IIIc R248C, S249C, G370C, Y373C, K650E 中的一種或多種 )。在一些實施方案中, 所述抗體結合單體的 FGFR3( 例如, 單體的 FGFR3IIIb 和 / 或 IIIc 同種型 )。在一些實施方案中, 所述抗體促進單體 FGFR3 的形成, 諸 如通過穩定與二聚體 FGFR3 形式相關的單體 FGFR3 形式。
     在一個方面, 本發明提供了分離的抗 -FGFR3 抗體, 其中所述抗體的全長 IgG 形式 -7 以 1x10 或更強的 Kd 結合人 FGFR3。如本領域中眾所周知的那樣, 配體與其受體的結合親 合力可以使用多種測定中的任一種來測定, 并且可以按照多種定量值來表示。因此, 在一 個實施方案中, 結合親合力表示為 Kd 值并且反映固有的結合親合力 ( 例如, 具有最小化的 抗體親抗原性效應 (avidity effect))。通常和優選地, 結合親合力在體外測量, 無論是在 無細胞的環境中還是在細胞相關的環境中測量。本領域中已知的許多測定中的任一種, 包 括本文所述的那些, 可以用來獲得結合親合力測量值, 包括, 例如, Biacore, 放射免疫測定 -8 (RIA), 和 ELISA。在一些實施方案中, 所述抗體的全長 IgG 形式以 1x10 或更強的 Kd, 以 -9 -10 1x10 或更強的 Kd, 或以 1x10 或更強的 Kd 結合人 FGFR3。
     通常, 本發明的抗 -FGFR3 抗體是拮抗劑抗體。因此, 在一個方面, 所述抗 -FGFR3 抗體抑制 FGFR3 活性 ( 例如, FGFR3-IIIb 和 / 或 FGFR3-IIIc 活性 )。在一些實施方案中, 抗 -FGFR3 抗體 ( 通常以二價形式 ) 不具有實質的 FGFR3 激動劑功能。在一些實施方案中, 抗 -FGFR3 拮抗劑抗體 ( 通常以二價形式 ) 具有很少或沒有 FGFR3 激動劑功能。 在一個實施 方案中, 本發明的抗體 ( 通常以二價形式 ) 不顯示超出本底水平的有統計學顯著性的 FGFR3 激動劑活性水平。
     在一個方面, 所述抗體與 FGFR3 的結合可以抑制所述受體與另一單位的所述受體
     在一個方面, 本發明提供了分離的抗 -FGFR3 抗體, 其中所述抗體的全長 IgG 形式 -7 以 1x10 或更強的 Kd 結合人 FGFR3。如本領域中眾所周知的那樣, 配體與其受體的結合親 合力可以使用多種測定中的任一種來測定, 并且可以按照多種定量值來表示。因此, 在一 個實施方案中, 結合親合力表示為 Kd 值并且反映固有的結合親合力 ( 例如, 具有最小化的 抗體親抗原性效應 (avidity effect))。通常和優選地, 結合親合力在體外測量, 無論是在 無細胞的環境中還是在細胞相關的環境中測量。本領域中已知的許多測定中的任一種, 包 括本文所述的那些, 可以用來獲得結合親合力測量值, 包括, 例如, Biacore, 放射免疫測定 -8 (RIA), 和 ELISA。在一些實施方案中, 所述抗體的全長 IgG 形式以 1x10 或更強的 Kd, 以 -9 -10 1x10 或更強的 Kd, 或以 1x10 或更強的 Kd 結合人 FGFR3。
     通常, 本發明的抗 -FGFR3 抗體是拮抗劑抗體。因此, 在一個方面, 所述抗 -FGFR3 抗體抑制 FGFR3 活性 ( 例如, FGFR3-IIIb 和 / 或 FGFR3-IIIc 活性 )。在一些實施方案中, 抗 -FGFR3 抗體 ( 通常以二價形式 ) 不具有實質的 FGFR3 激動劑功能。在一些實施方案中, 抗 -FGFR3 拮抗劑抗體 ( 通常以二價形式 ) 具有很少或沒有 FGFR3 激動劑功能。 在一個實施 方案中, 本發明的抗體 ( 通常以二價形式 ) 不顯示超出本底水平的有統計學顯著性的 FGFR3 激動劑活性水平。
     在一個方面, 所述抗體與 FGFR3 的結合可以抑制所述受體與另一單位的所述受體
     的二聚作用, 從而抑制所述受體的激活 ( 至少部分由于缺乏受體二聚作用導致 )。 抑制可以 是直接的或間接的。
     在一個方面, 本發明提供了抗 -FGFR3 抗體, 其不具有實質的凋亡活性 ( 例如, 不誘 導細胞的凋亡, 所述細胞例如, 移行性細胞癌細胞或多發性骨髓瘤細胞, 諸如包含 FGFR3 易 位, 諸如 t(4 ; 14) 易位的多發性骨髓瘤細胞 )。在一些實施方案中, 抗 -FGFR3 抗體擁有很 少或沒有凋亡功能。在一些實施方案中, 所述 FGFR3 抗體不顯示超出本底水平的有統計學 顯著性的凋亡功能。
     在一個方面, 本發明提供了抗 -FGFR3 抗體, 其不誘導實質的 FGFR3 下調。在一些 實施方案中, 抗 -FGFR3 抗體誘導很少的或不誘導受體下調。在一些實施方案中, FGFR3 抗 體不誘導超出本底水平的有統計學顯著性的受體下調。
     在一個方面, 本發明提供了抗 -FGFR3 抗體, 其擁有效應子功能。在一個實施方 案中, 效應子功能包括抗體 - 依賴性細胞介導的細胞毒性 (ADCC)。在一個實施方案中, 抗 -FGFR3 抗體 ( 在一些實施方案中, 裸抗 -FGFR3 抗體 ) 能夠殺死細胞, 在一些實施方案中, 殺死多發性骨髓瘤細胞 ( 例如, 包含易位, 例如 t(4 ; 14) 易位的多發性骨髓瘤細胞 )。在一 些實施方案中, 抗 -FGFR3 抗體能夠殺死每個細胞表達約 10,000 或更多個 FGFR3 分子 ( 諸 如每個細胞約 11,000, 約 12,000, 約 13,000, 約 14,000, 約 15,000, 約 16,000, 約 17,000, 約 18,000 或更多個 FGFR3 分子 ) 的細胞。 在其他實施方案中, 所述細胞每個細胞表達約 2000, 約 3000, 約 4000, 約 5000, 約 6000, 約 7000, 約 8000, 或更多個 FGFR3 分子。 在一個方面, 本發明的抗 -FGFR3 抗體抑制組成型 FGFR3 活性。 在一些實施方案中, 組成型 FGFR3 活性是配體依賴性 FGFR3 組成型活性。在一些實施方案中, 組成型 FGFR3 活 性是配體不依賴性組成型 FGFR3 活性。
     在一個方面, 抗 -FGFR3 抗體抑制包含對應于 FGFR3-IIIbR248C 的突變的 FGFR3。如 本文所使用的術語 “包含對應于 FGFR3-IIIbR248C 的突變”理解為包涵 FGFR3-IIIbR248C 和 FGFR3-IIIcR248C, 以及另外的包含在對應于 FGFR3-IIIb R248 的位置處的 R 至 C 突變的 FGFR3 形式。本領域普通技術人員理解如何比對 FGFR3 序列從而鑒定各個 FGFR3 序列之間的對應 殘基, 例如, 比對 FGFR3-IIIc 序列與 FGFR3-IIIb 序列以鑒定 FGFR3 中對應 FGFR3-IIIb 中 的 R248 位置的位置。在一些實施方案中, 所述抗 -FGFR3 抗體抑制 FGFR3-IIIbR248C 和 / 或 FGFR3-IIIcR248C。
     在一個方面, 抗 -FGFR3 抗體抑制包含對應于 FGFR3-IIIbK652E 的突變的 FGFR3。為 了方便起見, 術語 “包含對應于 FGFR3-IIIbK652E 的突變″理解為包涵 FGFR3-IIIbK652E 和 FGFR3-IIIcK650E, 以及另外的包含在對應于 FGFR3-IIIb K652 的位置處的 K 至 E 突變的 FGFR3 形式。本領域普通技術人員理解如何比對 FGFR3 序列從而鑒定各個 FGFR3 序列之間的對應 殘基, 例如, 比對 FGFR3-IIIc 序列與 FGFR3-IIIb 序列以鑒定 FGFR3 中的對應 FGFR3-IIIb 中 的 K652 位置的位置。在一些實施方案中, 所述抗 -FGFR3 抗體抑制 FGFR3-IIIbK652E 和 / 或 FGFR3-IIIcK650E。
     在一個方面, 抗 -FGFR3 抗體抑制包含對應于 FGFR3-IIIbS249C 的突變的 FGFR3。為 了方便起見, 術語 “包含對應于 FGFR3-IIIbS249C 的突變″理解為包涵 FGFR3-IIIb S249C 和 FGFR3-IIIc S249C, 以及另外的包含在對應于 FGFR3-IIIb S249 的位置處的 S 至 C 突變的 FGFR3 形式。 在一些實施方案中, 所述抗 -FGFR3 抗體抑制 FGFR3-IIIbS249C 和 / 或 FGFR3-IIIc
     在一個方面, 抗 -FGFR3 抗體抑制包含對應于 FGFR3-IIIbR248C 的突變的 FGFR3。如 本文所使用的術語 “包含對應于 FGFR3-IIIbR248C 的突變”理解為包涵 FGFR3-IIIbR248C 和 FGFR3-IIIcR248C, 以及另外的包含在對應于 FGFR3-IIIb R248 的位置處的 R 至 C 突變的 FGFR3 形式。本領域普通技術人員理解如何比對 FGFR3 序列從而鑒定各個 FGFR3 序列之間的對應 殘基, 例如, 比對 FGFR3-IIIc 序列與 FGFR3-IIIb 序列以鑒定 FGFR3 中對應 FGFR3-IIIb 中 的 R248 位置的位置。在一些實施方案中, 所述抗 -FGFR3 抗體抑制 FGFR3-IIIbR248C 和 / 或 FGFR3-IIIcR248C。
     在一個方面, 抗 -FGFR3 抗體抑制包含對應于 FGFR3-IIIbK652E 的突變的 FGFR3。為 了方便起見, 術語 “包含對應于 FGFR3-IIIbK652E 的突變″理解為包涵 FGFR3-IIIbK652E 和 FGFR3-IIIcK650E, 以及另外的包含在對應于 FGFR3-IIIb K652 的位置處的 K 至 E 突變的 FGFR3 形式。本領域普通技術人員理解如何比對 FGFR3 序列從而鑒定各個 FGFR3 序列之間的對應 殘基, 例如, 比對 FGFR3-IIIc 序列與 FGFR3-IIIb 序列以鑒定 FGFR3 中的對應 FGFR3-IIIb 中 的 K652 位置的位置。在一些實施方案中, 所述抗 -FGFR3 抗體抑制 FGFR3-IIIbK652E 和 / 或 FGFR3-IIIcK650E。
     在一個方面, 抗 -FGFR3 抗體抑制包含對應于 FGFR3-IIIbS249C 的突變的 FGFR3。為 了方便起見, 術語 “包含對應于 FGFR3-IIIbS249C 的突變″理解為包涵 FGFR3-IIIb S249C 和 FGFR3-IIIc S249C, 以及另外的包含在對應于 FGFR3-IIIb S249 的位置處的 S 至 C 突變的 FGFR3 形式。 在一些實施方案中, 所述抗 -FGFR3 抗體抑制 FGFR3-IIIbS249C 和 / 或 FGFR3-IIIc
     7102378767 A CN 102378777S249C說明書4/107 頁。在一個方面, 抗 -FGFR3 抗體抑制包含對應于 FGFR3-IIIbG372C 的突變的 FGFR3。為 了方便起見, 術語 “包含對應于 FGFR3-IIIbG372C 的突變″理解為包涵 FGFR3-IIIb G372C 和 FGFR3-IIIc G370C, 以及另外的包含在對應于 FGFR3-IIIb G372 的位置處的 G 至 C 突變的 FGFR3 形式。 在一些實施方案中, 所述抗 -FGFR3 抗體抑制 FGFR3-IIIbG372C 和 / 或 FGFR3-IIIc G370C 。
     在一個方面, 抗 -FGFR3 抗體抑制包含對應于 FGFR3-IIIbY375C 的突變的 FGFR3。為 了方便起見, 術語 “包含對應于 FGFR3-IIIbY375C 的突變″理解為包涵 FGFR3-IIIbY375C 和 FGFR3-IIIcY373C, 以及另外的包含在對應于 FGFR3-IIIb S249 的位置處的 S 至 C 突變的 FGFR3 形式。在一些實施方案中, 所述抗 -FGFR3 抗體抑制 FGFR3-IIIbY375C 和 / 或 FGFR3-IIIcY373C。
     在 一 個 方 面, 抗 -FGFR3 抗 體 抑 制 (a)FGFR3-IIIbK652E 和 (b)FGFR3-IIIbR248C, FGFR3-IIIbY375C, FGFR3-IIIbS249C, 和 FGFR3IIIb G372C 中的一種或多種。
     在 一 個 方 面, 抗 -FGFR3 抗 體 抑 制 (a)FGFR3-IIIcK650E 和 (b)FGFR3-IIIcR248C, FGFR3-IIIcY373C, FGFR3-IIIcS249C, 和 FGFR3IIIc G370C 中的一種或多種。
     在 一 個 方 面, 抗 -FGFR3 抗 體 抑 制 (a)FGFR3-IIIbR248C 和 (b)FGFR3-IIIbK652E, FGFR3-IIIbY375C, FGFR3-IIIbS249C, 和 FGFR3-IIIbG372C 中的一種或多種。
     在一個方面, 抗 -FGFR3 抗體抑制包含對應于 FGFR3-IIIbY375C 的突變的 FGFR3。為 了方便起見, 術語 “包含對應于 FGFR3-IIIbY375C 的突變″理解為包涵 FGFR3-IIIbY375C 和 FGFR3-IIIcY373C, 以及另外的包含在對應于 FGFR3-IIIb S249 的位置處的 S 至 C 突變的 FGFR3 形式。在一些實施方案中, 所述抗 -FGFR3 抗體抑制 FGFR3-IIIbY375C 和 / 或 FGFR3-IIIcY373C。
     在 一 個 方 面, 抗 -FGFR3 抗 體 抑 制 (a)FGFR3-IIIbK652E 和 (b)FGFR3-IIIbR248C, FGFR3-IIIbY375C, FGFR3-IIIbS249C, 和 FGFR3IIIb G372C 中的一種或多種。
     在 一 個 方 面, 抗 -FGFR3 抗 體 抑 制 (a)FGFR3-IIIcK650E 和 (b)FGFR3-IIIcR248C, FGFR3-IIIcY373C, FGFR3-IIIcS249C, 和 FGFR3IIIc G370C 中的一種或多種。
     在 一 個 方 面, 抗 -FGFR3 抗 體 抑 制 (a)FGFR3-IIIbR248C 和 (b)FGFR3-IIIbK652E, FGFR3-IIIbY375C, FGFR3-IIIbS249C, 和 FGFR3-IIIbG372C 中的一種或多種。
    在 一 個 方 面, 抗 -FGFR3 抗 體 抑 制 (a)FGFR3-IIIcR248C 和 (b)FGFR3-IIIcK650E, FGFR3-IIIcY373C, FGFR3-IIIcS249C, 和 FGFR3-IIIcG370C 中的一種或多種。
     在 一 個 方 面, 抗 -FGFR3 抗 體 抑 制 (a)FGFR3-IIIbG372C 和 (b)FGFR3-IIIbK652E, FGFR3-IIIbY375C, FGFR3-IIIbS249C, 和 FGFR3-IIIbR248C 中的一種或多種。
     在 一 個 方 面, 抗 -FGFR3 抗 體 抑 制 (a)FGFR3-IIIcG370C 和 (b)FGFR3-IIIcK650E, FGFR3-IIIcY373C, FGFR3-IIIcS249C, 和 FGFR3-IIIcR248C 中的一種或多種。
     在一個方面, 抗 -FGFR3 抗體抑制 FGFR3-IIIbR248C, FGFR3-IIIbK652E, FGFR3-IIIbY375C, FGFR3-IIIb S249C, 和 FGFR3-IIIb G372C。
     在一個方面, 抗 -FGFR3 抗體抑制 FGFR3-IIIcR248C, FGFR3-IIIcK650E, FGFR3-IIIcY373C, FGFR3-IIIc S249C, 和 FGFR3-IIIc G370C。
     在一個方面, 本發明提供了分離的抗 -FGFR3 抗體, 其包含 :
     (a) 至少一個、 兩個、 三個、 四個或五個高變區 (HVR) 序列, 所述高變區序列選自 :
     (i)HVR-L1, 其包含序列 A1-A11, 其中 A1-A11 是 RASQDVDTSLA(SEQ ID NO : 87),
     (ii)HVR-L2, 其包含序列 B1-B7, 其中 B1-B7 是 SASFLYS(SEQ IDNO : 88),
     (iii)HVR-L3, 其包含序列 C1-C9, 其中 C1-C9 是 QQSTGHPQT(SEQ ID NO : 89),
     (iv)HVR-H1, 其包含序列 D1-D10, 其中 D1-D10 是 GFTFTSTGIS(SEQ ID NO : 84),
     (v)HVR-H2, 其包含序列 E1-E18, 其中 E1-E18 是 GRIYPTSGSTNYADSVKG(SEQ ID NO : 85), 和
     (vi)HVR-H3, 其包含序列 F1-F20, 其中 F1-F20 是 ARTYGIYDLYVDYTEYVMDY(SEQ ID NO : 86) ; 和
     (b) 至少一個變體 HVR, 其中所述變體 HVR 序列包含 SEQ IDNOS : 1-18, 48-131 和 140-145 中所示的序列的至少一個殘基 ( 至少兩個殘基, 至少三個或更多個殘基 ) 的修飾。 所述修飾合意的是置換、 插入或缺失。
     在 一 個 方 面, 抗 -FGFR3 抗 體 抑 制 (a)FGFR3-IIIbG372C 和 (b)FGFR3-IIIbK652E, FGFR3-IIIbY375C, FGFR3-IIIbS249C, 和 FGFR3-IIIbR248C 中的一種或多種。
     在 一 個 方 面, 抗 -FGFR3 抗 體 抑 制 (a)FGFR3-IIIcG370C 和 (b)FGFR3-IIIcK650E, FGFR3-IIIcY373C, FGFR3-IIIcS249C, 和 FGFR3-IIIcR248C 中的一種或多種。
     在一個方面, 抗 -FGFR3 抗體抑制 FGFR3-IIIbR248C, FGFR3-IIIbK652E, FGFR3-IIIbY375C, FGFR3-IIIb S249C, 和 FGFR3-IIIb G372C。
     在一個方面, 抗 -FGFR3 抗體抑制 FGFR3-IIIcR248C, FGFR3-IIIcK650E, FGFR3-IIIcY373C, FGFR3-IIIc S249C, 和 FGFR3-IIIc G370C。
     在一個方面, 本發明提供了分離的抗 -FGFR3 抗體, 其包含 :
     (a) 至少一個、 兩個、 三個、 四個或五個高變區 (HVR) 序列, 所述高變區序列選自 :
     (i)HVR-L1, 其包含序列 A1-A11, 其中 A1-A11 是 RASQDVDTSLA(SEQ ID NO : 87),
     (ii)HVR-L2, 其包含序列 B1-B7, 其中 B1-B7 是 SASFLYS(SEQ IDNO : 88),
     (iii)HVR-L3, 其包含序列 C1-C9, 其中 C1-C9 是 QQSTGHPQT(SEQ ID NO : 89),
     (iv)HVR-H1, 其包含序列 D1-D10, 其中 D1-D10 是 GFTFTSTGIS(SEQ ID NO : 84),
     (v)HVR-H2, 其包含序列 E1-E18, 其中 E1-E18 是 GRIYPTSGSTNYADSVKG(SEQ ID NO : 85), 和
     (vi)HVR-H3, 其包含序列 F1-F20, 其中 F1-F20 是 ARTYGIYDLYVDYTEYVMDY(SEQ ID NO : 86) ; 和
     (b) 至少一個變體 HVR, 其中所述變體 HVR 序列包含 SEQ IDNOS : 1-18, 48-131 和 140-145 中所示的序列的至少一個殘基 ( 至少兩個殘基, 至少三個或更多個殘基 ) 的修飾。 所述修飾合意的是置換、 插入或缺失。
     在一些實施方案中, HVR-L1 變體包含下列位置的任意組合中的 1-6 個 (1, 2, 3, 4, 5, 或 6 個 ) 置換 : A5(V 或 D), A6(V 或 I), A7(D, E 或 S), A8(T 或 I), A9(A 或 S) 和 A10(V 或 L)。在一些實施方案中, HVR-L2 變體包含下列位置的任意組合中的 1-2 個 (1 或 2 個 ) 置 換: B1(S 或 G), B4(F 或 S 或 T) 和 B6(A 或 Y)。在一些實施方案中, HVR-L3 變體包含下列 位置的任意組合中的 1-6 個 (1, 2, 3, 4, 5, 或 6 個 ) 置換 : C3(G 或 S 或 T), C4(T 或 Y 或 A), C5(G 或 S 或 T 或 A), C6(A 或 H 或 D 或 T 或 N), C7(Q 或 P 或 S), 和 C8(S 或 Y 或 L 或 P 或 Q)。 在一些實施方案中, HVR-H1 變體包含下列位置的任意組合中的 1-3 個 (1, 2, 或 3 個 ) 置換 : D3(S 或 T), D5(W 或 Y 或 S 或 T), D6(S 或 G 或 T)。在一些實施方案中, HVR-H2 變體包含下 列位置的任意組合中的 1-6 個 (1, 2, 3, 4, 5, 或 6) 置換 : E2(R 或 S), E6(Y 或 A 或 L 或 S 或 T), E7(A 或 Q 或 D 或 G 或 Y 或 S 或 N 或 F), E8(A 或 D 或 G), E9(T 或 S), E10(K 或 F 或 T 或 S), E11(Y 或 H 或 N 或 I)。
     在一個方面, 本發明提供了分離的抗 -FGFR3 抗體, 其包含 :
     (a) 至少一個、 兩個、 三個、 四個或五個高變區 (HVR) 序列, 所述高變區序列選自 :
     (i)HVR-L1, 其包含序列 RASQX1X2X3X4X5X6A, 其中 X1 是 V 或 D, X2 是 V 或 I, X3 是 D, E 或 S, X4 是 T 或 I, X5 是 A 或 S, 和 X6 是 V 或 L(SEQID NO : 146),
     (ii)HVR-L2, 其包含序列 X1ASFLX2S, 其中 X1 是 S 或 G 且 X2 是 A 或 Y(SEQ ID NO : 147),
     (iii)HVR-L3, 其包含序列 QQX1X2X3X4X5X6T, 其中 X1 是 G, S 或 T, X2 是 T, Y 或 A, X3 是 G, S, T, 或 A, X4 是 A, H, D, T, 或 N, X5 是 Q, P 或 S, X6 是 S, Y, L, P 或 Q(SEQ ID NO : 148),
     (iv)HVR-H1, 其包含序列 GFX1FX2X3TGIS, 其中 X1 是 S 或 T, X2 是 W, Y, S 或 T, X3 是 S, G, 或 T(SEQ ID NO : 149),
     (v)HVR-H2, 其包含序列 GRIYPX1X2X3X4X5X6YADSVKG, 其中 X1 是 Y, A, L, S, 或 T, X2 是 A, Q, D, G, Y, S, N 或 F, X3 是 A, D, 或 G, X4 是 T 或 S, X5 是 K, F, T, 或 S, X6 是 Y, H, N 或 I(SEQ ID NO : 150), 和
     (vi)HVR-H3, 其包含序列 ARTYGIYDLYVDYTEYVMDY(SEQ IDNO : 151)。
     在一些實施方案中, HVR-L1 包含序列 RASQX1VX2X3X4VA, 其中 X1 是 V 或 D, X2 是 D, E 或 S, X3 是 T 或 I, X4 是 A 或 S(SEQ ID NO : 152)。在一些實施方案中, HVR-L3 包含序列 QQX1X2X3X4X5X6T, 其中 X1 是 S, G, 或 T, X2 是 Y, T, 或 A, X3 是 T 或 G, X4 是 T, H 或 N, X5 是 P 或 S, X6 是 P, Q, Y, 或 L(SEQ ID NO : 153)。 在一些實施方案中, HVR-H2 包含序列 GRIYPX1X2GSTX3YADSVKG, 其中 X1 是 T 或 L, X2 是 N, Y, S, G, A, 或Q; X3 是 N 或 H(SEQ ID NO : 154)。
     在另一個方面, 本發明的特征在于分離的抗 -FGFR3 抗體, 所述分離的抗 -FGFR3 抗 體包含一個、 兩個、 三個、 四個、 五個或六個 HVR, 其中各個 HVR 包含選自下列的序列, 由選自 下列的序列組成, 或基本上由選自下列的序列組成 : SEQ ID NOS : 1-18, 48-131 和 140-145, 并且其中 SEQID NO : 1, 7, 13, 48, 54, 60, 66, 72, 78, 84, 90, 96, 102, 108, 114, 120, 126 或 143 對應于 HVR-H1, SEQ ID NO : 2, 8, 14, 49, 55, 61, 67, 73, 79, 85, 91, 97, 103, 109, 115, 121, 127 或 144 對 應 于 HVR-H2, SEQ ID NO : 3, 9, 15, 50, 56, 62, 68, 74, 80, 86, 92, 98, 104, 110, 116, 122, 128 或 145 對應于 HVR-H3, SEQ ID NO : 4, 10, 16, 51, 57, 63, 69, 75, 81, 87, 93, 99, 105, 111, 117, 123, 129 或 140 對應于 HVR-L1, SEQ ID NO : 5, 11, 17, 52, 58, 64, 70, 76, 82, 88, 94, 100, 106, 112, 118, 124, 130 或 141 對應于 HVR-L2, 且 SEQ ID NO : 6, 12, 18, 53, 59, 65, 71, 77,83, 89, 95, 101, 107, 113, 119, 125, 131 或 142 對應于 HVR-L3。
     在一個方面, 本發明提供包含 HVR-H1 的抗 -FGFR3 抗體, 所述 HVR-H1 包含 SEQ ID NO : 1, 7, 13, 48, 54, 60, 66, 72, 78, 84, 90, 96, 102, 108, 114, 120, 126 或 143 的序列。
     在一個方面, 本發明提供包含 HVR-H2 的抗 -FGFR3 抗體, 所述 HVR-H2 包含 SEQ ID NO : 2, 8, 14, 49, 55, 61, 67, 73, 79, 85, 91, 97, 103, 109, 115, 121, 127 或 144 的序列。
     在一個方面, 本發明提供包含 HVR-H3 的抗 -FGFR3 抗體, 所述 HVR-H3 包含 SEQ ID NO : 3, 9, 15, 50, 56, 62, 68, 74, 80, 86, 92, 98, 104, 110, 116, 122, 128 或 145 的序列。
     在一個方面, 本發明提供包含 HVR-L1 區的抗 -FGFR3 抗體, 所述 HVR-L1 區包含 SEQ ID NO : 4, 10, 16, 51, 57, 63, 69, 75, 81, 87, 93, 99, 105, 111, 117, 123, 129 或 140 的序列。
     在一個方面, 本發明提供包含 HVR-L2 區的抗 -FGFR3 抗體, 所述 HVR-L2 區包含 SEQ ID NO : 5, 11, 17, 52, 58, 64, 70, 76, 82, 88, 94, 100, 106, 112, 118, 124, 130 或 141 的序列。
     在一個方面, 本發明提供包含 HVR-L3 區的抗 -FGFR3 抗體, 所述 HVR-L3 區包含 SEQ ID NO : 6, 12, 18, 53, 59, 65, 71, 77, 83, 89, 95, 101, 107, 113, 119, 125, 131 或 142 的序列。
     在一個方面, 抗 -FGFR3 抗體包含重鏈可變區和 / 或輕鏈可變區, 所述重鏈可變區 包含 HVR-H1, HVR-H2, HVR-H3, 其中各個按順序地包含 SEQ ID NO : 1, 2, 3, 所述輕鏈可變區 包含 HVR-L1, HVR-L2, 和 HVR-L3, 其中各個按順序地包含 SEQ ID NO : 4, 5, 6。 在另一個方面, 抗 -FGFR3 抗體包含重鏈可變區和 / 或輕鏈可變區, 所述重鏈可變 區包含 HVR-H1, HVR-H2, HVR-H3, 其中各個按順序地包含 SEQ ID NO : 7, 8, 9, 所述輕鏈可變 區包含 HVR-L1, HVR-L2, 和 HVR-L3, 其中各個按順序地包含 SEQ ID NO : 10, 11, 12。
     在另一個方面, 抗 -FGFR3 抗體包含重鏈可變區和 / 或輕鏈可變區, 所述重鏈可變 區包含 HVR-H1, HVR-H2, HVR-H3, 其中各個按順序地包含 SEQ ID NO : 13, 14, 15, 所述輕鏈可 變區包含 HVR-L1, HVR-L2, 和 HVR-L3, 其中各個按順序地包含 SEQ ID NO : 16, 17, 18。
     在另一個方面, 抗 -FGFR3 抗體包含重鏈可變區和 / 或輕鏈可變區, 所述重鏈可變 區包含 HVR-H1, HVR-H2, HVR-H3, 其中各個按順序地包含 SEQ ID NO : 48, 49, 50, 所述輕鏈可 變區包含 HVR-L1, HVR-L2, 和 HVR-L3, 其中各個按順序地包含 SEQ ID NO : 51, 52, 53。
     在另一個方面, 抗 -FGFR3 抗體包含重鏈可變區和 / 或輕鏈可變區, 所述重鏈可變 區包含 HVR-H1, HVR-H2, HVR-H3, 其中各個按順序地包含 SEQ ID NO : 54, 55, 56, 所述輕鏈可 變區包含 HVR-L1, HVR-L2, 和 HVR-L3, 其中各個按順序地包含 SEQ ID NO : 57, 58, 59。
     在另一個方面, 抗 -FGFR3 抗體包含重鏈可變區和 / 或輕鏈可變區, 所述重鏈可變 區包含 HVR-H1, HVR-H2, HVR-H3, 其中各個按順序地包含 SEQ ID NO : 60, 61, 62, 63, 所述輕 鏈可變區包含 HVR-L1, HVR-L2, 和 HVR-L3, 其中各個按順序地包含 SEQ ID NO : 63, 64, 65。
     在另一個方面, 抗 -FGFR3 抗體包含重鏈可變區和 / 或輕鏈可變區, 所述重鏈可變 區包含 HVR-H1, HVR-H2, HVR-H3, 其中各個按順序地包含 SEQ ID NO : 66, 67, 68, 所述輕鏈可 變區包含 HVR-L1, HVR-L2, 和 HVR-L3, 其中各個按順序地包含 SEQ ID NO : 69, 70, 71。
     在另一個方面, 抗 -FGFR3 抗體包含重鏈可變區和 / 或輕鏈可變區, 所述重鏈可變 區包含 HVR-H1, HVR-H2, HVR-H3, 其中各個按順序地包含 SEQ ID NO : 72, 73, 74, 所述輕鏈可 變區包含 HVR-L1, HVR-L2, 和 HVR-L3, 其中各個按順序地包含 SEQ ID NO : 75, 76, 77。
     在另一個方面, 抗 -FGFR3 抗體包含重鏈可變區和 / 或輕鏈可變區, 所述重鏈可變 區包含 HVR-H1, HVR-H2, HVR-H3, 其中各個按順序地包含 SEQ ID NO : 78, 7980, 所述輕鏈可
     變區包含 HVR-L1, HVR-L2, 和 HVR-L3, 其中各個按順序地包含 SEQ ID NO : 81, 82, 83。
     在另一個方面, 抗 -FGFR3 抗體包含重鏈可變區和 / 或輕鏈可變區, 所述重鏈可變 區包含 HVR-H1, HVR-H2, HVR-H3, 其中各個按順序地包含 SEQ ID NO : 84, 85, 86, 所述輕鏈可 變區包含 HVR-L1, HVR-L2, 和 HVR-L3, 其中各個按順序地包含 SEQ ID NO : 87, 88, 89。
     在另一個方面, 抗 -FGFR3 抗體包含重鏈可變區和 / 或輕鏈可變區, 所述重鏈可變 區包含 HVR-H1, HVR-H2, HVR-H3, 其中各個按順序地包含 SEQ ID NO : 90, 91, 92, 所述輕鏈可 變區包含 HVR-L1, HVR-L2, 和 HVR-L3, 其中各個按順序地包含 SEQ ID NO : 93, 94, 95。
     在另一個方面, 抗 -FGFR3 抗體包含重鏈可變區和 / 或輕鏈可變區, 所述重鏈可變 區包含 HVR-H1, HVR-H2, HVR-H3, 其中各個按順序地包含 SEQ ID NO : 96, 97, 98, 所述輕鏈可 變區包含 HVR-L1, HVR-L2, 和 HVR-L3, 其中各個按順序地包含 SEQ ID NO : 99, 100, 101。
     在另一個方面, 抗 -FGFR3 抗體包含重鏈可變區和 / 或輕鏈可變區, 所述重鏈可變 區包含 HVR-H1, HVR-H2, HVR-H3, 其中各個按順序地包含 SEQ ID NO : 102, 103, 104, 所述輕鏈 可變區包含 HVR-L1, HVR-L2, 和 HVR-L3, 其中各個按順序地包含 SEQ ID NO : 105, 106, 107。
     在另一個方面, 抗 -FGFR3 抗體包含重鏈可變區和 / 或輕鏈可變區, 所述重鏈可變 區包含 HVR-H1, HVR-H2, HVR-H3, 其中各個按順序地包含 SEQ ID NO : 108, 109, 110, 所述輕鏈 可變區包含 HVR-L1, HVR-L2, 和 HVR-L3, 其中各個按順序地包含 SEQ ID NO : 111, 112, 113。 在另一個方面, 抗 -FGFR3 抗體包含重鏈可變區和 / 或輕鏈可變區, 所述重鏈可變 區包含 HVR-H1, HVR-H2, HVR-H3, 其中各個按順序地包含 SEQ ID NO : 114, 115, 116, 所述輕鏈 可變區包含 HVR-L1, HVR-L2, 和 HVR-L3, 其中各個按順序地包含 SEQ ID NO : 117, 118, 119。
     在另一個方面, 抗 -FGFR3 抗體包含重鏈可變區和 / 或輕鏈可變區, 所述重鏈可變 區包含 HVR-H1, HVR-H2, HVR-H3, 其中各個按順序地包含 SEQ ID NO : 120, 121, 122, 所述輕鏈 可變區包含 HVR-L1, HVR-L2, 和 HVR-L3, 其中各個按順序地包含 SEQ ID NO : 123, 124, 125。
     在另一個方面, 抗 -FGFR3 抗體包含重鏈可變區和 / 或輕鏈可變區, 所述重鏈可變 區包含 HVR-H1, HVR-H2, HVR-H3, 其中各個按順序地包含 SEQ ID NO : 126, 127, 128, 所述輕鏈 可變區包含 HVR-L1, HVR-L2, 和 HVR-L3, 其中各個按順序地包含 SEQ ID NO : 129, 130, 131。
     在另一個方面, 抗 -FGFR3 抗體包含重鏈可變區和 / 或輕鏈可變區, 所述重鏈可變 區包含 HVR-H1, HVR-H2, HVR-H3, 其中各個按順序地包含 SEQ ID NO : 140, 141, 142, 所述輕鏈 可變區包含 HVR-L1, HVR-L2, 和 HVR-L3, 其中各個按順序地包含 SEQ ID NO : 143, 144, 145。
     SEQ ID NOs : 1-18, 48-131 和 140-145 的氨基酸序列關于如圖 1 中所示的單個 HVR( 即, H1, H2 或 H3) 進行編號, 所述編號與如下所述的 Kabat 編號系統一致。
     在另一個方面, 抗 -FGFR3 抗體包含重鏈可變區和輕鏈可變區, 所述重鏈可變區包 含 SEQ ID NO : 132。
     在另一個方面, 抗 -FGFR3 抗體包含輕鏈可變區和重鏈可變區, 所述輕鏈可變區包 含 SEQ ID NO : 133。
     在另一個方面, 抗 -FGFR3 抗體包含重鏈可變區和輕鏈可變區, 所述重鏈可變區包 含 SEQ ID NO : 132, 所述輕鏈可變區包含 SEQ ID NO : 133。
     在另一個方面, 抗 -FGFR3 抗體包含重鏈可變區和輕鏈可變區, 所述重鏈可變區包 含 SEQ ID NO : 134。
     在另一個方面, 抗 -FGFR3 抗體包含輕鏈可變區和重鏈可變區, 所述輕鏈可變區包
     含 SEQ ID NO : 135。
     在另一個方面, 抗 -FGFR3 抗體包含輕鏈可變區和重鏈可變區, 所述輕鏈可變區包 含 SEQ ID NO : 139。
     在另一個方面, 抗 -FGFR3 抗體包含重鏈可變區和輕鏈可變區, 所述重鏈可變區包 含 SEQ ID NO : 134, 所述輕鏈可變區包含 SEQ ID NO : 135。
     在另一個方面, 抗 -FGFR3 抗體包含重鏈可變區和輕鏈可變區, 所述重鏈可變區包 含 SEQ ID NO : 136。
     在另一個方面, 抗 -FGFR3 抗體包含輕鏈可變區和重鏈可變區, 所述輕鏈可變區包 含 SEQ ID NO : 137。
     在另一個方面, 抗 -FGFR3 抗體包含重鏈可變區和輕鏈可變區, 所述重鏈可變區包 含 SEQ ID NO : 136, 所述輕鏈可變區包含 SEQ ID NO : 137。
     在另一個方面, 抗 -FGFR3 抗體包含重鏈可變區和輕鏈可變區, 所述重鏈可變區包 含 SEQ ID NO : 138。
     在另一個方面, 抗 -FGFR3 抗體包含輕鏈可變區和重鏈可變區, 所述輕鏈可變區包 含 SEQ ID NO : 139。 在另一個方面, 抗 -FGFR3 抗體包含重鏈可變區和輕鏈可變區, 所述重鏈可變區包 含 SEQ ID NO : 138, 所述輕鏈可變區包含 SEQ ID NO : 139。
     在一個方面, 本發明提供抗 -FGFR3 抗體, 所述抗 -FGFR3 抗體包含 : 至少一個、 兩 個、 三個、 四個、 五個或六個高變區 (HVR) 序列, 所述高變區序列選自由下列各項組成的組 :
     (a)HVR-L1, 其包含序列 SASSSVSYMH(SEQ ID NO : 155), SASSSVSYMH(SEQ ID NO : 156) 或 LASQTIGTWLA(SEQ ID NO : 157),
     (b)HVR-L2, 其包含序列 TWIYDTSILAS(SEQ ID NO : 158), RWIYDTSKLAS(SEQ ID NO : 159), 或 LLIYAATSLAD(SEQ ID NO : 160),
     (c)HVR-L3, 其 包 含 序 列 QQWTSNPLT(SEQ ID NO : 161), QQWSSYPPT(SEQ ID NO : 162), 或 QQLYSPPWT(SEQ ID NO : 163),
     (d)HVR-H1, 其包含序列 GYSFTDYNMY(SEQ ID NO : 164), GYVFTHYNMY(SEQ ID NO : 165), 或 GYAFTSYNMY(SEQ ID NO : 166),
     (e)HVR-H2 , 其 包 含 序 列 WIGYIEPYNGGTSYNQKFKG(SEQ IDNO : 167) , WIGYIEPYNGGTSYNQKFKG(SEQ ID NO : 168), 或 WIGYIDPYIGGTSYNQKFKG(SEQ ID NO : 169), 和
     (f)HVR-H3 包含序列 ASPNYYDSSPFAY(SEQ ID NO : 170), ARGQGPDFDV(SEQ ID NO : 171), 或 ARWGDYDVGAMDY(SEQ IDNO : 172)。
     在一個方面, 本發明提供抗 -FGFR3 抗體, 其包含 : 至少一個、 兩個、 三個、 四個、 五 個或六個高變區 (HVR) 序列, 所述高變區序列選自由下列各項組成的組 :
     (a)HVR-L1, 其包含序列 SASSSVSYMH(SEQ ID NO : 155),
     (b)HVR-L2, 其包含序列 TWIYDTSILAS(SEQ ID NO : 158),
     (c)HVR-L3, 其包含序列 QQWTSNPLT(SEQ ID NO : 161),
     (d)HVR-H1, 其包含序列 GYSFTDYNMY(SEQ ID NO : 164),
     (e)HVR-H2, 其包含序列 WIGYIEPYNGGTSYNQKFKG(SEQ IDNO : 167), 和
     (f)HVR-H3, 其包含序列 ASPNYYDSSPFAY(SEQ ID NO : 170)。
     在一個方面, 本發明提供抗 -FGFR3 抗體, 其包含 : 至少一個、 兩個、 三個、 四個、 五 個或六個高變區 (HVR) 序列, 所述高變區序列選自由下列各項組成的組 :
     (a)HVR-L1, 其包含序列 SASSSVSYMH(SEQ ID NO : 156),
     (b)HVR-L2, 其包含序列 RWIYDTSKLAS(SEQ ID NO : 159),
     (c)HVR-L3, 其包含序列 QQWSSYPPT(SEQ ID NO : 162),
     (d)HVR-H1, 其包含序列 GYVFTHYNMY(SEQ ID NO : 165),
     (e)HVR-H2, 其包含序列 WIGYIEPYNGGTSYNQKFKG(SEQ IDNO : 168), 和
     (f)HVR-H3, 其包含序列 ARGQGPDFDV(SEQ ID NO : 171).
     在一個方面, 本發明提供抗 -FGFR3 抗體, 其包含 : 至少一個、 兩個、 三個、 四個、 五 個或六個高變區 (HVR) 序列, 所述高變區序列選自由下列各項組成的組 :
     (a)HVR-L1, 其包含序列 LASQTIGTWLA(SEQ ID NO : 157),
     (b)HVR-L2, 其包含序列 LLIYAATSLAD(SEQ ID NO : 160),
     (c)HVR-L3, 其包含序列 QQLYSPPWT(SEQ ID NO : 163),
     (d)HVR-H1, 其包含序列 GYAFTSYNMY(SEQ ID NO : 166),
     (e)HVR-H2, 其包含序列 WIGYIDPYIGGTSYNQKFKG(SEQ IDNO : 169), 和
     (f)HVR-H3, 其包含序列 ARWGDYDVGAMDY(SEQ ID NO : 172)。
     在一個方面, 本發明提供抗 -FGFR3 抗體, 所述抗 -FGFR3 抗體包含 : (a) 輕鏈, 所述 輕鏈包含 : (i)HVR-L1, 其包含序列 SASSSVSYMH(SEQ IDNO : 155) ; (ii)HVR-L2, 其包含序列 TWIYDTSILAS(SEQ ID NO : 158) ; 和 (iii)HVR-L3, 其包含序列 QQWTSNPLT(SEQ ID NO : 161) ; 和 / 或 (b) 重鏈, 所述重鏈包含 : (i)HVR-H1, 其包含序列 GYSFTDYNMY(SEQ IDNO : 164) ; (ii) HVR-H2, 其包含序列 WIGYIEPYNGGTSYNQKFKG(SEQID NO : 167) ; 和 (iii)HVR-H3, 其包含序列 ASPNYYDSSPFAY(SEQ IDNO : 170)。
     在一個方面, 本發明提供抗 -FGFR3 抗體, 所述抗 -FGFR3 抗體包含 : (a) 輕鏈, 其包含: (i)HVR-L1, 其 包 含 序 列 SASSSVSYMH(SEQ IDNO : 156) ; (ii)HVR-L2, 其包含序 列 RWIYDTSKLAS(SEQ ID NO : 159) ; 和 (iii)HVR-L3, 其包含序列 QQWSSYPPT(SEQ ID NO : 162) ; 和 / 或 (b) 重鏈, 其包含 : (i)HVR-H1 包含序列 GYVFTHYNMY(SEQ ID NO : 165) ; (ii) HVR-H2, 其包含序列 WIGYIEPYNGGTSYNQKFKG(SEQ ID NO : 168) ; 和 (iii)HVR-H3, 其包含序 列 ARGQGPDFDV(SEQ ID NO : 171)。
     在一個方面, 本發明提供抗 -FGFR3 抗體, 所述抗 -FGFR3 抗體包含 : (a) 輕鏈, 其包含 : (i)HVR-L1, 其包含序列 LASQTIGTWLA(SEQ IDNO : 157) ; (ii)HVR-L2, 其包含序列 LLIYAATSLAD(SEQ ID NO : 160) ; 和 (iii)HVR-L3, 其包含序列 QQLYSPPWT(SEQ ID NO : 163) ; 和 / 或 (b) 重 鏈, 其包含 : (i)HVR-H1, 其 包 含 序 列 GYAFTSYNMY(SEQ ID NO : 166) ; (ii) HVR-H2, 其包含序列 WIGYIDPYIGGTSYNQKFKG(SEQ ID NO : 169) ; 和 (iii)HVR-H3, 其包含序 列 ARWGDYDVGAMDY(SEQ ID NO : 172)。本發明的抗體的一些實施方案包含如下面 SEQ ID NO : 173 中所示的人源化 4D5 抗體 (huMAb4D5-8)( Genentech, Inc., South SanFrancisco, CA, USA)( 也在美國專利號 6,407,213 和 Lee 等 ., J.Mol.Biol.( 分子生物 學雜志 )(2004), 340(5) : 1073-1093 中提及 ) 的輕鏈可變結構域。
     I Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
    Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val13Thr Ala102378767 A CN 102378777
    
    
    
    說明書10/107 頁Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro GluAsp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Thr Thr Pro Pro Thr
     Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 107(SEQ ID NO : 173)
     (HVR 殘基被下劃線 )
     在一個實施方案中, huMAb4D5-8 輕鏈可變結構域序列在位置 30, 66, 和 91( 分別 如上面以粗體 / 斜體所示的 Asn, Arg, 和 His) 中的一個或多個處被修飾。在具體的實施方 案中, 修飾的 huMAb4D5-8 序列包含位置 30 中的 Ser, 位置 66 中的 Gly, 和 / 或位置 91 中的 Ser。 因此, 在一個實施方案中, 本發明的抗體包含輕鏈可變結構域, 所述輕鏈可變結構域包 含下面 SEQ ID NO : 174 中所示的序列 :
     I Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
     Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Thr Ala
     Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
     Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
    
    
    Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Thr Thr Pro Pro ThrPhe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 107(SEQ ID NO : 174)
     (HVR 殘基被下劃線 )
     關于 huMAb4D5-8 的置換殘基以粗體 / 斜體指示。
     本發明的抗體可以包含任何合適的構架可變結構域序列, 條件是基本上保留與 FGFR3 的結合活性。例如, 在一些實施方案中, 本發明的抗體包含人亞組 III 重鏈構架共有 序列。在這些抗體的一個實施方案中, 構架共有序列包含位置 71, 73, 和 / 或 78 處的置換。 在這些抗體的一些實施方案中, 位置 71 是 A, 73 是 T 和 / 或 78 是 A。在一個實施方案中, 這些抗體包含 huMAb4D5-8( Genentech, Inc., South San Francisco, CA, USA)( 也在美國專利號 6,407,213 和 5,821,337, 和 Lee 等 ., J.Mol.Biol.( 分子生物學雜 志 )(2004), 340(5) : 1073-1093 中提及 ) 的重鏈可變結構域構架序列。在一個實施方案中, 這些抗體還包含人 κI 輕鏈構架共有序列。在具體的實施方案中, 這些抗體包含如美國專 利號 6,407,213 和 5,821,337 中所述的 huMAb4D5-8 的輕鏈 HVR 序列。在一個實施方案中, 這些抗體包含 huMAb4D5-8( Genentech, Inc., South San Francisco, CA, USA)( 也在美國專利號 6,407,213 和 5,821,337, 和 Lee 等 ., J.Mol.Biol.( 分子生物學雜 志 )(2004), 340(5) : 1073-1093 中提及 ) 的輕鏈可變結構域序列。
     在一個實施方案中, 本發明的抗體包含重鏈可變結構域, 其中構架序列包含 SEQ ID NOS : 19 和 203-205, 20 和 206-208, 21 和 209-211, 22 和 212-214, 23 和 215-217, 24 和 218-220, 25 和 221-223, 26 和 224-226, 27 和 227-229, 28 和 230-232, 29 和 233-235, 30 和 236-238, 31 和 239-241, 32 和 242-244, 33 和 245-247, 34 和 248-250, 35 和 251-253, 36 和 254-256, 和 / 或 37 和 257-259 的序列, 并且 HVR H1, H2, 和 H3 序列分別是 SEQ IDNOS : 13, 14 和 / 或 15。在另一個實施方案中, 所述構架序列包含 SEQ IDNOS : 19 和 203-205, 20 和 206-208, 21 和 209-211, 22 和 212-214, 23 和 215-217, 24 和 218-220, 25 和 221-223, 26 和224-226, 27 和 227-229, 28 和 230-232, 29 和 233-235, 30 和 236-238, 31 和 239-241, 32 和 242-244, 33 和 245-247, 34 和 248-250, 35 和 251-253, 36 和 254-256, 和 / 或 37 和 257-259 的序列, 并且 HVR H1, H2, 和 H3 序列分別是 SEQ ID NOS : 48, 49 和 / 或 50。還在另一個實施 方案中, 所述構架序列包含 SEQ ID NOS : 19 和 203-205, 20 和 206-208, 21 和 209-211, 22 和 212-214, 23 和 215-217, 24 和 218-220, 25 和 221-223, 26 和 224-226, 27 和 227-229, 28 和 230-232, 29 和 233-235, 30 和 236-238, 31 和 239-241, 32 和 242-244, 33 和 245-247, 34 和 248-250, 35 和 251-253, 36 和 254-256, 和 / 或 37 和 257-259 的序列, 并且 HVR H1, H2, 和 H3 序列分別是 SEQ ID NOS : 84, 85, 和 / 或 86。在進一步的實施方案中, 所述構架序列包含 SEQ ID NOS : 19 和 203-205, 20 和 206-208, 21 和 209-211, 22 和 212-214, 23 和 215-217, 24 和 218-220, 25 和 221-223, 26 和 224-226, 27 和 227-229, 28 和 230-232, 29 和 233-235, 30 和 236-238, 31 和 239-241, 32 和 242-244, 33 和 245-247, 34 和 248-250, 35 和 251-253, 36 和 254-256, 和 / 或 37 和 257-259 的序列, 并且 HVR H1, H2, 和 H3 序列分別是 SEQ IDNOS : 108, 109, 和 / 或 110。
     在具體的實施方案中, 本發明的抗體包含輕鏈可變結構域, 其中構架序列包含 SEQ ID NOS : 38 和 260-262, 39 和 263-265, 40 和 266-268, 和 / 或 41 和 269-271 的序列, 并且 HVR L1, L2, 和 L3 序列分別是 SEQ IDNOS : 16, 17, 和 / 或 18。在另一個實施方案中, 本發明的抗 體包含輕鏈可變結構域, 其中構架序列包含 SEQ ID NOS : 38 和 260-262, 39 和 263-265, 40 和 266-268, 和 / 或 41 和 269-271 的序列, 并且 HVR L1, L2, 和 L3 序列分別是 SEQ ID NOS : 51, 52 和 / 或 53。在另外的實施方案中, 本發明的抗體包含輕鏈可變結構域, 其中構架序列 包含 SEQ ID NOS : 38 和 260-262, 39 和 263-265, 40 和 266-268, 和 / 或 41 和 269-271 的序 列, 并且 HVR L1, L2, 和 L3 序列分別是 SEQ ID NOS : 87, 88 和 / 或 89。還在另一個實施方案 中, 本發明的抗體包含輕鏈可變結構域, 其中構架序列包含 SEQ ID NOS : 38 和 260-262, 39 和 263-265, 40 和 266-268, 和 / 或 41 和 269-271 的序列, 并且 HVR L1, L2, 和 L3 序列分別 是 SEQ ID NOS : 111, 112, 和 / 或 113。
     在另一個方面, 本發明的抗體包含重鏈可變結構域和 / 或輕鏈可變結構域, 所述 重鏈可變結構域包含 SEQ ID NO : 132 的序列, 所述輕鏈可變結構域包含 SEQ ID NO : 133 的 序列。在另一個方面, 本發明的抗體包含重鏈可變結構域和 / 或輕鏈可變結構域, 所述重鏈 可變結構域包含 SEQ IDNO : 134 的序列, 所述輕鏈可變結構域包含 SEQ ID NO : 135 的序列。 在另一個方面, 本發明的抗體包含重鏈可變結構域和 / 或輕鏈可變結構域, 所述重鏈可變 結構域包含 SEQ ID NO : 136 的序列, 所述輕鏈可變結構域包含 SEQ ID NO : 137 的序列。在 另一個方面, 本發明的抗體包含重鏈可變結構域和 / 或輕鏈可變結構域, 所述重鏈可變結 構域包含 SEQ ID NO : 138 的序列, 所述輕鏈可變結構域包含 SEQ ID NO : 139 的序列。
     在一個方面, 本發明提供結合多肽的抗 -FGFR3 抗體, 所述多肽包含下列的氨基酸 序列, 基本上由下列的氨基酸序列組成或由下列的氨基酸序列組成 : LAVPAANTVRFRCPA(SEQ ID NO : 179) 和 / 或 SDVEFHCKVYSDAQP(SEQ ID NO : 180)。
     在一些實施方案中, 所述抗體結合多肽, 所述多肽包含成熟的人 FGFR3 氨基酸序 列的氨基酸數 164-178 和 / 或 269-283, 基本上由成熟的人 FGFR3 氨基酸序列的氨基酸數 164-178 和 / 或 269-283 組成或由成熟的人 FGFR3 氨基酸序列的氨基酸數 164-178 和 / 或 269-283 組成。在 一 個 實 施 方 案 中,本 發 明 的 抗 -FGFR3 抗 體 特 異 性 地 結 合 與 序 列 LAVPAANTVRFRCPA(SEQ ID NO : 179) 和 / 或 SDVEFHCKVYSDAQP(SEQ ID NO : 180) 具有至少 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%序列同一性或相似性的氨基酸序列。
     在一個方面, 本發明的抗 -FGFR3 抗體與 FGFR3IIIb 多肽的殘基 154, 155, 158, 159, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 177, 202, 205, 207, 210, 212, 214, 216, 217, 241, 246, 247, 248, 278, 279, 280, 281, 282, 283, 314, 315, 316, 317 和 / 或 318, 或 FGFR3IIIc 多肽的等效殘基中的至少一個、 兩個、 三個、 四個或至多達全部的任 意數目個殘基結合。本領域普通技術人員理解如何比對 FGFR3 序列從而鑒定各個 FGFR3 序 列之間的對應殘基。 兩個或多個殘基的組合可以包括 FGFR3IIIb 多肽的殘基 154, 155, 158, 159, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 177, 202, 205, 207, 210, 212, 214, 216, 217, 241, 246, 247, 248, 278, 279, 280, 281, 282, 283, 314, 315, 316, 317 和 / 或 318, 或 FGFR3IIIc 多肽的等效殘基中的任一個。在一些實施方案中, 抗 -FGFR3 抗 體 與 FGFR3IIIb 多 肽 的 殘 基 158, 159, 169, 170, 171, 173, 175, 205, 207, 和 / 或 315, 或 FGFR3IIIc 多肽的等效殘基中的至少一個、 兩個、 三個、 四個或至多達全部的任意數目個殘 基結合。在一些實施方案中, 抗 -FGFR3 抗體與 FGFR3IIIb 多肽的殘基 158, 170, 171, 173, 175, 和 / 或 315, 或 FGFR3IIIc 多肽的等效殘基中的至少一個、 兩個、 三個、 四個或至多達全 部的任意數目個殘基結合。 在一個方面, 本發明提供了抗 -FGFR3 抗體, 所述抗 -FGFR3 抗體與上面提及的抗體 中的任一個競爭與 FGFR3 的結合。 在一個方面, 本發明提供了抗 -FGFR3 抗體, 所述抗 -FGFR3 抗體結合與上面提及的抗體中的任一個所結合的相同或相似的 FGFR3 上的表位。
     如本領域中已知的那樣, 以及如下文更詳細描述的那樣, 對抗體的高變區劃界的 抗體的氨基酸位置 / 邊界可以根據具體情況和本領域中已知的各種定義 ( 如下所述 ) 而變 化。可變結構域內的一些位置可以視為雜合的超變位置, 因為根據一組標準這些位置可以 視為處于高變區內, 而根據不同組的標準這些位置可以被視為在高變區之外。這些位置中 的一個或多個也可見于擴展的高變區中 ( 如下面進一步定義 )。
     在一些實施方案中, 所述抗體是單克隆抗體。 在其他實施方案中, 所述抗體是多克 隆抗體。在一些實施方案中, 所述抗體選自由嵌合抗體、 親和力成熟抗體、 人源化抗體和人 抗體組成的組。在某些實施方案中, 所述抗體是抗體片段。在一些實施方案中, 所述抗體是 Fab, Fab′, Fab′ -SH, F(ab′ )2, 或 scFv。
     在一些實施方案中, FGFR3 抗體是包含 Fc 區的單臂抗體 ( 即, 重鏈可變結構域和 輕鏈可變結構域形成單個抗原結合臂 ), 其中 Fc 區包含第一和第二 Fc 多肽, 其中第一和第 二 Fc 多肽以復合體存在并形成 Fc 區, 所述 Fc 區與包含所述抗原結合臂的 Fab 分子相比增 加所述抗體片段的穩定性。參見, 例如, WO2006/015371。
     在一個實施方案中, 所述抗體是嵌合抗體, 例如, 包含移植至異源的非人、 人或人 源化序列 ( 例如, 構架和 / 或恒定結構域序列 ) 的來自非人供體的抗原結合序列的抗體。 在 一個實施方案中, 所述非人供體是小鼠。在進一步的實施方案中, 抗原結合序列是合成的, 例如, 通過誘變獲得 ( 例如, 噬菌體展示篩選等 )。 在具體的實施方案中, 本發明的嵌合抗體 具有鼠的 V 區和人的 C 區。在一個實施方案中, 鼠輕鏈 V 區與人 κ 輕鏈融合。在另一個實 施方案中, 鼠重鏈 V 區與人 IgG1C 區融合。
     本發明的人源化抗體包括在構架區 (FR) 中具有氨基酸置換的那些和在移植的 CDR 中有改變的親和力成熟變體。CDR 或 FR 中被置換的氨基酸不限于存在于供體或受體抗 體中的那些。在其他的實施方案中, 本發明的抗體還包含 Fc 區中的氨基酸殘基改變, 所述 改變導致提高的效應子功能, 包括增強的 CDC 和 / 或 ADCC 功能和 B- 細胞殺傷作用。 本發明 的其他抗體包括具有改善穩定性的特異性改變的那些。在其他實施方案中, 本發明的抗體 包含 Fc 區中的氨基酸殘基改變, 所述改變導致降低的效應子功能, 例如降低的 CDC 和 / 或 ADCC 功能和 / 或減小的 B- 細胞殺傷作用。 在一些實施方案中, 本發明的抗體的特征在于與 自然殺傷 (NK) 細胞上的人補體因子 C1q 和 / 或人 Fc 受體的結合減少 ( 諸如缺乏結合 )。 在一些實施方案中, 本發明的抗體的特征在于與人 FcγRI, FcγRIIA, 和 / 或 FcγRIIIA 的 結合減少 ( 諸如缺乏結合 )。在一些實施方案中, 本發明的抗體是 IgG 類 ( 例如, IgG1 或 IgG4) 并且包含 E233, L234, G236, D265, D270, N297, E318, K320, K322, A327, A330, P331, 和 / 或 P329( 根據 EU 指數編號 ) 中的至少一個突變。在一些實施方案中, 所述抗體包含突 變 L234A/L235A 或 D265A/N297A。
     在抗體包含 Fc 區的情況下, 與其結合的糖類可以改變。例如, 具有成熟的糖結 構 ( 所述糖結構缺少與抗體的 Fc 區連接的巖藻糖 ) 的抗體記述在美國專利申請號 US 2003/0157108(Presta, L.) 中。還參見 US2004/0093621(Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd)。 在與抗體的 Fc 區連接的糖中具有平分型 N- 乙酰氨基葡糖胺 (GlcNAc) 的抗體參見 WO 2003/011878, Jean-Mairet 等和美國專利號 6,602,684, Umana 等。在與抗體的 Fc 區連接 的寡糖中具有至少一個半乳糖殘基的抗體在 WO 1997/30087, Patel 等中報道。還參見, WO 1998/58964(Raju, S.) 和 WO 1999/22764(Raju, S.), 它們涉及與抗體的 Fc 區連接的糖發生 改變的抗體。還參見 US 2005/0123546(Umana 等 ), 其關于具有改變的糖基化作用的抗原 結合分子。在一個方面, 本發明提供了 FGFR3 結合多肽, 所述多肽包含本文提供的任一個抗 原結合序列, 其中所述 FGFR3 結合多肽特異性地結合 FGFR3, 例如, 人和 / 或犬和 / 或小鼠 FGFR3。
     本 發 明 的 抗 體 結 合 ( 諸 如 特 異 性 結 合 )FGFR3( 例 如, FGFR3-IIIb 和 / 或 FGFR3-IIIc), 并且在一些實施方案中, 可以調節 ( 例如, 抑制 )FGFR3 信號傳導 ( 諸如 FGFR3 磷酸化 ) 中的一個或多個方面和 / 或破壞任何生物學相關的 FGFR3 和 / 或 FGFR3 配體生物 學途徑, 和 / 或治療和 / 或預防腫瘤、 細胞增生性病癥或癌癥 ; 和 / 或治療或預防與 FGFR3 表達和 / 或活性 ( 諸如增加的 FGFR3 表達和 / 或活性 ) 相關的病癥。在一些實施方案中, FGFR3 抗體特異性結合由 FGFR3( 例如, 人或小鼠 FGFR3) 組成或基本上由 FGFR3( 例如, 人或 小鼠 FGFR3) 組成的多肽。在一些實施方案中, 所述抗體以 1x10-7M 或更強的 Kd 特異性結 合 FGFR3。
     在一些實施方案中, 本發明的抗 -FGFR3 抗體不是 : 美國專利公開號 2005/0147612 中 所 述 的 抗 -FGFR3 抗 體 ( 例 如, 抗 體 MSPRO2, MSPRO12, MSPRO59, MSPRO11, MSPRO21, MSPRO24 ,MSPRO26 ,MSPRO28 ,MSPRO29 ,MSPRO43 ,MSPRO55) ,Rauchenberger 等,J Biol Chem( 生 物 化 學 雜 志 )278(40) : 38194-38205(2003) 中 所 述 的 抗 體 ; PCT 公 開 號 WO2006/048877 中 所 述 的 抗 體 ( 例 如, 抗 體 PRO-001), Martinez-Torrecuadrada 等, Mol Cancer Ther( 分子癌癥治療 )(2008)7(4) : 862-873 中所述的抗體 ( 例如, scFvαFGFR3 3C), Direnzo, R 等 (2007)Proceedings of AACR Annual Meeting(AACR 年會進展 ), 摘要No.2080 中所述的抗體 ( 例如, D11), 或 WO 2010/002862 中所述的抗體 ( 例如, 抗體 15D8, 27H2, 4E7, 2G4, 20B4)。
     在一個方面, 本發明提供包含載體和本發明的一種或多種抗體的組合物。在一個 實施方案中, 所述載體是藥用的。
     在另一個方面, 本發明提供編碼本發明的 FGFR3 抗體的核酸。
     還在另一個方面, 本發明提供包含本發明的核酸的載體。
     在進一步的方面, 本發明提供包含載體和本發明的一種或多種核酸的組合物。在 一個實施方案中, 所述載體是藥用的。
     在一個方面, 本發明提供包含本發明的核酸或載體的宿主細胞。載體可以是任何 類型, 例如, 重組載體諸如表達載體。可以使用多種宿主細胞中的任一種。在一個實施方案 中, 宿主細胞是原核細胞, 例如, 大腸桿菌 (E.coli)。 在另一個實施方案中, 宿主細胞是真核 細胞, 例如, 哺乳動物細胞, 諸如中國倉鼠卵巢 (CHO) 細胞。
     在進一步的方面, 本發明提供制備本發明的抗體的方法。例如, 本發明提供制備 抗 -FGFR3 抗體的方法 ( 所述抗 -FGFR3 抗體如本文所定義其包括全長抗體及其片段 ), 所述 方法包括在合適的宿主細胞表達編碼所述抗體的本發明的重組載體, 并回收所述抗體。在 一些實施方案中, 所述方法包括培養包含編碼所述抗體的核酸的宿主細胞, 使得所述核酸 得以表達。在一些實施方案中, 所述方法進一步包括從所述宿主細胞培養物中回收所述抗 體。在一些實施方案中, 所述抗體從所述宿主細胞培養基中回收。在一些實施方案中, 所述 方法進一步包括將回收的抗體與藥用載體、 賦形劑或載體組合從而制備包含所述人源化抗 體的藥物制劑。
     在一個方面, 本發明提供一種包含容器的制品 ; 和包含在容器內的組合物, 其中所 述組合物包含本發明的一種或多種 FGFR3 抗體。在一個實施方案中, 所述組合物包含本發 明的核酸。 在另一個實施方案中, 包含抗體的組合物還包含載體, 在一些實施方案中所述載 體是藥用的。在一個實施方案中, 本發明的制品還包含用于將所述組合物 ( 例如, 所述抗 體 ) 施用于個體的說明書 ( 諸如用于本文所述的任一種方法的說明書 )。
     在另一個方面, 本發明提供一種包含第一容器和第二容器的試劑盒, 所述第一容 器包含組合物, 所述組合物包含本發明的一種或多種抗 -FGFR3 抗體 ; 所述第二容器包含緩 沖劑。在一個實施方案中, 所述緩沖劑是藥用的。在一個實施方案中, 包含抗體的組合物還 包含載體, 在一些實施方案中所述載體是藥用的。 在另一個實施方案中, 試劑盒還包含用于 將所述組合物 ( 例如, 所述抗體 ) 施用于個體的說明書。
     在進一步的方面, 本發明提供了本發明的抗 -FGFR3 抗體, 所述抗 -FGFR3 抗體用作 藥物。
     在進一步的方面, 本發明提供本發明的抗 -FGFR3 抗體, 所述抗 -FGFR3 抗體用于治 療或預防病癥, 諸如與 FGFR3 激活和 / 或表達 ( 在一些實施方案中, 過表達 ) 相關的病理學 狀況。在一些實施方案中, 所述病癥是癌癥、 腫瘤和 / 或細胞增生性病癥。在一些實施方案 中, 所述癌癥、 腫瘤和 / 或細胞增生性病癥是多發性骨髓瘤或膀胱癌癥 ( 例如, 移行性細胞 癌 ), 乳腺癌或肝癌。
     在 進 一 步 的 方 面, 本 發 明 提 供 本 發 明 的 抗 -FGFR3 抗 體, 所 述 抗 -FGFR3 抗 體 用于治療或預防病癥諸如骨骼病癥。在一些實施方案中, 所述病癥是軟骨發育不全(achondroplasia)、 軟 骨 發 育 不 良 (hypochondroplasia)、 侏 儒 癥 (dwarfism)、 致死性 發 育 不 全 (thantophoricdysplasia)(TD ; 臨 床 形 式 TD1 和 TDII) 或 顱 縫 早 閉 綜 合 癥 (craniosynostosissyndrome)。
     在進一步的方面, 本發明提供本發明的抗 -FGFR3 抗體, 所述抗 -FGFR3 抗體用于減 少細胞增殖。
     在進一步的方面, 本發明提供本發明的抗 -FGFR3 抗體, 所述抗 -FGFR3 抗體用于殺 傷細胞。在一些實施方案中, 所述細胞是多發性骨髓瘤細胞。在一些實施方案中, 所述細胞 被 ADCC 殺傷。在一些實施方案中, 所述抗體是裸抗體。在一些實施方案中, 所述細胞過表 達 FGFR3。
     在進一步的方面, 本發明提供本發明的抗 -FGFR3 抗體, 所述抗 -FGFR3 抗體用于清 除細胞, 諸如多發性骨髓瘤細胞。在一些實施方案中, 所述細胞被 ADCC 殺傷。在一些實施 方案中, 所述抗體是裸抗體。在一些實施方案中, 所述細胞過表達 FGFR3。
     在進一步的方面, 本發明提供本發明的抗 -FGFR3 抗體在制備用于治療性和 / 或預 防性治療病癥的藥物中的用途, 所述病癥諸如與 FGFR3 激活和 / 或表達 ( 在一些實施方案 中, 過表達 ) 相關的病理學狀況。在一些實施方案中, 所述病癥是癌癥、 腫瘤和 / 或細胞增 生性病癥。在一些實施方案中, 所述癌癥、 腫瘤和 / 或細胞增生性病癥是多發性骨髓瘤或膀 胱癌 ( 例如, 移行性細胞癌 ), 乳腺癌或肝癌。在一些實施方案中, 所述病癥是骨骼病癥, 例 如, 軟骨發育不全、 軟骨發育不良、 侏儒癥、 致死性發育不全 (TD ; 臨床形式 TD1 和 TDII) 或 顱縫早閉綜合癥。
     在一個方面, 本發明提供本發明的核酸在制備用于治療性和 / 或預防性治療病癥 的藥物中的用途, 所述病癥諸如與 FGFR3 激活和 / 或表達 ( 在一些實施方案中, 過表達 ) 相 關的病理學狀況。在一些實施方案中, 所述病癥是癌癥、 腫瘤和 / 或細胞增生性病癥。在 一些實施方案中, 所述癌癥、 腫瘤和 / 或細胞增生性病癥是多發性骨髓瘤或膀胱癌 ( 例如, 移行性細胞癌 ), 乳腺癌或肝癌。在一些實施方案中, 所述病癥是骨骼病癥, 例如, 軟骨發育 不全、 軟骨發育不良、 侏儒癥、 致死性發育不全 (TD ; 臨床形式 TD1 和 TDII) 或顱縫早閉綜合 癥。
     在另一個方面, 本發明提供本發明的表達載體在制備用于治療性和 / 或預防性治 療病癥的藥物中的用途, 所述病癥諸如與 FGFR3 激活和 / 或表達 ( 在一些實施方案中, 過表 達 ) 相關的病理學狀況。 在一些實施方案中, 所述病癥是癌癥、 腫瘤和 / 或細胞增生性病癥。 在一些實施方案中, 所述癌癥、 腫瘤和 / 或細胞增生性病癥是多發性骨髓瘤或膀胱癌 ( 例 如, 移行性細胞癌 ), 乳腺癌或肝癌。 在一些實施方案中, 所述病癥是骨骼病癥, 例如, 軟骨發 育不全、 軟骨發育不良、 侏儒癥、 致死性發育不全 (TD ; 臨床形式 TD1 和 TDII) 或顱縫早閉綜 合癥。
     還在另一個方面, 本發明提供本發明的宿主細胞在制備用于治療性和 / 或預防性 治療病癥的藥物中的用途, 所述病癥諸如與 FGFR3 激活和 / 或表達 ( 在一些實施方案中, 過 表達 ) 相關的病理學狀況。在一些實施方案中, 所述病癥是癌癥、 腫瘤和 / 或細胞增生性病 癥。在一些實施方案中, 所述癌癥、 腫瘤和 / 或細胞增生性病癥是多發性骨髓瘤或膀胱癌 ( 例如, 移行性細胞癌 ), 乳腺癌或肝癌。在一些實施方案中, 所述病癥是骨骼病癥, 例如, 軟 骨發育不全、 軟骨發育不良、 侏儒癥、 致死性發育不全 (TD ; 臨床形式 TD1 和 TDII) 或顱縫早閉綜合癥。
     在進一步的方面, 本發明提供本發明的制品在制備用于治療性和 / 或預防性治療 病癥的藥物中的用途, 所述病癥諸如與 FGFR3 激活和 / 或表達 ( 在一些實施方案中, 過表 達 ) 相關的病理學狀況。 在一些實施方案中, 所述病癥是癌癥、 腫瘤和 / 或細胞增生性病癥。 在一些實施方案中, 所述癌癥、 腫瘤和 / 或細胞增生性病癥是多發性骨髓瘤或膀胱癌 ( 例 如, 移行性細胞癌 ), 乳腺癌或肝癌。 在一些實施方案中, 所述病癥是骨骼病癥, 例如, 軟骨發 育不全、 軟骨發育不良、 侏儒癥、 致死性發育不全 (TD ; 臨床形式 TD1 和 TDII) 或顱縫早閉綜 合癥。
     在進一步的方面, 本發明提供本發明的試劑盒制備用于治療性和 / 或預防性治療 病癥的藥物中的用途, 所述病癥諸如與 FGFR3 激活和 / 或表達 ( 在一些實施方案中, 過表 達 ) 相關的病理學狀況。 在一些實施方案中, 所述病癥是癌癥、 腫瘤和 / 或細胞增生性病癥。 在一些實施方案中, 所述癌癥、 腫瘤和 / 或細胞增生性病癥是多發性骨髓瘤或膀胱癌 ( 例 如, 移行性細胞癌 ), 乳腺癌或肝癌。 在一些實施方案中, 所述病癥是骨骼病癥, 例如, 軟骨發 育不全、 軟骨發育不良、 侏儒癥、 致死性發育不全 (TD ; 臨床形式 TD1 和 TDII) 或顱縫早閉綜 合癥。
     在進一步的方面, 本發明提供本發明的抗 -FGFR3 抗體在制備用于抑制細胞增殖 的藥物中的用途。在進一步的方面, 本發明提供本發明的抗 -FGFR3 抗體在制備用于細胞殺 傷的藥物中的用途。在一些實施方案中, 所述細胞是多發性骨髓瘤細胞。在一些實施方案 中, 所述細胞被 ADCC 殺傷。在一些實施方案中, 所述抗體是裸抗體。在一些實施方案中, 所 述細胞過表達 FGFR3。
     在進一步的方面, 本發明提供本發明的抗 -FGFR3 抗體在制備用于清除細胞 ( 諸如 多發性骨髓瘤細胞 ) 的藥物中的用途。在一些實施方案中, 所述細胞被 ADCC 殺傷。在一些 實施方案中, 所述抗體是裸抗體。在一些實施方案中, 所述細胞過表達 FGFR3。
     本發明提供可用于調節與 FGFR3 的表達和 / 或信號傳導, 諸如增加表達和 / 或信 號傳導或不合乎需要的表達和 / 或信號傳導相關的病癥的方法和組合物。
     本發明的方法可以用來影響任何合適的病理學狀態。示例性的病癥如本文所 述, 并且包括選自由下列各項組成的組的癌癥 : 非小細胞肺癌 (non-small cell lung cancer), 卵 巢 癌, 甲 狀 腺 癌, 睪 丸 癌 (testicularcancer), 子 宮 內 膜 癌 (endometrial cancer), 頭頸癌, 腦癌 ( 例如, 神經母細胞瘤 (neuroblastoma) 或腦膜瘤 (meningioma)), 皮膚癌 ( 例如, 黑色素瘤, 基底細胞癌 (basal cell carcinoma) 或鱗狀細胞癌 ), 膀胱癌 ( 例如, 移行性細胞癌 ), 乳腺癌, 胃癌, 結直腸癌 (CRC), 肝細胞癌, 子宮頸癌, 肺癌, 胰腺癌, 前列腺癌和惡性血液病 ( 例如, T- 細胞急性淋巴細胞白血病 (T-ALL), B- 細胞急性淋巴細 胞白血病 (B-ALL), 急性髓細胞白血病 (AML), B- 細胞惡性腫瘤, 霍奇金淋巴瘤 (Hodgkin lymphoma) 和多發性骨髓瘤 )。在一些實施方案中, 所述病癥是侵襲性移行性細胞癌。在一 些實施方案中, 所述病癥是多發性骨髓瘤。 其他的示例性病癥包括骨骼病癥, 諸如軟骨發育 不全、 軟骨發育不良、 侏儒癥、 致死性發育不全 (TD ; 臨床形式 TD1 和 TDII) 或顱縫早閉綜合 癥。
     在某些實施方案中, 所述癌癥表達 FGFR3, 擴增的 FGFR3, 易位的 FGFR3, 和 / 或突變 的 FGFR3。 在某些實施方案中, 所述癌癥表達激活的 FGFR3。 在某些實施方案中, 所述癌癥表達易位的 FGFR3( 例如, t(4 ; 14) 易位 )。在某些實施方案中, 所述癌癥表達組成型 FGFR3。 在一些實施方案中, 組成型 FGFR3 包括酪氨酸激酶結構域和 / 或近膜結構域和 / 或配體結 合結構域中的突變。 在某些實施方案中, 所述癌癥表達配體不依賴性 FGFR3。 在一些實施方 案中, 所述癌癥表達配體依賴性 FGFR3。
     在一些實施方案中, 所述癌癥表達包含對應于 FGFR3-IIIbS248C 的突變的 FGFR3。 在 S248C S248C 一些實施方案中, 所述癌癥表達 FGFR3-IIIb 和 / 或 FGFR3-IIIc 。
     在一些實施方案中, 所述癌癥表達包含對應于 FGFR3-IIIbK652E 的突變的 FGFR3。 在 K652E K650E 一些實施方案中, 所述癌癥表達 FGFR3-IIIb 和 / 或 FGFR3-IIIc 。 S249C
     FGFR3 包含對應于 FGFR3-IIIb 的突變。在一些實施方案中, 所述癌癥表達 S249C S249C FGFR3-IIIb 和 / 或 FGFR3-IIIc 。
     在一個方面, 所述癌癥表達包含對應于 FGFR3-IIIbG372C 的突變的 FGFR3。 在一些實 G372C G370C 施方案中, 所述癌癥表達 FGFR3-IIIb 和 / 或 FGFR3-IIIc 。 Y375C
     在一個方面, 所述癌癥表達包含對應于 FGFR3-IIIb 的突變的 FGFR3。 在一些實 Y375C Y373C 施方案中, 所述癌癥表達 FGFR3-IIIb 和 / 或 FGFR3-IIIc 。
     在 一 些 實 施 方 案 中, 所 述 癌 癥 表 達 (a)FGFR3-IIIbK652E 和 (b)FGFR3-IIIbR248C, FGFR3-IIIbY375C, FGFR3-IIIbS249C, 和 FGFR3IIIb G372C 中的一種或多種。
     在 一 些 實 施 方 案 中, 所 述 癌 癥 表 達 (a)FGFR3-IIIbR248C 和 (b)FGFR3-IIIbK652E, FGFR3-IIIbY375C, FGFR3-IIIbS249C, 和 FGFR3-IIIbG372C 中的一種或多種。
     在 一 些 實 施 方 案 中, 所 述 癌 癥 表 達 (a)FGFR3-IIIbG372C 和 (b)FGFR3-IIIbK652E, FGFR3-IIIbY375C, FGFR3-IIIbS249C, 和 FGFR3-IIIbR248C 中的一種或多種。
     在 一 些 實 施 方 案 中,所 述 癌 癥 表 達 FGFR3-IIIbR248C, FGFR3-IIIbK652E, FGFR3-IIIbY375C, FGFR3-IIIb S249C, 和 FGFR3-IIIb G372C。
     在某些實施方案中, 所述癌癥表達相對于對照樣品 ( 例如, 正常組織的樣品 ) 或水 平增加水平的磷酸 -FGFR3, 磷酸 -FRS2 和 / 或磷酸 -MAPK。
     在一些實施方案中, 所述癌癥表達 ( 例如, 在細胞表面上 ) 約 10,000 個 FGFR3 分 子 / 細胞或更多 ( 諸如 11,000, 12,000, 13,000, 14,000, 15,000, 16,000, 17,000, 18,000 或 更多個 FGFR3 受體 )。在一些實施方案中, 所述癌癥表達約 13000 個 FGFR3 分子。在其他 實施方案中, 所述癌癥表達約 5000, 6000, 7000, 8000, 或更多個 FGFR3 分子。在一些實施方 案中, 所述癌癥表達小于約 4000, 3000, 2000, 1000, 或更少個 FGFR3 分子。在一些實施方案 中, 所述癌癥表達小于約 1000 個 FGFR3 分子。
     在一個實施方案中, 在本發明的方法中被靶向的細胞是癌細胞。例如, 癌細胞可 以是選自由下列各項組成的組的一種 : 乳腺癌細胞, 結直腸癌細胞, 肺癌細胞 ( 例如, 非 小細胞肺癌細胞 ), 甲狀腺癌細胞, 多發性骨髓瘤細胞, 睪丸癌細胞, 乳頭狀癌 (papillary carcinoma) 細胞, 結腸癌細胞, 胰腺癌細胞, 卵巢癌細胞, 宮頸癌細胞, 中樞神經細胞癌細 胞, 骨源性肉瘤 (osteogenic sarcoma) 細胞, 腎癌細胞, 肝細胞癌細胞, 膀胱癌細胞 ( 例如, 移行性細胞癌細胞 ), 胃癌細胞, 頭頸鱗狀癌細胞, 黑色素瘤細胞, 白血病細胞, 多發性骨髓 瘤細胞 ( 例如, 包含 t(4 ∶ 14)FGFR3 易位的多發性骨髓瘤細胞 ) 和結腸腺瘤細胞。在一個 實施方案中, 在本發明的方法中被靶向的細胞是過度增生和 / 或增生的細胞。在另一個實 施方案中, 在本發明的方法中被靶向的細胞是異常增生細胞 (dysplastic cell)。 還在另一個實施方案中, 在本發明的方法中被靶向的細胞是轉移細胞。
     在一個方面, 本發明提供抑制受試者中的細胞增殖的方法, 所述方法包括向所述 受試者施用有效量的抗 -FGFR3 抗體以減少細胞增殖。
     在一個方面, 本發明提供殺傷受試者中的細胞的方法, 所述方法包括向所述受試 者施用有效量的抗 -FGFR3 抗體以殺傷細胞。在一些實施方案中, 所述細胞是多發性骨髓瘤 細胞。在一些實施方案中, 所述細胞被 ADCC 殺傷。在一些實施方案中, 所述抗體是裸抗體。 在一些實施方案中, 所述細胞過表達 FGFR3。
     在一個方面, 本發明提供清除受試者中的細胞 ( 諸如多發性骨髓瘤細胞 ) 的方法, 所述方法包括向所述受試者施用有效量的抗 -FGFR3 抗體以殺傷細胞。在一些實施方案中, 所述細胞被 ADCC 殺傷。在一些實施方案中, 所述抗體是裸抗體。在一些實施方案中, 所述 細胞過表達 FGFR3。
     在一個方面, 本發明提供治療或預防骨骼病癥的方法。 在一些實施方案中, 所述病 癥是軟骨發育不全、 軟骨發育不良、 侏儒癥、 致死性發育不全 (TD ; 臨床形式 TD1 和 TDII) 或 顱縫早閉綜合癥。
     本發明的方法可以進一步包括附加的治療步驟。 例如, 在一個實施方案中, 一種方 法進一步包括一個步驟, 在所述步驟中被靶向的細胞和 / 或組織 ( 例如, 癌細胞 ) 暴露于放 射治療或化療劑。 在一個方面, 本發明提供了下述方法, 所述方法包括施用有效量的抗 -FGFR3 抗體 結合有效量的另一種治療劑 ( 諸如抗 - 血管生成劑, 另一種抗體, 化療劑, 細胞毒性劑, 免 疫抑制劑, 前藥, 細胞因子, 細胞毒性放射治療, 皮質類固醇, 止吐劑, 癌癥疫苗, 止痛劑, 或 生長抑制劑 )。例如, 抗 -FGFR3 抗體與抗癌劑或抗血管生成劑聯合使用以治療多種腫瘤 或非腫瘤病癥。在具體的實例中, 抗 -FGFR3 抗體與下列聯合使用 : 萬珂 (velcade), 來那 度胺 (revlimid), 他莫昔芬 (tamoxifen), 來曲唑 (letrozole), 依西美坦 (exemestane), 阿 那 曲 唑 (anastrozole), 伊 立 替 康 (irinotecan), 西 妥 昔 單 抗 (cetuximab), 氟維司 群 (fulvestrant), 長 春 瑞 濱 (vinorelbine), 貝 伐 珠 單 抗 (bevacizumab), 長春新堿 (vincristine), 順鉑 (cisplain), 吉西他濱 (gemcitabine), 甲氨蝶呤 (methotrexate), 長 春堿 (vinblastine), 卡鉑 (carboplatin), 紫杉醇 (paclitaxel), 多西他賽 (docetaxel), 培 美 曲 塞 (pemetrexed), 5- 氟 尿 嘧 啶 (5-fluorouracil), 多 柔 比 星 (doxorubicin), 硼 替 佐 米 (bortezomib), 來 那 度 胺 (lenalidomide), 地 塞 米 松 (dexamethasone), 馬 法 蘭 (melphalin), 潑 尼 松 (prednisone), 長 春 新 堿 (vincristine) 和 / 或 沙 利 度 胺 (thalidomide)。
     取決于待治療的具體癌癥適應證, 本發明的聯合療法可以與附加的治療劑諸如化 療劑, 或附加的療法諸如放療或手術結合。許多已知的化療劑可以用于本發明的聯合療法 中。優選使用為用于治療所述具體適應證的標準的那些化療劑。要聯合使用的每種治療劑 的劑量或頻次優選與當不使用其他一種或多種藥劑時相應治療劑的劑量或頻次相同, 或小 于相應治療劑的劑量或頻次。
     在另一個方面, 本發明提供本文所述的任一種抗 -FGFR3 抗體, 其中所述抗 -FGFR3 抗體包含可檢測的標記物。
     在另一個方面, 本發明提供本文所述的任一種抗 -FGFR3 抗體和 FGFR3 的復合體。
     在一些實施方案中, 所述復合體在體內或體外。在一些實施方案中, 所述復合體包含癌細 胞。在一些實施方案中, 抗 -FGFR3 抗體被可檢測地標記。
     附圖簡要說明
     圖 1A, 1B 和 1C : 抗 -FGFR3 抗體的重鏈和輕鏈 HVR 環序列。所述附圖顯示重鏈 HVR 序列, H1, H2 和 H3, 以及輕鏈 HVR 序列, L1, L2, 和 L3。序列編號如下 :
     克隆 184.6(HVR-H1 是 SEQ ID NO : 1; HVR-H2 是 SEQ ID NO : 2; HVR-H3 是 SEQ ID NO : 3; HVR-L1 是 SEQ ID NO : 4; HVR-L2 是 SEQ IDNO : 5; HVR-L3 是 SEQ ID NO : 6) ;
     克隆 184.6.1(HVR-H1 是 SEQ ID NO : 7; HVR-H2 是 SEQ ID NO : 8; HVR-H3 是 SEQ ID NO : 9; HVR-L1 是 SEQ ID NO : 10 ; HVR-L2 是 SEQ IDNO : 11 ; HVR-L3 是 SEQ ID NO : 12)
     克隆 184.6.58(HVR-H1 是 SEQ ID NO : 13 ; HVR-H2 是 SEQ ID NO : 14 ; HVR-H3 是 SEQ ID NO : 15 ; HVR-L1 是 SEQ ID NO : 16 ; HVR-L2 是 SEQ IDNO : 17 ; HVR-L3 是 SEQ ID NO : 18)
     克隆 184.6.62(HVR-H1 是 SEQ ID NO : 48 ; HVR-H2 是 SEQ ID NO : 49 ; HVR-H3 是 SEQ ID NO : 50 ; HVR-L1 是 SEQ ID NO : 51 ; HVR-L2 是 SEQ IDNO : 52 ; HVR-L3 是 SEQ ID NO : 53)
     克隆 184.6.21(HVR-H1 是 SEQ ID NO : 54 ; HVR-H2 是 SEQ ID NO : 55 ; HVR-H3 是 SEQ ID NO : 56 ; HVR-L1 是 SEQ ID NO : 57 ; HVR-L2 是 SEQ IDNO : 58 ; HVR-L3 是 SEQ ID NO : 59)
     克隆 184.6.49(HVR-H1 是 SEQ ID NO : 60 ; HVR-H2 是 SEQ ID NO : 61 ; HVR-H3 是 SEQ ID NO : 62 ; HVR-L1 是 SEQ ID NO : 63 ; HVR-L2 是 SEQ IDNO : 64 ; HVR-L3 是 SEQ ID NO : 65)
     克隆 184.6.51(HVR-H1 是 SEQ ID NO : 66 ; HVR-H2 是 SEQ ID NO : 67 ; HVR-H3 是 SEQ ID NO : 68 ; HVR-L1 是 SEQ ID NO : 69 ; HVR-L2 是 SEQ IDNO : 70 ; HVR-L3 是 SEQ ID NO : 71)
     克隆 184.6.52(HVR-H1 是 SEQ ID NO : 72 ; HVR-H2 是 SEQ IDNO : 73 ; HVR-H3 是 SEQ ID NO : 74 ; HVR-L1 是 SEQ ID NO : 75 ; HVR-L2 是 SEQ ID NO : 76 ; HVR-L3 是 SEQ ID NO : 77)
     克隆 184.6.92(HVR-H1 是 SEQ ID NO : 78 ; HVR-H2 是 SEQ IDNO : 79 ; HVR-H3 是 SEQ ID NO : 80 ; HVR-L1 是 SEQ ID NO : 81 ; HVR-L2 是 SEQ ID NO : 82 ; HVR-L3 是 SEQ ID NO : 83)
     克隆 184.6.1.N54S(HVR-H1 是 SEQ ID NO : 84 ; HVR-H2 是 SEQ IDNO : 85 ; HVR-H3 是 SEQ ID NO : 86 ; HVR-L1 是 SEQ ID NO : 87 ; HVR-L2 是 SEQ ID NO : 88 ; HVR-L3 是 SEQ ID NO : 89)
     克隆 184.6.1.N54G(HVR-H1 是 SEQ ID NO : 90 ; HVR-H2 是 SEQ IDNO : 91 ; HVR-H3 是 SEQ ID NO : 92 ; HVR-L1 是 SEQ ID NO : 93 ; HVR-L2 是 SEQ ID NO : 94 ; HVR-L3 是 SEQ ID NO : 95)
     克隆 184.6.1.N54A(HVR-H1 是 SEQ ID NO : 96 ; HVR-H2 是 SEQ IDNO : 97 ; HVR-H3 是 SEQ ID NO : 98 ; HVR-L1 是 SEQ ID NO : 99 ; HVR-L2 是 SEQ ID NO : 100 ; HVR-L3 是 SEQ ID NO : 101)
     克隆 184.6.1.N54Q(HVR-H1 是 SEQ ID NO : 102 ; HVR-H2 是 SEQID NO : 103 ; HVR-H3 是 SEQ ID NO : 104 ; HVR-L1 是 SEQ ID NO : 105 ; HVR-L2 是 SEQ ID NO : 106 ; HVR-L3 是 SEQ ID NO : 107)
     克隆 184.6.58.N54S(HVR-H1 是 SEQ ID NO : 108 ; HVR-H2 是 SEQID NO : 109 ; HVR-H3 是 SEQ ID NO : 110 ; HVR-L1 是 SEQ ID NO : 111 ; HVR-L2 是 SEQ ID NO : 112 ; HVR-L3 是 SEQ ID NO : 113)
     克隆 184.6.58.N54G(HVR-H1 是 SEQ ID NO : 114 ; HVR-H2 是 SEQID NO : 115 ; HVR-H3是 SEQ ID NO : 116 ; HVR-L1 是 SEQ ID NO : 117 ; HVR-L2 是 SEQ ID NO : 118 ; HVR-L3 是 SEQ ID NO : 119)
     克隆 184.6.58.N54A(HVR-H1 是 SEQ ID NO : 120 ; HVR-H2 是 SEQID NO : 121 ; HVR-H3 是 SEQ ID NO : 122 ; HVR-L1 是 SEQ ID NO : 123 ; HVR-L2 是 SEQ ID NO : 124 ; HVR-L3 是 SEQ ID NO : 125)
     克隆 184.6.58.N54Q(HVR-H1 是 SEQ ID NO : 126 ; HVR-H2 是 SEQID NO : 127 ; HVR-H3 是 SEQ ID NO : 128 ; HVR-L1 是 SEQ ID NO : 129 ; HVR-L2 是 SEQ ID NO : 130 ; HVR-L3 是 SEQ ID NO : 131)。
     克 隆 184.6.1.NS D30E(HVR-H1 是 SEQ ID NO : 143 ; HVR-H2 是 SEQ ID NO : 144 ; HVR-H3 是 SEQ ID NO : 145 ; HVR-L1 是 SEQ ID NO : 140 ; HVR-L2 是 SEQ ID NO : 141 ; HVR-L3 是 SEQ ID NO : 142)。
     氨基酸位置根據下述 Kabat 編號系統進行編號。
     圖 2A 和 2B : 描繪了 (A) 抗 -FGFR3 抗體 184.6.1.N54S, 184.6.58, 和 184.6.62 的 重鏈可變區和輕鏈可變區的氨基酸序列 ; 和 (B) 抗 -FGFR3 抗體 1G6, 6G1, 和 15B2 的高變區。
     圖 3A, 3B, 和4: 描繪了示例性的接納體 (acceptor) 人共有構架序列, 其用于使用 如下的序列標識符實施本發明 :
     可變重鏈 (VH) 共有構架 ( 圖 3A, 3B)
     人 VH 亞組 I 共有構架減去 Kabat CDRs(SEQ ID NOS : 19 和 203-205)
     人 VH 亞 組 I 共 有 構 架 減 去 延 伸 的 高 變 區 (SEQ ID NOS : 20 和 206-208, 21 和 209-211, 22 和 212-214)
     人 VH 亞組 II 共有構架減去 Kabat CDRs(SEQ ID NOS : 23 和 215-217)
     人 VH 亞組 II 共有構架減去延伸的高變區 (SEQ ID NOS : 24 和 218-220, 25 和 221-223, 26 和 224-226)
     人 VH 亞組 II 共有構架減去延伸的
     人 VH 亞組 III 共有構架減去 Kabat CDRs(SEQ ID NOS : 27 和 227-229)
     人 VH 亞組 III 共有構架減去延伸的高變區 (SEQ ID NOS : 28 和 230-232, 29 和 233-235, 30 和 236-238)
     人 VH 接納體構架減去 Kabat CDRs(SEQ ID NOS : 31 和 239-241)
     人 VH 接納體構架減去延伸的高變區 (SEQ ID NOS : 32 和 242-244, 33 和 2245-247)
     人 VH 接納體 2 構架減去 Kabat CDRs(SEQ ID NOS : 34 和 248-250)
     人 VH 接納體 2 構架減去延伸的高變區 (SEQ ID NOS : 35 和 251-253, 36 和 254-256, 37 和 257-259)
     可變輕鏈 (VL) 共有構架 ( 圖 4)
     人 VLκ 亞組 I 共有構架 (SEQ ID NO : 38 和 260-262)
     人 VLκ 亞組 II 共有構架 (SEQ ID NO : 39 和 263-265)
     人 VLκ 亞組 III 共有構架 (SEQ ID NO : 40 和 266-268)
     人 VLκ 亞組 IV 共有構架 (SEQ ID NO : 41 和 269-271)
     圖5: 描繪了 huMAb4D5-8 輕鏈 (SEQ ID NOS : 42-45) 和重鏈 (SEQ IDNOS : 46, 47, 175, 176) 的構架區序列。上標 / 粗體中的數字表示按照 Kabat 的氨基酸位置。圖6 : 描繪了 huMAb4D5-8 輕鏈 (SEQ ID NOS : 42, 43, 177, 45) 和重鏈 (SEQ ID NOS : 46, 47, 178, 和 176) 的修飾 / 變體的構架區序列。上標 / 粗體中的數字表示按照 Kabat 的 氨基酸位置。上標 / 粗體中的數字表示按照 Kabat 的氨基酸位置。
     圖7 : 在膀胱癌細胞 RT112 中敲低 FGFR3 抑制增殖并在體外誘導 G1 細胞周期停滯, 并在體內抑制腫瘤生長。將三種不同的 FGFR3shRNA 克隆進 Tet- 可誘導型表達載體中。使 用嘌呤霉素選擇建立穩定表達 FGFR3shRNAs 或對照 shRNA 的 RT112 細胞。 (A) 在選擇的用強 力霉素處理或未用強力霉素 (Dox, 0, 0.1 和 1μg/ml, 從左至右 ) 處理的克隆中顯示 FGFR3 3 表達的代表性印跡 .(B)RT112 穩定細胞的 [ H]- 胸苷的摻入。 將 RT112 穩定的克隆用或不用 3 1μg/ml 強力霉素培養 3 天, 然后與 [ H]- 胸苷 (1μCi/ 孔 ) 溫育 16 小時。摻入的 [3H]- 胸 苷的計數針對來自沒有使用強力霉素誘導的細胞的計數進行標準化。 誤差條代表 SEM。 (C) RT112 穩定細胞的 DNA 熒光流式細胞儀直方圖。表達對照 shRNA 或 FGFR3 shRNA4 的 RT112 克隆用或不用 1μg/ml 強力霉素培養 72 小時, 并用碘化丙啶 (PI) 染色細胞核。對 FGFR3 shRNA2 和 6 獲得類似的結果 ( 圖 16)。(D) 表達對照 shRNA( 每個處理組 n = 9) 或 FGFR3 shRNA4( 每個處理組 n = 11) 的 RT112 細胞在小鼠中的生長。小鼠單獨給予 5%蔗糖或補 充以 1mg/ml 強力霉素, 并且一周測量腫瘤大小兩次。誤差條代表 SEM。對 FGFR3shRNA2 和 6 獲得類似的結果 ( 圖 16)。下部圖片 : 從對照 shRNA 或 FGFR3shRNA4 穩定細胞異種移植物 組織中提取的腫瘤裂解產物中 FGFR3 蛋白的表達。
     圖8: R3Mab 阻斷 FGF/FGFR3 相互作用。(A)R3Mab 對人 FGFR3 的選擇性結合。人 FGFR1-4Fc 嵌合蛋白被固定并與漸增量的 R3Mab 溫育。使用抗 - 人 Fab 抗體檢測特異性 結合。(B-C)R3Mab 阻斷 FGF1 與人 FGFR3-IIIb(B) 或 IIIc(C) 的結合。使用生物素化的 FGF1- 特異性多克隆抗體檢測特異性結合。(D-E)R3Mab 阻斷 FGF9 與人 FGFR3-IIIb(D) 或 IIIc(E) 的結合。使用生物素化的 FGF9- 特異性多克隆抗體檢測特異性結合。誤差條代表 平均值的標準誤差 (SEM) 并且有時小于符號。
     圖9 : R3Mab 抑制由野生型和突變的 FGFR3 驅動的 Ba/F3 細胞增殖。 (A)R3Mab 對表 達野生型人 FGFR3-IIIb 的 Ba/F3 細胞的活力的抑制作用。細胞在不含 FGF1( 無 FGF1) 的 培養基中培養, 或在單獨的 10ng/ml FGF1 加 10μg/ml 肝素 (FGF1) 的存在下培養, 或結合 對照抗體 (Control) 或 R3Mab 培養。在與抗體溫育 72 小時后用 CellTiter-Glo(Promega) 評價細胞活力。(B) 在 Ba/F3-FGFR3-IIIbWT 穩定的細胞中 R3Mab 對 FGFR3 和 MAPK 磷酸化 的抑制。將細胞用 15ng/ml FGF1 和 10μg/ml 肝素 (+) 或單獨肝素 (-) 處理 10 分鐘, 然后 與對照 Ab(Ctrl), 遞減量的 PBS 中的 R3Mab( 分別為 1, 0, 2, 0.04μg/ml), 或單獨 PBS( 模擬 653/654 Thr202/Tyr204 (Mock)) 預溫育 3 小時。裂解產物用分別針對 pFGFRY 和 pMAPK 的抗體進行免 疫印跡以評價 FGFR3 和 p44/42MAPK 的磷酸化。(C) 基于發表的數據的膀胱癌中 FGFR3 突變 熱點和頻次的示意性圖示 ( 繪制的序列編號基于 FGFR3IIIb 同種型氨基酸序列 )(32)。 TM, 跨膜結構域 ; TK1 和 TK2, 酪氨酸激酶結構域 1 和 2。(D-H)R3Mab 對表達癌相關 FGFR3 突變 體的 Ba/F3 細胞的活力的抑制作用。G372C 來自 IIIc 同種型, 且其余的來自 IIIb 同種型。 對于所有突變體的序列編號基于 FGFR3IIIb 同種型氨基酸序列 ( 包括 G372C 突變體, 其將 基于 FGFR3IIIc 同種型氨基酸序列編號為 G370C)。如 (A) 中所述在與抗體溫育 72 小時后 評價細胞活力。誤差條表示 SEM。
     圖 10 : R3Mab 的表位作圖以及 R3Mab Fab 片段和人 FGFR3-IIIb 的 IgD2-D3 之間的復合體的晶體結構。(A) 通過跨越人 FGFR3 的 IgD2-D3 的 13 個肽與 R3Mab 的結合確定 的表位。每個生物素化的肽被俘獲在鏈霉抗生物素蛋白 (streptavidin) 包被的微量滴定 孔上并與 R3Mab 溫育。使用山羊抗人 IgG 抗體檢測特異性結合的 R3Mab。(B) 人 FGFR3 肽 3(LAVPAANTVRFRCPA(SEQ ID NO : 179) 和 11(SDVEFHCKVYSDAQP(SEQ ID NO : 180) 與人 FGFR1 的細胞外區段 ( 肽 3 : HAVPAAKTVKFKCPS(SEQ ID NO : 181) ; 肽 11 : SNVEFMCKVYSDPQP(SEQ ID NO : 182)) 的序列比對。參與初級 FGF2-FGFR1 相互作用、 肝素結合、 和受體 - 受體締合的 FGFR1 殘基分別以粗體、 斜體和下劃線的字體顯示。FGFR1 殘基的功能比對基于 Plotnikov 等 (34)。(C) 與人 FGFR3IgD2-D3( 顯示在分子表面, 白色 ) 形成復合體的 R3Mab Fab( 顯 示為絲帶 - 螺旋, 輕鏈灰色, 重鏈黑色 ) 的結構。參與配體結合和二聚作用的受體殘基基 于 Plotnikov 等 (34) 分別以灰色 / 陰影交叉線和深灰色著色。(D) 晶體結構的特寫顯 示 來 自 Fab 的 CDR-H3 和 -H2 構 成 與 FGFR3 的 IgD2 和 IgD3 的 主 要 相 互 作 用 位 點。(E) FGFR3-IIIc-FGF1 復合體 (PDB 代碼 1RY7) 與 FGFR3-IIIb-Fab 復合體的重疊。FGFR3-IIIc 和 FGF1 分別以灰色和深灰色著色。FGFR3-IIIb 以白色顯示, 且 Fab 以淺灰色顯示輕鏈, 深 灰色顯示重鏈。IgD2 用作用于重疊的錨。注意當被 R3Mab 結合時來自兩個結構的重疊良好 的 IgD2 和 FGFR3-IIIb 的 IgD3 所采取的新構象。(F)FGFR3-IIIc-FGF1 復合體 (PDB 代碼 1RY7) 與 FGFR3-IIIb-Fab 復合體重疊的另一圖示。FGFR3-IIIc 和 FGF1 顯示為分子表面, 它們分別是灰色 / 網狀構造和深灰色 / 斑點構造。FGFR3-IIIb 顯示為白色且 Fab 以灰色顯 示輕鏈, 黑色顯示重鏈。IgD2 用作用于重疊的錨。注意當被 R3Mab 結合時來自兩個結構的 重疊良好的 IgD2 和 FGFR3-IIIb 的 IgD3 所采取的新構象。
     圖 11 : R3Mab 抑制表達野生型或突變的 FGFR3S249C 的膀胱癌細胞中的增殖、 克隆性 3 生長和 FGFR3 信號傳導。(A) 在膀胱癌細胞系 RT112 中 R3Mab 抑制 [ H]- 胸苷摻入。誤差 條代表 SEM。 (B) 在膀胱癌細胞系 RT112 中與單獨處理培養基 (Mock) 或對照抗體 (Ctrl) 相 比較, R3Mab(15μg/ml) 阻斷 FGF1- 激活的 FGFR3 信號傳導。細胞裂解物用抗 -FGFR3 抗體 免疫沉淀并用抗磷酸 - 酪氨酸抗體 (4G10) 評價 FGFR3 磷酸化。將裂解物免疫印跡以檢測 AKT(pAKTS473) 和 p44/42MAPK(pMAPKThr202/Tyr204) 的磷酸化。 (C) 在膀胱癌細胞系 UMUC-14( 攜帶 S249C FGFR3 ) 中與單獨處理培養基 (Mock) 或對照抗體 (Ctrl) 相比較, R3Mab(10μg/ml) 抑制 克隆性生長。 (D)(C) 中研究的定量, 從 12 個孔的復孔報告每孔直徑大于 120μm 的集落數。 -9 誤差條代表 SEM。P < 3.4X10 相對于 Mock 或 Ctrl。(E) 在 UMUC-14 細胞中 R3Mab(15μg/ ml) 抑制 FGFR3 磷酸化。如 (B) 中那樣分析 FGFR3 磷酸化。注意在此細胞系中 FGFR3 的組 成型磷酸化。
     圖 12 : R3Mab 通過將二聚體 - 單體平衡朝向單體狀態驅動來減少二硫化物連接的 S249C FGFR3 二聚體的穩態水平。(A) 在 UMUC-14 細胞中 R3Mab 對 FGFR3S249C 二聚體的作用。將 細胞與 R3Mab(15μg/ml) 或對照抗體 (Ctrl) 溫育 3 小時, 且通過在非還原和還原條件下的 免疫印跡來分析全細胞裂解物。 (B) 在 UMUC-14 細胞中游離巰基阻斷劑 DTNB 對 FGFR3S249C 二 聚體 - 單體平衡的作用。 將 UMUC-14 細胞用漸增濃度的 DTNB 處理 3 小時, 如 (A) 中那樣分析 S249C 細胞裂解物。(C) 在體外 R3Mab 對純化的重組 FGFR3 二聚體的作用。由 IgD2-D3 構成的 S249C FGFR3 二聚體通過尺寸排阻柱純化, 并與 PBS(Mock), 對照抗體 (Ctrl), 或 R3Mab 在 37℃ 下溫育。在指定的時間收集樣品用于在非還原條件下進行免疫印跡分析。使用抗 -FGFR3 雜交瘤抗體 6G1(A-C) 檢測 FGFR3 二聚體 - 單體。圖 13 : R3Mab 抑制膀胱癌細胞的異種移植物生長和 Ba/F3-FGFR3S249C 的同種異體移 植物生長。(A) 與賦形劑 (vehicle) 對照相比, R3Mab 對預先形成的 RT112 膀胱癌異種移植 物的生長的作用。每組 n = 10。(B)R3Mab 抑制 RT112 腫瘤組織中的 FGFR3 信號傳導。在 獨立的實驗中, 收集用 15mg/kg 對照抗體 (Ctrl) 或 R3Mab 處理 48 小時或 72 小時的 RT112 異種移植物腫瘤 ( 每組 n = 3), 勻漿并通過免疫印跡分析 FRS2α 和 MAPK 激活。(C)R3Mab S249C 對預先形成的 Ba/F3-FGFR3 同種異體移植物的生長的作用。每組 n = 10。(D)R3Mab 對 預先形成的 UMUC-14 膀胱異種移植物的生長的作用, 每組 n = 10。(E) 在 UMUC-14 腫瘤組 S249C 織中 R3Mab 對 FGFR3 二聚體和信號傳導的作用。收集用 30mg/kg 對照抗體 (Ctrl) 或 R3Mab 處理 24 小時或 72 小時的 UMUC-14 異種移植物腫瘤 ( 每組 n = 3), 勻漿并通過免疫 S249C 印跡分析 FGFR3 二聚體 - 單體以及 MAPK 激活。使用抗 -FGFR3 兔多克隆抗體 sc9007 檢 測 FGFR3 二聚體 - 單體以避免來自腫瘤裂解物中小鼠 IgG 的干擾。誤差條代表 SEM。
     圖 14 : 在 t(4 ; 14) 陽性多發性骨髓瘤模型中, ADCC 有助于 R3Mab 的抗 - 腫瘤功效。 (A-B)R3Mab 對預先形成的 OPM2(A) 和 KMS11(B) 骨髓瘤異種移植物的生長的作用。每組 n = 10。(C-F) 在細胞培養中 R3Mab 誘導的骨髓瘤細胞系 OPM2(C) 和 KMS11(D), 或膀胱癌細 胞系 RT112(E) 和 UMUC-14(F) 的細胞裂解。骨髓瘤或膀胱癌細胞與新鮮分離的人 PBMC 在 R3Mab 或對照抗體的存在下溫育。細胞毒性通過測量上清液中釋放的 LDH 來測定。(G-H) R3Mab 或其 DANA 突變體對預先形成的 OPM2(G) 和 KMS11(H) 骨髓瘤異種移植物的生長的作 用。每組 n = 10。誤差條代表 SEM 并且有時小于符號。
     圖 15 : 用 siRNA 敲低 FGFR3 抑制膀胱癌細胞系的細胞增殖。在 Genentech 設計和 合成 6-7 種不同的 FGFR3 siRNAs 和三種非特異性對照 siRNA。將膀胱癌細胞系 RT112(A), SW780(B), RT4(C) 和 UMUC-14(D) 接種至 96 孔板 (3000 細胞 / 孔 ) 中并使其貼壁過夜, 并且 3 用與 RNAiMax(Invitrogen) 形成復合體的 25nM siRNA 瞬時轉染。轉染后 72hr, 將 [ H]- 胸 3 苷 (1μCi/ 孔 ) 加入至培養物 (A, C, 和 D) 中進行另外 16 小時溫育。摻入的 [ H]- 胸苷用 TopCount 定量。數據針對來自用單獨 RNAiMax 轉染的細胞 (Mock) 的數據進行標準化。誤 差條代表 SEM。下部圖片 : 顯示 siRNA 轉染的細胞中 FGFR3 表達的代表性印跡。(B) 轉染后 96 小時用 CellTiter-Glo(Promega) 測量細胞活力。誤差條代表 SEM。
     圖 16 : 在膀胱癌細胞系 RT112 中敲低 FGFR3 在體外誘導 G1 細胞周期停滯, 并在體 內抑制腫瘤生長。設計三種不同的 FGFR3RNA 并克隆至 Tet- 誘導型 shRNA 表達逆轉錄病 毒載體中。采用嘌呤霉素選擇建立表達 FGFR3shRNA 或對照 shRNA 的 RT112 穩定的克隆。 (A) 在用或不用 1μg/ml 強力霉素處理 72 小時后從表達 FGFR3shRNA2 或 shRNA6 的 RT112 穩定的細胞獲得的碘化丙啶 (PI)- 染色的細胞核的 DNA 熒光流式細胞儀直方圖。(B) 表達 FGFR3shRNA2-4( 每個處理組 n = 11) 或 FGFR3shRNA6-16( 每個處理組 n = 10) 的 RT112 穩定的細胞在 nu/nu 小鼠中的生長。荷瘤小鼠接受僅 5%蔗糖 ( 實心圓圈 ) 或 5%蔗糖加 1mg/ml 強力霉素 ( 實心方形 ), 并且用測徑器測量腫瘤一周兩次。誤差條代表 SEM。
     圖 17 : 抗 -FGFR3 雜交瘤抗體 16G, 6G1 和 15B2 對由野生型和突變的 FGFR3 驅動的 Ba/F3 細胞增殖的作用。抗 -FGFR3 雜交瘤抗體通過用人 FGFR3-IIIb/Fc 或人 FGFR3-IIIc/ Fc 嵌 合 體 免 疫 BALB/c 小 鼠 產 生。 在 來 自 雜 交 瘤 選 擇 試 劑 盒 (StemCell Technologies, Inc., Vancouver, BC, Canada) 的培養基 D 中使用次黃嘌呤 - 氨基喋呤 - 胸 苷選擇來選擇融合的雜交瘤細胞。相繼地通過 ELISA 篩選雜交瘤抗體結合 FGFR3-IIIb 和FGFR3-IIIc 的能力并通過 FACS 識別細胞表面 FGFR3。然后將選擇的雜交瘤通過有限稀釋 克隆。類似于圖 9A 中所述, 16G, 6G1 和 15B2 是用來評價對表達野生型或突變的 FGFR3 的 Ba/F3 細胞增殖的作用的克隆。誤差條代表 SEM。
     圖 18 : 通過肽譜和晶體結構分析確定的 R3Mab 表位的比較。(A) 由與人 FGFR3 的 細胞外 IgD2-D3 區段形成復合體的 R3Mab Fab 片段的結構揭示的表位。與 Fab 重鏈和輕鏈 接觸的 FGFR3 殘基分別用黑色和灰色著色。(B)FGFR3 上肽 3 和 11 的位置。
     圖 19 : 在包含野生型或突變的 FGFR3S249C 的膀胱癌細胞中, R3Mab 抑制增殖和 FGFR3 信號傳導。(A) 在膀胱癌細胞系 RT4 中 R3Mab 抑制細胞活力。在與抗體溫育 96hr 后用 CellTiter-Glo(Promega) 評價細胞活力。誤差條代表 SEM。(B) 在膀胱癌細胞系 RT4 中 R3Mab(15ug/ml) 阻斷 FGF1- 激活的 FGFR3 信號傳導。(C) 在膀胱癌細胞系 RCC-97-7( 包 含 FGFR3S249C) 中, R3Mab 抑制 [3H]- 胸苷摻入。誤差條代表 SEM。(D) 在 TCC-97-7 細胞中, R3Mab(15ug/ml) 抑制 FGFR3 磷酸化。(E) 與對照抗體 (Ctrl) 相比, 在與 R3Mab(15ug/ml) S249C 溫育 3 小時后 TCC-97-7 細胞中的 FGFR3 二聚體減少。
     圖 20 : 在 UMUC-14 細胞中, 胞吞作用抑制劑對 R3Mab 和 FGFR3S249C 二聚體的內在化 的作用。(A) 胞吞作用抑制劑對 R3Mab 的內在化的作用。將用各種胞吞作用抑制劑或 DMSO 在 37℃下預處理 1 小時的 UMUC-14 細胞與 R3Mab(15ug/ml) 在 37℃下溫育 3 小時以允許內 在化。使用低 pH 洗滌來移除細胞表面 R3Mab 從而使內在化的抗體可視化。固定細胞并用 Alexa 488- 標記的抗 - 人 IgG 染色細胞。使用共聚焦顯微鏡攝取圖像。(B) 在用 R3Mab 處 理的 UMUC-14 細胞中, 胞吞作用抑制劑對 FGFR3S249C 二聚體的作用。將用各種胞吞作用抑制 劑或 DMSO 在 37℃下預處理 1 小時的 UMUC-14 細胞與載體對照 (mock)(1 道 ), 對照抗體 (2 道 ), 或 R3Mab(15ug/ml, 3 道 ) 在 37℃下溫育 3 小時。細胞裂解物在非還原或還原條件下 通過免疫印跡分析 FGFR3 蛋白。注意氯丙嗪 ( 網格蛋白介導的胞吞作用的抑制劑 ) 和染料 木素 ( 胞吞作用的 pan- 抑制劑 (pan-inhibitor)) 阻斷 R3Mab 內在化, 但對 R3Mab 誘導的 S249C FGFR3 二聚體減少沒有作用。
     圖 21 : 不同抗 -FGFR3 抗體在非還原條件下針對單體和二聚體 FGFR3S249C 的檢測靈 敏度。在用 R3Mab(1 道 ), 對照 IgG1(2 道 ), 或 PBS(3 道 ) 處理 3 小時后, 將 UMUC-14 細胞 裂解, 并將細胞裂解物在還原或非還原條件下進行免疫印跡分析。注意 6G1( 在 Genentech 產生的鼠雜交瘤抗體 ) 檢測 FGFR3S249C 二聚體和單體兩者, 而 sc9007( 兔多克隆抗體, SantaCruz Biotechnology) 或 sc13121( 鼠雜交瘤抗體, Santa Cruz Biotechnology) 優先 S249C 地檢測二聚體 FGFR3 。
     圖 22 : R3Mab 對 t(4 ; 14)+ 多發性骨髓瘤細胞的增殖的作用。 (A)R3Mab 對 UTMC-2 細 3 胞的 [ H]- 胸苷摻入的抑制作用。 UTMC-2 細胞在包含 R3Mab 或對照抗體的培養基中在 25ng/ ml FGF9 和 5ug/ml 肝素或單獨肝素 ( 無 FGF9) 的存在下生長。溫育 6 天后, 加入 [3H]- 胸 苷溫育 16hr。數據針對來自在缺少 FGF9 和抗體的條件下生長的細胞的數據進行標準化。 (B-C)R3Mab 對 OPM2(B) 和 KMS11(C) 細胞的 [3H]- 胸苷摻入的作用。生長在 1.5 % FBS 培 養基中的細胞用 R3Mab 或對照抗體處理 6 天。數據針對來自未處理的細胞的數據進行標準 化。誤差條代表 SEM。
     圖 23 : 骨髓瘤和膀胱癌細胞中 FGFR3 的細胞表面表達水平。(A) 通過 FACS 分析 評估的骨髓瘤細胞和膀胱癌細胞中的細胞表面 FGFR3 表達。細胞用藻紅蛋白 - 綴合的針對人 FGFR3 的小鼠 mAb(FAB766P, R&DSystems) 或藻紅蛋白 - 綴合的同種型對照小鼠 IgG1(BD Pharmingen) 染色。(B) 骨髓瘤細胞和膀胱癌細胞中 FGFR3 密度的 Scatchard 分析。R3Mab 被放射性碘化并與細胞在含有過量未標記的抗體的懸浮液中溫育。在 RT 下溫育 2 小時后, 細胞通過離心沉淀, 并洗滌兩次。測定特異性結合的 125I。受體密度和結合親合力 (Kd) 代 表兩次結合實驗的平均值。
     圖 24 : R3Mab 或其 DANA 突變體對膀胱癌細胞的異種移植物生長的作用。(A)R3Mab 和其 DANA 突變體 ( 各自 50mg/kg) 對預先形成的 RT112 腫瘤的生長的作用。(B)R3Mab 和其 DANA 突變體 ( 各自 50mg/kg) 對預先形成的 UMUC-14 腫瘤的生長的作用。誤差條代表 SEM。
     發明詳述
     本發明在本文中提供可用于例如, 治療或預防與 FGFR3 的表達和 / 或活性, 諸如增 加的表達和 / 或活性或不合乎需要的表達和 / 或活性相關的疾病狀態的抗 -FGFR3 抗體。 在 一些實施方案中, 本發明的抗體用來治療腫瘤、 癌癥和 / 或細胞增生性病癥。
     在另一個方面, 本發明的抗 -FGFR3 抗體具有用作檢測和 / 或分離 FGFR3, 諸如在多 種組織和細胞類型中檢測 FGFR3 的試劑的用途。
     本發明進一步提供制備和使用抗 -FGFR3 抗體、 和編碼抗 -FGFR3 抗體的多核苷酸 的方法。
     通用技術
     本文所述或參考的技術和方法通常是本領域技術人員充分了解的并且使用常 規方法普遍地采用的, 諸如例如, 在下述參考文獻中所述廣泛使用的方法 : Sambrook 等, 分子克隆: 實 驗 室 手 冊 (Molecular Cloning : ALaboratory Manual), 第 3 版 (2001) 冷 泉 港 實 驗 室 出 版 社, 冷 泉 港, N.Y. 現 代 分 子 生 物 學 實 驗 技 術 (CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULARBIOLOGY)(F.M.Ausubel, 等 . 編 輯, (2003)) ; 酶 學 方 法 (Methods INENZYMOLOGY) 系列 ( 學術出版社公司 ) : PCR 2 : 實用方法 (PCR 2 : APRACTICAL APPROACH) (M.J.MacPherson, B.D.Hames 和 G.R.Taylor 編 輯 (1995)), Harlow 和 Lane, 編 輯 (1988) 抗 體, 實 驗 室 手 冊, 和 動 物 細 胞 培 養 (ANTIBODIES, A LABORATORY MANUAL, and ANIMAL CELLCULTURE)(R.I.Freshney, 編輯 (1987))。
     定義
     “分離的” 抗體指已經鑒定且與其天然環境的成分分離和 / 或從其回收的抗體。 抗體的天然環境的污染性成分是將會干擾其診斷或治療用途的物質, 并且可包括酶、 激素、 和其它蛋白質性或非蛋白質性的溶質。在優選實施方案中, 將抗體純化至 (1) 通過例如 Lowry 法確定, 超過 95 重量%的抗體, 并且最優選超過 99 重量%的抗體, (2) 足以通過使 用轉杯式測序儀 (spinning cup sequenator) 獲得至少 15 個殘基的 N- 末端或內部氨基酸 序列的程度, 或 (3) 通過使用例如考馬斯藍或優選銀染色, 在還原性或非還原性條件下的 SDS-PAGE( 十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳 ), 達到同質。既然抗體的天然環境的至少 一種成分不會存在, 那么分離的抗體包括重組細胞內的原位抗體。 然而, 分離的抗體通常通 過至少一個純化步驟來制備。
     “分離的” 核酸分子是這樣的核酸分子, 其被鑒定并與至少一種污染性核酸分子分 離, 其與所述至少一種污染性核酸分子通常在所述核酸的天然來源中締合。分離的核酸分 子不同于其在自然界中被發現時的形式或環境。因此, 分離的核酸分子不同于存在于天然細胞中的核酸分子。然而, 分離的核酸分子包括包含在通常表達核酸分子的細胞中的核酸 分子 ( 例如, 編碼抗體的核酸 ), 其中, 例如, 所述核酸分子存在的染色體位置與天然細胞的 染色體位置不同。
     術語 “依照 Kabat 的可變結構域殘基編號方式” 或 “依照 Kabat 的氨基酸位置編號 方式” 及其變化形式指 Kabat 等, Sequences of Proteins ofImmunological Interest( 免 疫學感興趣的蛋白的序列 ), 第 5 版, PublicHealth Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD.(1991) 中的用于抗體編制的重鏈可變結構域或輕鏈可變結構域的編 號系統。使用此編號系統, 實際的線性氨基酸序列可包含較少或另外的氨基酸, 對應于可 變結構域 FR 或 CDR 的縮短或插入。例如, 重鏈可變結構域可包含 H2 的殘基 52 后的單一 氨基酸插入物 ( 依照 Kabat 為殘基 52a) 及重鏈 FR 殘基 82 后的多個插入殘基 ( 例如依照 Kabat 為殘基 82a、 82b 和 82c 等 )。給定抗體的 Kabat 殘基編號方式可通過將抗體序列與 “標準” Kabat 編號序列的同源區進行比對來確定。
     術語 “基本相似” 或 “基本不同, ” 用于本文時, 是指在兩個數值 ( 通常一個與本發 明的抗體相關, 而另一個與參照 / 比較抗體相關 ) 之間的足夠高程度的相似性, 從而使本領 域技術人員認為在通過所述值 ( 例如, Kd 值 ) 測量的生物學特征的背景下, 在兩個值之間 的差異是具有很少或沒有生物學和 / 或統計學顯著性的。在所述兩個值之間的差異作為參 照 / 比較抗體的值的函數優選小于約 50%, 優選小于約 40%, 優選小于約 30%, 優選小于約 20%, 和 / 或優選小于約 10%。
     “結合親合力” 通常指分子 ( 例如抗體 ) 的單一結合位點與其結合配偶體 ( 例如抗 原 ) 之間全部非共價相互作用總和的強度。除非另有說明, 在用于本文時, “結合親合力” 指 反映結合對 ( 例如抗體與抗原 ) 的成員之間 1 ∶ 1 相互作用的固有結合親合力。分子 X 對 其配偶體 Y 的親合力通常可用解離常數 (Kd) 來表述。合乎需要的是 Kd 為 1x10-7, 1x10-8, 5x10-8, 1x10-9, 3x10-9, 5x10-9, 或甚至 1x10-10 或更強。親合力可通過本領域知道的常用方法 來測量, 包括本文中所描述的那些方法。低親合力抗體通常緩慢的結合抗原且趨于容易解 離, 而高親合力抗體通常更快速的結合抗原且趨于保持更長時間的結合。本領域知道測量 結合親合力的多種方法, 其中任一種都可用于本發明的目的。具體說明型實施方案在下文 中描述。
     在一個實施方案中, 根據本發明的 “Kd” 或 “Kd 值” 通過如在下面測定法中所述用 目的抗體的 Fab 形式和其抗原進行的放射性標記的抗原結合測定法 (RIA) 測量 : 所述測定 法測量 Fabs 對抗原的溶液結合親合力, 這通過在存在滴定系列的未標記抗原時, 用最小濃 125 度的 ( I)- 標記的抗原來平衡 Fab, 接著用抗 -Fab 抗體 - 包被的板捕獲結合的抗原來進行 (Chen, 等, (1999) 分子生物學雜志 (J.Mol.Biol.)293 : 865-881)。 為了確定測定的條件, 將 微量滴定板 (Dynex) 用 5μg/ml 的在 50mM 碳酸鈉 (pH 9.6) 中的捕獲抗 -Fab 抗體 (Cappel Labs) 包被過夜, 并隨后用 PBS 中的 2% (w/v) 牛血清白蛋白在室溫 ( 約 23℃ ) 封閉 2-5 小 時。在非吸附板 (Nunc#269620) 中, 將 100pM 或 26pM[125I]- 抗原與目的 Fab 的系列稀釋物 混合 ( 例如, 與在 Presta 等, (1997) 癌癥研究 (Cancer Res).57 : 4593-4599 中的抗 -VEGF 抗體, Fab-12 的評價一致 )。 接著, 將目的 Fab 溫育過夜 ; 然而溫育可以持續更長的階段 ( 例 如 65 小時 ) 從而確保達到平衡。 隨后, 將混合物轉移到捕獲板中來在室溫進行溫育 ( 例如, 1 小時 )。接著, 去除溶液, 并將所述板用在 PBS 中的 0.1%吐溫 -20 洗滌 8 次。當所述板已經干燥時, 加入 150μl/ 孔的閃爍劑 (MicroScint-20 ; Packard), 并將所述板在 Topcountγ 計數器 (Packard) 上計數 10 分鐘。選擇提供少于或等于 20%的最大結合的每種 Fab 的濃 度用在競爭性結合測定法中。 根據另一個實施方案, Kd 或 Kd 值是通過使用表面等離振子共 TM TM 振測定法使用 BIAcore -2000 或 BIAcore -3000(BIAcore, Inc., Piscataway, NJ) 在 25℃ 使用固定化抗原 CM5 芯片以約 10 個響應單位 (RU) 測量的。 簡言之, 依照供應商的說明書用 鹽酸 N- 乙基 -N’ -(3- 二甲基氨基丙基 )- 碳化二亞胺 (N-ethyl-N’ -(3-dimethylaminoprop yl)-carbodiimide hydrochloride)(EDC) 和 N- 羥基琥珀酰亞胺 (N-hydroxysuccinimide) (NHS) 活化羧甲基化葡聚糖生物傳感器芯片 (CM5, BIAcore Inc.)。用 10mM 乙酸鈉 pH4.8 將抗原稀釋至 5μg/ml( 約 0.2μM), 然后以 5μl/ 分鐘的流速注入以獲得約 10 個響應單 位 (RU) 的偶聯蛋白質。注入抗原后, 注入 1M 乙醇胺以封閉未反應的基團。為了進行動力 學測量, 將 Fab 的兩倍連續稀釋液 (0.78nM 至 500nM) 在 25℃以約 25μl/ 分鐘的流速注入 在含 0.05%吐溫 20 的 PBS(PBST) 中。 在一些實施方案中, 下列的改進用于表面等離振子共 振測定法 : 將抗體固定在 CM5 生物傳感器芯片以達到大約 400RU, 并用于動力學測量, 靶蛋 白 ( 例如, FGFR3-IIIb 或 -IIIc) 的兩倍系列稀釋液 ( 從 67nM 開始 ) 在 25℃以約 30ul/ 分 鐘的流速注入至 PBST 緩沖液中。 使用簡單一對一朗格繆爾結合模型 (one-to-oneLangmuir binding model)(BIAcore 評價軟件 3.2 版 (BIAcore EvaluationSoftware version 3.2)) 通過同時擬合締合和解離傳感圖來計算締合速率 (kon) 和解離速率 (koff)。平衡解離常數 (Kd) 以比率 koff/kon 計算。參見例如 Chen 等, (1999)J.Mol.Biol.( 分子生物學雜志 )293 : 865-881。如果根據上文表面等離振子共振測定法, 締合速率 (on-rate) 超過 106M-1S-1, 則 締合速率可使用熒光淬滅技術來測定, 即如在分光計諸如配備了斷流裝置的分光光度計 (Aviv Instruments) 或 8000 系列 SLM-Aminco 分光光度計 (ThermoSpectronic) 中用攪拌 比色杯 (stirred cuvette) 測量, 在存在漸增濃度的抗原的條件下, 測量 PBS, pH 7.2 中的 20nM 抗 - 抗原抗體 (Fab 形式 ) 在 25℃的熒光發射強度 ( 激發= 295nm ; 發射= 340nm, 16nm 通帶 ) 的升高或降低。
     根據本發明的 “締合速率” (on-rate, 或 rate of association, 或 association TM TM rate) 或 “kon”也可使用 BIAcore -2000 或 BIAcore -3000(BIAcore, Inc., Piscataway, NJ) 采用上述相同的表面等離振子共振技術, 在 25℃利用固定的抗原 CM5 芯片以約 10 個響 應單位 (RU) 來測定。簡言之, 依照供應商的說明書用鹽酸 N- 乙基 -N’ -(3- 二甲基氨基丙 基 )- 碳化二亞胺 (EDC) 和 N- 羥基 - 琥珀酰亞胺 (NHS) 活化羧甲基化葡聚糖生物傳感器芯 片 (CM5, BIAcore Inc.)。用 10mM 乙酸鈉 pH4.8 將抗原稀釋至 5μg/ml( 約 0.2μM), 然后 以 5μl/ 分鐘的流速注入至獲得約 10 個響應單位 (RU) 的偶聯蛋白質。注入抗原后, 注入 1M 乙醇胺以封閉未反應的基團。為了進行動力學測量, 在 25℃以約 25μl/ 分鐘的流速在 含 0.05%吐溫 20 的 PBS(PBST) 中注入 Fab(0.78nM 至 500nM) 的兩倍連續稀釋液。在一些 實施方案中, 下列的改進用于表面等離振子共振測定法 : 將抗體固定在 CM5 生物傳感器芯 片以達到大約 400RU, 并對于動力學測量, 靶蛋白 ( 例如, FGFR3-IIIb 或 -IIIc) 的兩倍連續 稀釋液 ( 從 67nM 開始 ) 在 25℃以約 30ul/ 分鐘的流速注入至 PBST 緩沖液中。使用簡單一 對一朗格繆爾 (Langmuir) 結合模型 (BIAcore Evaluation Software version 3.2) 通過 同時擬合締合和解離 S 型曲線計算締合速率 (kon) 和解離速率 (koff)。平衡解離常數 (Kd) 以比率 koff/kon 計算。參見例如 Chen, Y. 等, (1999)J.Mol.Biol.( 分子生物學雜志 )293 :865-881。然而, 如果根據上文表面等離振子共振測定法, 締合速率超過 106M-1S-1, 那么締 合速率優選地使用熒光淬滅技術來測定, 即根據分光計諸如配備了斷流裝置的分光光度計 (stop-flow equippedspectrophometer)(Aviv Instruments) 或 8000 系列 SLM-Aminco 分 光光度計 (ThermoSpectronic) 中用攪拌比色杯的測量, 在存在濃度漸增的抗原的條件下, 測量 PBS, pH 7.2 中的 20nM 抗 - 抗原抗體 (Fab 形式 ) 在 25℃的熒光發射強度 ( 激發= 295nm ; 發射= 340nm, 16nm 帶通 ) 的升高或降低。
     當用于本文時, 術語 “載體” 意在指能夠運送已經與其連接的另一核酸的核酸分 子。一種類型的載體是 “質粒” , 其指環狀雙鏈 DNA 環, 另外的 DNA 區段可以連接在該環狀雙 鏈 DNA 環中。另一種類型的載體是噬菌體載體。另一種類型的載體是病毒載體, 其中另外 的 DNA 區段可以連接至病毒基因組中。某些載體能夠在已經引入它們的宿主細胞中自主復 制 ( 例如, 具有細菌復制起始點的細菌載體和附加型哺乳動物載體 )。其他載體 ( 例如, 非 附加型哺乳動物載體 ) 在引入至宿主細胞中時可以整合至宿主細胞的基因組中, 并且因此 它們與宿主基因組一起復制。 此外, 某些載體能夠指導與它們可操作地連接的基因的表達。 這樣的載體在本文中稱為 “重組表達載體” ( 或簡單地, “重組載體” )。通常, 用于重組 DNA 技術中的表達載體經常是質粒的形式。在本說明書中, “質粒” 和 “載體” 可以互換使用, 因 為質粒是最普遍使用的載體形式。 “多核苷酸” 或 “核酸” 當在本文中可互換使用時, 是指任意長度的核苷酸的聚合 物, 包括 DNA 和 RNA。核苷酸可以是脫氧核糖核苷酸、 核糖核苷酸、 修飾的核苷酸或堿基、 和 / 或它們的類似物、 或可以通過 DNA 或 RNA 聚合酶、 或通過合成反應摻入至聚合物中的任何 基質。多核苷酸可以包含修飾的核苷酸, 諸如甲基化的核苷酸和它們的類似物。如果存在, 可以在所述聚合物組裝之前或之后施加對核苷酸結構的修飾作用。核苷酸的序列可以被 非核苷酸成分中斷。多核苷酸可以在合成后進一步被修飾, 諸如通過與標記物綴合。其他 類型的修飾作用包括, 例如, “帽 (caps)” , 一個或多個天然存在的核苷酸被類似物的置換, 核苷酸間修飾諸如, 例如, 具有不帶電荷的鍵的那些 ( 例如, 膦酸甲酯, 膦酸三酯, 氨基磷酸 酯 (phosphoamidates), 氨基甲酸酯, 等 ) 和具有帶電荷鍵的那些 ( 例如, 硫代磷酸酯, 二硫 代磷酸酯, 等 ), 包含側基結構部分的那些, 諸如, 例如, 蛋白質 ( 例如, 核酸酶, 毒素, 抗體, 信號肽, 聚 -L- 賴氨酸, 等 ), 具有嵌入劑的那些 ( 例如, 吖啶, 補骨脂素 (psoralen), 等 ), 包含螯合劑的那些 ( 例如, 金屬, 放射性金屬, 硼, 氧化性金屬, 等 ), 包含烷化劑的那些, 具 有修飾的鍵的那些 ( 例如, α 異頭核酸, 等 ), 以及一種或多種未修飾形式的多核苷酸。此 外, 通常存在于糖中的任一個羥基可以被例如膦酸酯基團、 磷酸酯基團置換, 被標準的保護 基團保護, 或被活化以制備與另外的核苷酸連接的另外的鍵, 或可以與固體或半固體的支 持體綴合。5’ 和 3’ 末端 OH 可以被磷酸化或被胺或 1-20 個碳原子的有機封端基團結構部 分取代。其他羥基也可以被衍生為標準的保護基團。多核苷酸也可以包含本領域中普遍已 知的核糖或脫氧核糖糖類的類似形式, 包括, 例如, 2’ -O- 甲基 -, 2’ -O- 烯丙基, 2’ -氟-或 2’ - 疊氮基 - 核糖, 碳環糖類似物, α- 異頭糖, 差向異構糖諸如阿拉伯糖, 木糖或來蘇糖, 吡 喃糖, 呋喃糖, 景天庚酮糖 (sedoheptulose), 無環類似物和堿性核苷類似物諸如甲基核糖 核苷。一個或多個磷酸二酯鍵可以被可選的連接基團置換。這些可選的連接基團包括, 但 ), P(S)S(“二硫代酯 (dithioate)” ), 不限于, 其中磷酸酯被 P(O)S(“硫代酯 (thioate)” (O)NR2(“酰胺化物” ), P(O)R, P(O)OR’ , CO 或 CH2(“甲縮醛 (formacetal)” ) 置換的實施
     方案, 其中每個 R 或 R’ 獨立地是 H 或取代的或未取代的烷基 (1-20C), 任選地包含醚 (-O-) 鍵, 芳基, 烯基, 環烷基, 環烯基或 araldyl。多核苷酸中的所有鍵沒有必要是相同的。前面 的描述適用于本文提及的所有多核苷酸, 包括 RNA 和 DNA。
     “寡核苷酸, ” 當用于本文中時, 通常是指短的、 - 般是單鏈的、 - 般是合成的多核苷 酸, 其通常, 但非必要地, 長度小于約 200 個核苷酸。術語 “寡核苷酸” 和 “多核苷酸” 不互 斥。上面對于多核苷酸的描述同樣和完全地適用于寡核苷酸。
     關于肽或多肽序列的 “百分比 (% ) 氨基酸序列同 - 性” , 定義為將候選序列與具體 肽或多肽序列在進行序列比對 ( 并在必要時導入空隙 ) 以獲取最大百分比序列同 - 性, 且 不將任何保守置換視為序列同 - 性的部分之后, 候選序列中的氨基酸殘基與所述具體肽或 多肽序列中的氨基酸殘基相同的百分數。 可使用本領域技術內的各種方法進行序列比對以 便測定氨基酸序列同 - 性百分比, 例如, 使用公眾可得到的計算機軟件如 BLAST、 BLAST-2、 ALIGN 或 Megalign(DNASTAR) 軟件。 本領域技術人員可以決定測量比對的適宜參數, 包括對 所比較的序列全長獲得最大比對所需的任何算法。然而, 為此目的, 氨基酸序列同 - 性%值 使用序列比較計算機程序 ALIGN-2 產生, 其中用于 ALIGN-2 程序的全部源代碼在下面的表 A 中提供。ALIGN-2 序列比對計算機程序的作者是 Genentech, Inc., 該源代碼已經隨用戶 文檔提交至美國版權局 (Washington D.C., 20559), 其美國版權注冊登記號為 TXU510087。 公眾可通過 Genentech, Inc.(South SanFrancisco, 加利福尼亞 ) 得到 ALIGN-2 程序, 或者 可以從例如 WO2007/001851 中提供的源代碼進行編譯。 ALIGN-2 程序應當為在 UNIX 操作系 統, 優選在數字 UNIX V4.0D 上使用而進行編譯。ALIGN-2 程序設定了所有序列比對參數并 且不變。
     在 ALIGN-2 應用于氨基酸序列比較的情況中, 給定氨基酸序列 A 相對于 (to)、 與 (with)、 或針對 (against) 給定氨基酸序列 B 的氨基酸序列同 - 性% ( 或者這樣說 : 給定氨 基酸序列 A 具有或含有相對于、 與或針對給定氨基酸序列 B 的某 -%氨基酸序列同 - 性 ) 如 下計算 :
     X/Y 比值乘以 100,
     其中 X 是用序列比對程序 ALIGN-2 在該程序的 A 和 B 比對中評分為相同匹配的氨 基酸殘基數, 且其中 Y 是 B 中的氨基酸殘基總數。可以理解, 當氨基酸序列 A 與氨基酸序列 B 的長度不相等時, A 相對于 B 的氨基酸序列同 - 性%將不等于 B 相對于 A 的氨基酸序列 同 - 性%。
     在 - 些實施方案中, 兩個或多個氨基酸序列至少 50%, 60%, 70%, 80%, 或 90%相 同。在 - 些實施方案中, 兩個或多個氨基酸序列至少 95%, 97%, 98%, 99%, 或甚至 100% 相同。除非另外特別指出, 使用 ALIGN-2 計算機程序如在緊接的前面段落中所述獲得在本 文中所用的所有的%氨基酸序列同 - 性的值。
     術語 “FGFR3, ” 當在本文中使用時, 除非具體或另外根據上下文指示, 是指任何天 然或變體 ( 不論天然或合成的 )FGFR3 多肽 ( 例如, FGFR3-IIIb 同種型或 FGFR3-IIIc 同種 型 )。術語 “天然序列” 具體包涵天然存在的截短形式 ( 例如, 細胞外結構域序列或跨膜亞 基序列 ), 天然存在的變體形式 ( 例如, 選擇性拼接形式 ) 和天然存在的等位基因變體。術 語 “野生型 FGFR3” 通常是指包含天然存在的 FGFR3 蛋白的氨基酸序列的多肽。術語 “野生 型 FGFR3 序列” 通常是指存在于天然存在的 FGFR3 中的氨基酸序列。術語 “FGFR3 配體, ” ( 可互換地稱為 “FGF” ) 當在本文中使用時, 除非具體或另外根 據上下文指示, 是指任何天然或變體 ( 不論天然或合成的 )FGFR3 配體 ( 例如, FGF1, FGF2, FGF4, FGF8, FGF9, FGF17, FGF18, FGF23) 多肽。術語 “天然序列” 具體地包涵天然存在的截 短形式 ( 例如, 細胞外結構域序列或跨膜亞基序列 ), 天然存在的變體形式 ( 例如, 選擇性拼 接形式 ) 和天然存在的等位基因變體。術語 “野生型 FGFR3 配體” 通常是指包含天然存在 的 FGFR3 配體蛋白的氨基酸序列的多肽。術語 “野生型 FGFR3 配體序列” 通常是指存在于 天然存在的 FGFR3 配體中的氨基酸序列。
     “FGFR3 激活” 是指 FGFR3 受體的激活或磷酸化。一般而言, FGFR3 激活導致信號轉 導 ( 例如, 由 FGFR3 受體的胞內激酶結構域磷酸化 FGFR3 或底物多肽中的酪氨酸殘基所導 致 )。FGFR3 激活可由 FGFR 配體結合目的 FGFR3 受體介導。結合 FGFR3 的 FGFR3 配體 ( 例 如, 諸如 FGF1 或 FGF9) 可激活 FGFR3 的激酶結構域, 從而導致 FGFR3 中的酪氨酸殘基的磷 酸化和 / 或另外的一種或多種底物多肽中的酪氨酸殘基的磷酸化。
     術語 “組成型” 當用于本文中時, 當例如應用于受體激酶活性時, 是指受體的連續 信號傳導活性, 該活性不依賴于配體或其他激活分子的存在。 取決于受體的性質, 所有活性 可以是組成型的或受體的活性可以進一步被其他分子 ( 例如, 配體 ) 的結合激活。導致受 體的激活的細胞事件對于本領域普通技術人員是公知的。例如, 激活可以包括低聚化 ( 例 如, 二聚化, 三聚化等 ) 成為更高級的受體復合物。復合物可以包含單一的蛋白物種, 即, 均 聚復合物 (homomeric complex)。 備選地, 復合物可以包含至少兩種不同的蛋白物種, 即, 異 聚復合物 (heteromeric complex)。 復合物形成可以由例如, 正常或突變體形式的受體在細 胞表面上的過表達導致。復合物形成也可以由受體中一個或多個特定的突變導致。
     術語 “配體 - 不依賴性” 當用于本文中時, 當例如應用于受體信號傳導活性時, 是 指不依賴于配體的存在的信號傳導活性。具有配體 - 不依賴性激酶活性的受體沒有必要排 除用于產生另外的激酶活性激活的配體與該受體的結合。
     術語 “配體 - 依賴性” 當用于本文中時, 當例如應用于受體信號傳導活性時, 是指 依賴于配體的存在的信號傳導活性。
     短語″基因擴增″是指這樣的過程, 通過該過程在特定細胞或細胞系中形成多拷 貝的基因或基因片段。被復制的區 ( 一段擴增的 DNA) 常常被稱為 “擴增子” 。通常, 所產生 的信使 RNA(mRNA) 的量, 即基因表達的水平, 也與被表達的該特定基因產生的拷貝數成比 例地增加。
     ″酪氨酸激酶抑制劑″是這樣的分子, 其在一些程度上抑制酪氨酸激酶如 FGFR3 受體的酪氨酸激酶活性。
     “顯示 FGFR3 表達、 擴增或激活” 的癌癥或生物學樣品是在診斷檢測中, 表達 ( 包括 過表達 )FGFR3, 具有擴增的 FGFR3 基因, 和 / 或以其他方式證明 FGFR3 的激活或磷酸化的癌 癥或生物學樣品。
     ″顯示 FGFR3 激活″的癌癥或生物學樣品是在診斷測試中, 證明 FGFR3 的激活或 磷酸化的癌癥或生物學樣品。此類激活可直接確定 ( 例如通過 ELISA 測量 FGFR3 磷酸化 ) 或間接確定。
     ″顯示 FGFR3 激活″的癌癥或生物學樣品是在診斷檢測中, 表現出 FGFR3 的組成 型激活或磷酸化的癌癥或生物學樣品。 此類激活可直接確定 ( 例如通過 ELISA 測量 c-FGFR3磷酸化 ) 或間接確定。
     ″顯示 FGFR3 擴增″的癌癥或生物學樣品是在診斷檢測中具有擴增的 FGFR3 基因 的癌癥或生物學樣品。
     ″顯示 FGFR3 易位″的癌癥或生物學樣品是在診斷檢測中具有易位的 FGFR3 基因 的癌癥或生物學樣品。FGFR3 易位的實例是 t(4 ; 14) 易位, 其發生在一些多發性骨髓瘤腫 瘤中。
     “磷酸 -ELISA 測定 (phospho-ELISA assay)” 在本文中是其中在酶聯免疫吸附測 定法 (ELISA) 中評估一種或多種 FGFR3、 底物或下游信號傳導分子的磷酸化的測定, 該測定 使用試劑, 通常是抗體, 檢測磷酸化的 FGFR3、 底物或下游信號傳導分子。在一些實施方案 中, 使用檢測磷酸化的 FGFR3 或 pMAPK 的抗體。該測定可對細胞裂解物、 優選來自新鮮的或 冷凍的生物學樣品的細胞裂解物進行。
     ″顯示配體 - 不依賴性 FGFR3 激活″的癌癥或生物學樣品是在診斷檢測中, 表現 出 FGFR3 的配體 - 不依賴性激活或磷酸化的癌癥或生物學樣品。此類激活可直接確定 ( 例 如通過 ELISA 測量 FGFR3 磷酸化 ) 或間接確定。
     ″顯示配體 - 依賴性 FGFR3 激活″的癌癥或生物學樣品是在診斷檢測中, 表現出 FGFR3 的配體 - 依賴性激活或磷酸化的癌癥或生物學樣品。此類激活可直接確定 ( 例如通 過 ELISA 測量 FGFR3 磷酸化 ) 或間接確定。
     ″顯示配體 - 不依賴性 FGFR3 激活″的癌癥或生物學樣品是在診斷檢測中, 表現 出 FGFR3 的配體 - 不依賴性激活或磷酸化的癌癥或生物學樣品。此類激活可直接確定 ( 例 如通過 ELISA 測量 FGFR3 磷酸化 ) 或間接確定。
     具有 “FGFR3 過表達或擴增” 的癌細胞指與同一組織類型的非癌細胞相比, 具有顯 著更高的 FGFR3 蛋白質或基因水平的癌細胞。此類過表達可以是由基因擴增或者轉錄或翻 譯增加引起。可在診斷或預后測定中通過評估細胞表面上存在的增加的 FGFR3 蛋白質水平 ( 例如通過免疫組化測定, IHC) 來測定 FGFR3 的過表達或擴增。備選地, 或另外地, 可測量 細胞中編碼 FGFR3 的核酸的水平, 例如通過熒光原位雜交 (FISH ; 參見 1998 年 10 月公布的 WO98/45479)、 Southern 印跡或聚合酶鏈式反應 (PCR) 技術, 諸如定量實時 PCR(qRT-PCR)。 在上述測定法之外, 熟練從業人員還可利用多種體內測定法。 例如, 可將患者體內細胞暴露 于任選用可檢測標記物例如放射性同位素標記的抗體, 并且可評估該抗體與患者體內細胞 的結合, 例如通過外部掃描放射性或通過分析取自事先已暴露于所述抗體的患者的活組織 檢查。
     術語 “突變” 在本文中使用時指特定蛋白質或核酸 ( 基因, RNA) 分別相對于野生型 蛋白質或核酸的氨基酸或核酸序列的差異。 突變的蛋白質或核酸可以由基因的一個等位基 因 ( 雜合的 ) 或兩個等位基因 ( 純合的 ) 表達或者在其中找到, 而且它可以是體細胞的或 種系的。在本發明中, 突變一般是體細胞的。突變包括序列重排, 諸如插入、 缺失、 和點突變 ( 包括單核苷酸 / 氨基酸多態性 )。
     “抑制” 是與參照相比降低或減少活性、 功能, 和 / 或量。
     當一種藥劑模擬目的多肽 ( 例如, FGFR 配體, 諸如 FGF1 或 FGF9) 的至少一種功能 性活性時, 其具有 “激動劑活性或功能” 。
     “激動劑抗體” 在本文中使用時是模擬目的多肽 ( 例如, FGFR 配體, 諸如 FGF1 或FGF9) 的至少一種功能性活性的抗體。
     蛋白質 “表達” 指基因中所編碼的信息轉換成信使 RNA(mRNA), 然后轉換成蛋白質。
     在本文中, “表達” 目的蛋白質 ( 諸如 FGF 受體或 FGF 受體配體 ) 的樣品或細胞指 這樣的樣品或細胞, 在所述樣品或細胞中確定存在有編碼該蛋白質的 mRNA, 或蛋白質 ( 包 括其片段 )。
     “免疫綴合物” ( 可互換地稱為 “抗體 - 藥物綴合物” 或 “ADC” ), 是指與一種或多 種細胞毒性劑綴合的抗體, 所述細胞毒性劑諸如化療劑、 藥物、 生長抑制劑、 毒素 ( 例如蛋 白毒素, 細菌、 真菌、 植物或動物來源的酶活性毒素, 或其片段 ) 或放射性同位素 ( 即放射綴 合物 )。
     術語 “Fc 區” 用于本文時一般是指包含免疫球蛋白重鏈 C 末端的多肽序列的二聚 體復合物, 其中 C 末端多肽序列是可以通過木瓜蛋白酶消化完整抗體獲得的序列。Fc 區可 以包括天然或變體 Fc 序列。雖然免疫球蛋白重鏈 Fc 序列的邊界可以變化, 但是人 IgG 重 鏈 Fc 序列通常定義為 Fc 序列自大約 Cys226 位置或大約 Pro230 位置的氨基酸殘基至羧基 末端的區段。免疫球蛋白的 Fc 序列一般包含兩個恒定結構域, 即 CH2 結構域和 CH3 結構 域, 任選包含 CH4 結構域。Fc 區的 C- 末端賴氨酸 ( 依照 EU 編號系統的殘基 447) 可以被移 除, 例如, 在抗體的純化期間或通過編碼所述抗體的核酸的重組改造。因此, 根據本發明包 含具有 Fc 區的抗體的組合物可以包含具有 K447 的抗體、 所有 K447 均被移除的抗體、 或具 有 K447 殘基的抗體和沒有 K447 殘基的抗體的混合物。
     本文中 “Fc 多肽” 的意思是構成 Fc 區的多肽之一。Fc 多肽可從任何適當的免疫 球蛋白 ( 如 IgG1, IgG2, IgG3, 或 IgG4 亞型, IgA, IgE, IgD 或 IgM) 獲得。在一些實施方案中, Fc 多肽包含部分或全部野生型鉸鏈序列 ( 一般在其 N 末端 )。在一些實施方案中, Fc 多肽 不包含功能的或野生型鉸鏈序列。
     “封閉” 抗體或抗體 “拮抗劑” 是抑制或降低其結合的抗原的生物學活性的抗體。優 選的封閉抗體或拮抗性抗體完全抑制抗原的生物學活性。
     “裸抗體 (naked antibody)” 是沒有綴合異源分子 ( 如細胞毒性結構部分或放射 性標記 ) 的抗體。
     具有指定抗體的 “生物學特征” 的抗體指具有該指定抗體區別于結合相同抗原的 其它抗體的一項或多項生物學特征的抗體。
     為了篩選這樣的抗體, 其結合由目的抗體結合的抗原的表位, 可以實施常規交叉 阻斷測定法, 諸如抗體, 實驗室手冊 (Antibodies, A Laboratory Manual), 冷泉港實驗室, Ed Harlow 和 David Lane(1988) 中所記載的。
     為增加包含本發明的氨基酸序列的抗體或多肽的半衰期, 可將拯救受體 (salvage receptor) 結合表位連接到抗體 ( 尤其是抗體片段 ), 如例如美國專利 5,739,277 所述。例 如, 可將編碼拯救受體結合表位的核酸分子與編碼本發明多肽序列的核酸符合閱讀框地連 接, 從而使改造的核酸分子所表達的融合蛋白包含所述拯救受體結合表位和本發明的多肽 序列。本文所用的術語 “拯救受體結合表位” 指 IgG 分子 ( 例如 IgG 1, IgG2, IgG3, 或 IgG4) 的 Fc 區的表位, 其負責增加 IgG 分子的體內血清半衰期 ( 例如 Ghetie 等, Ann.Rev.Immunol. ( 免疫學年評 )18 : 739-766(2000), 表 1)。在其 Fc 區具有取代并且血清半衰期增加的抗 體 也 見 于 WO00/42072, WO 02/060919 ; Shields 等, 生 物 化 學 雜 志 (J.Biol.Chem.)276 :6591-6604(2001) ; Hinton, 生物化學雜志 (J.Biol.Chem.)279 : 6213-6216(2004)) 的描述。 在另一個實施方案中, 例如通過連接其它多肽序列, 也可以增加血清半衰期。例如, 本發明 的方法中有用的抗體或其它多肽可與血清白蛋白或血清白蛋白的結合 FcRn 受體的部分 或血清白蛋白結合肽連接, 從而使所述血清白蛋白結合所述抗體或多肽, 例如這樣的多肽 序列見于 WO01/45746 的公開。在一個優選的實施方案中, 所連接的血清白蛋白肽包含氨 基酸序列 DICLPRWGCLW(SEQID NO : 183)。在另一個實施方案中, Fab 的半衰期是通過這些 方法增加的。血清白蛋白結合肽序列也見 Dennis 等, 生物化學雜志 (J.Biol.Chem.)277 : 35035-35043(2002)。
     “片段” 意指優選包含參照核酸分子或多肽的完整長度的至少 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 或更多的多肽或核酸分子的部分。片段可以包含 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 或 100, 200, 300, 400, 500, 600, 或更多個核苷酸或 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 140, 160, 180, 190, 200 個氨基酸或更多個氨基酸。
     關于本發明的抗體的短語 “很少至沒有激動劑功能” 在本文中使用時是指例如, 在 施用于受試者時, 所述抗體不引發有生物學意義的量的激動劑活性。 如本領域中所理解的, 活性的量可以定量地或定性地確定, 只要在本發明的抗體和參照副本之間可以作出比較。 所述活性可以根據本領域已知的任何測定或技術來測量或檢測, 包括, 例如, 本文所述的那 些。本發明的抗體及其參照副本的活性的量可以平行地確定或在單獨的運行中確定。在一 些實施方案中, 本發明的二價抗體不具有實質的激動劑功能。
     術語 “凋亡” 和 “凋亡活性” 以廣義使用, 并且是指哺乳動物中細胞死亡的有秩序 或可控形式, 其典型地伴有一種或多種特征性細胞改變, 包括細胞質的凝聚, 質膜微絨毛的 損失, 細胞核的分裂 (segmentation), 染色體 DNA 的降解或線粒體功能的喪失。 此活性可以 使用本領域中已知的技術確定和測量, 例如, 通過細胞活力測定, FACS 分析或 DNA 電泳, 和 更具體地通過膜聯蛋白 V(annexin V) 的結合, DNA 的片段化, 細胞收縮, 內質網的擴張, 細 胞片段化, 和 / 或膜囊泡的形成 ( 稱為凋亡小體 ) 確定和測量。
     術語 “抗體” 和 “免疫球蛋白” 以最廣義可互換使用, 并且包括單克隆抗體 ( 例如, 全長或完整的單克隆抗體 )、 多克隆抗體、 多價抗體、 多特異性抗體 ( 例如雙特異性抗體, 只 要它們顯示所需的生物學活性 ), 并且還可以包括某些抗體片段 ( 如本文中更詳細地描述 的那樣 )。抗體可以是人的、 人源化的和 / 或親和力成熟的。
     術語 “可變的” 指可變結構域中的某些部分在抗體間序列差異廣泛且用于每種特 定抗體對其特定抗原的結合和特異性的事實。然而, 變異性并非均勻分布于抗體的整個可 變結構域。它集中于輕鏈和重鏈可變結構域中稱作互補性決定區 (CDRS) 或高變區的三個 區段。可變結構域中更加高度保守的部分被稱作構架 (FR)。天然重鏈和輕鏈的可變結構 域各自包含四個 FR 區, 它們大多采取 β- 折疊構象, 通過形成環狀連接且在有些情況中形 成 β- 折疊結構一部分的三個 CDRs 連接。每條鏈中的 CDRs 通過 FR 區非常接近的保持在 一起, 并與另一條鏈的 CDRs 一起促成抗體的抗原結合位點的形成 ( 參見 Kabat 等, 免疫學 感興趣的蛋白的序列 (Sequences of Proteins of Immunological Interest), 第 5 版, 國 立衛生研究所 (National Institute of Health), Bethesda, MD.(1991))。恒定結構域不 直接參與抗體與抗原的結合, 但展現出多種效應子功能, 諸如抗體在抗體依賴性細胞毒性 中的參與。抗體的木瓜蛋白酶消化產生兩個相同的抗原結合片段, 稱為 “Fab”片段, 所述 “Fab” 片段每個具有單抗原結合位點, 并且產生殘余的 “Fc” 片段, 其名稱反映其容易結晶的 能力。胃蛋白酶處理產生 F(ab’ )2 片段, 所述片段具有兩個抗原組合位點, 并且仍舊能夠交 聯抗原。
     “Fv” 是包含完整抗原識別和結合位點的最小抗體片段。在雙鏈 Fv 種類中, 此區由 一個重鏈可變結構域和一個輕鏈可變結構域以緊密的、 非共價締合的二聚體組成。在單鏈 Fv 種類中, 一個重鏈可變結構域和一個輕鏈可變結構域可以通過柔性肽接頭共價連接從而 使輕鏈和重鏈可以以類似于雙鏈 Fv 種類的 “二聚體” 結構締合。在這種構型中, 每個可變 結構域的三個 CDRs 相互作用從而限定在 VH-VL 二聚體的表面上的抗原結合位點。總而言 之, 六個 CDRs 將抗原結合特異性賦予抗體。然而, 即使是單個可變結構域 ( 或只包含對抗 原特異的三個 CDRs 的半個 Fv) 也具有識別和結合抗原的能力, 然而親和性低于完整結合位 點。
     Fab 片段還包含輕鏈的恒定結構域和重鏈的第一恒定結構域 (CH1)。Fab’ 片段與 Fab 片段的不同之處在于在重鏈 CH1 結構域的羧基端加入幾個殘基, 包括來自抗體鉸鏈區 的一個或多個半胱氨酸。Fab’ -SH 是本文關于 Fab’ 的名稱, 其中恒定結構域的半胱氨酸殘 基具有游離巰基。F(ab’ )2 抗體片段最初作為在它們之間具有鉸鏈半胱氨酸的 Fab’ 片段 對產生。還已知抗體片段的其它化學偶聯。
     基于抗體 ( 免疫球蛋白 ) 的恒定結構域的氨基酸序列, 可以將來自任何脊椎動物 物種的抗體 ( 免疫球蛋白 ) 的 “輕鏈” 分為兩種清楚區分的類型之一, 稱為 kappa(κ) 和 lambda(λ)。
     取決于免疫球蛋白的重鏈的恒定結構域的氨基酸序列, 可以將免疫球蛋白分為不 同的種類。存在五種主要的免疫球蛋白類別 : IgA, IgD, IgE, IgG, 和 IgM, 并且這些中的一 些可以進一步分為亞類 ( 同種型 ), 例如 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, 和 IgA2。對應于不同 類別的免疫球蛋白的重鏈恒定結構域分別被稱為 α, δ, ε, γ, 和 μ。不同類別的免疫球 蛋白的亞基結構和三維構型是眾所周知的。 “抗體片段” 僅包含完整抗體的一部分, 其中所 述部分優選地保留與該部分存在于完整抗體中時正常相關的至少一種、 優選大多數或全部 功能。抗體片段的實例包括 Fab、 Fab′、 F(ab′ )2 和 Fv 片段 ; 雙抗體 ; 線性抗體 ; 單鏈抗 體分子 ; 和由抗體片段形成的多特異性抗體。 在一個實施方案中, 抗體片段包含完整抗體的 抗原結合位點, 并且因此保留了結合抗原的能力。在另一個實施方案中, 抗體片段, 例如包 含 Fc 區的抗體片段保留了與 Fc 區存在于完整抗體中時正常相關的至少一種生物學功能, 抗體片段是 諸如 FcRn 結合, 抗體半衰期調節, ADCC 功能和補體結合。在一個實施方案中, 單價抗體, 其在體內的半衰期基本上類似于完整的抗體。 例如, 這樣的抗體片段可以在與 Fc 連接的抗原結合臂上包含能夠賦予該片段以體內穩定性的序列。
     術語 “高變區” 、 “HVR”或 “HV”在用于本文時指抗體可變結構域中序列上高度 可變和 / 或形成結構上限定的環的區域。通常, 抗體包含六個高變區 : 三個在 VH 中 (H1、 H2、 H3), 三個在 VL 中 (L1、 L2、 L3)。本文中使用且涵蓋許多高變區的敘述。Kabat 互補 性決定區 (CDR) 是以序列變異性為基礎的, 而且是最常用的 (Kabat 等, 免疫學感興趣的 蛋白的序列 (Sequences of Proteins of Immunological Interest), 第 5 版 . 公眾健康 服務 (Public Health Service), 國立衛生研究所 (National Institutes of Health),Bethesda, MD.(1991))。相反, Chothia 指結構環的位置 (Chothia 和 Lesk, 分子生物學雜志 (J.Mol.Biol.)196 : 901-917(1987))。AbM 高變區代表 Kabat CDRs 與 Chothia 結構環之間 的折衷, 而且由 Oxford Molecular 的 AbM 抗體建模軟件使用。 “接觸 (contact)” 高變區是 以對可獲得的復合物晶體結構的分析為基礎的。下文記錄了這些高變區中每一個的殘基。
    高變區可包括如下的 “延 伸 的 高 變 區” : VL 中 的 24-36 或 24-34(L1)、 46-56 或 50-56(L2) 和 89-97(L3) 及 VH 中 的 26-35(H1)、 50-65 或 49-65(H2) 和 93-102、 94-102 或 95-102(H3)。對于這些定義中的每一個, 可變結構域殘基是依照 Kabat 等, 見上文編號的。
     “構架” 或 “FR” 殘基指除本文中所定義的高變區殘基之外的那些可變結構域殘基。
     非人 ( 例如鼠 ) 抗體的 “人源化” 形式是包含衍生自非人免疫球蛋白的最少序列的 嵌合抗體。對于大多數部分, 人源化抗體是人免疫球蛋白 ( 接受體抗體 ), 其中接受體的高 變區殘基用具有期望特異性、 親和性和 / 或能力的非人物種 ( 供體抗體 )( 諸如小鼠、 大鼠、 兔或非人靈長類動物 ) 的高變區殘基替換。在有些情況中, 將人免疫球蛋白的構架區 (FR) 殘基用相應的非人殘基替換。此外, 人源化抗體可包含在接受體抗體中或在供體抗體中沒 有發現的殘基。 進行這些修飾是為了進一步改進抗體的性能。 一般而言, 所述人源化抗體將 包含基本上全部的至少一個、 典型地兩個可變結構域, 其中所有或基本上所有高變環對應 于非人免疫球蛋白的高變環, 且所有或基本上所有 FR 是人免疫球蛋白序列的 FR。 人源化抗 體任選還將包含至少部分免疫球蛋白恒定區 (Fc), 典型地是人免疫球蛋白的恒定區。更多 細節參見 Jones 等, 自然 (Nature)321 : 522-525(1986) ; Riechmann 等, 自然 (Nature)332 : 323-329(1988) ;及 Presta,現 代 結 構 生 物 學 觀 點 (Curr.Op.Struct.Biol.)2 : 593-596(1992)。還參見下面的綜述文章和其中引用的參考文獻 : Vaswani 和 Hamilton, Ann.Allergy, Asthma & Immunol.( 變 態 反 應、 哮 喘 和 免 疫 學 年 報 )1 : 105-115(1998) ; Harris, Biochem.Soc.Transactions( 生 物 化 學 會 會 刊 )23 : 1035-1038(1995) ; Hurle 和 Gross, Curr.Op.Biotech.( 生物技術現代評論 )5 : 428-433(1994)。
     “嵌合” 抗體 ( 免疫球蛋白 ) 具有與衍生自特定物種或屬于特定抗體類別或亞類的 抗體中的相應序列相同或同源的一部分重鏈和 / 或輕鏈 ( 而一條或多條鏈的剩余部分與衍
     生自另一物種或屬于另一抗體類別或亞類的抗體中的相應序列相同或同源 ), 以及此類抗 體的片段, 只要它們展現出期望的生物學活性 ( 美國專利號 4,816,567 和 Morrison 等, 美 國國家科學院學報 (Proc.Nat.Acad.Sci.USA)81 : 6851-6855(1984))。人源化抗體當在本 文中使用時是嵌合抗體的亞組。
     “單鏈 Fv” 或 “scFv”抗體片段包含抗體的 VH 和 VL 結構域, 其中這些結構域以 單多肽鏈存在。一般地, 所述 scFv 多肽在 VH 和 VL 結構域之間還包含多肽接頭, 所述接 頭使 scFv 形成對于抗原結合需要的結構。關于 scFv 的綜述參見例如 Pluckthun 于 The Pharmacology of MonoclonalAntibodies( 單 克 隆 抗 體 藥 理 學 ), 卷 113, Rosenburg 和 Moore 編輯, Springer-Verlag, New York, pp.269-315(1994) 中。
     “抗原” 是抗體可以選擇性結合的預定抗原。靶抗原可以是多肽, 碳水化合物, 核 酸, 半抗原或其他天然存在的或合成的化合物。優選地, 靶抗原是多肽。
     術語 “雙抗體 (diabodies)” 指具有兩個抗原結合位點的小抗體片段, 所述片段在 相同的多肽鏈 (VH-VL) 中包含與輕鏈可變結構域 (VL) 連接的重鏈可變結構域 (VH)。通過 使用太短所以不能在相同鏈上的兩個結構域之間配對的接頭, 迫使所述結構域與另一條鏈 的互補結構域配對從而產生兩個抗原結合位點。雙抗體更充分地描述于例如 EP 404,097 ; WO 93/11161 ; 和 Hollinger 等, 美 國 國 家 科 學 院 學 報 (Proc.Natl.Acad.Sci.USA)90 : 6444-6448(1993) 中。
     “人抗體” 指這樣的抗體, 其具有與由人生成的抗體的氨基酸序列對應的氨基酸序 列和 / 或使用本文所公開的用于生成人抗體的任何技術產生。人抗體的這種定義明確排除 包含非人抗原結合殘基的人源化抗體。
     “親和力成熟的” 抗體指在抗體的一個或多個 CDRs 中具有一處或多處改變的抗 體, 所述改變導致該抗體對抗原的親和性與沒有這些改變的親本抗體相比有所提高。優 選的親和力成熟的抗體將具有納摩爾或甚至皮摩爾量級的對靶抗原的親和性。親和力成 熟的抗體通過一些本領域已知方法來生成。Marks 等, 生物 / 技術 (Bio/Technology)10 : 779-783(1992) 記載了通過 VH 和 VL 結構域改組進行的親和性成熟。以下文獻記載了 CDR 和 / 或構架殘基的隨機誘變 : Barbas 等, 美國國家科學院學報 (Proc Nat.Acad.Sci, USA)91 : 3809-3813(1994) ; Schier 等, 基因 (Gene)169 : 147-155(1995) ; Yelton 等, 免疫學 雜志 (J.Immunol.)155 : 1994-2004(1995) ; Jackson 等, 免疫學雜志 (J.Immunol.)154(7) : 3310-9(1995) ; 及 Hawkins 等, 分子生物學雜志 (J.Mol.Biol.)226 : 889-896(1992)。
     抗體 “效應子功能” 指那些可歸于抗體 Fc 區 ( 天然序列 Fc 區或氨基酸序列變體 Fc 區 ) 且隨抗體同種型而變化的生物學活性。抗體效應子功能的實例包括 : C1q 結合和補 體依賴性細胞毒性 ; Fc 受體結合 ; 抗體依賴性細胞介導的細胞毒性 (ADCC) ; 吞噬作用 ; 細 胞表面受體 ( 例如 B 細胞受體 ) 下調 ; 和 B 細胞活化。
     “抗體依賴性細胞介導的細胞毒性” 或 “ADCC” 指其中結合到某些細胞毒性細胞 ( 例如天然殺傷 (NK) 細胞、 嗜中性粒細胞和巨噬細胞 ) 上存在的 Fc 受體 (FcR) 上的分泌 型 Ig 使得這些細胞毒性效應細胞能夠特異性結合攜帶抗原的靶細胞, 隨后用細胞毒素殺 死靶細胞的細胞毒性形式。抗體 “武裝” 細胞毒性細胞并且對于這種殺傷是絕對必需的。 介導 ADCC 的主要細胞即 NK 細胞只表達 FcγRIII, 而單核細胞表達 FcγRI、 FcγRII 和 FcγRIII。Ravetch 和 Kinet, 免疫學年評 (Annu.Rev.Immunol.)9 : 457-92(1991) 第 464 頁表 3 總結了造血細胞上的 FcR 表達。為了評估目的分子的 ADCC 活性, 可進行體外 ADCC 測 定法, 諸如美國專利號 5,500,362 或 5,821,337 或 Presta 美國專利號 6,737,056 中所記載 的。可用于此類測定法的效應細胞包括外周血單核細胞 (PBMC) 和天然殺傷 (NK) 細胞。備 選地或另外地, 可在體內評估目的分子的 ADCC 活性, 例如在動物模型中, 諸如 Clynes 等, PNAS(USA)95 : 652-656(1998) 中所公開的。
     “人效應細胞” 指表達一種或多種 FcR 并行使效應子功能的白細胞。優選該細胞至 少表達 FcγRIII 并行使 ADCC 效應子功能。介導 ADCC 的人白細胞的實例包括外周血單核 細胞 (PBMC)、 天然殺傷 (NK) 細胞、 單核細胞、 細胞毒性 T 細胞和嗜中性粒細胞, 優選 PBMCs 和 NK 細胞。效應細胞可以從天然來源 ( 例如從血液 ) 分離。
     “Fc 受體” 或 “FcR” 描述結合抗體 Fc 區的受體。優選 FcR 是天然序列人 FcR。此 外, 優選的 FcR 是結合 IgG 抗體的 FcR(γ 受體 ), 包括 FcγRI、 FcγRII 和 FcγRIII 亞類的 受體, 包括這些受體的等位基因變體和選擇性剪接形式。FcγRII 受體包括 FcγRIIA( “激 活受體” ) 和 FcγRIIB(“抑制受體” ), 它們具有相似的氨基酸序列, 區別主要在于其胞質結 構域。 活化受體 FcγRIIA 在其胞質結構域中包含免疫受體基于酪氨酸的活化基序 (ITAM)。 抑制受體 FcγRIIB 在其胞質結構域中包含免疫受體基于酪氨酸的抑制基序 (ITIM)( 參 見, , 免疫學年評 (Annu.Rev.Immunol.)15 : 203-234(1997) 中的綜述 )。FcR 的綜 述參見 Ravetch 和 Kinet, 免疫學年評 (Annu.Rev.Immunol.)9 : 457-92(1991) ; Capel 等, 免疫方法 (Immunomethods)4 : 25-34(1994) ; 及 de Haas 等, 實驗室臨床醫學雜志 (J.Lab. Clin.Med.)126 : 330-41(1995)。 術語 “FcR” 在本文中涵蓋其它 FcR, 包括未來將會鑒定的那 些。該術語還包括新生兒受體, FcRn, 它負責將母體 IgG 轉移給胎兒 (Guyer 等, 免疫學雜志 (J.Immunol.)117 : 587(1976) 和 Kim 等, 免疫學雜志 (J.Immunol.)24 : 249(1994)) 并調節 免疫球蛋白的體內穩態。WO00/42072(Presta) 描述了與 FcRs 的結合改善或減少的抗體變 Shields 等, J.Biol.Chem. 體。該專利公開的內容具體地通過引用合并于本文中。還參見, ( 生物化學雜志 )9(2) : 6591-6604(2001)。
     測量對 FcRn 的結合的方法是已知的 ( 參見, 例如, Ghetie 1997, Hinton2004)。可 測定人 FcRn 高親和性結合多肽與人 FcRn 的體內結合和血清半衰期, 例如在表達人 FcRn 的 轉基因小鼠或經轉染的人細胞系中, 或者在施用抑 Fc 變體多肽的靈長類動物中。
     “補體依賴性細胞毒性” 或 “CDC” 指存在補體時對靶細胞的裂解。經典補體途徑的 激活是由補體系統第一組分 (C1q) 結合 ( 適宜亞類的 ) 抗體起始的, 該抗體已結合至其關 聯抗原。為了評估補體激活, 可進行 CDC 測定法, 例如如 Gazzano-Santoro 等, 免疫方法雜 志 (J.Immunol.Methods)202 : 163(1996) 中所記載的。 具有改變的 Fc 區氨基酸序列及提高或降低的 C1q 結合能力的多肽變體記載于例 如美國專利號 6,194,551B1 和 WO 99/51642。那些專利公開的內容具體地通過引用合并于 本文中。還可參見 Idusogie 等, 免疫學雜志 (J.Immunol.)164 : 4178-4184(2000)。
     術語 “包含 Fc 區的多肽” 是指包含 Fc 區的多肽, 諸如抗體或免疫粘附素。例如, 在抗體純化過程中或通過重組改造編碼所述多肽的核酸, 可以去除 Fc 區的 C- 末端賴氨酸 ( 依照 EU 編號系統的殘基 447)。因此, 根據本發明的包含具有 Fc 區的多肽的組合物可以 包含具有 K447 的多肽, 所有 K447 均被去除的多肽, 或具有和不具有 K447 殘基的多肽的混 合物。
     用于本文目的的 “接納體人構架” 是包含衍生自人免疫球蛋白構架, 或衍生自人共 有構架的 VL 或 VH 構架的氨基酸序列的構架。 “衍生自” 人免疫球蛋白構架或人共有構架 的接納體人構架可以包含其相同的氨基酸序列, 或其可以包含預先存在的氨基酸序列的變 化。當存在預先存在的氨基酸變化時, 優選存在不多于 5 個和優選 4 個以下, 或 3 個以下的 預先存在的氨基酸變化。如果在 VH 中存在預先存在的氨基酸變化, 優選地那些變化僅在 位置 71H, 73H, 和 78H 中的三個、 兩個或一個位置處 ; 例如, 在那些位置的氨基酸殘基可以是 71A, 73T, 和 / 或 78A。在一個實施方案中, VL 接納體人構架的序列與 VL 人免疫球蛋白構架 序列或人共有構架序列相同。
     “人共有構架” 是在人免疫球蛋白 VL 或 VH 構架序列的選擇中代表最常見的氨基酸 殘基的構架。 一般地, 人免疫球蛋白 VL 或 VH 序列的選擇物來自可變結構域序列的亞組。 一 般地, 序列的亞組是在 Kabat 等中的亞組。在一個實施方案中, 關于 VL, 亞組是如在 Kabat 等中的亞組 κI。在一個實施方案中, 關于 VH, 亞組是如在 Kabat 等中的亞組 III。
     “VH 亞組 III 共有構架” 包含獲自在 Kabat 等的可變重鏈亞組 III 中的氨基酸序 列的共有序列。在一個實施方案中, VH 亞組 III 共有構架氨基酸序列包含下列序列的每個 的至少一部分或全部 :
     EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS(SEQ ID NO : 184)-HI-WVRQAPGKGLEWV(SEQ ID NO : 185)-H2-RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYC(SEQ ID NO : 186)-H3-WGQGTLVTVSS(SEQ ID NO : 187)
     “VL 亞組 I 共有構架” 包含獲自在 Kabat 等的可變輕鏈 κ 亞組 I 的氨基酸序列的 共有序列。在一個實施方案中, VH 亞組 I 共有構架氨基酸序列包含下列序列的每個的至少 一部分或全部 :
     DIQMTQSPSSLSASVGDRVTTTC(SEQ ID NO : 188)-LI-WYQQKPGKAPKLLIY(SEQ ID NO : 189)-L2-GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC(SEQ ID NO : 190)-L3-FGQGTKVEIK(SEQ ID NO : 191)
     當用于本文時, “抗體突變體” 或 “抗體變體” 指抗體的氨基酸序列變體, 其中所述 物種依賴型抗體的一個或多個氨基酸殘基已被修飾。 所述突變體必須與所述物種依賴型抗 體具有小于 100%的序列同一性或相似性。 在一個實施方案中, 所述抗體突變體與所述物種 依賴型抗體的重鏈可變結構域或輕鏈可變結構域任一個的氨基酸序列具有至少 75%的氨 基酸序列同一性或相似性, 更優選至少 80%、 更優選至少 85%、 更優選至少 90%、 且最優選 至少 95%的氨基酸序列同一性或相似性。 關于這一序列的同一性或相似性在本文中定義為 在比對序列且在需要時引入缺口 ( 以獲得最大百分比的序列同一性 ) 后, 候選序列中與物 種依賴型抗體殘基相同 ( 即, 相同殘基 ) 或相似 ( 即, 基于共有側鏈特性, 來自于同一組的 氨基酸殘基, 見下 ) 的氨基酸殘基的百分比。在可變結構域外抗體序列中的 N 端、 C 端、 或 內部延伸、 缺失或插入無一應該被解釋為影響序列的同一性或相似性。
     “病癥 (disorder)” 或 “疾病 (disease)” 是將從用本發明的物質 / 分子或方法進 行治療獲益的任何病況。這包括慢性和急性病癥或疾病, 包括使所述哺乳動物易感目的病 癥的病理性狀況的那些。在本文中要治療的病癥的非限制性實例包括惡性和良性腫瘤 ; 癌 癥, 母細胞瘤和肉瘤。
     “治療” 是指治療性處理和預防性或預防措施。需要治療的那些包括已經患有良性、 癌前的 (pre-cancerous) 或非轉移性腫瘤的那些以及其中要預防癌癥的發生或復發的 那些。
     術語 “治療有效量” 是指在哺乳動物中治療劑治療或預防疾病或病癥的量。在癌 癥的情況下, 治療劑的治療有效量可減少癌細胞的數量 ; 減小原發性腫瘤大小 ; 抑制 ( 即減 慢到一定程度并優選停止 ) 癌細胞浸潤到周圍器官中 ; 抑制 ( 即減慢到一定程度并優選停 止 ) 腫瘤轉移 ; 在一定程度抑制腫瘤生長 ; 和 / 或在一定程度上緩解一或多種與病癥相關 的癥狀。在達到藥物可以預防現存癌細胞生長和 / 或殺死現存癌細胞的程度時, 其可為細 胞生長抑制性和 / 或細胞毒性的。對于癌癥治療, 體內效力可以通過, 例如評價存活時間、 疾病進展時間 (TTP)、 反應率 (RR)、 反應持續時間、 和 / 或生活質量來測量。
     術語 “癌癥” 和 “癌性” 是指或者描述哺乳動物中典型地特征在于不可調控的細 胞生長的生理學狀態。包含于這種定義中的是良性和惡性癌癥。 “早期癌癥” 或 “早期腫 瘤” 是指沒有侵襲或轉移的癌癥或被分類為 0、 I 或 II 期癌癥的癌癥。癌癥的例子包括, 但不限于, 癌 (carcinoma)、 淋巴瘤、 母細胞瘤 ( 包括髓母細胞瘤 (medulloblastoma) 和視 網膜母細胞瘤 (retinoblastoma))、 肉瘤 ( 包括脂肪肉瘤 (liposarcoma) 和滑膜細胞肉 瘤 (synovial cell sarcoma)), 神經內分泌腫瘤 (neuroendocrine tumors)( 包括類癌瘤 (carcinoid tumors), 胃泌素瘤 (gastrinoma), 和胰島細胞癌 (islet cellcancer)), 間皮 瘤 (mesothelioma), 神經鞘瘤 (schwannoma)( 包括聽神經瘤 (acoustic neuroma)), 腦膜 瘤 (meningioma), 腺癌 (adenocarcinoma), 黑色素瘤 (melanoma), 和白血病或淋巴惡性腫 瘤 (lymphoid malignancies)。 這類癌癥的更具體的例子包括鱗狀細胞癌 ( 例如, 上皮鱗狀 細胞癌 ), 肺癌, 包括小細胞肺癌 (SCLC)、 非小細胞肺癌 (NSCLC)、 肺腺癌和肺鱗狀癌, 腹膜 癌, 肝細胞癌, 胃的或胃癌 (gastric or stomach cancer), 包括胃腸癌 (gastrointestinal cancer), 胰腺癌, 成膠質細胞瘤 (glioblastoma), 子宮頸癌, 卵巢癌, 肝癌, 膀胱癌, 肝細胞 瘤 (hepatoma), 乳腺癌 ( 包括轉移性乳腺癌 ), 結腸癌, 直腸癌, 結腸直腸癌, 子宮內膜或子 宮癌, 唾液腺癌, 腎癌 (kidneyor renal cancer), 前列腺癌, 外陰癌, 甲狀腺癌, 肝癌, 肛門 癌, 陰莖癌, 睪丸癌, 食管癌, 膽道腫瘤, 以及頭頸部癌癥和多發性骨髓瘤。
     術語 “癌前的” 是指典型地在癌癥之前或發展成為癌癥的狀態或生長。 “癌前的” 生長具有以異常的細胞周期調控、 增殖或分化為特征的細胞, 其可以通過細胞周期調控、 細 胞增殖或分化的標志物來確定。
     “發育異常 (dysplasia)” 是指組織、 器官或細胞的任何異常生長或發育。優選發 育異常是高分級的或癌前的。
     “轉移” 意指癌癥由其初始部位向身體的其它位置擴散。癌細胞可以脫離原代腫 瘤, 滲透到淋巴和血管中, 通過血流循環, 并且在身體中其它位置的正常組織中的遠端病灶 中生長 ( 轉移 )。轉移可以是局部的或遠端的。轉移是一個序貫的過程, 在脫離原代腫瘤的 腫瘤細胞上偶然發生, 通過血流移行, 并且在遠端部位停止。在新的部位, 細胞建立血液供 應, 并且可以生長形成威脅生命的團塊 (mass)。
     腫瘤細胞內的刺激性和抑制性分子途徑調控這一行為, 并且在遠端部位中腫瘤細 胞和宿主細胞之間的相互作用也是重要的。 “非轉移性” 是指良性的癌癥或保持在原發部位中并且沒有滲透至淋巴或血管系 統中或沒有滲透至原發部位以外的組織中的癌癥。通常, 非轉移性癌癥是為 0、 I 或 II 期癌
     癥的任一種癌癥, 并且偶爾是 III 期癌癥。
     “原發腫瘤” 或 “原發癌癥” 是指初始的癌癥并且不是位于該受試者體內另一組織、 器官或位置中的轉移病灶。
     “良性腫瘤” 或 “良性癌癥” 是指仍然位于起源部位并且不具有浸潤、 侵襲或轉移至 遠端部位的能力的腫瘤。
     “腫瘤負荷 (tumor burden)” 是指機體內癌細胞的數目、 腫瘤的大小或癌的量。腫 瘤負荷也稱為腫瘤負荷量 (tumor load)。
     “腫瘤數” 是至腫瘤的數目。
     “受試者” 意指哺乳動物, 包括但不限于, 人或非人哺乳動物, 諸如牛、 馬、 犬、 羊或 貓。優選地, 所述受試者是人。
     術語 “抗癌治療” 是指有效用于治療癌癥的治療。抗癌治療劑的實例包括, 但不限 于, 例如, 化療劑、 生長抑制劑、 細胞毒性試劑、 放射性治療中所有的試劑、 抗血管發生劑、 凋 亡劑、 抗微管蛋白劑、 和其它治療癌癥的試劑、 抗 -CD20 抗體、 血小板衍生生長因子抑制劑 TM ( 例如, Gleevec 甲磺酸伊馬替尼 (Imatinib Mesylate)), COX-2 抑制劑 ( 例如, 塞來考昔 (celecoxib)), 干擾素, 細胞因子, 結合下述一種或多種靶標的拮抗劑 ( 例如, 中和抗體 ) : ErbB2, ErbB3, ErbB4, PDGFR-β, BlyS, APRIL, BCMA 或 VEGF 受體, TRAIL/Apo2, 和其它生物 活性和有機化學劑等。它們的組合也包含在本發明中。
     術語 “細胞毒性劑” 用在本發明中指抑制或防止細胞功能和 / 或引起細胞破壞的 物質。該術語意欲包括放射性同位素 ( 例如 L131, L125, Y90 和 Re186), 化療劑, 和毒素如細菌、 真菌、 植物或動物來源的酶學活性毒素, 或其片段。
     “化療劑” 是有效用于治療癌癥的化合物。化療劑的實例包括有效用于治療癌 癥的化合物。化療劑的實例包括烷化劑類 (alkylating agents), 如塞替哌 (thiotepa) 和 環 磷 酰 胺 (cyclosphosphamide) ; 烷 基 磺 酸 酯 (alkyl sulfonates) 如 白 消 安 (busulfan), 英 丙 舒 凡 (improsulfan) 和 哌 泊 舒 凡 (piposulfan) ; 吖丙啶類 (aziridines) 如 苯 佐 替 派 (benzodopa)、 卡 波 醌 (carboquone)、 美 妥 替 哌 (meturedopa) 和烏瑞替哌 (uredopa) ; 乙烯亞胺 (ethylenimines) 和甲基蜜胺類 (methylamelamines), 包 括 六 甲 蜜 胺 (altretamine)、 曲 他 胺 (triethylenemelamine)、 三亞乙基磷酰胺 (triethylenephosphoramide)、 三 乙 撐 硫 代 磷 酰 胺 (triethylenethiophosphoramide) 和 三 羥 甲 蜜 胺 (trimethylolomelamine) ; 多 聚 乙 酰 類 (acetogenins)( 特 別 是 布 拉 他 辛 (bullatacin) 和 布 拉 他 辛 酮 (bullatacinone)) ; 喜 樹 堿 (camptothecin)( 包 括 合 成 的 類 似 物 托 泊 替 康 (topotecan)) ; 苔 蘚 抑 素 (bryostatin) ; callystatin ; CC-1065( 包 括 其 阿 多 來 新 (adozelesin)、 卡 折 來 新 (carzelesin) 和 比 折 來 新 (bizelesin) 合 成類似物 ) ; 隱 藻 素 類 (cryptophycins)( 特 別 是 隱 藻 素 1 和 隱 藻 素 8) ; 多拉司他汀 (dolastatin) ; 倍 癌 霉 素 (duocarmycin)( 包 括 合 成 的 類 似 物、 KW-2189 和 CB1-TM1) ; 艾 榴 素 (eleutherobin) ; pancratistatin ; 匍 枝 珊 瑚 醇 (sarcodictyin) ; 海 綿 素 (spongistatin) ; 氮 芥 (nitrogen mustards) 如 苯 丁 酸 氮 芥 (chlorambucil)、萘 氮 芥 (chlornaphazine)、 膽 磷 酰 胺 (cholophosphamide)、 雌 莫 司 汀 (estramustine)、 異 環 磷 酰 胺 (ifosfamide)、氮 芥 (mechlorethamine)、鹽 酸 氧 氮 芥 (mechlorethamine oxide hydrochloride)、美 法 侖 (melphalan)、新 氮 芥 (novembichin)、苯 芥 膽 甾醇 (phenesterine)、 潑 尼 莫 司 汀 (prednimustine)、 曲 磷 胺 (trofosfamide)、 尿嘧啶 氮 芥 (uracil mustard) ; 亞 硝 脲 類 (nitrosureas) 如 卡 莫 司 汀 (carmustine)、 氯脲 菌 素 (chlorozotocin)、福 莫 司 汀 (fotemustine)、洛 莫 司 汀 (lomustine)、尼 莫 司 汀 (nimustine) 和 雷 莫 司 汀 (ranimnustine) ; 抗 生 素 類, 如 烯 二 炔 類 (enediyne) 抗 生 素 ( 例 如, 加 利 車 霉 素 (calicheamicin)、 特 別 是 加 利 車 霉 素 γ1I 和 加 利 車 霉 素 ωI1( 參 見,例 如, Agnew, Chem Intl.Ed.Engl., 33 : 183-186(1994)) ;烯 二 炔 蒽 環 類 抗 生 素 (dynemicin), 包 括 烯 二 炔 蒽 環 類 抗 生 素 A(dynemicin A) ; 二膦酸鹽類 (diphosphonates), 如 氯 膦 酸 鹽 (clodronate) ; 埃 斯 波 霉 素 (esperamicin) ; 以及新制 癌 菌 素 (neocarzinostatin) 發 色 團 和 相 關 色 蛋 白 烯 二 炔 類 抗 生 素 發 色 團、 阿克拉霉 素 (aclacinomysins)、 放 線 菌 素 (actinomycin)、 安 曲 霉 素 (anthramycin)、 偶氮絲氨 酸 (azaserine)、 博 來 霉 素 (bleomycins)、 放 線 菌 素 C(cactinomycin)、 carabicin、 洋 紅 霉 素 (carminomycin)、 嗜 癌 霉 素 (carzinophilin)、 色 霉 素 (chromomycinis)、 放線 菌 素 D(dactinomycin)、 柔 紅 霉 素 (daunorubicin)、 地 托 比 星 (detorubicin)、 6- 重 氮 基 -5- 氧 -L- 正 亮 氨 酸 (6-diazo-5-oxo-L-norleucine)、 多柔比星 (doxorubicin)( 包括嗎啉代 - 多柔比星 (morpholino-doxorubicin)、 氰基嗎啉代 - 多柔比 星 (cyanomorpholino-doxorubicin)、 2- 吡咯啉代 - 多柔比星 (2-pyrrolino-doxorubicin) 和脫氧多柔比星 (deoxydoxorubicin))、 表柔比星 (epirubicin)、 依索比星 (esorubicin)、 伊 達 比 星 (idarubicin)、 馬 塞 羅 霉 素 (marcellomycin)、 絲 裂 霉 素 類 (mitomycins) 如 絲 裂 霉 素 C、 麥 考 酚 酸 (mycophenolic acid)、 諾 拉 霉 素 (nogalamycin)、 橄欖霉 素 (olivomycins)、培 洛 霉 素 (peplomycin)、 potfiromycin、嘌 呤 霉 素 (puromycin)、 三 鐵 阿 霉 素 (quelamycin)、 羅 多 比 星 (rodorubicin)、 鏈 黑 霉 素 (streptonigrin)、 鏈 佐 星 (streptozocin)、 殺 結 核 菌 素 (tubercidin)、 烏 苯 美 司 (ubenimex)、 凈司他丁 (zinostatin)、 佐柔比星 (zorubicin) ; 抗代謝物如甲氨喋呤 (methotrexate) 和 5- 氟尿 嘧啶 (5-fluorouracil)(5-FU) ; 葉酸類似物如二甲葉酸 (denopterin)、 甲氨喋呤、 喋羅呤 (pteropterin)、 三甲曲沙 (trimetrexate) ; 嘌呤類似物, 如氟達拉濱 (fludarabine)、 6- 巰 基嘌呤 (6-mercaptopurine)、 硫咪嘌呤 (thiamiprine)、 硫鳥嘌呤 (thioguanine) ; 嘧啶類 似物, 如安西他濱 (ancitabine)、 阿扎胞苷 (azacitidine)、 6- 氮尿苷 (6-azauridine)、 卡 莫 氟 (carmofur)、 阿 糖 胞 苷 (cytarabine)、 雙 脫 氧 尿 苷 (dideoxyuridine)、 去氧 氟 尿 苷 (doxifluridine)、 依 諾 他 濱 (enocitabine)、 氟 尿 苷 (floxuridine) ; 雄激素 類, 諸 如 卡 魯 睪 酮 (calusterone)、 丙 酸 屈 他 雄 酮 (dromostanolone propionate)、 環 硫 雄 醇 (epitiostanol)、 美 雄 烷 (mepitiostane)、 睪 內 酯 (testolactone) ; 抗腎上腺 藥 (anti-adrenals), 如 氨 魯 米 特 (aminoglutethimide)、 米 托 坦 (mitotane)、 曲洛司 坦 (trilostane) ; 葉 酸 補 充 劑, 如 亞 葉 酸 (folinic acid) ; 醋 葡 醛 內 酯 (aceglatone) ; aldophosphamide glycoside ; 5- 氨 基 酮 戊 酸 (aminolevulinicacid) ;恩 尿 嘧 啶 (eniluracil) ; 安 吖 啶 (amsacrine) ; bestrabucil ; 比 生 群 (bisantrene) ; 依達曲 沙 (edatraxate) ; defofamine ;秋 水 仙 胺 (demecolcine) ;地 吖 醌 (diaziquone) ; elfornithine ; 依利醋銨 (elliptinium acetate) ; epothilone ; 依托格魯 (etoglucid) ; 硝 酸 鎵 (gallium nitrate) ; 羥 脲 (hydroxyurea) ; 香 菇 多 糖 (lentinan) ; 氯尼達明 (lonidainine) ; 美 登 木 素 生 物 堿 類 (maytansinoids), 如 美 登 素 (maytansine) 和 安 絲菌 素 (ansamitocins) ; 米 托 胍 腙 (mitoguazone) ; 米 托 蒽 醌 (mitoxantrone) ; 莫哌達醇 (mopidanmol) ; 尼曲吖啶 (nitraerine) ; 噴司他丁 (pentostatin) ; 異丙嗪 (phenamet) ; 吡 柔 比 星 (pirarubicin) ; 洛 索 蒽 醌 (losoxantrone) ; 鬼 臼 酸 (podophyllinic acid) ; 2- 乙 基 酰 肼 (2-ethylhydrazide) ; 丙 卡 巴 肼 (procarbazine) ; 多 糖 復 合 物 (JHS NaturalProducts(JHS 天然產品 ), Eugene, OR) ; 雷佐生 (razoxane) ; 利索新 (rhizoxin) ; 西佐喃 (sizofiran) ; 鍺螺胺 (spirogermanium) ; 細交鏈孢菌酮酸 (tenuazonicacid) ; 三 亞胺醌 (triaziquone) ; 2, 2’ , 2” - 三氯三乙胺 (2, 2’ , 2” -trichlorotriethylamine) ; 單端 孢霉烯族化合物 (trichothecenes)( 特別是 T-2 毒素、 verracurin A、 桿孢菌素 A(roridin A) 和 anguidine) ; 烏拉坦 (urethan) ; 長春地辛 (vindesine) ; 達卡巴嗪 (dacarbazine) ; 甘露莫司汀 (mannomustine) ; 二溴甘露醇 (mitobronitol) ; 二溴衛矛醇 (mitolactol) ; 哌 泊溴烷 (pipobroman) ; gacytosine ; 阿拉伯糖苷 (arabinoside)(“Ara-C” ); 環磷酰胺 ; 塞替哌 (thiotepa) ; 紫杉烷類化合物 (taxoids), 例如, 紫杉醇 (Bristol-Myers TM Squibb Oncology, Princeton, 新澤西 ), ABRAXANE 無克列莫佛 (Cremophor-free)、 紫杉醇 的白蛋白改造的納米顆粒制劑 (American Pharmaceutical Partners, Schaumberg, 伊利諾 伊州 ) ; 和 多西他賽 (doxetaxel)( -Poulenc Rorer, Antony, 法國 ) ; chloranbucil ; 吉 西 他 濱 (gemcitabine) ; 6- 硫 鳥 嘌 呤 (6-thioguanine) ; 巰 嘌 呤 (mercaptopurine) ; 甲 氨 喋 呤; 鉑 類 似 物,如 順 鉑 (cisplatin) 和 卡 鉑 (carboplatin) ; 長春堿 (vinblastine) ; 鉑; 依托泊苷 (etoposide)(VP-16) ; 異環磷酰胺 (ifosfamide) ; 米 托 蒽 醌 (mitoxantrone) ; 長 春 新 堿 (vincristine) ; 長 春 瑞 濱 (vinorelbine) ; 諾 安 托 (novantrone) ; 替 尼 泊 苷 (teniposide) ; 依達曲沙 (edatrexate) ; 柔紅霉素 (daunomycin) ; 氨基喋呤 (aminopterin) ; 希羅達 (xeloda) ; 伊 班膦酸鹽 (ibandronate) ; 伊立替康 (irinotecan)(Camptosar, CPT-11)( 包括伊立替康 與 5-FU 和亞葉酸 (leucovorin) 的治療方案 ) ; 拓撲異構酶抑制劑 RFS 2000 ; 二氟甲基 鳥 氨 酸 (difluoromethylornithine)(DMFO) ; 維 甲 類 (retinoids), 如 視 黃 酸 (retinoic acid) ; 卡 培 他 濱 (capecitabine) ; 康 普 瑞 汀 (combretastatin) ; VELCADE 硼 替 佐 米 (bortezomib) ; REVLIMID 來 那 度 胺 (lenalidomide) ; 亞 葉 酸 (leucovorin)(LV) ; 奧沙利 鉑 (oxaliplatin), 包括奧沙利鉑治療方案 (FOLFOX) ; 下列的抑制劑 : PKC-α, Raf, H-Ras, TM EGFR( 例如, 厄洛替尼 (erlotinib)(Tarceva )) 和 VEGF-A, 所述抑制劑減少細胞增殖, 以及 上述任一種的藥用鹽、 酸或衍生物。
     抗激素試劑也包含在這一定義中, 其起作用調控或抑制激素對腫瘤的作用, 如 抗 雌 激 素 和 選 擇 性 雌 激 素 受 體 調 節 劑 (SERMs), 其 包 括, 例 如, 他 莫 昔 芬 (tamoxifen) ( 包括 他 莫 昔 芬 ), 雷 洛 昔 芬 (raloxifene), 屈 洛 昔 芬 (droloxifene), 4- 羥 基 他 莫 昔 芬 (4-hydroxytamoxifen),曲 沃 昔 芬 (trioxifene), keoxifene, LY117018, 奧 那 司 酮 (onapristone), 和 FARESTON· 托 瑞 米 芬 (toremifene) ; 抑制芳 香酶的芳香酶抑制劑, 其調節腎上腺中的雌激素生產, 諸如例如, 4(5)- 咪唑, 氨魯米特 (aminoglutethimide), 醋酸甲地孕酮 (megestrolacetate), 依 西 美 坦 (exemestane), 福 美 坦 (formestanie), 法 倔 唑 (fadrozole), 伏 氯 唑 (vorozole), 來 曲 唑 (letrozole),和 阿那曲 唑 (anastrozole) ; 和 抗 雄 激 素 類, 如 氟 他 胺 (flutamide), 尼 魯 米 特 (nilutamide),比 卡 魯 胺 (bicalutamide), 亮 丙 立 德 (leuprolide), 和 戈 舍 瑞 林 (goserelin) ; 以 及 曲 沙 他 濱 (troxacitabine)(1, 3- 二 氧 戊 環 核 苷 胞 嘧 啶 類 似 物 (1, 3-dioxolane nucleosidecytosine analog)) ; 反義寡核苷酸, 特別是抑制異常細胞增殖中所涉及的信 號傳導途徑中的基因 ( 諸如例如, PKC-α, Raf 和 H-Ras) 表達的那些 ; 核酶如 VEGF 表達 抑制劑 ( 例如, 核酶 ) 和 HER2 表達抑制劑 ; 疫苗如基因治療疫苗, 例 如, 疫 苗, 疫 苗, 和 疫苗 ; rIL-2 ; 拓撲異構酶1抑制劑; rmRH ; 長春瑞濱 (Vinorelbine) 和埃斯波霉素 (Esperamicins)( 參見美國專利號 4,675,187), 以及上述任 一種的藥用鹽、 酸或衍生物。
     術語 “前藥” 用在本申請中是指藥物活性物質的前體或衍生物形式, 其較親本藥 物對腫瘤細胞的細胞毒性更小并且能夠被酶活化或轉化為更具活性的親本形式。參見, 例 如, Wilman,″ Prodrugs in CancerChemotherapy( 癌癥化療中的前藥 )″ Biochemical Society Transactions( 生 物 化 學 學 會 學 報 ), 14,第 375-382 頁, 615th Meeting Belfast(1986) 和 Stella 等, ″ Prodrugs : A Chemical Approach to Targeted Drug Delivery, ( 前藥 : 靶向藥物遞送的化學方法 )″ Directed Drug Delivery( 定向藥物遞 送 ), Borchardt 等, ( 編輯 ), 第 247-267 頁, Humana Press(1985)。本發明的前藥包括, 但 不限于, 含磷酸鹽的前藥, 含硫代磷酸鹽的前藥, 含硫酸鹽的前藥, 含肽的前藥, D- 氨基酸修 飾的前藥, 糖基化前藥, 含 β- 內酰胺的前藥, 含任選取代的苯氧基乙酰胺的前藥或含任選 取代的苯基乙酰胺的前藥, 可以被轉化為更具活性的無細胞毒性的藥物的 5- 氟胞嘧啶和 其它 5- 氟尿嘧啶前藥。可以被衍生成用于本發明的前藥形式的細胞毒性藥物的實例包括, 但不限于, 上述那些化療劑。
     “放射性治療” 意指使用定向的 γ 射線或 β 射線誘導充分的細胞損害, 從而限 制其正常行使功能的能力或完全破壞細胞。應該理解, 本領域中存在已知的多種方式來確 定治療的劑量和持續時間。典型的治療提供為一次施用并且典型的劑量在 10-200 單位 (Grays)/ 天范圍內。
     ″生物學樣品″ ( 可相互替換地稱為 “樣品” 或 “組織或細胞樣品” ) 涵蓋從個體 獲得的多種樣品類型并可用于診斷或監測測定中。 該定義涵蓋生物學來源的血和其它液體 樣品, 實體組織樣品如活組織檢查樣品或組織培養物或由其衍生的細胞, 以及其后代。 該定 義也包括在它們獲得后以任何方式操作的樣品, 如用試劑處理, 增溶, 或富集某些成分如蛋 白或多核苷酸, 或包埋在半固體或固體基質中用于切片的目的。術語″生物學樣品″涵蓋 臨床樣品, 并也包括培養物中的細胞、 細胞上清液、 細胞裂解物、 血清、 血漿、 生物學液體和 組織樣品。生物學樣品的來源可以是實體組織, 來自于新鮮、 冷凍和 / 或儲存的器官或組織 樣品或活組織檢查或抽吸 ; 血液或任何血液成分 ; 體液如腦脊液、 羊水、 腹水或間質液 ; 來 自于個體孕育或發育中的任何時間的細胞。在一些實施方案中, 生物學樣品從原發性或轉 移腫瘤中獲得。 生物學樣品可含有本身與組織不天然混合的化合物如防腐劑、 抗凝劑、 緩沖 劑、 固定劑、 營養素、 抗生素等。
     為了本文的目的, 組織樣品的 “切片” 是指組織樣品的單一部分或片, 例如, 從組織 樣品切取的組織薄片或細胞。要理解可以取組織樣品的多個切片并根據本發明進行分析。 在一些實施方案中, 組織樣品的同一切片在形態學和分子水平兩者上進行分析, 或關于蛋白和核酸兩者進行分析。
     詞語 “標記物” 當在本文中使用時是指直接或間接與試劑諸如核酸探針或抗體綴 合或融合并促進與其綴合或融合的試劑的檢測的化合物或組合物。 所述標記物可以本身是 可檢測的 ( 例如, 放射同位素標記物或熒光標記物 ), 或者, 在酶標記物的情形中, 可以催化 可檢測的底物化合物或組合物的化學改變。
     本發明的組合物和方法
     本發明涵蓋組合物, 包括藥物組合物, 它們包含抗 -FGFR3 抗體 ; 并且涵蓋包含 編碼抗 -FGFR3 抗體的序列的多核苷酸。當在本文中使用時, 組合物包含一種或多種結合 FGFR3 的抗體, 和 / 或一種或多種包含編碼一種或多種結合 FGFR3 的抗體的序列的多核苷 酸。這些組合物可以進一步包含合適的載體, 諸如藥用賦形劑, 所述藥用賦形劑包括緩沖 劑, 它們在本領域中是公知的。
     本發明還涵蓋分離的抗體和多核苷酸實施方案。 本發明還涵蓋基本上純的抗體和 多核苷酸實施方案。
     本發明還涵蓋使用抗 -FGFR3 抗體 ( 如本文所述或如本領域中已知的 ) 治療病癥, 例如多發性骨髓瘤或過渡期癌癥 ( 例如, 侵襲性過渡期癌癥 ) 的方法。
     組合物
     本發明的抗 -FGFR3 抗體優選是單克隆的。還涵蓋在本發明的范圍內的有本文提 供的抗 -FGFR3 抗體的 Fab, Fab′, Fab′ -SH 和 F(ab′ )2 片段。這些抗體片段可以通過傳 統手段形成, 諸如酶消化, 或可以通過重組技術生成。 這樣的抗體片段可以是嵌合的或人源 化的。這些片段可用于下面給出的診斷和治療目的。
     單克隆抗體從基本上同質的抗體的群體獲得, 即, 包含該單一抗體的群體除了可 能天然存在的突變以外均是相同的, 所述天然存在的突變可能以微量存在。因此, 修飾語 “單克隆” 表示抗體的特征不是毫無聯系的抗體的混合物。
     本發明的抗 -FGFR3 單克隆抗體可以使用最初由 Kohler 等, Nature( 自然 ), 256 : 495(1975) 描述的雜交瘤法制備, 或可以通過重組 DNA 方法 ( 美國專利號 4,816,567) 制備。
     在雜交瘤方法中, 將小鼠或其它適當的宿主動物 ( 如倉鼠 ) 免疫以激發產生或能 夠產生特異性結合用于免疫的蛋白的抗體的淋巴細胞。針對 FGFR3 的抗體可以在動物中通 過多次皮下 (sc) 或腹膜內 (ip) 注射 FGFR3 和佐劑來產生。 FGFR3 可以使用本領域中公知的 方法來制備, 在本文中進一步描述這些方法中的一些。例如, 下面描述人和鼠 FGFR3 的重組 產生。 在一個實施方案中, 將動物用與免疫球蛋白重鏈的 Fc 部分融合的 FGFR3 免疫。 在優選 的實施方案中, 將動物用 FGFR3-IgG1 融合蛋白免疫。動物通常針對 FGFR3 與單磷酰基脂質 A(MPL)/ 海藻糖 dicrynomycolate(trehalose dicrynomycolate)(TDM)(Ribi Immunochem. Research, Inc., Hamilton, MT) 的免疫原性綴合物或衍生物免疫并且將該溶液在多個部位 皮內注射。兩周后將動物加強免疫。7 至 14 天后, 將動物放血并且測定血清的抗 -FGFR3 效 價。將動物加強免疫直至效價達到穩定期。
     備選地, 淋巴細胞可以在體外免疫。 然后, 使用適當的融合劑, 如聚乙二醇, 將淋巴 細胞與骨髓瘤細胞融合, 以形成雜交瘤細胞 (Goding, Monoclonal Antibodies : Principles and Practice( 單克隆抗體 : 原理與實踐 ), 第 59-103 頁 (Academic Press, 1986))。
     將這樣制備的雜交瘤接種和生長在適當的培養基中, 所述培養基優選地包含一種或多種抑制未融合的親本骨髓瘤細胞的生長或存活的物質。例如, 如果親本骨髓瘤細胞缺 少這樣的酶, 即次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖基轉移酶 (HGPRT 或 HPRT), 則用于雜交瘤的培養 基典型地將包括次黃嘌呤、 氨基蝶呤、 和胸苷 (HAT 培養基 ), 所述物質防止 HGPRT- 缺陷型細 胞生長。
     優選的骨髓瘤細胞是有效融合、 支持所選擇的生產抗體的細胞的穩定的高水平 抗體生產、 并且對諸如 HAT 培養基的培養基敏感的那些細胞。其中, 優選的骨髓瘤細胞系 是鼠骨髓瘤株系, 諸如來源于 MOPC-21 和 MPC-11 小鼠腫瘤的那些, 其可從美國加利福尼亞 州圣地亞哥的 Salk 細胞配送中心研究所 (Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, California USA) 獲得, 以及 SP-2 或 X63-Ag8-653 細胞, 其可從美國馬里蘭州 Rockville 的美國典型培養物保藏中心 (American Type CultureCollection, Rockville, Maryland USA) 獲得。也記述了人骨髓瘤和小鼠 - 人異源骨髓瘤細胞系, 其用于生產人單 克隆抗體 (Kozbor, J.Immunol.( 免疫學雜志 ), 133 : 3001(1984) ; Brodeur 等, Monoclonal Antibody ProductionTechniques and Applications( 單克隆抗體生產技術和應用 ), 第 51-63 頁 (Marcel Dekker, Inc., 紐約, 1987))。
     測定其中雜交瘤細胞正在生長的培養基中針對 FGFR3 的單克隆抗體的產生。優選 地, 通過免疫沉淀或通過體外結合測定, 諸如放射性免疫測定 (RIA) 或酶聯免疫吸附測定 (ELISA), 來確定由雜交瘤細胞生產的單克隆抗體的結合特異性。
     單克隆抗體的結合親合力可以, 例如, 通過 Munson 等, Anal.Biochem.( 分析生物 化學 ), 107 : 220(1980) 的 Scatchard 分析測定。
     在鑒定了生產具有所需要的特異性、 親和性和 / 或活性的抗體的雜交瘤細胞 后, 可以通過有限的稀釋步驟亞克隆該克隆, 并且通過標準方法 (Goding, Monoclonal Antibodies : Principles and Practice( 單 克 隆 抗 體 : 原 理 和 實 踐 ), 第 59-103 頁 (Academic Press, 1986)) 生長。適用于該目的的培養基包括, 例如, D-MEM 或 RPMI-1640 培 養基。另外, 雜交瘤細胞可以在動物中作為腹水瘤體內生長。
     通過常規免疫球蛋白純化方法, 諸如例如, 蛋白質 A- 瓊脂糖、 羥磷灰石層析、 凝膠 電泳、 透析、 或親和層析, 適當地從培養基、 腹水液、 或血清中分離由亞克隆分泌的單克隆抗 體。
     可以通過使用組合文庫篩選具有所需的一種或多種活性的合成抗體克隆來制備 本發明的抗 FGFR3 抗體。原則上, 通過篩選包含這樣的噬菌體的噬菌體文庫來選擇合成 的抗體克隆, 所述噬菌體展示融合于噬菌體外殼蛋白的抗體可變區 (Fv) 的各種片段。所 述噬菌體文庫通過針對需要的抗原的親和層析法進行淘選。將表達能夠結合需要的抗原 的 Fv 片段的克隆吸附到抗原上, 并且由此與在文庫中未結合的克隆分離。接著從抗原上 洗脫結合的克隆, 并且可以進一步通過另外的抗原吸附 / 洗脫循環富集。本發明的任一種 抗 -FGFR3 抗體可以通過下述獲得 : 設計適合的抗原篩選方法以選擇目的噬菌體克隆, 隨后 使用來自目的噬菌體克隆的 Fv 序列和在 Kabat 等, 免疫學感興趣的蛋白的序列 (Sequence of Proteins ofImmunological Interest),第 5 版, NIH 出 版 物 91-3242, Bethesda MD(1991), 卷 1-3 中所述的適合的恒定區 (Fc) 序列構建全長抗 -FGFR3 抗體克隆。
     抗體的抗原結合結構域由約 110 個氨基酸的兩個可變 (V) 區形成, 每個分別來自 輕鏈 (VL) 和重鏈 (VH), 并且都具有三個高變環或互補性決定區 (CDRs)。可變結構域可以功能上展示在噬菌體上, 或者作為單鏈 Fv(scFv) 片段展示, 其中 VH 和 VL 通過短的柔性肽 共價連接, 或作為 Fab 片段展示, 其中它們分別融合于恒定結構域并且非共價地相互作用, 如在 Winter 等, Ann.Rev.Immunol.( 免疫學年度綜述 ), 12 : 433-455(1994) 中所述。用于 本文時, 編碼 scFv 的噬菌體克隆和編碼 Fab 的噬菌體克隆統稱為 “Fv 噬菌體克隆” 或″ Fv 克隆″。
     VH 和 VL 基因的所有組成成分可以通過聚合酶鏈式反應 (PCR) 單獨克隆并且隨 機重組在噬菌體文庫中, 其接著可以關于抗原結合克隆被探究, 如在 Winter 等, Ann.Rev. Immunol.( 免疫學年度綜述 ), 12 : 433-455(1994) 中所述。來自免疫來源的文庫提供針對 免疫原的高親和性抗體, 而不需要構建雜交瘤。 備選地, 可以克隆天然的所有組成成分從而 在無需任何免疫的條件下提供針對廣泛范圍的非自體抗原以及自體抗原的人抗體的單一 來源, 如在 Griffiths 等, EMBO J, 12 : 725-734(1993) 中所述。最終, 還可以通過從干細胞 克隆未重排的 V- 基因區段, 并使用包含隨機序列的 PCR 引物來編碼高度可變的 CDR3 區并 實現體外重排來合成制備天然文庫, 如由 Hoogenboom 和 Winter, 分子生物學雜志 (J.Mol. Biol.), 227 : 381-388(1992) 所述。
     將絲狀噬菌體用于通過融合于較小的外殼蛋白 pIII 來展示抗體片段。所述抗體 片段可以作為單鏈 Fv 片段展示, 其中 VH 和 VL 結構域在相同的多肽鏈上通過柔性多肽間 隔臂連接, 例如如由 Marks 等, 分子生物學雜志 (J.Mol.Biol.), 222 : 581-597(1991) 所述, 或作為 Fab 片段展示, 其中一條鏈融合于 pIII, 而另一條鏈分泌到細菌宿主細胞周質中, 其 中組裝 Fab- 外殼蛋白結構, 其通過取代一些野生型外殼蛋白而展示在噬菌體表面上, 如在 Hoogenboom 等, 核酸研究 (Nucl.Acids Res)., 19 : 4133-4137(1991) 中所述。
     一般地, 編碼抗體基因片段的核酸獲自從人或動物中收集的免疫細胞。如果需要 偏向有利于抗 -FGFR3 克隆的文庫, 用 FGFR3 來免疫個體從而產生抗體反應, 并且回收脾細 胞和 / 或循環 B 細胞、 其它的外周血淋巴細胞 (PBLs) 用于文庫構建。在一個優選的實施方 案中, 在攜帶功能性人免疫球蛋白基因陣列 ( 并且缺乏功能性內源抗體生產系統 ) 的轉基 因小鼠中通過產生抗 -FGFR3 抗體反應來獲得偏向有利于抗 -FGFR3 克隆的人抗體基因片段 文庫, 從而使 FGFR3 免疫提供產生針對 FGFR3 的人抗體的 B 細胞。在下面描述生產人抗體 的轉基因小鼠的產生。
     可以通過使用適合的篩選方法來分離表達 FGFR3- 特異性膜結合抗體的 B 細胞來 獲得對抗 -FGFR3 反應性細胞群體的另外的富集, 例如通過使用 FGFR3 親和層析法分離細胞 或將細胞吸附到熒光染料標記的 FGFR3, 隨后進行流式激活的細胞分選 (flow-activated cell sorting)(FACS) 而進行。
     備選地, 應用來自未被免疫的供體的脾細胞和 / 或 B 細胞或其它 PBLs 提供可能的 抗體所有組成成分的更好的呈現, 并且還允許使用任何其中 FGFR3 不是抗原性的動物 ( 人 或非人 ) 物種來構建抗體文庫。對于體外結合抗體基因的文庫構建, 從個體中收集干細胞 從而提供編碼未重排的抗體基因區段的核酸。可以從多種動物物種, 如人、 小鼠、 大鼠、 兔 類、 luprine、 犬、 貓、 豬、 牛、 馬和禽類物種等獲得目的免疫細胞。
     從目的細胞中回收編碼抗體可變基因區段 ( 包括 VH 和 VL 區段 ) 的核酸, 并且進 行擴增。在重排的 VH 和 VL 基因文庫的情形中, 可以通過從淋巴細胞中分離基因組 DNA 或 mRNA, 隨后用匹配重排 VH 和 VL 基因的 5′和 3′端的引物進行聚合酶鏈式反應 (PCR) 來獲得需要的 DNA, 如在 Orlandi 等, 美國國家科學院學報 (Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)), 86 : 3833-3837(1989) 中所述, 由此制備多樣的 V 基因所有組成成分進行表達。可以從 cDNA 和 基因組 DNA 擴增 V 基因, 其中反向引物 (back primers) 在編碼成熟 V- 結構域的外顯子 5′ 端, 而正向引物基于 J- 區段中, 如在 Orlandi 等 (1989) 和 Ward 等, 自然 (Nature), 341 : 544-546(1989) 中所述。然而, 對于從 cDNA 中擴增, 反向引物也可以基于前導外顯子中, 如 在 Jones 等, 生物技術 (Biotechnol.), 9: 88-89(1991) 中所述, 而正向引物在恒定區內, 如 在 Sastry 等, 美國國家科學院學報 (Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)), 86 : 5728-5732(1989) 中 所述。 為了使互補性最大化, 可以將簡并性結合在引物中, 如在 Orlandi 等 (1989) 或 Sastry 等 (1989) 中所述。優選地, 通過使用靶向每個 V 基因家族的 PCR 引物以擴增在免疫細胞 核酸樣品中存在的所有可獲得的 VH 和 VL 排列來使文庫多樣性最大化, 例如在 Marks 等, 分子生物學雜志 (J.Mol.Biol.), 222 : 581-597(1991) 的方法中所述, 或如在 Orum 等, 核酸 研究 (Nucleic Acids Res.), 21 : 4491-4498(1993) 的方法中所述。關于將擴增的 DNA 克 隆到表達載體中, 可以將稀有的限制性酶切位點作為在一端的標記引入 PCR 引物中, 如在 Orlandi 等 (1989) 中所述, 或通過用標記的引物進一步進行 PCR 擴增, 如在 Clackson 等, 自 然 (Nature), 352 : 624-628(1991) 中所述。
     合成的重排的 V 基因的所有組成成分可以在體外來自 V 基因區段。已經對大部 分的人 VH- 基因區段進行克隆和測序 ( 在 Tomlinson 等, 分子生物學雜志 (J.Mol.Biol.), 227 : 776-798(1992) 中報道 ), 并進行作圖 ( 在 Matsuda 等, 自然遺傳學 (Nature Genet.), 3: 88-94(1993) 中報道 ) ; 可以將這些克隆的區段 ( 包括 H1 和 H2 環的所有主要的構象 ) 用于用編碼多樣序列和長度的 H3 環的 PCR 引物產生多樣的 VH 基因的所有組成成分, 如在 Hoogenboom 和 Winter, 分子生物學雜志 (J.Mol.Biol.), 227 : 381-388(1992) 中所述。VH 所有組成成分還可以用集中在單一長度的長 H3 環中的所有的序列多樣性進行制備, 如在 Barbas 等, 美國國家科學院學報 (Proc.Natl.Acad.Sci.USA), 89 : 4457-4461(1992) 中所 述。 已經對人 Vκ 和 Vλ 區段進行克隆和測序 ( 在 Williams 和 Winter, 歐洲免疫雜志 (Eur. J.Immunol.), 23 : 1456-1461(1993) 中報道 ), 并且可以用于制備合成的輕鏈所有組成成 分。 基于一系列 (a range of)VH 和 VL 折疊, 和 L3 和 H3 長度的合成的 V 基因所有組成成分 將編碼具有相當多結構多樣性的抗體。 在擴增編碼 V- 基因的 DNA 后, 可以根據 Hoogenboom 和 Winter, 分子生物學雜志 (J.Mol.Biol.), 227 : 381-388(1992) 的方法, 將種系 V- 基因區 段在體外進行重排。
     抗體片段的所有組成成分可以通過以數種方式將 VH 和 VL 基因的所有組成成分組 合在一起而構建。 每個所有組成成分可以在不同的載體中產生, 所述載體可以在體外重組, 例如如在 Hogrefe 等, 基因 (Gene), 128 : 119-126(1993) 中所述, 或可以通過組合感染在體 內重組, 例如通過在 Waterhouse 等, 核酸研究 (Nucl.Acids Res)., 21 : 2265-2266(1993) 中 所述的 loxP 系統。體內重組方法應用 Fab 片段的雙鏈性質來克服由大腸桿菌轉化效率對 文庫大小所施加的限制。將天然 VH 和 VL 所有組成成分單獨克隆, 一個克隆到噬菌粒中, 并 且另一個克隆到噬菌體載體中。 接著將兩種文庫通過對包含噬菌粒的細菌的噬菌體感染進 行組合從而使每個細胞包含不同的組合, 并且文庫大小僅由存在的細胞數量 ( 約 1012 個克 隆 ) 限制。兩種載體包含體內重組信號從而可以將 VH 和 VL 基因重組到單一復制子上并且 共同包裝到噬菌體病毒體中。 這些巨大的文庫提供大量的具有良好親和性 (Kd-1 約為 10-8M)的多種抗體。
     備選地, 可以將所有組成成分順序地克隆到同一載體中, 例如如在 Barbas 等, 美 國 國 家 科 學 院 學 報 (Proc.Natl.Acad.Sci.USA, )88 : 7978-7982(1991) 中 所 述, 或通 過 PCR 裝 配 在 一 起, 并 且 接 著 進 行 克 隆, 例 如 如 在 Clackson 等, 自 然 (Nature), 352 : 624-628(1991) 中所述。還可以將 PCR 裝配 (PCR assembly) 用于將 VH 和 VL DNA 與編碼 柔性肽間隔臂的 DNA 連接在一起形成單鏈 Fv(scFv) 所有組成成分。在其它的技術中, 將 “在細胞中的 PCR 裝配 (in cell PCR assembly)” 用于將 VH 和 VL 基因通過 PCR 組合在淋 巴細胞中, 并且接著克隆連接的基因的所有組成成分, 如在 Embleton 等, 核酸研究 (Nucl. AcidsRes.), 20 : 3831-3837(1992) 中所述。
     由天然文庫 ( 自然的或合成的 ) 產生的抗體可以具有中度親和性 (Kd-1 為約 106 到 107M-1), 但是親和力成熟也可以通過構建次級文庫并且再次從所述文庫中選擇來在體外 進行模擬, 如在 Winter 等 (1994), 見上文中所述。例如, 可以在 Hawkins 等, 分子生物學 雜志 (J.Mol.Biol.), 226 : 889-896(1992) 的方法或 Gram 等, 美國國家科學院學報 (Proc. Natl.Acad.Sci USA), 89 : 3576-3580(1992) 的方法中使用易錯聚合酶 ( 在 Leung 等, 技術 (Technique), 1: 11-15(1989) 中報道 ), 在體外隨機引入突變。 另外可以如下進行親和力成 熟: 例如使用由引物 ( 攜帶跨越目的 CDR 的隨機序列 ) 進行的 PCR 在選定的個體 Fv 克隆 中隨機突變一個或多個 CDR, 并且篩選具有更高親和性的克隆。WO 96/07754( 公開于 1996 年 3 月 14 日 ) 描述了一種在免疫球蛋白輕鏈的互補性決定區中誘導突變發生從而產生輕 鏈基因的文庫的方法。另一種有效方法是將通過噬菌體展示選擇的 VH 或 VL 結構域與獲自 未免疫的供體的天然存在的 V 結構域變體的所有組成成分重組并且在數輪鏈改組中關于 更高的親和性進行篩選, 如在 Marks 等, 生物技術 (Biotechnol.), 10 : 779-783(1992) 中所 -9 述。該技術允許產生具有 10 M 范圍內的親和性的抗體和抗體片段。
     FGFR3 核酸和氨基酸序列在本領域中是已知的。編碼 FGFR3 的核酸序列可以使 用 FGFR3 的所需區的氨基酸序列來設計。如本領域中所公知的, 存在兩種主要的 FGFR3 的 剪接同種型, 即 FGFR3IIIb 和 FGFR3IIIc。FGFR3 序列在本領域中是公知的, 并且可能包括 UniProKB/Swiss-Prot 登記號 P22607(FGFR3IIIc) 或 P22607_2(FGFR3IIIb) 的序列。 FGFR3 突變已經得以鑒定并且在本領域中是眾所周知的, 并且包括下列突變 ( 參照 UniProKB/ Swiss-Prot 登記號 P22607(FGFR3IIIc) 或 P22607_2(FGFR3IIIb) 中顯示的序列 ) :
    編碼 FGFR3 的核酸可以通過本領域中已知的多種方法制備。這些方法包括, 但不 限于, 通過 Engels 等 ., Agnew.Chem.Int.Ed.Engl., 28 : 716-734(1989) 中所述的任意方法
     化學合成, 所述方法諸如三酯、 亞磷酸酯、 亞磷酰胺和 H- 膦酸酯法。在一個實施方案中, 表 達宿主細胞優選的密碼子用于編碼 FGFR3 的 DNA 的設計中。備選地, 編碼 FGFR3 的 DNA 可 以從基因組或 cDNA 文庫中分離。
     在構建編碼 FGFR3 的 DNA 分子后, 該 DNA 分子可操作地連接至表達載體 ( 諸如質 粒 ) 中的表達控制序列, 其中所述控制序列被用該載體轉化的宿主細胞識別。通常, 質粒載 體包含復制和控制序列, 它們來源于與該宿主細胞相容的物種。 該載體通常攜帶復制位點, 以及編碼能夠在轉化的細胞中提供表型選擇的蛋白的序列。 用于在原核和真核宿主細胞中 表達的合適載體是本領域中公知的, 并且一些進一步在本文中描述。可以使用真核生物諸 如酵母, 或來源于多細胞生物體諸如哺乳動物的細胞。
     任選地, 編碼 FGFR3 的 DNA 可操作地連接至分泌前導序列, 導致表達產物被宿主細 胞分泌至培養基中。分泌前導序列的實例包括 stII, ecotin, lamB, 皰疹 GD, lpp, 堿性磷酸 酶, 轉化酶和 α 因子。還適合用于本文中的有蛋白 A 的 36 個氨基酸前導序列 (Abrahmsen 等 ., EMBO J., 4: 3901(1985))。
     宿主細胞用上述本發明的表達或克隆載體轉染和優選轉化, 并且在根據情況適當 改良的常規營養培養基中培養以誘導啟動子、 選擇轉化體, 或擴增編碼所需序列的基因。
     轉染是指由宿主細胞攝取表達載體, 無論是否實際表達任何編碼序列。大量的轉 染方法是普通技術人員所公知的, 例如, CaPO4 沉淀和電穿孔。通常當在宿主細胞中出現此 載體工作的任何指征時識別成功的轉染。轉染的方法在本領域中是公知, 并且在本文中進 一步描述其中的一些。
     轉化的含義是將 DNA 引入至生物體中使得 DNA 是可復制的, 或作為染色體外元件 或通過染色體整合體復制。取決于使用的宿主細胞, 使用適合于此類細胞的標準技術完成 轉化。轉化的方法在本領域中是公知, 并且在本文中進一步描述其中的一些。
     用來產生 FGFR3 的原核宿主細胞可以如通常在 Sambrook 等 ., 見上文中所述進行 培養。
     用來產生 FGFR3 的哺乳動物宿主細胞可以在多種培養基中培養, 所述培養基在本 領域中是公知的, 并且在本文中描述其中的一些。
     本公開中提及的宿主細胞涵蓋體外培養的細胞以及在宿主動物內的細胞。
     FGFR3 的純化可以使用本領域公認的方法來實現, 本文描述其中的一些。
     純化的 FGFR3 可以附著至合適的基質諸如瓊脂糖珠, 丙烯酰胺珠, 玻璃珠, 纖維 素, 各種丙烯酸共聚物, 甲基丙烯酸羥基酯凝膠, 聚丙烯酸和聚甲基丙烯酸共聚物, 尼龍, 中 性和離子載體, 等等, 從而用于噬菌體展示克隆的親合層析分離中。FGFR3 蛋白附著到基質 上可以通過 Methodsin Enzymology( 酶學方法 ), vol.44(1976) 中所述的方法來實現。普 遍被采用用于將蛋白配體附著于多糖基質 ( 例如, 瓊脂糖, 葡聚糖或纖維素 ) 的技術涉及用 鹵化氰活化載體, 隨后將肽配體的伯脂族或芳族胺與活化的基質偶聯。
     備選地, FGFR3 用于包被吸附板的孔, 并且在粘附于吸附板的宿主細胞上表達或用 于細胞分選, 或綴合于生物素從而用鏈霉抗生物素蛋白包被的珠進行捕獲, 或用在任何對 噬菌體展示文庫進行淘選的其它本領域公知的方法中。
     在適合將噬菌體顆粒的至少一部分與吸附劑結合的條件下, 將噬菌體文庫樣品與 固定的 FGFR3 接觸。在正常情況下, 選擇所述條件, 包括 pH, 離子強度, 溫度等來模擬生理條件。對結合于固相的噬菌體進行洗滌并且接著用酸洗脫, 例如如在 Barbas 等, 美國國家 科學院學報 (Proc.Natl.Acad.Sci USA), 88 : 7978-7982(1991) 中所述, 或用堿洗脫, 例如 如在 Marks 等, 分子生物學雜志 (J.Mol.Biol.), 222 : 581-597(1991) 中所述, 或通過 FGFR3 抗原競爭洗脫, 例如以類似于 Clackson 等, 自然 (Nature), 352 : 624-628(1991) 的抗原競爭 方法的方法進行。可以將噬菌體在單輪選擇中富集 20-1,000 倍。而且可以將富集的噬菌 體生長在細菌培養物中并且進行另幾輪的選擇。
     選擇的效率取決于許多因素, 包括在洗滌過程中解離的動力學, 以及在單個噬菌 體上的多種抗體片段是否可以同時與抗原結合 (engage)。可以通過使用短暫洗滌, 多價 噬菌體展示以及抗原在固相中的高度包被密度保持具有快速解離動力學 ( 以及弱的結 合親和性 ) 的抗體。高密度不僅通過多價相互作用穩定所述噬菌體, 而且有利于解離的 噬菌體的再次結合。可以通過使用長時間洗滌, 和如在 Bass 等, 蛋白質 (Proteins), 8: 309-314(1990) 和在 WO 92/09690 中所述的單價噬菌體展示, 以及在 Marks 等, 生物技術 (Biotechnol)., 10 : 779-783(1992) 中所述的低包被密度的抗原來促進對具有緩慢解離動 力學 ( 和良好結合親和性 ) 的抗體的選擇。
     可以在對于 FGFR3 具有不同親和性 ( 甚至具有稍稍不同的親和性 ) 的噬菌體抗體 之間進行選擇。然而, 選定的抗體的隨機突變 ( 例如, 如在上述親和力成熟技術中的一些中 進行的 ) 可能產生了許多突變體, 大部分與抗原結合, 并且其中一些具有更高的親和性。以 FGFR3 為限制條件, 只有極少的高親和性噬菌體可以競爭勝出。 為了保留所有的更高親和性 的突變體, 噬菌體可以用過量的生物素化的 FGFR3 溫育, 但是所述生物素化的 FGFR3 的濃度 低于關于 FGFR3 的靶摩爾親和性常數的摩爾濃度。接著, 所述高親和性結合的噬菌體被鏈 霉抗生物素蛋白包被的順磁珠 (paramagnetic beads) 捕獲。所述 “平衡捕獲” 允許抗體根 據它們的結合親和性進行選擇, 其敏感性允許從大量過量的具有較低親和性的噬菌體中分 離少至兩倍更高親和性的突變體克隆。 還可以對在洗滌結合于固相的噬菌體中所用的條件 進行操作以基于解離動力學進行區分。
     可以通過活性來選擇 FGFR3 克隆。在一個實施方案中, 本發明提供這樣的 FGFR3 抗體, 其阻斷 FGFR3 受體及其配體 ( 諸如 FGF1 和 / 或 FGF9) 之間的結合。可以通過下述來 選擇對應于所述 FGFR3 抗體的 Fv 克隆 : (1) 從如上所述的噬菌體文庫中分離 FGFR3 克隆, 并且任選地通過在適合的細菌宿主中增殖所述群體擴增分離的噬菌體克隆群體 ; (2) 選擇 針對其分別需要阻斷和不阻斷活性的 FGFR3 和第二蛋白 ; (3) 將抗 -FGFR3 噬菌體克隆吸附 于固定的 FGFR3 ; (4) 使用過量的第二蛋白洗脫任何識別這樣的 FGFR3- 結合決定簇的不需 要的克隆, 所述決定簇與第二蛋白的結合決定簇重疊或共享 ; 和 (5) 在步驟 (4) 之后, 洗脫 保持被吸附的克隆。任選地, 可以通過重復本文所述的選擇方法一次或多次來進一步富集 具有需要的封閉 / 不封閉性質的克隆。
     編碼本發明的雜交瘤來源的單克隆抗體或噬菌體展示 Fv 克隆的 DNA 容易使用常 規方法進行分離和測序 ( 例如通過使用設計用來特異性擴增來自雜交瘤或噬菌體 DNA 模 板的目的重鏈和輕鏈編碼區的寡核苷酸引物 )。一旦分離, 可以將所述 DNA 置于表達載體 中, 將其接著轉染到宿主細胞如大腸桿菌 (E.coli) 細胞中, 猿猴 COS 細胞中, 中國倉鼠卵巢 (CHO) 細胞中, 或不另外產生免疫球蛋白的骨髓瘤細胞中, 從而在重組宿主細胞中獲得需 要的單克隆抗體的合成。關于在細菌中重組表達編碼抗體的 DNA 的綜述文獻包括 Skerra等, 現代免疫學觀點 (Curr.Opinion inImmunol.), 5: 256(1993) 和 Pluckthun, 免疫學綜述 (Immunol.Revs), 130 : 151(1992)。
     可以將編碼本發明的 Fv 克隆的 DNA 與編碼重鏈和 / 或輕鏈恒定區的已知 DNA 序 列 ( 例如可以獲自 Kabat 等, 見上文的適合的 DNA 序列 ) 組合從而形成編碼全長或部分長 度的重鏈和 / 或輕鏈的克隆。 要理解的是, 任何同種型的恒定區可以用于該目的, 包括 IgG, IgM, IgA, IgD, 和 IgE 恒定區, 并且所述恒定區可以獲自任何人或動物物種。來自一種動物 ( 如人 ) 物種的可變結構域 DNA 的 Fv 克隆并接著與另一種動物物種的恒定區 DNA 融合從 而形成關于 “雜合” 全長重鏈和 / 或輕鏈的編碼序列, 這包含在本文所用的 “嵌合體” 和 “雜 合” 抗體的定義中。在優選實施方案中, 將衍生自人可變 DNA 的 Fv 克隆與人恒定區 DNA 融 合從而形成關于全部人的全長或部分長度的重鏈和 / 或輕鏈的編碼序列。
     例如, 還可以通過用人重鏈和輕鏈恒定結構域的編碼序列取代來自雜交瘤克隆 的同源鼠序列來修飾衍生自本發明的雜交瘤的編碼抗 -FGFR3 抗體的 DNA( 例如, 如在 Morrison 等, 美國國家科學院學報 (Proc.Natl.Acad.Sci.USA), 81 : 6851-6855(1984) 的方 法中 )。可以通過將免疫球蛋白編碼序列共價連接于非免疫球蛋白多肽的全部或部分編碼 序列來進一步修飾編碼雜交瘤或 Fv 克隆來源的抗體或片段的 DNA。以這種方式, 制備這樣 的 “嵌合” 或 “雜合” 抗體, 其具有本發明的 Fv 克隆或雜交瘤克隆衍生的抗體的結合特異性。
     抗體片段
     本發明涵蓋抗體片段。 在某些情形中, 存在使用抗體片段, 而不是使用完整抗體的 益處。更小的片段大小容許快速清除, 并且可以導致提高的對實體瘤的接近。
     已經開發了用于生成抗體片段的多種技術。傳統上, 通過蛋白水解消化完整 抗體來衍生這些片段 ( 參見例如 Morimoto 等, 生物化學和生物物理方法雜志 (Journal of Biochemical and Biophysical Methods)24 : 107-117(1992) ; 和 Brennan 等,科 學 (Science)229 : 81(1985))。然而, 現在可直接由重組宿主細胞生成這些片段。Fab, Fv 和 ScFv 抗體片段都可以在大腸桿菌中表達并且分泌, 由此導致容易產生大量的這些片段。可 從上文討論的抗體噬菌體文庫中分離抗體片段。或者, 可直接從大腸桿菌回收 Fab’ -SH 片 段 并 化 學 偶 聯 以 形 成 F(ab’ )2 片 段 (Carter 等, 生 物 / 技 術 (Bio/Technology)10 : 163-167(1992))。根據另一種方法, 可以直接從宿主細胞培養物中分離 F(ab’ )2 片段。包 含補救受體結合表位殘基具有增加的體內半衰期的 Fab 和 F(ab’ )2 片段在美國專利號 5,869,046 中描述。用于生成抗體片段的其它技術對于熟練從業人員將是顯而易見的。在 其他實施方案中, 選擇的抗體是單鏈 Fv 片段 (scFv)( 參見, 例如, WO93/16185 ; 美國專利號 5,571,894 及 5,587,458)。Fv 和 sFv 是具有完整結合位點、 缺少恒定區的唯一類型 ; 如此, 它們適于在體內使用時降低非特異性結合。可構建 sFv 融合蛋白以產生效應子蛋白質在 sFv 的氨基末端或羧基末端的融合。參見抗體改造 (Antibody Engineering), Borrebaeck 編, 見上文。抗體片段還可以是 “線性抗體” , 例如如美國專利號 5,641,870 中所記載的。此 類線性抗體片段可以是單特異性的或雙特異性的。
     人源化的抗體
     本發明涵蓋人源化抗體。在本領域中已知用于人源化非人抗體的各種方法。例 如, 人源化抗體可以具有一個或多個從非人來源引入的氨基酸殘基。這些非人氨基酸殘基 常常稱作 “輸入” 殘基, 它們典型的取自 “輸入” 可變結構域。人源化可基本上遵循 Winter及其同事的方法 (Jones 等, (1986) 自然 (Nature)321 : 522-525 ; Riechmann 等 (1988), 自 然 (Nature)332 : 323-327 ; Verhoeyen 等 (1988), 科學 (Science)239 : 1534-1536), 通過用 高變區序列取代相應的人抗體序列而進行。因而, 此類 “人源化” 抗體是嵌合抗體 ( 美國專 利號 4,816,567), 其中基本上少于完整的人可變結構域用來自非人物種的相應序列置換。 在實踐中, 人源化抗體典型的是其中一些高變區殘基和可能的一些 FR 殘基用來自嚙齒類 抗體中類似位點的殘基置換的人抗體。
     用于制備人源化抗體的人可變結構域 ( 輕鏈和重鏈二者 ) 的選擇對于降低抗原性 非常重要。依照所謂的 “最適” (best-fit) 方法, 針對已知的人可變結構域序列的整個文庫 篩選嚙齒類抗體的可變結構域序列。 然后接受與嚙齒類最接近的人序列作為人源化抗體的 人構架。(Sims 等 (1993), 免疫學雜志 (J.Immunol.)151 : 2296 ; Chothia 等 (1987), 分子生 物學雜志 (J.Mol.Biol.)196 : 901)。另一種方法使用由特定輕鏈或重鏈亞組的所有人抗體 的共有序列衍生的特定構架。同一構架可用于數種不同的人源化抗體 (Carter 等 (1992), 美國國家科學院學報 (Proc.Natl.Acad Sci.USA)89 : 4285 ; Presta 等 (1993), 免疫學雜志 (J.Immunol.)151 : 2623。
     更重要的是, 抗體在人源化后保持對抗原的高親和性及其它有利的生物學特性。 為了實現這一目標, 依照一種方法, 通過使用親本和人源化序列的三維模型分析親本序列 和各種概念性人源化產物的方法來制備人源化抗體。三維免疫球蛋白模型是公眾可獲得 的, 且為本領域技術人員所熟悉。可獲得圖解和顯示所選候選免疫球蛋白序列的可能三維 構象結構的計算機程序。 檢查這些顯示圖像容許分析殘基在候選免疫球蛋白序列的功能行 使中的可能作用, 即分析影響候選免疫球蛋白結合其抗原的能力的殘基。 以這種方式, 可從 接受體和輸入序列中選出 FR 殘基并進行組合, 從而獲得期望的抗體特征, 如對于靶抗原增 加的親和性。一般而言, 高變區殘基直接且最實質地參與影響對抗原的結合。
     人抗體
     本發明的人抗 -FGFR3 抗體可以通過組合選自人來源的噬菌體展示文庫的 Fv 克 隆可變結構域序列和如上所述的已知人恒定結構域序列構建。備選地, 本發明的人單克隆 抗 -FGFR3 抗體可以通過雜交瘤方法制備。用于產生人單克隆抗體的人骨髓瘤和小鼠 - 人 異骨髓瘤 (heteromyeloma) 細胞系已經在例如 Kozbor 免疫學雜志 (J.Immunol.), 133 : 3001(1984) ; Brodeur 等, 單克隆產生技術和應用 (Monoclonal Production Techniques andApplications), 第 51-63 頁 (Marcel Dekker, Inc., 紐約, 1987) ; 和 Boerner 等, 免疫學 雜志 (J.Immunol.), 147 : 86(1991) 中進行描述。
     現在有可能產生在缺乏內源免疫球蛋白生成的情況下能夠在免疫后生成人抗體 完整全集的轉基因動物 ( 例如小鼠 )。例如, 已經記載了嵌合和種系突變小鼠中抗體重鏈 連接區 (JH) 基因的純合缺失導致內源抗體生成的完全抑制。在此類種系突變小鼠中轉移 人種系免疫球蛋白基因陣列將導致在抗原攻擊后生成人抗體。參見例如 Jakobovits 等, 美 國 國 家 科 學 院 學 報 (Proc.Natl.Acad.Sci.USA)90 : 2551(1993) ; Jakobovits 等, 自然 (Nature)362 : 255(1993) ; Bruggermann 等, Year in Immunol., 7: 33(1993)。
     還可以將基因改組用于從非人, 例如嚙齒類動物抗體衍生人抗體, 其中人抗體具 有與起始的非人抗體相似的親和性和特異性。根據該方法, 其也稱為 “表位印刻 (epitope imprinting)” , 將通過如上所述的噬菌體展示技術獲得的非人抗體片段的重鏈或輕鏈可變區用人 V 結構域基因的所有組成部分取代, 產生非人鏈 / 人鏈 scFv 或 Fab 嵌合體的群體。 用抗原進行選擇導致非人鏈 / 人鏈嵌合 scFv 或 Fab 的分離, 其中人鏈恢復了在初級噬菌體 展示克隆中去除了相應的非人鏈之后被破壞的抗原結合位點, 即表位支配 ( 印刻 ) 人鏈配 偶體的選擇。當重復所述方法從而取代余下的非人鏈時, 獲得人抗體 ( 見在 1993 年 4 月 1 日公開的 PCT WO 93/06213)。不像通過 CDR 移植對非人抗體進行的傳統人源化, 這種技術 提供完整的人抗體, 其不具有非人來源的 FR 或 CDR 殘基。
     雙特異性抗體
     雙特異性抗體是對于至少兩種不同的抗原具有結合特異性的單克隆抗體, 優選是 人抗體或人源化抗體。在這種情況下, 一種結合特異性是關于 FGFR3 的, 而另一種是關于任 何其它抗原的。示例性的雙特異性抗體可以結合 FGFR3 的兩種不同的表位。還可以將雙特 異性抗體用于將細胞毒性藥劑定位到表達 FGFR3 的細胞。 這些抗體具有 FGFR3- 結合臂和結 合細胞毒性藥劑的臂 ( 所述細胞毒性藥劑例如, 肥皂草毒蛋白 (saporin)、 抗 - 干擾素 -α、 長春花生物堿、 蓖麻毒蛋白 A 鏈、 甲氨蝶呤或放射性同位素半抗原 )。可以將雙特異性抗體 制備為全長抗體或抗體片段 ( 例如, F(ab′ )2 雙特異性抗體 )。
     用于生成雙特異性抗體的方法是本領域已知的。傳統上, 雙特異性抗體的重組生 產基于兩對免疫球蛋白重鏈 - 輕鏈的共表達, 其中兩條重鏈具有不同的特異性 (Milstein 和 Cuello, 自然 (Nature)305 : 537(1983))。由于免疫球蛋白重鏈和輕鏈的隨機分配, 這些 雜交瘤 ( 四源雜交瘤 (quadroma)) 生成 10 種不同抗體分子的潛在混合物, 其中只有 - 種具 有正確的雙特異性結構。 通常通過親和層析步驟進行的正確分子的純化相當麻煩且產物產 量低。類似的方法披露于在 1993 年 5 月 13 日公開的 WO 93/08829 及 Traunecker 等, EMBO J.10 : 3655(1991)。
     依照一種不同且更優選的方法, 將具有期望的結合特異性 ( 抗體 - 抗原結合位點 ) 的抗體可變結構域與免疫球蛋白恒定結構域序列融合。融合體優選具有包含至少部分鉸 鏈、 CH2 和 CH3 區的免疫球蛋白重鏈恒定結構域。優選在至少一種融合體中存在包含輕鏈 結合所必需的位點的第一重鏈恒定區 (CH1)。將編碼免疫球蛋白重鏈融合物和需要時的編 碼免疫球蛋白輕鏈的 DNA 插入分開的表達載體, 并共轉染入合適的宿主生物體。在用于構 建的三種多肽鏈比例不等時提供最佳產量的實施方案中, 這為調整三種多肽片段的相互比 例提供了很大的靈活性。然而, 在至少兩種多肽鏈以相同比例表達導致高產量時或在該比 例沒有特別意義時, 有可能將兩種或所有三種多肽鏈的編碼序列插入一個表達載體中。
     在該方法的一個優選實施方案中, 雙特異性抗體由一個臂上具有第一結合特異性 的雜合免疫球蛋白重鏈, 和另一個臂上的雜合免疫球蛋白重鏈 - 輕鏈對 ( 提供第二結合特 異性 ) 構成。由于免疫球蛋白輕鏈僅在半個雙特異性分子中的存在提供了便利的分離途 徑, 因此發現這種不對稱結構便于將想要的雙特異性化合物與不想要的免疫球蛋白鏈組合 分開。該方法披露于 WO 94/04690。關于生成雙特異性抗體的進一步詳情參見例如 Suresh 等, 酶學方法 (Methods in Enzymology)121 : 210(1986)。
     依照另一種方法, 可改造一對抗體分子間的界面, 以將從重組細胞培養物回收的 異二聚體的百分比最大化。該優選界面包含抗體恒定結構域的至少部分 CH3 結構域。在該 方法中, 將第一抗體分子界面的一個或多個小氨基酸側鏈用較大側鏈 ( 例如酪氨酸或色氨 酸 ) 置換。通過將大氨基酸側鏈用較小氨基酸側鏈 ( 例如丙氨酸或蘇氨酸 ) 置換, 在第二抗體分子的界面上產生與大側鏈大小相同或相似的補償性 “空腔” 。 這提供了較之其它不想 要的終產物 ( 諸如同二聚體 ) 提高異二聚體產量的機制。
     雙特異性抗體包括交聯的或 “異源綴合的” 抗體。例如, 在異源綴合抗體中的一種 抗體可以與抗生物素蛋白偶聯, 另一種抗體可以與生物素偶聯。所述抗體已經例如被提議 靶向免疫系統細胞到不想要的細胞 ( 美國專利號 4,676,980), 并且用于治療 HIV 感染 (WO 91/00360, WO 92/00373, 和 EP 03089)。可以使用任何便利的交聯方法制備異源綴合抗體。 適合的交聯試劑是本領域中公知的, 并且連同許多交聯技術在美國專利號 4,676,980 中公 開。
     文獻中還記載了由抗體片段生成雙特異性抗體的技術。例如, 可使用化學連接來 制備雙特異性抗體。Brennan 等, 科學 (Science)229 : 81(1985) 記載了通過蛋白水解切割 完整抗體以生成 F(ab’ )2 片段的方法。將這些片段在存在二硫醇絡合劑亞砷酸鈉時還原, 以穩定鄰近的二硫醇并防止分子間二硫鍵的形成。然后將產生的 Fab’ 片段轉變為硫代硝 基苯甲酸酯 (TNB) 衍生物。然后將 Fab’ -TNB 衍生物之一通過巰基乙胺的還原重新恢復成 Fab’ - 硫醇, 并與等摩爾量的另一種 Fab’ -TNB 衍生物混合, 以形成雙特異性抗體。產生的 雙特異性抗體可用作酶的選擇性固定化試劑。
     最新的進展便于從大腸桿菌直接回收 Fab’ -SH 片段, 這些片段可化學偶聯以形成 雙特異性抗體。Shalaby 等, J.Exp.Med.( 實驗醫學雜志 )175 : 217-225(1992) 記載了完全 人源化的雙特異性抗體 F(ab’ )2 分子的生成。由大腸桿菌分別分泌每種 Fab’ 片段, 并在體 外進行定向化學偶聯以形成雙特異性抗體。 如此形成的雙特異性抗體能夠結合過表達 HER2 受體的細胞和正常人 T 細胞, 以及觸發人細胞毒性淋巴細胞針對人乳瘤靶標的裂解活性。
     還記載了從重組細胞培養物直接生成和分離雙特異性抗體片段的多種技術。例 如, 已使用亮氨酸拉鏈生成雙特異性抗體。Kostelny 等, 免疫學雜志 (J.Immunol.)148(5) : 1547-1553(1992)。將來自 Fos 和 Jun 蛋白的亮氨酸拉鏈肽通過基因融合與兩種不同抗體 的 Fab’ 部分連接。抗體同型二聚體在鉸鏈區還原以形成單體, 然后重新氧化以形成抗體 異二聚體。這種方法也可用于生成抗體同型二聚體。Hollinger 等, 美國國家科學院學報 (Proc.Natl.Acad.Sci.USA)90 : 6444-6448(1993) 記載的 “雙抗體” 技術提供了生成雙特異 性抗體片段的替代機制。該片段包含通過接頭相連的重鏈可變結構域 (VH) 和輕鏈可變結 構域 (VL), 所述接頭太短使得同一條鏈上的兩個結構域之間不能配對。 因而, 迫使一個片段 上的 VH 和 VL 結構域與另一個片段上的互補 VL 和 VH 結構域配對, 由此形成兩個抗原結合 位點。還報道了通過使用單鏈 Fv(sFv) 二聚體生成雙特異性抗體片段的另一種策略。參見 Gruber 等, 免疫學雜志 (J.Immunol.), 152 : 5368(1994)。
     涵蓋具有超過二價的抗體。例如, 可制備三特異性抗體。Tutt 等, 免疫學雜志 (J.Immunol.)147 : 60(1991)。
     多價抗體
     多價抗體可以比二價抗體更快的受到表達該抗體所結合抗原的細胞的內在化 ( 和 / 或異化 (catabolized))。本發明的抗體可以是可容易的通過重組表達編碼抗體多肽 鏈的核酸而生成的、 具有三個或更多抗原結合位點 ( 例如四價抗體 ) 的多價抗體 ( 除 IgM 類 別以外的 )。多價抗體可包含二聚化結構域和三個或更多抗原結合位點。優選的二聚化結 構域包含 ( 或由其組成 )Fc 區或鉸鏈區。在這種情況中, 抗體將包含 Fc 區及 Fe 區氨基末端的三個或更多抗原結合位點。本文優選的多價抗體包含 ( 或由其組成 ) 三個至約八個, 但優選四個抗原結合位點。 多價抗體包含至少一條多肽鏈 ( 和優選兩條多肽鏈 ), 其中所述 多肽鏈包含兩個或更多可變結構域。例如, 多肽鏈可包含 VD1-(X1)n-VD2-(X2)n-Fc, 其中 VD1 是第一可變結構域, VD2 是第二可變結構域, Fc 是 Fc 區的一條多肽鏈, X1 和 X2 代表氨 基酸或多肽, 而 n 是 0 或 1。例如, 多肽鏈可包含 : VH-CH1- 柔性接頭 -VH-CH1-Fc 區鏈 ; 或 VH-CH1-VH-CH1-Fc 區鏈。 本文中的多價抗體優選進一步包含至少兩條 ( 和優選四條 ) 輕鏈 可變結構域多肽。本文中的多價抗體可包含例如約兩條至約八條輕鏈可變結構域多肽。本 文涵蓋的輕鏈可變結構域多肽包含輕鏈可變結構域, 且任選進一步包含 CL 結構域。
     抗體變體
     在一些實施方案中, 預期本文所述的抗體的氨基酸序列修飾。 例如, 可能需要提高 抗體的結合親合力和 / 或其它生物學性質。通過將適合的核苷酸變化引入抗體核酸, 或通 過肽合成來制備抗體的氨基酸序列變體。所述修飾包括, 例如在抗體的氨基酸序列中缺失 殘基和 / 或插入殘基, 和 / 或置換殘基。進行缺失、 插入和置換的任何組合從而得到最終的 構建體, 條件是最終的構建體具有需要的特征。 在制備該序列時, 可以將氨基酸改變引入目 標抗體氨基酸序列。
     用于鑒定對于突變發生是優選位置的抗體的某些殘基或區域的有用方法被稱為 “丙氨酸分區誘變法 (alanine scanning mutagenesis)” , 如 Cunningham 和 Wells(1989) 科 學 (Science), 244 : 1081-1085 所述。在此處, 鑒定了一種殘基或一組靶殘基 ( 例如帶電荷 的殘基如 arg, asp, his, lys, 和 glu), 并且用中性或帶負電荷氨基酸 ( 最優選丙氨酸或聚 丙氨酸 ) 置換從而影響氨基酸與抗原的相互作用。然后, 通過在置換位點或關于置換位點 引入另外的或其它變體來精選顯示對置換的功能敏感性的那些氨基酸位置。因此, 當預先 確定引入氨基酸序列變化的位點時, 突變本身的性質不需要被預先確定。 例如, 為了分析在 給定位點的突變的性能, 在靶密碼子或靶區進行丙氨酸分區誘變或隨機誘變并且關于需要 的活性篩選表達的免疫球蛋白。
     氨基酸序列插入包括氨基和 / 或羧基端融合, 長度范圍在 1 個殘基到包含一百個 以上殘基的多肽, 以及單一氨基酸殘基或多個氨基酸殘基的序列內插入。末端插入的實例 包括具有 N- 端甲硫氨酰殘基的抗體或與細胞毒性多肽融合的抗體。抗體分子的其它插入 變體包括抗體的 N 端或 C 端與增加抗體的血清半衰期的酶 ( 例如, 關于 ADEPT) 或多肽的融 合。
     多肽的糖基化典型地是 N- 連接或 O- 連接的。N- 連接指糖結構部分與天冬酰胺 殘基的側鏈的連接。其中 X 是除了脯氨酸之外的任何氨基酸的三肽序列天冬酰胺 -X- 絲氨 酸和天冬酰胺 -X- 蘇氨酸, 是關于將糖結構部分酶促連接于天冬酰胺側鏈的識別序列。因 此, 在多肽中這些三肽序列中任一個的存在產生潛在的糖基化位點。O- 連接的糖基化指將 糖 N- 乙酰基半乳糖胺、 半乳糖或木糖之一連接于羥基氨基酸, 最常見連接于絲氨酸或蘇氨 酸, 盡管也可以使用 5- 羥基脯氨酸或 5- 羥基賴氨酸。
     常規情況下, 在抗體上加入糖基化位點通過改變氨基酸序列完成, 使得其包含一 個或多個上述三肽序列 ( 關于 N- 連接的糖基化位點 )。 還可以通過將一個或多個絲氨酸或 蘇氨酸殘基加入至起始抗體序列或通過置換一個或多個絲氨酸或蘇氨酸殘基來進行所述 改變 ( 對于 O- 連接的糖基化位點 )。如果抗體包含 Fc 區, 那么可以改變其連接的糖。例如, 在美國專利申請號 US 2003/0157108(Presta, L.) 中記述了具有成熟的糖結構的抗體, 其缺少連接在抗體 Fc 區 上的巖藻糖。還參見 US 2004/0093621(KyowaHakko Kogyo Co., Ltd)。在連接到抗體 Fc 區上的糖中具有平分型 N- 乙酰葡糖胺 (N-acetylglucosamine)(GlcNAc) 的抗體參見 WO 2003/011878, Jean-Mairet 等和美國專利號 6,602,684, Umana 等。WO 1997/30087, Patel 等報道了在連接到抗體 Fc 區上的寡糖中具有至少一個半乳糖殘基的抗體。還參見 WO 1998/58964(Raju, S.) 和 WO 1999/22764(Raju, S.), 其關于具有連接到抗體 Fc 區上的改變 的糖的抗體。 還參見 US 2005/0123546(Umana 等 ), 其關于具有改變的糖基化的抗原結合分 子。
     本文優選的糖基化變體包含 Fc 區, 其中與 Fc 區連接的糖結構缺少巖藻糖。這樣 的變體具有改善的 ADCC 功能。任選地, Fc 區中進一步包含一個或多個氨基酸置換, 所述 置換進一步改善 ADCC, 例如, Fc 區的位置 298, 333, 和 / 或 334 處 ( 殘基的 Eu 編號 ) 的置 換。涉及 “脫巖藻糖基化” 或 “缺少巖藻糖的” 抗體的公開物的實例包括 : US 2003/0157108 ; WO2000/61739 ; WO 2001/29246 ; US 2003/0115614 ; US 2002/0164328 ; US2004/0093621 ; US 2004/0132140 ; US 2004/0110704 ; US 2004/0110282 ; US2004/0109865 ; WO 2003/085119 ; WO 2003/084570 ; WO 2005/035586 ; WO2005/035778 ; WO2005/053742 ; Okazaki 等 .J.Mol. Biol.( 分子生物學雜志 )336 : 1239-1249(2004) ; Yamane-Ohnuki 等 .Biotech.Bioeng.( 生 物技術和生物工程 )87 : 614(2004)。產生脫巖藻糖基化抗體的細胞系的實例包括蛋白質 巖藻糖基化缺陷的 Lec13CHO 細胞 (Ripka 等 .Arch.Biochem.Biophys.( 生物化學和生物 物理學集刊 )249 : 533-545(1986) ; 美國專利申請號 US2003/0157108A1, Presta, L; 和 WO 2004/056312A1, Adams 等 ., 特別是實施例 11), 和敲除的細胞系, 諸如 α-1, 6- 巖藻糖基轉 移酶基因 FUT8 敲除的 CHO 細胞 (Yamane-Ohnuki 等 .Biotech.Bioeng.( 生物技術和生物工 程 )87 : 614(2004))。
     另一種類型的變體是氨基酸置換變體。 這些變體在抗體分子中具有被不同的殘基 置換的至少一個氨基酸 ( 至少兩個, 至少三個, 至少 4 個以上 ) 殘基。用于置換誘變的最感 興趣的位點包括高變區, 但是也預期 FR 改變。保守性置換在 “優選的置換” 的標題下在表 1 中顯示。如果這樣的置換導致生物活性的改變, 則可以引入在表 1 中稱為 “示例性置換” 或 在下面參照氨基酸類別進一步描述的更多實質性的改變, 并篩選產物。
     表1
    抗體的生物學性質中的實質性修飾通過選擇這樣的置換來進行, 所述置換在它們 對下列的作用方面有顯著差異 : (a) 保持在置換區域中的多肽主鏈的結構, 例如, 作為折疊 或螺旋構象, (b) 保持在靶位點處的分子的電荷或疏水性, 或 (c) 保持側鏈的體積。將天然 存在的殘基基于常見的側鏈性質分為數組 :
     (1) 疏水性 : 正亮氨酸, met, ala, val, leu, ile ;
     (2) 中性親水性 : Cys, Ser, Thr, Asn, Gln ;
     (3) 酸性 : asp, glu ;
     (4) 堿性 : his, lys, arg ;
     (5) 影響鏈取向的殘基 : gly, pro ; 和
     (6) 芳族的 : trp, tyr, phe。
     非保守性置換需要將這些類別中之一的成員交換為另一類。
     一種類型的置換變體包括置換親本抗體 ( 例如人源化或人抗體 ) 的一個或多個高 變區殘基。一般地, 關于進一步發展所選擇的得到的一種或多種變體相對于它們產生自其 中的親本抗體具有提高的生物學性質。 一種產生這樣的置換變體的便利方式涉及使用噬菌 體展示的親和力成熟。 簡言之, 對一些高變區位點 ( 例如, 6-7 個位點 ) 突變從而在每個位點 產生所有可能的氨基酸置換。由此產生的抗體作為在每個顆粒中包裝的與 M13 的基因 III 產物的融合體而由絲狀噬菌體顆粒展示。 接著如本文公開的那樣篩選噬菌體展示的變體的 生物學活性 ( 例如, 結合親合力 )。為了鑒定用于修飾的候選高變區位點, 可以進行丙氨酸 分區誘變從而鑒定對抗原結合有顯著貢獻的高變區殘基。備選地, 或另外地, 分析抗原 - 抗 體復合體的晶體結構從而鑒定抗體和抗原之間的接觸點可以是有益的。 根據本文闡述的技 術, 所述接觸殘基和鄰近殘基是用于置換的候選物, 包括在本文中闡釋的那些。 一旦產生了 所述變體, 該組變體如本文所述進行篩選, 并且可以選擇在一個或多個相關測定法中具有 較佳性質的抗體用于進一步開發。
     編碼抗體的氨基酸序列變體的核酸分子通過本領域已知的多種方法進行制備。 這 些方法包括, 但不限于 : 從自然來源分離 ( 在天然存在的氨基酸變體的情形中 ) 或通過早期 制備的抗體的變體或非變體形式的寡核苷酸 - 介導 ( 或位點定向 ) 的誘變, PCR 誘變, 和盒 誘變進行制備。
     可能需要將一個或多個氨基酸修飾引入本發明的免疫球蛋白多肽的 Fc 區, 由此 產生 Fc 區變體。所述 Fc 區變體可以包含這樣的人 Fc 區序列 ( 例如人 IgG1, IgG2, IgG3 或 IgG4Fc 區 ), 所述 Fc 區序列在一個或多個氨基酸位置包含氨基酸修飾 ( 例如置換 ), 包含鉸 鏈半胱氨酸的氨基酸修飾。
     根據該說明書以及本領域的教導, 預期在一些實施方案中, 在本發明的方法中使 用的抗體與野生型對應體抗體比較可以包含一個或多個改變, 例如在 Fc 區中包含一個或 多個改變。然而, 這些抗體仍舊基本保留與它們的野生型對應體相同的治療應用所需要 的特征。例如, 認為可以在 Fc 區中進行某些改變, 所述改變將導致改變的 ( 即, 提高的或 減少的 )C1q 結合和 / 或補體依賴性細胞毒性 (CDC), 例如如在 WO 99/51642 中所述。還 見 Duncan & Winter, 自然 (Nature)322 : 738-40(1988) ; 美國專利號 5,648,260 ; 美國專 利號 5,624,821 ; 和 WO94/29351, 其涉及 Fc 區變體的其它實例。WO00/42072(Presta) 和 WO 2004/056312(Lowman) 描述了具有提高的或減少的與 FcRs 結合的抗體變體。這些專 利出版物的內容特別通過引用結合在本文中。還見, Shields 等, 生物化學雜志 (J.Biol. Chem.)9(2) : 6591-6604(2001)。 在 US2005/0014934A1(Hinton 等 ) 中 描 述 了 具 有 增 加 的半衰期并且對于新生兒 Fc 受體 (FcRn) 具有提高的結合的抗體, 其負責將母體 IgGs 轉 移 給 胎 兒 (Guyer 等, 免 疫 學 雜 志 (J.Immunol)117 : 587(1976) 和 Kim 等, 免疫學雜志 (J.Immunol.)24 : 249(1994))。這些抗體包含在其中具有一個或多個置換的 Fc 區, 所述 置換提高 Fc 區與 FcRn 的結合。在美國專利號 6,194,551B1, WO99/51642 中描述了具有 改變的 Fc 區氨基酸序列和增加的或減少的 C1q 結合能力的多肽變體。將這些專利出版物的內容特別通過引用結合在本文。還見, Idusogie 等, 免疫學雜志 (J.Immunol.)164 : 4178-4184(2000)。
     抗體衍生物
     可以對本發明的抗體進一步修飾以包含本領域已知并且容易獲得的另外的非蛋 白質性的結構部分。優選地, 適合抗體的衍生作用的結構部分是水溶性聚合物。水溶性聚 合物的非限制性實例包括, 但不限于 : 聚乙二醇 (PEG), 乙二醇 / 丙二醇的共聚物, 羧甲基纖 維素, 葡聚糖, 聚乙烯醇, 聚乙烯吡咯烷酮, 聚 -1, 3- 二氧戊環, 聚 -1, 3, 6- 三噁烷, 乙烯 / 馬 來酸酐共聚物, 聚氨基酸 ( 同聚物或隨機共聚物 ), 和葡聚糖或聚 (n- 乙烯基吡咯烷酮 ) 聚 乙二醇, 丙二醇同聚物, 聚環氧丙烷 / 氧化乙烯共聚物, 聚氧乙基化的多元醇 ( 例如甘油 ), 聚乙烯醇, 及其混合物。由于其在水中的穩定性, 聚乙二醇丙醛可以在生產中具有優勢。聚 合物可以具有任何分子量, 并且可以是分支或不分支的。與抗體連接的聚合物的數目可以 變化, 并且如果連接多于一個聚合物, 它們可以是相同或不同的分子。一般地, 用于衍生化 的聚合物的數目和 / 或類型可以基于這樣的考慮來確定, 所述考慮包括, 但不限于, 待提高 的抗體的具體性質或功能, 抗體衍生物是否將在限定的條件下用于治療中等。
     篩選具有所需性質的抗體
     本發明的抗體可以通過本領域中已知的多種測定法 ( 它們中的一些公開在本文 中 ) 來表征它們的物理 / 化學性質和生物學功能。在一些實施方案中, 抗體關于下列中的 任一種或多種進行表征 : FGF( 諸如 FGF1 和 / 或 FGF9) 結合的減少或阻斷, FGFR3 激活的減 少或阻斷, FGFR3 下游分子信號傳導的減少或阻斷, FGFR3 與配體 ( 例如, FGF1, FGF9) 結合 的破壞或阻斷, FGFR3 二聚作用的減少或阻斷, 促進單體 FGFR3 的形成, 與單體 FGFR3 的結 合, 和 / 或治療和 / 或預防腫瘤、 細胞增生性病癥或癌癥 ; 和 / 或治療或預防與 FGFR3 表達 和 / 或活性 ( 諸如增加的 FGFR3 表達和 / 或活性 ) 相關的病癥的。在一些實施方案中, 對 抗體篩選增加的 FGFR3 激活, 增加的 FGFR3 下游分子信號傳導, 凋亡活性, FGFR3 下調, 和效 應子功能 ( 例如, ADCC 活性 )。
     純化的抗體可以進一步通過一系列測定進行表征, 所述測定包括, 但不限于, N- 末 端測序, 氨基酸分析, 非變性尺寸排阻高壓液相色譜法 (HPLC), 質譜法, 離子交換色譜法和 木瓜蛋白酶消化。
     在本發明的某些實施方案中, 分析本文制備的抗體的生物學活性。在一些實施方 案中, 測試本發明的抗體的抗原結合活性。本領域已知的且可以在本文中使用的抗原結合 測定法包括但不限于任何直接的或競爭性的結合測定法, 所述測定法使用諸如 western 印 跡, 放射免疫測定, ELISA( 酶聯免疫吸附測定 ), “夾心” 免疫測定, 免疫沉淀測定, 熒光免疫 測定和蛋白 A 免疫測定的技術。示例性的抗原結合和其他測定在下面的實施例章節中提 供。
     如果需要抑制細胞生長的抗 -FGFR3 抗體, 則候選抗體可以在體外和 / 或體內 測定中測試, 所述測定測量對細胞生長的抑制。如果需要促進或不促進凋亡的抗 -FGFR3 抗體, 則候選抗體可以在測量凋亡的測定中測試。用于檢驗癌細胞生長和 / 或增殖的 方法, 或測定癌細胞的凋亡的方法在本領域中是公知的, 并且一些在本文中描述和例 證。用于測定細胞生長和 / 或增殖和 / 或凋亡的示例性方法包括, 例如, BrdU 摻入測 定, MTT, [3H]- 胸苷摻入 ( 例如, TopCount 測定 (PerkinElmer)), 細胞活力測定 ( 例如,CellTiter-Glo(Promega)), DNA 片段化測定, 胱天蛋白酶 (caspase) 激活測定, 臺盼藍拒染 (tryptan blue exclusion), 染色質形態測定等等。
     在一個實施方案中, 本發明設想了具有效應子功能的抗體。 在某些實施方案中, 測 量的抗體的 Fc 活性。可以進行體外和 / 或體內細胞毒性測定法從而證實 CDC 和 / 或 ADCC 活性的減少 / 消除。例如, 可以進行 Fc 受體 (FcR) 結合測定法從而確保抗體缺乏 FcγR 結 合 ( 因此可能缺乏 ADCC 活性 ), 但是保留 FcRn 結合能力。用于介導 ADCC 的主要細胞, 即 NK 細胞僅表達 FcγRIII, 而單核細胞表達 FcγRI, FcγRII 和 FcγRIII。在 Ravetch 和 Kinet, Annu.Rev.Immunol.9 : 457-92(1991) 的第 464 頁上的表 3 中總結在造血細胞上的 FcR 表達。 評估目的分子的 ADCC 活性的體外測定法的實例描述在美國專利號 5,500,362 或 5,821,337 中。在本文中也舉例說明了一種檢測 ADCC 活性的測定。用于所述測定法的有用 效應細胞包括外周血單核細胞 (PBMC) 和天然殺傷 (NK) 細胞。備選地或另外地, 目的分子 的 ADCC 活性可以在體內評估, 例如在諸如 Clynes 等 PNAS(USA)95 : 652-656(1998) 中公開 的動物模型中評估。還可以進行 C1q 結合測定法從而證實抗體不能結合 C1q 并且因此缺乏 CDC 活性。為了評估補體激活, 可以進行 CDC 測定法, 例如, 如在 Gazzano-Santoro 等, 免疫 學方法雜志 (J.Immunol.Methods)202 : 163(1996) 中所述。 還可以使用本領域已知的方法, 例如, 實施例章節中所述的那些方法, 進行 FcRn 結合和體內清除 / 半衰期測定。
     如果需要結合單體 FGFR3 的抗 -FGFR3 抗體, 則候選抗體可以在測量與單體 FGFR3 的結合和促進單體 FGFR3 形成的測定 ( 諸如體外測定 ) 中測試。此類測定在本領域中是已 知的, 并且在本文中描述和舉例說明一些測定。
     如果需要抑制 FGFR3 二聚作用的抗 -FGFR3 抗體, 則候選抗體可以在二聚作用測定 中測試, 例如, 所述測定如本文所述和例證。
     在一些實施方案中, 測定候選抗體的 FGFR3 激動劑功能。用于評估 FGFR3 抗體的 激動劑功能或活性的方法在本領域中是已知的, 并且一些也在本文中描述和例證。
     在一些實施方案中, 測定 FGFR3 抗體促進 FGFR3 受體下調的能力, 例如, 使用本文 描述和例證的方法進行。在一個實施方案中, FGFR3 抗體與合適的測試細胞, 例如, 膀胱癌 細胞系 ( 例如, RT112) 溫育, 并且在合適的時間段后, 收獲細胞裂解物, 并檢驗總 FGFR3 水 平。FACS 分析也可以用來檢驗與候選 FGFR3 抗體溫育后的表面 FGFR3 受體水平。
     載體、 宿主細胞和重組方法
     為了重組產生本發明的抗體, 分離編碼它的核酸, 并將其插入可復制載體, 用于進 一步克隆 (DNA 擴增 ) 或表達。可使用常規流程容易地分離并測序編碼抗體的 DNA( 如使用 能夠與編碼抗體重鏈和輕鏈的基因特異結合的寡核苷酸探針 )。可利用許多載體。載體的 選擇部分取決于將要使用的宿主細胞。通常, 優選的宿主細胞是原核或真核 ( 通常是哺乳 動物 ) 來源的。要理解的是任何同種型的恒定區可以用于此目的, 包括 IgG, IgM, IgA, IgD, 和 IgE 恒定區, 并且這樣的恒定區可以獲自任何人或動物物種。
     a. 使用原核宿主細胞產生抗體 :
     i. 載體構建
     可使用標準重組技術來獲得編碼本發明抗體的多肽成分的多核苷酸序列。 可從抗 體生成細胞諸如雜交瘤細胞分離期望的多核苷酸序列并測序。或者, 可使用核苷酸合成儀 或 PCR 技術合成多核苷酸。一旦得到, 將編碼多肽的序列插入能夠在原核宿主中復制并表達異源多核苷酸的重組載體。為了本發明的目的, 可使用本領域可獲得的且已知的許多載 體。 適宜載體的選擇將主要取決于將要插入載體的核酸的大小和將要用該載體轉化的具體 宿主細胞。根據其功能 ( 擴增或表達異源多核苷酸, 或二者兼之 ) 及其與它在其中駐留的 具體宿主細胞的相容性, 每種載體含有多種構件。載體構件通常包括但不限于 : 復制起點、 選擇標志基因、 啟動子、 核糖體結合位點 (RBS)、 信號序列、 異源核酸插入片段、 和轉錄終止 序列。
     一般而言, 與宿主細胞一起使用的質粒載體包含衍生自與這些宿主細胞相容的物 種的復制子和控制序列。載體通常攜帶復制位點, 以及能夠在轉化細胞中提供表型選擇的 標志序列。例如, 通常用衍生自大腸桿菌物種的質粒 pBR322 轉化大腸桿菌。pBR322 包含 編碼氨芐青霉素 (Amp) 和四環素 (Tet) 抗性的基因, 由此提供輕松鑒定轉化細胞的手段。 pBR322、 其衍生物、 或其它微生物質粒或噬菌體還可包含或經修飾而包含可被微生物生物 體用于表達內源蛋白質的啟動子。Carter 等人, 美國專利號 5,648,237 中詳細記載了用于 表達特定抗體的 pBR322 衍生物的實例。
     另外, 可將包含與宿主微生物相容的復制子和控制序列的噬菌體載體用作這些宿 主的轉化載體。例如, 可使用噬菌體諸如 λGEM.TM.-11 來構建可用于轉化易感宿主細胞 ( 諸如大腸桿菌 LE392) 的重組載體。
     本發明的表達載體可包含兩種或多種啟動子 - 順反子對, 它們編碼每一種多肽成 分。啟動子是位于順反子上游 (5′ ) 的非翻譯調控序列, 它調控順反子的表達。原核啟動 子通常分成兩類, 誘導型的和組成型的。誘導型啟動子指響應培養條件的變化 ( 如營養物 的存在與否或溫度變化 ) 而啟動受其控制的順反子的升高水平轉錄的啟動子。
     眾所周知受到多種潛在宿主細胞識別的大量啟動子。通過限制酶消化切下源 DNA 中的啟動子并將分離的啟動子序列插入本發明的載體, 由此可將選擇的啟動子與編碼輕鏈 或重鏈的順反子 DNA 可操作性連接。天然啟動子序列和許多異源啟動子都可用于指導靶基 因的擴增和 / 或表達。在有些實施方案中, 使用異源啟動子, 因為與天然靶多肽啟動子相 比, 它們通常容許所表達的靶基因的更高轉錄和更高產量。
     適用于原核宿主的啟動子包括 PhoA 啟動子、 β- 半乳糖苷酶 (β-galactamase) 和 乳糖啟動子系統、 色氨酸 (trp) 啟動子系統、 和雜合啟動子諸如 tac 或 trc 啟動子。 然而, 在 細菌中有功能的其它啟動子 ( 諸如其它已知的細菌或噬菌體啟動子 ) 也是合適的。它們的 核苷酸序列已經發表, 由此熟練工作人員能夠使用提供任何所需限制位點的接頭或銜接頭 將它們與編碼靶輕鏈和重鏈的順反子可操作性連接 (Siebenlist 等 (1980)Cell( 細胞 )20 : 269)。
     在本發明的一個方面, 重組載體內的每個順反子都包含指導所表達的多肽穿膜轉 運的分泌信號序列構件。 一般而言, 信號序列可以是載體的構件, 或者它可以是插入載體的 靶多肽 DNA 的一部分。為了本發明而選擇的信號序列應當是受到宿主細胞識別并加工 ( 即 被信號肽酶切除 ) 的信號序列。對于不識別并加工異源多肽的天然信號序列的原核宿主細 胞, 將信號序列用選自例如由下列各項組成的組的原核信號序列替代 : 堿性磷酸酶、 青霉素 酶、 Ipp、 或熱穩定的腸毒素 II(STII) 前導序列、 LamB、 PhoE、 PelB、 OmpA 和 MBP。在本發明的 一個實施方案中, 表達系統的兩個順反子中都使用的信號序列是 STII 信號序列或其變體。
     在另一方面, 依照本發明的免疫球蛋白的生成可在宿主細胞的細胞質中發生, 因此不需要在每個順反子內存在分泌信號序列。在那一點上, 免疫球蛋白輕鏈和重鏈在細 胞質內表達、 折疊和裝配而形成功能性免疫球蛋白。某些宿主菌株 ( 如大腸桿菌 trxB- 菌 株 ) 提供有利于二硫鍵形成的細胞質條件, 從而容許所表達蛋白質亞基的正確折疊和裝 配。Proba 和 Pluckthun Gene( 基因 ), 159 : 203(1995)。
     適于表達本發明抗體的原核宿主細胞包括古細菌 (Archaebacteria) 和真細菌 (Eubacteria), 諸如革蘭氏陰性或革蘭氏陽性生物體。有用細菌的實例包括埃希氏菌屬 (Escherichia)( 如大腸埃希氏菌 (E.coli))、 芽孢桿菌屬 (Bacilli)( 如枯草芽孢桿菌 (B.subtilis))、 腸桿菌屬 (Enterobacteria)、 假單胞菌屬物種 (Pseudomonas species) ( 如銅綠假單胞菌 (P.aeruginosa))、 鼠傷寒沙門氏菌 (Salmonella typhimurium)、 粘質 沙雷氏菌 (Serratia marcescans)、 克雷伯氏菌屬 (Klebsiella)、 變形菌屬 (Proteus)、 志賀氏菌屬 (Shigella)、 根瘤菌屬 (Rhizobia)、 透明顫菌屬 (Vitreoscilla) 或副球菌屬 (Paracoccus)。在一個實施方案中, 使用革蘭氏陰性細胞。在一個實施方案中, 使用大腸桿 菌細胞作為本發明的宿主。大腸桿菌菌株的實例包括菌株 W3110(Bachmann, Cellular and Molecular Biology( 細胞和分子生物學 ), vol.2(Washington, D.C. : American Society for Microbiology( 美國微生物學學會 ), 1987), 第 1190-1219 頁 ; ATCC 保藏號 27,325) 及其衍生物, 包括菌株 33D3, 其具有基因型 W3110 ΔfhuA(ΔtonA)ptr3 lac Iq lacL8 ΔompTΔ(nmpc-fepE)degP41 kanR( 美國專利號 5,639,635)。其它菌株及其衍生物, 諸 如大腸桿菌 294(ATCC 31,446)、 大腸桿菌 B、 大腸桿菌 λ1776(ATCC 31,537) 和大腸桿菌 RV308(ATCC 31,608) 也是合適的。 這些實例只是例示而非限制。 本領域已知用于構建具有 指定基因型的任何上述細菌衍生物的方法, 并且描述在例如 Bass 等, Proteins( 蛋白質 ), 8: 309-314(1990) 中。通常必需考慮復制子在細菌細胞中的可復制性來選擇適當的細菌。 例如, 在使用眾所周知的質粒諸如 pBR322、 pBR325、 pACYC177 或 pKN410 來提供復制子時, 大 腸桿菌、 沙雷氏菌屬 (Serratia)、 或沙門氏菌屬 (Salmonella) 物種可適當的用作宿主。通 常, 宿主細胞應當分泌最小量的蛋白水解酶, 而且可能希望在細胞培養中摻入額外的蛋白 酶抑制劑。
     ii 抗體產生
     用上述表達載體轉化宿主細胞, 并在為了誘導啟動子、 選擇轉化子或擴增編碼期 望序列的基因而適當改良的常規營養培養基中進行培養。
     轉化意即將 DNA 導入原核宿主, 使得 DNA 能夠進行復制, 或是作為染色體外元件或 是通過染色體整合進行。 根據所用的宿主細胞, 使用適于這些細胞的標準技術進行轉化。 采 用氯化鈣的鈣處理通常用于具有堅固細胞壁屏障的細菌細胞。 另一種轉化方法采用聚乙二 醇 /DMSO。使用的另一種技術是電穿孔。
     在本領域已知的且適于培養選定的宿主細胞的培養基中生長用于生成本發明 多肽的原核細胞。合適培養基的實例包括添加了必需營養補充物的 LB 培養基 (Luria broth)。 在有些實施方案中, 培養基還含有根據表達載體的構建而選擇的選擇劑, 以選擇性 容許包含所述表達載體的原核細胞生長。例如, 向用于培養表達氨芐青霉素抗性基因的細 胞的培養基中添加氨芐青霉素。
     除了碳、 氮和無機磷酸鹽來源以外, 還可含有適當濃度的任何必需補充物, 或是單 獨加入或是作為與另一種補充物或培養基的混合物, 諸如復合氮源。 任選的是, 培養基可含有一種或多種選自下組的還原劑 : 谷胱甘肽、 半胱氨酸、 胱胺 (cystamine)、 巰基乙酸鹽 / 酯 (thioglycollate)、 二硫赤蘚糖醇 (dithioerythritol) 和二硫蘇糖醇。
     在合適的溫度培養原核宿主細胞。例如, 對于培養大腸桿菌, 優選溫度范圍為約 20℃至約 39℃、 更優選約 25℃至約 37℃、 甚至更優選約 30℃。主要取決于宿主生物體, 培 養基的 pH 可以是范圍為約 5 至約 9 的任何 pH。對于大腸桿菌, pH 優選約 6.8 至約 7.4, 更 優選約 7.0。
     如果本發明的表達載體中使用誘導型啟動子, 那么在適于激活啟動子的條件下 誘導蛋白質表達。在本發明的一個方面, 使用 PhoA 啟動子來控制多肽的轉錄。因此, 為 了誘導, 在磷酸鹽限制培養基中培養經過轉化的宿主細胞。優選地, 磷酸鹽限制培養基是 C.R.A.P 培養基 ( 參見, 例如, Simmons 等, J.Immunol.Methods( 免疫學方法雜志 )(2002), 263 : 133-147)。根據所采用的載體構建體, 可采用多種其它誘導物, 正如本領域所知道的。
     在一個實施方案中, 所表達的本發明的多肽分泌到宿主細胞的周質中并從中回 收。蛋白質回收通常涉及破壞微生物, 通常通過諸如滲透壓休克、 超聲處理或裂解等手段。 一旦細胞遭到破壞, 可通過離心或過濾清除細胞碎片或整個細胞。可以通過例如親和樹脂 層析進一步純化蛋白質。或者, 蛋白質可能被轉運到培養液中并從中分離。可從培養液清 除細胞, 并且可以將培養物上清液過濾和濃縮, 用于進一步純化所生成的蛋白質。 可使用普 遍已知的方法諸如聚丙烯酰胺凝膠電泳 (PAGE) 和 Western 印跡測定來進一步分離和鑒定 所表達的多肽。
     在本發明的一個方面, 通過發酵過程大量進行抗體生產。多種大規模補料 - 分 批發酵流程可用于生產重組蛋白。大規模發酵具有至少 1000 升的容量, 優選約 1,000 至 100,000 升的容量。 這些發酵罐使用攪拌器葉輪來分配氧和養分, 尤其是葡萄糖 ( 優選的碳 源 / 能源 )。 小規模發酵通常指在體積容量不超過約 100 升的發酵罐中進行的發酵, 范圍可 以是約 1 升至約 100 升。
     在 發 酵 過 程 中, 通 常 在 將 細 胞 在 合 適 條 件 下 培 養 至 期 望 密 度 ( 如 OD550 約 180-220, 在此階段細胞處于早期穩定期 ) 后啟動蛋白質表達的誘導。根據所采用的載體構 建體, 可使用多種誘導物, 正如本領域知道的和上文描述的。 可在誘導前將細胞培養較短的 時間。通常將細胞誘導約 12-50 小時, 但是可使用更長或更短的誘導時間。
     為了提高本發明多肽的產量和質量, 可以修改多項發酵條件。例如, 為了改 善所分泌抗體多肽的正確裝配和折疊, 可使用過度表達伴侶蛋白諸如 Dsb 蛋白 (DsbA, DsbB, DsbC, DsbD 和 / 或 DsbG) 或 FkpA( 具有伴侶活性的一種肽基脯氨酸順反異構酶 ) 的另外的載體來共轉化宿主原核細胞。已經證明伴侶蛋白促進在細菌宿主細胞中生成 的異源蛋白質的正確折疊和溶解度。Chen 等 (1999)J.Bio.Chem.( 生物化學雜志 )274 : 19601-19605 ; Georgiou 等, 美國專利號 6,083,715 ; Georgiou 等, 美國專利號 6,027,888 ; Bothmann 和 Pluckthun(2000)J.Biol.Chem.( 生 物 化 學 雜 志 )275 : 17100-17105 ; Ramm 和 Pluckthun(2000)J.Biol.Chem.( 生物化學雜志 )275 : 17106-17113 ; Arie 等, (2001)Mol. Microbiol.( 分子微生物學 )39 : 199-210。
     為了將所表達異源蛋白質 ( 尤其是對蛋白水解敏感的異源蛋白質 ) 的蛋白水解降 至最低, 可將蛋白水解酶缺陷的某些宿主菌株用于本發明。例如, 可修飾宿主細胞菌株, 在 編碼已知細菌蛋白酶的基因中進行遺傳突變, 所述細菌蛋白酶諸如蛋白酶 III, OmpT, DegP,Tsp, 蛋白酶 I, 蛋白酶 Mi, 蛋白酶 V, 蛋白酶 VI, 及其組合。可以獲得一些大腸桿菌蛋白酶缺 陷型菌株, 例如, 在 Joly 等 (1998), 見上文 ; Georgiou 等, 美國專利號 5,264,365 ; Georgiou 等, 美國專利號 5,508,192 ; Hara 等, Microbial Drug Resistance( 微生物耐藥性 ), 2: 63-72(1996) 中所述。
     在一個實施方案中, 使用蛋白水解酶缺陷且用過表達一種或多種伴侶蛋白的質粒 轉化的大腸桿菌菌株作為在本發明的表達系統中的宿主細胞。
     iii. 抗體純化
     可采用本領域已知的標準蛋白質純化方法。下面的流程是合適純化流程的例示 : 免疫親和或離子交換柱上的分級、 乙醇沉淀、 反相 HPLC、 硅土或陽離子交換樹脂諸如 DEAE 上的層析、 層析聚焦、 SDS-PAGE、 硫酸銨沉淀、 和使用例如 Sephadex G-75 的凝膠過濾。
     在一個方面, 將固定在固相上的蛋白 A 用于本發明全長抗體產物的免疫親和純 化。蛋白 A 是來自金黃色葡萄球菌 (Staphylococcus aureas) 的 41kD 細胞壁蛋白質, 它 以高親合力結合抗體 Fc 區。Lindmark 等 (1983)J.Immunol.Meth.( 免疫學方法雜志 )62 : 1-13。蛋白 A 固定其上的固相優選是具有玻璃或硅石表面的柱子, 更優選是可控孔徑玻璃 柱或硅酸柱。在有些應用中, 柱子以諸如甘油等試劑包被, 試圖防止污染物的非特異粘附。
     作為純化的第一個步驟, 來源于如上所述的細胞培養物的制劑應用到固定有蛋白 A 的固相上從而允許目的抗體與蛋白 A 的特異性結合。然后清洗固相以清除與固相非特異 結合的污染物。最后通過洗脫從固相回收目的抗體。
     b. 使用真核宿主細胞產生抗體 :
     載體構件通常包括但不限于如下一種或多種 : 信號序列、 復制起點、 一種或多種標 志基因、 增強子元件、 啟動子、 轉錄終止序列。
     (i) 信號序列構件
     在真核宿主細胞中使用的載體還可以包含信號序列或在成熟的目的蛋白質或多 肽的 N 端處具有特異切割位點的其它多肽。優選選擇的異源信號序列是受到宿主細胞識別 并加工 ( 即被信號肽酶切除 ) 的異源信號序列。在哺乳動物細胞表達中, 可利用哺乳動物 信號序列以及病毒分泌前導序列, 例如單純皰疹病毒 gD 信號。
     將這些前體區的 DNA 連接到編碼抗體的 DNA 的閱讀框中。
     (ii) 復制起點
     通常, 哺乳動物表達載體不需要復制起始點構件。例如, 典型地可以使用 SV40 起 點, 這只是因為其包含早期啟動子。
     (iii) 選擇基因構件
     表達和克隆載體可包含選擇基因, 也稱為可選擇標志。典型的選擇基因編碼如下 蛋白質 : (a) 賦予對抗生素或其它毒素的抗性, 如氨芐青霉素、 新霉素、 甲氨蝶呤或四環素 ; (b) 在相關時, 補充營養缺陷性缺陷 ; 或 (c) 提供不能從復合培養基獲得的關鍵營養物。
     選擇方案的一個實例利用藥物來阻滯宿主細胞的生長。 經異源基因成功轉化的那 些細胞生成賦予藥物抗性的蛋白質, 因而幸免于選擇方案。此類顯性選擇的實例使用藥物 新霉素、 霉酚酸 (mycophenolic acid) 和潮霉素。
     適于哺乳動物細胞的選擇標志的另一個實例是能夠鑒定有能力攝取抗體核酸的 細胞的選擇標志, 諸如 DHFR、 胸苷激酶、 金屬硫蛋白 I 和 II, 優選靈長類金屬硫蛋白基因、 腺苷脫氨酶、 鳥氨酸脫羧酶等。
     例如, 首先通過將所有轉化子在含有甲氨蝶呤 (Mtx, DHFR 的一種競爭性拮抗劑 ) 的培養基中進行培養來鑒定經 DHFR 選擇基因轉化的細胞。在采用野生型 DHFR 時, 適宜的 宿主細胞是 DHFR 活性缺陷的中國倉鼠卵巢 (CHO) 細胞系 ( 例如 ATCC CRL-9096)。
     或者, 可通過在含有針對選擇標志的選擇劑諸如氨基糖苷抗生素 ( 如卡那霉素、 新霉素或 G418) 的培養基中培養細胞來選擇用編碼抗體、 野生型 DHFR 蛋白、 和另一種選擇 標志 ( 諸如氨基糖苷 3′ - 磷酸轉移酶 (APH)) 的 DNA 序列轉化或共轉化的宿主細胞 ( 特別 是包含內源 DHFR 的野生型宿主 )。參見美國專利號 4,965,199。
     (iv) 啟動子構件
     表達和克隆載體通常包含受到宿主生物體識別的啟動子, 且與抗體多肽核酸可操 作連接。 用于真核細胞的啟動子序列是已知的。 事實上, 所有真核基因都具有富含 AT 區, 它 位于起始轉錄的位點上游約 25 至 30 個堿基處。在許多基因的轉錄起點上游 70 至 80 個堿 基處發現的另一種序列是 CNCAAT 區, 其中 N 可以是任何核苷酸。在大多數真核基因的 3′ 端是 AATAAA 序列, 它可能是向編碼序列的 3′端添加聚腺苷酸 (polyA) 尾的信號。所有這 些序列合適地插入至真核表達載體中。
     在哺乳動物宿主細胞中由載體轉錄抗體多肽受到例如從病毒 ( 諸如多瘤病毒、 禽 痘病毒、 腺病毒 ( 諸如 2 型腺病毒 )、 牛乳頭瘤病毒、 禽類肉瘤病毒、 巨細胞病毒、 逆轉錄病 毒、 乙肝病毒、 和猿猴病毒 40(SV40)) 基因組獲得的啟動子、 來自異源哺乳動物啟動子 ( 如 肌動蛋白啟動子或免疫球蛋白啟動子 )、 來自熱休克啟動子的啟動子的控制, 條件是這些啟 動子與宿主細胞系統相容。
     方便的以 SV40 限制性片段的形式獲得 SV40 病毒的早期和晚期啟動子, 該片段還 包含 SV40 病毒復制起點。方便的以 HindIII E 限制性片段的形式獲得人巨細胞病毒的即 時早期啟動子。美國專利號 4,419,446 中公開了使用牛乳頭瘤病毒作為載體在哺乳動物宿 主中表達 DNA 的系統。美國專利號 4,601,978 中記載了該系統的修改。備選地, 可使用勞 氏肉瘤病毒長末端重復作為啟動子。
     (v) 增強子元件構件
     常常通過在載體中插入增強子序列來提高高等真核生物對編碼本發明抗體多肽 的 DNA 的轉錄。現在已知來自哺乳動物基因 ( 球蛋白、 彈性蛋白酶、 白蛋白、 α- 胎蛋白和 胰島素 ) 的許多增強子序列。然而, 通常使用來自真核細胞病毒的增強子。實例包括 SV40 復制起點晚期側的增強子 (bp100-270)、 巨細胞病毒早期啟動子增強子、 多瘤病毒復制起 點晚期側的增強子、 和腺病毒增強子。關于激活真核啟動子的增強元件還可參見 Yaniv, Nature( 自然 )297 : 17-18(1982)。增強子可剪接到載體中, 位于抗體多肽編碼序列的 5′ 或 3′位置, 但是優選位于啟動子的 5′位點。
     (vi) 轉錄終止構件
     典型地, 在真核宿主細胞中使用的表達載體還包含終止轉錄和穩定 mRNA 所必需 的序列。此類序列通常可從真核或病毒 DNA 或 cDNA 的非翻譯區的 5′端和偶爾的 3′端獲 得。這些區域包含在編碼抗體的 mRNA 的非翻譯區中轉錄成聚腺苷酸化片段的核苷酸區段。 一種有用的轉錄終止構件是牛生長激素聚腺苷酸化區。參見 WO94/11026 及其中公開的表 達載體。(vii) 宿主細胞的選擇和轉化
     適于克隆或表達本文載體中的 DNA 的宿主細胞包括本文描述的高等真核細 胞, 包括脊椎動物宿主細胞。脊椎動物細胞在培養 ( 組織培養 ) 中的繁殖已經成為常 規流程。有用的哺乳動物宿主細胞系的實例有經 SV40 轉化的猴腎 CV1 系 (COS-7, ATCC CRL 1651) ; 人 胚 腎 系 (293 細 胞 或 為 懸 浮 培 養 生 長 而 亞 克 隆 的 293 細 胞, Graham 等, J.Gen.Virol.( 遺傳病毒學雜志 )36 : 59(1977)) ; 幼倉鼠腎細胞 (BHK, ATCC CCL 10) ; 中 國 倉 鼠 卵 巢 細 胞 /-DHFR(CHO, Urlaub 等, Proc.Natl.Acad.Sci.USA( 美 國 國 家 科 學 院 學 報 )77 : 4216(1980)) ; 小 鼠 塞 托 利 (sertoli) 細 胞 (TM4, Mather, Biol.Reprod.23 : 243-251(1980)) ; 猴腎細胞 (CV1, ATCC CCL 70) ; 非洲綠猴腎細胞 (VERO-76, ATCC CRL 1587) ; 人宮頸癌細胞 (HELA, ATCC CCL 2) ; 犬腎細胞 (MDCK, ATCC CCL 34) ; 布法羅鼠 (buffalo rat) 肝細胞 (BRL 3A, ATCC CRL 1442) ; 人肺細胞 (W138, ATCC CCL 75) ; 人肝細 胞 (Hep G2, HB 8065) ; 小鼠乳瘤 (MMT 060562, ATCC CCL 51) ; TRI 細胞 (Mather 等, Annals N.Y.Acad.Sci.383 : 44-68(1982)) ; MRC 5 細 胞 ; FS4 細 胞 ; 和 人 肝 細 胞 瘤 (hepatoma) 系 (Hep G2)。
     為了生成抗體, 用上文所述表達載體或克隆載體轉化宿主細胞, 并在為了誘導啟 動子、 選擇轉化子或擴增編碼期望序列的基因而適當改良的常規營養培養基中進行培養。
     (viii) 宿主細胞的培養
     可在多種培養基中培養用于生成本發明抗體的宿主細胞。商品化培養基諸如 Ham’ s F10(Sigma)、 極限必需培養基 ((MEM), Sigma)、 RPMI-1640(Sigma)、 和 Dulbecco 改 良 Eagle 培養基 ((DMEM), Sigma) 適于培養宿主細胞。另外, 可使用下列文獻中記載的任 何培養基作為宿主細胞的培養基 : Ham 等, Meth.Enz.( 酶學方法 )58 : 44(1979), Barnes 等, Anal.Biochem.( 分析生物化學 )102 : 255(1980), 美國專利號 4,767,704 ; 4,657,866 ; 4,927,762 ; 4,560,655 ; 或 5,122,469 ; WO 90/03430 ; WO 87/00195 ; 或美國再頒專利 30,985。任何這些培養基可根據需要補充激素和 / 或其它生長因子 ( 諸如胰島素、 運鐵蛋 白或表皮生長因子 )、 鹽 ( 諸如氯化鈉、 鈣、 鎂和磷酸鹽 )、 緩沖劑 ( 諸如 HEPES)、 核苷酸 ( 諸 TM 如腺苷和胸苷 )、 抗生素 ( 諸如 GENTAMYCIN 藥物 )、 痕量元素 ( 定義為通常以微摩爾范圍 的終濃度存在的無機化合物 )、 和葡萄糖或等效能源。 還可以適宜濃度含有本領域技術人員 已知的任何其它必需補充物。培養條件諸如溫度、 pH 等即為表達而選擇的宿主細胞先前所 用的培養條件, 這對于普通技術人員是顯而易見的。
     (ix) 抗體的純化
     在使用重組技術時, 抗體可在細胞內生成, 或者直接分泌到培養基中。如果在細 胞內生成抗體, 那么首先需要通過例如離心或超濾清除微粒碎片, 即宿主細胞或裂解片 段。如果抗體分泌到培養基中, 那么通常首先使用商品化蛋白質濃縮濾器 ( 例如 Amicon 或 Millipore Pellicon 超濾部件 ) 濃縮來自這些表達系統的上清液。 可在任何上述步驟中包 括蛋白酶抑制劑諸如 PMSF 以抑制蛋白水解, 而且可包括抗生素以防止外來污染物的生長。
     可使用例如羥磷灰石層析、 凝膠電泳、 透析和親和層析來純化從細胞制備的抗體 組合物, 親和層析是優選的純化技術。蛋白 A 作為親和配體的適宜性取決于抗體中存在的 任何免疫球蛋白 Fc 結構域的種類和同種型。蛋白 A 可用于純化基于人 γ1、 γ2 或 γ4 重 鏈的抗體 (Lindmark 等, J.Immunol.Meth.( 免疫學方法雜志 )62 : 1-13(1983))。蛋白 G 推薦用于所有小鼠同種型和人 γ3(Guss 等, EMBO J.5 : 15671575(1986))。親和配體所附著 的基質最常用的是瓊脂糖, 但是可使用其它基質。物理穩定的基質諸如可控孔徑玻璃或聚 ( 苯乙烯二乙烯基 ) 苯能獲得比瓊脂糖更快的流速和更短的處理時間。若抗體包含 CH3 結 構域, 則可使用 Bakerbond ABXTM 樹脂 (J.T.Baker, Phillipsburg, NJ) 進行純化。根據待回 收的抗體, 也可使用其它蛋白質純化技術諸如離子交換柱上的分級、 乙醇沉淀、 反相 HPLC、 TM 硅土上的層析、 肝素 SEPHAROSE 上的層析、 陰離子或陽離子交換樹脂 ( 諸如聚天冬氨酸柱 ) 上的層析、 層析聚焦、 SDS-PAGE 和硫酸銨沉淀。
     在任何初步純化步驟之后, 可將含有目的抗體和污染物的混合物進行低 pH 疏水 相互作用層析, 使用 pH 約 2.5-4.5 的洗脫緩沖液, 優選在低鹽濃度 ( 例如約 0-0.25M 鹽 ) 進行。
     免疫綴合物
     本發明還提供免疫綴合物 ( 可互換地稱為 “抗體 - 藥物綴合物” 或 “ADC” ), 其包含 與細胞毒性劑綴合的本文所述的任一種抗 FGFR3 抗體, 所述細胞毒性劑諸如化療劑、 藥物、 生長抑制劑、 毒素 ( 例如細菌、 真菌、 植物或動物來源的酶活性毒素或其片段 ) 或放射性同 位素 ( 即放射綴合物 )。
     在癌癥治療中, 用于局部遞送細胞毒性劑或細胞生長抑制劑 ( 即殺死或抑制腫 瘤 細 胞 的 藥 物 ) 的 抗 體 - 藥 物 綴 合 物 的 使 用 (Syrigos 和 Epenetos(1999)Anticancer Researchy( 抗 癌 研 究 )19 : 605-614 ; Niculescu-Duvaz andSpringer(1997)Adv.Drg. Del.Rev.26 : 151-172 ; 美 國 專 利 號 4,975,278) 允 許 將 藥 物 部 分 靶 向 遞 送 至 腫 瘤, 并 在其中細胞內積累, 而這些未經綴合的藥劑的全身施用可導致對正常細胞以及試圖消 除 的 腫 瘤 細 胞 的 不 可 接 受 的 毒 性 水 平 (Baldwin 等, (1986)Lancet( 柳 葉 刀 )pp.(1986 年 3 月 15 日 ) : 603-05 ; Thorpe, (1985)“Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents InCancer Therapy : AReview( 腫瘤治療中細胞毒性劑的抗體載體 : 綜述 ), ” 在 Monoclonal Antibodies ′ 84 : Biological And Clinical Applications( 單克隆抗體′ 84 : 生物學 和臨床應用 ), A.Pinchera 等編輯, 第 475-506 頁中 )。由此尋求最大功效且具有最小 毒性。多克隆抗體和單克隆抗體皆有報道可用于這些策略 (Rowland 等, (1986)Cancer Immunol.Immunother.( 癌癥免疫學和免疫療法 ), 21 : 183-87)。這些方法中所使用的藥 物包括道諾霉素 (daunomycin)、 多柔比星 (doxorubicin)、 甲氨蝶呤 (methotrexate) 和 長 春 地 辛 (vindesine)(Rowland 等, 1986, 見 上 文 )。 抗 體 - 毒 素 綴 合 物 中 所 使 用 的 毒 素包括細菌毒素諸如白喉毒素、 植物毒素諸如蓖麻毒蛋白、 小分子毒素諸如格爾德霉素 (geldanamycin)(Mandler 等 (2000)Jour.of the Nat.CancerInst.( 國家癌癥研究所雜 志 )92(19) : 1573-1581 ; Mandler 等, (2000)Bioorganic&Med.Chem.Letters( 生 物 有 機 和醫學化學通訊 )10 : 1025-1028 ; Mandler 等, (2002)Bioconjugate Chem.( 生物綴合化 學 )13 : 786-791), 美登木素生物堿類 (maytansinoids)(EP 1391213 ; Liu 等, (1996)Proc. Natl.Acad.Sci.USA( 美國科學院學報 )93 : 8618-8623), 和加利車霉素 (calicheamicin) (Lode 等, (1998)Cancer Res.( 癌癥研究 )58 : 2928 ; Hinman 等, (1993)Cancer Res.( 癌癥 研究 )53 : 3336-3342)。毒素可通過包括微管蛋白結合、 DNA 結合或拓撲異構酶抑制的機制 影響其細胞毒性和細胞生長抑制作用。 有些細胞毒性藥物在與大的抗體或蛋白質受體配體 綴合時趨于失活或活性降低。( 替 伊 莫 單 抗 (ibritumomab tiuxetan), Biogen/Idec) 是 由 針 對在正常和惡性 B 淋巴細胞表面上發現的 CD20 抗原的鼠 IgG1κ 單克隆抗體與通過硫 脲接頭 - 螯合劑所結合的 111In 或 90Y 放射性同位素構成的抗體 - 放射性同位素綴合物 (Wiseman 等, (2000)Eur.Jour.Nucl.Med.27(7) : 766-77 ; Wiseman 等, (2002)Blood( 血 液 )99(12) : 4336-42 ; Witzig 等, (2002)J.Clin.Oncol.( 臨 床 腫 瘤 學 雜 志 )20(10) : 2453-63 ; Witzig 等, (2002)J.Clin.Oncol.( 臨 床 腫 瘤 學 雜 志 )20(15) : 3262-69)。 盡 管 ZEVALIN 具有針對 B 細胞非霍奇金淋巴瘤 (NHL) 的活性, 然而施藥在大多數患者中導致嚴 TM 重且長時間的血細胞減少。MYLOTARG ( 吉妥珠單抗奧佐米星 (gemtuzumab ozogamicin), Wyeth Pharmaceuticals), 即由 hu CD33 抗體與加利車霉素連接而構成的抗體 - 藥物綴 合物, 在 2000 年批準用于經注射治療急性骨髓性白血病 (Drugs of the Future( 未來 藥 物 )(2000)25(7) : 686 ; 美 國 專 利 號 4,970,198 ; 5,079,233 ; 5,585,089 ; 5,606,040 ; 5,6937,62 ; 5,739,116 ; 5,767,285 ; 5,773,001)。美坎珠單抗 (Cantuzumab mertansine) (Immunogen, Inc.), 即由 huC242 抗體經二硫化物接頭 SPP 與美登木素生物堿類藥物結構 部分 DM1 連接而構成的抗體藥物綴合物, 正在進行用于治療表達 CanAg 的癌癥諸如結腸 癌、 胰腺癌、 胃癌和其它癌的 II 期試驗。MLN-2704(Millennium Pharm., BZL Biologics, Immunogen Inc.), 即由抗前列腺特異性膜抗原 (PSMA) 單克隆抗體與美登木素生物堿類藥 物結構部分 DM1 連接而構成的抗體藥物綴合物, 正在進行用于前列腺腫瘤潛在治療的開 發。將多拉司他汀 (dolastatin) 的合成類似物 auristatin 肽, 即 auristatin E(AE) 和單 甲基 auristatin(MMAE) 與嵌合單克隆抗體 cBR96( 對癌上的 Lewis Y 特異 ) 和 cAC10( 對 惡性血液腫瘤上的 CD30 特異 ) 綴合 (Doronina 等, (2003)Nature Biotechnology.( 自然 生物技術 )21(7) : 778-784), 且正在進行治療性開發。
     本文 ( 例如上文 ) 描述了可用于生成此類免疫綴合物的化療劑。可使用的酶活 性毒素及其片段包括白喉毒素 A 鏈、 白喉毒素的非結合活性片段、 外毒素 A 鏈 ( 來自銅綠 假單胞菌 (Pseudomonas aeruginosa))、 蓖麻毒蛋白 (ricin)A 鏈、 相思豆毒蛋白 (abrin)A 鏈、 蒴蓮根毒蛋白 (modeccin)A 鏈、 α- 帚曲霉素 (α-sarcin)、 油桐 (Aleutites fordii) 蛋白、 香石竹毒蛋白 (dianthinprotein)、 美洲商陸 (Phytolaca americana) 蛋白 (PAPI、 PAPII 和 PAP-S)、 苦瓜 (Momordica charantia) 抑制劑、 麻瘋樹毒蛋白 (curcin)、 巴豆毒蛋 白 (crotin)、 肥皂草 (sapaonaria officinalis) 抑制劑、 白樹毒蛋白 (gelonin)、 絲林霉素 (mitogellin)、 局限曲菌素 (restrictocin)、 酚霉素 (phenomycin)、 依諾霉素 (enomycin) 和單端孢菌素 (trichothecenes)。參見例如 1993 年 10 月 28 日公開的 WO 93/21232。多種 131 131 90 放射性核素可用于生成放射綴合抗體。實例包括 212Bi、 I、 In、 Y、 和 186Re。抗體和細胞 毒性劑的綴合物可使用多種雙官能蛋白質偶聯劑來制備, 諸如 N- 琥珀酰亞胺基 -3-(2- 吡 啶基二硫代 ) 丙酸酯 (SPDP)、 亞氨基硫烷 (iminothiolane)(IT)、 亞氨酸酯的雙官能衍生 物 ( 諸如二甲基己二亞酰胺鹽酸化物 (dimethyl adipimidate HCl))、 活性酯類 ( 諸如辛 二酸二琥珀酰亞胺基酯 )、 醛類 ( 諸如戊二醛 )、 雙疊氮化合物 ( 諸如雙 ( 對 - 疊氮苯甲酰 基 ) 己二胺 )、 雙重氮衍生物 ( 諸如雙 ( 對 - 重氮苯甲酰基 ) 己二胺 )、 二異氰酸酯 ( 諸如 甲苯 2, 6- 二異氰酸酯 )、 和雙活性氟化合物 ( 諸如 1, 5- 二氟 -2, 4- 二硝基苯 )。例如, 可 如 Vitetta 等, Science( 科學 )238 : 1098(1987) 中所述制備蓖麻毒蛋白免疫毒素。碳 -14 標記的 1- 異硫氰酸苯甲基 -3- 甲基二亞乙基三胺五乙酸 (MX-DTPA) 是用于將放射性核苷酸與抗體綴合的例示性螯合劑。參見 WO 94/11026。
     本文還設想了抗體與一種或多種小分子毒素諸如加利車霉素 (calicheamicin)、 美登木素生物堿類 (maytansinoids)、 多拉司他汀 (dolastatins)、 aurostatins、 單端孢霉 素 (trichothecene) 和 CC1065 及這些毒素具有毒素活性的片段的綴合物。
     i. 美登素 (Maytansine) 和美登木素生物堿類
     在一些實施方案中, 免疫綴合物包含與一個或多個美登木素生物堿類分子綴合的 本發明的抗體 ( 全長或片段 )。
     美登木素生物堿類是通過抑制微管蛋白多聚化來發揮作用的有絲分裂抑制 劑。美登素最初從東非灌木齒葉美登木 (Maytenus serrata) 分離得到 ( 美國專利號 3,896,111)。隨后發現某些微生物也生成美登木素生物堿類, 諸如美登醇和 C-3 美登醇酯 ( 美國專利號 4,151,042)。例如下列美國專利公開了合成的美登醇及其衍生物和類似物 : Nos.4,137,230 ; 4,248,870 ; 4,256,746 ; 4,260,608 ; 4,265,814 ; 4,294,757 ; 4,307,016 ; 4,308,268 ; 4,308,269 ; 4,309,428 ; 4,313,946 ; 4,315,929 ; 4,317,821 ; 4,322,348 ; 4,331,598 ; 4,361,650 ; 4,364,866 ; 4,424,219 ; 4,450,254 ; 4,362,663 ; 和 4,371,533。
     在抗體藥物綴合物中, 美登木素生物堿類藥物結構部分是有吸引力的藥物結構部 分, 因為它們 : (i) 相對易于通過發酵或化學修飾、 從發酵產物衍生而制備, (ii) 易于用適 于通過非二硫化物接頭綴合至抗體的官能團衍生化, (iii) 在血漿中穩定, 和 (iv) 針對多 種腫瘤細胞系有效。
     已經公開了含有美登木素生物堿類的免疫綴合物、 其制備方法及其治療用途, 例 如, 公開在美國專利 Nos.5,208,020, 5,416,064 及歐洲專利 EP0425235B1 中, 明確將其公 開內容通過引用并入本文。Liu 等, Proc.Natl.Acad.Sci.USA( 美國國家科學院學報 )93 : 8618-8623(1996) 記載了包含與針對人結腸直腸癌的單克隆抗體 C242 連接的稱為 DM1 的 美登木素生物堿類的免疫綴合物。發現該綴合物具有針對培養的結腸癌細胞的高度細胞 毒性, 而且在體內腫瘤生長測定法中顯示抗腫瘤活性。Chari 等, CancerResearch( 癌癥研 究 )52 : 127-131(1992) 記載了其中美登木素生物堿類經二硫化物接頭與結合人結腸癌細 胞系上抗原的鼠抗體 A7 或結合 HER-2/neu 癌基因的另一種鼠單克隆抗體 TA.1 綴合的免疫 綴合物。在體外在人乳癌細胞系 SK-BR-3 上測試了 TA.1- 美登木素生物堿類綴合物的細胞 毒性, 該細胞系每個細胞表達 3x105 個 HER-2 表面抗原。 藥物綴合物達到了與游離美登木素 生物堿類藥物相似的一定程度的細胞毒性, 這可通過增加每個抗體分子綴合的美登木素生 物堿類分子數目來提高。A7- 美登木素生物堿類綴合物在小鼠中顯示低系統性細胞毒性。
     抗體 - 美登木素生物堿類綴合物可通過將抗體與美登木素生物堿類分子化學連 接且不顯著削弱抗體或美登木素生物堿類分子的生物學活性來制備。參見例如, 美國專 利 No.5,208,020( 其公開內容通過引用明確并入本文 )。每個抗體分子綴合平均 3-4 個美 登木素生物堿類分子已在增強針對靶細胞的細胞毒性中顯示功效, 且對抗體的功能或溶解 度沒有負面影響, 盡管預計甚至一個分子的毒素 / 抗體也將較之使用裸抗體而增強細胞毒 性。美登木素生物堿類在本領域是眾所周知的, 而且可通過已知技術合成或從天然來源分 離。例如美國專利 5,208,020 和上文提及的其它專利及非專利發表物中公開了合適的美登 木素生物堿類。 優選的美登木素生物堿類是美登醇和在美登醇分子的芳香環或其它位置經 過修飾的美登醇類似物, 諸如各種美登醇酯。本領域已知許多連接基團可用于制備抗體 - 美登木素生物堿類綴合物, 包括例如 美國專利 No.5,208,020 或歐洲專利 0425235B1, Chari 等, Cancer Research( 癌癥研究 )52 : 127-131(1992), 和 2004 年 10 月 8 日提交的美國專利申請 No.10/960,602 中所公開的, 其公 開內容通過引用明確并入本文。 可如 2004 年 10 月 8 日提交的美國專利申請 No.10/960,602 所公開的制備包含接頭成分 SMCC 的抗體 - 美登木素生物堿類綴合物。連接基團包括二硫 化物基團、 硫醚基團、 酸不穩定基團、 光不穩定基團、 肽酶不穩定基團、 或酯酶不穩定基團, 正如上文所述專利中所公開的, 二硫化物和硫醚基團是優選的。另外的連接基團在本文進 行了描述和例示。
     可使用多種雙官能蛋白質偶聯劑來制備抗體和美登木素生物堿類的綴合物, 諸如 N- 琥珀酰亞胺基 -3-(2- 吡啶基二硫代 ) 丙酸酯 (SPDP)、 琥珀酰亞胺基 -4-(N- 馬來酰亞氨 基甲基 ) 環己烷 -1- 羧酸酯 (SMCC)、 亞氨基硫烷 (IT)、 亞氨酸酯的雙官能衍生物 ( 諸如二 甲基己二亞酰胺鹽酸化物 )、 活性酯類 ( 諸如辛二酸二琥珀酰亞胺基酯 )、 醛類 ( 諸如戊二 醛 )、 雙疊氮化合物 ( 諸如雙 ( 對 - 疊氮苯甲酰基 ) 己二胺 )、 雙重氮衍生物 ( 諸如雙 ( 對 - 重 氮苯甲酰基 )- 乙二胺 )、 二異氰酸酯 ( 諸如甲苯 2, 6- 二異氰酸酯 )、 和雙活性氟化合物 ( 諸 如 1, 5- 二氟 -2, 4- 二硝基苯 )。特別優選的偶聯劑包括 N- 琥珀酰亞胺基 -3-(2- 吡啶基二 硫代 ) 丙酸酯 (SPDP)(Carlsson 等, Biochem.J.( 生物化學雜志 )173 : 723-737(1978)) 和 N- 琥珀酰亞氨基 -4-(2- 吡啶基硫代 ) 戊酸酯 (SPP), 從而提供二硫鍵連接。
     根據連接的類型, 可將接頭連接于美登木素生物堿類分子的多個位置。 例如, 可使 用常規偶聯技術通過與羥基的反應來形成酯鍵。反應可發生在具有羥基的 C-3 位置、 經羥 甲基修飾的 C-14 位置、 經羥基修飾的 C-15 位置、 和具有羥基的 C-20 位置。在一個優選實 施方案中, 在美登醇或美登醇類似物的 C-3 位置形成連接鍵。
     ii.Auristatin 和多拉司他汀
     在一些實施方案中, 免疫綴合物包含與多拉司他汀 (dolastatin) 或多拉司他 汀肽類似物和衍生物, auristatins 綴合的本發明的抗體 ( 美國專利 Nos.5,635,483 和 5,780,588)。多拉司他汀類和 auristatins 已經顯示出干擾微管動力學、 GTP 水解、 及 核 和 細 胞 分 裂 (Woyke 等 (2001)Antimicrob.Agentsand Chemother.( 抗 微 生 物 劑 和 化 療 )45(12) : 3580-3584) 且具有抗癌 (U.S. 專利號 5,663,149) 和抗真菌活性 (Pettit 等, (1998)Antimicrob.AgentsChemother.( 抗微生物劑和化療 )42 : 2961-2965)。多拉司他汀 或 auristatin 藥物結構部分可經由肽藥物結構部分的 N( 氨基 ) 末端或 C( 羧基 ) 末端連 接于抗體 (WO 02/088172)。
     例示性的 auristatin 實施方案包括 N- 末端連接的單甲基 auristatin 藥物結構 部 分 DE 和 DF, 披 露 于 2004 年 11 月 5 日 提 交 的 “MonomethylvalineCompounds Capable of Conjugation to Ligands( 能 綴 合 至 配 體 的 單 甲 基 纈 氨 酸 化 合 物 )” , 美國序列號 10/983,340, 通過引用明確將其公開內容完整合并入本文。
     典型的是, 基于肽的藥物結構部分可通過在兩個或多個氨基酸和 / 或肽片段之 間形成肽鍵來制備。此類肽鍵可依照例如肽化學領域眾所周知的液相合成法來制備 ( 參 見 E. 和 K.Lübke, “The Peptides( 肽 ), ” 第 1 卷, 第 76-136 頁, 1965, Academic Press)。Auristatin/ 多拉司他汀藥物結構部分可依照以下文獻中的方法來制備 : U.S. 專 利 號 5,635,483 和 5,780,588 ; Pettit 等, (1989)J.Am.Chem.Soc.( 美 國 化 學 學 會 雜志 )111 : 5463-5465 ; Pettit 等, (1998)Anti-Cancer Drug Design( 抗 癌 藥 物 設 計 )13 : 243-277 ; Pettit, G.R.,等, Synthesis( 合 成 ), 1996, 719-725 ;和 Pettit 等, (1996) J.Chem.Soc.Perkin Trans.15 : 859-863。 也 見 Doronina(2003)Nat.Biotechnol.( 自 然 : 生物技術 )21(7) : 778-784 ; “MonomethylvalineCompounds Capable of Conjugation to Ligands( 能綴合至配體的單甲基纈氨酸化合物 )” , 2004 年 11 月 5 日提交的美國序列號 No.10/983,340, , 將其通過引用完整收入本文 ( 披露了例如制備綴合至接頭的單甲基纈氨 酸化合物 ( 諸如 MMAE 和 MMAF) 的接頭和方法 )。
     iii. 加利車霉素
     在其它實施方案中, 免疫綴合物包含與一個或多個加利車霉素分子綴合的本發 明的抗體。加利車霉素抗生素家族能夠在亞皮摩爾濃度產生雙鏈 DNA 斷裂。關于加利車 霉素家族綴合物的制備參見美國專利號 5,712,374, 5,714,586, 5,739,116, 5,767,285, 5,770,701, 5,770,710, 5,773,001, 和 5,877,296( 都屬于 American Cyanamid Company)。 可用的加利車霉素結構類似物包括但不限于 γ1I, α2I, α3I, N- 乙酰基 -γ1I, PSAG 和 I θ 1(Hinman 等, Cancer Research( 癌 癥 研 究 )53 : 3336-3342(1993), Lode 等, Cancer Research( 癌 癥 研 究 )58 : 2925-2928(1998) ; 及 上 述 屬 于 American Cyanamid 的 美 國 專 利 )。可與抗體綴合的另一種抗腫瘤藥物是 QFA, 它是一種抗葉酸藥物。加利車霉素和 QFA 都具有胞內作用位點, 且不易穿過質膜。 因此, 這些試劑經由抗體介導的內在化的細胞攝取 大大增強了它們的細胞毒性效果。
     iv. 其它細胞毒性劑
     可與本發明的抗體綴合的其它抗腫瘤劑包括 BCNU、 鏈佐星 (streptozoicin)、 長 春新堿 (vincristine) 和 5- 氟尿嘧啶、 美國專利號 5,053,394 和 5,770,710 記載的統稱為 LL-E33288 復合體的試劑家族、 及埃斯波霉素類 (esperamicins)( 美國專利號 5,877,296)。
     可用的酶活性毒素及其片段包括白喉毒素 A 鏈、 白喉毒素的非結合活性片段、 外 毒素 A 鏈 ( 來自銅綠假單胞菌 )、 蓖麻毒蛋白 (ricin)A 鏈、 相思豆毒蛋白 (abrin)A 鏈、 蒴蓮根毒蛋白 (modeccin)A 鏈、 α- 帚曲霉素 (α-sarcin)、 油桐 (Aleutites fordii) 蛋 白、 香石竹毒蛋白 (dianthin protein)、 美洲商陸 (Phytolaca americana) 蛋白 (PAPI、 PAPII 和 PAP-S)、 苦瓜 (Momordicacharantia) 抑制劑、 麻瘋樹毒蛋白 (curcin)、 巴豆毒蛋 白 (crotin)、 肥皂草 (sapaonaria officinalis) 抑制劑、 白樹毒蛋白 (gelonin)、 絲林霉素 (mitogellin)、 局限曲菌素 (restrictocin)、 酚霉素 (phenomycin)、 依諾霉素 (enomycin) 和單端孢菌素 (trichothecenes)。參見例如 1993 年 10 月 28 日公開的 WO93/21232。
     本發明還考慮了以下免疫綴合物, 其在抗體和具有核酸降解活性的化合物 ( 如核 糖核酸酶或 DNA 內切核酸酶, 諸如脫氧核糖核酸酶 ; DNA 酶 ) 之間形成。
     為了選擇性破壞腫瘤, 抗體可包含高度放射性原子。多種放射性同位素可用于生 成放射綴合的抗體。實例包括 At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212 和 Lu 的 放射性同位素。 在將綴合物用于檢測時, 可包含用于閃爍照相研究的放射性原子, 例如 tc99m 或 I123, 或是包含用于核磁共振 (NMR) 成像 ( 也稱為磁共振成像, mri) 的自旋標記物, 諸如 同樣是碘 -123、 碘 -131、 銦 -111、 氟 -19、 碳 -13、 氮 -15、 氧 -17、 釓、 錳或鐵。
     可以已知方式將放射性或其它標記物摻入綴合物。例如, 可生物合成肽, 或是通 過化學氨基酸合成法合成肽, 其中使用包括例如氟 -19 代替氫的合適的氨基酸前體。可經肽中的半胱氨酸殘基來連接標記物, 諸如 tc99m 或 I123, Re186, Re188 和 In111。可以經賴氨 酸殘基來連接釔 -90。IODOGEN 法 (Fraker 等 (1978)Biochem.Biophys.Res.Commun.( 生 物化學和生物物理學研究通訊 )80 : 49-57) 可用于摻入碘 -123。 “MonoclonalAntibodies inImmunoscintigraphy( 免疫閃爍成像中的單克隆抗體 )” (Chatal, CRC Press1989) 詳細 記載了其它方法。
     抗體和細胞毒性劑的綴合物可使用多種雙官能蛋白質偶聯劑來制備, 諸如 N- 琥 珀酰亞胺基 -3-(2- 吡啶基二硫代 ) 丙酸酯 (SPDP)、 琥珀酰亞胺基 -4-(N- 馬來酰亞氨甲基 ) 環己烷 -1- 羧酸酯 (SMCC)、 亞氨基硫烷 (IT)、 亞氨酸酯的雙官能衍生物 ( 諸如二甲基己二 亞酰胺鹽酸化物 )、 活性酯類 ( 諸如辛二酸二琥珀酰亞胺基酯 )、 醛類 ( 諸如戊二醛 )、 雙疊 氮化合物 ( 諸如雙 ( 對 - 疊氮苯甲酰基 ) 己二胺 )、 雙重氮衍生物 ( 諸如雙 ( 對 - 重氮苯甲 酰基 ) 己二胺 )、 二異氰酸酯 ( 諸如甲苯 2, 6- 二異氰酸酯 )、 和雙活性氟化合物 ( 諸如 1, 5- 二氟 -2, 4- 二硝基苯 )。例如, 可如 Vitetta 等, Science( 科學 )238 : 1098(1987) 中所述 制備蓖麻毒蛋白免疫毒素。 碳 -14 標記的 1- 異硫氰酸苯甲基 -3- 甲基二亞乙基三胺五乙酸 (MX-DTPA) 是用于將放射性核苷酸與抗體綴合的例示性螯合劑。 參見 WO 94/11026。 接頭可 以是便于在細胞中釋放細胞毒性藥物的 “可切割接頭” 。 例如, 可使用酸不穩定接頭、 肽酶敏 感接頭、 光不穩定接頭、 二甲基接頭、 或含二硫化物的接頭 (Chari 等, Cancer Research( 癌 癥研究 )52 : 127-131(1992) ; 美國專利 No.5,208,020)。
     本發明的化合物明確涵蓋但不限于用下列交聯劑制備的 ADC : 商品化 ( 如購自 Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL., 美國 ) 的 BMPS、 EMCS、 GMBS、 HBVS、 LC-SMCC、 MBS、 MPBH、 SBAP、 SIA、 SIAB、 SMCC、 SMPB、 SMPH、 硫 代 -EMCS、 硫 代 -GMBS、 硫 代 -KMUS、 硫 代 -MBS、 硫代 -SIAB、 硫代 -SMCC、 和硫代 -SMPB、 和 SVSB( 琥珀酰亞氨基 -(4- 乙烯基砜 ) 苯 甲酸酯 )。 見 2003-2004 年度應用手冊和產品目錄 (Applications Handbook and Catalog) 第 467-498 頁。
     v. 抗體藥物綴合物的制備
     在本發明的抗體藥物綴合物 (ADC) 中, 將抗體 (Ab) 經接頭 (L) 與一個或多個藥物 結構部分 (D) 綴合, 例如每個抗體綴合約 1 個至約 20 個藥物結構部分。可采用本領域技術 人員已知的有機化學反應、 條件和試劑通過數種路徑來制備通式 I 的 ADC, 包括 : (1) 抗體 的親核基團與二價接頭試劑反應, 以通過共價鍵形成 Ab-L, 隨后與藥物結構部分 D 反應 ; 和 (2) 藥物結構部分的親核基團與二價接頭試劑反應, 以通過共價鍵形成 D-L, 隨后與抗體的 親核基團反應。本文描述了用于制備 ADC 的另外的方法。
     Ab-(L-D)p I
     接頭可由一個或多個接頭構件構成。示例性接頭構件包括 6- 馬來酰亞胺己酰 基 (6-maleimidocaproyl, “MC” )、 馬 來 酰 亞 胺 基 丙 酰 基 (maleimidopropanoyl, “MP” )、 纈氨酸 - 瓜氨酸 (“val-cit” )、 丙氨酸 - 苯丙氨酸 (“ala-phe” )、 對 - 氨基苯甲氧基羰 基 (p-aminobenzyloxycarbonyl, “PAB” )、 N- 琥珀酰亞胺基 -4-(2- 吡啶基硫代 ) 戊酸酯 (“SPP” )、 N- 琥珀酰亞胺基 -4-(N- 馬來酰亞氨甲基 ) 環己烷 -1- 羧酸酯 (“SMCC’ )、 和 N- 琥珀酰亞胺基 (4- 碘 - 乙酰基 ) 氨基苯甲酸酯 ( “SIAB” )。 另外的接頭構件是本領域已知 的, 有些在本文進行了描述。 也見 “Monomethylvaline Compounds Capable ofConjugation to Ligands( 能綴合至配體的單甲基纈氨酸化合物 ), ” 2004 年 11 月 5 日提交的美國序列號 No.10/983,340, 其全文內容通過引用并入本文。
     在一些實施方案中, 接頭可包含氨基酸殘基。 示例性的氨基酸接頭構件包括二肽、 三肽、 四肽、 或五肽。 示例性的二肽包括 : 纈氨酸 - 瓜氨酸 (vc 或 val-cit)、 丙氨酸 - 苯丙氨 酸 (af 或 ala-phe)。示例性的三肽包括 : 甘氨酸 - 纈氨酸 - 瓜氨酸 (gly-val-cit) 和甘氨 酸 - 甘氨酸 - 甘氨酸 (gly-gly-gly)。包含氨基酸接頭構件的氨基酸殘基包括天然存在的 那些, 以及稀有氨基酸 (minor amino acid) 和非天然存在的氨基酸類似物, 如瓜氨酸。可 以設計氨基酸接頭構件并且最優化其選擇性以用于通過特定的酶 ( 如腫瘤相關的蛋白酶, 組織蛋白酶 B、 C 和 D, 或纖溶酶蛋白酶 ) 進行酶切割。
     抗體上的親核基團包括但不限于 : (i)N 末端胺基 ; (ii) 側鏈胺基, 如賴氨酸 ; (iii) 側鏈巰基, 如半胱氨酸 ; 和 (iv) 糖基化抗體中糖的羥基或氨基。胺基、 巰基、 和羥基 是親核的, 能夠與接頭結構部分和接頭試劑上的親電子基團反應而形成共價鍵, 而接頭結 構部分和接頭試劑包括 : (i) 活性酯類, 諸如 NHS 酯、 HOBt 酯、 鹵代甲酸酯、 和酸性鹵化物 ; (ii) 烷基和苯甲基鹵化物, 諸如鹵代乙酰胺 ; (iii) 醛類、 酮類、 羧基和馬來酰亞胺基團。 某 些抗體具有可還原的鏈間二硫鍵, 即半胱氨酸橋。可通過用還原劑諸如 DTT( 二硫蘇糖醇 ) 處理使抗體具有與接頭試劑綴合的反應活性。 每個半胱氨酸橋理論上將形成兩個反應性硫 醇親核體。可經由賴氨酸與 2- 亞氨基硫烷 (Traut 氏試劑 ) 的反應, 導致胺轉變為硫醇, 從 而將額外的親核基團引入抗體。通過引入一個、 兩個、 三個、 四個、 或更多半胱氨酸殘基 ( 例 如制備包含一個或多個非天然半胱氨酸氨基酸殘基的突變抗體 ) 可將反應性巰基引入抗 體。
     還可通過修飾抗體引入可與接頭試劑或藥物上的親核取代基反應的親電子結構 部分來生成本發明的抗體藥物綴合物。可用例如高碘酸鹽氧化劑氧化糖基化抗體的糖, 從 而形成可與接頭試劑或藥物結構部分的胺基團反應的醛或酮基團。 所得亞胺希夫堿基可形 成穩定的連接鍵, 或者可用例如硼氫化物試劑還原而形成穩定的胺連接鍵。在一個實施方 案中, 糖基化抗體的糖部分與半乳糖氧化酶或偏高碘酸鈉的反應可在蛋白質中生成羰 ( 醛 和酮 ) 基團, 它可與藥物上的適當基團反應 (Hermanson, BioconjugateTechniques)。在 另一個實施方案中, 包含 N 末端絲氨酸或蘇氨酸殘基的蛋白質可與偏高碘酸鈉反應, 導致 在第一個氨基酸處生成醛 (Geoghegan&Stroh, (1992)Bioconjugate Chem.( 生物綴合物化 學 )3 : 138-146 ; U.S. 專利號 5,362,852)。此類醛可與藥物結構部分或接頭親核體反應。
     同樣, 藥物結構部分上的親核基團包括但不限于 : 胺、 硫醇、 羥基、 酰肼、 肟、 肼、 縮 氨基硫脲 (thiosemicarbazone)、 肼羧酸酯、 和芳基酰肼基團, 它們能夠與接頭部分和接頭 試劑上的親電子基團反應而形成共價鍵, 而接頭部分和接頭試劑包括 : (i) 活性酯類, 諸如 NHS 酯、 HOBt 酯、 鹵代甲酸酯、 和酸性鹵化物 ; (ii) 烷基和苯甲基鹵化物, 諸如鹵代乙酰胺 ; (iii) 醛類、 酮類、 羧基、 和馬來酰亞胺基團。
     或者, 可通過例如重組技術或肽合成來制備包含抗體和細胞毒性劑的融合蛋白。 DNA 的長度可包含各自編碼綴合物兩個部分的區域, 其或彼此毗鄰或由編碼接頭肽的區域 分開, 該接頭肽不破壞綴合物的期望特性。
     在又一個實施方案中, 可將抗體與 “受體” ( 諸如鏈霉抗生物素蛋白 ) 綴合從而用 于腫瘤預先靶向, 其中對個體施用抗體 - 受體綴合物, 接著使用清除劑由循環中清除未結 合的綴合物, 然后施用與細胞毒性劑 ( 如放射性核苷酸 ) 綴合的 “配體” ( 如抗生物素蛋白 )。 使用抗 -FGFR3 抗體的方法
     本發明的特征在于將 FGFR3 抗體用作具體治療方案的一部分, 所述治療方案預期 由該治療劑提供有益的作用。本發明尤其可用于治療處于各種階段的各種類型的癌癥。
     術語癌癥包括一組增殖性病癥, 包括但不限于癌前生長、 良性腫瘤、 和惡性腫瘤。 良性腫瘤維持局限在原始位點并且沒有浸潤、 侵襲或轉移至遠端位點的能力。惡性腫瘤將 侵襲并破壞其周圍的其它組織。 它們也獲得了從原始位點剝離并擴散至身體其它部分的能 力 ( 轉移 ), 通常通過血流或通過淋巴結所在的淋巴系統轉移。 原發腫瘤通過它們所發生的 組織類型進行分類 ; 轉移瘤通過癌細胞所來源的組織類型進行分類。 經過一段時間, 惡性腫 瘤的細胞變得更加異常并顯得更不像正常細胞。這種癌細胞的外觀變化稱為腫瘤分級, 并 且癌細胞被描述為良好分化的 ( 低級別 (low grade))、 中度分化的、 較差分化的或未分化 的 ( 高級別 (high grade))。良好分化的細胞顯得非常正常并且類似于它們所來源的正常 細胞。未分化的細胞是變得如此異常以至于不能確定該細胞的來源的細胞。
     癌癥分期系統描述了癌癥在解剖學上擴散多遠并試圖將具有相似預后和治療的 患者放在相同的分期組中。可進行數種測試以協助進行癌癥分期, 包括組織活檢和某些顯 影測試如胸部 X 線、 乳房 X 線照片、 骨掃描、 CT 掃描和 MRI 掃描。還使用血液測試和臨床評 價來評價患者的總體健康并檢測癌癥是否擴散到某些器官。
     為對癌癥分期, 美國癌癥聯合委員會 (American Joint Committee onCancer) 首 次使用 TNM 分類系統將癌癥特別是實體瘤以字母類別排列。癌癥被指定為字母 T( 腫瘤大 小 )、 N( 可觸及淋巴結 )、 和 / 或 M( 轉移 )。T1, T2, T3, 和 T4 描述了原發損害的大小增加 ; N0, N1, N2, N3 表明涉及淋巴結的進行性進展 ; M0 和 M1 反映了遠端轉移的不存在或存在。
     在第二種分期方法中, 也已知為總體分期分組 (Overall Stage Grouping) 或羅馬 數字分期 (Roman Numeral Staging), 癌癥被分為 0 至 IV 期, 包括原發損害的大小以及淋巴 結擴散和遠端轉移的存在。在這種系統中, 病例分組到由羅馬數字 I 到 IV 表示的四個期, 或分類為 “復發” 。對一些癌癥, 0 期被稱為 “原位” 或 “Tis” , 如對于乳腺癌的原位導管癌或 原位小葉癌。高級別腺瘤也可分類為 0 期。一般而言, I 期癌癥是通常可治愈的小的局限 性癌癥, 而 IV 期通常代表不可手術或轉移的癌癥。II 期和 III 期癌癥通常是局部進展和 / 或表現出局部淋巴結的參與。一般而言, 更高分期數字表示更大面積的疾病, 包括更大的 腫瘤大小和 / 或癌癥擴散到附近淋巴結和 / 或原發腫瘤鄰近的器官。這些分期是精確定義 的, 但該定義對每種癌癥不同并且是本領域技術人員已知的。
     許多癌癥登記, 諸如國立癌癥研究所的監測、 流行病學和遠期結果計劃 (NCI’ s Surveillance, Epidemiology, and End Results Program(SEER)) 使用概括分期 (summary staging)。這種系統用于所有類型的癌癥。它將癌癥病例分成五個主要類型的組 :
     原位 (In situ) 是早期癌, 其僅在其發生的細胞層中存在。
     局部 (Localized) 是局限于其發生的器官的癌癥, 無擴散跡象。
     區域 (Regional) 是已經從最初 ( 原發 ) 位點擴散到附近淋巴結或器官和組織的 癌癥。
     遠處 (Distant) 是已經從原發位點擴散到遠處器官或遠處淋巴結的癌癥。
     未知 (Unknown) 用于描述對于該病例沒有足夠的信息表明分期的病例。
     此外, 癌癥通常在原發腫瘤已經去除后數個月或數年復發。在所有可見的腫瘤切 除后癌癥復發稱為復發性疾病。在原發腫瘤區域復發的疾病是局部復發, 作為轉移復發的 疾病稱為遠端復發。
     腫瘤可以是實體瘤或非實體瘤或軟組織腫瘤。軟組織腫瘤的實例包括白血病 ( 例如, 慢性髓細胞性白血病 (chronic myelogenous leukemia)、 急性髓細胞性白血病 (acute myelogenous leukemia)、 成人急性淋巴細胞白血病 (adult acute lymphoblastic leukemia)、 急 性 髓 性 白 血 病 (acute myelogenousleukemia)、 成熟 B 細胞急性淋巴細 胞 白 血 病 (mature B-cell acutelymphoblastic leukemia)、 慢性淋巴細胞白血病 (chronic lymphocyticleukemia)、 polymphocytic 白 血 病 (polymphocytic leukemia)、 或毛細胞白血病 (hairy cell leukemia)) 或淋巴瘤 (lymphoma)( 例如, 非霍奇金淋巴瘤 (non-Hodgkin′ s lymphoma)、 皮膚 T 細胞淋巴瘤 (cutaneous T-celllymphoma)、 或霍奇森 病 (Hodgkin′ s disease))。實體瘤包括除血液、 骨髓、 或淋巴系統之外的任何身體組織的 癌癥。實體瘤可進一步分為上皮細胞來源的那些和非上皮細胞來源的那些。上皮細胞實體 瘤的實例包括胃腸道、 結腸、 乳腺、 前列腺、 肺、 腎、 肝、 胰腺、 卵巢、 頭和頸、 口腔、 胃、 十二指 腸、 小腸、 大腸、 肛門、 膽囊、 陰唇、 鼻咽、 皮膚、 子宮、 男性生殖器、 泌尿器官、 膀胱及皮膚的腫 瘤。非上皮來源的實體瘤包括肉瘤 (sarcomas)、 腦腫瘤 (brain tumors)、 和骨腫瘤 (bone tumors)。腫瘤的其他實例描述在定義章節中。
     在一些實施方案中, 對本文的患者進行診斷測試, 例如在治療前和 / 或治療中和 / 或治療后。一般而言, 如果進行診斷測試, 可從需要治療的患者獲得樣品。當受試者患有 癌癥時, 該樣品可以是腫瘤樣品, 或其它生物學樣品, 如生物學液體, 包括但不限于血液、 尿 液、 唾液、 腹水或衍生物如血清和血漿等等。
     本文的生物學樣品可以是固定的樣品, 例如福爾馬林固定的、 石蠟包埋 (FFPE) 的 樣品或冷凍的樣品。
     用于測定 mRNA 或蛋白質表達的方法有多種, 包括但不限于基因表達譜、 聚合酶鏈 式反應 (PCR)( 包括定量實時 -PCR(qRT-PCR))、 微陣列分析、 基因表達系列分析 (serial analysis of gene expression, SAGE)、 MassARRAY、 通 過 大 量 平 行 簽 名 測 序 (Massive Parallel SignitureSequencing, MPSS) 進行的基因表達分析、 蛋白質組學、 免疫組化 (IHC) 等。優選對 mRNA 定量。所述 mRNA 分析優選使用聚合酶鏈式反應 (PCR) 技術或通過微陣列 分析來進行。若采用 PCR, 則優選的 PCR 形式是定量實時 PCR(qRT-PCR)。在一個實施方案 中, 如果上文提到的一種或多種基因的表達處于中值或高于中值, 例如與相同腫瘤類型的 其它樣品相比, 那么認為其是陽性表達。 可以在與測量基因表達的同時測定中值表達水平, 或者可以事先測定。
     多篇已發表的期刊論文 ( 例如 Godfrey 等 J.Molec.Diagnostics( 分子診斷雜 志 )2 : 84-91(2000) ; Specht 等, Am.J.Pathol.( 美國病理學雜志 )158 : 419-29(2001)) 中給 出了使用固定的、 石蠟包埋的組織作為 RNA 來源的代表性基因表達概況分析方案的步驟 : 包括 mRNA 分離、 純化、 引物延伸和擴增。簡單的說, 一種代表性方法首先將石蠟包埋的腫瘤 組織樣品切成約 10 微米厚的切片。 然后提取 RNA 并除去蛋白質和 DNA。 分析 RNA 濃度后, 如 果需要可以包括 RNA 修復和 / 或擴增步驟, 并使用基因特異性啟動子逆轉錄 RNA, 然后 PCR。 最后分析數據, 根據所檢驗腫瘤樣品中鑒定的特征性基因表達模式來確定患者可用的最佳治療選項。
     基因或蛋白表達的檢測可以直接或間接確定。
     人們可以測定癌癥中的 FGFR3 的表達或易位或擴增 ( 直接地或間接地測定 )。對 此, 可利用多種診斷 / 預后測定法。 在一個實施方案中, 可通過 IHC 來分析 FGFR3 的過表達。 可將來自腫瘤組織活檢的石蠟包埋組織切片進行 IHC 測定法并對照如下 FGFR3 蛋白質染色 強度標準 :
     得分 0 : 未觀察到染色或者在少于 10%的腫瘤細胞中觀察到膜染色。
     得分 1+ : 在超過 10%的腫瘤細胞中檢測到微弱的 / 剛剛可察覺的膜染色。所述細 胞只在其部分膜中有染色。
     得分 2+ : 在超過 10%的腫瘤細胞中觀察到微弱至中等的完全膜染色。
     得分 3+ : 在超過 10%的腫瘤細胞中觀察到中等至強烈的完全膜染色。
     在一些實施方案中, 那些 FGFR3 過表達評估得分為 0 或 1+ 的腫瘤可表征為未過表 達 FGFR3, 而那些得分為 2+ 或 3+ 的腫瘤可表征為過表達 FGFR3。
     在一些實施方案中, 過表達 FGFR3 的腫瘤可根據對應于每個細胞表達的 FGFR3 分 子拷貝數的免疫組化得分進行定級, 并且可通過生化方法測定 :
     0 = 0-90 個拷貝 / 細胞,
     1+ =至少約 100 個拷貝 / 細胞,
     2+ =至少約 1000 個拷貝 / 細胞,
     3+ =至少約 10,000 個拷貝 / 細胞。
     備選地, 或另外地, 可對福爾馬林固定、 石蠟包埋的腫瘤組織進行 FISH 測定法來 測定腫瘤中 FGFR3 擴增或易位的存在或和 / 或程度 ( 如果有的話 )。
     FGFR3 激活可直接測定 ( 例如通過磷酸 -ELISA 測試或其它檢測磷酸化受體的方 法 ) 或間接測定 ( 例如通過檢測激活的下游信號傳導途徑組分, 檢測受體二聚物 ( 例如同 二聚體、 異二聚體 ), 檢測基因表達概況等 )。
     相似地, 組成型 FGFR3 和 / 或配體不依賴性或配體依賴性的 FGFR3 可直接或間接 檢測 ( 例如通過檢測與組成型活性相關的受體突變、 通過檢測與組成型活性相關的受體擴 增等 )。
     檢測核酸突變的方法是本領域公知的。 通常, 盡管不是必需的, 擴增樣品中的靶核 酸以提供所希望的材料量, 來確定是否存在突變。擴增技術是本領域公知的。例如, 擴增產 物可以涵蓋或不涵蓋所有編碼目的蛋白質的核酸序列, 只要該擴增產物包含懷疑突變所在 的特定氨基酸 / 核酸序列位置。
     在一個實施例中, 可以通過將來自樣品的核酸與能夠與編碼突變核酸的核酸特異 性雜交的核酸探針接觸, 并檢測所述雜交, 由此確定突變的存在。在一個實施方案中, 探針 3 32 33 被可檢測的標記, 例如用放射性同位素 ( H, P, P 等 )、 熒光劑 ( 若丹明、 熒光素等 ) 或發 色劑標記。在一些實施方案中, 探針是反義寡聚物, 例如 PNA、 嗎啉代 - 氨基磷酸酯、 LNA 或 2′ - 烷氧基烷氧基。探針可以有約 8 個核苷酸至約 100 個核苷酸、 或約 10 個至約 75 個、 或約 15 個至約 50 個、 或約 20 個至約 30 個。在另一個方面, 本發明的核酸探針提供在試劑 盒中, 用以鑒定樣品中的 FGFR3 突變, 所述試劑盒包含特異雜交于或鄰近于編碼 FGFR3 的核 酸中的突變位點的寡核苷酸。試劑盒可進一步包括根據使用試劑盒的雜交測試的結果, 用FGFR3 拮抗劑治療患包含 FGFR3 突變的腫瘤的患者的說明書。
     也可通過比較擴增的核酸的電泳遷移率和相應編碼野生型 FGFR3 的核酸的電泳 遷移率, 由此來檢測突變。遷移率差異表明擴增的核酸序列中存在突變。可通過任何合適 的分子分離技術, 例如在聚丙烯酰胺凝膠上, 來確定電泳遷移率。
     利 用 酶 突 變 檢 測 (EMD), 也 可 分 析 核 酸 來 檢 測 突 變 (Del Tito 等, Clinical Chemistry( 臨床化學 )44 : 731-739, 1998)。EMD 使用噬菌體解離酶 T4 內切核酸酶 VII, 其 掃描雙鏈 DNA 直到它檢測并切割了由堿基對錯配造成的結構變形, 所述錯配由核酸改變諸 如點突變、 插入和缺失造成。例如通過凝膠電泳, 檢測到兩個由解離酶切割形成的短片段, 表明存在突變。 EMD 方法的益處是以單個方案直接從擴增反應中鑒定出所檢驗的點突變、 缺 失、 和插入, 不需要純化樣品, 縮短了雜交時間, 并提高了信噪比。包含比正常至多過量 20 倍的大小至多 4kb 的核酸和片段的混合樣品可進行測試。 可是, EMD 掃描不能鑒定在突變陽 性樣品中發生的特定堿基改變, 所以如果需要, 通常要額外的測序步驟來鑒定特定的突變。 如美國專利 No.5,869,245 所證實的, 相似地可用 CEL I 酶替代解離酶 T4 內切核酸酶 VII。
     另 一 種 用 于 檢 測 突 變 的 簡 單 試 劑 盒 是 反 向 雜 交 測 試 條, 其 與 用 于 檢 測 HFE、 TFR2 和 FPN1 基因中造成血色病 (Haemochromatosis) 的多重突變的 Haemochromatosis StripAssayTM(Viennalabshttp://www.bamburghmarrsh.com/pdf/4220.pdf) 相似。這種測 試基于 PCR 擴增后的序列特異性雜交。對于單突變測試, 可使用基于微量板的檢測系統, 而 對于多重突變測試, 可使用測試條作為 “宏陣列 (macro-arrays)” 。試劑盒可包括可供樣品 制備、 擴增和突變檢測即時使用的試劑。 多重擴增方案提供了便利, 并允許以非常有限的體 積來測試樣品。利用直接 StripAssay 形式, 可以在小于 5 小時內完成二十個以上突變的測 試, 而無需昂貴設備。 從樣品中分離 DNA 并體外擴增靶核酸 ( 例如通過 PCR), 并用生物素標 記, 一般可在單個 (“多重” ) 擴增反應中進行。然后, 擴增產物選擇性地與固定在諸如測試 條的固體支持物上的寡核苷酸探針 ( 野生型和突變體特異的 ) 雜交, 其中探針固定為平行 線或條帶。利用鏈霉抗生物素蛋白 - 堿性磷酸酶和有色底物, 來檢測結合的生物素化的擴 增子。這樣的測試能檢測本發明的所有突變或其任意子集。對于特定的突變體探針條帶, 三種信號傳導模式之一是有可能的 : (i) 僅針對野生型探針的條帶, 其表明是正常的核酸 序列, (ii) 針對野生型和突變體探針的條帶, 其表明是雜合基因型, 和 (iii) 僅針對突變體 探針的條帶, 其表明是純合突變體基因型。因此, 在一個方面, 本發明提供了檢測本發明突 變的方法, 其包括從樣品中分離和 / 或擴增靶 FGFR3 核酸序列, 使得擴增產物包含配體, 使 擴增產物與包含針對該配體的可檢測結合配偶體的探針接觸, 而且該探針能夠與本發明的 突變特異性雜交, 然后檢測所述探針與所述擴增產物的雜交。 在一個實施方案中, 配體是生 物素, 而結合配偶體包括抗生物素蛋白或鏈霉抗生物素蛋白。 在一個實施方案中, 結合配偶 體包括鏈霉抗生物素蛋白 - 堿性磷酸酶, 其可用有色底物檢測。在一個實施方案中, 例如, 探針固定于測試條上, 其中與不同突變互補的探針彼此分開。 可選地, 擴增的核酸用放射性 同位素標記, 在該情況中, 探針不必包含可檢測的標記物。
     野生型基因的改變涵蓋所有形式的突變, 諸如插入、 倒位、 缺失、 和 / 或點突變。在 一個實施方案中, 突變是體細胞的。體細胞突變是僅發生于某些組織中 ( 例如在腫瘤組織 中 ) 且不在種系中遺傳的那些。種系突變可以在任何身體組織中找到。
     包含靶核酸的樣品可通過本領域公知的方法獲得, 而且它們適于特定類型和位置的腫瘤。組織活檢通常用于獲得有代表性的腫瘤組織片。可選地, 可以已知或認為包含目 的腫瘤細胞的組織 / 流體的形式間接獲取腫瘤細胞。例如, 肺癌損傷的樣品可通過切除術、 支氣管鏡檢、 細針抽吸、 支氣管刷檢、 或從痰、 胸膜液或血液中獲得。 可從腫瘤或從其它身體 樣品諸如尿、 痰或血清中檢測出突變的基因或基因產物。上述討論的用于檢測腫瘤樣品中 突變的靶基因或基因產物的同樣技術可用于其它身體樣品。癌細胞從腫瘤上脫落下來, 并 出現在這些身體樣品中。通過篩選這些身體樣品, 可實現對于諸如癌癥的疾病的簡單早期 診斷。 另外, 通過對這些身體樣品測試突變的靶基因或基因產物, 可更容易地監測治療的進 展。
     用于富集腫瘤細胞的組織制備物的手段是本領域已知的。例如, 可以從石蠟或低 溫恒溫保存的切片中分離組織。 癌細胞也可通過流式細胞術或激光捕捉顯微解剖而與正常 細胞分開。這些以及其它分離腫瘤和正常細胞的技術是本領域公知的。如果腫瘤組織被正 常細胞高度污染, 那么檢測突變可能更困難, 盡管最小化污染和 / 或假陽性 / 陰性結果的技 術是已知的, 其中一些在下文有描述。例如, 也可以對樣品評估生物標志物 ( 包括突變 ) 的 存在情況, 所述標志物已知與目的腫瘤細胞有關而與相應的正常細胞無關, 反之亦然。
     可通過用本領域公知的技術來分子克隆靶核酸并測序該核酸, 由此來完成靶核酸 中點突變的檢測。可選地, 諸如聚合酶鏈式反應 (PCR) 的擴增技術可用于直接從腫瘤組織 的基因組 DNA 制備物中擴增出靶核酸序列。然后確定擴增序列的核酸序列并鑒定其突變。 擴增技術是本領域公知的, 例如描述于 Saiki 等, Science( 科學 )239 : 487, 1988 ; 美國專利 Nos.4,683,203 和 4,683,195 中的聚合酶鏈式反應。
     應當注意, 設計并選擇合適的引物是本領域中充分確定的技術。
     本 領 域已 知的連接 酶鏈式反應也可 用于 擴增靶核酸 序列。 參 見例如 Wu 等, Genomics( 基因組學 ), Vol.4, pp.560-569(1989)。 另外, 也可使用稱為等位基因特異性 PCR 的技術。參見例如 Ruano 和 Kidd, Nucleic AcidsResearch( 核酸研究 ), Vol.17, p.8392, 1989。根據該技術, 使用的引物在其 3′端與特定靶核酸突變雜交。如果不存在特定的突 變, 那么不會觀察到擴增產物。也可以使用耐擴增突變系統 (Amplification Refractory MutationSystem, ARMS), 其如歐洲專利申請公開號 0332435 和 Newton 等, NucleicAcids Research( 核酸研究 ), Vol.17, p.7, 1989 所公開的。基因的插入和缺失也可通過克隆、 測 序和擴增來檢測。另外, 基因或周圍標志基因的限制性片段長度多態性 (RFLP) 探針可用于 對等位基因的改變或多態性片段中的插入來評分。也可用單鏈構象多態性 (SSCP) 分析來 檢測等位基因的堿基變化變體。參見例如 Orita 等, Proc.Natl.Acad.Sci.USA( 美國國家 科學院學報 )Vol.86, pp.2766-2770, 1989, 和 Genomics( 基因組學 ), Vol.5, pp.874-879, 1989。也可用其它用于檢測插入和缺失的本領域已知技術。
     根據基因野生型表達產物的改變, 也可檢測野生型基因的改變。這些表達產物包 括 mRNA 以及蛋白質產物。通過擴增和測序 mRNA 或分子克隆由 mRNA 制備的 cDNA, 來檢測點 突變。利用本領域公知的 DNA 測序技術, 可以確定克隆的 cDNA 的序列。cDNA 也可以通過聚 合酶鏈式反應 (PCR) 來測序。
     錯配是沒有 100%互補性的雜交核酸雙鏈。缺乏完全的互補性可以是因為缺失、 插入、 倒位、 置換或移碼突變造成的。可用錯配檢測來檢測靶核酸中的點突變。盡管這些技 術可能不如測序靈敏, 然而對大量組織樣品來說更容易實施。錯配裂解技術的實例是 RNA酶保護方法, 其在 Winter 等, Proc.Natl.Acad.Sci.USA( 美國國家科學院學報 ), Vol.82, p.7575, 1985, 和 Meyers 等, Science( 科學 ), Vol.230, p.1242, 1985 中有詳細描述。例如, 本發明的方法可包括使用標記的核糖核酸探針 (riboprobe), 其與人野生型靶核酸互補。 衍 生自組織樣品的核糖核酸探針和靶核酸在一起退火 ( 雜交 ), 然后用 RNA 酶 A 消化, 其能夠 檢測雙鏈 RNA 結構中的一些錯配。如果 RNA 酶 A 檢測到錯配, 那么它在錯配位點裂解。因 此, 當在電泳凝膠基質上分離退火的 RNA 制備物時, 如果 RNA 酶 A 檢測到錯配并裂解, 那么 將見到比核糖核酸探針與 mRNA 或 DNA 的全長雙鏈 RNA 小的 RNA 產物。考慮到它涵蓋了懷 疑突變了的位置, 核糖核酸探針不需要是靶核酸 mRNA 或基因的全長, 但可以是靶核酸的一 部分。如果核糖核酸探針僅包含靶核酸 mRNA 或基因的一個區段, 如果需要, 那么可能希望 使用大量這些探針來篩選整個靶核酸序列的錯配。
     以相似的方式, 可用 DNA 探針檢測錯配, 例如通過酶或化學裂解進行。參見例如 Cotton 等, Proc.Natl.Acad.Sci.USA( 美國國家科學院學報 ), Vol.85, 4397, 1988 ; 和 Shenk 等, Proc.Natl.Acad.Sci.USA( 美國國家科學院學報 ), Vol.72, p.989, 1975。可選地, 通過 錯配雙鏈體相對于匹配雙鏈體的電泳遷移率變化, 可檢測錯配。參見例如 Cariello, Human Genetics( 人類遺傳學 ), Vol.42, p.726, 1988。用核糖核酸探針或 DNA 探針, 可以在雜交前 擴增可能包含突變的靶核酸 mRNA 或 DNA。 尤其是如果改變是總的重排, 諸如缺失和插入, 那 么利用 Southern 雜交也可檢測靶核酸 DNA 中的改變。
     擴增出的靶核酸 DNA 序列也可用等位基因特異性探針篩選。這些探針是核酸寡聚 物, 每一個都包含靶核酸基因中包含已知突變的區域。 例如, 一個寡聚物的長度可以為約 30 個核苷酸, 對應于部分靶基因序列。 通過使用一組這樣的等位基因特異性探針, 可篩選靶核 酸擴增產物, 以鑒定靶基因中以前鑒定出的突變的存在。可以例如在尼龍濾器上進行等位 基因特異性探針與擴增的靶核酸序列的雜交。 在嚴格雜交條件下與特定探針的雜交表明腫 瘤組織中存在與等位基因特異性探針中相同的突變。
     通過篩選相應野生型蛋白的改變, 可檢測野生型靶基因的改變。 例如, 與靶基因產 物有免疫反應性的單克隆抗體可用于篩選組織, 例如用已知與基因產物 ( 蛋白質 ) 的特定 突變位置結合的抗體。例如, 所用的抗體可以是結合缺失的外顯子的抗體或結合包含靶蛋 白缺失部分的構象表位的抗體。缺少關聯抗原將表示有突變。突變等位基因產物的特異性 抗體也可用于檢測突變基因產物。可以從噬菌體展示文庫中鑒定抗體。這些免疫學測定法 可以以本領域已知的任何便利形式進行。這些包括 Western 印跡、 免疫組織化學測定法和 ELISA 測定法。任何檢測改變的蛋白質的方法都可用于檢測野生型靶基因的改變。
     利用核酸擴增技術, 諸如聚合酶鏈式反應, 引物對可用于確定靶核酸的核苷酸序 列。 單鏈 DNA 引物對可以與靶核酸序列之內或周圍的序列退火, 從而引發靶序列的擴增。 也 可使用等位基因特異性引物。該引物僅與特定的突變靶序列退火, 因此僅在存在突變的靶 序列作為模板的情況下才會擴增出產物。為了便于接下來克隆擴增的序列, 引物可具有限 制酶位點序列, 該序列附加在這些引物的末端。這些酶和位點是本領域公知的。可以用本 領域公知的技術來合成引物本身。 一般而言, 可用寡核苷酸合成儀制造引物, 所述儀器可從 商業渠道獲得。設計特定引物完全在本領域技術范圍內。
     核酸探針可用于許多目的。它們可用于對基因組 DNA 的 Southern 雜交中, 并可用 于 RNA 酶保護方法中以檢測上文已經討論過的點突變。探針可用于檢測靶核酸擴增產物。利用其它技術, 它們也可用于檢測野生型基因或 mRNA 的錯配。利用酶 ( 例如 S1 核酸酶 )、 化學藥品 ( 例如羥胺或四氧化鋨和哌啶 )、 或錯配雜交體相對于完全匹配雜交體的電泳遷 移率變化, 可檢測錯配。這些技術是本領域已知的。參見 Novack 等, Proc.Natl.Acad.Sci. USA( 美國國家科學院學報 ), Vol.83, p.586, 1986。一般而言, 探針與激酶結構域外的序列 互補。整組核酸探針可用于組成試劑盒來檢測靶核酸中的突變。試劑盒容許進行對目的靶 序列的大區域的雜交。探針可彼此交疊或毗鄰。
     如果用核糖核酸探針來檢測與 mRNA 的錯配, 那么它一般與靶基因的 mRNA 互補。 因 此, 核糖核酸探針是反義探針, 因為由于它與有義鏈互補, 它不編碼相應的基因產物。核糖 核酸探針一般會用放射性、 比色、 或熒光材料來標記, 這可以通過任何本領域已知方法來實 現。如果用核糖核酸探針來檢測與 DNA 的錯配, 它可以是任一極性, 即有義的或反義的。相 似地, 也可用 DNA 探針來檢測錯配。
     在一些情況下, 癌癥過表達或不過表達 FGFR3。可在診斷或預后測定中通過評估 細胞表面上存在的受體蛋白質水平的升高 ( 例如通過免疫組化測定, IHC) 來測定受體的過 表達。備選地, 或者另外地, 可測量細胞中編碼受體的核酸的水平, 例如通過熒光原位雜交 (FISH ; 參見 1998 年 10 月公布的 WO98/45479)、 southern 印跡或聚合酶鏈式反應 (PCR) 技 術, 諸如實時定量 PCR(RT-PCR)。在上述測定法之外, 熟練從業人員還可利用多種體內測定 法。 例如, 可將患者體內細胞暴露于任選用可檢測標記物例如放射性同位素標記的抗體, 并 且可評估該抗體與患者內細胞的結合, 例如通過外部掃描放射性或通過分析取自事先已暴 露于所述抗體的患者的活組織檢查。
     化療劑
     本發明的聯合療法可以進一步包含一種或多種化療劑。 聯合給藥包括使用單獨的 制劑或單一的藥物制劑的共同施用或同時施用, 和以任意的順序連續施用, 其中優選在兩 種 ( 或所有 ) 活性劑同時發揮它們的生物活性時存在一定的時間段。
     如果施用的話, 化療劑通常以其已知的劑量施用, 或任選地由于藥物的聯合作用 或歸因于抗代謝物化療劑的施用所引起的不良副作用而以降低的劑量施用。 對于此類化療 劑的制備和給藥方案可以根據生產商的說明書或由專業從業人員通過經驗確定來使用。
     在本文中公開了可以聯合的多種化療劑。
     在 一 些 實 施 方 案 中, 待聯合的化療劑選自由下列各項組成的組 : 來那度胺 (REVLIMID), 蛋白體抑制劑 ( 諸如硼替佐米 (VELCADE) 和 PS342), 紫杉烷 (bora taxoid) ( 包 括 多 西 他 賽 (docetaxel) 和 紫 杉 醇 (paclitaxel)), 長春花屬 ( 諸如長春瑞濱 (vinorelbine) 或長春堿 (vinblastine)), 鉑化合物 ( 諸如卡鉑 (carboplatin) 或順鉑 (cisplatin)), 芳香酶抑制劑 ( 諸如來曲唑 (letrozole), 阿那曲唑 (anastrazole), 或依西 美坦 (exemestane)), 抗雌激素 ( 例如, 氟維司群 (fulvestrant) 或他莫昔芬 (tamoxifen)), 依 托 泊 苷 (etoposide), 塞 替 哌 (thiotepa), 環 磷 酰 胺 (cyclophosphamide), 培美曲塞 (pemetrexed), 甲氨蝶呤 (methotrexate), 多柔比星脂質體 (liposomal doxorubicin), 聚 乙 二 醇 化 多 柔 比 星 脂 質 體, 卡 培 他 濱 (capecitabine), 吉 西 他 濱 (gemcitabine), melthalin, 多 柔 比 星 (doxorubicin), 長 春 新 堿 (vincristine), COX-2 抑 制 劑 ( 例 如, 塞 來 考 昔 (celecoxib)), 或 類 固 醇 ( 例 如, 地 塞 米 松 (dexamethasone) 和 潑 尼 松 (prednisone))。 在一些實施方案中 ( 例如涉及治療 t(4 ; 14)+ 多發性骨髓瘤的實施方案 ),聯合地塞米松和來那度胺, 或地塞米松, 或硼替佐米, 或長春新堿, 多柔比星和地塞米松, 或 來那度胺和地塞米松, 或多柔比星脂質體, 長春新堿和地塞米松, 或來那度胺和地塞米松, 或硼替佐米和地塞米松, 或硼替佐米, 多柔比星, 和地塞米松。在一些實施方案中 ( 例如, 涉 及膀胱癌的實施方案 ), 吉西他濱和順鉑, 或紫杉烷 ( 例如, 紫杉醇, 多西他賽 ), 或培美曲 塞, 或甲氨蝶呤, 長春堿, 多柔比星和順鉑, 或卡鉑, 或絲裂霉素 C 結合 5- 氟尿嘧啶, 或順鉑, 或順鉑和 5- 氟尿嘧啶相聯合。
     制劑、 劑量和施用
     可以與優良醫學實踐一致的方式配制、 劑量給藥和施用本發明中使用的治療劑。 在這種情形中考慮的因素包括所治療的具體病癥、 所治療的具體受試者、 患者個體的臨床 狀態、 病癥的起因、 投遞藥劑的部位、 施藥的方法、 施藥的日程安排、 將要組合的藥劑的藥 物 - 藥物相互作用和醫學從業人員已知的其它因素。
     治療用制劑可通過將具有期望純度的活性成分與任選的生理學上可接受的載體、 賦形劑或穩定劑混合使用本領域已知的標準方法而制備 (Remington′ s Pharmaceutical Sciences( 雷明頓制藥科學 )( 第 20 版 ), 編輯 A.Gennaro, 2000, Lippincott, Williams & Wilkins, Philadelphia, PA)。 可接受的載體包括鹽水或緩沖劑, 諸如磷酸鹽、 檸檬酸鹽和其 它有機酸 ; 抗氧化劑, 包括抗壞血酸 ; 低分子量 ( 少于約 10 個殘基 ) 多肽 ; 蛋白質, 諸如血 清白蛋白、 明膠或免疫球蛋白 ; 親水性聚合物, 諸如聚乙烯吡咯烷酮 ; 氨基酸, 諸如甘氨酸、 谷氨酰胺、 天冬酰胺、 精氨酸或賴氨酸 ; 單糖、 二糖和其它糖類, 包括葡萄糖、 甘露糖或糊精 ; 螯合劑, 諸如 EDTA ; 糖醇, 諸如甘露醇、 或山梨醇 ; 成鹽平衡離子, 諸如鈉 ; 和 / 或非離子表 TM TM 面活性劑, 諸如 TWEEN 、 PLURONICS 或 PEG。
     任選地, 但優選地, 制劑含有藥用鹽, 優選為氯化鈉, 且優選大約為生理濃度。 任選 地, 本發明的制劑可包含藥用防腐劑。 在一些實施方案中, 防腐劑濃度范圍在 0.1 至 2.0%, 典型地為 v/v。適當的防腐劑包括制藥領域已知的那些。優選的防腐劑是苯甲醇、 酚、 間甲 酚、 對羥基苯甲酸甲酯和對羥基苯甲酸丙酯。任選地, 本發明的制劑可包含濃度為 0.005 至 0.02%的藥用表面活性劑。
     本文中的制劑還可含有超過一種所治療具體適應癥所必需的活性化合物, 優選活 性互補且彼此沒有不利影響的那些。合適的是, 此類分子以對于預定目的有效的量組合。
     活性成分還可包載于例如通過凝聚技術或通過界面聚合制備的微膠囊中 ( 例如 分別是羥甲基纖維素或明膠微膠囊和聚 ( 甲基丙烯酸甲酯 ) 微膠囊 )、 包載在膠狀藥物投 遞系統中 ( 例如脂質體、 白蛋白微球體、 微乳劑、 納米顆粒和納米膠囊 )、 或包載在粗滴乳狀 液 (macroemulsion) 中。此類技術披露于 Remington′ s Pharmaceutical Sciences, 見上 文。
     可制備緩釋制劑。 緩釋制劑的合適例子包括含有抗體的固體疏水性聚合物的半透 性基質, 該基質是定型產品的形式, 例如薄膜或微膠囊。緩釋基質的例子包括聚酯、 水凝膠 ( 例如聚 (2- 羥乙基 - 甲基丙烯酸酯 ) 或聚 ( 乙烯醇 ))、 聚交酯 ( 美國專利 No.3,773,919)、 L- 谷氨酸與 γ 乙基 -L- 谷氨酸酯的共聚物、 不可降解的乙烯 - 乙酸乙烯酯、 可降解的乳 TM 酸 - 乙醇酸共聚物諸如 LUPRON DEPOT ( 由乳酸 - 乙醇酸共聚物和醋酸亮丙立德構成的可 注射微球體 ) 及聚 -D-(-)-3- 羥基丁酸。雖然諸如乙烯 - 乙酸乙烯酯和乳酸 - 乙醇酸的聚 合物能夠釋放分子達 100 天以上, 但是某些水凝膠釋放蛋白質的時間較短。當封裝的抗體在體內長時間維持時, 它們可能由于暴露于 37℃的潮濕環境而變性或聚集, 導致生物學活 性損失和可能的免疫原性改變。可以根據相關機制來設計合理的穩定化策略。例如, 如果 發現聚集機制是經由硫代 - 二硫化物互換的分子間 S-S 鍵形成, 那么可通過修飾巰基殘基、 由酸性溶液凍干、 控制濕度、 采用適當添加劑和開發特定聚合物基質組合物來實現穩定。
     本發明的治療劑依照已知的方法施用給人患者, 諸如, 作為推注或通過一段時間 的連續輸注的靜脈內施用, 通過肌肉內的、 腹膜內的、 腦脊內的、 皮下的、 關節內的、 滑膜內 的、 鞘內的、 口腔的、 局部的、 或吸入途徑。離體 (ex vivo) 策略也可在治療性應用中使用。 離體策略涉及通過編碼 FGFR3 拮抗劑的多核苷酸轉染或轉導從受試者獲得的細胞。該轉染 或轉導的細胞然后回輸至受試者。該細胞可以是許多類型的任一種, 包括但不限于造血細 胞 ( 例如骨髓細胞、 巨噬細胞、 單核細胞、 樹突細胞、 T 細胞或 B 細胞 )、 成纖維細胞、 上皮細 胞、 內皮細胞、 角質細胞或肌細胞。
     例如, 如果 FGFR3 拮抗劑是抗體, 該抗體通過任何合適的手段施用, 所述手段包括 腸胃外、 皮下、 腹膜內、 肺內和鼻內途徑, 并且如果希望局部免疫抑制治療, 進行損傷內施 用。腸胃外輸注包括肌內、 靜脈內、 動脈內、 腹膜內或者皮下施用。此外, 通過脈沖輸注, 尤 其使用降低劑量的抗體合適地施用抗體。 優選地, 給藥通過注射給予, 最優選地通過靜脈內 或皮下注射給予, 這部分取決于施用是短期還是長期的。
     在另一個實例中, 當病癥或腫瘤的位置允許時, FGFR3 拮抗劑化合物局部施用, 例 如通過直接注射, 并且該注射可周期性地重復。 FGFR3 拮抗劑也可系統投遞給受試者或直接 投遞至腫瘤細胞, 例如投遞至腫瘤或手術切除腫瘤后的瘤床, 以預防或降低局部復發或轉 移。
     組合施用治療劑典型地在限定的時間期間 ( 根據所選的組合通常數分鐘、 數小 時、 數天或數周 ) 進行。聯合療法意圖涵蓋以連續的方式施用這些治療劑, 即其中每種治療 劑在不同時間施用, 以及涵蓋以基本同時的方式施用這些治療劑, 或至少該治療劑中的兩 種。
     治療劑可通過相同的途徑或不同的途徑施用。例如組合中的抗 FGFR3 抗體可通過 靜脈內注射施用, 而組合中的化療劑可口服施用。 備選地, 例如, 兩種治療劑均可口服施用, 或兩種治療劑均可通過靜脈內注射施用, 這取決于具體治療劑。治療劑施用的順序也根據 具體藥劑而變化。
     取決于疾病的類型和嚴重性, 約 1μg/kg 至 100mg/kg 的每種治療劑是施用于患者 的初始候選劑量, 例如, 無論通過一次或多次單獨的給藥, 或通過連續輸注。典型的日劑量 可以在約 1μg/kg 至約 100mg/kg 以上的范圍內, 這取決于上面提及的因素。對于在幾天 或更長時間內的反復給藥, 取決于病況, 持續治療直至癌癥被治療, 如上述方法所測量的那 樣。然而, 可以使用其他給藥方案。
     本申請設想通過基因療法來施用 FGFR3 抗體。關于使用基因療法來產生胞內抗 體, 參見例如 1996 年 3 月 14 日公開的 WO 96/07321。
     制品
     在本發明的另一個方面中, 提供了包含可用于治療、 預防和 / 或診斷上文所述病 癥的物質的制品。所述制品包括容器和在容器上或與其相關的標簽或包裝插頁。合適的 容器包括例如瓶 (bottle)、 藥瓶 (vial)、 注射器等。所述容器可以用多種材料制成, 諸如玻璃或塑料。所述容器裝有組合物, 其本身存在或當與有效治療、 預防和 / 或診斷所述病況 的另一種或多種組合物組合時, 可以具有無菌存取口 ( 例如所述容器可以是帶有皮下注射 針可刺穿的塞子的靜脈內溶液袋或藥瓶 )。在所述組合物中的至少一種活性劑是本發明的 抗體。標簽或包裝插頁指明該組合物用于治療所選擇的病況, 諸如癌癥。而且, 所述制品可 以包含 (a) 具有包含在其中的組合物的第一容器, 其中所述組合物包含本發明的抗體 ; 和 (b) 具有包含在其中的組合物的第二容器, 其中所述組合物包含另外的細胞毒性藥劑。在 本發明的該實施方案中的制品還可以包含包裝插頁, 其說明可以將第一和第二抗體組合物 用于治療特定病況, 例如癌癥。備選地, 或另外地, 所述制品還可以包含第二 ( 或第三 ) 容 器, 其包含藥用緩沖液, 如用于注射的抑菌水 (BWFI)、 磷酸緩沖鹽溶液、 林格氏溶液和葡萄 糖 (dextrose) 溶液。其可進一步包括從商業和用戶立場出發所需要的其它物質, 包括其它 緩沖劑、 稀釋劑、 濾器、 針頭和注射器。
     下述是本發明的方法和組合物的實例。 應當理解考慮上文提供的一般描述可以實 施多種其它實施方案。 實施例 材料和方法
     細胞和細胞培養
     細 胞 系 RT4 獲 自 美 國 典 型 培 養 物 保 藏 中 心 (American Type Cell CultureCollection)。 細胞系 RT112, OPM2 和 Ba/F3 購自德國微生物和細胞培養物培養物保 藏中心 (German Collection of Microorganisms and Cell Cultures)(DSMZ, (Germany))。 多發性骨髓瘤細胞系 KMS 11 由川崎醫學院 (KawasakiMedical School)( 日本 ) 的 Takemi Otsuki 博士饋贈。膀胱癌細胞系 TCC-97-7 由圣詹姆斯大學醫院 (St James’ s University Hospital(Leeds, UK)) 的 Margaret Knowles 博士饋贈。 UMUC-14 細胞系獲自 H.B.Grossman 博士 ( 目前在得克薩斯大學安德森癌癥中心 (University of Texas M.D.AndersonCancer Center), TX)。細胞用補充了 10%胎牛血清 (FBS)(Sigma), 100U/ml 青霉素, 0.1mg/ml 鏈霉 素和 L- 谷氨酰胺的 RPMI 培養基在 5% CO2 的條件下在 37℃維持生長。
     FGFR3S249C 二聚作用研究
     UMUC-14 細 胞 生 長 在 無 半 胱 氨 酸 培 養 基 中, 用 R3Mab 或 DTNB 處 理 3hr, 并將 細胞裂解物在還原或非還原條件下進行免疫印跡分析。對于體外二聚作用研究, 將 S249C FGFR3-IIIb ( 殘基 143-374) 克隆至 pAcGP67A 載體中, 并在 T.ni Pro 細胞中表達。通過 Ni-NTA 柱, 然后通過 Superdex S200 柱純化重組蛋白。二聚體 FGFR3S249C 在 25mM Tris(pH 7.5) 和 300mMNaCl 中洗脫。R3Mab(1μM) 與 FGFR3S249C 二聚體 (0.1μM) 在 37℃下在下列的 條件下溫育 : 100mM KH2PO4(pH 7.5), 25μM DTT, 1mM EDTA 和 0.75mg/ml BSA。在指定的時 間點獲取反應物的等分試樣, 并且通過添加不含 β- 巰基乙醇的樣品緩沖液終止反應。通 過免疫印跡分析二聚體 - 單體。
     異種移植物研究
     所 有 研 究 得 到 Genentech 機 構 動 物 管 理 和 使 用 委 員 會 (Genentech’ sInstitutional Animal Care and Use Committee) 的批準。6-8 周齡雌性 nu/nu 小鼠或 CB17 嚴重聯合免疫缺陷 (SCID) 小鼠購自 Charles River 實驗室 (Hollister,
     CA)。 雌 性 無 胸 腺 裸 鼠 獲 自 國 立 癌 癥 學 會 - 弗 雷 德 里 克 癌 癥 中 心 (National Cancer Institute-Frederick Cancer Center)。小鼠在無特殊病原體條件下飼養。RT112 shRNA 穩定的細胞 (7x106), RT112(7x106), Ba/F3-FGFR3S249C(5x106), OPM2(15x106), 或 KMS11 細胞 6 (20x10 ) 以在 HBSS/ 基質膠 (matrigel)(1 ∶ 1v/v, BD Biosciences) 中的 0.2ml 體積皮下 植入至小鼠的側腹中。植入不含基質膠的 UMUC-14 細胞 (5x106)。使用測徑器測量腫瘤每 周兩次, 并且使用下面的公式計算腫瘤體積 : V = 0.5axb2, 其中 a 和 b 分別是腫瘤的長度和 3 寬度。當平均腫瘤體積達到 150-200mm 時, 將小鼠隨機化分到每組 10 只的各組中, 并且腹 膜內 (i.p) 注射 HBSS 中稀釋的 R3Mab(0.3-50mg/kg) 或對照人 IgG1, 每周處理兩次。對照 動物只給予賦形劑 (HBSS)。
     統計學
     匯總的數據表示為均值 +/-SEM。對于兩組間的比較使用非配對斯氏 t 檢驗 ( 雙 尾 )。在所有試驗中 P < 0.05 的值被認為是統計學顯著的。
     FGFR3shRNA 穩定細胞的生成
     將三種獨立的 FGFR3shRNA 如 (1) 所述克隆進 pHUSH 載體中。在本研究中使用的 FGFR3 shRNA 的序列如下 : shRNA2 : 5’ GATCCCCGCATCAAGCTGCGGCATCATTCAAGAGATGATGCCGCA GCTTGATGCTTTTTTGGAAA(SEQ ID NO : 192) ; shRNA4 : 5’ -GATCCCCTGCACAACCTCGACTACTATTCAA GAGATAGTAGTCGAGGTTGTGCATTTTTTGGAAA-3’ (SEQ ID NO : 193) ; shRNA6 : 5’ -GATCCCCAACCTCGA CTACTACAAGATTCAAGAGATCTTGTAGTAGTCGAGGTTTTTTTTGGAAA-3’ (SEQ ID NO : 194)。 所有構建 體均通過測序確認。 EGFP 對照 shRNA 描述在我們先前的研究中 (50)。 包含 shRNA 的逆轉錄 病毒通過用 VSV-G(Clontech Laboratories) 和 pHUSH-FGFR3shRNA 構建體共轉染 GP2-293 包裝細胞 (Clontech Laboratories, MountainView, CA) 來產生, 并且在轉染后 72hr 收獲病 毒上清液, 并通過離心清除細胞碎片用于轉導實驗。
     RT112 細胞在包含無四環素 FBS(Clontech Laboratories) 的 RPMI 1640 培養基中 維持生長, 并用逆轉錄病毒上清液在存在 4μg/ml 聚凝胺的條件下轉導。感染 72 小時后, 向培養基中加入 2μg/ml 嘌呤霉素 (ClontechLaboratories) 以選擇表達 shRNA 的穩定克 隆。分離穩定的細胞, 用 0.1 或 1μg/ml 強力霉素 (Clontech Laboratories) 處理 4 天, 通 過 Western 印跡分析評估 FGFR3 蛋白表達的可誘導性敲低。如 (51) 所述進行細胞周期分 析。
     選擇對 FGFR3 特異的噬菌體抗體
     在選擇的互補決定區 (H1, H2, H3, L3) 中具有合成多樣性的模擬人 IgG 所有組成成 分 (repertoire) 的天然多樣性的人噬菌體抗體文庫用于淘選。Fab 片段雙價地展示在 M13 噬菌體顆粒的表面上 (52)。 將人 FGFR3-IIIb 和 IIIc 的 His- 標記的 IgD2-D3 用作抗原。 96 孔 MaxiSorp 免疫測定板 (Nunc) 用 FGFR3-IIIb-His 蛋白或 FGFR3-IIIC-His 蛋白 (10μg/ ml) 在 4℃下包被過夜并用補充了 1% BSA 的 PBST 緩沖液 ( 含 0.05%吐溫 20 的 PBS) 封閉 1 小時。加入抗體噬菌體文庫并在室溫 (RT) 下溫育過夜。用 PBST 緩沖液洗滌測定板, 用 50mM HCl 和 500mM NaCl 洗脫結合的噬菌體 30 分鐘, 并用等體積的 1M Tris 堿中和。回收 的噬菌體在大腸桿菌 XL-1blue 細胞中擴增。在隨后的選擇輪次中, 噬菌體抗體的溫育時間 減少至 2 小時, 測定板洗滌的嚴格性逐漸增加 (53)。通過噬菌體 ELISA 和 DNA 測序鑒定與 FGFR3 的 IIIb 和 IIIc 同種型兩者均結合的獨特的和特異的噬菌體抗體。在篩選的 400 個克隆中, 選擇出 4 個通過分別將各個克隆的 VL 和 VH 區克隆至 LPG3 和 LPG4 載體中來重新 格式化成全長 IgG, 在哺乳動物細胞中瞬時表達, 并用蛋白 A 柱純化 (54)。選擇克隆 184.6 用于親和力成熟。
     對于親和力成熟, 在 M13 噬菌體的表面上展示單價 Fab 的噬菌粒 (52) 充當移植噬 菌體 Ab 的輕鏈 (VL) 和重鏈 (VH) 可變結構域的文庫模板。 將終止密碼子結合在 CDR-L3 中。 如 (53) 所述對于親和力成熟采用簡單 (soft) 隨機化策略。選擇 CDR 環的兩個不同組合, H1/H2/L3, H3/L3, 或 L1/L2/L3 進行隨機化。為了選擇親和力成熟的克隆, 針對 FGFR3IIIb 或 IIIc-His 蛋白分選噬菌體文庫, 如 (52) 所述進行第一輪測定板分選, 然后進行四輪溶液 相分選。5 輪淘選后, 如 (55) 所述使用高通量單點競爭性噬菌體 ELISA 來快速篩選高親和 力克隆。選擇在存在 10nM FGFR3-His 的條件下與缺少 FGFR3-His 的條件下 450nm 處吸光 度的比率低的克隆用于進一步表征。
     克隆 184.6.1, 184.6.21, 184.6.49, 184.6.51, 184.6.58, 184.6.62 和 184.6.92 顯 著降低了 Ba/F3-FGFR3-IIIb, Ba/F3-FGFR3-IIIc 和 Ba/F3-FGFR3-S249C 細胞系的活力, 且 克隆 184.6.52 顯著降低了 Ba/F3-FGFR3-S249C 細胞系的活力。根據測定的細胞系不同, 增加的抑制活性范圍為親代克隆 184.6 的約 50 倍 ( 克隆 184.6.52) 至約 100 倍 ( 克隆 184.6.1, 184.6.21, 184.6.49, 184.6.51, 184.6.58, 184.6.62 和 184.6.92)。使用 BIAcore 如下測定克隆 184.6.1, 184.6.58, 和 184.6.62 與 FGFR3-IIIb 和 FGFR3-IIIc 的結合動力 學:
    克隆 184.6.1, 184.6.58, 和 184.6.62 也顯示對 Ba/F3-FGFR3 細胞、 RT112 細胞和 OPM2 細胞中 FGFR3 下游信號傳導的抑制提高。
     選擇克隆 184.6.1。將一個序列修飾 N54S 在殘基 54 處引入至 HVR H2 以提高可制 造性, 形成克隆 184.6.1N54S。克隆 184.6.1 和 184.6.1N54S 顯示相當的結合動力學 ( 在 Biacore 測定中測量 ) 和在 Ba/F3 細胞活力測定中相當的活性。生成另外的 HVR H2 變體 : 將 N54S 引入至克隆 184.6.58 中, 并將 N54G, N54A, 或 N54Q 引入至克隆 184.6.1 和 184.6.58 中。這些克隆在 Ba/F3 細胞活力測定中顯示與親代克隆 184.6.1 或 184.6.58 相當的活性。
     將 另 一 個 序 列 修 飾 D30E 引 入 至 克 隆 184.6.1N54S 的 HVR L1 中, 形成克隆 184.6.1NSD30E。 克 隆 184.6.1NSD30E 和 克 隆 184.6.1N54S 顯 示 與 親 代 克 隆 184.6.1 或 184.6.58 相當的結合動力學和在 BA/F3 細胞活力測定中顯示相當的活性。
     當用于本文時, “R3Mab” 是指抗 -FGFR3 抗體克隆 184.6.1N54S, 184.6.1, 或 184.6。 克隆 184.6.1N54S 用在提及 “R3Mab” 的附圖和試驗中, 例外是得到下列附圖中顯示的結 果的試驗 ( 其使用的抗體顯示在括號中 ) : 圖 9B( 克隆 184.6.1), 10( 克隆 184.6), 11A 和
     B( 克隆 184.6), 13( 克隆 184.6.1), 14A( 克隆 184.6.1), 14B, G, 和 H( 克隆 184.6), 19( 克 隆 184.6.1), 和 22B 和 C( 克隆 184.6.1)。
     測定抗體結合親和力的 BIAcore/ 表面等離振子共振 (SRP) 分析
     R3Mab 與 FGFR3 的結合親和力通過 Biacore/SRP 使用 BIAcoreTM-3000 儀器如 (52) 所述采用下列的改良測量。將 R3Mab 直接包被在 CM5 生物傳感器芯片上以達到大約 400 響 應單位 (RU)。對于動力學測量, FGFR3-IIIb 或 IIIc-His 蛋白的兩倍連續稀釋液 ( 從 67nM 起始 ) 在 25℃以 30μl/min 的流速注入 PBST 緩沖液中。使用簡單一對一朗格繆爾結合模 型 (BIAcore 評價軟件 3.2 版 (BIAcore Evaluation Software version 3.2)) 計算結合速 率 (Kon, per mol/s) 和解離速率 (Koff, per s)。平衡解離常數 (Kd, permol) 以 Koff/Kon 的比率計算。
     如下通過 Biacore/SRP 測量針對 FGFR3 的小鼠雜交瘤抗體的結合親和力。將人 FGFR3-IIIb 或 IIIc 偶聯至 BIACORETM CM5 傳感器芯片的三個不同的流動池 (flow cell, FC), FC2, FC3 和 FC4 以達到約 50RU 的響應單位 (RU)。使用生產商提供的試驗方案通過氨 基的隨機偶聯實現固定化。通過以 30μl/min 的流速注射 250nM-0.48nM 的范圍內以 2 倍 增量增加的系列溶液, 記錄在 25℃下雜交瘤來源的抗 FGFR3 鼠 IgG 或 Fab 片段與這些表面 結合的傳感圖。 在每次注射之間, 10mM 甘氨酸 -HCl pH 1.7 充當緩沖液以再生傳感器芯片。 從在 FC2, FC3 和 FC4 處觀察到的傳感圖中減去來自參照池 (FC1) 的信號。通過數據的非 線性回歸擬合根據 1 ∶ 1 朗格繆爾結合模型使用 BIAcore 評價軟件 (3.2 版 )( 由制造商提 供 ) 計算動力學常數。
     ELISA 結合研究
     將編碼人 FGFR1-IIIb, IIIc, FGFR2-IIIb 和 IIIc, FGFR3-IIIb 和 IIIc, 和 FGFR4 的 細胞外結構域 (ECD) 的 cDNA 克隆至基于 pRK 的載體中生成人 FGFR- 人 Fc 嵌合蛋白。通過 瞬時轉染中國倉鼠卵巢 (CHO) 細胞產生重組蛋白, 并經由蛋白 A 親和層析純化。 為了測試抗 體與人 FGFR 的結合, 將 Maxisorp 96 孔板 (Nunc) 用 50μl 2μg/ml 的 FGFR ECD- 人 Fc 嵌 合蛋白在 4℃下包被過夜。用磷酸鹽緩沖鹽水 (PBS)/3% BSA 封閉后, 加入 FGFR3 抗體并在 RT 下溫育 2 小時。使用 HRP- 綴合的抗 - 人 Fab 和 TMB 過氧化物酶產色底物 (colorigenic substrate)(KPL, Gaithersburg, MD) 檢測特異性結合的 FGFR3 抗體。
     為了測試針對 FGFR3 的抗體對 FGF/FGFR3 相互作用的效用, 將 FGFR3-Fc 嵌合蛋 白俘獲在包被以抗 - 人免疫球蛋白 Fcγ 片段特異性抗體 (Jackson Immunoresearch, West Grove, PA) 的 Maxisorp 測定板上。洗滌后, 將漸增量的 FGFR3 抗體加入至測定板并溫育 30 分鐘。然后, 加入 FGF1 或 FGF9 和肝素, 在 RT 下溫育 2 小時。洗滌測定板, 并與生物素化的 FGF1- 特異性多克隆抗體 (BAF232) 或生物素化 FGF9 抗體 (BAF273, R&DSystems) 溫育 1 小 時, 然后用鏈霉抗生物素蛋白 -HR 和 TMB 檢測。
     Ba/F3-FGFR3 穩定細胞的生成
     將 編 碼 全 長 人 FGFR3IIIb 或 IIIc 的 cDNA 克 隆 至 pQCXIP 載 體 (Clontech Laboratories, Mountain View, CA) 中 以 生 成 pQCXIP-FGFR3-IIIb 或 IIIc。 特 異 性 突 變, 即, 將 R248C, S249C, G372C, Y375C 和 K652E 經 QuickChange(Stratagene, La Jolla, CA) 引入至 cDNA 中。為了生成表達野生型或突變 FGFR3 的 Ba/F3 穩定的細胞, 將多種 pQCXIP-FGFR3 構建體與 VSV-G 質粒 (Clontech Laboratories) 共轉染至包裝細胞 GP2-293中。在用 2μg/ml 嘌呤霉素選擇 2 周后, 將表達野生型或突變 FGFR3 的細胞用藻紅蛋白 綴合的抗 - 人 FGFR3mAb(FAB766P, R&D Systems) 染色, 并通過熒光激活細胞分選 (FACS) 選擇用于功能測定。對于在 96 孔微量滴定板中的細胞增殖測定, 使用下列的細胞密度 : 對于表達野生型 FGFR3-IIIb 和 FGFR3-K652E 的細胞 : 5,000 細胞 / 孔 ; 對于其余的細胞 : 10,000 細 胞 / 孔。 細 胞 接 種 在 補 充 了 10 % 胎 牛 血 清, 10ng/ml FGF1 和 10μg/ml 肝 素 (Sigma-Aldrich, St.Louis, MO) 的 RPMI 1640 培養基中。R3Mab 以指定的濃度加入, 并且 小鼠雜交瘤 FGFR3 抗體在 FGFR3-IIIb 實驗中以 2000-0.49ng/ml( 以 4 倍連續稀釋液 ) 加 入, 在 FGFR3-IIIc 實驗中以 5000-1.2ng/ml( 以 4 倍連續稀釋液 ) 加入。溫育 72 小時后, 用 CellTiter-Glo(Promega, Madison, WI) 評價細胞活力。
     細胞增殖測定
     對 于 RT112, RT4 和 TCC-97-7 細 胞 的 增 殖 測 定, 將 3000 細 胞 / 孔 接 種 至 96 孔 微量滴定板中并使其貼壁過夜。然后用含有指定濃度的對照或 R3Mab 的低血清培養基 (0.5% FBS) 更換培養基。 溫育 4 天后, 向每孔中加入 1μCi[ 甲基 -3H] 胸苷 (PerkinElmer, Waltham, MA), 并另外溫育 16 小時。使用 Packard Filtermate Harvester 將細胞轉移 至 UniFilters, 并使用 TopCount(PerkinElmer) 測量摻入至生長細胞的基因組 DNA 中的 3 [ H]- 胸苷。在一些情況下, 在與抗體溫育 4 天后用 CellTiter-Glo(Promega) 評價細胞活 力。值表示為四次實驗的均值 +/-SE。
     克隆生長測定
     根據前述的試驗方案 (50) 評價 R3Mab 對細胞克隆形成能力的作用。簡言之, 400 個 UMUC-14 細胞接種至 6 孔板中補充了 10%胎牛血清的 DMEM 培養基中, 使其貼壁過夜。然 后加入在 0.1% BSA 培養基中稀釋的 R3Mab 或對照抗體至 10μg/ml 的終濃度。僅使用等體 積的 0.1% BSA 培養基 ( 模擬 (Mock)) 用作另一對照。細胞孵育約 12 天直至對照組中的細 胞形成足夠大的集落。集落用 0.5%結晶紫染色, 使用 GelCount(Oxford, UK) 定量集落的 數目和大小。直徑大于 120μm 的集落的數目表示為均值 +/-SEM(n = 12)。
     免疫沉淀和免疫印跡分析
     為了研究抗體對 FGFR3 信號傳導的作用, 將細胞在無血清培養基中饑餓過夜, 然 后開始處理。細胞與在 0.1% BSA(w/v), RPMI 1640 培養基中稀釋的任一種抗體, 或與僅 0.1% BSA 培養基 ( 模擬 ) 溫育。在 37℃下 3 小時后, 將 FGF1( 終濃度為 15ng/ml) 和肝素 ( 終濃度為 5-10μg/ml) 加入至一半樣品中。作為對照, 僅將相似體積的肝素加入至另一 半樣品中。繼續溫育 10min。通過抽吸移除上清液, 并用冰冷的 PBS 洗滌細胞, 然后在補充 了 1mM 原釩酸鈉和完全蛋白酶抑制劑混合物 (Roche Applied Science, Indianapolis, IN) 的 RIPA 緩沖液 (Upstate, Charlottesville, VA) 中裂解。通過離心清除裂解物中的不溶物 質。
     使 用 兔 多 克 隆 抗 體 (sc-123, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) 免 疫 沉 淀 FGFR3 并 通 過 十 二 烷 基 磺 酸 鈉 - 聚 丙 烯 酰 胺 凝 膠 電 泳 (SDS-PAGE) 和 Western 印跡進行分析。用針對磷酸 - 酪氨酸的單克隆抗體 (4G10, Upstate) 評價磷酸 化 FGFR3。 用 針 對 FGFR3 的 單 克 隆 抗 體 (sc-13121, Santa CruzBiotechnology) 探 測 總 FGFR3。使用下列的抗體探測 FGFR3 信號傳導途徑的磷酸化和激活 : 抗 -FGFRY653/654, 抗 -FRS2αY196, 抗 - 磷 酸 -p44/42MAPKT202/Y204, 抗 - 總 p44/42MAPK 和 抗 -AKTS473 獲 自 CellSignalingTechnology( 細胞信號傳導技術 )(Danvers, MA) ; 和抗 - 總 FRS2α(sc-8318) 購 自 Santa Cruz Biotechnology(Santa Cruz 生物技術 )(Santa Cruz, CA)。印跡使用化學 發光底物 (ECL Plus, Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ) 顯色。
     抗體表位作圖
     為了確定 R3Mab 的表位, 合成 13 種重疊肽 ( 每種的長度為 15 個氨基酸 ) 以覆蓋人 FGFR3 從殘基 138 至 310 的細胞外結構域。所述肽在 C- 端被生物素化, 并且在鏈霉抗生物 素蛋白板 (Pierce, Rockford, IL) 上俘獲過夜。在用 PBS/3% BSA 封閉后, 所述板與 R3Mab 溫育, 并使用 HRP- 綴合的抗 - 人 IgG(Jackson Immunoresearch) 和 TMB 過氧化物酶產色底 物 (KPL, Gaithersburg, MD) 檢測。
     小鼠抗人 FGFR3 雜交瘤抗體 1G6, 6G1, 和 15B2 在 ELISA 測定中測試以鑒定它們的 結合表位。1G6, 6G1 和 15B2 結合人 FGFR3IgD2-IgD3(IIIb 和 IIIc 同種型兩者 ), 而 5B8 僅 結合人 FGFR3-IIIb 的 IgD2-IgD3。在競爭測定中, 1G6, 6G1 和 15B2 彼此競爭與人 FGFR3 的 結合, 表明 1G6, 6G1 和 15B2 具有重疊的表位。沒有一種雜交瘤抗體與噬菌體抗體 184.6 競 爭, 表明該雜交瘤抗體具有與 184.6 不同的一個或多個表位。
     小鼠抗 -FGFR3 抗體 1G6, 6G1, 和 15B2 的制備和分子克隆
     將 BALB/c 小鼠用懸浮在單磷酰基脂質 A/ 海藻糖 dicrynomycolate(trehalose dicrynomycolate) 佐劑 (Corixa, Hamilton, MT) 中的 2.0μgFGFR3-IIIb(rhFGFR3(IIIB)/ Fc 嵌 合 體 ( 獲 自 R&D Systems, catalog#1264-FR, lot#CYH025011), 或 用 2.0μg FGFR3-IIIc(rhFGFR3(IIIc)/Fc 嵌 合 體 ( 獲 自 R&D Systems, catalog#766-FR, lot#CWZ055041) 在每只后足墊中一周兩次免疫 12 次。最后一次強化免疫后 3 天, 將腘 淋巴結與小鼠骨髓瘤細胞系 P3X63Ag.U.1 經電融合 (Hybrimune, Cyto Pulse Sciences, GlenBurnie, Maryland) 融 合。 使 用 在 來 自 雜 交 瘤 選 擇 試 劑 盒 (StemCell Technologies, Inc., Vancouver, BC, Canada) 的培養基 D 中的次黃嘌呤 - 氨基蝶呤 - 胸苷 (HAT) 選擇從未融合的腘淋巴結或骨髓瘤細胞中選擇融合的雜交瘤細胞。通過 ELISA 初步 篩選培養上清液結合 FGFR3-IIIb 和 FGFR3-IIIc 的能力, 隨后通過 FACS 篩選目的雜交瘤對 轉染的 FGFR3-IIIb 的 Ba/F 細胞和對照 Ba/F 染色的能力, 以及抗體阻斷活性。然后將選擇 的雜交瘤通過有限稀釋進行克隆。
     使用 RNeasy Mini 試劑盒 (Qiagen, 德國 ) 從產生小鼠抗人 FGFRIII 單克隆抗體 1G6 和 15B2 的雜交瘤細胞中提取總 RNA。使用 RT-PCR 采用下列的簡并引物擴增可變輕鏈 (VL) 和可變重鏈 (VH) 結構域 :
     1G6 :
     輕鏈 (LC) 正向 : 5’ -GTCAGATATCGTKCTSACMCARTCTCCWGC-3’ (SEQ ID NO : 195)
     重鏈 (HC) 正向 :
     5’ -GATCGACGTACGCTGAGATCCARYTGCARCARTCTGG-3’ (SEQ ID NO : 196)
     6G1 :
     輕鏈 (LC) 正向 : 5’ -GTCAGATATCGTGCTGACMCARTCTCC-3’ (SEQ ID NO : 197)
     重鏈 (HC) 正向 :
     5’ -GATCGACGTACGCTGAGATCCARYTGCARCARTCTGG-3’ (SEQ ID NO : 198)
     15B2 :輕鏈 (LC) 正向 : 5’ -GTACGATATCCAGATGACMCARTCTCC-3’ (SEQID NO : 199)
     重鏈 (HC) 正向 :
     5’ -GATCGACGTACGCTGAGATCCARYTGCARCARTCTGG-3’ (SEQ ID NO : 200)
     對于所有三種克隆的輕鏈和重鏈反向引物如下 :
     輕鏈反向 : 5’ -TTTDAKYTCCAGCTTGGTACC-3’ (SEQ ID NO : 201)
     重鏈反向 :
     5’ -ACAGTGGGCCCTTGGTGGAGGCTGMRGAGACDGTGASHRDRGT-3’ (SEQ ID NO : 202)。
     正向引物對 VL 和 VH 區的 N- 端氨基酸序列特異。LC 和 HC 反向引物設計用于分別 與恒定輕鏈 (CL) 和恒定重鏈結構域 1(CH1) 中的區域退火, 它們在物種間是高度保守的。
     將 擴 增 的 VL 克 隆 至 包 含 人 κ 恒 定 結 構 域 的 pRK 哺 乳 動 物 細 胞 表 達 載 體 中 (Shields 等, (2000)J.Biol.Chem.( 生物化學雜志 )276 : 659)。將擴增的 VH 插入至編碼全 長人 IgG1 恒定結構域的 pRK 哺乳動物細胞表達載體中。使用常規方法確定重鏈和輕鏈的 序列。
     結晶、 結構測定和修正
     將人 FGFR3-IIIb ECD( 殘基 143-374) 克隆至 pAcGP67A 載體 (BDBioscience, San Jose, CA) 中, 在 T.ni Pro 細胞中生產并使用 Ni-NTA 柱然后用尺寸排阻層析純化。R3Mab Fab 在大腸桿菌中表達并經蛋白 G 親和柱、 SP 瓊脂糖柱和 Superdex 75 柱連續純化。通過 將 Fab 與過量的 FGFR3ECD 溫育產生 Fab-FGFR3 復合體, 然后該復合體脫糖基化并在 20mM TrisClpH 7.5 和 200mM NaCl 緩沖液中經 Superdex-200 尺寸分離柱 (sizing column) 純 化。匯集包含復合體的級分并濃縮至 20mg/ml, 并用于結晶試驗中。結構測定中使用的晶 體在 4℃下使用蒸汽擴散法從下列條件中生長 : 0.1M 二甲基砷酸鈉 pH 6.5, 40% MPD 和 5% PEG8000。 數據使用 HKL2000 和 Scalepack 處理 (56)。 使用程序 Phaser(57) 和 1RY3(FGFR3) 和 1N8Z(Fab 片段 ) 的坐標采用分子置換解析結構。使用程序 Coot(58) 完成建模, 使用程 序 Refmac(59) 將結構修正為 20.4% /24.3%的 R/Rfree。坐標和結構因子以登錄代碼 3GRW 存放在蛋白數據庫 (Protein Data Bank) 并且還公開在于 2009 年 3 月 25 日提交的 USSN 61/163,222 中, 兩者的內容通過引用合并入本文中。
     ADCC 測定
     人 PBMC 通過肝素化血液的蔗聚糖 (Ficoll) 梯度離心分離, 并且使用作為靶標 的多發性骨髓瘤細胞系 OPM2 或 KMS11 或膀胱癌細胞系 RT112 或 UMUC-14 和作為效應細 胞 的 PBMC 以 1 ∶ 100 的 靶 標 ∶ 效 應 子 比 率 測 量 ADCC。 靶 細 胞 (10,000 細 胞 / 孔 ) 用 R3Mab 或用對照人 IgG1 在 37℃下處理 4 小時。通過使用 CytoTox-ONE 均質膜完整性測定 (HomogeneousMembrane Integrity Assay) 根據生產商 (Promega, Madison, WI) 的說明書通 過測量 LDH 釋放來測定細胞毒性。結果使用下述公式表示為特定細胞裂解的百分比 : 細胞 毒性 (% ) = [( 實驗性裂解 - 實驗性自發裂解 )/( 靶標最大裂解 - 靶標自發裂解 )]x100, 其 中自發裂解是在缺少抗體的條件下的非特異性細胞裂解, 并且靶標最大裂解由 1% Triton X-100 誘發。
     結果
     FGFR3 的可誘導 shRNA 敲低減少了體內膀胱癌生長
     作為評價 FGFR3 對體內腫瘤生長的重要性的開端, 我們檢驗了體外 FGFR3 敲低的作用。在表達 WT(RT112, RT4, SW780) 或突變的 (UMUC-14, S249C 突變 )FGFR3 的膀胱癌細 胞系中, 幾種 FGFR3 小干擾 (si)RNA 有效下調 FGFR3。在所有四種細胞系中 FGFR3 敲低顯著 地抑制培養物的增殖 ( 圖 15)。下一步, 我們產生了表達強力霉素 - 可誘導性 FGFR3shRNA 的穩定的 RT112 細胞系。強力霉素對三種獨立的 FGFR3shRNA 的誘導消除了 FGFR3 表達, 而 靶向 EGFP 的對照 shRNA 的誘導沒有作用 ( 圖 7A)。在缺少外源性 FGF 的條件下, 強力霉素 3 處理減少了表達不同 FGFR3shRNA 的細胞的 [ H]- 胸苷摻入, 但對對照 shRNA 的細胞無作用 ( 圖 7B), 這證實 FGFR3 敲低抑制增殖。對數生長的 RT112 細胞的進一步分析表明用強力霉 素處理 72hr 的 FGFR3 敲低顯著地和特異性地減少了處于細胞周期的 S 和 G2 期的細胞的百 分比, 而伴有處于 G1 期的細胞增加 ( 圖 7C)。使用兩種其他 FGFR3shRNA 觀察到相似的作用 ( 圖 16A)。沒有檢測到顯著數目的具有亞二倍體 DNA 含量的細胞, 表明凋亡水平沒有變化。 因此, FGFR3 敲低對 RT112 細胞的增殖的抑制作用主要歸因于細胞周期進程的減緩。
     我們下一步評價了 FGFR3 敲低對在小鼠中預先建立的 RT112 腫瘤異種移植物的生 長的作用。FGFR3 敲低實質上和特異性地抑腫瘤生長 ( 圖 7D, 上部圖片和圖 16B)。45 天腫 瘤樣品的分析證實了與對照 shRNA 相比 FGFR3shRNA 的強力霉素誘導后的有效 FGFR3 敲低 ( 圖 7D, 底部圖片 )。這些結果證明 FGFR3 在體外和體內對于 RT112 膀胱癌細胞的生長均是 至關重要的。
     阻斷抗 -FGFR3 單克隆抗體的生成
     為了進一步檢驗 FGFR3 在腫瘤生長中的重要性并探究該受體作為治療靶標的可 能性, 我們使用噬菌體展示方法開發了一種拮抗性抗 -FGFR3 單克隆抗體 ( 稱為 R3Mab)。 我 們基于其阻斷 FGFR3 的配體結合和二聚作用兩者的能力, 和其不僅抑制 WT FGFR3 而且抑 制該受體的最普遍的癌癥相關突變體的特有能力選擇了該特殊抗體 ( 見下 )。R3Mab 靶向 FGFR3 的細胞外 IgD2 和 IgD3 結構域, 它們對于 FGF 結合是必需的且是足夠的 (4)。R3Mab 結合人 FGFR3 的 IIIb 和 IIIc 兩種同種型, 而沒有顯示與 FGFR1, FGFR2 或 FGFR4 的可檢測 到的結合 ( 圖 8A)。Biacore 分析表明 R3Mab 與鼠、 食蟹猴和人 FGFR3-IIIc 具有類似的表 觀親和力 ( 未顯示的數據 )。R3Mab 對人 FGFR3 的親和力顯示在表 2 中。
     表 2. 通過 BIAcore 分析測定的 R3Mab 對人 FGFR3 的親和力。
    我們下一步測試了 R3Mab 阻斷 FGFR3 與 FGF1 和 FGF9 結合的能力。 R3Mab 強力地抑 制 FGF1 與 FGFR3-IIIb 和 -IIIc 的結合, 其半最大抑制濃度 (IC50) 分別為 0.3nM 和 1.7nM( 圖 8B, C)。同樣, R3Mab 有效阻斷 FGF9 與 FGFR3-IIIb 和 -IIIc 的結合, 其 IC50 分別為 1.1nM 和 1.3nM( 圖 8D, E)。
     R3Mab 抑制 WT FGFR3 和其最普遍的癌癥相關突變變體
     為了檢驗 R3Mab 是否抑制由 WT 或突變的 FGFR3 驅動的細胞增殖, 我們利用了下面
     的觀察結果, 即鼠原 -B 細胞 Ba/F3 中的異位 FGFR3 表達賦予白介素 (IL)-3- 不依賴性的、 FGF1 依賴性的增殖和存活 (29)。在缺少 FGF1 和 IL-3 的條件下, 穩定表達 WT FGFR3 的 Ba/ F3 細胞不能成活, 而 FGF1 極大地增強了它們的增殖 ( 圖 9A)。R3Mab 以劑量依賴性方式特 異性地阻斷 FGF1- 刺激的 Ba/F3-FGFR3 細胞增殖 ( 圖 9A)。我們下一步評價了在這些細胞 中 R3Mab 對 FGFR3 信號傳導的影響。FGF1 誘導 FGFR3 的磷酸化和激活, 伴有 p44/42MAPK 的 激活, 而 R3Mab 有效地抑制兩種分子的激活 ( 圖 9B)。
     在膀胱癌中, FGFR3 的體細胞激活突變集中在 IgD2 和 IgD3 之間的連接區、 細胞外 近膜結構域、 或激酶結構域內 ( 圖 9C)。細胞外錯義置換最常見地導致未配對的半胱氨酸, 導致 FGFR3 的配體不依賴性二聚作用。這些突變顯著地導致不同水平的組成型 FGFR3 激 活, 可能歸因于對細胞質激酶結構域的取向的差異性影響 (30, 31)。最頻繁發生的突變是 S249C, Y375C, R248C, G372C, 和 K652E, 它們總共占膀胱癌中所有 FGFR3 突變的 98% (32)。 我們推斷最適治療劑應當不僅阻斷 WT FGFR3 蛋白 ( 其在某些癌癥中過表達 ), 而且還阻斷 最多見的腫瘤相關的 FGFR3 突變體。為了進一步評價 R3Mab, 我們生成了穩定表達 5 種最 常見 FGFR3 突變變體的每一種的 Ba/F3 細胞系。所有突變體在細胞表面以相似的水平表 達, 并且半胱氨酸突變體在沒有配體的情況下自發地二聚化 ( 未顯示的數據 )。表達不同 半胱氨酸突變體的細胞系顯示對 FGF1 的生長反應是可變的, 這與早先的發現相符合 (30, R248C 31)。如以前所報道的 (33), 表達 FGFR3 的細胞顯示組成型的、 配體不依賴性的增殖, 并 S249C 且對 FGF1 沒有反應 ( 圖 9D)。同樣, 最頻繁發生的突變 FGFR3 , 賦予配體不依賴性的增 殖 ( 圖 9E)。R3Mab 顯著地抑制由任一種突變體驅動的組成型增殖 ( 圖 9D, E)。表達近膜 G372C Y375C 結構域突變 FGFR3 ( 圖 9F) 或 FGFR3 ( 圖 9G) 的細胞的增殖需要 FGF1, 并且它們的生 K652E 長被 R3Mab 完全阻斷。表達 FGFR3 的細胞顯示弱的配體不依賴性增殖和響應于 FGF1 的 K652E 明顯生長 (33)。R3Mab 不影響 FGFR3 的弱基礎活性 ( 未顯示的數據 ), 但幾乎消除了由 該突變體介導的配體誘導的增殖 ( 圖 9H)。因此, R3Mab 具有抑制 WT FGFR3 和 FGFR3 的常 見的癌癥相關突變體兩者的獨特能力。此外, R3Mab 不顯示可檢測到的激動劑活性。
     作為單獨的嘗試, 我們生成和表征了多種鼠 - 抗 - 人 FGFR3 雜交瘤抗體。沒有一 種雜交瘤抗體可以抑制我們測試的所有癌相關 FGFR3 突變體 ( 圖 17), 它們也不與 R3Mab 共 享重疊表位。
     此外, 所有雜交瘤抗體顯示激動劑活性, 強烈地刺激癌相關的 FGFR3 突變體 R248C 和 S249C 的增殖, 并顯示對突變體 Y375C 和 G370C 的增殖的一些刺激。這些雜交瘤抗體顯 示有差別水平的拮抗和激動作用, 這取決于所測試的 FGFR3 突變體, 如下所示 :
     1G6 FGFR3-IIIb 野生型 FGFR3-IIIb R248C FGFR3-IIIb S249C FGFR3-IIIb Y375C 抑制 2X 刺激 2X 刺激 1.2-1.5X 刺激 6G1 抑制 4-5X 刺激 4-5X 刺激 1.2-1.5X 刺激 15B2 抑制 3-4X 刺激 4-5X 刺激 1.2-1.5X 刺激95102378767 A CN 102378777 FGFR3-IIIb K652E FGFR3-IIIc FGFR3-IIIc G370C
     50%抑制 抑制 無作用說明書60-70%抑制 抑制 20-30%抑制 抑制 抑制 10-2-%抑制92/107 頁因此, 所述雜交瘤抗體顯示了對由不同 FGFR3 變體驅動的 Ba/F3 細胞細胞增殖的 不可預測的差別作用。
     小鼠 - 抗 - 人 FGFR3 雜交瘤抗體的表征
     小鼠抗 - 人 FGFR3 雜交瘤抗體進一步表征如下 :
     (1) 在測試抗 -FGFR3 鼠雜交瘤抗體抑制 FGF1 與人 FGFR3-IIIb 和 IIIc 同種型結合 的能力的測定中, 抗體 1G6, 6G1 和 15B2 能夠以劑量依賴性方式阻斷 FGF1 與人 FGFR3-IIIb 和 IIIc 同種型的結合。當在約 2000 至 0.49ng/ml 的抗體濃度范圍內測試時, 抗體 1G6, 6G1 和 15B2 以 0.69, 0.87 和 0.72nM 的 IC50 值阻斷 FGF1 與 FGFR3-IIIb 的結合。當在約 5000 至 1.2ng/ml 的抗體濃度范圍內測試時, 抗體 1G6, 6G1 和 15B2 分別以 0.57, 3.4 和 0.7nM 的 IC50 值阻斷 FGF1 與 FGFR3-IIIc 的結合。
     (2) 在 測 試 抗 -FGFR3 鼠 雜 交 瘤 抗 體 抑 制 FGF9 與 人 FGFR3-IIIb 和 IIIc 同 種 型結合的能力的測定中, 抗體 1G6, 6G1 和 15B2 以劑量依賴性方式有效地阻斷 FGF1 與人 FGFR3-IIIb 和 IIIc 同種型的結合。當在約 2000 至 0.49ng/ml 的抗體濃度范圍內測試時, 抗體 1G6, 6G1 和 15B2 分別以 0.13, 0.16, 和 0.07nM 的 IC50 值阻斷 FGF9 與 FGFR3-IIIb 的 結合。當在約 5000 至 1.2ng/ml 的抗體濃度范圍內測試時, 抗體 1G6, 6G1 和 15B2 分別以 0.13, 0.11, 和 0.07nM 的 IC50 值阻斷 FGF9 與 FGFR3-IIIc 的結合。
     (3) 使用 Biacore 分析測定全長抗 -FGFR3 鼠雜交瘤抗體 1G6, 6G1 和 15B2 的結合 親和力。這一分析的結果顯示在表 3 中。
     表 3.
    (4) 在測試抗 -FGFR3 鼠雜交瘤抗體抑制由人 FGFR3-IIIb 或 IIIc 驅動的 Ba/F3 細 胞增殖的能力的測定中, 抗體 1G6, 6G1 和 15B2 能夠以劑量依賴性方式阻斷由人 FGFR3-IIIb 或 IIIc 驅動的 Ba/F3 細胞增殖。當在約 0.01 至 100ug/ml 的抗體濃度范圍內測試時, 抗體 1G6, 6G1 和 15B2 分別以 3-5nM, 3nM, 和 6-8nM 的 IC50 值阻斷由 FGFR3-IIIb 驅動的 Ba/F3 細胞增殖, 并且分別以 10-35nM, 24nM, 和 60nM 的 IC50 值阻斷由 FGFR3-IIIc 驅動的 Ba/F3
     細胞增殖。
     (5) 在測試抗 -FGFR3 鼠雜交瘤抗體抑制表達人 FGFR3-IIIb 的 Ba/F3 細胞中的 FGF1- 誘導的信號傳導的能力的測定中, 當在約 0.25 至 6.75ug/ml 的抗體濃度范圍內測試 時, 抗體 1G6, 6G1 和 15B2 能夠以劑量依賴性方式阻斷表達人 FGFR3-IIIb 的 Ba/F3 細胞中 的 FGF1- 誘導的信號傳導。在該實驗中使用 25ng/ml 的 FGF1。在缺少 FGF1 的條件下, 抗體 處理對 FGFR3 激活沒有作用。
     (6) 在測試抗 -FGFR3 鼠雜交瘤抗體抑制表達人 FGFR3-IIIc 的 Ba/F3 細胞中的 FGF1- 誘導的信號傳導的能力的測定中, 當在約 0.25 至 6.75ug/ml 的抗體濃度范圍內測試 時, 抗體 1G6, 6G1 和 15B2 能夠以劑量依賴性方式阻斷表達人 FGFR3-IIIc 的 Ba/F3 細胞中 的 FGF1- 誘導的信號傳導。在該實驗中使用 25ng/ml 的 FGF1。在缺少 FGF1 的條件下, 抗體 處理對 FGFR3 激活沒有作用。
     R3Mab 與 FGFR3 相互作用的結構基礎
     為了了解 R3Mab 與 FGFR3 相互作用的模式, 我們合成了一組跨越 FGFR3-IIIb IgD2 和 D3 區的 13 個重疊肽, 并測試了它們與 R3Mab 的結合。肽 3( 殘基 164-178) 和 11( 殘 基 269-283) 顯示與 R3Mab 的特異性結合, 其中肽 3 具有較強的相互作用 ( 圖 10A), 這表明 FGFR3 上的相應區對于 R3Mab 的識別是至關重要的。以前對與 FGF2 形成復合體的 FGFR1 的 結晶學研究鑒定了參與與 FGF 和肝素直接結合以及受體二聚作用的關鍵性受體殘基 (34)。 FGFR3 肽 3 和 11 與 FGFR1 中功能上重要的位點的比對揭示了這些肽涵蓋對于直接 FGF2 結 合、 受體二聚作用以及與肝素的相互作用至關重要的相應 FGFR1 殘基 ( 圖 10B)。這些數據 表明在 FGFR3 上 R3Mab 的表位與參與配體締合和受體 - 受體相互作用的受體殘基重疊。
     我們下一步結晶了 R3Mab 的 Fab 片段和人 FGFR3-IIIb 的細胞外 IgD2-D3 區之間的 復合體, 并以 和 解析度測定了 X- 線結構 ( 圖 10C, D; 表 4)。在該復合體中, 約的溶劑可及表面積分別包埋在 FGFR3 和 Fab 中。約 80 %被包埋的界面涉及IgD2, 而其余的限定在接頭和 IgD3 區。在復合體的 Fab 側, 約 40%被包埋的界面涉及互補 決定區 (CDR)-H3, 20%涉及 CDR-H2, 20%涉及 CDR-L2, 較少的貢獻來自其他 CDRs 和構架殘 基。值得注意的是, 來自 CDR-H3 的氨基酸 (AAs) 形成兩個 β- 鏈, 其延長了 IgD2 的 β- 折 疊 ( 圖 10D)。Fab 與構成 FGFR3 的 FGF 結合位點的 AAs 和形成受體二聚化界面的殘基相互 作用, 如以前在多種二聚體 FGF : FGFR 復合體 ( 例如, PDB 代碼 1CVS, (34) ; 和圖 10C, 灰色 / 陰影交叉線和深灰色的區域 ) 中所鑒定的那樣。通過結晶學鑒定的相互作用界面與基于肽 的數據完全一致 ( 圖 18A, B)。總之, 這些結果揭示了 R3Mab 如何抑制配體結合, 并且進一 步表明 R3Mab 與 FGFR3 的結合可能防止受體二聚化。接觸 R3Mab 的 FGFR3 氨基酸顯示在表 5 中。對該結構的結晶學坐標以登錄代碼 3GRW 保存在蛋白質數據庫 (Protein Data Bank) 中。
     表4: 結晶學分析的概述
    
    
    
    
    
    
    
    
    
    
    
    a b cRsym =∑ |I-|/ ∑ I。 是獨特反射的對稱相關觀測的平均強度。 括號中的數字是指最高的解析度對象 (resolution shell)。R =∑ |Fo-Fc|/ ∑ Fo。Rfree 作為 R 計算, 但用于從所有修正中剔除的 5%的反射。 表5: FGFR3 中與 R3Mab 接觸的殘基 殘基 界面中殘基的被包埋的表面 THR ARG ARG MET LYS LYS 154 155 158 159 161 162 0.10 16.50 105.40 6.00 52.50 1.70LEU 163 12.30
     LEU 164 55.10
     ALA 165 10.10
     VAL 166 10.60
     PRO 167 45.50
     ALA 168 22.60
     ALA 169 63.60
     ASN 170 75.40
     THR 171 83.00
     VAL 172 1.70
     ARG 173 91.70
     PHE 174 1.50
     ARG 175 95.60
     PRO 177 15.90
     GLY 202 2.10
     LYS 205 63.40
     ARG 207 67.60
     GLN 210 31.60
     SER 212 0.40
     VAL 214 26.40
     GLU 216 48.90
     SER 217 1.80
     TYR 241 15.90
     LEU 246 3.10
     GLU 247 1.80
     ARG 248 46.90
     TYR 278 32.20
     SER 279 1.80
     ASP 280 19.80
     ALA 281 3.00
     GLN 282 24.80
     PRO 283 0.50
     SER 314 1.20
     GLU 315 82.60
     SER 316 33.20
     VAL 317 56.60
     GLU 318 51.50
     我們將 R3Mab-FGFR3 結構與以前發表的與 FGF1 形成復合體的 FGFR3-IIIc 的結構 (4, 35) 進行了比較 ( 圖 10E, 10F)。抗體 - 受體和配體 - 受體復合體的重疊揭示了除了區分 FGFR3-IIIc 與 FGFR3-IIIb 的區域以外, 在各個受體結構域內沒有顯著的構象差異 ; 然 而, IgD3 相對于 IgD2 的定向極大地不同 ( 圖 10E, 白色和灰色 ; 圖 10F, 白色和灰色的網 )。 由于 IgD2 和 IgD3 的相對位置對于配體結合是至關重要的, 因此在 R3Mab 結合時 IgD3 所采 取的交替構象可能提供防止配體與 FGFR3 相互作用的另外的機制。
     R3Mab 抑制膀胱癌細胞中的內源性 WT 和突變的 FGFR3
     為了評價 R3Mab 是否能夠抑制膀胱癌細胞中的 FGFR3 功能, 我們首先檢驗了 RT112 和 RT4 細胞系, 它們表達 WT FGFR3。R3Mab 強力地抑制 RT112 細胞的 [3H]- 胸苷摻入 ( 圖 11A) 并且發揮明顯的但較為適度的對 RT4 細胞增殖的抑制 ( 圖 19A)。為了研究 R3Mab 對 FGFR3 激活的作用, 我們檢驗了 RT112 細胞中 FGFR3 的磷酸化。與 Ba/F3-FGFR3 細胞中的結 果 ( 圖 9B) 一致, R3Mab 顯著地減少了 FGF1- 誘導的 FGFR3 磷酸化 ( 圖 11B)。我們下一步 檢驗了 FRS2α, AKT, 和 p44/42MAPK 的磷酸化, 它們三個是 FGFR3 信號傳導的下游介質。在 RT112 細胞中 FGF1 強力地激活這些分子, 而 R3Mab 顯著地消除這種激活 ( 圖 11B)。同樣, 在 RT4 細胞中 R3Mab 抑制 FGF1- 誘導的 FGFR3 和 MAPK 的磷酸化 ( 圖 19B)。
     我們下一步研究了 R3Mab 是否能夠在人膀胱癌細胞中抑制內源性突變的 FGFR3 的 激活。在膀胱癌中 S249C 是最常見的 FGFR3 突變 ( 圖 9C)。兩種可獲得的細胞系 UMUC-14 和 TCC-97-7 攜帶突變的 FGFR3S249C 等位基因 ( 參考文獻 36 和未顯示的數據 )。盡管 R3Mab 不影響培養的 UMUC-14 細胞的對數生長 ( 未顯示的數據 ), 但其明顯地減少了這些細胞的克 隆生長 ( 圖 11C)。具體地, 與對照抗體相比, R3Mab 減少了直徑大于 120μm 的集落數目大 約 77% ( 圖 11D)。此外, R3Mab 抑制培養的 TCC-97-7 細胞的 [3H]- 胸苷摻入 ( 圖 19C)。
     據報道 S249C 突變導致 FGFR3 的配體不依賴性激活 (26, 30)。實際上, 在 UMUC-14 S249C 細胞和 TCC-97-7 細胞中, FGFR3 被組成型地磷酸化, 無論是否用 FGF1 處理, 而在兩種細 S249C 胞系中與對照抗體相比, R3Mab 減少了 FGFR3 的組成型磷酸化 ( 圖 11E, 19D)。 S249C
     R3Ma 抑制 FGFR3 的二聚體形成
     考慮到突變體 FGFR3S249C 可能經歷二硫化物連接的配體不依賴性二聚作用, R3Mab S249C 抑制膀胱癌細胞中組成型 FGFR3 信號傳導和增殖的能力是令人驚奇的 (26, 30)。為了 S249C 探尋 R3Mab 如何抑制 FGFR3 , 我們在 UMUC-14 細胞中檢驗了 R3Mab 對該突變體的低聚 體狀態的作用。在還原條件下, FGFR3S249C 作為~ 97kDa 的單一條帶遷移, 與單體大小一致 ( 圖 12A)。在非還原條件下, 在用對照抗體處理的細胞中, 一個大的 FGFR3S249C 級分作為~ 200kDa 的條帶出現, 無論是否添加 FGF1, 這表示組成型的二聚體狀態 ( 圖 12A)。R3Mab 處 理實質上地減少了二聚體的量, 伴有單體的增加 ( 圖 12A)。與此相一致地, 在 TCC-97-7 細 S249C 胞中 R3Mab 減少了 FGFR3 二聚體的水平, 無論是否用 FGF1 處理 ( 圖 19E)。
     在膀胱癌細胞中 R3Mab 如何減少 FGFR3S249C 二聚體水平?一種可能的解釋是其通 過抗體誘導的 FGFR3 內在化和通過內體或溶酶體運輸而破壞了 FGFR3S249C 二聚體。我們通 過藥理學干預胞吞作用來測試了這種可能性。但 R3Mab 在用多種胞吞作用抑制劑預處理的 UMUC-14 細胞中仍然降低了二聚體的量, 盡管基本上阻斷了 FGFR3S249C 內在化 ( 圖 20A, B)。 S249C 因此, R3Mab 的二聚體破壞不依賴于胞吞作用。另一種可能的解釋是細胞的 FGFR3 可能 S249C 以動態的單體 - 二聚體平衡存在 ; 因此, R3Mab 與單體 FGFR3 的結合可能阻止了二聚體 形成并且因此使該平衡朝向單體狀態改變。為了檢驗這種可能性, 我們使用了非細胞通透 劑 5, 5’ 二硫代雙 2- 硝基苯甲酸 (DTNB), 其選擇性地與未配對的半胱氨酸的游離巰基反應并阻斷該游離的巰基 (37)。用 DTNB 處理 UMUC-14 細胞導致 FGFR3S249C 單體的積聚而二聚體 減少 ( 圖 12B), 表明 FGFR3S249C 以單體和二聚體之間的動態平衡存在。
     為了測試 R3Mab 是否影響該平衡, 我們生成了一種包含 FGFR3S249C 的 IgD2-D3 結構 域的可溶性重組蛋白, 并且通過尺寸排阻層析分離了該二聚體。我們將該二聚體與緩沖液 或抗體在存在非常低濃度的還原劑 (25μMof DTT) 的條件下溫育, 并通過 SDS-PAGE 在非還 原條件下分析該受體的低聚體狀態。與模擬 (mock) 或抗體對照相比, R3Mab 顯著地加速了 S249C 代表單體 FGFR3 的~ 25kDa 條帶的出現, 同時減少了~ 50kDa 二聚體 ( 圖 12C) ; 實際上, 在 R3Mab 的存在下, 到 2hr 時基本上更完全地減少了二聚體。這些結果表明 R3Mab 以利于 單體的方向改變了 FGFR3S249C 的單體和二聚體狀態之間的平衡。
     R3Mab 不促進 FGFR3 下調
     我們通過分析 FGFR3 抗體處理的細胞中 FGFR3 內在化和降解來檢驗 R3Mab( 克隆 184.6.1) 和抗 -FGFR3 雜交瘤抗體對 FGFR3 下調的作用。將表達野生型 FGFR3(RT112) 或突 變的 FGFR3(TCC97-7 中的 S249C) 的膀胱癌細胞系用 R3Mab 或雜交瘤抗體 1G6 或 6G1 處理 4 至 24 小時, 然后收獲細胞裂解物用于總 FGFR3 水平的 western 印跡分析。用 R3Mab 處理 不減少 FGFR3 水平, 而用雜交瘤 mabs 1G6 和 6G1 處理顯著地降低 FGFR3 水平。這些結果提 示 R3Mab 不促進 FGFR3 下調而 mabs 1G6 和 6G1 的確促進 FGFR3 受體內在化和下調。 在單獨 的實驗中, 使用 FACS 分析檢驗表面 FGFR3 水平。R3Mab( 克隆 184.6.1) 處理 UMUC-14 細胞 ( 包含 FGFR3S249C 突變 )24 小時后, 細胞表面 FGFR3 水平輕微升高。這些結果證明 R3Mab 處理不促進 FGFR3 下調。
     在多個腫瘤模型中 R3Mab 抑制生長和 FGFR3 信號傳導
     下一步, 我們檢驗了 R3Mab 在體內對膀胱癌細胞的生長的作用。我們用 RT112 細 胞 ( 其表達 WT FGFR3) 注射 nu/nu 小鼠, 使腫瘤生長至~ 150mm3 的平均體積, 并對動物給 予賦形劑或 R3Mab 一周兩次。在 27 天時與賦形劑對照相比, 以 5 或 50mg/kg 的 R3Mab 處理 分別抑制腫瘤生長約 41%或 73% ( 圖 13A)。處理后 48hr 或 72hr 采集的腫瘤裂解物的分 析顯示 R3Mab 顯著降低磷酸化 FRS2α 的水平 ( 圖 13B)。有趣的是, 在 R3Mab- 處理的腫瘤 中, 總 FRS2α 蛋白水平也較低, 提示抑制 FGFR3 可以進一步導致 FRS2α 的下調。R3Mab 還 降低腫瘤中磷酸化 MAPK 的量, 而不影響總 MAPK 水平 ( 圖 13B)。因此, R3Mab 抑制 RT112 腫 瘤異種移植物的生長并阻斷由 WT FGFR3 引起的信號傳導。
     我們下一步研究了 R3Mab 對表達突變 FGFR3 的異種移植物的生長的作用。 R3Mab 處 S249C 理極大地延緩了 Ba/F3-FGFR3 腫瘤的進展 ( 圖 13C)。此外, R3Mab 顯著地抑制 UMUC-14 膀胱癌異種移植物的生長 ( 圖 13D)。為了評價 R3Mab 是否在體內影響 FGFR3S249C 激活, 我 S249C 們評估了處理后 24hr 或 72hr 采集的腫瘤裂解物中的 FGFR3 二聚體水平。在非還原條 S249C 件下, 與對照組相比, 在 R3Mab 處理的腫瘤中 FGFR3 二聚體的量大量降低, 而通過在還原 S249C 條件下檢測到的量判斷, 總 FGFR3 水平顯示很小的變化 ( 圖 13E)。 與細胞培養中的結果 S249C 相反, 在腫瘤裂解物中沒有觀察到明顯的 FGFR3 單體的積聚 ( 圖 13E vs.12A)。這可能 是因為在非還原條件下本研究中使用的兔多克隆抗 -FGFR3 抗體對單體 FGFR3 的檢測靈敏 度較弱的緣故 ( 圖 21)。重要的是, R3Mab 還顯著地抑制 UMUC-14 腫瘤中 MAPK 的磷酸化和 激活 ( 圖 13E), 提示 R3Mab 在體內抑制 FGFR3S249C 的活性。在任一項體內研究中我們均沒有 觀察到顯著的體重減輕或其他顯著的異常。 此外, 在小鼠中進行的安全性研究中, 與人和鼠FGFR3 兩者以類似的親和性結合的 R3Mab 在任何器官 ( 包括膀胱 ) 中均沒有顯示任何可分 辨的毒性 ( 未顯示的數據 )。 總之, 這些數據表明在小鼠中可良好地耐受對 R3Mab 的多次暴 露。
     R3Mab 在多發性骨髓瘤異種移植物模型中的抗腫瘤活性涉及 ADCC
     為了評估 R3Mab 是否可能具有對多發性骨髓瘤的治療潛力, 我們首先測試了 R3Mab 對三種培養的 t(4 ; 14)+ 細胞系的增殖和存活的作用。 UTMC-2 細胞攜帶 WT FGFR3, 而 OPM2 和 KMS11 分別帶有 K650E 和 Y373C 置換 (7)。在培養中, R3Mab 完全消除了 FGF9- 誘 導的 UTMC-2 細胞的增殖 ( 圖 22A)。R3Mab 適度地抑制了 OPM2 細胞的生長, 但對 KMS11 細 胞的增殖沒有明顯作用 ( 圖 22B, C)。由于 UTMC-2 細胞在小鼠中不形成腫瘤, 我們評價了 R3Mab 針對 OPM2 和 KMS11 腫瘤的功效。R3Mab 幾乎完成消除了兩種細胞系的異種移植物腫 瘤生長 ( 圖 14A, B)。
     R3Mab 在體外和體內針對 OPM2 和 KMS11 腫瘤細胞的活性的顯著差異提示 R3Mab 可 能能夠支持 Fc- 介導的針對這些過表達 FGFR3 的腫瘤的免疫效應子功能的可能性。兩種細 胞系均表達高水平的 CD55 和 CD59( 未顯示的數據 ), 它們是補體途徑的兩種抑制劑 ; 因此, 沒有觀察到補體依賴的細胞毒性 ( 未顯示的數據 )。然后, 我們集中于 ADCC。當抗體在靶 細胞上與其抗原結合時發生 ADCC, 并且經由其 Fc 區, 連接免疫效應細胞上表達的 Fcγ 受 體 (FcγRs)(38)。為了在體外測試 ADCC, 我們將 KMS11 或 OPM2 細胞與剛分離的人外周血 單核細胞 (PBMC) 在存在 R3Mab 或對照抗體的條件下溫育。 R3Mab 介導針對兩種骨髓瘤細胞 系的顯著的 PBMC 細胞裂解活性 ( 圖 14C, D)。相反, R3Mab 不支持膀胱癌 RT112 或 UMUC-14 細胞的細胞裂解 ( 圖 14E, F)。當通過 Scatchard 分析測量時, 多發性骨髓瘤細胞比膀胱癌 細胞系表達實質上更多的細胞表面 FGFR3( ~ 5-6 倍多的受體 / 細胞 ; 圖 23A, B)。
     為 了 了 解 ADCC 對 R3Mab 的 體 內 活 性 的 貢 獻, 我 們 將 以 前 表 征 的 D265A/ N297A(DANA) 突變引入至抗體的 Fc 結構域中。抗體的 Fc 結構域中的這種雙重置換消除了 其與 FcγRs 的結合 (39), 阻止了對免疫效應細胞的募集。DANA 突變不改變 R3Mab 與 FGFR3 的結合或在體外對 FGFR3 活性的抑制, 也不改變小鼠中 R3Mab 的藥代動力學 ( 未顯示的數 據); 然而, 其基本上消除了針對 OPM2 或 KMS11 異種移植物的體內活性 ( 圖 14G, H)。相反, DANA 突變不改變 R3Mab 針對 RT112 和 UMUC-14 膀胱癌異種移植物的抗 - 腫瘤活性 ( 圖 24A, B)。總之, 這些結果提示 Fc- 依賴性的 ADCC 在 R3Mab 針對 OPM2 和 KMS11 多發性骨髓瘤異 種移植物的功效中具有重要的作用。
     其他異種移植物研究
     R3Mab( 克隆 184.6.1N54S) 進一步如下表征 :
     (a) 基本上如上所述, 使用基于肝癌細胞系 (Huh7) 的腫瘤異種移植物模型測試 R3Mab 的體內功效。當以 5mg/kg 和 30mg/kg 的抗體濃度測試時, R3Mab 在體內顯著抑制腫 瘤生長。與對照動物中的腫瘤生長相比, 腫瘤生長被抑制約 50%。
     (b) 基本上如上所述, 使用基于乳腺癌細胞系 (Cal-51)( 其表達 FGFR3) 的腫瘤異 種移植物模型測試 R3Mab 的體內功效。 來自該功效研究的結果表明當以約 1mg/kg 至 100mg/ kg 范圍內的抗體濃度測試時, R3Mab 能夠在體內抑制腫瘤。與對照動物中的腫瘤生長相比, 腫瘤生長被抑制約 30%。
     討論在 t(4 ; 14)+ 多發性骨髓瘤患者中 FGFR3 過表達與預后差的關聯性和在幾個實驗 模型中激活的 FGFR3 的轉化活性已經將 FGFR3 確定為這種血液惡性腫瘤中的一個重要致癌 驅動物且因此是潛在的治療靶標。相反, 盡管在膀胱癌中報道有高頻率的 FGFR3 突變和 / 或過表達 (24, 25, 40), 但在體內還沒有確定 FGFR3 信號傳導在這種上皮惡性腫瘤中的關鍵 作用。此外, 抑制 FGFR3 在膀胱癌中的治療潛力還有待確定。在此我們顯示遺傳或藥理學 干預 FGFR3 抑制小鼠中幾種人膀胱癌異種移植物的生長。這些結果證明 FGFR3 功能在這種 背景中對于腫瘤生長是至關重要的, 強調了該受體作為膀胱癌中的致癌驅動物和治療靶標 的潛在重要性。FGFR3 功能的阻斷以類似的方式抑制表達 WT 或突變 FGFR3 的異種移植物 的生長, 提示該受體的兩種形式可以顯著地促進膀胱腫瘤的進展。雖然不及在膀胱癌中頻 繁, 但 FGFR3 突變或過表達在其他實體惡性腫瘤中也已經被鑒定到, 包括子宮頸癌 (40), 肝 細胞癌 (41) 和非小細胞肺癌 (42, 43), 提示了 FGFR3 對其他類型上皮癌的潛在貢獻。
     FGFR3 在各種惡性腫瘤中的明顯參與使該受體被鑒定為靶向治療的一個吸引人的 候選物。盡管已經記載了可以抑制 FGFR3 激酶活性的小分子化合物 (18-22, 44), 但 FGFR 家族內激酶結構域的密切同源性已經妨礙了 FGFR3- 選擇性抑制劑的開發。已報道的抑制 劑缺少選擇性使得難以辨別 FGFR3 對特定癌癥類型的生物學的相對貢獻度 ; 此外, 其可能 帶有安全性責任, 有最大劑量水平的限制, 并且因此限制了對 FGFR3 的最適抑制。因此, 為 了實現對 FGFR3 的選擇性和特異性靶向, 我們轉向了基于抗體的策略。我們的理由是最適 的治療性抗體應當能夠不僅阻斷 WT 而且能夠阻斷 FGFR3 的常見癌癥相關突變體。此外, 已知 FGFR3 的二聚作用對于其激活是至關重要的, 不僅阻斷配體結合而且干預受體二聚作 用的抗體可能是較佳的。其他所需的性質將包括支持 Fc 介導的效應子功能的能力和全長 抗體的天然構架所賦予的長血清半衰期。我們將我們的篩選和改造工作集中于鑒定結合 了所有這些特征的抗體分子, 從而產生了 R3Mab。結合研究證明 R3Mab 與 FGF 配體競爭與 FGFR3 的 IIIb 和 IIIc 同種型兩者的相互作用的能力。使用轉染的 BaF/3 細胞系的更多實 驗證實了 R3Mab 阻斷 WT 和常見的癌癥相關 FGFR3 突變體的卓越能力。另外, R3Mab 在表達 S249C WT FGFR3 或 FGFR3 ( 其是這種疾病中該受體的最常見突變體 ) 的膀胱癌的幾種異種移 植物模型中發揮了明顯的抗 - 腫瘤活性。藥效學研究提示 R3Mab 在這些模型中的抗腫瘤活 性基于對 FGFR3 信號傳導的抑制, 這顯然是通過消除其下游調控劑 FRS2α 和 MAPK 的磷酸 化。這些數據進一步強化了這樣的結論, 即 FGFR3 是膀胱腫瘤進展所必需的, 如通過我們的 FGFR3shRNA 研究所證明的那樣。
     膀胱癌中的 FGFR3 突變代表了實體惡性腫瘤中蛋白激酶最頻繁發生的致癌變化 之一, 使人想起了黑色素瘤中 B-Raf 的常見突變 (45)。 FGFR3 中的大多數激活的突變產生未 配對的半胱氨酸, 導致配體不依賴性的受體二聚作用, 并且導致各種程度的組成型激活。 以 前使用單價抗 -FGFR3Fab 片段的研究表明針對特定 FGFR3 突變體的差別性抑制活性 (46) ; 然而, 并沒有研究這種可變作用的分子基礎。 與單價抗體片段相比, 二價抗體具有誘導抗原 聚集的能力, 并且在受體酪氨酸激酶的情況下, 可以導致受體低聚化和激活。 盡管其全長的 二價構象, R3Mab 顯示對 WT FGFR3 和廣譜 FGFR3 突變體的普遍抑制, 包括這樣的變體, 它們 G372C Y375C R248C S249C 是配體依賴的 (FGFR3 , FGFR3 ), 組成型活性的 (FGFR3 , FGFR3 ), 或具有兩種性 K652E 質 (FGFR3 )。這些結果提出了這樣的問題 : R3Mab 如何對抗 WT 和各種 FGFR3 突變體 ( 包 括二硫化物連接的變體 ) ?基于與 FGFR1 的序列比對, 被 R3Mab 識別的肽表位與參與結合配體和肝素以及受 體二聚作用的 FGFR3 殘基重疊。該結論通過 R3Mab 與 FGFR3 的細胞外區之間的復合體的結 晶學研究的證實。 X- 線結構揭示所述抗體結合 IgD2 和 IgD3 的區域, 所述區域對于配體 - 受 體相互作用以及受體 - 受體接觸是至關重要的。因此, R3Mab 可以通過競爭配體結合并通 過阻止受體二聚作用來阻斷 WT FGFR3。R3Mab 可以采用類似的機制來抑制 FGFR3K652E, 后者 具有低組成型活性, 但需要配體用于完全激活。此外, R3Mab 的結合改變了 FGFR3IgD3 相對 于 IgD2 的相對方向。這個發現提出了這樣一種形式上的可能性, 即該抗體也可以通過強迫 形成不導致信號轉導的構象 ( 這種想法需要進一步研究 ) 來抑制受體激活。
     為了更好地了解 R3Mab 如何阻斷具有未配對的半胱氨酸的 FGFR3 變體, 我們更詳 S249C 細地分析了最常見的突變體 FGFR3 。使用游離巰基阻斷劑 DTNB 的實驗表明 FGFR3S249C 的單體和二聚體狀態之間的動態平衡。對于 NMDA 受體已經報道了通過內源性氧化還原調 節劑調控氧化和還原狀態之間的類似平衡 (46)。將表達 FGFR3S249C 的膀胱癌細胞與 R3Mab 溫育導致受體二聚體量的減少并伴有單體水平的增加。此外, 純化的 FGFR3S249C 的 IgD2-D3 片段在溶液中形成二聚體 ; 當與 R3Mab 溫育時, 二聚體不斷地消失, 而單體 FGFR3S249C 積聚。 綜合結構分析, 這些結果提示 R3Mab 俘獲單體 FGFR3S249C 并阻礙其二聚化。隨著時間推移, R3Mab 使平衡朝向單體狀態遷移, 阻斷組成型受體活性。 這一機制也可以解釋 R3Mab 如何抑 制 FGFR3 的其他半胱氨酸突變體。
     該研究的另一重要發現是在體內 R3Mab 針對 t(4 ; 14)+ 多發性骨髓瘤細胞系 OPM2 和 KMS11 的有效抗腫瘤活性。 相反, R3Mab 對培養中的這些細胞的增殖或存活具有中度至最 小的影響。OPM2 和 KMS11 細胞表達相對高水平的細胞表面 FGFR3( 比 RT112 和 UMUC-14 膀 胱癌細胞高 4-5 倍 )。這些較高的抗原密度可以允許 R3Mab 支持有效募集攜帶 FcγR 的免 疫效應細胞并激活 ADCC。實際上, 在人 PBMC 的存在下, R3Mab 介導 OPM2 和 KMS11 細胞的細 胞裂解, 但不介導 RT112 或 UMUC-14 膀胱癌細胞的細胞裂解。此外, R3Mab 的 DANA 突變形 式不能夠結合 FcγR, 其在體內對 KMS11 或 OPM2 的生長沒有作用, 但仍然與 R3Mab 相似地抑 制 RT112 和 UMUC-14 腫瘤的生長。總之, 這些數據表明 R3Mab 具有抗腫瘤活性的雙重機制 : (a) 在表達較低表面水平的 WT 或突變 FGFR3 的細胞中, 其阻斷配體依賴性或組成型信號傳 導; (b) 在表達相對高的表面 FGFR3 水平的細胞中, 其誘導 ADCC。
     我們的結果還提出了一些新的問題。首先, 還不知道在此研究中測試的膀胱癌細 胞系為什么顯示對 R3Mab 的可變敏感性。這種差別性的反應對于靶向治療是普遍的, 其可 能反映了每種腫瘤的顯著不同的基因組成。實際上, Her2- 陽性乳腺癌細胞顯示對抗 -Her2 抗體的可變敏感性 (48), 正如多種癌細胞對抗 -EGFR 抗體的反應那樣 (49)。 在這種情形下, 急切需要開發另外的具有 WT 和突變 FGFR3 的膀胱癌的體內模型以在動物中評估對 FGFR3 分子的敏感性。此外, 對預測性生物標志物的闡明可以有助于識別可能從 FGFR3 靶向治療 中最適宜受益的患者。其次, 因為在我們檢驗的模型中 R3Mab 不誘導腫瘤消退, 因此未來的 研究應該探尋 R3Mab 是否可以與已確定的治療劑協同作用。
     總之, 我們的發現暗示 WT 和突變 FGFR3 兩者對于膀胱癌生長是重要的, 因此將該 受體的體內致癌參與作用從血液惡性腫瘤擴展至上皮惡性腫瘤。此外, 我們的結果證明可 以使用全長抗體在腫瘤中有效地靶向 WT 和突變 FGFR3 兩者, 所述全長抗體綜合了阻斷配體 結合、 受體二聚作用和信號傳導以及促進通過 ADCC 裂解腫瘤細胞的能力。這些結果為在與FGFR3 相關的多種多樣的惡性腫瘤中研究基于抗體的靶向 FGFR3 的治療提供了強有力的基 本原理。
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     盡管為清楚理解的目的已經通過說明和實施例詳細描述前述發明, 但所述描述和 實施例不應當解釋為限制本發明的范圍。111102378767 A CN 102378777
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     在一個方面, 本發明提供了分離的抗 -FGFR3 抗體, 其包含 :
     (a) 至少一個、 兩個、 三個、 四個或五個高變區 (HVR) 序列, 所述高變區序列選自 :
     (i)HVR-L1, 其包含序列 RASQX1X2X3X4X5X6A, 其中 X1 是 V 或 D, X2 是 V 或 I, X3 是 D, E 或 S, X4 是 T 或 I, X5 是 A 或 S, 和 X6 是 V 或 L(SEQID NO : 146),
     (ii)HVR-L2, 其包含序列 X1ASFLX2S, 其中 X1 是 S 或 G 且 X2 是 A 或 Y(SEQ ID NO : 147),
     (iii)HVR-L3, 其包含序列 QQX1X2X3X4X5X6T, 其中 X1 是 G, S 或 T, X2 是 T, Y 或 A, X3 是 G, S, T, 或 A, X4 是 A, H, D, T, 或 N, X5 是 Q, P 或 S, X6 是 S, Y, L, P 或 Q(SEQ ID NO : 148),
     (iv)HVR-H1, 其包含序列 GFX1FX2X3TGIS, 其中 X1 是 S 或 T, X2 是 W, Y, S 或 T, X3 是 S, G, 或 T(SEQ ID NO : 149),
     (v)HVR-H2, 其包含序列 GRIYPX1X2X3X4X5X6YADSVKG, 其中 X1 是 Y, A, L, S, 或 T, X2 是 A, Q, D, G, Y, S, N 或 F, X3 是 A, D, 或 G, X4 是 T 或 S, X5 是 K, F, T, 或 S, X6 是 Y, H, N 或 I(SEQ ID NO : 150), 和
     (vi)HVR-H3, 其包含序列 ARTYGIYDLYVDYTEYVMDY(SEQ IDNO : 151)。
     在一些實施方案中, HVR-L1 包含序列 RASQX1VX2X3X4VA, 其中 X1 是 V 或 D, X2 是 D, E 或 S, X3 是 T 或 I, X4 是 A 或 S(SEQ ID NO : 152)。在一些實施方案中, HVR-L3 包含序列 QQX1X2X3X4X5X6T, 其中 X1 是 S, G, 或 T, X2 是 Y, T, 或 A, X3 是 T 或 G, X4 是 T, H 或 N, X5 是 P 或 S, X6 是 P, Q, Y, 或 L(SEQ ID NO : 153)。 在一些實施方案中, HVR-H2 包含序列 GRIYPX1X2GSTX3YADSVKG, 其中 X1 是 T 或 L, X2 是 N, Y, S, G, A, 或Q; X3 是 N 或 H(SEQ ID NO : 154)。
     在另一個方面, 本發明的特征在于分離的抗 -FGFR3 抗體, 所述分離的抗 -FGFR3 抗 體包含一個、 兩個、 三個、 四個、 五個或六個 HVR, 其中各個 HVR 包含選自下列的序列, 由選自 下列的序列組成, 或基本上由選自下列的序列組成 : SEQ ID NOS : 1-18, 48-131 和 140-145, 并且其中 SEQID NO : 1, 7, 13, 48, 54, 60, 66, 72, 78, 84, 90, 96, 102, 108, 114, 120, 126 或 143 對應于 HVR-H1, SEQ ID NO : 2, 8, 14, 49, 55, 61, 67, 73, 79, 85, 91, 97, 103, 109, 115, 121, 127 或 144 對 應 于 HVR-H2, SEQ ID NO : 3, 9, 15, 50, 56, 62, 68, 74, 80, 86, 92, 98, 104, 110, 116, 122, 128 或 145 對應于 HVR-H3, SEQ ID NO : 4, 10, 16, 51, 57, 63, 69, 75, 81, 87, 93, 99, 105, 111, 117, 123, 129 或 140 對應于 HVR-L1, SEQ ID NO : 5, 11, 17, 52, 58, 64, 70, 76, 82, 88, 94, 100, 106, 112, 118, 124, 130 或 141 對應于 HVR-L2, 且 SEQ ID NO : 6, 12, 18, 53, 59, 65, 71, 77,83, 89, 95, 101, 107, 113, 119, 125, 131 或 142 對應于 HVR-L3。
     在一個方面, 本發明提供包含 HVR-H1 的抗 -FGFR3 抗體, 所述 HVR-H1 包含 SEQ ID NO : 1, 7, 13, 48, 54, 60, 66, 72, 78, 84, 90, 96, 102, 108, 114, 120, 126 或 143 的序列。
     在一個方面, 本發明提供包含 HVR-H2 的抗 -FGFR3 抗體, 所述 HVR-H2 包含 SEQ ID NO : 2, 8, 14, 49, 55, 61, 67, 73, 79, 85, 91, 97, 103, 109, 115, 121, 127 或 144 的序列。
     在一個方面, 本發明提供包含 HVR-H3 的抗 -FGFR3 抗體, 所述 HVR-H3 包含 SEQ ID NO : 3, 9, 15, 50, 56, 62, 68, 74, 80, 86, 92, 98, 104, 110, 116, 122, 128 或 145 的序列。
     在一個方面, 本發明提供包含 HVR-L1 區的抗 -FGFR3 抗體, 所述 HVR-L1 區包含 SEQ ID NO : 4, 10, 16, 51, 57, 63, 69, 75, 81, 87, 93, 99, 105, 111, 117, 123, 129 或 140 的序列。
     在一個方面, 本發明提供包含 HVR-L2 區的抗 -FGFR3 抗體, 所述 HVR-L2 區包含 SEQ ID NO : 5, 11, 17, 52, 58, 64, 70, 76, 82, 88, 94, 100, 106, 112, 118, 124, 130 或 141 的序列。
     在一個方面, 本發明提供包含 HVR-L3 區的抗 -FGFR3 抗體, 所述 HVR-L3 區包含 SEQ ID NO : 6, 12, 18, 53, 59, 65, 71, 77, 83, 89, 95, 101, 107, 113, 119, 125, 131 或 142 的序列。
     在一個方面, 抗 -FGFR3 抗體包含重鏈可變區和 / 或輕鏈可變區, 所述重鏈可變區 包含 HVR-H1, HVR-H2, HVR-H3, 其中各個按順序地包含 SEQ ID NO : 1, 2, 3, 所述輕鏈可變區 包含 HVR-L1, HVR-L2, 和 HVR-L3, 其中各個按順序地包含 SEQ ID NO : 4, 5, 6。 在另一個方面, 抗 -FGFR3 抗體包含重鏈可變區和 / 或輕鏈可變區, 所述重鏈可變 區包含 HVR-H1, HVR-H2, HVR-H3, 其中各個按順序地包含 SEQ ID NO : 7, 8, 9, 所述輕鏈可變 區包含 HVR-L1, HVR-L2, 和 HVR-L3, 其中各個按順序地包含 SEQ ID NO : 10, 11, 12。
     在另一個方面, 抗 -FGFR3 抗體包含重鏈可變區和 / 或輕鏈可變區, 所述重鏈可變 區包含 HVR-H1, HVR-H2, HVR-H3, 其中各個按順序地包含 SEQ ID NO : 13, 14, 15, 所述輕鏈可 變區包含 HVR-L1, HVR-L2, 和 HVR-L3, 其中各個按順序地包含 SEQ ID NO : 16, 17, 18。
     在另一個方面, 抗 -FGFR3 抗體包含重鏈可變區和 / 或輕鏈可變區, 所述重鏈可變 區包含 HVR-H1, HVR-H2, HVR-H3, 其中各個按順序地包含 SEQ ID NO : 48, 49, 50, 所述輕鏈可 變區包含 HVR-L1, HVR-L2, 和 HVR-L3, 其中各個按順序地包含 SEQ ID NO : 51, 52, 53。
     在另一個方面, 抗 -FGFR3 抗體包含重鏈可變區和 / 或輕鏈可變區, 所述重鏈可變 區包含 HVR-H1, HVR-H2, HVR-H3, 其中各個按順序地包含 SEQ ID NO : 54, 55, 56, 所述輕鏈可 變區包含 HVR-L1, HVR-L2, 和 HVR-L3, 其中各個按順序地包含 SEQ ID NO : 57, 58, 59。
     在另一個方面, 抗 -FGFR3 抗體包含重鏈可變區和 / 或輕鏈可變區, 所述重鏈可變 區包含 HVR-H1, HVR-H2, HVR-H3, 其中各個按順序地包含 SEQ ID NO : 60, 61, 62, 63, 所述輕 鏈可變區包含 HVR-L1, HVR-L2, 和 HVR-L3, 其中各個按順序地包含 SEQ ID NO : 63, 64, 65。
     在另一個方面, 抗 -FGFR3 抗體包含重鏈可變區和 / 或輕鏈可變區, 所述重鏈可變 區包含 HVR-H1, HVR-H2, HVR-H3, 其中各個按順序地包含 SEQ ID NO : 66, 67, 68, 所述輕鏈可 變區包含 HVR-L1, HVR-L2, 和 HVR-L3, 其中各個按順序地包含 SEQ ID NO : 69, 70, 71。
     在另一個方面, 抗 -FGFR3 抗體包含重鏈可變區和 / 或輕鏈可變區, 所述重鏈可變 區包含 HVR-H1, HVR-H2, HVR-H3, 其中各個按順序地包含 SEQ ID NO : 72, 73, 74, 所述輕鏈可 變區包含 HVR-L1, HVR-L2, 和 HVR-L3, 其中各個按順序地包含 SEQ ID NO : 75, 76, 77。
     在另一個方面, 抗 -FGFR3 抗體包含重鏈可變區和 / 或輕鏈可變區, 所述重鏈可變 區包含 HVR-H1, HVR-H2, HVR-H3, 其中各個按順序地包含 SEQ ID NO : 78, 7980, 所述輕鏈可
     在另一個方面, 抗 -FGFR3 抗體包含重鏈可變區和 / 或輕鏈可變區, 所述重鏈可變 區包含 HVR-H1, HVR-H2, HVR-H3, 其中各個按順序地包含 SEQ ID NO : 13, 14, 15, 所述輕鏈可 變區包含 HVR-L1, HVR-L2, 和 HVR-L3, 其中各個按順序地包含 SEQ ID NO : 16, 17, 18。
     在另一個方面, 抗 -FGFR3 抗體包含重鏈可變區和 / 或輕鏈可變區, 所述重鏈可變 區包含 HVR-H1, HVR-H2, HVR-H3, 其中各個按順序地包含 SEQ ID NO : 48, 49, 50, 所述輕鏈可 變區包含 HVR-L1, HVR-L2, 和 HVR-L3, 其中各個按順序地包含 SEQ ID NO : 51, 52, 53。
     在另一個方面, 抗 -FGFR3 抗體包含重鏈可變區和 / 或輕鏈可變區, 所述重鏈可變 區包含 HVR-H1, HVR-H2, HVR-H3, 其中各個按順序地包含 SEQ ID NO : 54, 55, 56, 所述輕鏈可 變區包含 HVR-L1, HVR-L2, 和 HVR-L3, 其中各個按順序地包含 SEQ ID NO : 57, 58, 59。
     在另一個方面, 抗 -FGFR3 抗體包含重鏈可變區和 / 或輕鏈可變區, 所述重鏈可變 區包含 HVR-H1, HVR-H2, HVR-H3, 其中各個按順序地包含 SEQ ID NO : 60, 61, 62, 63, 所述輕 鏈可變區包含 HVR-L1, HVR-L2, 和 HVR-L3, 其中各個按順序地包含 SEQ ID NO : 63, 64, 65。
     在另一個方面, 抗 -FGFR3 抗體包含重鏈可變區和 / 或輕鏈可變區, 所述重鏈可變 區包含 HVR-H1, HVR-H2, HVR-H3, 其中各個按順序地包含 SEQ ID NO : 66, 67, 68, 所述輕鏈可 變區包含 HVR-L1, HVR-L2, 和 HVR-L3, 其中各個按順序地包含 SEQ ID NO : 69, 70, 71。
     在另一個方面, 抗 -FGFR3 抗體包含重鏈可變區和 / 或輕鏈可變區, 所述重鏈可變 區包含 HVR-H1, HVR-H2, HVR-H3, 其中各個按順序地包含 SEQ ID NO : 72, 73, 74, 所述輕鏈可 變區包含 HVR-L1, HVR-L2, 和 HVR-L3, 其中各個按順序地包含 SEQ ID NO : 75, 76, 77。
     在另一個方面, 抗 -FGFR3 抗體包含重鏈可變區和 / 或輕鏈可變區, 所述重鏈可變 區包含 HVR-H1, HVR-H2, HVR-H3, 其中各個按順序地包含 SEQ ID NO : 78, 7980, 所述輕鏈可
     變區包含 HVR-L1, HVR-L2, 和 HVR-L3, 其中各個按順序地包含 SEQ ID NO : 81, 82, 83。
     在另一個方面, 抗 -FGFR3 抗體包含重鏈可變區和 / 或輕鏈可變區, 所述重鏈可變 區包含 HVR-H1, HVR-H2, HVR-H3, 其中各個按順序地包含 SEQ ID NO : 84, 85, 86, 所述輕鏈可 變區包含 HVR-L1, HVR-L2, 和 HVR-L3, 其中各個按順序地包含 SEQ ID NO : 87, 88, 89。
     在另一個方面, 抗 -FGFR3 抗體包含重鏈可變區和 / 或輕鏈可變區, 所述重鏈可變 區包含 HVR-H1, HVR-H2, HVR-H3, 其中各個按順序地包含 SEQ ID NO : 90, 91, 92, 所述輕鏈可 變區包含 HVR-L1, HVR-L2, 和 HVR-L3, 其中各個按順序地包含 SEQ ID NO : 93, 94, 95。
     在另一個方面, 抗 -FGFR3 抗體包含重鏈可變區和 / 或輕鏈可變區, 所述重鏈可變 區包含 HVR-H1, HVR-H2, HVR-H3, 其中各個按順序地包含 SEQ ID NO : 96, 97, 98, 所述輕鏈可 變區包含 HVR-L1, HVR-L2, 和 HVR-L3, 其中各個按順序地包含 SEQ ID NO : 99, 100, 101。
     在另一個方面, 抗 -FGFR3 抗體包含重鏈可變區和 / 或輕鏈可變區, 所述重鏈可變 區包含 HVR-H1, HVR-H2, HVR-H3, 其中各個按順序地包含 SEQ ID NO : 102, 103, 104, 所述輕鏈 可變區包含 HVR-L1, HVR-L2, 和 HVR-L3, 其中各個按順序地包含 SEQ ID NO : 105, 106, 107。
     在另一個方面, 抗 -FGFR3 抗體包含重鏈可變區和 / 或輕鏈可變區, 所述重鏈可變 區包含 HVR-H1, HVR-H2, HVR-H3, 其中各個按順序地包含 SEQ ID NO : 108, 109, 110, 所述輕鏈 可變區包含 HVR-L1, HVR-L2, 和 HVR-L3, 其中各個按順序地包含 SEQ ID NO : 111, 112, 113。 在另一個方面, 抗 -FGFR3 抗體包含重鏈可變區和 / 或輕鏈可變區, 所述重鏈可變 區包含 HVR-H1, HVR-H2, HVR-H3, 其中各個按順序地包含 SEQ ID NO : 114, 115, 116, 所述輕鏈 可變區包含 HVR-L1, HVR-L2, 和 HVR-L3, 其中各個按順序地包含 SEQ ID NO : 117, 118, 119。
     在另一個方面, 抗 -FGFR3 抗體包含重鏈可變區和 / 或輕鏈可變區, 所述重鏈可變 區包含 HVR-H1, HVR-H2, HVR-H3, 其中各個按順序地包含 SEQ ID NO : 120, 121, 122, 所述輕鏈 可變區包含 HVR-L1, HVR-L2, 和 HVR-L3, 其中各個按順序地包含 SEQ ID NO : 123, 124, 125。
     在另一個方面, 抗 -FGFR3 抗體包含重鏈可變區和 / 或輕鏈可變區, 所述重鏈可變 區包含 HVR-H1, HVR-H2, HVR-H3, 其中各個按順序地包含 SEQ ID NO : 126, 127, 128, 所述輕鏈 可變區包含 HVR-L1, HVR-L2, 和 HVR-L3, 其中各個按順序地包含 SEQ ID NO : 129, 130, 131。
     在另一個方面, 抗 -FGFR3 抗體包含重鏈可變區和 / 或輕鏈可變區, 所述重鏈可變 區包含 HVR-H1, HVR-H2, HVR-H3, 其中各個按順序地包含 SEQ ID NO : 140, 141, 142, 所述輕鏈 可變區包含 HVR-L1, HVR-L2, 和 HVR-L3, 其中各個按順序地包含 SEQ ID NO : 143, 144, 145。
     SEQ ID NOs : 1-18, 48-131 和 140-145 的氨基酸序列關于如圖 1 中所示的單個 HVR( 即, H1, H2 或 H3) 進行編號, 所述編號與如下所述的 Kabat 編號系統一致。
     在另一個方面, 抗 -FGFR3 抗體包含重鏈可變區和輕鏈可變區, 所述重鏈可變區包 含 SEQ ID NO : 132。
     在另一個方面, 抗 -FGFR3 抗體包含輕鏈可變區和重鏈可變區, 所述輕鏈可變區包 含 SEQ ID NO : 133。
     在另一個方面, 抗 -FGFR3 抗體包含重鏈可變區和輕鏈可變區, 所述重鏈可變區包 含 SEQ ID NO : 132, 所述輕鏈可變區包含 SEQ ID NO : 133。
     在另一個方面, 抗 -FGFR3 抗體包含重鏈可變區和輕鏈可變區, 所述重鏈可變區包 含 SEQ ID NO : 134。
     在另一個方面, 抗 -FGFR3 抗體包含輕鏈可變區和重鏈可變區, 所述輕鏈可變區包
     含 SEQ ID NO : 135。
     在另一個方面, 抗 -FGFR3 抗體包含輕鏈可變區和重鏈可變區, 所述輕鏈可變區包 含 SEQ ID NO : 139。
     在另一個方面, 抗 -FGFR3 抗體包含重鏈可變區和輕鏈可變區, 所述重鏈可變區包 含 SEQ ID NO : 134, 所述輕鏈可變區包含 SEQ ID NO : 135。
     在另一個方面, 抗 -FGFR3 抗體包含重鏈可變區和輕鏈可變區, 所述重鏈可變區包 含 SEQ ID NO : 136。
     在另一個方面, 抗 -FGFR3 抗體包含輕鏈可變區和重鏈可變區, 所述輕鏈可變區包 含 SEQ ID NO : 137。
     在另一個方面, 抗 -FGFR3 抗體包含重鏈可變區和輕鏈可變區, 所述重鏈可變區包 含 SEQ ID NO : 136, 所述輕鏈可變區包含 SEQ ID NO : 137。
     在另一個方面, 抗 -FGFR3 抗體包含重鏈可變區和輕鏈可變區, 所述重鏈可變區包 含 SEQ ID NO : 138。
     在另一個方面, 抗 -FGFR3 抗體包含輕鏈可變區和重鏈可變區, 所述輕鏈可變區包 含 SEQ ID NO : 139。 在另一個方面, 抗 -FGFR3 抗體包含重鏈可變區和輕鏈可變區, 所述重鏈可變區包 含 SEQ ID NO : 138, 所述輕鏈可變區包含 SEQ ID NO : 139。
     在一個方面, 本發明提供抗 -FGFR3 抗體, 所述抗 -FGFR3 抗體包含 : 至少一個、 兩 個、 三個、 四個、 五個或六個高變區 (HVR) 序列, 所述高變區序列選自由下列各項組成的組 :
     (a)HVR-L1, 其包含序列 SASSSVSYMH(SEQ ID NO : 155), SASSSVSYMH(SEQ ID NO : 156) 或 LASQTIGTWLA(SEQ ID NO : 157),
     (b)HVR-L2, 其包含序列 TWIYDTSILAS(SEQ ID NO : 158), RWIYDTSKLAS(SEQ ID NO : 159), 或 LLIYAATSLAD(SEQ ID NO : 160),
     (c)HVR-L3, 其 包 含 序 列 QQWTSNPLT(SEQ ID NO : 161), QQWSSYPPT(SEQ ID NO : 162), 或 QQLYSPPWT(SEQ ID NO : 163),
     (d)HVR-H1, 其包含序列 GYSFTDYNMY(SEQ ID NO : 164), GYVFTHYNMY(SEQ ID NO : 165), 或 GYAFTSYNMY(SEQ ID NO : 166),
     (e)HVR-H2 , 其 包 含 序 列 WIGYIEPYNGGTSYNQKFKG(SEQ IDNO : 167) , WIGYIEPYNGGTSYNQKFKG(SEQ ID NO : 168), 或 WIGYIDPYIGGTSYNQKFKG(SEQ ID NO : 169), 和
     (f)HVR-H3 包含序列 ASPNYYDSSPFAY(SEQ ID NO : 170), ARGQGPDFDV(SEQ ID NO : 171), 或 ARWGDYDVGAMDY(SEQ IDNO : 172)。
     在一個方面, 本發明提供抗 -FGFR3 抗體, 其包含 : 至少一個、 兩個、 三個、 四個、 五 個或六個高變區 (HVR) 序列, 所述高變區序列選自由下列各項組成的組 :
     (a)HVR-L1, 其包含序列 SASSSVSYMH(SEQ ID NO : 155),
     (b)HVR-L2, 其包含序列 TWIYDTSILAS(SEQ ID NO : 158),
     (c)HVR-L3, 其包含序列 QQWTSNPLT(SEQ ID NO : 161),
     (d)HVR-H1, 其包含序列 GYSFTDYNMY(SEQ ID NO : 164),
     (e)HVR-H2, 其包含序列 WIGYIEPYNGGTSYNQKFKG(SEQ IDNO : 167), 和
     (f)HVR-H3, 其包含序列 ASPNYYDSSPFAY(SEQ ID NO : 170)。
     在一個方面, 本發明提供抗 -FGFR3 抗體, 其包含 : 至少一個、 兩個、 三個、 四個、 五 個或六個高變區 (HVR) 序列, 所述高變區序列選自由下列各項組成的組 :
     (a)HVR-L1, 其包含序列 SASSSVSYMH(SEQ ID NO : 156),
     (b)HVR-L2, 其包含序列 RWIYDTSKLAS(SEQ ID NO : 159),
     (c)HVR-L3, 其包含序列 QQWSSYPPT(SEQ ID NO : 162),
     (d)HVR-H1, 其包含序列 GYVFTHYNMY(SEQ ID NO : 165),
     (e)HVR-H2, 其包含序列 WIGYIEPYNGGTSYNQKFKG(SEQ IDNO : 168), 和
     (f)HVR-H3, 其包含序列 ARGQGPDFDV(SEQ ID NO : 171).
     在一個方面, 本發明提供抗 -FGFR3 抗體, 其包含 : 至少一個、 兩個、 三個、 四個、 五 個或六個高變區 (HVR) 序列, 所述高變區序列選自由下列各項組成的組 :
     (a)HVR-L1, 其包含序列 LASQTIGTWLA(SEQ ID NO : 157),
     (b)HVR-L2, 其包含序列 LLIYAATSLAD(SEQ ID NO : 160),
     (c)HVR-L3, 其包含序列 QQLYSPPWT(SEQ ID NO : 163),
     (d)HVR-H1, 其包含序列 GYAFTSYNMY(SEQ ID NO : 166),
     (e)HVR-H2, 其包含序列 WIGYIDPYIGGTSYNQKFKG(SEQ IDNO : 169), 和
     (f)HVR-H3, 其包含序列 ARWGDYDVGAMDY(SEQ ID NO : 172)。
     在一個方面, 本發明提供抗 -FGFR3 抗體, 所述抗 -FGFR3 抗體包含 : (a) 輕鏈, 所述 輕鏈包含 : (i)HVR-L1, 其包含序列 SASSSVSYMH(SEQ IDNO : 155) ; (ii)HVR-L2, 其包含序列 TWIYDTSILAS(SEQ ID NO : 158) ; 和 (iii)HVR-L3, 其包含序列 QQWTSNPLT(SEQ ID NO : 161) ; 和 / 或 (b) 重鏈, 所述重鏈包含 : (i)HVR-H1, 其包含序列 GYSFTDYNMY(SEQ IDNO : 164) ; (ii) HVR-H2, 其包含序列 WIGYIEPYNGGTSYNQKFKG(SEQID NO : 167) ; 和 (iii)HVR-H3, 其包含序列 ASPNYYDSSPFAY(SEQ IDNO : 170)。
     在一個方面, 本發明提供抗 -FGFR3 抗體, 所述抗 -FGFR3 抗體包含 : (a) 輕鏈, 其包含: (i)HVR-L1, 其 包 含 序 列 SASSSVSYMH(SEQ IDNO : 156) ; (ii)HVR-L2, 其包含序 列 RWIYDTSKLAS(SEQ ID NO : 159) ; 和 (iii)HVR-L3, 其包含序列 QQWSSYPPT(SEQ ID NO : 162) ; 和 / 或 (b) 重鏈, 其包含 : (i)HVR-H1 包含序列 GYVFTHYNMY(SEQ ID NO : 165) ; (ii) HVR-H2, 其包含序列 WIGYIEPYNGGTSYNQKFKG(SEQ ID NO : 168) ; 和 (iii)HVR-H3, 其包含序 列 ARGQGPDFDV(SEQ ID NO : 171)。
     在一個方面, 本發明提供抗 -FGFR3 抗體, 所述抗 -FGFR3 抗體包含 : (a) 輕鏈, 其包含 : (i)HVR-L1, 其包含序列 LASQTIGTWLA(SEQ IDNO : 157) ; (ii)HVR-L2, 其包含序列 LLIYAATSLAD(SEQ ID NO : 160) ; 和 (iii)HVR-L3, 其包含序列 QQLYSPPWT(SEQ ID NO : 163) ; 和 / 或 (b) 重 鏈, 其包含 : (i)HVR-H1, 其 包 含 序 列 GYAFTSYNMY(SEQ ID NO : 166) ; (ii) HVR-H2, 其包含序列 WIGYIDPYIGGTSYNQKFKG(SEQ ID NO : 169) ; 和 (iii)HVR-H3, 其包含序 列 ARWGDYDVGAMDY(SEQ ID NO : 172)。本發明的抗體的一些實施方案包含如下面 SEQ ID NO : 173 中所示的人源化 4D5 抗體 (huMAb4D5-8)( Genentech, Inc., South SanFrancisco, CA, USA)( 也在美國專利號 6,407,213 和 Lee 等 ., J.Mol.Biol.( 分子生物 學雜志 )(2004), 340(5) : 1073-1093 中提及 ) 的輕鏈可變結構域。
     I Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
    Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val13Thr Ala102378767 A CN 102378777
    
    
    
    說明書10/107 頁Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro GluAsp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Thr Thr Pro Pro Thr
     Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 107(SEQ ID NO : 173)
     (HVR 殘基被下劃線 )
     在一個實施方案中, huMAb4D5-8 輕鏈可變結構域序列在位置 30, 66, 和 91( 分別 如上面以粗體 / 斜體所示的 Asn, Arg, 和 His) 中的一個或多個處被修飾。在具體的實施方 案中, 修飾的 huMAb4D5-8 序列包含位置 30 中的 Ser, 位置 66 中的 Gly, 和 / 或位置 91 中的 Ser。 因此, 在一個實施方案中, 本發明的抗體包含輕鏈可變結構域, 所述輕鏈可變結構域包 含下面 SEQ ID NO : 174 中所示的序列 :
     I Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
     Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Thr Ala
     Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
     Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
    
    
    Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Thr Thr Pro Pro ThrPhe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 107(SEQ ID NO : 174)
     (HVR 殘基被下劃線 )
     關于 huMAb4D5-8 的置換殘基以粗體 / 斜體指示。
     本發明的抗體可以包含任何合適的構架可變結構域序列, 條件是基本上保留與 FGFR3 的結合活性。例如, 在一些實施方案中, 本發明的抗體包含人亞組 III 重鏈構架共有 序列。在這些抗體的一個實施方案中, 構架共有序列包含位置 71, 73, 和 / 或 78 處的置換。 在這些抗體的一些實施方案中, 位置 71 是 A, 73 是 T 和 / 或 78 是 A。在一個實施方案中, 這些抗體包含 huMAb4D5-8( Genentech, Inc., South San Francisco, CA, USA)( 也在美國專利號 6,407,213 和 5,821,337, 和 Lee 等 ., J.Mol.Biol.( 分子生物學雜 志 )(2004), 340(5) : 1073-1093 中提及 ) 的重鏈可變結構域構架序列。在一個實施方案中, 這些抗體還包含人 κI 輕鏈構架共有序列。在具體的實施方案中, 這些抗體包含如美國專 利號 6,407,213 和 5,821,337 中所述的 huMAb4D5-8 的輕鏈 HVR 序列。在一個實施方案中, 這些抗體包含 huMAb4D5-8( Genentech, Inc., South San Francisco, CA, USA)( 也在美國專利號 6,407,213 和 5,821,337, 和 Lee 等 ., J.Mol.Biol.( 分子生物學雜 志 )(2004), 340(5) : 1073-1093 中提及 ) 的輕鏈可變結構域序列。
     在一個實施方案中, 本發明的抗體包含重鏈可變結構域, 其中構架序列包含 SEQ ID NOS : 19 和 203-205, 20 和 206-208, 21 和 209-211, 22 和 212-214, 23 和 215-217, 24 和 218-220, 25 和 221-223, 26 和 224-226, 27 和 227-229, 28 和 230-232, 29 和 233-235, 30 和 236-238, 31 和 239-241, 32 和 242-244, 33 和 245-247, 34 和 248-250, 35 和 251-253, 36 和 254-256, 和 / 或 37 和 257-259 的序列, 并且 HVR H1, H2, 和 H3 序列分別是 SEQ IDNOS : 13, 14 和 / 或 15。在另一個實施方案中, 所述構架序列包含 SEQ IDNOS : 19 和 203-205, 20 和 206-208, 21 和 209-211, 22 和 212-214, 23 和 215-217, 24 和 218-220, 25 和 221-223, 26 和224-226, 27 和 227-229, 28 和 230-232, 29 和 233-235, 30 和 236-238, 31 和 239-241, 32 和 242-244, 33 和 245-247, 34 和 248-250, 35 和 251-253, 36 和 254-256, 和 / 或 37 和 257-259 的序列, 并且 HVR H1, H2, 和 H3 序列分別是 SEQ ID NOS : 48, 49 和 / 或 50。還在另一個實施 方案中, 所述構架序列包含 SEQ ID NOS : 19 和 203-205, 20 和 206-208, 21 和 209-211, 22 和 212-214, 23 和 215-217, 24 和 218-220, 25 和 221-223, 26 和 224-226, 27 和 227-229, 28 和 230-232, 29 和 233-235, 30 和 236-238, 31 和 239-241, 32 和 242-244, 33 和 245-247, 34 和 248-250, 35 和 251-253, 36 和 254-256, 和 / 或 37 和 257-259 的序列, 并且 HVR H1, H2, 和 H3 序列分別是 SEQ ID NOS : 84, 85, 和 / 或 86。在進一步的實施方案中, 所述構架序列包含 SEQ ID NOS : 19 和 203-205, 20 和 206-208, 21 和 209-211, 22 和 212-214, 23 和 215-217, 24 和 218-220, 25 和 221-223, 26 和 224-226, 27 和 227-229, 28 和 230-232, 29 和 233-235, 30 和 236-238, 31 和 239-241, 32 和 242-244, 33 和 245-247, 34 和 248-250, 35 和 251-253, 36 和 254-256, 和 / 或 37 和 257-259 的序列, 并且 HVR H1, H2, 和 H3 序列分別是 SEQ IDNOS : 108, 109, 和 / 或 110。
     在具體的實施方案中, 本發明的抗體包含輕鏈可變結構域, 其中構架序列包含 SEQ ID NOS : 38 和 260-262, 39 和 263-265, 40 和 266-268, 和 / 或 41 和 269-271 的序列, 并且 HVR L1, L2, 和 L3 序列分別是 SEQ IDNOS : 16, 17, 和 / 或 18。在另一個實施方案中, 本發明的抗 體包含輕鏈可變結構域, 其中構架序列包含 SEQ ID NOS : 38 和 260-262, 39 和 263-265, 40 和 266-268, 和 / 或 41 和 269-271 的序列, 并且 HVR L1, L2, 和 L3 序列分別是 SEQ ID NOS : 51, 52 和 / 或 53。在另外的實施方案中, 本發明的抗體包含輕鏈可變結構域, 其中構架序列 包含 SEQ ID NOS : 38 和 260-262, 39 和 263-265, 40 和 266-268, 和 / 或 41 和 269-271 的序 列, 并且 HVR L1, L2, 和 L3 序列分別是 SEQ ID NOS : 87, 88 和 / 或 89。還在另一個實施方案 中, 本發明的抗體包含輕鏈可變結構域, 其中構架序列包含 SEQ ID NOS : 38 和 260-262, 39 和 263-265, 40 和 266-268, 和 / 或 41 和 269-271 的序列, 并且 HVR L1, L2, 和 L3 序列分別 是 SEQ ID NOS : 111, 112, 和 / 或 113。
     在另一個方面, 本發明的抗體包含重鏈可變結構域和 / 或輕鏈可變結構域, 所述 重鏈可變結構域包含 SEQ ID NO : 132 的序列, 所述輕鏈可變結構域包含 SEQ ID NO : 133 的 序列。在另一個方面, 本發明的抗體包含重鏈可變結構域和 / 或輕鏈可變結構域, 所述重鏈 可變結構域包含 SEQ IDNO : 134 的序列, 所述輕鏈可變結構域包含 SEQ ID NO : 135 的序列。 在另一個方面, 本發明的抗體包含重鏈可變結構域和 / 或輕鏈可變結構域, 所述重鏈可變 結構域包含 SEQ ID NO : 136 的序列, 所述輕鏈可變結構域包含 SEQ ID NO : 137 的序列。在 另一個方面, 本發明的抗體包含重鏈可變結構域和 / 或輕鏈可變結構域, 所述重鏈可變結 構域包含 SEQ ID NO : 138 的序列, 所述輕鏈可變結構域包含 SEQ ID NO : 139 的序列。
     在一個方面, 本發明提供結合多肽的抗 -FGFR3 抗體, 所述多肽包含下列的氨基酸 序列, 基本上由下列的氨基酸序列組成或由下列的氨基酸序列組成 : LAVPAANTVRFRCPA(SEQ ID NO : 179) 和 / 或 SDVEFHCKVYSDAQP(SEQ ID NO : 180)。
     在一些實施方案中, 所述抗體結合多肽, 所述多肽包含成熟的人 FGFR3 氨基酸序 列的氨基酸數 164-178 和 / 或 269-283, 基本上由成熟的人 FGFR3 氨基酸序列的氨基酸數 164-178 和 / 或 269-283 組成或由成熟的人 FGFR3 氨基酸序列的氨基酸數 164-178 和 / 或 269-283 組成。在 一 個 實 施 方 案 中,本 發 明 的 抗 -FGFR3 抗 體 特 異 性 地 結 合 與 序 列 LAVPAANTVRFRCPA(SEQ ID NO : 179) 和 / 或 SDVEFHCKVYSDAQP(SEQ ID NO : 180) 具有至少 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%序列同一性或相似性的氨基酸序列。
     在一個方面, 本發明的抗 -FGFR3 抗體與 FGFR3IIIb 多肽的殘基 154, 155, 158, 159, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 177, 202, 205, 207, 210, 212, 214, 216, 217, 241, 246, 247, 248, 278, 279, 280, 281, 282, 283, 314, 315, 316, 317 和 / 或 318, 或 FGFR3IIIc 多肽的等效殘基中的至少一個、 兩個、 三個、 四個或至多達全部的任 意數目個殘基結合。本領域普通技術人員理解如何比對 FGFR3 序列從而鑒定各個 FGFR3 序 列之間的對應殘基。 兩個或多個殘基的組合可以包括 FGFR3IIIb 多肽的殘基 154, 155, 158, 159, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 177, 202, 205, 207, 210, 212, 214, 216, 217, 241, 246, 247, 248, 278, 279, 280, 281, 282, 283, 314, 315, 316, 317 和 / 或 318, 或 FGFR3IIIc 多肽的等效殘基中的任一個。在一些實施方案中, 抗 -FGFR3 抗 體 與 FGFR3IIIb 多 肽 的 殘 基 158, 159, 169, 170, 171, 173, 175, 205, 207, 和 / 或 315, 或 FGFR3IIIc 多肽的等效殘基中的至少一個、 兩個、 三個、 四個或至多達全部的任意數目個殘 基結合。在一些實施方案中, 抗 -FGFR3 抗體與 FGFR3IIIb 多肽的殘基 158, 170, 171, 173, 175, 和 / 或 315, 或 FGFR3IIIc 多肽的等效殘基中的至少一個、 兩個、 三個、 四個或至多達全 部的任意數目個殘基結合。 在一個方面, 本發明提供了抗 -FGFR3 抗體, 所述抗 -FGFR3 抗體與上面提及的抗體 中的任一個競爭與 FGFR3 的結合。 在一個方面, 本發明提供了抗 -FGFR3 抗體, 所述抗 -FGFR3 抗體結合與上面提及的抗體中的任一個所結合的相同或相似的 FGFR3 上的表位。
     如本領域中已知的那樣, 以及如下文更詳細描述的那樣, 對抗體的高變區劃界的 抗體的氨基酸位置 / 邊界可以根據具體情況和本領域中已知的各種定義 ( 如下所述 ) 而變 化。可變結構域內的一些位置可以視為雜合的超變位置, 因為根據一組標準這些位置可以 視為處于高變區內, 而根據不同組的標準這些位置可以被視為在高變區之外。這些位置中 的一個或多個也可見于擴展的高變區中 ( 如下面進一步定義 )。
     在一些實施方案中, 所述抗體是單克隆抗體。 在其他實施方案中, 所述抗體是多克 隆抗體。在一些實施方案中, 所述抗體選自由嵌合抗體、 親和力成熟抗體、 人源化抗體和人 抗體組成的組。在某些實施方案中, 所述抗體是抗體片段。在一些實施方案中, 所述抗體是 Fab, Fab′, Fab′ -SH, F(ab′ )2, 或 scFv。
     在一些實施方案中, FGFR3 抗體是包含 Fc 區的單臂抗體 ( 即, 重鏈可變結構域和 輕鏈可變結構域形成單個抗原結合臂 ), 其中 Fc 區包含第一和第二 Fc 多肽, 其中第一和第 二 Fc 多肽以復合體存在并形成 Fc 區, 所述 Fc 區與包含所述抗原結合臂的 Fab 分子相比增 加所述抗體片段的穩定性。參見, 例如, WO2006/015371。
     在一個實施方案中, 所述抗體是嵌合抗體, 例如, 包含移植至異源的非人、 人或人 源化序列 ( 例如, 構架和 / 或恒定結構域序列 ) 的來自非人供體的抗原結合序列的抗體。 在 一個實施方案中, 所述非人供體是小鼠。在進一步的實施方案中, 抗原結合序列是合成的, 例如, 通過誘變獲得 ( 例如, 噬菌體展示篩選等 )。 在具體的實施方案中, 本發明的嵌合抗體 具有鼠的 V 區和人的 C 區。在一個實施方案中, 鼠輕鏈 V 區與人 κ 輕鏈融合。在另一個實 施方案中, 鼠重鏈 V 區與人 IgG1C 區融合。
     本發明的人源化抗體包括在構架區 (FR) 中具有氨基酸置換的那些和在移植的 CDR 中有改變的親和力成熟變體。CDR 或 FR 中被置換的氨基酸不限于存在于供體或受體抗 體中的那些。在其他的實施方案中, 本發明的抗體還包含 Fc 區中的氨基酸殘基改變, 所述 改變導致提高的效應子功能, 包括增強的 CDC 和 / 或 ADCC 功能和 B- 細胞殺傷作用。 本發明 的其他抗體包括具有改善穩定性的特異性改變的那些。在其他實施方案中, 本發明的抗體 包含 Fc 區中的氨基酸殘基改變, 所述改變導致降低的效應子功能, 例如降低的 CDC 和 / 或 ADCC 功能和 / 或減小的 B- 細胞殺傷作用。 在一些實施方案中, 本發明的抗體的特征在于與 自然殺傷 (NK) 細胞上的人補體因子 C1q 和 / 或人 Fc 受體的結合減少 ( 諸如缺乏結合 )。 在一些實施方案中, 本發明的抗體的特征在于與人 FcγRI, FcγRIIA, 和 / 或 FcγRIIIA 的 結合減少 ( 諸如缺乏結合 )。在一些實施方案中, 本發明的抗體是 IgG 類 ( 例如, IgG1 或 IgG4) 并且包含 E233, L234, G236, D265, D270, N297, E318, K320, K322, A327, A330, P331, 和 / 或 P329( 根據 EU 指數編號 ) 中的至少一個突變。在一些實施方案中, 所述抗體包含突 變 L234A/L235A 或 D265A/N297A。
     在抗體包含 Fc 區的情況下, 與其結合的糖類可以改變。例如, 具有成熟的糖結 構 ( 所述糖結構缺少與抗體的 Fc 區連接的巖藻糖 ) 的抗體記述在美國專利申請號 US 2003/0157108(Presta, L.) 中。還參見 US2004/0093621(Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd)。 在與抗體的 Fc 區連接的糖中具有平分型 N- 乙酰氨基葡糖胺 (GlcNAc) 的抗體參見 WO 2003/011878, Jean-Mairet 等和美國專利號 6,602,684, Umana 等。在與抗體的 Fc 區連接 的寡糖中具有至少一個半乳糖殘基的抗體在 WO 1997/30087, Patel 等中報道。還參見, WO 1998/58964(Raju, S.) 和 WO 1999/22764(Raju, S.), 它們涉及與抗體的 Fc 區連接的糖發生 改變的抗體。還參見 US 2005/0123546(Umana 等 ), 其關于具有改變的糖基化作用的抗原 結合分子。在一個方面, 本發明提供了 FGFR3 結合多肽, 所述多肽包含本文提供的任一個抗 原結合序列, 其中所述 FGFR3 結合多肽特異性地結合 FGFR3, 例如, 人和 / 或犬和 / 或小鼠 FGFR3。
     本 發 明 的 抗 體 結 合 ( 諸 如 特 異 性 結 合 )FGFR3( 例 如, FGFR3-IIIb 和 / 或 FGFR3-IIIc), 并且在一些實施方案中, 可以調節 ( 例如, 抑制 )FGFR3 信號傳導 ( 諸如 FGFR3 磷酸化 ) 中的一個或多個方面和 / 或破壞任何生物學相關的 FGFR3 和 / 或 FGFR3 配體生物 學途徑, 和 / 或治療和 / 或預防腫瘤、 細胞增生性病癥或癌癥 ; 和 / 或治療或預防與 FGFR3 表達和 / 或活性 ( 諸如增加的 FGFR3 表達和 / 或活性 ) 相關的病癥。在一些實施方案中, FGFR3 抗體特異性結合由 FGFR3( 例如, 人或小鼠 FGFR3) 組成或基本上由 FGFR3( 例如, 人或 小鼠 FGFR3) 組成的多肽。在一些實施方案中, 所述抗體以 1x10-7M 或更強的 Kd 特異性結 合 FGFR3。
     在一些實施方案中, 本發明的抗 -FGFR3 抗體不是 : 美國專利公開號 2005/0147612 中 所 述 的 抗 -FGFR3 抗 體 ( 例 如, 抗 體 MSPRO2, MSPRO12, MSPRO59, MSPRO11, MSPRO21, MSPRO24 ,MSPRO26 ,MSPRO28 ,MSPRO29 ,MSPRO43 ,MSPRO55) ,Rauchenberger 等,J Biol Chem( 生 物 化 學 雜 志 )278(40) : 38194-38205(2003) 中 所 述 的 抗 體 ; PCT 公 開 號 WO2006/048877 中 所 述 的 抗 體 ( 例 如, 抗 體 PRO-001), Martinez-Torrecuadrada 等, Mol Cancer Ther( 分子癌癥治療 )(2008)7(4) : 862-873 中所述的抗體 ( 例如, scFvαFGFR3 3C), Direnzo, R 等 (2007)Proceedings of AACR Annual Meeting(AACR 年會進展 ), 摘要No.2080 中所述的抗體 ( 例如, D11), 或 WO 2010/002862 中所述的抗體 ( 例如, 抗體 15D8, 27H2, 4E7, 2G4, 20B4)。
     在一個方面, 本發明提供包含載體和本發明的一種或多種抗體的組合物。在一個 實施方案中, 所述載體是藥用的。
     在另一個方面, 本發明提供編碼本發明的 FGFR3 抗體的核酸。
     還在另一個方面, 本發明提供包含本發明的核酸的載體。
     在進一步的方面, 本發明提供包含載體和本發明的一種或多種核酸的組合物。在 一個實施方案中, 所述載體是藥用的。
     在一個方面, 本發明提供包含本發明的核酸或載體的宿主細胞。載體可以是任何 類型, 例如, 重組載體諸如表達載體。可以使用多種宿主細胞中的任一種。在一個實施方案 中, 宿主細胞是原核細胞, 例如, 大腸桿菌 (E.coli)。 在另一個實施方案中, 宿主細胞是真核 細胞, 例如, 哺乳動物細胞, 諸如中國倉鼠卵巢 (CHO) 細胞。
     在進一步的方面, 本發明提供制備本發明的抗體的方法。例如, 本發明提供制備 抗 -FGFR3 抗體的方法 ( 所述抗 -FGFR3 抗體如本文所定義其包括全長抗體及其片段 ), 所述 方法包括在合適的宿主細胞表達編碼所述抗體的本發明的重組載體, 并回收所述抗體。在 一些實施方案中, 所述方法包括培養包含編碼所述抗體的核酸的宿主細胞, 使得所述核酸 得以表達。在一些實施方案中, 所述方法進一步包括從所述宿主細胞培養物中回收所述抗 體。在一些實施方案中, 所述抗體從所述宿主細胞培養基中回收。在一些實施方案中, 所述 方法進一步包括將回收的抗體與藥用載體、 賦形劑或載體組合從而制備包含所述人源化抗 體的藥物制劑。
     在一個方面, 本發明提供一種包含容器的制品 ; 和包含在容器內的組合物, 其中所 述組合物包含本發明的一種或多種 FGFR3 抗體。在一個實施方案中, 所述組合物包含本發 明的核酸。 在另一個實施方案中, 包含抗體的組合物還包含載體, 在一些實施方案中所述載 體是藥用的。在一個實施方案中, 本發明的制品還包含用于將所述組合物 ( 例如, 所述抗 體 ) 施用于個體的說明書 ( 諸如用于本文所述的任一種方法的說明書 )。
     在另一個方面, 本發明提供一種包含第一容器和第二容器的試劑盒, 所述第一容 器包含組合物, 所述組合物包含本發明的一種或多種抗 -FGFR3 抗體 ; 所述第二容器包含緩 沖劑。在一個實施方案中, 所述緩沖劑是藥用的。在一個實施方案中, 包含抗體的組合物還 包含載體, 在一些實施方案中所述載體是藥用的。 在另一個實施方案中, 試劑盒還包含用于 將所述組合物 ( 例如, 所述抗體 ) 施用于個體的說明書。
     在進一步的方面, 本發明提供了本發明的抗 -FGFR3 抗體, 所述抗 -FGFR3 抗體用作 藥物。
     在進一步的方面, 本發明提供本發明的抗 -FGFR3 抗體, 所述抗 -FGFR3 抗體用于治 療或預防病癥, 諸如與 FGFR3 激活和 / 或表達 ( 在一些實施方案中, 過表達 ) 相關的病理學 狀況。在一些實施方案中, 所述病癥是癌癥、 腫瘤和 / 或細胞增生性病癥。在一些實施方案 中, 所述癌癥、 腫瘤和 / 或細胞增生性病癥是多發性骨髓瘤或膀胱癌癥 ( 例如, 移行性細胞 癌 ), 乳腺癌或肝癌。
     在 進 一 步 的 方 面, 本 發 明 提 供 本 發 明 的 抗 -FGFR3 抗 體, 所 述 抗 -FGFR3 抗 體 用于治療或預防病癥諸如骨骼病癥。在一些實施方案中, 所述病癥是軟骨發育不全(achondroplasia)、 軟 骨 發 育 不 良 (hypochondroplasia)、 侏 儒 癥 (dwarfism)、 致死性 發 育 不 全 (thantophoricdysplasia)(TD ; 臨 床 形 式 TD1 和 TDII) 或 顱 縫 早 閉 綜 合 癥 (craniosynostosissyndrome)。
     在進一步的方面, 本發明提供本發明的抗 -FGFR3 抗體, 所述抗 -FGFR3 抗體用于減 少細胞增殖。
     在進一步的方面, 本發明提供本發明的抗 -FGFR3 抗體, 所述抗 -FGFR3 抗體用于殺 傷細胞。在一些實施方案中, 所述細胞是多發性骨髓瘤細胞。在一些實施方案中, 所述細胞 被 ADCC 殺傷。在一些實施方案中, 所述抗體是裸抗體。在一些實施方案中, 所述細胞過表 達 FGFR3。
     在進一步的方面, 本發明提供本發明的抗 -FGFR3 抗體, 所述抗 -FGFR3 抗體用于清 除細胞, 諸如多發性骨髓瘤細胞。在一些實施方案中, 所述細胞被 ADCC 殺傷。在一些實施 方案中, 所述抗體是裸抗體。在一些實施方案中, 所述細胞過表達 FGFR3。
     在進一步的方面, 本發明提供本發明的抗 -FGFR3 抗體在制備用于治療性和 / 或預 防性治療病癥的藥物中的用途, 所述病癥諸如與 FGFR3 激活和 / 或表達 ( 在一些實施方案 中, 過表達 ) 相關的病理學狀況。在一些實施方案中, 所述病癥是癌癥、 腫瘤和 / 或細胞增 生性病癥。在一些實施方案中, 所述癌癥、 腫瘤和 / 或細胞增生性病癥是多發性骨髓瘤或膀 胱癌 ( 例如, 移行性細胞癌 ), 乳腺癌或肝癌。在一些實施方案中, 所述病癥是骨骼病癥, 例 如, 軟骨發育不全、 軟骨發育不良、 侏儒癥、 致死性發育不全 (TD ; 臨床形式 TD1 和 TDII) 或 顱縫早閉綜合癥。
     在一個方面, 本發明提供本發明的核酸在制備用于治療性和 / 或預防性治療病癥 的藥物中的用途, 所述病癥諸如與 FGFR3 激活和 / 或表達 ( 在一些實施方案中, 過表達 ) 相 關的病理學狀況。在一些實施方案中, 所述病癥是癌癥、 腫瘤和 / 或細胞增生性病癥。在 一些實施方案中, 所述癌癥、 腫瘤和 / 或細胞增生性病癥是多發性骨髓瘤或膀胱癌 ( 例如, 移行性細胞癌 ), 乳腺癌或肝癌。在一些實施方案中, 所述病癥是骨骼病癥, 例如, 軟骨發育 不全、 軟骨發育不良、 侏儒癥、 致死性發育不全 (TD ; 臨床形式 TD1 和 TDII) 或顱縫早閉綜合 癥。
     在另一個方面, 本發明提供本發明的表達載體在制備用于治療性和 / 或預防性治 療病癥的藥物中的用途, 所述病癥諸如與 FGFR3 激活和 / 或表達 ( 在一些實施方案中, 過表 達 ) 相關的病理學狀況。 在一些實施方案中, 所述病癥是癌癥、 腫瘤和 / 或細胞增生性病癥。 在一些實施方案中, 所述癌癥、 腫瘤和 / 或細胞增生性病癥是多發性骨髓瘤或膀胱癌 ( 例 如, 移行性細胞癌 ), 乳腺癌或肝癌。 在一些實施方案中, 所述病癥是骨骼病癥, 例如, 軟骨發 育不全、 軟骨發育不良、 侏儒癥、 致死性發育不全 (TD ; 臨床形式 TD1 和 TDII) 或顱縫早閉綜 合癥。
     還在另一個方面, 本發明提供本發明的宿主細胞在制備用于治療性和 / 或預防性 治療病癥的藥物中的用途, 所述病癥諸如與 FGFR3 激活和 / 或表達 ( 在一些實施方案中, 過 表達 ) 相關的病理學狀況。在一些實施方案中, 所述病癥是癌癥、 腫瘤和 / 或細胞增生性病 癥。在一些實施方案中, 所述癌癥、 腫瘤和 / 或細胞增生性病癥是多發性骨髓瘤或膀胱癌 ( 例如, 移行性細胞癌 ), 乳腺癌或肝癌。在一些實施方案中, 所述病癥是骨骼病癥, 例如, 軟 骨發育不全、 軟骨發育不良、 侏儒癥、 致死性發育不全 (TD ; 臨床形式 TD1 和 TDII) 或顱縫早閉綜合癥。
     在進一步的方面, 本發明提供本發明的制品在制備用于治療性和 / 或預防性治療 病癥的藥物中的用途, 所述病癥諸如與 FGFR3 激活和 / 或表達 ( 在一些實施方案中, 過表 達 ) 相關的病理學狀況。 在一些實施方案中, 所述病癥是癌癥、 腫瘤和 / 或細胞增生性病癥。 在一些實施方案中, 所述癌癥、 腫瘤和 / 或細胞增生性病癥是多發性骨髓瘤或膀胱癌 ( 例 如, 移行性細胞癌 ), 乳腺癌或肝癌。 在一些實施方案中, 所述病癥是骨骼病癥, 例如, 軟骨發 育不全、 軟骨發育不良、 侏儒癥、 致死性發育不全 (TD ; 臨床形式 TD1 和 TDII) 或顱縫早閉綜 合癥。
     在進一步的方面, 本發明提供本發明的試劑盒制備用于治療性和 / 或預防性治療 病癥的藥物中的用途, 所述病癥諸如與 FGFR3 激活和 / 或表達 ( 在一些實施方案中, 過表 達 ) 相關的病理學狀況。 在一些實施方案中, 所述病癥是癌癥、 腫瘤和 / 或細胞增生性病癥。 在一些實施方案中, 所述癌癥、 腫瘤和 / 或細胞增生性病癥是多發性骨髓瘤或膀胱癌 ( 例 如, 移行性細胞癌 ), 乳腺癌或肝癌。 在一些實施方案中, 所述病癥是骨骼病癥, 例如, 軟骨發 育不全、 軟骨發育不良、 侏儒癥、 致死性發育不全 (TD ; 臨床形式 TD1 和 TDII) 或顱縫早閉綜 合癥。
     在進一步的方面, 本發明提供本發明的抗 -FGFR3 抗體在制備用于抑制細胞增殖 的藥物中的用途。在進一步的方面, 本發明提供本發明的抗 -FGFR3 抗體在制備用于細胞殺 傷的藥物中的用途。在一些實施方案中, 所述細胞是多發性骨髓瘤細胞。在一些實施方案 中, 所述細胞被 ADCC 殺傷。在一些實施方案中, 所述抗體是裸抗體。在一些實施方案中, 所 述細胞過表達 FGFR3。
     在進一步的方面, 本發明提供本發明的抗 -FGFR3 抗體在制備用于清除細胞 ( 諸如 多發性骨髓瘤細胞 ) 的藥物中的用途。在一些實施方案中, 所述細胞被 ADCC 殺傷。在一些 實施方案中, 所述抗體是裸抗體。在一些實施方案中, 所述細胞過表達 FGFR3。
     本發明提供可用于調節與 FGFR3 的表達和 / 或信號傳導, 諸如增加表達和 / 或信 號傳導或不合乎需要的表達和 / 或信號傳導相關的病癥的方法和組合物。
     本發明的方法可以用來影響任何合適的病理學狀態。示例性的病癥如本文所 述, 并且包括選自由下列各項組成的組的癌癥 : 非小細胞肺癌 (non-small cell lung cancer), 卵 巢 癌, 甲 狀 腺 癌, 睪 丸 癌 (testicularcancer), 子 宮 內 膜 癌 (endometrial cancer), 頭頸癌, 腦癌 ( 例如, 神經母細胞瘤 (neuroblastoma) 或腦膜瘤 (meningioma)), 皮膚癌 ( 例如, 黑色素瘤, 基底細胞癌 (basal cell carcinoma) 或鱗狀細胞癌 ), 膀胱癌 ( 例如, 移行性細胞癌 ), 乳腺癌, 胃癌, 結直腸癌 (CRC), 肝細胞癌, 子宮頸癌, 肺癌, 胰腺癌, 前列腺癌和惡性血液病 ( 例如, T- 細胞急性淋巴細胞白血病 (T-ALL), B- 細胞急性淋巴細 胞白血病 (B-ALL), 急性髓細胞白血病 (AML), B- 細胞惡性腫瘤, 霍奇金淋巴瘤 (Hodgkin lymphoma) 和多發性骨髓瘤 )。在一些實施方案中, 所述病癥是侵襲性移行性細胞癌。在一 些實施方案中, 所述病癥是多發性骨髓瘤。 其他的示例性病癥包括骨骼病癥, 諸如軟骨發育 不全、 軟骨發育不良、 侏儒癥、 致死性發育不全 (TD ; 臨床形式 TD1 和 TDII) 或顱縫早閉綜合 癥。
     在某些實施方案中, 所述癌癥表達 FGFR3, 擴增的 FGFR3, 易位的 FGFR3, 和 / 或突變 的 FGFR3。 在某些實施方案中, 所述癌癥表達激活的 FGFR3。 在某些實施方案中, 所述癌癥表達易位的 FGFR3( 例如, t(4 ; 14) 易位 )。在某些實施方案中, 所述癌癥表達組成型 FGFR3。 在一些實施方案中, 組成型 FGFR3 包括酪氨酸激酶結構域和 / 或近膜結構域和 / 或配體結 合結構域中的突變。 在某些實施方案中, 所述癌癥表達配體不依賴性 FGFR3。 在一些實施方 案中, 所述癌癥表達配體依賴性 FGFR3。
     在一些實施方案中, 所述癌癥表達包含對應于 FGFR3-IIIbS248C 的突變的 FGFR3。 在 S248C S248C 一些實施方案中, 所述癌癥表達 FGFR3-IIIb 和 / 或 FGFR3-IIIc 。
     在一些實施方案中, 所述癌癥表達包含對應于 FGFR3-IIIbK652E 的突變的 FGFR3。 在 K652E K650E 一些實施方案中, 所述癌癥表達 FGFR3-IIIb 和 / 或 FGFR3-IIIc 。 S249C
     FGFR3 包含對應于 FGFR3-IIIb 的突變。在一些實施方案中, 所述癌癥表達 S249C S249C FGFR3-IIIb 和 / 或 FGFR3-IIIc 。
     在一個方面, 所述癌癥表達包含對應于 FGFR3-IIIbG372C 的突變的 FGFR3。 在一些實 G372C G370C 施方案中, 所述癌癥表達 FGFR3-IIIb 和 / 或 FGFR3-IIIc 。 Y375C
     在一個方面, 所述癌癥表達包含對應于 FGFR3-IIIb 的突變的 FGFR3。 在一些實 Y375C Y373C 施方案中, 所述癌癥表達 FGFR3-IIIb 和 / 或 FGFR3-IIIc 。
     在 一 些 實 施 方 案 中, 所 述 癌 癥 表 達 (a)FGFR3-IIIbK652E 和 (b)FGFR3-IIIbR248C, FGFR3-IIIbY375C, FGFR3-IIIbS249C, 和 FGFR3IIIb G372C 中的一種或多種。
     在 一 些 實 施 方 案 中, 所 述 癌 癥 表 達 (a)FGFR3-IIIbR248C 和 (b)FGFR3-IIIbK652E, FGFR3-IIIbY375C, FGFR3-IIIbS249C, 和 FGFR3-IIIbG372C 中的一種或多種。
     在 一 些 實 施 方 案 中, 所 述 癌 癥 表 達 (a)FGFR3-IIIbG372C 和 (b)FGFR3-IIIbK652E, FGFR3-IIIbY375C, FGFR3-IIIbS249C, 和 FGFR3-IIIbR248C 中的一種或多種。
     在 一 些 實 施 方 案 中,所 述 癌 癥 表 達 FGFR3-IIIbR248C, FGFR3-IIIbK652E, FGFR3-IIIbY375C, FGFR3-IIIb S249C, 和 FGFR3-IIIb G372C。
     在某些實施方案中, 所述癌癥表達相對于對照樣品 ( 例如, 正常組織的樣品 ) 或水 平增加水平的磷酸 -FGFR3, 磷酸 -FRS2 和 / 或磷酸 -MAPK。
     在一些實施方案中, 所述癌癥表達 ( 例如, 在細胞表面上 ) 約 10,000 個 FGFR3 分 子 / 細胞或更多 ( 諸如 11,000, 12,000, 13,000, 14,000, 15,000, 16,000, 17,000, 18,000 或 更多個 FGFR3 受體 )。在一些實施方案中, 所述癌癥表達約 13000 個 FGFR3 分子。在其他 實施方案中, 所述癌癥表達約 5000, 6000, 7000, 8000, 或更多個 FGFR3 分子。在一些實施方 案中, 所述癌癥表達小于約 4000, 3000, 2000, 1000, 或更少個 FGFR3 分子。在一些實施方案 中, 所述癌癥表達小于約 1000 個 FGFR3 分子。
     在一個實施方案中, 在本發明的方法中被靶向的細胞是癌細胞。例如, 癌細胞可 以是選自由下列各項組成的組的一種 : 乳腺癌細胞, 結直腸癌細胞, 肺癌細胞 ( 例如, 非 小細胞肺癌細胞 ), 甲狀腺癌細胞, 多發性骨髓瘤細胞, 睪丸癌細胞, 乳頭狀癌 (papillary carcinoma) 細胞, 結腸癌細胞, 胰腺癌細胞, 卵巢癌細胞, 宮頸癌細胞, 中樞神經細胞癌細 胞, 骨源性肉瘤 (osteogenic sarcoma) 細胞, 腎癌細胞, 肝細胞癌細胞, 膀胱癌細胞 ( 例如, 移行性細胞癌細胞 ), 胃癌細胞, 頭頸鱗狀癌細胞, 黑色素瘤細胞, 白血病細胞, 多發性骨髓 瘤細胞 ( 例如, 包含 t(4 ∶ 14)FGFR3 易位的多發性骨髓瘤細胞 ) 和結腸腺瘤細胞。在一個 實施方案中, 在本發明的方法中被靶向的細胞是過度增生和 / 或增生的細胞。在另一個實 施方案中, 在本發明的方法中被靶向的細胞是異常增生細胞 (dysplastic cell)。 還在另一個實施方案中, 在本發明的方法中被靶向的細胞是轉移細胞。
     在一個方面, 本發明提供抑制受試者中的細胞增殖的方法, 所述方法包括向所述 受試者施用有效量的抗 -FGFR3 抗體以減少細胞增殖。
     在一個方面, 本發明提供殺傷受試者中的細胞的方法, 所述方法包括向所述受試 者施用有效量的抗 -FGFR3 抗體以殺傷細胞。在一些實施方案中, 所述細胞是多發性骨髓瘤 細胞。在一些實施方案中, 所述細胞被 ADCC 殺傷。在一些實施方案中, 所述抗體是裸抗體。 在一些實施方案中, 所述細胞過表達 FGFR3。
     在一個方面, 本發明提供清除受試者中的細胞 ( 諸如多發性骨髓瘤細胞 ) 的方法, 所述方法包括向所述受試者施用有效量的抗 -FGFR3 抗體以殺傷細胞。在一些實施方案中, 所述細胞被 ADCC 殺傷。在一些實施方案中, 所述抗體是裸抗體。在一些實施方案中, 所述 細胞過表達 FGFR3。
     在一個方面, 本發明提供治療或預防骨骼病癥的方法。 在一些實施方案中, 所述病 癥是軟骨發育不全、 軟骨發育不良、 侏儒癥、 致死性發育不全 (TD ; 臨床形式 TD1 和 TDII) 或 顱縫早閉綜合癥。
     本發明的方法可以進一步包括附加的治療步驟。 例如, 在一個實施方案中, 一種方 法進一步包括一個步驟, 在所述步驟中被靶向的細胞和 / 或組織 ( 例如, 癌細胞 ) 暴露于放 射治療或化療劑。 在一個方面, 本發明提供了下述方法, 所述方法包括施用有效量的抗 -FGFR3 抗體 結合有效量的另一種治療劑 ( 諸如抗 - 血管生成劑, 另一種抗體, 化療劑, 細胞毒性劑, 免 疫抑制劑, 前藥, 細胞因子, 細胞毒性放射治療, 皮質類固醇, 止吐劑, 癌癥疫苗, 止痛劑, 或 生長抑制劑 )。例如, 抗 -FGFR3 抗體與抗癌劑或抗血管生成劑聯合使用以治療多種腫瘤 或非腫瘤病癥。在具體的實例中, 抗 -FGFR3 抗體與下列聯合使用 : 萬珂 (velcade), 來那 度胺 (revlimid), 他莫昔芬 (tamoxifen), 來曲唑 (letrozole), 依西美坦 (exemestane), 阿 那 曲 唑 (anastrozole), 伊 立 替 康 (irinotecan), 西 妥 昔 單 抗 (cetuximab), 氟維司 群 (fulvestrant), 長 春 瑞 濱 (vinorelbine), 貝 伐 珠 單 抗 (bevacizumab), 長春新堿 (vincristine), 順鉑 (cisplain), 吉西他濱 (gemcitabine), 甲氨蝶呤 (methotrexate), 長 春堿 (vinblastine), 卡鉑 (carboplatin), 紫杉醇 (paclitaxel), 多西他賽 (docetaxel), 培 美 曲 塞 (pemetrexed), 5- 氟 尿 嘧 啶 (5-fluorouracil), 多 柔 比 星 (doxorubicin), 硼 替 佐 米 (bortezomib), 來 那 度 胺 (lenalidomide), 地 塞 米 松 (dexamethasone), 馬 法 蘭 (melphalin), 潑 尼 松 (prednisone), 長 春 新 堿 (vincristine) 和 / 或 沙 利 度 胺 (thalidomide)。
     取決于待治療的具體癌癥適應證, 本發明的聯合療法可以與附加的治療劑諸如化 療劑, 或附加的療法諸如放療或手術結合。許多已知的化療劑可以用于本發明的聯合療法 中。優選使用為用于治療所述具體適應證的標準的那些化療劑。要聯合使用的每種治療劑 的劑量或頻次優選與當不使用其他一種或多種藥劑時相應治療劑的劑量或頻次相同, 或小 于相應治療劑的劑量或頻次。
     在另一個方面, 本發明提供本文所述的任一種抗 -FGFR3 抗體, 其中所述抗 -FGFR3 抗體包含可檢測的標記物。
     在另一個方面, 本發明提供本文所述的任一種抗 -FGFR3 抗體和 FGFR3 的復合體。
     在一些實施方案中, 所述復合體在體內或體外。在一些實施方案中, 所述復合體包含癌細 胞。在一些實施方案中, 抗 -FGFR3 抗體被可檢測地標記。
     附圖簡要說明
     圖 1A, 1B 和 1C : 抗 -FGFR3 抗體的重鏈和輕鏈 HVR 環序列。所述附圖顯示重鏈 HVR 序列, H1, H2 和 H3, 以及輕鏈 HVR 序列, L1, L2, 和 L3。序列編號如下 :
     克隆 184.6(HVR-H1 是 SEQ ID NO : 1; HVR-H2 是 SEQ ID NO : 2; HVR-H3 是 SEQ ID NO : 3; HVR-L1 是 SEQ ID NO : 4; HVR-L2 是 SEQ IDNO : 5; HVR-L3 是 SEQ ID NO : 6) ;
     克隆 184.6.1(HVR-H1 是 SEQ ID NO : 7; HVR-H2 是 SEQ ID NO : 8; HVR-H3 是 SEQ ID NO : 9; HVR-L1 是 SEQ ID NO : 10 ; HVR-L2 是 SEQ IDNO : 11 ; HVR-L3 是 SEQ ID NO : 12)
     克隆 184.6.58(HVR-H1 是 SEQ ID NO : 13 ; HVR-H2 是 SEQ ID NO : 14 ; HVR-H3 是 SEQ ID NO : 15 ; HVR-L1 是 SEQ ID NO : 16 ; HVR-L2 是 SEQ IDNO : 17 ; HVR-L3 是 SEQ ID NO : 18)
     克隆 184.6.62(HVR-H1 是 SEQ ID NO : 48 ; HVR-H2 是 SEQ ID NO : 49 ; HVR-H3 是 SEQ ID NO : 50 ; HVR-L1 是 SEQ ID NO : 51 ; HVR-L2 是 SEQ IDNO : 52 ; HVR-L3 是 SEQ ID NO : 53)
     克隆 184.6.21(HVR-H1 是 SEQ ID NO : 54 ; HVR-H2 是 SEQ ID NO : 55 ; HVR-H3 是 SEQ ID NO : 56 ; HVR-L1 是 SEQ ID NO : 57 ; HVR-L2 是 SEQ IDNO : 58 ; HVR-L3 是 SEQ ID NO : 59)
     克隆 184.6.49(HVR-H1 是 SEQ ID NO : 60 ; HVR-H2 是 SEQ ID NO : 61 ; HVR-H3 是 SEQ ID NO : 62 ; HVR-L1 是 SEQ ID NO : 63 ; HVR-L2 是 SEQ IDNO : 64 ; HVR-L3 是 SEQ ID NO : 65)
     克隆 184.6.51(HVR-H1 是 SEQ ID NO : 66 ; HVR-H2 是 SEQ ID NO : 67 ; HVR-H3 是 SEQ ID NO : 68 ; HVR-L1 是 SEQ ID NO : 69 ; HVR-L2 是 SEQ IDNO : 70 ; HVR-L3 是 SEQ ID NO : 71)
     克隆 184.6.52(HVR-H1 是 SEQ ID NO : 72 ; HVR-H2 是 SEQ IDNO : 73 ; HVR-H3 是 SEQ ID NO : 74 ; HVR-L1 是 SEQ ID NO : 75 ; HVR-L2 是 SEQ ID NO : 76 ; HVR-L3 是 SEQ ID NO : 77)
     克隆 184.6.92(HVR-H1 是 SEQ ID NO : 78 ; HVR-H2 是 SEQ IDNO : 79 ; HVR-H3 是 SEQ ID NO : 80 ; HVR-L1 是 SEQ ID NO : 81 ; HVR-L2 是 SEQ ID NO : 82 ; HVR-L3 是 SEQ ID NO : 83)
     克隆 184.6.1.N54S(HVR-H1 是 SEQ ID NO : 84 ; HVR-H2 是 SEQ IDNO : 85 ; HVR-H3 是 SEQ ID NO : 86 ; HVR-L1 是 SEQ ID NO : 87 ; HVR-L2 是 SEQ ID NO : 88 ; HVR-L3 是 SEQ ID NO : 89)
     克隆 184.6.1.N54G(HVR-H1 是 SEQ ID NO : 90 ; HVR-H2 是 SEQ IDNO : 91 ; HVR-H3 是 SEQ ID NO : 92 ; HVR-L1 是 SEQ ID NO : 93 ; HVR-L2 是 SEQ ID NO : 94 ; HVR-L3 是 SEQ ID NO : 95)
     克隆 184.6.1.N54A(HVR-H1 是 SEQ ID NO : 96 ; HVR-H2 是 SEQ IDNO : 97 ; HVR-H3 是 SEQ ID NO : 98 ; HVR-L1 是 SEQ ID NO : 99 ; HVR-L2 是 SEQ ID NO : 100 ; HVR-L3 是 SEQ ID NO : 101)
     克隆 184.6.1.N54Q(HVR-H1 是 SEQ ID NO : 102 ; HVR-H2 是 SEQID NO : 103 ; HVR-H3 是 SEQ ID NO : 104 ; HVR-L1 是 SEQ ID NO : 105 ; HVR-L2 是 SEQ ID NO : 106 ; HVR-L3 是 SEQ ID NO : 107)
     克隆 184.6.58.N54S(HVR-H1 是 SEQ ID NO : 108 ; HVR-H2 是 SEQID NO : 109 ; HVR-H3 是 SEQ ID NO : 110 ; HVR-L1 是 SEQ ID NO : 111 ; HVR-L2 是 SEQ ID NO : 112 ; HVR-L3 是 SEQ ID NO : 113)
     克隆 184.6.58.N54G(HVR-H1 是 SEQ ID NO : 114 ; HVR-H2 是 SEQID NO : 115 ; HVR-H3是 SEQ ID NO : 116 ; HVR-L1 是 SEQ ID NO : 117 ; HVR-L2 是 SEQ ID NO : 118 ; HVR-L3 是 SEQ ID NO : 119)
     克隆 184.6.58.N54A(HVR-H1 是 SEQ ID NO : 120 ; HVR-H2 是 SEQID NO : 121 ; HVR-H3 是 SEQ ID NO : 122 ; HVR-L1 是 SEQ ID NO : 123 ; HVR-L2 是 SEQ ID NO : 124 ; HVR-L3 是 SEQ ID NO : 125)
     克隆 184.6.58.N54Q(HVR-H1 是 SEQ ID NO : 126 ; HVR-H2 是 SEQID NO : 127 ; HVR-H3 是 SEQ ID NO : 128 ; HVR-L1 是 SEQ ID NO : 129 ; HVR-L2 是 SEQ ID NO : 130 ; HVR-L3 是 SEQ ID NO : 131)。
     克 隆 184.6.1.NS D30E(HVR-H1 是 SEQ ID NO : 143 ; HVR-H2 是 SEQ ID NO : 144 ; HVR-H3 是 SEQ ID NO : 145 ; HVR-L1 是 SEQ ID NO : 140 ; HVR-L2 是 SEQ ID NO : 141 ; HVR-L3 是 SEQ ID NO : 142)。
     氨基酸位置根據下述 Kabat 編號系統進行編號。
     圖 2A 和 2B : 描繪了 (A) 抗 -FGFR3 抗體 184.6.1.N54S, 184.6.58, 和 184.6.62 的 重鏈可變區和輕鏈可變區的氨基酸序列 ; 和 (B) 抗 -FGFR3 抗體 1G6, 6G1, 和 15B2 的高變區。
     圖 3A, 3B, 和4: 描繪了示例性的接納體 (acceptor) 人共有構架序列, 其用于使用 如下的序列標識符實施本發明 :
     可變重鏈 (VH) 共有構架 ( 圖 3A, 3B)
     人 VH 亞組 I 共有構架減去 Kabat CDRs(SEQ ID NOS : 19 和 203-205)
     人 VH 亞 組 I 共 有 構 架 減 去 延 伸 的 高 變 區 (SEQ ID NOS : 20 和 206-208, 21 和 209-211, 22 和 212-214)
     人 VH 亞組 II 共有構架減去 Kabat CDRs(SEQ ID NOS : 23 和 215-217)
     人 VH 亞組 II 共有構架減去延伸的高變區 (SEQ ID NOS : 24 和 218-220, 25 和 221-223, 26 和 224-226)
     人 VH 亞組 II 共有構架減去延伸的
     人 VH 亞組 III 共有構架減去 Kabat CDRs(SEQ ID NOS : 27 和 227-229)
     人 VH 亞組 III 共有構架減去延伸的高變區 (SEQ ID NOS : 28 和 230-232, 29 和 233-235, 30 和 236-238)
     人 VH 接納體構架減去 Kabat CDRs(SEQ ID NOS : 31 和 239-241)
     人 VH 接納體構架減去延伸的高變區 (SEQ ID NOS : 32 和 242-244, 33 和 2245-247)
     人 VH 接納體 2 構架減去 Kabat CDRs(SEQ ID NOS : 34 和 248-250)
     人 VH 接納體 2 構架減去延伸的高變區 (SEQ ID NOS : 35 和 251-253, 36 和 254-256, 37 和 257-259)
     可變輕鏈 (VL) 共有構架 ( 圖 4)
     人 VLκ 亞組 I 共有構架 (SEQ ID NO : 38 和 260-262)
     人 VLκ 亞組 II 共有構架 (SEQ ID NO : 39 和 263-265)
     人 VLκ 亞組 III 共有構架 (SEQ ID NO : 40 和 266-268)
     人 VLκ 亞組 IV 共有構架 (SEQ ID NO : 41 和 269-271)
     圖5: 描繪了 huMAb4D5-8 輕鏈 (SEQ ID NOS : 42-45) 和重鏈 (SEQ IDNOS : 46, 47, 175, 176) 的構架區序列。上標 / 粗體中的數字表示按照 Kabat 的氨基酸位置。圖6 : 描繪了 huMAb4D5-8 輕鏈 (SEQ ID NOS : 42, 43, 177, 45) 和重鏈 (SEQ ID NOS : 46, 47, 178, 和 176) 的修飾 / 變體的構架區序列。上標 / 粗體中的數字表示按照 Kabat 的 氨基酸位置。上標 / 粗體中的數字表示按照 Kabat 的氨基酸位置。
     圖7 : 在膀胱癌細胞 RT112 中敲低 FGFR3 抑制增殖并在體外誘導 G1 細胞周期停滯, 并在體內抑制腫瘤生長。將三種不同的 FGFR3shRNA 克隆進 Tet- 可誘導型表達載體中。使 用嘌呤霉素選擇建立穩定表達 FGFR3shRNAs 或對照 shRNA 的 RT112 細胞。 (A) 在選擇的用強 力霉素處理或未用強力霉素 (Dox, 0, 0.1 和 1μg/ml, 從左至右 ) 處理的克隆中顯示 FGFR3 3 表達的代表性印跡 .(B)RT112 穩定細胞的 [ H]- 胸苷的摻入。 將 RT112 穩定的克隆用或不用 3 1μg/ml 強力霉素培養 3 天, 然后與 [ H]- 胸苷 (1μCi/ 孔 ) 溫育 16 小時。摻入的 [3H]- 胸 苷的計數針對來自沒有使用強力霉素誘導的細胞的計數進行標準化。 誤差條代表 SEM。 (C) RT112 穩定細胞的 DNA 熒光流式細胞儀直方圖。表達對照 shRNA 或 FGFR3 shRNA4 的 RT112 克隆用或不用 1μg/ml 強力霉素培養 72 小時, 并用碘化丙啶 (PI) 染色細胞核。對 FGFR3 shRNA2 和 6 獲得類似的結果 ( 圖 16)。(D) 表達對照 shRNA( 每個處理組 n = 9) 或 FGFR3 shRNA4( 每個處理組 n = 11) 的 RT112 細胞在小鼠中的生長。小鼠單獨給予 5%蔗糖或補 充以 1mg/ml 強力霉素, 并且一周測量腫瘤大小兩次。誤差條代表 SEM。對 FGFR3shRNA2 和 6 獲得類似的結果 ( 圖 16)。下部圖片 : 從對照 shRNA 或 FGFR3shRNA4 穩定細胞異種移植物 組織中提取的腫瘤裂解產物中 FGFR3 蛋白的表達。
     圖8: R3Mab 阻斷 FGF/FGFR3 相互作用。(A)R3Mab 對人 FGFR3 的選擇性結合。人 FGFR1-4Fc 嵌合蛋白被固定并與漸增量的 R3Mab 溫育。使用抗 - 人 Fab 抗體檢測特異性 結合。(B-C)R3Mab 阻斷 FGF1 與人 FGFR3-IIIb(B) 或 IIIc(C) 的結合。使用生物素化的 FGF1- 特異性多克隆抗體檢測特異性結合。(D-E)R3Mab 阻斷 FGF9 與人 FGFR3-IIIb(D) 或 IIIc(E) 的結合。使用生物素化的 FGF9- 特異性多克隆抗體檢測特異性結合。誤差條代表 平均值的標準誤差 (SEM) 并且有時小于符號。
     圖9 : R3Mab 抑制由野生型和突變的 FGFR3 驅動的 Ba/F3 細胞增殖。 (A)R3Mab 對表 達野生型人 FGFR3-IIIb 的 Ba/F3 細胞的活力的抑制作用。細胞在不含 FGF1( 無 FGF1) 的 培養基中培養, 或在單獨的 10ng/ml FGF1 加 10μg/ml 肝素 (FGF1) 的存在下培養, 或結合 對照抗體 (Control) 或 R3Mab 培養。在與抗體溫育 72 小時后用 CellTiter-Glo(Promega) 評價細胞活力。(B) 在 Ba/F3-FGFR3-IIIbWT 穩定的細胞中 R3Mab 對 FGFR3 和 MAPK 磷酸化 的抑制。將細胞用 15ng/ml FGF1 和 10μg/ml 肝素 (+) 或單獨肝素 (-) 處理 10 分鐘, 然后 與對照 Ab(Ctrl), 遞減量的 PBS 中的 R3Mab( 分別為 1, 0, 2, 0.04μg/ml), 或單獨 PBS( 模擬 653/654 Thr202/Tyr204 (Mock)) 預溫育 3 小時。裂解產物用分別針對 pFGFRY 和 pMAPK 的抗體進行免 疫印跡以評價 FGFR3 和 p44/42MAPK 的磷酸化。(C) 基于發表的數據的膀胱癌中 FGFR3 突變 熱點和頻次的示意性圖示 ( 繪制的序列編號基于 FGFR3IIIb 同種型氨基酸序列 )(32)。 TM, 跨膜結構域 ; TK1 和 TK2, 酪氨酸激酶結構域 1 和 2。(D-H)R3Mab 對表達癌相關 FGFR3 突變 體的 Ba/F3 細胞的活力的抑制作用。G372C 來自 IIIc 同種型, 且其余的來自 IIIb 同種型。 對于所有突變體的序列編號基于 FGFR3IIIb 同種型氨基酸序列 ( 包括 G372C 突變體, 其將 基于 FGFR3IIIc 同種型氨基酸序列編號為 G370C)。如 (A) 中所述在與抗體溫育 72 小時后 評價細胞活力。誤差條表示 SEM。
     圖 10 : R3Mab 的表位作圖以及 R3Mab Fab 片段和人 FGFR3-IIIb 的 IgD2-D3 之間的復合體的晶體結構。(A) 通過跨越人 FGFR3 的 IgD2-D3 的 13 個肽與 R3Mab 的結合確定 的表位。每個生物素化的肽被俘獲在鏈霉抗生物素蛋白 (streptavidin) 包被的微量滴定 孔上并與 R3Mab 溫育。使用山羊抗人 IgG 抗體檢測特異性結合的 R3Mab。(B) 人 FGFR3 肽 3(LAVPAANTVRFRCPA(SEQ ID NO : 179) 和 11(SDVEFHCKVYSDAQP(SEQ ID NO : 180) 與人 FGFR1 的細胞外區段 ( 肽 3 : HAVPAAKTVKFKCPS(SEQ ID NO : 181) ; 肽 11 : SNVEFMCKVYSDPQP(SEQ ID NO : 182)) 的序列比對。參與初級 FGF2-FGFR1 相互作用、 肝素結合、 和受體 - 受體締合的 FGFR1 殘基分別以粗體、 斜體和下劃線的字體顯示。FGFR1 殘基的功能比對基于 Plotnikov 等 (34)。(C) 與人 FGFR3IgD2-D3( 顯示在分子表面, 白色 ) 形成復合體的 R3Mab Fab( 顯 示為絲帶 - 螺旋, 輕鏈灰色, 重鏈黑色 ) 的結構。參與配體結合和二聚作用的受體殘基基 于 Plotnikov 等 (34) 分別以灰色 / 陰影交叉線和深灰色著色。(D) 晶體結構的特寫顯 示 來 自 Fab 的 CDR-H3 和 -H2 構 成 與 FGFR3 的 IgD2 和 IgD3 的 主 要 相 互 作 用 位 點。(E) FGFR3-IIIc-FGF1 復合體 (PDB 代碼 1RY7) 與 FGFR3-IIIb-Fab 復合體的重疊。FGFR3-IIIc 和 FGF1 分別以灰色和深灰色著色。FGFR3-IIIb 以白色顯示, 且 Fab 以淺灰色顯示輕鏈, 深 灰色顯示重鏈。IgD2 用作用于重疊的錨。注意當被 R3Mab 結合時來自兩個結構的重疊良好 的 IgD2 和 FGFR3-IIIb 的 IgD3 所采取的新構象。(F)FGFR3-IIIc-FGF1 復合體 (PDB 代碼 1RY7) 與 FGFR3-IIIb-Fab 復合體重疊的另一圖示。FGFR3-IIIc 和 FGF1 顯示為分子表面, 它們分別是灰色 / 網狀構造和深灰色 / 斑點構造。FGFR3-IIIb 顯示為白色且 Fab 以灰色顯 示輕鏈, 黑色顯示重鏈。IgD2 用作用于重疊的錨。注意當被 R3Mab 結合時來自兩個結構的 重疊良好的 IgD2 和 FGFR3-IIIb 的 IgD3 所采取的新構象。
     圖 11 : R3Mab 抑制表達野生型或突變的 FGFR3S249C 的膀胱癌細胞中的增殖、 克隆性 3 生長和 FGFR3 信號傳導。(A) 在膀胱癌細胞系 RT112 中 R3Mab 抑制 [ H]- 胸苷摻入。誤差 條代表 SEM。 (B) 在膀胱癌細胞系 RT112 中與單獨處理培養基 (Mock) 或對照抗體 (Ctrl) 相 比較, R3Mab(15μg/ml) 阻斷 FGF1- 激活的 FGFR3 信號傳導。細胞裂解物用抗 -FGFR3 抗體 免疫沉淀并用抗磷酸 - 酪氨酸抗體 (4G10) 評價 FGFR3 磷酸化。將裂解物免疫印跡以檢測 AKT(pAKTS473) 和 p44/42MAPK(pMAPKThr202/Tyr204) 的磷酸化。 (C) 在膀胱癌細胞系 UMUC-14( 攜帶 S249C FGFR3 ) 中與單獨處理培養基 (Mock) 或對照抗體 (Ctrl) 相比較, R3Mab(10μg/ml) 抑制 克隆性生長。 (D)(C) 中研究的定量, 從 12 個孔的復孔報告每孔直徑大于 120μm 的集落數。 -9 誤差條代表 SEM。P < 3.4X10 相對于 Mock 或 Ctrl。(E) 在 UMUC-14 細胞中 R3Mab(15μg/ ml) 抑制 FGFR3 磷酸化。如 (B) 中那樣分析 FGFR3 磷酸化。注意在此細胞系中 FGFR3 的組 成型磷酸化。
     圖 12 : R3Mab 通過將二聚體 - 單體平衡朝向單體狀態驅動來減少二硫化物連接的 S249C FGFR3 二聚體的穩態水平。(A) 在 UMUC-14 細胞中 R3Mab 對 FGFR3S249C 二聚體的作用。將 細胞與 R3Mab(15μg/ml) 或對照抗體 (Ctrl) 溫育 3 小時, 且通過在非還原和還原條件下的 免疫印跡來分析全細胞裂解物。 (B) 在 UMUC-14 細胞中游離巰基阻斷劑 DTNB 對 FGFR3S249C 二 聚體 - 單體平衡的作用。 將 UMUC-14 細胞用漸增濃度的 DTNB 處理 3 小時, 如 (A) 中那樣分析 S249C 細胞裂解物。(C) 在體外 R3Mab 對純化的重組 FGFR3 二聚體的作用。由 IgD2-D3 構成的 S249C FGFR3 二聚體通過尺寸排阻柱純化, 并與 PBS(Mock), 對照抗體 (Ctrl), 或 R3Mab 在 37℃ 下溫育。在指定的時間收集樣品用于在非還原條件下進行免疫印跡分析。使用抗 -FGFR3 雜交瘤抗體 6G1(A-C) 檢測 FGFR3 二聚體 - 單體。圖 13 : R3Mab 抑制膀胱癌細胞的異種移植物生長和 Ba/F3-FGFR3S249C 的同種異體移 植物生長。(A) 與賦形劑 (vehicle) 對照相比, R3Mab 對預先形成的 RT112 膀胱癌異種移植 物的生長的作用。每組 n = 10。(B)R3Mab 抑制 RT112 腫瘤組織中的 FGFR3 信號傳導。在 獨立的實驗中, 收集用 15mg/kg 對照抗體 (Ctrl) 或 R3Mab 處理 48 小時或 72 小時的 RT112 異種移植物腫瘤 ( 每組 n = 3), 勻漿并通過免疫印跡分析 FRS2α 和 MAPK 激活。(C)R3Mab S249C 對預先形成的 Ba/F3-FGFR3 同種異體移植物的生長的作用。每組 n = 10。(D)R3Mab 對 預先形成的 UMUC-14 膀胱異種移植物的生長的作用, 每組 n = 10。(E) 在 UMUC-14 腫瘤組 S249C 織中 R3Mab 對 FGFR3 二聚體和信號傳導的作用。收集用 30mg/kg 對照抗體 (Ctrl) 或 R3Mab 處理 24 小時或 72 小時的 UMUC-14 異種移植物腫瘤 ( 每組 n = 3), 勻漿并通過免疫 S249C 印跡分析 FGFR3 二聚體 - 單體以及 MAPK 激活。使用抗 -FGFR3 兔多克隆抗體 sc9007 檢 測 FGFR3 二聚體 - 單體以避免來自腫瘤裂解物中小鼠 IgG 的干擾。誤差條代表 SEM。
     圖 14 : 在 t(4 ; 14) 陽性多發性骨髓瘤模型中, ADCC 有助于 R3Mab 的抗 - 腫瘤功效。 (A-B)R3Mab 對預先形成的 OPM2(A) 和 KMS11(B) 骨髓瘤異種移植物的生長的作用。每組 n = 10。(C-F) 在細胞培養中 R3Mab 誘導的骨髓瘤細胞系 OPM2(C) 和 KMS11(D), 或膀胱癌細 胞系 RT112(E) 和 UMUC-14(F) 的細胞裂解。骨髓瘤或膀胱癌細胞與新鮮分離的人 PBMC 在 R3Mab 或對照抗體的存在下溫育。細胞毒性通過測量上清液中釋放的 LDH 來測定。(G-H) R3Mab 或其 DANA 突變體對預先形成的 OPM2(G) 和 KMS11(H) 骨髓瘤異種移植物的生長的作 用。每組 n = 10。誤差條代表 SEM 并且有時小于符號。
     圖 15 : 用 siRNA 敲低 FGFR3 抑制膀胱癌細胞系的細胞增殖。在 Genentech 設計和 合成 6-7 種不同的 FGFR3 siRNAs 和三種非特異性對照 siRNA。將膀胱癌細胞系 RT112(A), SW780(B), RT4(C) 和 UMUC-14(D) 接種至 96 孔板 (3000 細胞 / 孔 ) 中并使其貼壁過夜, 并且 3 用與 RNAiMax(Invitrogen) 形成復合體的 25nM siRNA 瞬時轉染。轉染后 72hr, 將 [ H]- 胸 3 苷 (1μCi/ 孔 ) 加入至培養物 (A, C, 和 D) 中進行另外 16 小時溫育。摻入的 [ H]- 胸苷用 TopCount 定量。數據針對來自用單獨 RNAiMax 轉染的細胞 (Mock) 的數據進行標準化。誤 差條代表 SEM。下部圖片 : 顯示 siRNA 轉染的細胞中 FGFR3 表達的代表性印跡。(B) 轉染后 96 小時用 CellTiter-Glo(Promega) 測量細胞活力。誤差條代表 SEM。
     圖 16 : 在膀胱癌細胞系 RT112 中敲低 FGFR3 在體外誘導 G1 細胞周期停滯, 并在體 內抑制腫瘤生長。設計三種不同的 FGFR3RNA 并克隆至 Tet- 誘導型 shRNA 表達逆轉錄病 毒載體中。采用嘌呤霉素選擇建立表達 FGFR3shRNA 或對照 shRNA 的 RT112 穩定的克隆。 (A) 在用或不用 1μg/ml 強力霉素處理 72 小時后從表達 FGFR3shRNA2 或 shRNA6 的 RT112 穩定的細胞獲得的碘化丙啶 (PI)- 染色的細胞核的 DNA 熒光流式細胞儀直方圖。(B) 表達 FGFR3shRNA2-4( 每個處理組 n = 11) 或 FGFR3shRNA6-16( 每個處理組 n = 10) 的 RT112 穩定的細胞在 nu/nu 小鼠中的生長。荷瘤小鼠接受僅 5%蔗糖 ( 實心圓圈 ) 或 5%蔗糖加 1mg/ml 強力霉素 ( 實心方形 ), 并且用測徑器測量腫瘤一周兩次。誤差條代表 SEM。
     圖 17 : 抗 -FGFR3 雜交瘤抗體 16G, 6G1 和 15B2 對由野生型和突變的 FGFR3 驅動的 Ba/F3 細胞增殖的作用。抗 -FGFR3 雜交瘤抗體通過用人 FGFR3-IIIb/Fc 或人 FGFR3-IIIc/ Fc 嵌 合 體 免 疫 BALB/c 小 鼠 產 生。 在 來 自 雜 交 瘤 選 擇 試 劑 盒 (StemCell Technologies, Inc., Vancouver, BC, Canada) 的培養基 D 中使用次黃嘌呤 - 氨基喋呤 - 胸 苷選擇來選擇融合的雜交瘤細胞。相繼地通過 ELISA 篩選雜交瘤抗體結合 FGFR3-IIIb 和FGFR3-IIIc 的能力并通過 FACS 識別細胞表面 FGFR3。然后將選擇的雜交瘤通過有限稀釋 克隆。類似于圖 9A 中所述, 16G, 6G1 和 15B2 是用來評價對表達野生型或突變的 FGFR3 的 Ba/F3 細胞增殖的作用的克隆。誤差條代表 SEM。
     圖 18 : 通過肽譜和晶體結構分析確定的 R3Mab 表位的比較。(A) 由與人 FGFR3 的 細胞外 IgD2-D3 區段形成復合體的 R3Mab Fab 片段的結構揭示的表位。與 Fab 重鏈和輕鏈 接觸的 FGFR3 殘基分別用黑色和灰色著色。(B)FGFR3 上肽 3 和 11 的位置。
     圖 19 : 在包含野生型或突變的 FGFR3S249C 的膀胱癌細胞中, R3Mab 抑制增殖和 FGFR3 信號傳導。(A) 在膀胱癌細胞系 RT4 中 R3Mab 抑制細胞活力。在與抗體溫育 96hr 后用 CellTiter-Glo(Promega) 評價細胞活力。誤差條代表 SEM。(B) 在膀胱癌細胞系 RT4 中 R3Mab(15ug/ml) 阻斷 FGF1- 激活的 FGFR3 信號傳導。(C) 在膀胱癌細胞系 RCC-97-7( 包 含 FGFR3S249C) 中, R3Mab 抑制 [3H]- 胸苷摻入。誤差條代表 SEM。(D) 在 TCC-97-7 細胞中, R3Mab(15ug/ml) 抑制 FGFR3 磷酸化。(E) 與對照抗體 (Ctrl) 相比, 在與 R3Mab(15ug/ml) S249C 溫育 3 小時后 TCC-97-7 細胞中的 FGFR3 二聚體減少。
     圖 20 : 在 UMUC-14 細胞中, 胞吞作用抑制劑對 R3Mab 和 FGFR3S249C 二聚體的內在化 的作用。(A) 胞吞作用抑制劑對 R3Mab 的內在化的作用。將用各種胞吞作用抑制劑或 DMSO 在 37℃下預處理 1 小時的 UMUC-14 細胞與 R3Mab(15ug/ml) 在 37℃下溫育 3 小時以允許內 在化。使用低 pH 洗滌來移除細胞表面 R3Mab 從而使內在化的抗體可視化。固定細胞并用 Alexa 488- 標記的抗 - 人 IgG 染色細胞。使用共聚焦顯微鏡攝取圖像。(B) 在用 R3Mab 處 理的 UMUC-14 細胞中, 胞吞作用抑制劑對 FGFR3S249C 二聚體的作用。將用各種胞吞作用抑制 劑或 DMSO 在 37℃下預處理 1 小時的 UMUC-14 細胞與載體對照 (mock)(1 道 ), 對照抗體 (2 道 ), 或 R3Mab(15ug/ml, 3 道 ) 在 37℃下溫育 3 小時。細胞裂解物在非還原或還原條件下 通過免疫印跡分析 FGFR3 蛋白。注意氯丙嗪 ( 網格蛋白介導的胞吞作用的抑制劑 ) 和染料 木素 ( 胞吞作用的 pan- 抑制劑 (pan-inhibitor)) 阻斷 R3Mab 內在化, 但對 R3Mab 誘導的 S249C FGFR3 二聚體減少沒有作用。
     圖 21 : 不同抗 -FGFR3 抗體在非還原條件下針對單體和二聚體 FGFR3S249C 的檢測靈 敏度。在用 R3Mab(1 道 ), 對照 IgG1(2 道 ), 或 PBS(3 道 ) 處理 3 小時后, 將 UMUC-14 細胞 裂解, 并將細胞裂解物在還原或非還原條件下進行免疫印跡分析。注意 6G1( 在 Genentech 產生的鼠雜交瘤抗體 ) 檢測 FGFR3S249C 二聚體和單體兩者, 而 sc9007( 兔多克隆抗體, SantaCruz Biotechnology) 或 sc13121( 鼠雜交瘤抗體, Santa Cruz Biotechnology) 優先 S249C 地檢測二聚體 FGFR3 。
     圖 22 : R3Mab 對 t(4 ; 14)+ 多發性骨髓瘤細胞的增殖的作用。 (A)R3Mab 對 UTMC-2 細 3 胞的 [ H]- 胸苷摻入的抑制作用。 UTMC-2 細胞在包含 R3Mab 或對照抗體的培養基中在 25ng/ ml FGF9 和 5ug/ml 肝素或單獨肝素 ( 無 FGF9) 的存在下生長。溫育 6 天后, 加入 [3H]- 胸 苷溫育 16hr。數據針對來自在缺少 FGF9 和抗體的條件下生長的細胞的數據進行標準化。 (B-C)R3Mab 對 OPM2(B) 和 KMS11(C) 細胞的 [3H]- 胸苷摻入的作用。生長在 1.5 % FBS 培 養基中的細胞用 R3Mab 或對照抗體處理 6 天。數據針對來自未處理的細胞的數據進行標準 化。誤差條代表 SEM。
     圖 23 : 骨髓瘤和膀胱癌細胞中 FGFR3 的細胞表面表達水平。(A) 通過 FACS 分析 評估的骨髓瘤細胞和膀胱癌細胞中的細胞表面 FGFR3 表達。細胞用藻紅蛋白 - 綴合的針對人 FGFR3 的小鼠 mAb(FAB766P, R&DSystems) 或藻紅蛋白 - 綴合的同種型對照小鼠 IgG1(BD Pharmingen) 染色。(B) 骨髓瘤細胞和膀胱癌細胞中 FGFR3 密度的 Scatchard 分析。R3Mab 被放射性碘化并與細胞在含有過量未標記的抗體的懸浮液中溫育。在 RT 下溫育 2 小時后, 細胞通過離心沉淀, 并洗滌兩次。測定特異性結合的 125I。受體密度和結合親合力 (Kd) 代 表兩次結合實驗的平均值。
     圖 24 : R3Mab 或其 DANA 突變體對膀胱癌細胞的異種移植物生長的作用。(A)R3Mab 和其 DANA 突變體 ( 各自 50mg/kg) 對預先形成的 RT112 腫瘤的生長的作用。(B)R3Mab 和其 DANA 突變體 ( 各自 50mg/kg) 對預先形成的 UMUC-14 腫瘤的生長的作用。誤差條代表 SEM。
     發明詳述
     本發明在本文中提供可用于例如, 治療或預防與 FGFR3 的表達和 / 或活性, 諸如增 加的表達和 / 或活性或不合乎需要的表達和 / 或活性相關的疾病狀態的抗 -FGFR3 抗體。 在 一些實施方案中, 本發明的抗體用來治療腫瘤、 癌癥和 / 或細胞增生性病癥。
     在另一個方面, 本發明的抗 -FGFR3 抗體具有用作檢測和 / 或分離 FGFR3, 諸如在多 種組織和細胞類型中檢測 FGFR3 的試劑的用途。
     本發明進一步提供制備和使用抗 -FGFR3 抗體、 和編碼抗 -FGFR3 抗體的多核苷酸 的方法。
     通用技術
     本文所述或參考的技術和方法通常是本領域技術人員充分了解的并且使用常 規方法普遍地采用的, 諸如例如, 在下述參考文獻中所述廣泛使用的方法 : Sambrook 等, 分子克隆: 實 驗 室 手 冊 (Molecular Cloning : ALaboratory Manual), 第 3 版 (2001) 冷 泉 港 實 驗 室 出 版 社, 冷 泉 港, N.Y. 現 代 分 子 生 物 學 實 驗 技 術 (CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULARBIOLOGY)(F.M.Ausubel, 等 . 編 輯, (2003)) ; 酶 學 方 法 (Methods INENZYMOLOGY) 系列 ( 學術出版社公司 ) : PCR 2 : 實用方法 (PCR 2 : APRACTICAL APPROACH) (M.J.MacPherson, B.D.Hames 和 G.R.Taylor 編 輯 (1995)), Harlow 和 Lane, 編 輯 (1988) 抗 體, 實 驗 室 手 冊, 和 動 物 細 胞 培 養 (ANTIBODIES, A LABORATORY MANUAL, and ANIMAL CELLCULTURE)(R.I.Freshney, 編輯 (1987))。
     定義
     “分離的” 抗體指已經鑒定且與其天然環境的成分分離和 / 或從其回收的抗體。 抗體的天然環境的污染性成分是將會干擾其診斷或治療用途的物質, 并且可包括酶、 激素、 和其它蛋白質性或非蛋白質性的溶質。在優選實施方案中, 將抗體純化至 (1) 通過例如 Lowry 法確定, 超過 95 重量%的抗體, 并且最優選超過 99 重量%的抗體, (2) 足以通過使 用轉杯式測序儀 (spinning cup sequenator) 獲得至少 15 個殘基的 N- 末端或內部氨基酸 序列的程度, 或 (3) 通過使用例如考馬斯藍或優選銀染色, 在還原性或非還原性條件下的 SDS-PAGE( 十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳 ), 達到同質。既然抗體的天然環境的至少 一種成分不會存在, 那么分離的抗體包括重組細胞內的原位抗體。 然而, 分離的抗體通常通 過至少一個純化步驟來制備。
     “分離的” 核酸分子是這樣的核酸分子, 其被鑒定并與至少一種污染性核酸分子分 離, 其與所述至少一種污染性核酸分子通常在所述核酸的天然來源中締合。分離的核酸分 子不同于其在自然界中被發現時的形式或環境。因此, 分離的核酸分子不同于存在于天然細胞中的核酸分子。然而, 分離的核酸分子包括包含在通常表達核酸分子的細胞中的核酸 分子 ( 例如, 編碼抗體的核酸 ), 其中, 例如, 所述核酸分子存在的染色體位置與天然細胞的 染色體位置不同。
     術語 “依照 Kabat 的可變結構域殘基編號方式” 或 “依照 Kabat 的氨基酸位置編號 方式” 及其變化形式指 Kabat 等, Sequences of Proteins ofImmunological Interest( 免 疫學感興趣的蛋白的序列 ), 第 5 版, PublicHealth Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD.(1991) 中的用于抗體編制的重鏈可變結構域或輕鏈可變結構域的編 號系統。使用此編號系統, 實際的線性氨基酸序列可包含較少或另外的氨基酸, 對應于可 變結構域 FR 或 CDR 的縮短或插入。例如, 重鏈可變結構域可包含 H2 的殘基 52 后的單一 氨基酸插入物 ( 依照 Kabat 為殘基 52a) 及重鏈 FR 殘基 82 后的多個插入殘基 ( 例如依照 Kabat 為殘基 82a、 82b 和 82c 等 )。給定抗體的 Kabat 殘基編號方式可通過將抗體序列與 “標準” Kabat 編號序列的同源區進行比對來確定。
     術語 “基本相似” 或 “基本不同, ” 用于本文時, 是指在兩個數值 ( 通常一個與本發 明的抗體相關, 而另一個與參照 / 比較抗體相關 ) 之間的足夠高程度的相似性, 從而使本領 域技術人員認為在通過所述值 ( 例如, Kd 值 ) 測量的生物學特征的背景下, 在兩個值之間 的差異是具有很少或沒有生物學和 / 或統計學顯著性的。在所述兩個值之間的差異作為參 照 / 比較抗體的值的函數優選小于約 50%, 優選小于約 40%, 優選小于約 30%, 優選小于約 20%, 和 / 或優選小于約 10%。
     “結合親合力” 通常指分子 ( 例如抗體 ) 的單一結合位點與其結合配偶體 ( 例如抗 原 ) 之間全部非共價相互作用總和的強度。除非另有說明, 在用于本文時, “結合親合力” 指 反映結合對 ( 例如抗體與抗原 ) 的成員之間 1 ∶ 1 相互作用的固有結合親合力。分子 X 對 其配偶體 Y 的親合力通常可用解離常數 (Kd) 來表述。合乎需要的是 Kd 為 1x10-7, 1x10-8, 5x10-8, 1x10-9, 3x10-9, 5x10-9, 或甚至 1x10-10 或更強。親合力可通過本領域知道的常用方法 來測量, 包括本文中所描述的那些方法。低親合力抗體通常緩慢的結合抗原且趨于容易解 離, 而高親合力抗體通常更快速的結合抗原且趨于保持更長時間的結合。本領域知道測量 結合親合力的多種方法, 其中任一種都可用于本發明的目的。具體說明型實施方案在下文 中描述。
     在一個實施方案中, 根據本發明的 “Kd” 或 “Kd 值” 通過如在下面測定法中所述用 目的抗體的 Fab 形式和其抗原進行的放射性標記的抗原結合測定法 (RIA) 測量 : 所述測定 法測量 Fabs 對抗原的溶液結合親合力, 這通過在存在滴定系列的未標記抗原時, 用最小濃 125 度的 ( I)- 標記的抗原來平衡 Fab, 接著用抗 -Fab 抗體 - 包被的板捕獲結合的抗原來進行 (Chen, 等, (1999) 分子生物學雜志 (J.Mol.Biol.)293 : 865-881)。 為了確定測定的條件, 將 微量滴定板 (Dynex) 用 5μg/ml 的在 50mM 碳酸鈉 (pH 9.6) 中的捕獲抗 -Fab 抗體 (Cappel Labs) 包被過夜, 并隨后用 PBS 中的 2% (w/v) 牛血清白蛋白在室溫 ( 約 23℃ ) 封閉 2-5 小 時。在非吸附板 (Nunc#269620) 中, 將 100pM 或 26pM[125I]- 抗原與目的 Fab 的系列稀釋物 混合 ( 例如, 與在 Presta 等, (1997) 癌癥研究 (Cancer Res).57 : 4593-4599 中的抗 -VEGF 抗體, Fab-12 的評價一致 )。 接著, 將目的 Fab 溫育過夜 ; 然而溫育可以持續更長的階段 ( 例 如 65 小時 ) 從而確保達到平衡。 隨后, 將混合物轉移到捕獲板中來在室溫進行溫育 ( 例如, 1 小時 )。接著, 去除溶液, 并將所述板用在 PBS 中的 0.1%吐溫 -20 洗滌 8 次。當所述板已經干燥時, 加入 150μl/ 孔的閃爍劑 (MicroScint-20 ; Packard), 并將所述板在 Topcountγ 計數器 (Packard) 上計數 10 分鐘。選擇提供少于或等于 20%的最大結合的每種 Fab 的濃 度用在競爭性結合測定法中。 根據另一個實施方案, Kd 或 Kd 值是通過使用表面等離振子共 TM TM 振測定法使用 BIAcore -2000 或 BIAcore -3000(BIAcore, Inc., Piscataway, NJ) 在 25℃ 使用固定化抗原 CM5 芯片以約 10 個響應單位 (RU) 測量的。 簡言之, 依照供應商的說明書用 鹽酸 N- 乙基 -N’ -(3- 二甲基氨基丙基 )- 碳化二亞胺 (N-ethyl-N’ -(3-dimethylaminoprop yl)-carbodiimide hydrochloride)(EDC) 和 N- 羥基琥珀酰亞胺 (N-hydroxysuccinimide) (NHS) 活化羧甲基化葡聚糖生物傳感器芯片 (CM5, BIAcore Inc.)。用 10mM 乙酸鈉 pH4.8 將抗原稀釋至 5μg/ml( 約 0.2μM), 然后以 5μl/ 分鐘的流速注入以獲得約 10 個響應單 位 (RU) 的偶聯蛋白質。注入抗原后, 注入 1M 乙醇胺以封閉未反應的基團。為了進行動力 學測量, 將 Fab 的兩倍連續稀釋液 (0.78nM 至 500nM) 在 25℃以約 25μl/ 分鐘的流速注入 在含 0.05%吐溫 20 的 PBS(PBST) 中。 在一些實施方案中, 下列的改進用于表面等離振子共 振測定法 : 將抗體固定在 CM5 生物傳感器芯片以達到大約 400RU, 并用于動力學測量, 靶蛋 白 ( 例如, FGFR3-IIIb 或 -IIIc) 的兩倍系列稀釋液 ( 從 67nM 開始 ) 在 25℃以約 30ul/ 分 鐘的流速注入至 PBST 緩沖液中。 使用簡單一對一朗格繆爾結合模型 (one-to-oneLangmuir binding model)(BIAcore 評價軟件 3.2 版 (BIAcore EvaluationSoftware version 3.2)) 通過同時擬合締合和解離傳感圖來計算締合速率 (kon) 和解離速率 (koff)。平衡解離常數 (Kd) 以比率 koff/kon 計算。參見例如 Chen 等, (1999)J.Mol.Biol.( 分子生物學雜志 )293 : 865-881。如果根據上文表面等離振子共振測定法, 締合速率 (on-rate) 超過 106M-1S-1, 則 締合速率可使用熒光淬滅技術來測定, 即如在分光計諸如配備了斷流裝置的分光光度計 (Aviv Instruments) 或 8000 系列 SLM-Aminco 分光光度計 (ThermoSpectronic) 中用攪拌 比色杯 (stirred cuvette) 測量, 在存在漸增濃度的抗原的條件下, 測量 PBS, pH 7.2 中的 20nM 抗 - 抗原抗體 (Fab 形式 ) 在 25℃的熒光發射強度 ( 激發= 295nm ; 發射= 340nm, 16nm 通帶 ) 的升高或降低。
     根據本發明的 “締合速率” (on-rate, 或 rate of association, 或 association TM TM rate) 或 “kon”也可使用 BIAcore -2000 或 BIAcore -3000(BIAcore, Inc., Piscataway, NJ) 采用上述相同的表面等離振子共振技術, 在 25℃利用固定的抗原 CM5 芯片以約 10 個響 應單位 (RU) 來測定。簡言之, 依照供應商的說明書用鹽酸 N- 乙基 -N’ -(3- 二甲基氨基丙 基 )- 碳化二亞胺 (EDC) 和 N- 羥基 - 琥珀酰亞胺 (NHS) 活化羧甲基化葡聚糖生物傳感器芯 片 (CM5, BIAcore Inc.)。用 10mM 乙酸鈉 pH4.8 將抗原稀釋至 5μg/ml( 約 0.2μM), 然后 以 5μl/ 分鐘的流速注入至獲得約 10 個響應單位 (RU) 的偶聯蛋白質。注入抗原后, 注入 1M 乙醇胺以封閉未反應的基團。為了進行動力學測量, 在 25℃以約 25μl/ 分鐘的流速在 含 0.05%吐溫 20 的 PBS(PBST) 中注入 Fab(0.78nM 至 500nM) 的兩倍連續稀釋液。在一些 實施方案中, 下列的改進用于表面等離振子共振測定法 : 將抗體固定在 CM5 生物傳感器芯 片以達到大約 400RU, 并對于動力學測量, 靶蛋白 ( 例如, FGFR3-IIIb 或 -IIIc) 的兩倍連續 稀釋液 ( 從 67nM 開始 ) 在 25℃以約 30ul/ 分鐘的流速注入至 PBST 緩沖液中。使用簡單一 對一朗格繆爾 (Langmuir) 結合模型 (BIAcore Evaluation Software version 3.2) 通過 同時擬合締合和解離 S 型曲線計算締合速率 (kon) 和解離速率 (koff)。平衡解離常數 (Kd) 以比率 koff/kon 計算。參見例如 Chen, Y. 等, (1999)J.Mol.Biol.( 分子生物學雜志 )293 :865-881。然而, 如果根據上文表面等離振子共振測定法, 締合速率超過 106M-1S-1, 那么締 合速率優選地使用熒光淬滅技術來測定, 即根據分光計諸如配備了斷流裝置的分光光度計 (stop-flow equippedspectrophometer)(Aviv Instruments) 或 8000 系列 SLM-Aminco 分 光光度計 (ThermoSpectronic) 中用攪拌比色杯的測量, 在存在濃度漸增的抗原的條件下, 測量 PBS, pH 7.2 中的 20nM 抗 - 抗原抗體 (Fab 形式 ) 在 25℃的熒光發射強度 ( 激發= 295nm ; 發射= 340nm, 16nm 帶通 ) 的升高或降低。
     當用于本文時, 術語 “載體” 意在指能夠運送已經與其連接的另一核酸的核酸分 子。一種類型的載體是 “質粒” , 其指環狀雙鏈 DNA 環, 另外的 DNA 區段可以連接在該環狀雙 鏈 DNA 環中。另一種類型的載體是噬菌體載體。另一種類型的載體是病毒載體, 其中另外 的 DNA 區段可以連接至病毒基因組中。某些載體能夠在已經引入它們的宿主細胞中自主復 制 ( 例如, 具有細菌復制起始點的細菌載體和附加型哺乳動物載體 )。其他載體 ( 例如, 非 附加型哺乳動物載體 ) 在引入至宿主細胞中時可以整合至宿主細胞的基因組中, 并且因此 它們與宿主基因組一起復制。 此外, 某些載體能夠指導與它們可操作地連接的基因的表達。 這樣的載體在本文中稱為 “重組表達載體” ( 或簡單地, “重組載體” )。通常, 用于重組 DNA 技術中的表達載體經常是質粒的形式。在本說明書中, “質粒” 和 “載體” 可以互換使用, 因 為質粒是最普遍使用的載體形式。 “多核苷酸” 或 “核酸” 當在本文中可互換使用時, 是指任意長度的核苷酸的聚合 物, 包括 DNA 和 RNA。核苷酸可以是脫氧核糖核苷酸、 核糖核苷酸、 修飾的核苷酸或堿基、 和 / 或它們的類似物、 或可以通過 DNA 或 RNA 聚合酶、 或通過合成反應摻入至聚合物中的任何 基質。多核苷酸可以包含修飾的核苷酸, 諸如甲基化的核苷酸和它們的類似物。如果存在, 可以在所述聚合物組裝之前或之后施加對核苷酸結構的修飾作用。核苷酸的序列可以被 非核苷酸成分中斷。多核苷酸可以在合成后進一步被修飾, 諸如通過與標記物綴合。其他 類型的修飾作用包括, 例如, “帽 (caps)” , 一個或多個天然存在的核苷酸被類似物的置換, 核苷酸間修飾諸如, 例如, 具有不帶電荷的鍵的那些 ( 例如, 膦酸甲酯, 膦酸三酯, 氨基磷酸 酯 (phosphoamidates), 氨基甲酸酯, 等 ) 和具有帶電荷鍵的那些 ( 例如, 硫代磷酸酯, 二硫 代磷酸酯, 等 ), 包含側基結構部分的那些, 諸如, 例如, 蛋白質 ( 例如, 核酸酶, 毒素, 抗體, 信號肽, 聚 -L- 賴氨酸, 等 ), 具有嵌入劑的那些 ( 例如, 吖啶, 補骨脂素 (psoralen), 等 ), 包含螯合劑的那些 ( 例如, 金屬, 放射性金屬, 硼, 氧化性金屬, 等 ), 包含烷化劑的那些, 具 有修飾的鍵的那些 ( 例如, α 異頭核酸, 等 ), 以及一種或多種未修飾形式的多核苷酸。此 外, 通常存在于糖中的任一個羥基可以被例如膦酸酯基團、 磷酸酯基團置換, 被標準的保護 基團保護, 或被活化以制備與另外的核苷酸連接的另外的鍵, 或可以與固體或半固體的支 持體綴合。5’ 和 3’ 末端 OH 可以被磷酸化或被胺或 1-20 個碳原子的有機封端基團結構部 分取代。其他羥基也可以被衍生為標準的保護基團。多核苷酸也可以包含本領域中普遍已 知的核糖或脫氧核糖糖類的類似形式, 包括, 例如, 2’ -O- 甲基 -, 2’ -O- 烯丙基, 2’ -氟-或 2’ - 疊氮基 - 核糖, 碳環糖類似物, α- 異頭糖, 差向異構糖諸如阿拉伯糖, 木糖或來蘇糖, 吡 喃糖, 呋喃糖, 景天庚酮糖 (sedoheptulose), 無環類似物和堿性核苷類似物諸如甲基核糖 核苷。一個或多個磷酸二酯鍵可以被可選的連接基團置換。這些可選的連接基團包括, 但 ), P(S)S(“二硫代酯 (dithioate)” ), 不限于, 其中磷酸酯被 P(O)S(“硫代酯 (thioate)” (O)NR2(“酰胺化物” ), P(O)R, P(O)OR’ , CO 或 CH2(“甲縮醛 (formacetal)” ) 置換的實施
     方案, 其中每個 R 或 R’ 獨立地是 H 或取代的或未取代的烷基 (1-20C), 任選地包含醚 (-O-) 鍵, 芳基, 烯基, 環烷基, 環烯基或 araldyl。多核苷酸中的所有鍵沒有必要是相同的。前面 的描述適用于本文提及的所有多核苷酸, 包括 RNA 和 DNA。
     “寡核苷酸, ” 當用于本文中時, 通常是指短的、 - 般是單鏈的、 - 般是合成的多核苷 酸, 其通常, 但非必要地, 長度小于約 200 個核苷酸。術語 “寡核苷酸” 和 “多核苷酸” 不互 斥。上面對于多核苷酸的描述同樣和完全地適用于寡核苷酸。
     關于肽或多肽序列的 “百分比 (% ) 氨基酸序列同 - 性” , 定義為將候選序列與具體 肽或多肽序列在進行序列比對 ( 并在必要時導入空隙 ) 以獲取最大百分比序列同 - 性, 且 不將任何保守置換視為序列同 - 性的部分之后, 候選序列中的氨基酸殘基與所述具體肽或 多肽序列中的氨基酸殘基相同的百分數。 可使用本領域技術內的各種方法進行序列比對以 便測定氨基酸序列同 - 性百分比, 例如, 使用公眾可得到的計算機軟件如 BLAST、 BLAST-2、 ALIGN 或 Megalign(DNASTAR) 軟件。 本領域技術人員可以決定測量比對的適宜參數, 包括對 所比較的序列全長獲得最大比對所需的任何算法。然而, 為此目的, 氨基酸序列同 - 性%值 使用序列比較計算機程序 ALIGN-2 產生, 其中用于 ALIGN-2 程序的全部源代碼在下面的表 A 中提供。ALIGN-2 序列比對計算機程序的作者是 Genentech, Inc., 該源代碼已經隨用戶 文檔提交至美國版權局 (Washington D.C., 20559), 其美國版權注冊登記號為 TXU510087。 公眾可通過 Genentech, Inc.(South SanFrancisco, 加利福尼亞 ) 得到 ALIGN-2 程序, 或者 可以從例如 WO2007/001851 中提供的源代碼進行編譯。 ALIGN-2 程序應當為在 UNIX 操作系 統, 優選在數字 UNIX V4.0D 上使用而進行編譯。ALIGN-2 程序設定了所有序列比對參數并 且不變。
     在 ALIGN-2 應用于氨基酸序列比較的情況中, 給定氨基酸序列 A 相對于 (to)、 與 (with)、 或針對 (against) 給定氨基酸序列 B 的氨基酸序列同 - 性% ( 或者這樣說 : 給定氨 基酸序列 A 具有或含有相對于、 與或針對給定氨基酸序列 B 的某 -%氨基酸序列同 - 性 ) 如 下計算 :
     X/Y 比值乘以 100,
     其中 X 是用序列比對程序 ALIGN-2 在該程序的 A 和 B 比對中評分為相同匹配的氨 基酸殘基數, 且其中 Y 是 B 中的氨基酸殘基總數。可以理解, 當氨基酸序列 A 與氨基酸序列 B 的長度不相等時, A 相對于 B 的氨基酸序列同 - 性%將不等于 B 相對于 A 的氨基酸序列 同 - 性%。
     在 - 些實施方案中, 兩個或多個氨基酸序列至少 50%, 60%, 70%, 80%, 或 90%相 同。在 - 些實施方案中, 兩個或多個氨基酸序列至少 95%, 97%, 98%, 99%, 或甚至 100% 相同。除非另外特別指出, 使用 ALIGN-2 計算機程序如在緊接的前面段落中所述獲得在本 文中所用的所有的%氨基酸序列同 - 性的值。
     術語 “FGFR3, ” 當在本文中使用時, 除非具體或另外根據上下文指示, 是指任何天 然或變體 ( 不論天然或合成的 )FGFR3 多肽 ( 例如, FGFR3-IIIb 同種型或 FGFR3-IIIc 同種 型 )。術語 “天然序列” 具體包涵天然存在的截短形式 ( 例如, 細胞外結構域序列或跨膜亞 基序列 ), 天然存在的變體形式 ( 例如, 選擇性拼接形式 ) 和天然存在的等位基因變體。術 語 “野生型 FGFR3” 通常是指包含天然存在的 FGFR3 蛋白的氨基酸序列的多肽。術語 “野生 型 FGFR3 序列” 通常是指存在于天然存在的 FGFR3 中的氨基酸序列。術語 “FGFR3 配體, ” ( 可互換地稱為 “FGF” ) 當在本文中使用時, 除非具體或另外根 據上下文指示, 是指任何天然或變體 ( 不論天然或合成的 )FGFR3 配體 ( 例如, FGF1, FGF2, FGF4, FGF8, FGF9, FGF17, FGF18, FGF23) 多肽。術語 “天然序列” 具體地包涵天然存在的截 短形式 ( 例如, 細胞外結構域序列或跨膜亞基序列 ), 天然存在的變體形式 ( 例如, 選擇性拼 接形式 ) 和天然存在的等位基因變體。術語 “野生型 FGFR3 配體” 通常是指包含天然存在 的 FGFR3 配體蛋白的氨基酸序列的多肽。術語 “野生型 FGFR3 配體序列” 通常是指存在于 天然存在的 FGFR3 配體中的氨基酸序列。
     “FGFR3 激活” 是指 FGFR3 受體的激活或磷酸化。一般而言, FGFR3 激活導致信號轉 導 ( 例如, 由 FGFR3 受體的胞內激酶結構域磷酸化 FGFR3 或底物多肽中的酪氨酸殘基所導 致 )。FGFR3 激活可由 FGFR 配體結合目的 FGFR3 受體介導。結合 FGFR3 的 FGFR3 配體 ( 例 如, 諸如 FGF1 或 FGF9) 可激活 FGFR3 的激酶結構域, 從而導致 FGFR3 中的酪氨酸殘基的磷 酸化和 / 或另外的一種或多種底物多肽中的酪氨酸殘基的磷酸化。
     術語 “組成型” 當用于本文中時, 當例如應用于受體激酶活性時, 是指受體的連續 信號傳導活性, 該活性不依賴于配體或其他激活分子的存在。 取決于受體的性質, 所有活性 可以是組成型的或受體的活性可以進一步被其他分子 ( 例如, 配體 ) 的結合激活。導致受 體的激活的細胞事件對于本領域普通技術人員是公知的。例如, 激活可以包括低聚化 ( 例 如, 二聚化, 三聚化等 ) 成為更高級的受體復合物。復合物可以包含單一的蛋白物種, 即, 均 聚復合物 (homomeric complex)。 備選地, 復合物可以包含至少兩種不同的蛋白物種, 即, 異 聚復合物 (heteromeric complex)。 復合物形成可以由例如, 正常或突變體形式的受體在細 胞表面上的過表達導致。復合物形成也可以由受體中一個或多個特定的突變導致。
     術語 “配體 - 不依賴性” 當用于本文中時, 當例如應用于受體信號傳導活性時, 是 指不依賴于配體的存在的信號傳導活性。具有配體 - 不依賴性激酶活性的受體沒有必要排 除用于產生另外的激酶活性激活的配體與該受體的結合。
     術語 “配體 - 依賴性” 當用于本文中時, 當例如應用于受體信號傳導活性時, 是指 依賴于配體的存在的信號傳導活性。
     短語″基因擴增″是指這樣的過程, 通過該過程在特定細胞或細胞系中形成多拷 貝的基因或基因片段。被復制的區 ( 一段擴增的 DNA) 常常被稱為 “擴增子” 。通常, 所產生 的信使 RNA(mRNA) 的量, 即基因表達的水平, 也與被表達的該特定基因產生的拷貝數成比 例地增加。
     ″酪氨酸激酶抑制劑″是這樣的分子, 其在一些程度上抑制酪氨酸激酶如 FGFR3 受體的酪氨酸激酶活性。
     “顯示 FGFR3 表達、 擴增或激活” 的癌癥或生物學樣品是在診斷檢測中, 表達 ( 包括 過表達 )FGFR3, 具有擴增的 FGFR3 基因, 和 / 或以其他方式證明 FGFR3 的激活或磷酸化的癌 癥或生物學樣品。
     ″顯示 FGFR3 激活″的癌癥或生物學樣品是在診斷測試中, 證明 FGFR3 的激活或 磷酸化的癌癥或生物學樣品。此類激活可直接確定 ( 例如通過 ELISA 測量 FGFR3 磷酸化 ) 或間接確定。
     ″顯示 FGFR3 激活″的癌癥或生物學樣品是在診斷檢測中, 表現出 FGFR3 的組成 型激活或磷酸化的癌癥或生物學樣品。 此類激活可直接確定 ( 例如通過 ELISA 測量 c-FGFR3磷酸化 ) 或間接確定。
     ″顯示 FGFR3 擴增″的癌癥或生物學樣品是在診斷檢測中具有擴增的 FGFR3 基因 的癌癥或生物學樣品。
     ″顯示 FGFR3 易位″的癌癥或生物學樣品是在診斷檢測中具有易位的 FGFR3 基因 的癌癥或生物學樣品。FGFR3 易位的實例是 t(4 ; 14) 易位, 其發生在一些多發性骨髓瘤腫 瘤中。
     “磷酸 -ELISA 測定 (phospho-ELISA assay)” 在本文中是其中在酶聯免疫吸附測 定法 (ELISA) 中評估一種或多種 FGFR3、 底物或下游信號傳導分子的磷酸化的測定, 該測定 使用試劑, 通常是抗體, 檢測磷酸化的 FGFR3、 底物或下游信號傳導分子。在一些實施方案 中, 使用檢測磷酸化的 FGFR3 或 pMAPK 的抗體。該測定可對細胞裂解物、 優選來自新鮮的或 冷凍的生物學樣品的細胞裂解物進行。
     ″顯示配體 - 不依賴性 FGFR3 激活″的癌癥或生物學樣品是在診斷檢測中, 表現 出 FGFR3 的配體 - 不依賴性激活或磷酸化的癌癥或生物學樣品。此類激活可直接確定 ( 例 如通過 ELISA 測量 FGFR3 磷酸化 ) 或間接確定。
     ″顯示配體 - 依賴性 FGFR3 激活″的癌癥或生物學樣品是在診斷檢測中, 表現出 FGFR3 的配體 - 依賴性激活或磷酸化的癌癥或生物學樣品。此類激活可直接確定 ( 例如通 過 ELISA 測量 FGFR3 磷酸化 ) 或間接確定。
     ″顯示配體 - 不依賴性 FGFR3 激活″的癌癥或生物學樣品是在診斷檢測中, 表現 出 FGFR3 的配體 - 不依賴性激活或磷酸化的癌癥或生物學樣品。此類激活可直接確定 ( 例 如通過 ELISA 測量 FGFR3 磷酸化 ) 或間接確定。
     具有 “FGFR3 過表達或擴增” 的癌細胞指與同一組織類型的非癌細胞相比, 具有顯 著更高的 FGFR3 蛋白質或基因水平的癌細胞。此類過表達可以是由基因擴增或者轉錄或翻 譯增加引起。可在診斷或預后測定中通過評估細胞表面上存在的增加的 FGFR3 蛋白質水平 ( 例如通過免疫組化測定, IHC) 來測定 FGFR3 的過表達或擴增。備選地, 或另外地, 可測量 細胞中編碼 FGFR3 的核酸的水平, 例如通過熒光原位雜交 (FISH ; 參見 1998 年 10 月公布的 WO98/45479)、 Southern 印跡或聚合酶鏈式反應 (PCR) 技術, 諸如定量實時 PCR(qRT-PCR)。 在上述測定法之外, 熟練從業人員還可利用多種體內測定法。 例如, 可將患者體內細胞暴露 于任選用可檢測標記物例如放射性同位素標記的抗體, 并且可評估該抗體與患者體內細胞 的結合, 例如通過外部掃描放射性或通過分析取自事先已暴露于所述抗體的患者的活組織 檢查。
     術語 “突變” 在本文中使用時指特定蛋白質或核酸 ( 基因, RNA) 分別相對于野生型 蛋白質或核酸的氨基酸或核酸序列的差異。 突變的蛋白質或核酸可以由基因的一個等位基 因 ( 雜合的 ) 或兩個等位基因 ( 純合的 ) 表達或者在其中找到, 而且它可以是體細胞的或 種系的。在本發明中, 突變一般是體細胞的。突變包括序列重排, 諸如插入、 缺失、 和點突變 ( 包括單核苷酸 / 氨基酸多態性 )。
     “抑制” 是與參照相比降低或減少活性、 功能, 和 / 或量。
     當一種藥劑模擬目的多肽 ( 例如, FGFR 配體, 諸如 FGF1 或 FGF9) 的至少一種功能 性活性時, 其具有 “激動劑活性或功能” 。
     “激動劑抗體” 在本文中使用時是模擬目的多肽 ( 例如, FGFR 配體, 諸如 FGF1 或FGF9) 的至少一種功能性活性的抗體。
     蛋白質 “表達” 指基因中所編碼的信息轉換成信使 RNA(mRNA), 然后轉換成蛋白質。
     在本文中, “表達” 目的蛋白質 ( 諸如 FGF 受體或 FGF 受體配體 ) 的樣品或細胞指 這樣的樣品或細胞, 在所述樣品或細胞中確定存在有編碼該蛋白質的 mRNA, 或蛋白質 ( 包 括其片段 )。
     “免疫綴合物” ( 可互換地稱為 “抗體 - 藥物綴合物” 或 “ADC” ), 是指與一種或多 種細胞毒性劑綴合的抗體, 所述細胞毒性劑諸如化療劑、 藥物、 生長抑制劑、 毒素 ( 例如蛋 白毒素, 細菌、 真菌、 植物或動物來源的酶活性毒素, 或其片段 ) 或放射性同位素 ( 即放射綴 合物 )。
     術語 “Fc 區” 用于本文時一般是指包含免疫球蛋白重鏈 C 末端的多肽序列的二聚 體復合物, 其中 C 末端多肽序列是可以通過木瓜蛋白酶消化完整抗體獲得的序列。Fc 區可 以包括天然或變體 Fc 序列。雖然免疫球蛋白重鏈 Fc 序列的邊界可以變化, 但是人 IgG 重 鏈 Fc 序列通常定義為 Fc 序列自大約 Cys226 位置或大約 Pro230 位置的氨基酸殘基至羧基 末端的區段。免疫球蛋白的 Fc 序列一般包含兩個恒定結構域, 即 CH2 結構域和 CH3 結構 域, 任選包含 CH4 結構域。Fc 區的 C- 末端賴氨酸 ( 依照 EU 編號系統的殘基 447) 可以被移 除, 例如, 在抗體的純化期間或通過編碼所述抗體的核酸的重組改造。因此, 根據本發明包 含具有 Fc 區的抗體的組合物可以包含具有 K447 的抗體、 所有 K447 均被移除的抗體、 或具 有 K447 殘基的抗體和沒有 K447 殘基的抗體的混合物。
     本文中 “Fc 多肽” 的意思是構成 Fc 區的多肽之一。Fc 多肽可從任何適當的免疫 球蛋白 ( 如 IgG1, IgG2, IgG3, 或 IgG4 亞型, IgA, IgE, IgD 或 IgM) 獲得。在一些實施方案中, Fc 多肽包含部分或全部野生型鉸鏈序列 ( 一般在其 N 末端 )。在一些實施方案中, Fc 多肽 不包含功能的或野生型鉸鏈序列。
     “封閉” 抗體或抗體 “拮抗劑” 是抑制或降低其結合的抗原的生物學活性的抗體。優 選的封閉抗體或拮抗性抗體完全抑制抗原的生物學活性。
     “裸抗體 (naked antibody)” 是沒有綴合異源分子 ( 如細胞毒性結構部分或放射 性標記 ) 的抗體。
     具有指定抗體的 “生物學特征” 的抗體指具有該指定抗體區別于結合相同抗原的 其它抗體的一項或多項生物學特征的抗體。
     為了篩選這樣的抗體, 其結合由目的抗體結合的抗原的表位, 可以實施常規交叉 阻斷測定法, 諸如抗體, 實驗室手冊 (Antibodies, A Laboratory Manual), 冷泉港實驗室, Ed Harlow 和 David Lane(1988) 中所記載的。
     為增加包含本發明的氨基酸序列的抗體或多肽的半衰期, 可將拯救受體 (salvage receptor) 結合表位連接到抗體 ( 尤其是抗體片段 ), 如例如美國專利 5,739,277 所述。例 如, 可將編碼拯救受體結合表位的核酸分子與編碼本發明多肽序列的核酸符合閱讀框地連 接, 從而使改造的核酸分子所表達的融合蛋白包含所述拯救受體結合表位和本發明的多肽 序列。本文所用的術語 “拯救受體結合表位” 指 IgG 分子 ( 例如 IgG 1, IgG2, IgG3, 或 IgG4) 的 Fc 區的表位, 其負責增加 IgG 分子的體內血清半衰期 ( 例如 Ghetie 等, Ann.Rev.Immunol. ( 免疫學年評 )18 : 739-766(2000), 表 1)。在其 Fc 區具有取代并且血清半衰期增加的抗 體 也 見 于 WO00/42072, WO 02/060919 ; Shields 等, 生 物 化 學 雜 志 (J.Biol.Chem.)276 :6591-6604(2001) ; Hinton, 生物化學雜志 (J.Biol.Chem.)279 : 6213-6216(2004)) 的描述。 在另一個實施方案中, 例如通過連接其它多肽序列, 也可以增加血清半衰期。例如, 本發明 的方法中有用的抗體或其它多肽可與血清白蛋白或血清白蛋白的結合 FcRn 受體的部分 或血清白蛋白結合肽連接, 從而使所述血清白蛋白結合所述抗體或多肽, 例如這樣的多肽 序列見于 WO01/45746 的公開。在一個優選的實施方案中, 所連接的血清白蛋白肽包含氨 基酸序列 DICLPRWGCLW(SEQID NO : 183)。在另一個實施方案中, Fab 的半衰期是通過這些 方法增加的。血清白蛋白結合肽序列也見 Dennis 等, 生物化學雜志 (J.Biol.Chem.)277 : 35035-35043(2002)。
     “片段” 意指優選包含參照核酸分子或多肽的完整長度的至少 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 或更多的多肽或核酸分子的部分。片段可以包含 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 或 100, 200, 300, 400, 500, 600, 或更多個核苷酸或 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 140, 160, 180, 190, 200 個氨基酸或更多個氨基酸。
     關于本發明的抗體的短語 “很少至沒有激動劑功能” 在本文中使用時是指例如, 在 施用于受試者時, 所述抗體不引發有生物學意義的量的激動劑活性。 如本領域中所理解的, 活性的量可以定量地或定性地確定, 只要在本發明的抗體和參照副本之間可以作出比較。 所述活性可以根據本領域已知的任何測定或技術來測量或檢測, 包括, 例如, 本文所述的那 些。本發明的抗體及其參照副本的活性的量可以平行地確定或在單獨的運行中確定。在一 些實施方案中, 本發明的二價抗體不具有實質的激動劑功能。
     術語 “凋亡” 和 “凋亡活性” 以廣義使用, 并且是指哺乳動物中細胞死亡的有秩序 或可控形式, 其典型地伴有一種或多種特征性細胞改變, 包括細胞質的凝聚, 質膜微絨毛的 損失, 細胞核的分裂 (segmentation), 染色體 DNA 的降解或線粒體功能的喪失。 此活性可以 使用本領域中已知的技術確定和測量, 例如, 通過細胞活力測定, FACS 分析或 DNA 電泳, 和 更具體地通過膜聯蛋白 V(annexin V) 的結合, DNA 的片段化, 細胞收縮, 內質網的擴張, 細 胞片段化, 和 / 或膜囊泡的形成 ( 稱為凋亡小體 ) 確定和測量。
     術語 “抗體” 和 “免疫球蛋白” 以最廣義可互換使用, 并且包括單克隆抗體 ( 例如, 全長或完整的單克隆抗體 )、 多克隆抗體、 多價抗體、 多特異性抗體 ( 例如雙特異性抗體, 只 要它們顯示所需的生物學活性 ), 并且還可以包括某些抗體片段 ( 如本文中更詳細地描述 的那樣 )。抗體可以是人的、 人源化的和 / 或親和力成熟的。
     術語 “可變的” 指可變結構域中的某些部分在抗體間序列差異廣泛且用于每種特 定抗體對其特定抗原的結合和特異性的事實。然而, 變異性并非均勻分布于抗體的整個可 變結構域。它集中于輕鏈和重鏈可變結構域中稱作互補性決定區 (CDRS) 或高變區的三個 區段。可變結構域中更加高度保守的部分被稱作構架 (FR)。天然重鏈和輕鏈的可變結構 域各自包含四個 FR 區, 它們大多采取 β- 折疊構象, 通過形成環狀連接且在有些情況中形 成 β- 折疊結構一部分的三個 CDRs 連接。每條鏈中的 CDRs 通過 FR 區非常接近的保持在 一起, 并與另一條鏈的 CDRs 一起促成抗體的抗原結合位點的形成 ( 參見 Kabat 等, 免疫學 感興趣的蛋白的序列 (Sequences of Proteins of Immunological Interest), 第 5 版, 國 立衛生研究所 (National Institute of Health), Bethesda, MD.(1991))。恒定結構域不 直接參與抗體與抗原的結合, 但展現出多種效應子功能, 諸如抗體在抗體依賴性細胞毒性 中的參與。抗體的木瓜蛋白酶消化產生兩個相同的抗原結合片段, 稱為 “Fab”片段, 所述 “Fab” 片段每個具有單抗原結合位點, 并且產生殘余的 “Fc” 片段, 其名稱反映其容易結晶的 能力。胃蛋白酶處理產生 F(ab’ )2 片段, 所述片段具有兩個抗原組合位點, 并且仍舊能夠交 聯抗原。
     “Fv” 是包含完整抗原識別和結合位點的最小抗體片段。在雙鏈 Fv 種類中, 此區由 一個重鏈可變結構域和一個輕鏈可變結構域以緊密的、 非共價締合的二聚體組成。在單鏈 Fv 種類中, 一個重鏈可變結構域和一個輕鏈可變結構域可以通過柔性肽接頭共價連接從而 使輕鏈和重鏈可以以類似于雙鏈 Fv 種類的 “二聚體” 結構締合。在這種構型中, 每個可變 結構域的三個 CDRs 相互作用從而限定在 VH-VL 二聚體的表面上的抗原結合位點。總而言 之, 六個 CDRs 將抗原結合特異性賦予抗體。然而, 即使是單個可變結構域 ( 或只包含對抗 原特異的三個 CDRs 的半個 Fv) 也具有識別和結合抗原的能力, 然而親和性低于完整結合位 點。
     Fab 片段還包含輕鏈的恒定結構域和重鏈的第一恒定結構域 (CH1)。Fab’ 片段與 Fab 片段的不同之處在于在重鏈 CH1 結構域的羧基端加入幾個殘基, 包括來自抗體鉸鏈區 的一個或多個半胱氨酸。Fab’ -SH 是本文關于 Fab’ 的名稱, 其中恒定結構域的半胱氨酸殘 基具有游離巰基。F(ab’ )2 抗體片段最初作為在它們之間具有鉸鏈半胱氨酸的 Fab’ 片段 對產生。還已知抗體片段的其它化學偶聯。
     基于抗體 ( 免疫球蛋白 ) 的恒定結構域的氨基酸序列, 可以將來自任何脊椎動物 物種的抗體 ( 免疫球蛋白 ) 的 “輕鏈” 分為兩種清楚區分的類型之一, 稱為 kappa(κ) 和 lambda(λ)。
     取決于免疫球蛋白的重鏈的恒定結構域的氨基酸序列, 可以將免疫球蛋白分為不 同的種類。存在五種主要的免疫球蛋白類別 : IgA, IgD, IgE, IgG, 和 IgM, 并且這些中的一 些可以進一步分為亞類 ( 同種型 ), 例如 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, 和 IgA2。對應于不同 類別的免疫球蛋白的重鏈恒定結構域分別被稱為 α, δ, ε, γ, 和 μ。不同類別的免疫球 蛋白的亞基結構和三維構型是眾所周知的。 “抗體片段” 僅包含完整抗體的一部分, 其中所 述部分優選地保留與該部分存在于完整抗體中時正常相關的至少一種、 優選大多數或全部 功能。抗體片段的實例包括 Fab、 Fab′、 F(ab′ )2 和 Fv 片段 ; 雙抗體 ; 線性抗體 ; 單鏈抗 體分子 ; 和由抗體片段形成的多特異性抗體。 在一個實施方案中, 抗體片段包含完整抗體的 抗原結合位點, 并且因此保留了結合抗原的能力。在另一個實施方案中, 抗體片段, 例如包 含 Fc 區的抗體片段保留了與 Fc 區存在于完整抗體中時正常相關的至少一種生物學功能, 抗體片段是 諸如 FcRn 結合, 抗體半衰期調節, ADCC 功能和補體結合。在一個實施方案中, 單價抗體, 其在體內的半衰期基本上類似于完整的抗體。 例如, 這樣的抗體片段可以在與 Fc 連接的抗原結合臂上包含能夠賦予該片段以體內穩定性的序列。
     術語 “高變區” 、 “HVR”或 “HV”在用于本文時指抗體可變結構域中序列上高度 可變和 / 或形成結構上限定的環的區域。通常, 抗體包含六個高變區 : 三個在 VH 中 (H1、 H2、 H3), 三個在 VL 中 (L1、 L2、 L3)。本文中使用且涵蓋許多高變區的敘述。Kabat 互補 性決定區 (CDR) 是以序列變異性為基礎的, 而且是最常用的 (Kabat 等, 免疫學感興趣的 蛋白的序列 (Sequences of Proteins of Immunological Interest), 第 5 版 . 公眾健康 服務 (Public Health Service), 國立衛生研究所 (National Institutes of Health),Bethesda, MD.(1991))。相反, Chothia 指結構環的位置 (Chothia 和 Lesk, 分子生物學雜志 (J.Mol.Biol.)196 : 901-917(1987))。AbM 高變區代表 Kabat CDRs 與 Chothia 結構環之間 的折衷, 而且由 Oxford Molecular 的 AbM 抗體建模軟件使用。 “接觸 (contact)” 高變區是 以對可獲得的復合物晶體結構的分析為基礎的。下文記錄了這些高變區中每一個的殘基。
    高變區可包括如下的 “延 伸 的 高 變 區” : VL 中 的 24-36 或 24-34(L1)、 46-56 或 50-56(L2) 和 89-97(L3) 及 VH 中 的 26-35(H1)、 50-65 或 49-65(H2) 和 93-102、 94-102 或 95-102(H3)。對于這些定義中的每一個, 可變結構域殘基是依照 Kabat 等, 見上文編號的。
     “構架” 或 “FR” 殘基指除本文中所定義的高變區殘基之外的那些可變結構域殘基。
     非人 ( 例如鼠 ) 抗體的 “人源化” 形式是包含衍生自非人免疫球蛋白的最少序列的 嵌合抗體。對于大多數部分, 人源化抗體是人免疫球蛋白 ( 接受體抗體 ), 其中接受體的高 變區殘基用具有期望特異性、 親和性和 / 或能力的非人物種 ( 供體抗體 )( 諸如小鼠、 大鼠、 兔或非人靈長類動物 ) 的高變區殘基替換。在有些情況中, 將人免疫球蛋白的構架區 (FR) 殘基用相應的非人殘基替換。此外, 人源化抗體可包含在接受體抗體中或在供體抗體中沒 有發現的殘基。 進行這些修飾是為了進一步改進抗體的性能。 一般而言, 所述人源化抗體將 包含基本上全部的至少一個、 典型地兩個可變結構域, 其中所有或基本上所有高變環對應 于非人免疫球蛋白的高變環, 且所有或基本上所有 FR 是人免疫球蛋白序列的 FR。 人源化抗 體任選還將包含至少部分免疫球蛋白恒定區 (Fc), 典型地是人免疫球蛋白的恒定區。更多 細節參見 Jones 等, 自然 (Nature)321 : 522-525(1986) ; Riechmann 等, 自然 (Nature)332 : 323-329(1988) ;及 Presta,現 代 結 構 生 物 學 觀 點 (Curr.Op.Struct.Biol.)2 : 593-596(1992)。還參見下面的綜述文章和其中引用的參考文獻 : Vaswani 和 Hamilton, Ann.Allergy, Asthma & Immunol.( 變 態 反 應、 哮 喘 和 免 疫 學 年 報 )1 : 105-115(1998) ; Harris, Biochem.Soc.Transactions( 生 物 化 學 會 會 刊 )23 : 1035-1038(1995) ; Hurle 和 Gross, Curr.Op.Biotech.( 生物技術現代評論 )5 : 428-433(1994)。
     “嵌合” 抗體 ( 免疫球蛋白 ) 具有與衍生自特定物種或屬于特定抗體類別或亞類的 抗體中的相應序列相同或同源的一部分重鏈和 / 或輕鏈 ( 而一條或多條鏈的剩余部分與衍
     生自另一物種或屬于另一抗體類別或亞類的抗體中的相應序列相同或同源 ), 以及此類抗 體的片段, 只要它們展現出期望的生物學活性 ( 美國專利號 4,816,567 和 Morrison 等, 美 國國家科學院學報 (Proc.Nat.Acad.Sci.USA)81 : 6851-6855(1984))。人源化抗體當在本 文中使用時是嵌合抗體的亞組。
     “單鏈 Fv” 或 “scFv”抗體片段包含抗體的 VH 和 VL 結構域, 其中這些結構域以 單多肽鏈存在。一般地, 所述 scFv 多肽在 VH 和 VL 結構域之間還包含多肽接頭, 所述接 頭使 scFv 形成對于抗原結合需要的結構。關于 scFv 的綜述參見例如 Pluckthun 于 The Pharmacology of MonoclonalAntibodies( 單 克 隆 抗 體 藥 理 學 ), 卷 113, Rosenburg 和 Moore 編輯, Springer-Verlag, New York, pp.269-315(1994) 中。
     “抗原” 是抗體可以選擇性結合的預定抗原。靶抗原可以是多肽, 碳水化合物, 核 酸, 半抗原或其他天然存在的或合成的化合物。優選地, 靶抗原是多肽。
     術語 “雙抗體 (diabodies)” 指具有兩個抗原結合位點的小抗體片段, 所述片段在 相同的多肽鏈 (VH-VL) 中包含與輕鏈可變結構域 (VL) 連接的重鏈可變結構域 (VH)。通過 使用太短所以不能在相同鏈上的兩個結構域之間配對的接頭, 迫使所述結構域與另一條鏈 的互補結構域配對從而產生兩個抗原結合位點。雙抗體更充分地描述于例如 EP 404,097 ; WO 93/11161 ; 和 Hollinger 等, 美 國 國 家 科 學 院 學 報 (Proc.Natl.Acad.Sci.USA)90 : 6444-6448(1993) 中。
     “人抗體” 指這樣的抗體, 其具有與由人生成的抗體的氨基酸序列對應的氨基酸序 列和 / 或使用本文所公開的用于生成人抗體的任何技術產生。人抗體的這種定義明確排除 包含非人抗原結合殘基的人源化抗體。
     “親和力成熟的” 抗體指在抗體的一個或多個 CDRs 中具有一處或多處改變的抗 體, 所述改變導致該抗體對抗原的親和性與沒有這些改變的親本抗體相比有所提高。優 選的親和力成熟的抗體將具有納摩爾或甚至皮摩爾量級的對靶抗原的親和性。親和力成 熟的抗體通過一些本領域已知方法來生成。Marks 等, 生物 / 技術 (Bio/Technology)10 : 779-783(1992) 記載了通過 VH 和 VL 結構域改組進行的親和性成熟。以下文獻記載了 CDR 和 / 或構架殘基的隨機誘變 : Barbas 等, 美國國家科學院學報 (Proc Nat.Acad.Sci, USA)91 : 3809-3813(1994) ; Schier 等, 基因 (Gene)169 : 147-155(1995) ; Yelton 等, 免疫學 雜志 (J.Immunol.)155 : 1994-2004(1995) ; Jackson 等, 免疫學雜志 (J.Immunol.)154(7) : 3310-9(1995) ; 及 Hawkins 等, 分子生物學雜志 (J.Mol.Biol.)226 : 889-896(1992)。
     抗體 “效應子功能” 指那些可歸于抗體 Fc 區 ( 天然序列 Fc 區或氨基酸序列變體 Fc 區 ) 且隨抗體同種型而變化的生物學活性。抗體效應子功能的實例包括 : C1q 結合和補 體依賴性細胞毒性 ; Fc 受體結合 ; 抗體依賴性細胞介導的細胞毒性 (ADCC) ; 吞噬作用 ; 細 胞表面受體 ( 例如 B 細胞受體 ) 下調 ; 和 B 細胞活化。
     “抗體依賴性細胞介導的細胞毒性” 或 “ADCC” 指其中結合到某些細胞毒性細胞 ( 例如天然殺傷 (NK) 細胞、 嗜中性粒細胞和巨噬細胞 ) 上存在的 Fc 受體 (FcR) 上的分泌 型 Ig 使得這些細胞毒性效應細胞能夠特異性結合攜帶抗原的靶細胞, 隨后用細胞毒素殺 死靶細胞的細胞毒性形式。抗體 “武裝” 細胞毒性細胞并且對于這種殺傷是絕對必需的。 介導 ADCC 的主要細胞即 NK 細胞只表達 FcγRIII, 而單核細胞表達 FcγRI、 FcγRII 和 FcγRIII。Ravetch 和 Kinet, 免疫學年評 (Annu.Rev.Immunol.)9 : 457-92(1991) 第 464 頁表 3 總結了造血細胞上的 FcR 表達。為了評估目的分子的 ADCC 活性, 可進行體外 ADCC 測 定法, 諸如美國專利號 5,500,362 或 5,821,337 或 Presta 美國專利號 6,737,056 中所記載 的。可用于此類測定法的效應細胞包括外周血單核細胞 (PBMC) 和天然殺傷 (NK) 細胞。備 選地或另外地, 可在體內評估目的分子的 ADCC 活性, 例如在動物模型中, 諸如 Clynes 等, PNAS(USA)95 : 652-656(1998) 中所公開的。
     “人效應細胞” 指表達一種或多種 FcR 并行使效應子功能的白細胞。優選該細胞至 少表達 FcγRIII 并行使 ADCC 效應子功能。介導 ADCC 的人白細胞的實例包括外周血單核