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一種中藥萃取物的制備方法.pdf

摘要
申請專利號:

CN201310233904.4

申請日:

2013.06.09

公開號:

CN103316184B

公開日:

2015.01.07

當前法律狀態:

授權

有效性:

有權

法律詳情: 授權|||實質審查的生效IPC(主分類):A61K 36/8945申請日:20130609|||公開
IPC分類號: A61K36/8945 主分類號: A61K36/8945
申請人: 浙江中醫藥大學
發明人: 谷滿倉; 童培建; 金紅婷; 單樂天; 尹華; 吳承亮; 俞索靜; 肖魯偉
地址: 310053 浙江省杭州市濱江區濱文路548號
優先權:
專利代理機構: 杭州天正專利事務所有限公司 33201 代理人: 黃美娟;王兵
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法律狀態
申請(專利)號:

CN201310233904.4

授權公告號:

103316184B||||||

法律狀態公告日:

2015.01.07|||2013.10.30|||2013.09.25

法律狀態類型:

授權|||實質審查的生效|||公開

摘要

本發明公開了一種中藥萃取物的制備方法,所述方法為:將熟地5~8份、杜仲2~5份、附子5~8份、枸杞2~5份、肉桂3~5份、山茱萸1~3份、桃仁3~5份、紅花1~3份、山藥2~5份和甘草3~5份分別粉碎后混合均勻,制成中藥組合物粉末,將中藥組合物粉末置于超臨界流體萃取儀中,進行超臨界流體萃取0.1~10小時,從分離器中得到萃取物;本發明提供了采用中藥組合物為原料,以多元超臨界流體萃取技術作為新制備方法得到了兩種中藥萃取物,兩種萃取物促進成骨細胞活性的作用均顯著強于醇-水方法提取中藥提取物。

權利要求書

權利要求書
1.   一種中藥萃取物的制備方法,其特征在于所述方法為:將熟地5~8份、杜仲2~5份、附子5~8份、枸杞2~5份、肉桂3~5份、山茱萸1~3份、桃仁3~5份、紅花1~3份、山藥2~5份和甘草3~5份分別粉碎后混合均勻,制成中藥組合物粉末,將中藥組合物粉末置于超臨界流體萃取儀中,在萃取釜壓力1~100Mpa、萃取釜溫度1~100℃、分離器壓力1~100Mpa、分離器溫度1~100℃的條件下,以二氧化碳為介質進行超臨界流體萃取0.1~10小時,從分離器中得到中藥萃取物SFEI;然后再在萃取釜壓力1~100Mpa、萃取釜溫度1~100℃、分離器壓力1~100Mpa、分離器溫度1~100℃的條件下,以二氧化碳與無水乙醇的混合物為介質進行超臨界流體萃取0.1~10小時,從分離器中得到中藥萃取物SFEII;所述混合物中無水乙醇質量終濃度為0.1~10%。

2.   如權利要求1所述中藥萃取物的制備方法,其特征在于,所述萃取物SFEI制備過程中,萃取釜壓力23~38Mpa、萃取釜溫度38~44℃、分離器壓力7~12Mpa、分離器溫度50~65℃,萃取時間為2~4小時。

3.   如權利要求1或2所述中藥萃取物的制備方法,其特征在于,所述中藥萃取物SFEI制備過程中,萃取釜壓力23Mpa、萃取釜溫度38℃、分離器壓力7Mpa、分離器溫度50℃,萃取時間為4小時。

4.   如權利要求1所述中藥萃取物的制備方法,其特征在于,所述中藥萃取物SFEII制備過程中,萃取釜壓力25~40Mpa、萃取釜溫度38~45℃、分離器壓力6~15Mpa、分離器溫度45~55℃,萃取時間為4~6小時,以二氧化碳與無水乙醇混合物為介質,所述混合物中無水乙醇質量終濃度為0.1~10%。

5.   如權利要求1或4所述中藥萃取物的制備方法,其特征在于,所述中藥萃取物SFEII制備過程中,萃取釜壓力25Mpa、萃取釜溫度38℃、分離器壓力6Mpa、分離器溫度45℃,萃取時間為4小時,以二氧化碳與無水乙醇的混合物為介質,所述混合物中無水乙醇質量終濃度為2%。

6.   如權利要求1所述中藥萃取物的制備方法,其特征在于,所述中藥組合物粉末是將熟地6份、杜仲4份、附子6份、枸杞4份、肉桂4份、山茱萸2份、桃仁4份、紅花2份、山藥4份和甘草4份分別粉碎后混合而制成。

說明書

說明書一種中藥萃取物的制備方法
(一)技術領域
本發明涉及一種采用多元超臨界流體萃取技術制備中藥補腎活血方藥物的新方法,通過該方法所得萃取物具有明顯的促進成骨細胞增殖活性的作用。
(二)背景技術
骨質疏松癥(Osteoporosis,OP)是一種以單位體積內骨組織含量減少,骨密度降低,骨強度減弱,導致骨結構與骨脆性增加并易于發生骨折的全身性骨骼疾病,為骨科的常見病、多發病,其臨床表現主要有骨折、疼痛及肌力低下等其他非特異性癥狀。隨著中國人口老齡化的加速,OP已成為嚴重威脅中老年人健康的疾病。據調查2006年,我國已有骨質疏松患者約9000萬人,約占總人口7.1%,預計到2050年將增加到2.21億人,骨質疏松癥已成為目前社會的主要健康問題之一。現代醫學認為正常成人期骨代謝主要靠破骨細胞的骨吸收和成骨細胞的骨形成之間的協調平衡,從而形成體內骨轉換的穩定狀態;任何影響破骨細胞和成骨細胞數目和功能的因素,使骨吸收過多或骨形成不足,即可導致骨質疏松。目前治療骨質疏松的藥物主要可分為3大類:①抑制破骨細胞活性的藥物,主要有雌激素、降鈣素、雙膦酸鹽、異丙氧黃酮、選擇性雌激素受體調節劑等,②促進成骨細胞生成的藥物,主要有氯化物、甲狀旁腺激素、蛋白合成激素;③促進骨化的藥物,主要有鈣劑和維生素D及其衍生物等。目前臨床上對骨質疏松的治療,以藥物治療為主,化學藥物治療骨質疏松癥服藥時間長,且易引起神經系統和消化系統等一系列不良反應,在一定程度上還會損害肝臟等臟器,如雌激素替代療法可增加乳癌的危險性,氟化物可引起骨脆性增加。國內學者發揮傳統中醫藥的優勢,對利用補腎類方藥,對治療OP做了很多研究,并取得了一定的療效,因此從傳統中藥復方中發現新型的抗OP藥物,對于臨床治療OP具有重大意義。
補腎活血方為臨床治療骨質疏松的有效方劑,全方由仲景名方右歸飲加桃仁、紅花所組成,取右歸飲補腎助陽之功,增桃仁、紅花活血化瘀之力,全方補腎助陽,活血通絡,與骨質疏松患者腎陽不足,瘀血內停的病機相符,所以此方為臨床治療骨質疏松癥的有效方劑。發明專利《一種治療骨質疏松癥的中藥組合物及補腎活血顆粒劑》表明由補腎活血方進一步制得的補腎活血顆粒能夠有效提高大鼠骨密度、骨強度,通過降低尿脫氧吡啶酚、尿脫氧吡啶酚/尿肌酐水平以及破骨細胞整合素αVβ3的表達抑制骨吸收,從而達到治療骨質疏松的目的。許應星等的研究亦表明補腎活血顆粒含藥血清具有一定的促進成骨細胞活性與礦化能力的作用。
發明專利CN102145106A公開了一種以治療骨質疏松的補腎活血方藥物組合物為原料藥制備補腎活血顆粒的方法。該發明主要采用傳統的醇提加水煎煮乙醇沉淀方法。該制備方法雖然遵循了補腎活血方以湯劑給藥的傳統,但傳統湯劑隨煎隨服,此時揮發油和其他親脂性成分仍存在與湯劑中,因此可以保證療效。而現代工藝制備補腎活血顆粒往往需要過濾、濃縮和干燥等步驟,其主要成分與傳統湯劑相比可能已有較大差異;因此僅以右歸飲水煎劑作為對象研究藥效物質基礎,存在一定的局限性。化學成分研究表明復方中作為君藥的熟地黃因炮制的原因,其主要成分從親水性的苷類(如,環烯醚帖苷類、紫羅蘭酮苷類等)轉變為親脂性較強的苷元,水煎煮工藝可保證此類苷元有效溶出,目前都尚不清楚。處方中有肉桂,富含揮發油成分,且與療效密切相關。傳統給藥方法采用全方水煎煮后立即服用,揮發油仍存于湯劑中,可以保證療效。若按此工藝開發成成方制劑,則在提取、濃縮中揮發油成分必定損失殆盡。經改進后采用水蒸汽蒸餾或乙醇熱回流提取等方式,但得率較低,僅2.3%,且肉桂中其他有效成分在長時間加熱過程中容易損失。因此有必要采用新的提取技術于補腎活血方中促進成骨細胞活性的有效組分。
超臨界流體萃取技術(Supercritical fluid extraction,SFE)為一種較為先進的物理萃取方法,主要以CO2作為萃取介質,具有對環境友好無污染、提取溫度低、對有效成分破壞少等優點,已成為一種理想的現代中藥提取技術,廣泛應用于單味或復方藥味中脂肪油與揮發油的等脂溶性小分子物質的萃取中。然而由于中藥復方成分復雜,除了脂溶性小分子外,還有存在大量中等極性甚至強極性的有效成分,使得以CO2作為萃取介質的傳統SFE在應用于萃取復方中藥全方有效組分時收到極大限制。通過向CO2中添加乙醇等極性夾帶劑可使SFE適用于萃取生物堿、香豆素、木脂素、黃酮類、醌類、皂苷類等親脂性成分,但也增大的萃取物中雜質的含量,降低了SFE的選擇性。
(三)發明內容
本發明目的是提供一種采用超臨界流體萃取技術作為新的制備方法從中藥組合物(即補腎活血方藥物)中富集得到具有促進成骨細胞活性作用的萃取物;該萃取物與中藥組合物(即補腎活血方藥物)醇?水提取物相比具有更為顯著的促進成骨細胞活性的作用。
本發明采用的技術方案是:
本發明提供一種中藥萃取物的制備方法,所述方法為:將熟地5~8份、杜仲2~5份、附子5~8份、枸杞2~5份、肉桂3~5份、山茱萸1~3份、桃仁3~5份、紅花1~3份、山藥2~5份和甘草3~5份分別粉碎后混合均勻,制成中藥組合物粉末,將中藥組合物粉末置于超臨界流體萃取儀中,在萃取釜壓力1~100Mpa、萃取釜溫度1~100℃、分離器壓力1~100Mpa、分離器溫度1~100℃的條件下,以二氧化碳為介質進行超臨界流體萃取0.1~10小時,從分離器中得到中藥萃取物SFEI;然后再在萃取釜壓力1~100Mpa、萃取釜溫度1~100℃、分離器壓力1~100Mpa、分離器溫度1~100℃的條件下,以二氧化碳與無水乙醇混合物為介質進行超臨界流體萃取0.1~10小時,從分離器中得到中藥萃取物SFEII;所述二氧化碳與無水乙醇混合物中無水乙醇質量終濃度為0.1~10%。
進一步,所述萃取物SFEI制備過程中,萃取釜壓力23~38Mpa、萃取釜溫度38~44℃、分離器壓力7~12Mpa、分離器溫度50~65℃,萃取時間為2~4小時。
更進一步,優選所述中藥萃取物SFEI制備過程中,萃取釜壓力23Mpa、萃取釜溫度38℃、分離器壓力7Mpa、分離器溫度50℃,萃取時間為4小時。
進一步,所述中藥萃取物SFEII制備過程中,萃取釜壓力25~40Mpa、萃取釜溫度38~45℃、分離器壓力6~15Mpa、分離器溫度45~55℃,萃取時間為4~6小時,以二氧化碳與無水乙醇的混合物為介質,所述二氧化碳與無水乙醇混合物中無水乙醇質量終濃度為0.1~10%。
更進一步,所述中藥萃取物SFEII制備過程中,萃取釜壓力25Mpa、萃取釜溫度38℃、分離器壓力6Mpa、分離器溫度45℃,萃取時間為4小時,以二氧化碳與無水乙醇的混合物為介質,所述二氧化碳與無水乙醇混合物中無水乙醇質量終濃度為2%。
進一步,優選所述中藥組合物粉末是將熟地6份、杜仲4份、附子6份、枸杞4份、肉桂4份、山茱萸2份、桃仁4份、紅花2份、山藥4份和甘草4份分別粉碎后混合而制成。
本發明所述中藥組合物為補腎活血方藥物,參見發明專利CN102145106A。所述中藥組合物由經典古方右歸飲添加桃仁、紅花兩味活血中藥組成,具有補腎益精、活血化瘀、散寒止痛之療效,臨床用于治療骨質疏松癥。方中熟地益髓填精,杜仲補肝腎、壯筋骨,為君藥;附子、肉桂補腎陽,山茱萸、枸杞養肝血,助君藥以滋腎養肝,是為臣藥;桃仁、紅花活血以散瘀止痛,為佐藥;山藥、甘草補中養脾,為使藥;諸藥合用,共奏補腎益精、活血化瘀、散寒止痛之功效。
所述多元超臨界流體萃取技術方案所得中藥萃取物SFEI,得率為(0.4~8.9)%,含有桂皮醛(0.2~11.0)%,亞油酸(17.7~52.3)%,油酸(11.1~32.9)%。中藥萃取物SFEII,得率為(0.8~15.9)%,含有桂皮醛(0.8~12.0)%,亞油酸(11.3~27.5)%,油酸(6.6%~16.1)%。
本發明所述的超臨界流體方法獲得的中藥萃取物SFEI與萃取物SFEII經體外細胞學實驗證明,其含藥血清能夠促進原代培養大鼠顱成骨細胞及小鼠成骨細胞前體MC3T3E1的增殖活性,提高其堿性磷酸酶表達。本發明的中藥萃取物SFEI與中藥萃取物SFEII促進成骨細胞活性的效果明顯優于相同中藥醇?水提取物。
與現有技術相比,本發明的有益效果主要體現在:本發明提供了采用中藥組合物為原料,以多元超臨界流體萃取技術作為新制備方法得到了兩種中藥萃取物,兩種萃取物促進成骨細胞活性的作用均顯著強于醇?水方法獲得的中藥提取物。
(四)附圖說明
圖1為桂皮醛、油酸甲酯、亞油酸甲酯對照品氣相色譜圖:A為桂皮醛對照品氣相色譜圖;B為油酸甲酯對照品氣相色譜圖;C為亞油酸甲酯對照品氣相色譜圖;D為十七烷酸甲酯(內標)氣相色譜圖。
圖2為實施例1制備的SFEI、SFEII氣相色譜檢測結果圖:A為SFEI中桂皮醛氣相色譜檢測結果圖;B為SFEI中脂肪酸甲酯化氣相色譜檢測結果圖;C為SFEII中桂皮醛氣相色譜檢測結果圖;D為SFEII中脂肪酸甲酯化氣相色譜檢測結果圖。
圖3為實施例7制備的中藥醇?水提取物氣相色譜檢測結果圖:A為醇?水提取物中桂皮醛氣相色譜檢測結果圖,B為醇?水提取物中脂肪酸甲酯化氣相色譜檢測結果圖。
圖4不同給藥劑量SFEI與SFEII含藥血清促進原代培養顱成骨細胞增殖活性圖。
圖5不同給藥劑量SFEI與SFEII含藥血清促進MC3T3E1E1細胞增殖活性圖。
圖6不同給藥劑量SFEI與SFEII含藥血清促進MC3T3E1E1細胞堿性磷酸酶活性圖。
(五)具體實施方式
下面結合具體實施例對本發明進行進一步描述,但本發明的保護范圍并不僅限于此:
實施例1中藥萃取物的制備
處方:熟地6份,杜仲4份,附子6份,枸杞4份,肉桂4份,山茱萸2份,桃仁4份,紅花2份,山藥4份,甘草4份;
取上述各味藥材,采用小型植物粉碎機(FZ102,北京中興偉業儀器有限公司)粉碎成粒徑為30目~60目的粗粉后置于超臨界流體萃取儀(HA220?40?11,南通市華安超臨界萃取有限公司)的萃取釜中,用二氧化碳為介質進行超臨界流體萃取,萃取釜壓力23Mpa,萃取釜溫度38℃,分離器壓力7Mpa,分離器溫度50℃,萃取4小時,從分離器中得到萃取物SFEI。然后再在萃取釜壓力25Mpa,萃取釜溫度38℃,分離器壓力6Mpa,分離器溫度45℃,以二氧化碳與無水乙醇混合物(混合物中無水乙醇質量終濃度為2%)為介質進行超臨界流體萃取4小時,從分離器中得到萃取物SFEII。萃取物SFEI,為澄黃色透明油狀液體,得率為5.1%,每g萃取物SFEI相當于中藥組合物生藥量19.5g,萃取物SFEII為棕色浸膏狀半固體,得率為9.5%,每g萃取物SFEII相當于中藥組合物生藥量10.5g。采用氣相色譜法對SFEI和SFEII進行成分分析(測試方法見實施例2),結果見圖1、圖2所示,SFEI含有桂皮醛3.7%,亞油酸48.9%,油酸30.8%;SFEII含有桂皮醛9.0%,亞油酸16.2%,油酸9.5%。
實施例2中藥萃取物成分分析方法
1)桂皮醛含量測定方法:
(1)氣相色譜條件與系統適應性:色譜柱:DB?5毛細管氣相色譜柱(30m×250μm,0.25μm),載氣N2,流速1.0ml/min,進樣口溫度230℃,程序升溫條件:100℃,20℃/min升溫至140℃,2℃/min升溫至160℃,保持2min,FID檢測器,檢測器溫度:230℃,分流比:20:1,進樣量:1.0μl,分離度應大于1.5,理論板數以桂皮醛峰計應大于3000。
(2)對照品供試液制備:精密稱取桂皮醛對照品(購自中國食品藥品檢定研究院,貨號110710?201217)約50mg,置于50ml容量瓶中,無水甲醇溶解后定容至50ml,即為桂皮醛對照品貯備液,精密移取該對照品貯備液0.2ml、1.8ml置于2ml容量瓶,無水甲醇定容,即得桂皮醛對照品供試液a(0.1mg/ml)與b(0.9mg/ml),4℃保存。
(3)SFEI供試液制備:精密稱取SFEI200mg,加3.0ml無水甲醇,超聲提取10min,靜置待分層,取上層清液a置于5ml容量瓶,取殘渣用無水甲醇洗滌2次,每次無水甲醇1.0ml,靜置待分層,將兩次洗滌獲得的上層液并入上層清液a中,無水甲醇定容至5.0ml,即得SFEI供試液,4℃保存。
(4)測定法:分別精密吸取對照品供試液a與b各1.0μL、SFEI供試液1.0μL,分別注入氣相色譜儀進行色譜分析,對照品供試液的氣相色譜圖見圖1中A所示,SFEI供試液的氣相色譜圖見圖2中A所示。以桂皮醛對照品峰面積對桂皮醛對照品濃度做線性回歸,得回歸方程y=0.003x+0.0106,(r=0.9998),x為桂皮醛濃度,y為桂皮醛對照品峰面積,將SFEI供試液中桂皮醛峰面積代入該回歸方程計算,即得SFEI供試液中桂皮醛的含量。
SFEII供試液和醇?水提取物供試液的制備方法同SFEI供試液的制備,不同的是精密稱取SFEII500mg,或者醇?水提取物1.0g,SFEII供試液的氣相色譜圖見圖2中C所示,醇?水提取物供試液的氣相色譜圖見圖3中A所示。
2)油酸與亞油酸含量測定方法:
(1)氣相色譜條件與系統適應性:色譜柱:HP?INNOWax PEG毛細管氣相色譜柱(30m×250μm,0.32μm),載氣N2,流速1.0ml/min,進樣口溫度210℃,柱溫190℃,保持25min,FID檢測器,檢測器溫度:210℃,分流比:20:1,進樣量:0.2μl,分離度應大于1.5,理論板數以油酸甲酯和亞油酸甲酯峰計應大于3000。
(2)對照品貯備液制備:精密稱取油酸甲酯和亞油酸甲酯對照品各約100mg,分別置于25ml容量瓶中,正己烷溶解后定容至25ml,即得油酸甲酯對照品貯備液和亞油酸甲酯對照品貯備液,4℃保存。
(3)內標貯備液制備:精密稱取十七烷酸甲酯對照品約50mg,置于25ml容量瓶中,正己烷溶解后定容至50ml,即得內標貯備液,4℃保存。
(4)對照品供試液制備:精密移取油酸甲酯對照品貯備液0.1ml、1.6ml分別置于2ml容量瓶,每個容量瓶加入內標貯備液0.25ml,分別用正己烷定容,即得油酸甲酯對照品供試液a(0.2mg/ml)與b(3.2mg/ml),4℃保存。精密移取亞油酸甲酯對照品貯備液0.1ml、1.6ml分別置于2ml容量瓶,每個容量瓶加入內標貯備液0.25ml,分別用正己烷定容,即得亞油酸甲酯對照品供試液a(0.2mg/ml)與b(3.2mg/ml),4℃保存。
(5)SFEI供試液制備:精密移取內標貯備液0.5ml,置10ml容量瓶中,N2氣吹干溶劑,再精密加入SFEI30mg,加0.5mol/L氫氧化鉀甲醇溶液2ml,充氮氣,密塞,在65℃水浴中皂化約15min,待油珠溶解后,放冷,加2.0mol/L三氟化硼甲醇溶液2ml,充氮氣,在65℃中甲酯化2min,放冷,精密加入正己烷4ml,振搖,加入飽和氯化鈉溶液至刻度,充氮氣,靜置待分層,吸取上層清液1.0ml,即得SFEI供試液,4℃保存。
(6)測定法:精密吸取油酸甲酯對照品供試液a與b各0.2μL、亞油酸甲酯對照品供試液a與b各0.2μL、SFEI供試液0.2μL,分別注入氣相色譜儀進行色譜分析,油酸甲酯對照品氣相色譜圖見圖1中B所示,亞油酸甲酯對照品氣相色譜圖見圖1中C所示,SFEI供試液氣相色譜圖見圖2中B所示。以油酸甲酯或亞油酸甲酯對照品峰面積與內標峰面積比值對油酸甲酯對照品或亞油酸甲酯對照品濃度做線性回歸,得油酸甲酯回歸方程y=4.5809x?0.2303(r=0.9991),x為油酸甲酯對照品濃度,y為油酸甲酯對照品峰面積與內標峰面積比值;亞油酸甲酯回歸方程y=3.9658x?0.2535(r=0.9993),x為亞油酸甲酯對照品濃度,y為亞油酸甲酯對照品峰面積與內標峰面積比值,將SFEI供試液中油酸甲酯或亞油酸甲酯峰面積與內標峰面積比值代入該回歸方程計算,即得SFEI中油酸和亞油酸含量。
SFEII供試液、醇?水提取物供試液的制備同SFEI供試液,不同的是精密稱取SFEII30mg,或者精密加入醇?水提取物200mg,SFEII供試液氣相色譜圖見圖2中D所示,醇?水提取物供試品氣相色譜圖見圖3中B所示。
實施例3
處方:熟地5份,杜仲3份,附子5份,枸杞3份,肉桂3份,山茱萸2份,桃仁3份,紅花2份,山藥3份,甘草3份;
取上述各味藥材,采用小型植物粉碎機(FZ102,北京中興偉業儀器有限公司)粉碎成粒徑為30目~60目的粗粉后置于超臨界流體萃取儀的萃取釜中,用二氧化碳為介質進行超臨界流體萃取,萃取釜壓力38Mpa,萃取釜溫度44℃,分離器壓力12Mpa,分離器溫度65℃,萃取2小時,從分離器中得到萃取物SFEI。再在萃取釜壓力40Mpa,萃取釜溫度45℃,分離器壓力15Mpa,分離器溫度55℃,以二氧化碳與無水乙醇混合物(混合物中無水乙醇質量終濃度4%)為介質進行超臨界流體萃取6小時,從分離器中得到萃取物SFEII。萃取物SFEI為澄黃色透明油狀液體,得率為1.9%,每g萃取物SFEI相當于中藥組合物生藥量52.5g,萃取物SFEII為棕色浸膏狀半固體物質,得率為2.6%,每g萃取物SFEII相當于中藥組合物生藥量38.4g。根據實施例2方法測試得到SFEI含有桂皮醛6.1%,亞油酸51.4%,油酸32.4%。SFEII含有桂皮醛11.6%,亞油酸27.5%,油酸16.1%。
實施例4
處方:熟地6.5份,杜仲4.5份,附子6.5份,枸杞4.5份,肉桂4.5份,山茱萸1.8份,桃仁4.5份,紅花1.8份,山藥4.5份,甘草4.5份;
取上述各味藥材,粉碎后置于超臨界流體萃取儀的萃取釜中,用二氧化碳為介質進行超臨界流體萃取,萃取釜壓力1Mpa,萃取釜溫度90℃,分離器壓力1Mpa,分離器溫度95℃,萃取10小時,從分離器中得到萃取物SFEI。然后再在萃取釜壓力2Mpa,萃取釜溫度90℃,分離器壓力1Mpa,分離器溫度95℃,以二氧化碳與無水乙醇混合物(混合物中無水乙醇質量終濃度0.1%)為介質進行超臨界流體萃取10小時,從分離器中得到萃取物SFEII。萃取物SFEI為澄黃色渾濁油狀液體,得率為1.2%,每g萃取物SFEI相當于中藥組合物生藥量83.3g,萃取物SFEII為淺棕黃色流浸膏半固體物質,得率為1.5%,每g萃取物SFEII相當于中藥組合物生藥量66.7g。
根據實施例2方法可知,萃取物SFEI含有桂皮醛11.0%,亞油酸36.2%,油酸21.0%。萃取物SFEII含有桂皮醛12.0%,亞油酸11.8%,油酸6.9%。
實施例5
處方:熟地5份,杜仲3份,附子5份,枸杞3份,肉桂3份,山茱萸2份,桃仁3份,紅花2份,山藥3份,甘草3份;
取上述各味藥材,粉碎后置于超臨界流體萃取儀的萃取釜中,用二氧化碳為介質進行超臨界流體萃取,萃取釜壓力100Mpa,萃取釜溫度32℃,分離器壓力12Mpa,分離器溫度65℃,萃取2小時,從分離器中得到萃取物SFEI。再在萃取釜壓力1Mpa,萃取釜溫度80℃,分離器壓力100Mpa,分離器溫度85℃,以二氧化碳與乙醇混合物為介質(混合物中無水乙醇質量終濃度10%)超臨界流體萃取0.1小時,從分離器中得到萃取物SFEII。萃取物SFEI為澄黃色透明油狀液體,得率為8.9%,每g萃取物SFEI相當于中藥組合物生藥量11.2g,萃取物SFEII為淺棕黃色流浸膏狀半固體物質,得率為0.8%,每g萃取物SFEII相當于中藥組合物生藥量125g。
根據實施例2方法可知,萃取物SFEI含有桂皮醛1.6%,亞油酸52.3%,油酸32.9%。上述實例所得萃取物SFEII含有桂皮醛0.8%,亞油酸11.3%,油酸6.6%。
實施例6
處方:熟地6.5份,杜仲4.5份,附子6.5份,枸杞4.5份,肉桂4.5份,山茱萸1.8份,桃仁4.5份,紅花1.8份,山藥4.5份,甘草4.5份;
取上述各味藥材,粉碎后置于超臨界流體萃取儀的萃取釜中,用二氧化碳為介質進行超臨界流體萃取,萃取釜壓力1Mpa,萃取釜溫度90℃,分離器壓力100Mpa,分離器溫度95℃,萃取0.1小時,從分離器中得到萃取物SFEI。再在萃取釜壓力100Mpa,萃取釜溫度32℃,分離器壓力6Mpa,分離器溫度75℃,以二氧化碳與無水乙醇混合物(混合物中無水乙醇質量終濃度2%)為介質進行超臨界流體萃取2小時,從分離器中得到萃取物SFEII。萃取物SFEI為澄黃色透明油狀液體,得率為0.4%,每g萃取物SFEI相當于中藥組合物生藥量250g,萃取物SFEII為棕色浸膏狀半固體物質,得率為15.9%,每g萃取物SFEII相當于中藥組合物生藥量6.3g。
根據實施例2方法可知,萃取物SFEI含有桂皮醛8.8%,亞油酸17.7%,油酸11.1%;萃取物SFEII含有桂皮醛2.3%,亞油酸24.9%,油酸14.6%。
實施例7中藥醇?水提取物的制備(即補腎活血方藥物提取物)
處方:處方:熟地6份,杜仲4份,附子6份,枸杞4份,肉桂4份,山茱萸2份,桃仁4份,紅花2份,山藥4份,甘草4份;
制備方法:
杜仲、熟地、附子、山茱萸、等8味藥水提,肉桂、桃仁2味藥醇提。
(1)水提物:取配方量的熟地、杜仲、附子、枸杞、山茱萸、紅花、山藥和甘草中藥飲片,加入12質量倍的水,浸泡1~2h后,回流提取3次,每次1.5h,合并水提取液、減壓濃縮至相對密度為1.05,再加入體積濃度95%乙醇水溶液使乙醇水溶液體積濃度為60%,4℃下醇沉24h,回收乙醇并濃縮至相當于1g藥液相當于中藥組合物生藥量4.0g,藥液相對密度為1.45,得到水提物;
(2)醇提物:取配方量的肉桂和桃仁的中藥飲片,加入10質量倍的體積濃度60%乙醇水溶液浸泡1h后,85℃浸提3次,每次1.5h;合并醇提取液、減壓濃縮至相當于1g藥液相當于中藥組合物生藥量4.0g,藥液相對密度為1.45,得到醇提物;
(3)將全部水提物與全部醇提物混合均勻,即得中藥醇?水提取物,該提取物1g藥液相當于中藥組合物生藥量4.0g,藥液相對密度為1.45,含有桂皮醛0.42%。
實施例8中藥萃取物含藥血清制備方法
(1)實驗動物:SD大鼠66只,清潔級,雌雄各半、體重約200±20g,購自浙江中醫藥大學動物實驗中心,實驗在浙江中醫藥大學動物實驗中心進行,室溫20~23℃,相對濕度60%~70%,12小時交替光照。
(2)給藥方案與血清制備方法:所有動物按體重隨機分為11組,每組6只,分別為:空白對照組(組1),陽性藥物(仙靈骨葆膠囊,貴州同濟堂制藥有限公司生產,取仙靈骨葆膠囊內容物溶于適量純化水,制成0.019g/ml溶液)對照組(組2),實施例1制備的SFEI低劑量組(0.033g/ml萃取物SFEI水溶液1.0ml/100g體重,相當于給予中藥組合物生藥量6.25g/kg體重·天,組3)、中劑量組(0.13g/ml萃取物SFEI水溶液1.0ml/100g體重,相當于給予中藥組合物生藥量25g/kg體重·天,組4)、高劑量組(0.38g/ml萃取物SFEI水溶液1.0ml/100g體重,相當于給予中藥組合物75g/kg體重·天,組5),實施例1制備SFEII低劑量組(0.060g/ml萃取物SFEII水溶液1.0ml/100g體重,相當于給予中藥組合物生藥量6.25g/kg體重·天,組6)、中劑量組(0.24g/ml萃取物SFEII水溶液1.0ml/100g體重,相當于給予中藥組合物生藥量25g/kg體重·天,組7)、高劑量組(0.71g/ml萃取物SFEII水溶液1.0ml/100g體重,相當于給予中藥組合物生藥量75g/kg體重·天,組8),中藥醇?水提物低劑量組(0.16g/ml醇?水提取物水溶液1.0ml/100g體重,相當于給予中藥組合物6.25g/kg體重·天,組9)、中劑量組(0.62g/ml醇?水提取物水溶液1.0ml/100g體重,相當于給予中藥組合物生藥量25g/kg體重·天,組10)、高劑量組(1.87g/ml醇?水提取物水溶液1.0ml/100g體重,相當于給予中藥組合物生藥量75g/kg體重·天,組11)。各給藥組灌胃給藥1.0ml/100g體重,1次/天,共3天,空白對照組灌胃給予蒸餾水1.0ml/100g體重,其余同給藥組;末次給藥45min后腹腔注射30mg/g戊巴比妥溶液(0.15ml/100g體重)麻醉,15min后大鼠心臟取血約8~10ml置于預先標記組號的15ml離心管中,置于4℃冰箱0.5小時,離心3000rpm、10min,小心吸取上層血清于預先標記組號的離心管中,置于56℃水浴中滅活30min,?80℃保存,臨用前過0.22μm濾膜濾過除菌,即為空白血清(組1)和含藥血清(組2~組11)。
實施例9中藥萃取物、中藥醇?水提取物含藥血清促原代培養大鼠顱成骨細胞增殖實驗
(1)大鼠顱成骨細胞原代培養:取出生48h的SD大鼠乳鼠處死放于體積濃度75%乙醇水溶液中2min,放入無菌操作箱在無菌條件下取出顱蓋骨,PBS液(pH值為7.4)漂洗2次,剪成大小約1mm×1mm的小塊,置于離心管中加入5ml、2.5mg/ml胰蛋白酶/EDTA(購自Hyclone公司,貨號SH30042.01B)消化,置于37℃恒溫水浴20min,棄上清液,加5ml、1mg/ml I型膠原酶(取適量I型膠原酶粉末(購自Sigma公司,貨號C0130,≥125CDU/mg)溶于D?Hank’s培養液),恒溫振蕩儀孵育1小時,吸取上清液,1000轉/min離心15min,棄上清液,加入RPMI1640培養液(2000mg/L D?葡萄糖,300mg/L L?谷氨酰胺,2000mg/L碳酸氫鈉。pH值7.0?7.4。杭州吉諾生物醫藥技術有限公司,貨號GNM31800)制成細胞懸液;剩余骨片重復加入5ml I型膠原酶,重復前面操作,合并細胞懸液,按細胞數2×105將上述細胞懸液直接接種于6孔培養板中,37℃、5%CO2飽和濕度下培養,每3天換RPMI1640培養液1次,取對數生長期第3代大鼠顱成骨細胞進行藥物干預及細胞增殖活性測定。
(2)細胞增殖活性實驗(MTT法):取步驟(1)獲得的對數生長期第3代大鼠顱成骨細胞,經2.5mg/ml胰蛋白酶/EDTA消化、RPMI1640培養液混懸,計數后按2×104/ml將上述細胞懸液接種于96孔培養板,放回培養箱中37℃、5%CO2飽和濕度下孵育過夜。將實施例8制備的各組含藥血清(組2~組11)與空白對照組血清(組1)分別用無血清RPMI1640培養液稀釋使每孔中血清體積終濃度為2%,同時設立不含細胞的RPMI1640培養液對照孔。將培養板放回培養箱中37℃、5%CO2飽和濕度下孵育48h后棄去各孔培養液,小心用PBS(pH值為7.2)洗滌細胞一次,每孔加入100μL含0.5mg/ml噻唑蘭的無血清RPMI1640培養液,放回培養箱中37℃、5%CO2飽和濕度下孵育4h,4℃終止反應,小心棄去上層清液,每孔加150μL DMSO,振蕩15min,490nm下測定吸光度(OD),根據公式(1)計算成骨細胞凈增殖率,結果見圖3所示。
成骨細胞凈增殖率=[(含藥血清處理孔OD-培養液對照孔OD)-(空白血清處理孔OD-培養液對照孔OD)]/(空白血清處理孔OD-培養液對照孔OD)
(3)實驗結果:由圖4可知,本發明中藥萃取物,即SFEI低、中、高劑量組含藥血清促進原代成骨細胞增殖率分別為空白對照組的(110.62±5.61)%、(140.75±7.90)%與(110.15±4.97)%,各組與空白對照組相比均具有顯著性差異(P<0.05)。本發明中藥萃取物,即SFEII低、中、高劑量組含藥血清與空白對照組相比促進原代成骨細胞增殖率分別為(123.4±6.77)%、(119.63±5.89)%與(97.36±4.02)%,低劑量組和中劑量組與空白對照組相比具有顯著性差異(P<0.05)。中藥醇?水提取物低、中、高劑量組其中低劑量組與中劑量組促進原代成骨細胞增殖率分別為空白對照組的(106.02±7.42)%、(119.08±8.57)%與(106.35±6.91)%,中劑量組與空白對照組相比有顯著性差異(P<0.05)。其中SFEI中劑量組、SFEII低劑量組含藥血清促原代培養成骨細胞增殖作用顯著強于中藥醇?水提取物相應劑量組含藥血清(P<0.05)。
實施例10中藥萃取物、中藥醇?水提取物含藥血清促小鼠成骨前體細胞MC3T3E1增殖實驗
(1)細胞培養:MC3T3E1細胞(購自中國科學院典型培養物保藏委員會細胞庫)常規貼壁生長,傳代培養于含10%胎牛血清、100Ku/L青霉素和100mg/L鏈霉素的α?MEM培養液中(含核糖核酸和脫氧核糖核酸,1000mg/L D?葡萄糖,292mg/L L?谷氨酰胺,110mg/L丙酮酸鈉,2200mg/L碳酸氫鈉,pH值7.0?7.4。杭州吉諾生物醫藥技術有限公司,貨號GNM11900),37℃、5%CO2飽和濕度的細胞培養箱中孵育,2d換液,3d傳代1次。
(2)細胞增殖活性實驗(MTT法):取對數生長期MC3T3E1細胞,經消化、培養液混懸,計數后按2×104/ml接種于96孔培養板,放回培養箱中37℃、5%CO2飽和濕度下孵育過夜。將實施例8制備的各組含藥血清(組2~組11)與空白對照組血清(組1)分別用無血清α?MEM培養液稀釋使每孔中血清體積終濃度為2%,同時設立不含細胞的α?MEM培養液對照孔。將培養板放回培養箱中37℃、5%CO2飽和濕度下孵育48h后棄去各孔培養液,小心用PBS洗滌細胞一次,分別加入100μL含0.5mg/ml噻唑蘭的無血清α?MEM培養液,放回培養箱中37℃、5%CO2飽和濕度下孵育4h,4℃終止反應,小心棄去上層清液,每孔加150μL DMSO,振蕩15min,490nm下測定吸光度(OD),根據公式(1)計算成骨細胞凈增殖率。
成骨細胞凈增殖率=[(含藥血清處理孔OD-培養液對照孔OD)-(空白血清處理孔OD-培養液對照孔OD)]/(空白血清處理孔OD-培養液對照孔OD)
(3)實驗結果:由圖5可知,本發明中藥萃取物,即SFEI低、中、高劑量組含藥血清促進MC3T3E1細胞增殖率分別為空白對照組的(101.72±4.88)%、(125.97±7.41)%與(113.67±6.04)%,中劑量和高劑量組與空白對照組相比具有顯著性差異(P<0.05)。本發明中藥萃取物,即SFEII低、中、高劑量組促進MC3T3E1細胞增殖率分別為空白對照組的(121.22±7.26)%、(116.09±6.38)%與(115.89±7.11)%,各劑量組與空白對照組相比均具有顯著性差異(P<0.05)。中藥醇?水提取物低、中、高劑量組其中低劑量組與中劑量組與空白對照組相比促進原代成骨細胞增殖率分別為(107.42±5.98)%、(108.70±5.77)%與(111.82±6.23)%,高劑量組與空白對照組相比有顯著性差異(P<0.05)。其中SFEI中劑量組、SFEII低劑量組含藥血清促MC3T3E1細胞增殖作用顯著強于中藥醇?水提取物相應劑量組含藥血清(P<0.05)。
實施例11中藥萃取物、中藥醇?水提取物含藥血清增強小鼠成骨前體細胞MC3T3E1堿性磷酸酶活性實驗(pNPP法)
(1)實驗方法:取對數生長期MC3T3E1細胞,經消化、培養液混懸,計數后按2×104/ml接種于96孔培養板,放回培養箱中37℃、5%CO2飽和濕度下孵育過夜。將實施例8制備的各組含藥血清(組2~組11)與空白對照組(組1)血清分別用無血清α?MEM培養液稀釋使每孔中血清體積終濃度為2%,同時設立不含細胞的α?MEM培養液對照孔。將培養板放回培養箱中分別于37℃、5%CO2飽和濕度下孵育48h后棄去各孔培養液,小心用PBS洗滌細胞一次,按堿性磷酸酶檢測試劑盒(碧云天生物技術有限公司,貨號P0321)要求操作,同時按試劑盒要求制作對羥基硝基酚對照品孔,在405nm測定各孔吸光度。按對羥基硝基酚對照品濃度對吸光值做線性回歸,得回歸方程y=0.025x+0.0129(r=0.9998),x為對羥基硝基酚對照品濃度,y為吸光值。
將各測定孔吸光值代入回歸方程,以產生1微摩爾對羥基硝基酚所需的堿性磷酸酶的量定義為一個酶活力單位(IU)計算各孔堿性磷酸酶活性(IU)。
(2)實驗結果:由圖6可知,本發明中藥萃取物,即SFEI低、中、高劑量組含藥血清處理MC3T3E1細胞48hr后胞漿堿性磷酸酶活性分別為(8.56±1.03)IU、(24.41±2.68)IU與(13.37±1.60)IU,與對照組相比均具有顯著性差異(P<0.05)。本發明中藥萃取物,即SFEII低、中、高劑量組含藥血清處理MC3T3E1細胞48hr后胞漿堿性磷酸酶活性分別為(24.38±3.71)IU、(16.65±1.67)IU與(14.27±1.57)IU,與對照組相比均具有顯著性差異(P<0.05)。中藥醇?水提取物低、中、高劑量組含藥血清處理MC3T3E1細胞48hr后胞漿堿性磷酸酶活性分別為(9.97±1.10)IU、(14.15±1.70)IU與(11.80±1.30)IU,與對照組相比均具有顯著性差異(P<0.05)。其中SFEI中、高劑量組及SFEII低、中、高劑量組含藥血清促MC3T3E1細胞堿性磷酸酶活性作用顯著強于中藥醇?水提取物相應劑量組含藥血清(P<0.05)。
以上所述實施例僅表達了本發明的實施方式,其描述較為具體和詳細,但并不能因此而理解為對本發明專利范圍的限制。應當指出的是,對于本領域的普通技術人員來說,在不脫離本發明構思的前提下,還可以做出若干變形和改進,這些都屬于本發明的保護范圍。因此,本發明專利的保護范圍應以所附權利要求為準。

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一種 中藥 萃取 制備 方法
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