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一種用于組織培養楝樹幼苗的方法.pdf

摘要
申請專利號:

CN201310177348.3

申請日:

2013.05.14

公開號:

CN103299902B

公開日:

2015.01.07

當前法律狀態:

授權

有效性:

有權

法律詳情: 授權|||實質審查的生效IPC(主分類):A01H 4/00申請日:20130514|||公開
IPC分類號: A01H4/00 主分類號: A01H4/00
申請人: 王臺虎
發明人: 王臺虎
地址: 211800 江蘇省南京市浦口區經濟開發區天浦路5號
優先權:
專利代理機構: 南京中新達專利代理有限公司 32226 代理人: 陳偉;朱杰
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法律狀態
申請(專利)號:

CN201310177348.3

授權公告號:

103299902B||||||

法律狀態公告日:

2015.01.07|||2013.10.23|||2013.09.18

法律狀態類型:

授權|||實質審查的生效|||公開

摘要

本發明涉及一種用于組織培養楝樹幼苗的方法。本發明技術方案是采集外殖體,外殖體消毒,初代培養,誘導產生愈傷組織,利用愈傷組織誘導不定芽,增殖培養,生根培養,最后出瓶移栽。本發明解決了過去存在的組織培養方法無針對楝樹的培養基,及成活率低,時間長,不具備實用性,無法保證樹種遺傳特性的基礎上進行快速繁殖,從而提供大量廉價的楝樹樹苗等缺陷。本發明供了一種快速的、產業化培育楝樹幼苗的新方法,用材少,不受氣候、季節、基質等自然條件的影響,可培育出脫毒苗,抗逆性強、質優、生長旺盛,并且可以減少直至杜絕病毒病的傳播。

權利要求書

權利要求書
1.   一種用于組織培養楝樹幼苗的方法,其特征在于步驟如下:
(1)采集外殖體:剪下枝梢半木質化部分;
(2)外殖體消毒:在無菌的狀態下,用消毒試劑進行消毒;所述消毒試劑成分為0.1%~0.2%高錳酸鉀m/v,10%~20%次氯酸鈉溶液v/v,1mL/100mL吐溫水,無菌水,1mL/50mL山農一號I型水,50mg/L鏈霉素、50mg/L頭孢霉素、50mg/L制霉菌素,二甲基亞砜;
(3)初代培養:將外殖體轉接到初代培養基中培養2?3個月;所述培養基為MS基本培養基添加蔗糖20~60g,椰子汁20~100ml,活性炭0.5~2g,細胞分裂素噻重氮苯基脲0.1~0.5mg,山農1號II型1~4mL,卡拉膠3~10g,水至1升,調節pH至5.8~6.2;
(4)誘導產生愈傷組織:將外殖體轉接到新的愈傷組織的培養基中;所述培養基為MS培養基中添加蔗糖20~100g,椰子汁20~100ml,6?(N?芐基)氨基嘌呤0.5~2mg,萘乙酸0.005~0.02mg,卡拉膠3~10g,水至1升,調整pH至5.8~6.2;
(5)利用愈傷組織誘導不定芽:將愈傷組織放入培養基中誘導不定芽;所述培養基是在正常的MS培養基中加入蔗糖20~100g,椰子汁20~100ml,6?(N?芐基)氨基嘌呤0.2~1mg,萘乙酸0.05~0.2mg,卡拉膠3~10g,水至1升,調節pH到5.8~6.2;
(6)增殖培養:轉接一次到增殖培養基中;所述增殖培養基為MS培養基中加入蔗糖20~100g,椰子汁50~200ml,6?(N?芐基)氨基嘌呤0.2~1mg,萘乙酸0.05~0.2mg,卡拉膠3~10g,水至1升,調節pH至5.8~6.2;
(7)生根培養:將枝干切成小段,接種到生根培養基中;所述生根培養基為MS培養基中加入蔗糖40~80g,椰子汁20~100ml,吲哚丁酸0.5~2mg,卡拉膠5~10g,水至1升,調整pH至5.8~6.2;置于20~28℃、1000~3000lux光照條件下培養;
(8)出瓶移栽:移栽組培苗可用椰糠和土的混合物作為基質,其比例在0~2∶1之間,在植株的根長至3~5cm長時,即可出瓶移栽,移栽前用1‰的多菌靈浸泡,栽入育苗杯中,澆透水后用地膜覆蓋,培養。

2.   根據權利要求1所述的一種用于組織培養楝樹幼苗的方法,其特征在于步驟(3)所述的培養基優選為MS基本培養基中添加蔗糖40g,椰子汁50ml,活性炭1g,細胞分裂素噻重氮苯基脲0.2mg,山農1號II型2mL,卡拉膠7g,水至1升。

3.   根據權利要求1所述的一種用于組織培養楝樹幼苗的方法,其特征在于步驟(4)所述的培養基優選為MS培養基中添加了蔗糖40~80g,椰子汁50ml,6?(N?芐基)氨基嘌呤1.0mg,萘乙酸0.01mg,卡拉膠7g,水至1升。

4.   根據權利要求1所述的一種用于組織培養楝樹幼苗的方法,其特征在于步驟(5)所述的培養基優選為MS培養基中加入了蔗糖40~80g,椰子汁50ml,6?(N?芐基)氨基嘌呤0.5mg,萘乙酸0.1mg,卡拉膠7g,水至1升。

5.   根據權利要求1所述的一種用于組織培養楝樹幼苗的方法,其特征在于步驟(6)所述的培養基優選為MS培養基中加入蔗糖40~80g,椰子汁100ml,6?(N?芐基)氨基嘌呤0.5mg,萘乙酸0.1mg,卡拉膠7g,水至1升。

6.   根據權利要求1所述的一種用于組織培養楝樹幼苗的方法,其特征在于步驟(7)所述的培養基優選為MS培養基中加入了蔗糖40~80g,椰子汁50ml,吲哚丁酸1.0mg,卡拉膠7.5g,水至1升,置于25±2℃、2000±500lux光照條件下。

7.   根據權利要求1所述的一種用于組織培養楝樹幼苗的方法,其特征在于步驟(8)中的基質為椰糠∶土=1∶1的土壤。

說明書

說明書一種用于組織培養楝樹幼苗的方法 
技術領域
本發明涉及一種用于楝樹組織培養的方法,特別涉及一種用于組織培養楝樹幼苗的方法。 
背景技術
楝樹的用途很多,印楝素是從印度楝中提取出來的一種化學物質,是生產生物農藥的有效成分。楝樹的果實中富含不飽和脂肪酸,占干果總重量的20%,其榨出來的油脂可以作為生物柴油使用,亦可作為生產化工用品的原料。果實榨過油之后的渣滓可以用來作為化肥使用。楝樹的葉子可以泡茶飲用,在東南亞國家以及日本,都有飲用楝樹葉茶的習慣。楝樹的木質結實,可以作為家具的材料,具有極高的經濟價值。除此之外,楝樹具有極高的環境價值,可以凈化空氣,吸收有害氣體。楝樹可以釋放揮發性化學成分,驅趕蚊蟲和殺死細菌,是城市綠化的重要樹種。 
楝樹的育苗方法主要有播種、插根、插芽等,楝樹的種植通常以播種育苗為主。播種育苗有以下缺點: 
種子繁殖變異性大,不能有效地保持母本優良性狀,受季節限制,一年只能育苗一次,播種前的種子處理復雜,種子的前期處理復雜,中間的影響環節多,每個環節對種子的發芽率都產生或多或少的影響,發芽所需的時間長,間苗難,成活率低,田間工作量大,育苗空間需要大,種子發芽后直接在外界生長,易被細菌、霉菌感染,增加染病機率,引發病蟲害,降低幼苗的成活率。因此播種育苗不具有產業化的優勢。 
組織培養育苗的優點: 
變異可能小,有利于保持母本的優良性狀,用材少,不受氣候、季節、基質等自然條件的影響;解決常規育苗困難的問題,繁殖周期短,繁殖系數大,可大批量生產;培育脫毒苗,使植物減少微生物侵害。因此大規模種植楝樹的最佳方式是進行組織培養。 
在本發明之前,楝樹育苗的方式主要是育種育苗。育種育苗方法受季節、氣候與場地的限制,產量低、無法產業化生產。目前所有的組織培養方法還沒有針對楝樹的培養基,因此無法培養出楝樹本植物幼苗;已有的能夠實現的培養木本 植物,例如茶樹的組織培養,以及樹莓苗木組織培養,紅豆杉種苗培養方法等。但由于成活率的原因,這些組織培養的方法都不能用于楝樹的組織培養。例如:試驗表明,用于茶樹組織培養方法在誘導在初代培養楝樹外植體的時候會產生大量的死苗,其死亡比例高達87%;而紅豆杉種苗雖然在初代培養上效果略微好于茶樹組織培養方法,但其在誘導愈傷組織過程中成功率低,時間長,不具備實用性。 
因此,如何解決在保證樹種遺傳特性的基礎上進行快速繁殖,從而提供大量廉價的楝樹樹苗,成為楝樹產業的首要而迫切的問題。 
發明內容
本發明的目的就是克服上述缺陷,提供一種用于組織培養楝樹幼苗的方法。 
本發明的技術方案是: 
一種用于組織培養楝樹幼苗的方法,其特征在于步驟如下: 
(1)采集外殖體:剪下枝梢半木質化部分; 
(2)外殖體消毒:在無菌的狀態下,用消毒試劑進行消毒;所述消毒試劑成分為0.1%~0.2%高錳酸鉀m/v,10%~20%次氯酸鈉溶液v/v,1mL/100mL吐溫水,無菌水,1mL/50mL山農一號I型水,50mg/L鏈霉素、50mg/L頭孢霉素、50mg/L制霉菌素,二甲基亞砜; 
(3)初代培養:將外殖體轉接到初代培養基中培養2?3個月;所述培養基為MS基本培養基添加蔗糖20~60g,椰子汁20~100ml,活性炭0.5~2g,細胞分裂素噻重氮苯基脲0.1~0.5mg,山農1號II型1~4mL,卡拉膠3~10g,水至1升,調節pH至5.8~6.2; 
(4)誘導產生愈傷組織:將外殖體轉接到新的愈傷組織的培養基中;所述培養基為MS培養基中添加蔗糖20~100g,椰子汁20~100ml,6?(N?芐基)氨基嘌呤0.5~2mg,萘乙酸0.005~0.02mg,卡拉膠3~10g,水至1升,調整pH至5.8~6.2; 
(5)利用愈傷組織誘導不定芽:將愈傷組織放入培養基中誘導不定芽;所述培養基是在正常的MS培養基中加入蔗糖(20~100)g,椰子汁20~100ml,6?(N?芐基)氨基嘌呤0.2~1mg,萘乙酸0.05~0.2mg,卡拉膠3~10g,水至1升,調節pH到5.8~6.2; 
(6)增殖培養:轉接一次到增殖培養基中;所述增殖培養基為MS培養基中加入蔗糖20~100g,椰子汁50~200ml,6?(N?芐基)氨基嘌呤0.2~1mg,萘乙酸0.05~0.2mg,卡拉膠3~10g,水至1升,調節pH至5.8~6.2; 
(7)生根培養:將枝干切成小段,接種到生根培養基中;所述生根培養基為MS培養基中加入蔗糖40~80g,椰子汁20~100ml,吲哚丁酸0.5~2mg,卡拉膠5~10g,水至1升,調整pH至5.8~6.2;置于20~28℃、1000~3000lux光照條件下培養; 
(8)出瓶移栽:移栽組培苗可用椰糠和土的混合物作為基質,其比例在0~2∶1之間,在植株的根長至3~5cm長時,即可出瓶移栽,移栽前用1‰的多菌靈浸泡,栽入育苗杯中,澆透水后用地膜覆蓋,培養。 
本發明的優點和效果在于提供了一種快速的、產業化培育楝樹幼苗的新方法。本發明組培育苗是在室內使用培養基進行培養的。因此用材少,不受氣候、季節、基質等自然條件的影響。組培室可人工控制溫度、濕度、光照時間、光照強度等條件,可讓植物一年四季均處于最佳的生長環境下,同時培養基提供了充足的營養,使得植物可不受外界各種條件的影響,一直處理旺盛生長的狀態,生長快速。本發明可培育出脫毒苗。脫毒苗抗逆性強、質優、生長旺盛,并且可以減少直至杜絕病毒病的傳播。 
使用本發明培養出的楝樹幼苗可保持、延續母本的優良性狀。本發明的繁殖周期短,組培苗25天就可轉接繼代。繁殖系數大,半年內可由一株苗木繁殖一百萬株新個體。從而實現工廠化育苗,可在兩三年內迅速推廣。 
本發明的其他具體優點和效果將在下面繼續說明。 
附圖說明
 圖1——本發明流程示意圖。
具體實施方式
本發明的技術思路是: 
利用楝樹的無性繁殖的特性,通過特別配方的培養基,提高楝樹組織培養成功率,并且完全保持母本的遺傳特性,保證提供的樹種的均一、高質量、低成本。 
為了實現本發明的目的,本發明通過外殖體采集、外殖體消毒、初代培養、誘導產生愈傷組織、利用愈傷組織誘導不定芽、增殖培養、生根培養、出瓶移栽等八個步驟來實施。 
下面結合一些具體實施方式對本發明進行進一步的闡述。但不僅限于將次具體實施方式作為上述發明的范圍。 
1.外殖體采集 
選擇晴朗的天氣,在上午葉面無露水時進行采集。挑選健壯、無病蟲害的植株,用較鋒利的剪刀剪下枝梢半木質化部分,切除頂梢幼嫩段,只保留半木質化段。 
在腋芽上下2~4cm處切下腋芽,并只保留3cm左右的葉柄,切口要求平滑不裂,以利于隨后的消毒處理。 
2.外殖體消毒 
將外植體放入5%洗潔精溶液清洗5min,期間不斷的搖動或翻動;倒去洗潔精溶液,用自來水沖洗干凈。重復清洗3遍之后,放置在已開啟的超凈工作臺一旁,瀝干水備用。 
加熱100mL無菌水,稱量0.1g高錳酸鉀,在超凈工作臺上將高錳酸鉀粉末溶于熱無菌水,制成0.1%高錳酸鉀溶液(m/v)。將外植體放入高錳酸鉀溶液,振蕩、浸泡30min。然后用無菌水沖洗2~3遍。 
在超凈工作臺上,倒5mL以上的次氯酸鈉原溶液到其中一個空瓶中,用注射器吸取,然后用過濾針頭過濾進另一個空瓶中。吸取過濾后的次氯酸鈉5mL,加入吐溫+水混合液中,制成10%次氯酸鈉溶液(v/v)。外植體在次氯酸鈉溶液中振蕩、浸泡1h。再用無菌水沖洗2~3次。 
分別稱取頭孢霉素、鏈霉素、制霉菌素各100mg,再分別溶解于1mL無菌水,1mL無菌水和1mL二甲基亞砜。分別用注射器吸取以上三種抗生素,再分別過濾進另一個無菌離心管中。分別吸取1mL山農一號I型、25μL頭孢霉素、25μL鏈霉素、25μL制霉菌素,加入50mL無菌水中,制成抗生素溶液。外植體在抗生素溶液中振蕩、浸泡4h。 
取出外植體,切去每個端頭約1cm的小段,直接接種到初代培養基中。在消毒操作中要注意,鑷子等工具與玻璃器皿間、瓶口與瓶口間不要相互觸碰;手要握瓶子的中下部,不要碰到瓶口。 
3.初代培養: 
每隔14天,將外植體轉接到新的初代培養基中,連續轉接2~3個月,直至材料形成較明顯的芽點后,再轉接至增殖培養基中。初代轉接時,需小心切去下部褐化組織,以免褐化組織對材料生長產生不良影響。初代培養基優選為MS基 本培養基4.55±0.25g,蔗糖40g,椰子汁50ml,活性炭1g,細胞分裂素噻重氮苯基脲(thidiazuron,TDZ)0.2mg,山農1號II型2mL,卡拉膠7g,水至1升;pH=5.8~6.2。滅菌條件為:121℃,20±5min。 
置于25±2℃和2000±500lux光照條件下(日光燈或LED紅光燈作為照明光源)培養。每天提供16~24h光照。 
4.誘導產生愈傷組織 
每隔14天,將外植體轉接到新的愈傷組織培養基中,連續轉接2~3個月,直至材料形成較明顯的愈傷組織后,再轉接至愈傷組織誘導不定芽培養基中。愈傷組織每2周內繼代一次。 
繼代轉接時,需小心切去下部褐化組織,以免褐化組織對材料生長產生不良影響。愈傷組織培養基優選為MS基本培養基4.55±0.25g,蔗糖40~80g,椰子汁50ml,6?(N?芐基)氨基嘌呤1.0mg,萘乙酸0.01mg,卡拉膠7g,水至1升;pH=5.8~6.2愈傷組織培養基滅菌方法,滅菌條件為:121℃,(20±5)min。愈傷組織培養的溫度為25±2℃,黑暗處培養至生長出愈傷組織。 
5.利用愈傷組織誘導不定芽 
將誘導的愈傷組織置于滅了菌的濾紙等水分吸干后,用解剖刀將其切成適當的大小,大概0.2?0.5cm3,然后置于到分化培養基上,培養3~14天。直至材料形成較明顯的不定芽后,再轉接至增殖培養基中。愈傷組織誘導不定茅培養基優選為MS基本培養基4.55±0.25g、蔗糖40~80g、椰子汁50ml、6?(N?芐基)氨基嘌呤0.5mg、萘乙酸0.1mg、卡拉膠7g、水至1升、pH=5.8~6.2。愈傷組織誘導不定茅培養基滅菌方法為:在121℃下滅菌20±5分鐘。愈傷組織誘導不定芽培養條件是將愈傷組織置于25±2℃和2000±500lux光照條件下(日光燈或LED紅光燈作為照明光源)培養。每天提供16~24h光照。 
6.增殖培養 
20~25天轉接一次。轉接時,若外植體形成小而密的芽點,則切去底部衰老的組織,并將上部組織分切成2~3小塊,然后接種到增殖培養基中。經過5~6代的轉接,即可長出粗壯的單一植株。增殖培養基優選為MS基本培養基6.55±0.25g、蔗糖40~80g、椰子汁100ml、6?(N?芐基)氨基嘌呤0.5mg、萘乙酸0.1mg、卡拉膠7g、水至1升、pH=5.8~6.2。增殖培養條件是將組織置于25±2℃的溫度下和2000±500lux光照條件下(日光燈或LED紅光燈作為照明光源)進行培養。每天提供16~24h光照。 
7.生根培養 
挑選較粗壯的植株,切去葉柄,將枝干切成4~5cm的小段,接種到生根培養基中。生根壯苗培養基優選為MS基本培養基6.55±0.25g、蔗糖40~80g+椰子汁50ml、吲哚丁酸1.0mg、卡拉膠7.5g、水至1升、pH=5.8~6.2。培養基滅菌條件為:121℃,20±5min。生根培養條件置于25±2℃和2000±500lux光照條件下(日光燈或LED紅光燈作為照明光源)培養。每天提供16~24h光照。 
8.出瓶移栽 
移栽組培苗可用椰糠∶土=1∶1的土壤作為基質。在植株的根長至3~5cm長時,即可出瓶移栽。移栽前用竹筷或鑷子將瓶苗輕輕取出,洗凈培養基后用1‰的多菌靈浸泡5min,栽入育苗杯中,澆透水后用地膜覆蓋、培養。 
實施例1:椰子汁含量對初代培養的影響 
本實驗是在其他培養條件一致的情況下,只改變培養基中的椰子汁的含量,研究椰子汁含量變化對初代培養芽苗的影響。試驗結果見下述表1: 
表1:椰子汁含量對初代培養的影響 
椰子汁的含量 成功率 0.05水平差異顯著性的檢驗 0 20% a 20ml 50% b 50ml 85% c 100ml 87% c
注:0.05水平差異顯著性檢驗中的不同字母表示差異顯著,而相同字母代表兩者差異不顯著。 
從表1中可以看出,不使用椰子汁和使用椰子汁的效果有顯著差異。在培養基中增加20ml的椰子汁可以是成功率增加30%。50ml和100ml的椰子汁沒有顯著差異。為了節約成本,可以在培養基中使用50ml的椰子汁。 
實施例2:6?(N?芐基)氨基嘌呤對利用愈傷組織誘導不定芽的影響 
本實驗是在其他培養條件一致的情況下,只改變培養基中的6?(N?芐基)氨基嘌呤含量,研究其含量變化對利用愈傷組織誘導不定芽的影響。試驗結果見下述表2: 
表2:6?(N?芐基)氨基嘌呤對利用愈傷組織誘導不定芽的影響 
6?(N?芐基)氨基嘌呤含量 成功率 0.05水平差異顯著性的檢驗 0.1mg 10% a
[0062] 0.25mg 50% b 0.5mg 88% c 0.75mg 80% d
從表2中可以看出,當培養基中加入0.5mg的6?(N?芐基)氨基嘌呤誘導不定芽的成功率最高。因此利用愈傷組織誘導不定芽的培養基優選0.5mg6?(N?芐基)氨基嘌呤。 
實施例3:萘乙酸對增值培養的作用 
本實驗是在其他培養條件一致的情況下,只改變培養基中的萘乙酸含量,研究其含量變化對增值培養的影響。試驗結果見下述表3:萘乙酸對增殖培養的作用 
萘乙酸含量 成功率 0.05水平差異顯著性的檢驗 0.05mg 30% a 0.075mg 65% b 0.1mg 84% c 0.2mg 74% d
從表3中可以看出,當培養基中加入0.1mg的1?naphthylacetic產生的增值培養成功率為最高。 
實施例4:光度對生根培養的影響。 
本實驗是在其他培養條件一致的情況下,只改變培養基中的光度,研究其變化對生根培養的影響。試驗結果見下述表4: 
表4:光度對生根培養的影響 
光度(Lux) 生根率 0.05水平差異顯著性的檢驗 1000 17% a 2000 83% b 2500 85% b 3000 76% c
從表4可以看出,當光度為2000lux和2500lux,其生根率均達到最高,兩者沒有顯著差異。因此生根培養優選2000?2500lux的光照條件。 
實施例5:椰糠含量對移栽的組培苗根生長影響 
本實驗是在其他培養條件一致的情況下,只改變基質中椰糠含量的,研究其變化對組培苗生根的影響。試驗結果見下述表5: 
表5:椰糠含量對移栽的組培苗根生長影響 

由表5可以看出,基質中摻椰糠會顯著提高根的生長速度。在比例為1∶1以上可以在兩周苗即產生3cm以上的根。由于考慮到成本因素,基質最佳比例為1∶1。 
以上僅為本發明專利的具體實施方式,本發明專利中的方法和配方在各種大量實驗中均獲得一致的效果,在不同時間和地點的重復性試驗也獲得了相同的結果,因此本發明的保護范圍不僅僅局限于此,任何不經過創造性的更改和替換都應該涵蓋在本發明保護范圍內。因此,本發明的保護范圍應以權利要求書所限定的范圍為準。 

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一種 用于 組織培養 幼苗 方法
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