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禽源大腸桿菌疫苗株(NN株)及其應用.pdf

摘要
申請專利號:

CN201310468079.6

申請日:

2013.10.10

公開號:

CN103484411B

公開日:

2014.12.24

當前法律狀態:

授權

有效性:

有權

法律詳情: 授權|||實質審查的生效IPC(主分類):C12N 1/20申請日:20131010|||公開
IPC分類號: C12N1/20; A61K39/108; A61P31/04; C12R1/19(2006.01)N 主分類號: C12N1/20
申請人: 南京天邦生物科技有限公司
發明人: 王偉; 許秀梅; 汪愛芬
地址: 211102 江蘇省南京市江寧經濟技術開發區清水亭東路999號
優先權:
專利代理機構: 代理人:
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法律狀態
申請(專利)號:

CN201310468079.6

授權公告號:

103484411B||||||

法律狀態公告日:

2014.12.24|||2014.02.05|||2014.01.01

法律狀態類型:

授權|||實質審查的生效|||公開

摘要

本發明屬于獸醫生物醫藥領域,涉及一株禽源大腸桿菌天然融合株(O1/O2)NN株及該融合株作為疫苗株在防制鴨大腸桿菌病中的應用和應用效果。本發明疫苗株的微生物保藏號是:7670。本發明公開的疫苗株安全性良好、效力穩定,對由血清型O1和O2引起的鴨大腸桿菌病均具有良好的保護效力。該疫苗株可用于制備防治鴨大腸桿菌病的滅活單苗或聯苗。

權利要求書

權利要求書
1.  一種禽源大腸桿菌(O1/O2)疫苗株NN株,微生物保藏號CGMCC No是7670。

2.  一種疫苗組合物,其特征在于包含滅活的如權利要求1所述的禽源大腸桿菌(O1/O2)疫苗株NN株和藥學上可接受的佐劑。

3.  權利要求1所述的疫苗株E.coli NN在制備防制由血清型O1和O2引起的鴨大腸桿菌病藥物中應用。

說明書

說明書禽源大腸桿菌疫苗株(NN株)及其應用
技術領域
本發明屬于獸醫生物新醫藥技術領域,涉及一株禽源大腸桿菌疫苗株NN株及其應用。 
背景技術
鴨大腸桿菌病是一種急性敗血性傳染病,主要侵害2-6周齡的雛鴨。不管是原發性或繼發性,其主要特征為發生心包炎、肝周炎、氣囊炎、輸卵管炎的病變。眼炎型的多見于1心周齡的雛鴨;關節炎型的多于7-10日齡的雛鴨;腦炎型的多見于1周齡雛鴨;漿膜型的多見于2~6周齡雛鴨。隨著養鴨業的日益發展和集約化程度的提高及鴨大腸桿菌病的發生日趨嚴重,鴨大腸桿菌病給養鴨業造成了嚴重的經濟損失,尤其是近年來,在我國種鴨的細菌病中大腸桿菌病顯著增多。據調查顯示,鴨大腸桿菌病在我國不同類型的養鴨場中普遍存在,流行廣泛。 
關于雞源致病性大腸桿菌的血清型報道較多,而鴨源致病性大腸桿菌血清型的報道較少,由于大腸桿菌的血清型較為復雜,給防治工作帶來一定的困難。據有關報道,對鴨有致病性的以O1、O2、O35、O36、O73、O78為主,而且不同地區血清學差別很大。因此,在大腸桿菌的防控上,大家都致力于制備融合株,制備多價疫苗,以此期望用一種疫苗同時對多個血清型的大腸桿菌病能產生保護。關于天然融合株,由劉吉山等首次分離報道,當時就提出這為疫苗制備時涵蓋更多細菌血清型提供了方便條件。 
發明內容
本發明所要解決的技術問題是針對禽源大腸桿菌血清型眾多,不同地區甚至不同養殖場的流行菌株都不盡相同,為了滿足一種疫苗多種保護的需求,從臨床發病鴨群中分離篩選出一株天然融合株,該菌株制備疫苗對大腸桿菌血清型O1和O2引起的大腸桿菌病均能產生良好的保護。 
本發明所要解決的技術問題是通過如下途徑實現的: 
本發明提供一種禽源大腸桿菌疫苗株NN株,微生物保藏號是: CGMCC No. 7670,分類命名:大腸埃希氏菌(Escherichia coli);保藏時間2013-5-31;保藏單位:中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心;保藏地點:北京市朝陽區北辰西路1號院3號,中國科學院微生物研究所。
本發明提供的E.coli NN疫苗株的來源于: 
2009年10月分離于安徽省某大型鴨場,具有典型肝周炎、心包炎、輸卵管炎、氣囊炎及卵黃性腹膜炎等病變,通過革蘭氏染色、菌落形態觀察、培養特性試驗和生化試驗鑒定,確定為大腸桿菌。應用大腸埃希菌O抗原定型血清鑒定為O1/O2。
E.coli NN株具有如下特性: 
(1)培養特性  麥康凱培養基上的圓形、濕潤、光滑的紅色單個菌落;伊紅美藍培養基上生成暗紫紅色或紫黑色具有金屬光澤的菌落;革蘭氏陰性小桿菌。
(2)生化特性  可發酵碳水化合物,如葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、甘露糖、阿拉伯糖等;枸櫞酸鹽利用、V-P試驗均為陰性;M-R試驗、硝酸鹽還原、靛基質氧化酶為陽性 
(3)血清型  通過玻片凝集試驗分離株與單因子血清O1和O2都發生凝集,鑒定此株細菌為天然融合株O1/O2株。
(4)毒力  攻毒劑量為1×109CFU/只時,可致10只21日齡雛鴨全部死亡。 
本發明提供的禽源大腸桿菌NN株有益效果如下: 
分離自自然發病鴨,具有流行血清型,與單因子血清O1和O2都發生凝集,一株天然融合株,以NN株為疫苗株制成的滅活疫苗對兩種血清型菌株引起的大腸桿菌病均有不同程度的保護。
具體實施方式
下面結合具體實施例來進一步描述本發明,但這些實施例僅是范例性的,并不對本發明提供的毒株應用領域和形式構成任何限制。 
實施例1 禽源大腸桿菌NN株分離鑒定
一、細菌的分離培養
1、 病料分離 采用無菌操作,取病鴨的心臟、肝臟,用滅菌的接種環將病料接種于營養瓊脂平板上,37℃,培養18~24h,觀察結果。
2、 純化培養  E.coli分離株接種TSA培養基上,37℃培養箱中培養24 h后長出圓形、光滑、隆起、濕潤半透明的近無色的菌落;麥康凱培養基上的圓形、濕潤、光滑的紅色單個菌落;接種于伊紅美藍培養基上,37℃,培養 18~24h生成暗紫紅色或紫黑色具有金屬光澤的菌落;革蘭氏染色觀察;將革蘭氏染色形態為:兩端鈍圓、散在或成對、無芽孢的紅色小桿菌。 
二、細菌鑒定
1、生化鑒定
E.coli分離株可發酵碳水化合物,如葡萄糖、乳糖、果糖、甘露糖、阿拉伯糖等;枸櫞酸鹽利用為陰性;尿素利用、H2S、VP等均為陰性。M.R.試驗、吲哚試驗為陽性。
2、血清型鑒定 
2.1、 玻片凝集抗原的制備
用滅菌PBS洗下E.coli分離株的純培養物,置小圓底試管中,制成濃稠菌懸液,然后與普通肉湯小瓶培養物一起于121℃高壓2小時,破壞其“K”抗原,制成高壓抗原。
2.2、 玻片凝集試驗方法 
將5ul已制備好的 E.coli分離株玻片凝集抗原和5ul陽性血清分別在玻片上混勻,同時以E.coli標準株玻片凝集抗原設為抗原陽性反應對照,以鴨疫里默氏桿菌、多殺性巴氏桿菌和生理鹽水設為抗原陰性反應對照,結果判定:抗原與血清混合后3 min內與單因子血清O1和O2均出現顆粒狀凝集。 
3、毒力測定 
3.1、NN株動物回歸試驗
NN株的純培養物接種14日齡雛鴨后,結果顯示,攻毒劑量為1×108CFU/只時,死亡率達到80%。試驗鴨病程變化:攻毒后18h開始發病,發病鴨精神沉郁、縮頸、扎堆、不能站立、停止采食和飲水、眼鼻有分泌物、眼眶周圍濕潤、灰綠色水樣腹瀉等癥狀。病程2~4d,死前抽搐,有的鴨子會有神經癥狀:狂奔。剖檢病死鴨,24h內死亡鴨大多心包、肝臟、氣囊表面的纖維素性滲出不明顯,但敗血癥嚴重;72h后死亡鴨心包、肝臟表面、氣囊有大量灰白色纖維素性滲出物,部分鴨心包膜與胸內壁粘連,果凍樣滲出物,脾腫大。
3.2、NN株的半數致死量測定 
將NN株的18~24 h純培養物(8.0×109~1.0×1010 CFU/mL)用無菌生理鹽水作10-1、10-2、10-3、10-4倍稀釋后,分別取0.5 mL腿肌接種14日齡櫻桃谷鴨。其中試驗組雛鴨分4組,每組5只,另5只作為對照,對照鴨以同樣方式注射等量滅菌生理鹽水。接種后連續觀察l周。根據各組死亡情況計算出NN株的半數致死量(LD50)。
根據試驗結果,得到NN株對雛鴨的半數致死量為1.7×107CFU/羽。攻毒結果見表1。 
                             表1 半數致死量的測定結果 

3.3、NN株對不同日齡試驗鴨的毒力測定
將NN株的18~24 h純培養物(8.0×109~1.0×1010 CFU/mL)用無菌生理鹽水作10倍稀釋后,活菌計數,根據需要調整菌液濃度。將試驗鴨分為4批進行攻毒,即分別對21、35、49和60日齡的健康鴨進行頸部皮下注射攻毒;每批按不同攻毒劑量分為3組,每組10只,空白對照組10只,以同樣方式注射等量滅菌生理鹽水。接種后連續觀察l0天。根據各組死亡情況計算出NN株的攻毒菌量。
根據攻毒結果統計,不同日齡最佳攻毒劑量,即能使試驗鴨只100%發病的攻毒劑量分別為:21日齡1×109CFU/只,35日齡1×1010CFU/羽,49日齡5×1010CFU/羽。而60日齡的鴨只對5×1010CFU/羽 的攻毒劑量表現為不發病無感染,對于1×1011CFU/只的發病率僅為50%,表明60日齡的鴨只對于鴨大腸桿菌的感染性明顯降低。結果見表2。 
表2 NN株對不同日齡試驗鴨的毒力測定 

注:*發病數/攻毒數
3.2 NN對不同品種鴨的毒力試驗
E.coli SH株稀釋成約1.0×l09CFU/0.2ml,頸部皮下注射21日齡健康易感半番鴨、麻鴨、櫻桃谷鴨、番鴨,每種鴨注射10羽,每羽0.2ml,觀察10日。結果見表3。
由表3結果可見,NN株使用同一劑量攻毒時,不同品種鴨發病率無差異,發病率率均為10/10,說明不同品種鴨對NN株攻擊敏感程度無顯著差異。 
表3  E.coli SH對不同品種鴨的毒力試驗 

 4、免疫原性試驗
將NN株培養、濃縮、滅活、加入油佐劑制成單價滅活苗,確保疫苗各菌株的最終含菌量為5×l09CFU/ml以上作為疫苗。將制備的疫苗分別免疫3日齡健康易感雛鴨,每種疫苗免疫10羽,每羽0.3ml,同樣條件飼養。免疫后14日,連同對照鴨10羽進行攻毒試驗,疫苗免疫組及其對照組,每羽分別頸部皮下注射NN株活菌1×l09CFU/羽,觀察10日。攻毒結果見表4。
表5 效力試驗檢驗結果 

實施例2 禽源大腸桿菌NN株滅活疫苗制備
1、抗原制備
1.1、生產用種子制備
1.1.1、 一級菌種繁殖及鑒定  將凍干菌種接種于改良馬丁肉湯培養基中,置36~37℃培養24小時,然后劃線接種于含胰蛋白胨大豆瓊脂(TSA)平板,置37℃培養24小時,挑選典型菌落,再移植于改良馬丁肉湯,置36~37℃培養24小時。
1.1.2、二級種子繁殖  將一級種子接種于適量改良馬丁肉湯中,置36~37℃振蕩培養24小時。 
1.2、制苗用菌液制備 
1.2.1、菌液培養  用發酵罐通氣培養,按培養器容積裝入適量培養基(70%左右)及消泡劑,滅菌后按培養基量接種10%二級種子液,36.5℃通氣培養24小時。培養結束后的發酵液劃線接種于TSA培養基作純粹檢驗。
1.2.2、 抗原細菌的濃縮和計數  純檢合格的菌液分別經超濾濃縮儀濃縮后,用pH7.2的PBS制成懸浮液,采用活菌計數法,在普通TSA平板上進行計數,將培養后的發酵液用改良馬丁肉湯作為稀釋液,10倍梯度稀釋,取10-6、10-7、10-8三個稀釋度各0.1ml滴在5%兔血TSA平板平板上,并將其均勻分布于平板上,于37℃培養箱中培養18~22h,計數菌落,計算發酵液的活菌數量,菌體生長以活菌數表示,濃縮菌液含菌量均應≧2.0×1010CFU/ml。 
1.2.3、 滅活  
將濃縮菌液置無菌滅活罐內,計量加入10%甲醛溶液,隨加隨攪拌,使其充分混合,甲醛溶液最終濃度為0.5%。加完甲醛溶液后用無菌壓縮空氣將其壓入另一無菌滅活罐內,置37℃滅活24h(以罐內溫度達到37℃開始計時)。滅活結束后,取滅活菌液接種于TSA平板,37℃培養24小時,應無菌生長。
2、 滅活疫苗制備 
2.1、水相制備  將滅活檢驗合格的NN株抗原96份與Tween-80 4份,在水相罐中混勻備用。
2.2、油相的制備  取注射用白油96份、司本—80 4份,加入油相罐中,加熱攪拌混勻,經121℃滅菌30分鐘,冷卻至室溫備用。 
2.3、乳化及分裝  將3份油相放入乳化罐內,啟動乳化罐攪拌機攪拌,同時徐徐加入水相一份,加完后繼續攪拌10~15min,打開均質機進出口開關,啟動均質機,使乳化液經均質機進入另一罐,如此反復乳化數次(一般6~8次),乳化后取10ml,以3000r/min離心15min,若有分層現象,應重復攪拌一次。將乳化好的疫苗定量分裝,加蓋密封。 
3、  疫苗的檢驗  
3.1、物理性狀
外觀  乳白色均勻乳劑。
劑型  油包水型,取一清潔吸管,吸取少量疫苗滴于冷水中,除第一滴呈云霧狀擴散外,以后各滴均擴散。 
穩定性  取疫苗10ml裝于離心管內,以3000r/min離心15分鐘,管底析出的水相為0.2ml。 
黏度 黏度儀測定油苗的黏度(上海方瑞儀器廠 DV-1),黏度為28cP。 
3.2無菌檢驗 無菌生長。 
3.3  安全檢驗  用3日齡健康易感雛鴨10羽,各頸部背側皮下注射疫苗0.6ml (2羽份),觀察14日, 
在觀察期內均健活,未見行為異常,精神狀態良好,眼睛和鼻腔等無異常分泌物,進食和排便無異常。自疫苗注射部位剖檢試驗鴨,發現注射局部疫苗吸收良好,無紅腫硬結出現。即疫苗注射后均未出現與疫苗相關的局部或全身不良反應。
3.4效力檢驗   
用3日齡健康易感雛鴨80羽,隨機分為4組。每組20羽,其中3組為免疫組,分別免疫3批實驗室制品,各頸部背側皮下注射疫苗0.3ml,另一組作為陰性對照,同條件飼養。免疫后14日,取免疫鴨10羽和對照鴨10羽,每羽注射WJ株(血清型O1)0.2ml(內含活菌5×l08CFU);另取免疫鴨10羽和對照鴨10羽,每羽腿部肌肉注射D48株(血清型O2)0.2ml(內含活菌5×l08CFU),觀察10日。效力試驗結果見表5。
    表5 效力試驗檢驗結果 

免疫效力試驗結果顯示,以NN株為疫苗株制成的滅活疫苗對WJ株(血清型O1)的保護率為70%,對D48株(血清型O2)的保護率為80%,對兩種血清型菌株引起的大腸桿菌病均有不同程度的保護。
  

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大腸桿菌 疫苗 NN 及其 應用
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