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聚合物、二膦酸鹽和抗血管生成劑的綴合物及其在治療和監測骨相關疾病中的用途.pdf

摘要
申請專利號:

CN200980129400.X

申請日:

2009.05.21

公開號:

CN102131509B

公開日:

2015.01.07

當前法律狀態:

授權

有效性:

有權

法律詳情: 授權|||實質審查的生效IPC(主分類):A61K 31/74申請日:20090521|||公開
IPC分類號: A61K31/74; A61K31/655; A61K47/48 主分類號: A61K31/74
申請人: 特拉維夫大學拉莫特有限公司
發明人: R·薩奇法伊納羅; K·米勒; D·薩巴特; R·埃雷茨
地址: 以色列特拉維夫
優先權: 2008.05.22 US 61/071,889; 2008.10.30 US 61/193,138
專利代理機構: 中國專利代理(香港)有限公司 72001 代理人: 孔青;郭文潔
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法律狀態
申請(專利)號:

CN200980129400.X

授權公告號:

102131509B||||||

法律狀態公告日:

2015.01.07|||2011.08.31|||2011.07.20

法律狀態類型:

授權|||實質審查的生效|||公開

摘要

本發明公開了具有連接在其上的抗血管生成劑和二膦酸鹽骨靶向劑的聚合物或共聚物的綴合物,及其制備方法。還公開了含這些綴合物的藥物組合物及其在治療骨相關病癥中的用途。

權利要求書

1: 包含具有連接在其上的抗血管生成劑和二膦酸鹽骨靶向部分的聚合物主鏈的綴合 物, 所述聚合物主鏈源自選自以下的聚合物 : 右旋糖苷、 水溶性聚氨基酸、 聚乙二醇 (PEG)、 聚谷氨酸 (PGA)、 聚乳酸 (PLA)、 聚乳酸 - 乙醇酸共聚物 (PLGA)、 聚 (D, L- 丙交酯 - 乙交酯 共聚物 )(PLA/PLGA)、 聚 ( 羥基烷基甲基丙烯酰胺 )、 聚丙三醇、 聚酰氨基胺 (PAMAM) 和聚乙 烯亞胺 (PEI)。
2: 權利要求 1 的綴合物, 其中所述抗血管生成劑選自紫杉醇、 2- 甲氧雌二醇、 普利司 他、 巴馬司他、 BAY 12-9566、 羧基酰氨基三唑、 CC-1088、 乙酸右美沙芬、 乙酸二甲基呫噸酮、 內皮抑素、 IM-862、 馬立馬司他、 基質金屬蛋白酶、 青霉胺、 PTK787/ZK 222584、 RPI.4610、 乳 酸角鯊胺、 SU5416、 沙利度胺、 TNP-470、 康普瑞汀、 他莫昔芬、 COL-3、 新伐司他、 BMS-275291、 SU6668、 抗 VEGF 抗體、 Medi-522(Vitaxin II)、 CAI、 白介素 -12、 IM862、 阿米洛利、 血管抑素 蛋白、 血管抑素 K1-3、 血管抑素 K1-5、 卡托普利、 DL-α- 二氟甲基鳥氨酸、 鹽酸 DL-α- 二 氟甲基鳥氨酸、 內皮抑素 TM 蛋白、 夫馬潔林、 除莠霉素 A、 4- 羥基苯基視黃酰胺、 胡桃醌、 層粘連蛋白、 層粘連蛋白六肽、 層粘連蛋白五肽、 薰草菌素 A、 甲羥孕酮、 乙酸甲羥孕 酮、 米諾環素、 鹽酸米諾環素、 胎盤核糖核酸酶抑制劑、 蘇拉明、 蘇拉明鈉鹽、 人血小板反應 蛋白、 中性粒細胞、 針對特異性的促血管生成因子和 / 或其受體的單克隆抗體 ( 例如阿瓦斯 丁、 艾比特思、 維克替比、 曲妥單抗 ) ; 多種促血管生成生長因子受體的小分子酪氨酸激酶 抑制劑 ( 例如它塞瓦、 多吉美、 索坦、 易瑞沙 ) ; mTOR 的抑制劑 ( 哺乳動物雷帕霉素靶標 )( 例 如馱瑞塞爾 ) ; 干擾素 α、 β和γ; IL-12 ; 基質金屬蛋白酶 (MMP) 抑制劑 ( 例如 COL3、 馬立 馬司他、 巴馬司他 ) ; EMD121974( 西侖吉肽 ) ; Vitaxin ; 角鯊胺 ; COX-2 抑制劑 ; PDGFR 抑制 劑 ( 例如格列衛 ) ; NM3 和 2-ME2。
3: 權利要求 1 的綴合物, 其中所述抗血管生成劑為紫杉醇。
4: 權利要求 1-3 中任一項的綴合物, 其中所述聚合物主鏈源自 N-(2- 羥基丙基 ) 甲基 丙烯酰胺 (HPMA)。
5: 包含具有連接在其上的抗血管生成劑和二膦酸鹽骨靶向部分的聚合物主鏈的綴合 物。
6: 權利要求 1-5 中任一項的綴合物, 其中所述抗血管生成劑和所述骨靶向部分中至少 一種經由接頭與所述聚合物主鏈連接。
7: 權利要求 6 的綴合物, 其中所述接頭為生物可降解接頭。
8: 權利要求 6 的綴合物, 其中所述抗血管生成劑和所述骨靶向部分中每一種經由接頭 與所述聚合物主鏈連接。
9: 權利要求 1-8 中任一項的綴合物, 其中所述二膦酸鹽部分選自阿倫膦酸鹽、 英卡膦 酸鹽、 氯膦酸鹽、 替魯膦酸鹽、 依替膦酸鹽、 伊班膦酸鹽、 奈立膦酸鹽、 奧帕膦酸鹽、 利塞膦酸 鹽、 吡利膦酸鹽、 帕米膦酸鹽和唑來膦酸鹽。
10: 權利要求 1-8 中任一項的綴合物, 其中所述二膦酸鹽為阿倫膦酸鹽。
11: 權利要求 7 的綴合物, 其中所述生物可降解接頭選自 pH- 敏感的接頭和酶可裂解的 接頭。
12: 權利要求 7 的綴合物, 其中所述生物可降解接頭為酶可裂解的接頭。
13: 權利要求 12 的綴合物, 其中所述酶可裂解的接頭由在腫瘤組織中表達的酶裂解。
14: 權利要求 12 的綴合物, 其中所述酶可裂解的接頭由在腫瘤組織中過表達的酶裂 2 解。
15: 權利要求 13 和 14 中任一項的綴合物, 其中所述酶選自組織蛋白酶 B、 組織蛋白酶 K、 組織蛋白酶 D、 組織蛋白酶 H、 組織蛋白酶 L、 legumain、 MMP-2 和 MMP-9。
16: 權利要求 7 的綴合物, 其中所述生物可降解接頭包含具有 2-10 個氨基酸殘基的寡 肽。
17: 權利要求 16 的綴合物, 其中所述寡肽選自 -[Ala-Leu-Ala]-、 -[Cit-Val]-、 -[GlyLeu-Gly]-、 -[Gly-Phe-Gly]-、 -[Gly-Leu-Phe-Gly]-、 -[Gly-Phe-Leu-Gly]-、 -[Ala-Leu-AlaLeu]-、 -[Phe-Lys]- 和 -[Gly-Phe-Leu-Gly-Phe-Lys]-。
18: 權 利 要 求 17 的 綴 合 物,其 中 所 述 抗 血 管 生 成 劑 經 由 包 含 所 述 -[Gly-Phe-Leu-Gly-Phe-Lys] 的接頭與所述聚合物主鏈連接。
19: 權 利 要 求 17 的 綴 合 物,其 中 所 述 骨 靶 向 部 分 經 由 包 含 所 述 -[Gly-Phe-Leu-Gly]- 的接頭與所述聚合物主鏈連接。
20: 權利要求 1-19 中任一項的綴合物, 所述綴合物進一步包含間隔基, 所述間隔基將 所述抗血管生成劑和 / 或所述二膦酸鹽與所述聚合物主鏈和 / 或與所述接頭連接。
21: 權利要求 20 的綴合物, 其中所述抗血管生成劑為紫杉醇, 所述間隔基將所述紫杉 醇與所述聚合物主鏈或與所述生物可降解接頭連接。
22: 權利要求 20 和 21 中任一項的綴合物, 其中所述間隔基可降解。
23: 權利要求 22 的綴合物, 其中所述間隔基為碳酸對氨基苯甲酯 (PABC)。
24: 權利要求 4 及 6-23 中任一項的綴合物, 所述綴合物具有通式 II : 式 II 其中 : x 為具有使 x/(x+y+w) 乘以 100 在 0.01-99.9 范圍內的值的整數 ; y 為具有使 y/(x+y+w) 乘以 100 在 0.01-99.9 范圍內的值的整數 ; w 為具有使 w/(x+y+w) 乘以 100 在 0.01-99.9 范圍內的值的整數 ; B 為所述抗血管生成劑 ; D 為所述二膦酸鹽骨靶向部分 ; 和 所述 L1 和 L2 各自獨立為所述接頭或不存在。
25: 權利要求 24 的綴合物, 所述綴合物具有以下結構 : 3
26: 權利要求 24 和 25 中任一項的綴合物, 其中 : x 為具有使 x/(x+y+w) 乘以 100 在 70-99.9 范圍內的值的整數 ; y 為具有使 y/(x+y+w) 乘以 100 在 0.01-15 范圍內的值的整數 ; 和 w 為具有使 w/(x+y+w) 乘以 100 在 0.01-15 范圍內的值的整數。
27: 權利要求 1-26 中任一項的綴合物, 所述綴合物進一步包含連接在其上的標記物 質。
28: 權利要求 27 的綴合物, 其中所述標記物質選自熒光劑、 放射性試劑、 磁化劑、 發色 團、 生物發光劑、 化學發光劑、 磷光劑和重金屬團簇。
29: 藥物組合物, 包含作為活性成分的權利要求 1-28 中任一項的綴合物和藥學可接受 載體。
30: 權利要求 29 的藥物組合物, 所述組合物包裝在包裝材料中, 并在包裝材料里或表 面用印刷物說明用于治療骨相關疾病或病癥的用途。
31: 權利要求 29 的藥物組合物, 其中所述綴合物包含標記物質, 所述組合物包裝在包 裝材料中, 并在包裝材料里或表面用印刷物說明用于監測骨相關疾病或病癥的用途。
32: 在需要治療的受試者中治療骨相關疾病或病癥的方法, 所述方法包括給予所述受 試者治療有效量的權利要求 1-28 中任一項的綴合物。
33: 在受試者中監測骨相關疾病或病癥的方法, 所述方法包括 : 給予所述受試者權利要求 27 和 28 中任一項的綴合物 ; 和 采用用于監測所述綴合物在身體或其部分內分布的成像技術。
34: 權利要求 1-26 中任一項的綴合物作為藥物的用途。
35: 權利要求 1-26 中任一項的綴合物在制備用于治療骨 - 相關疾病或病癥的藥物中的 用途。
36: 權利要求 27 和 28 中任一項的綴合物作為診斷劑的用途。
37: 權利要求 27 和 28 中任一項的綴合物在制備用于監測骨相關疾病或病癥的診斷劑 中的用途。 4
38: 確認用于治療骨相關疾病或病癥的權利要求 1-28 中任一項的綴合物。
39: 確認用于監測骨相關疾病或病癥的權利要求 27 和 28 中任一項的綴合物。
40: 權利要求 30、 31、 32、 33、 35 和 37-39 中任一項的組合物、 方法、 用途或綴合物, 其中 所述疾病或病癥與血管生成有關。
41: 權利要求 40 的組合物、 方法、 用途或綴合物, 其中所述疾病或病癥選自骨轉移和骨 癌。
42: 制備權利要求 1-28 中任一項的綴合物的方法, 所述方法包括 : (a) 使多個所述聚合物主鏈單體單元共聚合, 其中所述多個聚合物主鏈單體單元的一 部分包含以第一反應性基團為終端的單體單元, 所述多個聚合物主鏈單體單元的另一部分 包含以第二反應性基團為終端的單體單元, 因此獲得包含包含多個主鏈單元的聚合物主鏈 的共聚物, 其中所述主鏈單元的一部分具有所述第一反應性基團, 所述主鏈單元的另一部 分具有所述第二反應性基團, 所述第一反應性基團能夠與所述抗血管生成劑起反應, 所述 第二反應性基團能夠與所述二膦酸鹽起反應 ; (b) 讓所述共聚物與所述抗血管生成劑或與其衍生物經由所述第一反應性基團反應, 因此獲得具有連接在其上的所述抗血管生成劑的所述共聚物 ; 和 (c) 讓所述共聚物與所述二膦酸鹽或其衍生物經由所述第二反應性基團反應, 因此獲 得具有連接在其上的所述二膦酸鹽的所述共聚物 ; 由此獲得權利要求 1 的綴合物。
43: 權利要求 42 的方法, 其中 (b) 在 (c) 之后、 同時或之前實施。
44: 權利要求 42 的方法, 其中以所述第一反應性基團為終端的所述單體單元和 / 或以 所述第二反應性基團為終端的所述單體單元, 進一步包含接頭, 所述接頭以所述第一反應 性基團為終端, 或以所述第二反應性基團為終端。
45: 權利要求 44 的方法, 所述方法進一步包括在 (a) 之前讓所述接頭與所述單體單元 連接。
46: 權利要求 42 的方法, 其中所述抗血管生成劑和所述二膦酸鹽中至少一種經由間隔 基與所述聚合物主鏈和 / 或與所述接頭連接, 所述方法進一步包括在 (a) 之前讓所述間隔 基與所述單體單元中的所述部分中的至少一個連接。
47: 權利要求 42 的方法, 其中所述抗血管生成劑和所述二膦酸鹽中的至少一種經由間 隔基與所述聚合物主鏈和 / 或與所述接頭連接, 所述方法進一步包括在 (a) 之前讓所述間 隔基與所述抗血管生成劑和 / 或與所述二膦酸鹽連接, 因此獲得所述抗血管生成劑和 / 或 所述二膦酸鹽的所述衍生物。

說明書


聚合物、 二膦酸鹽和抗血管生成劑的綴合物及其在治療和 監測骨相關疾病中的用途

    發明領域和背景
     本發明在其某些實施方案中涉及化學綴合物及其在治療和診斷中的用途, 更具 體但并非專門涉及在其上連接抗血管生成劑 (anti-angiogenesis agent) 和骨靶向部分 (bone targeting moiety) 的聚合物的化學綴合物, 所述化學綴合物用于診斷、 治療和監測 骨相關疾病和病癥, 例如骨癌和骨轉移。
     骨肉瘤是原發性骨癌的最常見類型, 其歸類為惡性間葉瘤, 其中腫瘤直接產生有 缺陷類骨質 ( 未成熟骨 )。它是富含血管并極有破壞性的惡性腫瘤, 最常見于長骨的干骺 端。過去二十多年來, 由與根治性手術切除聯合的侵略性化療組成的多種形式的療法成為 處理骨肉瘤的主流, 在沒有呈現轉移性疾病的患者中的 5 年存活率可達到 50-70%。 推薦了 幾種方案, 例如基于免疫的療法、 腫瘤抑制劑或自殺基因療法或在骨肉瘤中不常用的抗癌 藥物。 然而, 仍然有三分之一的患者死于這種毀滅型癌癥, 對于這些具有不能切除的癌癥的 患者而言, 沒有可治愈的系統療法。
     前列腺癌是工業化國家男性最常見的癌癥, 是男性癌癥死亡率的第二位原因。這 些患者的死亡不是由于原發性腫瘤生長, 而是由于因轉移到致命器官引起的并發癥。前列 腺癌主要轉移到骨, 但包括肺、 肝和腎上腺在內的其它器官位點也受到影響。
     乳腺癌經常也轉移到骨。
     晚期轉移性疾病患者的骨轉移發生率為大約 70%。 骨轉移與相當多的骨骼不健全 有關, 所述骨骼不健全包括嚴重骨疼、 病理性骨折、 脊髓或神經根受壓和惡性高血鈣癥。化 療劑、 激素剝奪和二膦酸鹽是對晚期轉移性疾病的常見治療。 然而, 該疾病隨著時間可發展 到標準療法不能控制該惡性腫瘤的時期, 并進一步發展到高度抗化療的狀態。
     近年來, 已經清楚腫瘤發展和轉移形成適度依賴血管生成。現在認為血管生成是 癌癥治療的重要控制點。因此, 腫瘤募集的微血管內皮細胞在癌癥治療中成為重要的第二 靶標。 微血管內皮細胞不象腫瘤細胞本身, 其往往不會出現對藥物的抗性。 腫瘤內皮細胞長 時間對藥物敏感, 在″抗血管生成方案″中可用細胞毒素劑治療。該方案涉及以大大低于 最大耐受劑量 (MTD) 的低劑量給予化療, 并長期窄時間間隔給藥 ( 節拍式給藥 )。 因此, 應避 免急性毒性, 并可長期給予藥物, 最終將癌癥轉化為慢性可控制的疾病。 盡管該方法對于非 小細胞肺癌、 乳腺癌和卵巢癌顯示出有前途的結果, 但當長期節拍式給予即使是低劑量的 化療藥物時, 也會在身體內聚積并引起損傷 (Browder 等, Antiangiogenic scheduling of chemotherapy improves efficacy against experimental drug-resistant cancer( 化療 的抗血管生成方案改進實驗性抗藥癌癥的療效 ), Cancer Res 2000 ; 60 : 1878-1886)。
     泰素紫杉醇 (taxane paclitaxel)(PTX) 是有效的抗腫瘤藥。在臨床上完全確定 了紫杉醇是用于治療轉移性前列腺癌和乳腺癌的單一療法及聯合療法的高度有效的抗腫 瘤藥物。紫杉醇的主要作用模式是促進微管蛋白組裝并使其穩定, 防止其解聚合并因此抑 制引起損害的有絲分裂的微管動力學, 導致細胞周期停止并最終導致細胞凋亡。盡管紫 杉醇有很強的抗癌活性, 但其水溶性很差, 呈現嚴重的劑量限制毒性和來源于調配溶媒克
     列莫佛 EL(cremophor EL) 的超敏反應并對靶標組織缺乏選擇性 (Gelderblom 等, 2001, EurJCANCER 37(13), 1950-8 ; Bhalla, K.N.Oncogene 2003 ; 22 : 9075-9086]。近些年來, 已 經明了低劑量紫杉醇具有抗血管生成性質 (Wang 等, Anticancer Drugs 2003 ; 14 : 13-19)。
     業已在乳腺癌患者中試驗了節拍式給予低劑量紫杉醇的抗血管生長計劃, 顯示出 低毒性的誘人的結果 [Munoz 等, breast, 14 : 466-79(2005)]。 然而, 即使是節拍式給予低劑 量的紫杉醇也會引起副作用。
     目前有 8 種公認具抗血管生成性質的核準的抗癌療法。可將這些中斷參與腫瘤 血管生成和生長的關鍵的細胞信號轉導途徑的藥物分為兩個主要類別 : (1) 針對特異性的 促血管生成因子和 / 或其受體的單克隆抗體 ( 阿瓦斯丁 (Avastin)、 艾比特思 (Erbitux)、 維克替比 (Vectibix)、 曲妥單抗 (Herceptin)) ; 和 (2) 多種促血管生成生長因子受體的 小分子酪氨酸激酶抑制劑 (TKI)( 特羅凱 (Tarveca)、 多吉美 (Nexavar)、 索坦 (Sutent))。 mTOR( 哺乳動物雷帕霉素 (rapamycin) 靶標 ) 的抑制劑代表第三種較小類別的抗血管生成 療法, 目前有一種核準藥物 ( 馱瑞塞爾 (Torisel))。 另外, 至少有兩種其它核準的血管生成 劑可通過并未完全理解的機理間接抑制血管生成 ( 硼替佐米 (Velcade), Celgene)。
     第 一 個 FDA 核 準 的 血 管 生 成 抑 制 劑 貝 伐 單 抗 (Bevacizumab)( 阿 瓦 斯 丁, Genentech) 是血管內皮生長因子 (VEGF) 的單克隆抗體, 其業已核準與標準的常規化療聯 合用于轉移性結腸癌治療。 阻止血管生成的最大的藥物類別是靶向 VEGF 受體 (VEGFR) 的多靶向酪氨酸激酶 抑制劑 (TKI)。 這些藥物例如舒尼替尼 (sunitinib)( 索坦, Pfizer)、 索拉非尼 (Sorafenib) ( 多吉美, Bayer/Onyx Pharmaceuticals) 和厄洛替尼 (Erlotinib)( 特羅凱, Gennentech/ OSI/Roche), 具有擊打多個靶標、 方便口服給藥和成本效益高的優點。 盡管這些藥物顯示出 有前景的功效, 但其用途受到其缺乏靶標特異性的限制, 缺乏靶標特異性導致始料不及的 毒性 [Cabebe 等 Curr Treat Options Oncol 2007 ; 8: 15-27]。
     水 溶 性 共 聚 物 例 如 甲 基 丙 烯 酸 羥 丙 酯 (HPMA) 為 生 物 相 容 的、 無免疫原性及 無 毒 性 的 載 體, 其 使 得 可 特 異 性 遞 送 到 腫 瘤 組 織 (Satchi-Fainaro 等 Nat Med 2004 ; 10 : 255-261)。這些大分子不通過正常血管擴散, 而是因為高滲透性及保持 (enhanced permeability and retention, EPR) 效果而在腫瘤位點選擇性聚積。在很多實體腫瘤中觀 察到大分子物質及脂質的這種通過滲透性過高的新血管被動擴散并定位在腫瘤間質組織 的現象。此外, 與諸如 HPMA 等共聚物綴合應該阻礙通過血腦屏障的通道, 并延長藥物的循 環半衰期, 因此通過讓在循環中比游離藥物存在更長時間的被綴合的藥物與細胞接觸來抑 制腫瘤內皮細胞和表皮細胞的生長。
     Satchi-Fainaro 等在 WO 03/086382 中闡述通過讓抗血管生成劑與 HPMA 綴合而 獲得有利特點的實例。本專利申請教導水溶性聚合物與抗血管生成劑 TNP-470 的綴合物及 其作為抗腫瘤劑的用途 ( 尤其是它們作為進入腫瘤血管的 TNP-470 載體的用途 ) 和它們對 TNP-470 的神經毒性的影響。 根據 WO 03/086382 的教導, 與單獨的 TNP-470 比較, 例示性所 述綴合物 HPMA-(TNP-470) 綴合物 (caplostatin) 表現出較高的抗腫瘤活性連同降低的毒 性水平。WO 03/086382 另外建議納入靶向配體, 例如 RGD 或抗體。
     業已在 WO 03/086178 中闡述 HPMA-TNP-470 綴合物用于治療血管生成相關病癥的 用途。
     在美國專利號 6,884,817 中介紹了通過讓抗腫瘤藥物與水溶性聚合物綴合而獲 得的增加活性但降低毒性的另一實例。
     Meerum Terwogt 等 [PNU166945 ; Anticancer drugs 2001 ; 12 : 315-323] 亦闡述了 紫杉醇的 HPMA 共聚物綴合物。這種綴合物的目標是改進藥物溶解性并提供控釋紫杉醇。
     二膦酸鹽, 例如阿倫膦酸鹽 (alendronate), 是用于治療骨質疏松癥、 骨轉移和預 防骨折的分子。這些化合物對骨礦物羥基磷灰石具有異常高的親和性, 因此已知亦被用于 作為靶向部分 (Uludag, H.Curr Pharm Des 2002 ; 8: 1929-1944)。
     認為阿倫膦酸鹽對于治療骨相關疾病和癌癥相關高血鈣癥有效。其已顯示在 幾種體內癌癥模型中通過幾種不同機理具有抗腫瘤作用 [Tuomela 等 2008, BMC Cancer 8: 81 ; Molinuevo 等 2007, Eur JPharmacol 562 : 28-33 ; Hashimoto 等 2005, CancerRes 65 : 540-545]。另外, 發現阿倫膦酸鹽通過以下機理具有抗血管生成活性 : (i) 在卵巢癌 癥模型中阻止 VEGF 誘導的 Rho 激活 [Hashimoto 等 2007, Biochem Biphys Res Commun 354 : 478-484] ; (ii) 在甲羥戊酸途徑中抑制法尼基焦磷酸合成酶 [Russell RG 2007, Pediatrics 119Suppl 2 : S150-162] ; 和 (iii) 在骨肉瘤細胞系中調節細胞 MMP-2 表達水 平 [Cheng 等 2004, Pediatr Blood Cancer42 ; 410-415]。 WO 2004/062588 教導水溶性聚合綴合物對于骨靶向的藥物遞送具有改良的藥代 動力學參數, 并且所裝載的藥物具有更好的水溶性。該申請教導的聚合物藥物遞送系統基 于甲基丙烯酸羥丙酯 (HPMA) 綴合物, 所述綴合物為靶向骨的藥物 ( 例如阿倫膦酸鹽 ) 和 D-Asp8 連同骨 - 相關治療劑 ( 例如四環素 (tetracycline)) 的綴合物。
     PK2(FCE28069) 是 HPMA 共 聚 物 - 阿 霉 素 (doxorubicin)- 半 乳 糖 胺 綴 合 物, 其 設計為治療肝細胞癌或繼發性肝病 [Seymour 等 Journal of Clinical Oncology 2002 ; 20 : 1668-1676]。阿霉素是在生理體液中溶解性有限的蒽環類抗生素, 是已經確定的抗 腫瘤藥物。半乳糖胺與肝臟的無唾液酸糖蛋白受體 (ASGPR) 結合, 由此作為特異性靶向 肝臟的部分。這些組分經由酶生物可降解接頭與 HPMA 聚合物連接, 所述接頭使得可在 肝臟內釋放游離阿霉素, 由此增加其作用位點的藥物濃度。酶可降解接頭為四肽間隔基 (Gly-Phe-Leu-Gly), 其設計為通過溶酶體組織蛋白酶來裂解。
     O′ hare 等 [Journal of Drug Targeting 1993 ; 1: 217-229] 合成了 HPMA 共聚 物, 所述共聚物含阿霉素和作為特異性靶向黑素瘤部分的黑素細胞刺激激素 (MSH)。 阿霉素 和黑素細胞刺激激素二者都經由酶生物可降解接頭與 HPMA 聚合物連接。
     Hruby 等 [Journal of Applied Polymer Science 2006 ; 101 : 3192-3201] 制備并 合成了新型聚合物藥物 - 遞送系統, 其設計用于靶向骨的抗腫瘤藥物, 所述遞送系統基于 生物相容的 HPMA 共聚物, 其含羥基二膦酸鹽靶向部分和模型藥物放射性療法 125I、 顯像劑 111 In 或抗癌藥物阿霉素。
     發明簡述
     目前已知的以達到抗腫瘤活性的劑量用于治療骨相關癌癥和其它血管生成 - 相 關病癥的藥物的特征在于高毒性, 這限制其應用。在研究改良目前已知的抗血管生成劑的 方式以使其具有更高的治療功效及降低的副作用水平的過程中, 本發明人設計并成功制備 和實施了羥丙基甲基丙烯酰胺 (HPMA) 共聚物、 抗血管生成劑 ( 例如紫杉醇 ) 和諸如阿倫膦 酸鹽 (ALN, 一種二膦酸鹽 ) 等靶向骨的藥物的新型綴合物, 其中讓抗血管生成劑和靶向骨
     的藥物經由生物可降解接頭與 HPMA 聚合物綴合。
     本發明某些實施方案一方面提供包含具有連接在其上的抗血管生成劑和二膦酸 鹽骨靶向部分的聚合物主鏈的綴合物, 所述聚合物主鏈源自選自以下的聚合物 : 右旋糖苷、 水溶性聚氨基酸、 聚乙二醇 (PEG)、 聚谷氨酸 (PGA)、 聚乳酸 (PLA)、 聚乳酸 - 乙醇酸共聚物 (PLGA)、 聚 (D, L- 丙交酯 - 乙交酯共聚物 )(PLA/PLGA)、 聚 ( 羥基烷基甲基丙烯酰胺 )、 聚丙 三醇、 聚酰氨基胺 (PAMAM) 和聚乙烯亞胺 (PEI)。
     根 據 某 些 實 施 方 案, 抗血管生成劑選自 : 紫 杉 醇、 2- 甲 氧 雌 二 醇、 普利司他 (prinomastat)、 巴 馬 司 他 (batimastat)、 BAY 12-9566、 羧 基 酰 氨 基 三 唑、 CC-1088、 乙 酸 右 美 沙 芬 (dextromethorphan acetic acid)、 乙 酸 二 甲 基 呫 噸 酮、 內 皮 抑 素、 IM-862、 馬立馬司他 (marimastat)、 基質金屬蛋白酶、 青霉胺 (penicillamine)、 PTK787/ ZK 222584、 RPI.4610、 乳 酸 角 鯊 胺、 SU5416、沙 利 度 胺 (thalidomide)、 TNP-470、 康 普 瑞 汀 (combretastatin)、他 莫 昔 芬 (tamoxifen)、 COL-3、新 伐 司 他 (neovastat)、 BMS-275291、 SU6668、抗 VEGF 抗 體、 Medi-522(Vitaxin II)、 CAI、白 介 素 -12、 IM862、 阿 米 洛 利 (Amilloride)、 蛋 白、 血 管 抑 素 K1-3、 血 管 抑 素 K1-5、 卡托普 內利 (Captopril)、 DL-α- 二氟甲基鳥氨酸、 鹽酸 DL-α- 二氟甲基鳥氨酸、皮 抑 素 TM 蛋 白、 夫 馬 潔 林 (Fumagillin)、 除 莠 霉 素 A(Herbimycin A)、 4- 羥 基 苯 基 視 黃 酰 胺 (4-Hydroxyphenylretinamide)、 胡 桃 醌 (Juglone)、 層 粘 連 蛋 白、 層粘連蛋白六 肽、 層粘連蛋白五肽、 薰草菌素 A(Lavendustin A)、 甲羥孕酮、 乙酸甲羥孕酮、 米諾環素 (Minocycline)、 鹽酸米諾環素、 胎盤核糖核酸酶抑制劑、 蘇拉明 (Suramin)、 蘇拉明鈉鹽、 人血小板反應蛋白、 中性粒細胞、 針對特異性的促血管生成因子和 / 或其受體的單克隆 抗體 ( 例如阿瓦斯丁、 艾比特思、 維克替比、 曲妥單抗 ) ; 多種促血管生成生長因子受體 的小分子酪氨酸激酶抑制劑 ( 例如它塞瓦 (Tarceva)、 多吉美、 索坦、 易瑞沙 (Iressa)) ; mTOR( 哺乳動物雷帕霉素靶標 ) 的抑制劑 ( 例如馱瑞塞爾 ) ; 干擾素 α、 β和γ; IL-12 ; 基質金屬蛋白酶 (MMP) 抑制劑 ( 例如 COL3、 馬立馬司他、 巴馬司他 ) ; EMD121974( 西侖吉肽 (Cilengitide)) ; Vitaxin ; 角鯊胺 (Squalamin) ; COX-2 抑制劑 ; PDGFR 抑制劑 ( 例如格列衛 (Gleevec)) ; NM3 和 2-ME2。
     根據某些實施方案, 抗血管生成劑為紫杉醇。
     根據某些實施方案, 聚合物主鏈源自 N-(2- 羥基丙基 ) 甲基丙烯酰胺 (HPMA)。
     本發明實施方案一方面提供包含具有連接在其上的抗血管生成劑和二膦酸鹽骨 靶向部分的聚合物主鏈的綴合物。
     根據某些實施方案, 抗血管生成劑和骨靶向部分中至少一種經由接頭與聚合物主 鏈連接。
     根據某些實施方案, 接頭為生物可降解接頭。
     根據某些實施方案, 抗血管生成劑和骨靶向部分各自經由接頭與聚合物主鏈連 接。
     根據某些實施方案, 二膦酸鹽部分選自阿倫膦酸鹽、 英卡膦酸鹽 (cimadronate)、 氯膦酸鹽 (clodronate)、 替魯膦酸鹽 (tiludronate)、 依替膦酸鹽 (etidronate)、 伊班膦 酸鹽 (ibandronate)、 奈立膦酸鹽 (neridronate)、 奧帕膦酸鹽 (olpadronate)、 利塞膦酸 鹽 (risedonate)、 吡利膦酸鹽 (piridronate)、 帕米膦酸鹽 (pamidronate) 和唑來膦酸鹽(zoledronate)。
     根據某些實施方案, 二膦酸鹽為阿倫膦酸鹽。
     根據某些實施方案, 生物可降解接頭選自 pH- 敏感的接頭和酶可裂解的接頭。
     根據某些實施方案, 生物可降解接頭為酶可裂解的接頭。
     根據某些實施方案, 酶可裂解的接頭由在腫瘤組織中表達的酶來裂解。
     根據某些實施方案, 酶可裂解的接頭由在腫瘤組織中過表達的酶來裂解。
     根據某些實施方案, 所述酶選自組織蛋白酶 B、 組織蛋白酶 K、 組織蛋白酶 D、 組織 蛋白酶 H、 組織蛋白酶 L、 legumain、 MMP-2 和 MMP-9。
     根據某些實施方案, 生物可降解接頭包含具有 2-10 個氨基酸殘基的寡肽。
     根據某些實施方案, 寡肽選自 -[Ala-Leu-Ala]-、 -[Cit-Val]-、 -[Gly-Leu-Gly]-、 -[Gly-Phe-Gly]-、 -[Gly-Leu-Phe-Gly]-、 -[Gly-Phe-Leu-Gly]-、 -[Ala-Leu-Ala-Leu]-、 -[Ph e-Lys]- 和 -[Gly-Phe-Leu-Gly-Phe-Lys]-。
     根據某些實施方案, 抗血管生成劑經由包含 -[Gly-Phe-Leu-Gly-Phe-Lys] 的接 頭與聚合物主鏈連接。
     根據某些實施方案, 骨靶向部分經由包含 -[Gly-Phe-Leu-Gly]- 的接頭與聚合物 主鏈連接。 根據某些實施方案, 綴合物進一步包含將抗血管生成劑和 / 或二膦酸鹽與聚合物 主鏈和 / 或與接頭連接在一起的間隔基。
     根據某些實施方案, 抗血管生成劑為紫杉醇, 間隔基讓紫杉醇與聚合物主鏈或與 生物可降解接頭連接。
     根據某些實施方案, 間隔基可降解。
     根據某些實施方案, 間隔基為碳酸對氨基苯甲酯 (PABC)。
     根據某些實施方案, 綴合物具有本文所定義的通式 II。
     根據某些實施方案, 綴合物進一步包含連接在其上的標記物質。
     根據某些實施方案, 標記物質選自熒光劑、 放射性試劑、 磁化劑、 發色團、 生物發光 劑、 化學發光劑、 磷光劑和重金屬團簇。
     本發明實施方案一方面提供包含作為活性成分的本文所述綴合物和藥學可接受 載體的藥物組合物。
     根據某些實施方案, 將組合物包裝在包裝材料中, 并在包裝材料里或表面用印刷 物說明用于治療骨相關疾病或病癥的用途。
     根據某些實施方案, 所述綴合物包含標記物質, 所述組合物包裝在包裝材料中, 并 在包裝材料里或表面用印刷物說明用于監測骨相關疾病或病癥的用途。
     本發明某些實施方案一方面提供在需要治療的受試者中治療骨相關疾病或病癥 的方法, 所述方法包括給予受試者有效量的本文所述綴合物。
     本發明某些實施方案一方面提供在受試者中監測骨相關疾病或病癥的方法, 所述 方法包括 : 給予受試者本文所述的具有連接在其上的標記物質的綴合物 ; 和采用成像技術 來監測綴合物在身體或其部分內的分布。
     本發明某些實施方案一方面提供作為藥物的本文所述綴合物。
     本發明某些實施方案一方面提供本文所述綴合物在制備用于治療骨 - 相關疾病
     或病癥的藥物中的用途。
     本發明某些實施方案一方面提供作為診斷劑的本文所述具有連接在其上的標記 物質的綴合物。
     本發明某些實施方案一方面提供本文所述具有連接在其上的標記物質的綴合物 在制備用于監測骨相關疾病或病癥的診斷劑中的用途。
     根據某些實施方案, 所述疾病或病癥與血管生成有關。
     根據某些實施方案, 所述疾病或病癥選自骨轉移和骨癌。
     本發明某些實施方案一方面提供制備本文所述綴合物的方法, 所述方法包括 :
     (a) 使多個聚合物主鏈單體單元共聚合, 其中多個聚合物主鏈單體單元的一部分 包含以第一反應性基團為終端的單體單元, 多個聚合物主鏈單體單元的另一部分包含以第 二反應性基團為終端的單體單元, 因此獲得包含包含多個主鏈單元的聚合物主鏈的共聚 物, 其中主鏈單元的一部分具有第一反應性基團, 主鏈單元的另一部分具有第二反應性基 團, 所述第一反應性基團能夠與抗血管生成劑起反應, 所述第二反應性基團能夠與二膦酸 鹽起反應 ;
     (b) 讓共聚物與抗血管生成劑或與其衍生物經由第一反應性基團反應, 因此獲得 具有連接在其上的抗血管生成劑的共聚物 ; 和 (c) 讓共聚物與二膦酸鹽或其衍生物經由第二反應性基團反應, 因此獲得具有連 接在其上的二膦酸鹽的共聚物, 由此獲得所述綴合物。
     根據某些實施方案, (b) 在 (c) 之后、 同時或之前進行。
     根據某些實施方案, 所述以第一反應性基團為終端的單體單元和 / 或以第二反應 性基團為終端的單體單元進一步包含接頭, 所述接頭以所述第一反應性基團為終端或以第 二反應性基團為終端。
     根據某些實施方案, 所述方法進一步包括在 (a) 之前讓接頭與單體單元連接。
     根據某些實施方案, 讓抗血管生成劑和二膦酸鹽中至少一種與聚合物主鏈和 / 或 與接頭經由間隔基連接, 所述方法進一步包括在 (a) 之前讓間隔基與單體單元的至少一個 部分連接。
     根據某些實施方案, 讓抗血管生成劑和二膦酸鹽中至少一種與聚合物主鏈和 / 或 與接頭經由間隔基連接, 所述方法進一步包括在 (a) 之前讓間隔基與抗血管生成劑和 / 或 與二膦酸鹽連接, 因此獲得抗血管生成劑和 / 或二膦酸鹽的衍生物。
     除非另外定義, 否則本文所用所有技術和 / 或科學術語具有與本發明所屬技術的 一般技術人員所通常理解一樣的意義。 盡管在實行或試驗本發明實施方案中可使用與本文 所述相似或等同的方法及材料, 但例示性的方法和 / 或材料如下所述。在沖突的情況下, 以 本發明說明書 ( 包括定義 ) 為準。另外, 所述材料、 方法和實施例僅為闡明性的, 并非必不 可少的限制。
     附圖簡述
     本文僅通過舉例關于附圖及圖像闡述本發明實施方案。 關于現在特別詳細地提及 的附圖, 強調所顯示的細節是為了舉例及闡明性討論本發明實施方案的目的。 在這點上, 對 附圖的說明使本領域技術人員明了可怎樣實行本發明實施方案。
     在附圖中 :
     圖 1 顯 示 闡 明 通 過 組 織 蛋 白 酶 B 酶 裂 解 本 發 明 某 些 實 施 方 案 的 HPMA 共 聚 物 -PTX-FK-ALN 綴合物 ( 化合物 1) 的機理的流程圖。
     圖 2A-C 顯示闡明本發明某些實施方案的合成 HPMA 共聚物 -PTX-FK-ALN 綴合物 ( 化合物 1) 的流程圖 ( 圖 2A), 和綴合物的流體力學直徑和粒徑分布圖 ( 圖 2B), 和闡明根據 本發明某些實施方案經由 RAFT 合成另一 HPMA 共聚物 -PTX-ALN 綴合物的流程圖 ( 圖 2C)。
     圖 3A-B 顯示本發明某些實施方案的對所測樣品中未結合的 HPMA 共聚物 - 紫杉 醇 -FK-ALN 綴合物的 FPLC 檢測, 其在存在及缺乏羥基磷灰石情況下于選擇的時間點 ( 圖 3A) 進行, 圖表顯示作為洗脫時間的函數的與羥基磷灰石結合的 HPMA- 紫杉醇 -FK-ALN 綴合 物的百分比 ( 圖 3B)。用作對照的是 HPMA 共聚物。
     圖 4A-B 顯示根據本發明某些實施方案, 通過組織蛋白酶 B 在體外酶引發的從 HPMA 共聚物 -PTX-FK-ALN 綴合物釋放紫杉醇的 HPLC 檢測, 其在還原性谷胱甘肽和組織蛋白酶 B 存在下, 在磷酸鹽緩沖液中于 37℃進行 0、 24 和 48 小時孵育 ( 圖 4A), 圖表顯示作為與組織 蛋白酶 B 孵育時間的函數從綴合物釋放的紫杉醇 ( 游離 PTX) 的量 ( 圖 4B)。
     圖 5 顯示證明當紫杉醇與 HPMA 共聚物結合時保留其對 HUVEC 細胞的抗血管生 成作用的比較性圖表。結果表示為作為紫杉醇濃度的函數的細胞生長百分比 ( 出自對照 組): 單獨 HPMA 聚合物 ( 空心菱形 ) ; 游離紫杉醇 -FK(PTX-FK)( 實心三角形 ) ; 本發明某 些實施方案的 HPMA 共聚物 -PTX-FK-ALN 綴合物 ( 實心方框 ) ; 游離紫杉醇 + 游離 ALN 組 合 (ALN+PTX ; 空心三角形 ) ; 游離 ALN( 十字形 ) ; 游離紫杉醇 (PTX, 空心圓 ) ; 和游離紫杉 醇 -FK+ 游離 ALN(PTX-FK+ALN ; 實心圓 )。 圖 6A-C 顯示不可裂解的 HPMA-GGGG-PTX 綴合物 ( 圖 6A)、 組織蛋白酶 B- 酶可裂解 的 HPMA-GGFK-PTX 綴合物 ( 圖 6B) 的 2-D 化學結構, 比較性圖表顯示, 在抑制 HUVEC 增殖方 面不可裂解的對照 HPMA-GGGG-PTX 綴合物比組織蛋白酶 B- 可裂解的 HPMAGGFK-PTX 綴合物 的活性小 ( 圖 6C)。HUVEC 與 HPMA-GGGG-PTX( 實心三角形 ) 或與 HPMA-GGFK-PTX( 實心方 框 ) 綴合物孵育 48 小時。 HPMA-GGGG-PTX 綴合物以比組織蛋白酶 B 可裂解的 HPMA-GGFK-PTX 綴合物高 2-log 的濃度抑制 HUVEC 增殖。數據代表平均值 ±SD。X 軸為對數標度。
     圖 7 代表顯示在組織蛋白酶 B 抑制劑存在下本發明某些實施方案的 HPMA 共 聚 物 -PTX-FK-ALN 綴 合 物 和 PTX-FK 的 細 胞 毒 性 降 低 的 條 線 圖。HUVEC 與 HPMA 共 聚 物 -PTX-FK-ALN 綴合物或與 PTX-FK+ALN 以 500nM 和 300nM 的濃度分別在組織蛋白酶 B 抑 制劑 (BI) 存在或不存在下孵育 48 小時。HUVEC 未與任何作為對照的藥物孵育 ( 表示為″ 未治療″ )。結果表示為細胞生長百分比 ( 出自對照組 )。數據代表平均值 ±SD。* = p < 0.05。
     圖 8 顯示本發明某些實施方案的顯示由 HPMA 共聚物 -PTX-FK-ALN 綴合物抑制 HUVEC 遷向趨化劑 VEGF 的條線圖。HUVEC 與紫杉醇和 ALN 組合、 紫杉醇 -FK 和 ALN 組合、 與 每種單獨藥物并與 HPMA 共聚物 - 紫杉醇 -FK-ALN 綴合物孵育。測量朝 VEGF 的遷移, 并用 代表單獨遷向 VEGF 的 100%來使遷移百分比標準化。
     圖 9A-B 顯示本發明某些實施方案的圖像 ( 圖 9A) 和條線圖 ( 圖 9B), 其顯示 HPMA 共聚物 -PTX-FK-ALN 綴合物、 游離紫杉醇 -FK(PTX) 游離 ALN 及其混合物在 8 小時孵育后對 HUVEC 形成毛細管樣管狀結構的能力的影響 ( 圖 9A), 及所測物質在不同濃度時抑制 HUVEC 毛細管樣管狀結構的百分比 ( 圖 9B)。
     圖 10 顯示證明紫杉醇與 HPMA 共聚物結合時保留其對人前列腺癌細胞 (PC3) 的細 胞毒性作用的比較性圖表。結果表示為作為紫杉醇濃度的函數的細胞生長百分比 ( 出自對 照組 )。PC3 細胞與 PTX( 空心圓 )、 ALN( 十字形 )、 PTX-FK( 實心三角 )、 ALN+PTX( 空心三 角 )、 PTX-FK+ALN( 實心圓 )、 HPMA 共聚物 ( 空心菱形 ) 和 HPMA 共聚物 -PTX-FK-ALN 綴合物 ( 實心方框 ) 孵育 72 小時。數據代表平均值 ±SD。X 軸為對數標度。
     圖 11A-B 顯示證明本發明某些實施方案的 HPMA 共聚物 - 紫杉醇 -FK-ALN 綴合物 抑制脛骨中的 DA3 腫瘤 ( 圖 11A) 及在治療小鼠中未觀察到體重減少 ( 圖 11B) 的比較性圖 表。將游離 ( 閉合圓 ) 或綴合的 ( 閉合三角 )ALN 和 PTX 對 DA3 腫瘤生長的抗腫瘤作用與用 溶媒處理的對照組 ( 閉合方框 ) 進行比較。用對荷有 mCherry- 標記的 DA3 腫瘤的小鼠進 行靜脈內非創傷性熒光成像來評估腫瘤發展。HPMA 共聚物 -PTX-FK-ALN 綴合物開始治療 9 天后抑制 37%腫瘤生長, 而在用游離 ALN+ 游離 PTX 組合治療的小鼠及對照組 ( 圖 11A) 中 未觀察到腫瘤生長的顯著變化。監測治療的小鼠的體重, 在任何組中都未觀察到體重減輕 ( 圖 11B)。
     本發明具體實施方案說明
     在其某些實施方案中, 本發明涉及化學綴合物及其在治療和診斷中的用途, 更具 體但并非專有地, 涉及具有連接在其上的抗血管生成劑和骨靶向部分的聚合物的化學綴合 物, 所述綴合物用于治療和監測骨相關疾病和病癥, 例如骨癌和骨轉移。
     參考附圖及隨附說明, 可更好地理解本發明綴合物、 組合物、 用途、 方法和過程的 原理及操作。
     在詳細解釋至少一個本發明實施方案之前, 應該理解, 本發明不限于其在以下說 明所提出的或實施例所舉的細節方面的應用。 本發明能夠是其它實施方案或以各種方式實 行或實施其它實施方案。 同樣地, 應該理解本文采用的表達方式和術語為了說明目的, 不應 該認為是限制。
     如上所述, 目前已知的以達到抗腫瘤活性的劑量用于治療骨相關癌癥和其它血管 生成 - 相關病癥的藥物的特征在于高毒性, 這限制其應用。
     本發明人現在設計并成功制備和實施了新型共聚物的綴合物, 其具有連接在共聚 物上的抗血管生成劑和骨靶向部分, 即二膦酸鹽。
     在設計所述作用劑以便表現出有益于治療骨癌或骨轉移的抗血管生成活性的同 時, 所述改進的特異性由聚合物誘導的 EPR 作用及骨靶向部分誘導的靶向作用二者來實 現。
     如以下實施例章節所證明, 本發明人成功地制備并實施了新型羥丙基甲基丙烯酰 胺 (HPMA) 共聚物的綴合物, 其具有連接在共聚物上的抗血管生成劑紫杉醇和二膦酸鹽阿 倫膦酸鹽 (ALN), 其中紫杉醇和阿倫膦酸鹽與源自 HPMA 的聚合物主鏈經由生物可降解接 頭綴合 (HPMA 共聚物 - 紫杉醇 -FK-ALN ; 參見圖 2)。綴合物的抗血管生成活性業已通過以 下來證明 : 綴合物抑制 HUVEC 增殖的能力 ( 圖 5) ; 抑制血管內皮生長因子 (VEGF)- 誘導的 HUVEC 遷移的能力 ( 圖 8) ; 和抑制 HUVEC 形成毛細管樣管狀結構的能力 ( 圖 9)。用體外羥 基磷灰石結合測定進一步證明綴合物與骨礦物的結合能力, 與羥基磷灰石結合的綴合物為 50% ( 圖 3)。另外, 顯示了綴合物對人前列腺 PC3 細胞系增殖的細胞毒活性 ( 圖 10)。體 內實驗表明綴合物與游離紫杉醇藥物比較具有有益活性, 由此脛骨內注射的極具侵略性的腫瘤模型 DA3 鼠乳房癌不受游離 PTX 治療的影響, 但 HPMA 共聚物 -PTX-FK-ALN 綴合物治療 抑制 37%的腫瘤生長 ( 圖 11)。
     這些結果證明本文所述綴合物可有利地用于治療骨和骨相關病癥 ( 例如特征在 于血管生成的癌癥和病癥 )。
     本發明某些實施方案一方面提供聚合綴合物, 所述聚合綴合物包含具有連接在其 上的至少一種抗血管生成劑和至少一種骨靶向部分的聚合物主鏈, 所述骨靶向部分為二膦 酸鹽。
     本文亦互換稱為″抗血管生成劑″或″血管生成抑制劑″的術語″抗血管生成 劑″闡述具有以下能力的作用劑 : (a) 抑制內皮細胞增殖或遷移 ; (b) 殺死增殖的內皮細 胞; 和 / 或 (c) 抑制組織中新血管形成。
     適用于本發明實施方案情況的例示性抗血管生成劑包括但不限于 : 紫杉醇、 2- 甲 氧雌二醇、 普利司他、 巴馬司他、 BAY 12-9566、 羧基酰氨基三唑、 CC-1088、 乙酸右美沙芬、 乙酸二甲基呫噸酮、 內皮抑素、 IM-862、 馬立馬司他、 基質金屬蛋白酶、 青霉胺、 PTK787/ ZK222584、 RPI.4610、 乳酸角鯊胺、 SU5416、 沙利度胺、 TNP-470、 康普瑞汀、 他莫昔芬、 COL-3、 新伐司他、 BMS-275291、 SU6668、 抗 VEGF 抗體、 Medi-522(Vitaxin II)、 CAI、 白介素 -12、 IM862、 阿米洛利、 血管抑素 蛋白、 血管抑素 K1-3、 血管抑素 K1-5、 卡托普利、 DL-α- 二氟 甲基鳥氨酸、 鹽酸 DL-α- 二氟甲基鳥氨酸、 內皮抑素 TM 蛋白、 夫馬潔林、 除莠霉 素 A、 4- 羥基苯基視黃酰胺、 胡桃醌、 層粘連蛋白、 層粘連蛋白六肽、 層粘連蛋白五肽、 薰草 菌素 A、 甲羥孕酮、 乙酸甲羥孕酮、 米諾環素、 鹽酸米諾環素、 胎盤核糖核酸酶抑制劑、 蘇拉 明、 蘇拉明鈉鹽、 人血小板反應蛋白、 中性粒細胞、 針對特異性的促血管生成因子和 / 或其 受體的單克隆抗體 ( 例如阿瓦斯丁、 艾比特思、 維克替比、 曲妥單抗 ) ; 多種促血管生成生長 因子受體的小分子酪氨酸激酶抑制劑 ( 例如它塞瓦、 多吉美、 索坦、 易瑞沙 ) ; mTOR 的抑制劑 ( 哺乳動物雷帕霉素靶標 )( 例如馱瑞塞爾 ) ; 干擾素 α、 β和γ; IL-12 ; 基質金屬蛋白酶 (MMP) 抑制劑 ( 例如 COL3、 馬立馬司他、 巴馬司他 ) ; EMD121974( 西侖吉肽 ) ; Vitaxin ; 角鯊 胺; COX-2 抑制劑 ; PDGFR 抑制劑 ( 例如格列衛 ) ; NM3 和 2-ME2。
     本 文 所 用 術 語 ″ COX-2 抑 制 劑 ″ 指 抑 制 COX-2 酶 相 對 優 先 于 COX-1 酶 的 非 甾體類藥物。優選 COX-2 抑制劑實例包括但不限于 : 塞來考昔 (celecoxib)、 帕瑞考昔 (parecoxib)、 羅非考昔 (rofecoxib)、 伐地考昔 (valdecoxib)、 美洛昔康 (meloxicam) 和依 托考昔 (etoricoxib)。 在某些實施方案中, 抗血管生成劑選自 : TNP-470、 紫杉醇、 針對特異性的促血管 生成因子和 / 或其受體的單克隆抗體 ( 例如阿瓦斯丁、 艾比特思、 維克替比、 曲妥單抗 ) ; 多種促血管生成生長因子受體的小分子酪氨酸激酶抑制劑 ( 例如它塞瓦、 多吉美、 索坦、 易 瑞沙 ) ; mTOR 的抑制劑 ( 哺乳動物雷帕霉素靶標 )( 例如馱瑞塞爾 ) ; 干擾素 α、 β和γ; IL-12 ; 基質金屬蛋白酶 (MMP) 抑制劑 ( 例如 COL3、 馬立馬司他、 巴馬司他 ) ; EMD121974( 西 侖吉肽 ) ; Vitaxin ; 角鯊胺 ; COX-2 抑制劑 ; PDGFR 抑制劑 ( 例如格列衛 ) ; NM3 ; 和 2-ME2。
     在某些實施方案中, 抗血管生成劑為紫杉醇。
     微管干擾劑紫杉醇為常用于治療晚期轉移性乳腺癌的藥物。 然而, 它毒害神經, 引 起血液學毒性, 并且很多乳腺腫瘤對其發展出抗性。最近顯示超低劑量的紫杉醇抑制血管 生成。然而, 紫杉醇溶解性差, 現在用來溶解其商用形式的賦形劑克列莫佛 EL 或乙醇引發
     超敏反應。
     本文注意到盡管某些抗血管生成劑表現出抗腫瘤活性, 但本發明實施方案包括那 些可經由抑制血管生成起作用的抗腫瘤藥物。
     本文所用短語″骨靶向部分″闡述體內給予后能夠優先在硬組織 ( 即骨組織 ) 而 不是任何其它器官或組織聚積的部分。
     二膦酸鹽 (BP) 例如阿倫膦酸鹽是具有與無機焦磷酸鹽 (PPi) 相似結構的化學結 構的化合物, 所述無機焦磷酸鹽是骨礦物化的內生調節劑。在生理條件下對骨礦物表現出 強親和力的二膦酸鹽的藥代動力學概況、 其低毒性和抗血管生成活性 ( 通常以其相當高的 濃度時表現出 ), 都有利于靶向限定在骨組織中的腫瘤。
     因此, 本文所述骨靶向部分為包含至少兩個膦酸鹽 (-P( = O)(OH)2) 基團和任選 其它官能團的化合物。
     例示性化合物具有如本文所定義的以下通式化合物或其藥學可接受鹽 :
     其中 R1 和 R2 各自獨立選自氫、 取代或未取代烷基、 取代或未取代環烷基、 取代或未 取代芳基、 取代或未取代雜芳基、 取代或未取代雜脂環、 鹵素、 羥基、 硫醇基、 烷氧基、 硫代烷 氧基、 芳氧基和硫代芳氧基, 其如下文所定義。
     在某些實施方案中, R1 和 R2 中至少一個為烷基、 環烷基、 芳基、 雜芳基或雜脂環, 其 任選如本文所定義被取代。
     在某些實施方案中, 烷基、 環烷基、 芳基、 雜芳基或雜脂環被如本文所定義的反應 性基團例如胺、 羥基、 硫醇基、 鹵素、 羧酸酯等取代, 這使得其可與聚合物主鏈上的相容的反 應性基團綴合。
     在某些實施方案中, R1 和 R2 中至少一個為羥基, 另一個為烷基、 環烷基、 芳基、 雜芳 基或雜脂環, 其如本文所述。
     在某些實施方案中, R1 為羥基, R2 為以氨基基團為末端的烷基。所述烷基在其主 鏈上可有 1-6 個碳原子。
     適用于本發明實施方案情況的例示性二膦酸鹽骨靶向部分包括但不限于 : 阿倫膦 酸鹽、 英卡膦酸鹽、 氯膦酸鹽、 替魯膦酸鹽、 依替膦酸鹽、 伊班膦酸鹽、 奈立膦酸鹽、 奧帕膦酸 鹽、 利塞磷酸鹽 (risedronate)、 吡利膦酸鹽、 帕米膦酸鹽和唑來膦酸鹽。
     在某些實施方案中, 骨靶向部分為阿倫膦酸鹽 (4- 氨基 -1- 羥基亞丁基 ) 二膦 酸):
     本文術語″阿倫膦酸鹽″和″二膦酸鹽″包括其任何藥學可接受鹽、 溶劑化物和 / 或水合物, 其如下文所定義。
     如上所述, 本發明人業已讓阿倫膦酸鹽與聚合物主鏈連同紫杉醇綴合, 通過提高 綴合物與羥基磷灰石 ( 作為模擬骨組織的模型 ) 的結合證明獲得的聚合綴合物的靶向骨的 能力 ( 圖 3)。亦證明所述綴合物在治療骨癌轉移小鼠模型中的有益的治療活性 ( 圖 11)。
     在某些實施方案中, 本文所述聚合綴合物由聚合物主鏈組成, 所述主鏈由多個彼 此共價連接的主鏈單元形成, 其中這種多個主鏈單元中至少一部分有連接在其上的本文所 述抗血管生成劑, 多個主鏈單元中至少另一部分有連接在其上的骨靶向部分 ( 本文所述二 膦酸鹽 )。
     那些具有連接在其上的抗血管生成劑的主鏈單元和那些具有連接在其上的二膦 酸鹽的主鏈單元可在聚合物主鏈內隨機分散。
     聚合物主鏈可進一步包括如下文所述的非功能化的主鏈單元, 所述主鏈單元上未 連接抗血管生成劑及二膦酸鹽或任何其它作用劑。
     在某些實施方案中, 所述綴合物的聚合物主鏈構成聚合物 ( 或共聚物 ), 在其上連 接有抗血管生成劑和骨靶向部分。
     適用于本發明實施方案情況的聚合物為生物相容、 無免疫原性和無毒的。將所述 聚合物用作載體, 所述載體可能由于上文所述的 EPR 作用能夠特異性遞送到腫瘤組織。
     本文所用術語″聚合物″闡述由多個彼此共價連接的重復結構單元 ( 主鏈單元 ) 組成的有機物質。本文所用術語 “聚合物” 包括有機聚合物和無機聚合物, 并進一步包括一 種或多種同型聚合物、 共聚物或其混合物 ( 混合品 )。 本文所用術語″同型聚合物″闡述由 一種類型的單體單元構成并因此由同型主鏈單元組成的聚合物。 本文所用術語″共聚物″ 闡述由不止一種類型的單體單元構成并因此由異型主鏈單元組成的聚合物。 異型主鏈單元 可因其所附的基團而彼此不相同。
     所述聚合物由主鏈單元組成, 所述主鏈單元通過讓相應的單體單元聚合形成, 藉 此讓抗血管生成劑和骨靶向部分與這些主鏈單元的至少部分連接。 這些主鏈單元中某些或 全部通常在綴合前功能化, 以使具有用于連接抗血管生成劑和骨靶向部分的反應性基團。 那些未功能化和 / 或不參與綴合抗血管生成劑和骨靶向部分的主鏈單元本文稱之為″游 離″主鏈單元。
     聚合物可為生物穩定的聚合物、 生物可降解聚合物或其組合。本發明實施方案情 況中所用的術語″生物穩定的″, 闡述了在生理條件下保持完整的化合物或聚合物 ( 例如 在體內不降解 )。
     術語″生物可降解″闡述在生理條件下和 / 或環境條件下可分解為裂解產物的 物質。所述生理條件和 / 或環境條件包括例如水解 ( 經由水解裂解分解 )、 酶催化作用 ( 酶
     降解 ) 和機械作用。 該術語通常指在這些條件下分解從而在短于一年的時間內分解 50%重 量的物質。
     本發明實施方案情況中所用術語″生物可降解″亦包括術語″生物可再吸收″, 其闡述在生理條件下分解裂解為經歷生物再吸收到宿主的產物的物質, 也就是說, 分解產 物成為宿主 - 生物體生化系統中的代謝物。
     所述聚合物可為水溶性或不溶于水。在某些實施方案中, 聚合物在室溫下為水溶 性。
     聚合物可進一步為帶電荷聚合物或不帶電荷聚合物。 帶電荷聚合物可為陽離子聚 合物, 其具有正電荷基團并在生理 pH 時帶凈正電荷 ; 或為陰離子聚合物, 其具有負電荷基 團, 并在生理 pH 時帶凈負電荷。不帶電荷聚合物可具有在生理 pH 時為中性凈電荷的正電 荷和負電荷基團, 或可不帶電荷。
     在某些實施方案中, 所述聚合物具有在 100Da-800kDa 范圍的平均分子量。在某些 實施方案中, 聚合物具有小于 60kDa 的平均分子量。在某些實施方案中, 聚合物的平均分子 量介于 15-40kDa 之間。
     具有高于 10kDa 分子量的聚合物質通常表現出本文所述的 EPR 作用, 同時具有 100kDa 及更高分子量的聚合物質具有相對長的血漿半衰期和低效率的腎清除。因此, 當考 慮血漿半衰期和腎清除率及綴合物在腫瘤中聚積時可確定聚合綴合物的分子量。
     至少在某種程度上可通過聚合 ( 或共聚合 ) 程度來控制聚合物分子量。
     本發明實施方案情況中所用聚合物可為合成聚合物或天然存在的聚合物。 在某些 實施方案中, 所述聚合物為合成聚合物。
     本文所述聚合物的聚合主鏈可源自例如聚丙烯酸酯、 聚乙烯、 聚酰胺、 聚脲烷、 聚 亞胺、 聚糖、 聚肽、 聚羧酸酯及其混合物。
     適用于本發明實施方案情況的例示性聚合物包括但不限于 : 右旋糖苷、 水溶性聚 氨基酸、 聚乙二醇 (PEG)、 聚谷氨酸 (PGA)、 聚乳酸 (PLA)、 聚乳酸 - 乙醇酸共聚物 (PLGA)、 聚 (D, L- 丙交酯 - 乙交酯共聚物 )(PLA/PLGA)、 聚 ( 羥基烷基甲基丙烯酰胺 )、 聚丙三醇、 聚酰 氨基胺 (PAMAM) 和聚乙烯亞胺 (PEI)。
     這些聚合物可如本文所述為任何分子量。
     在某些實施方案中, 聚合物主鏈源自聚 ( 羥基烷基甲基丙烯酰胺 ) 或其共聚物。 所 述聚合物主鏈包含甲基丙烯酰胺主鏈單元, 所述主鏈單元具有連接在其上的 2- 羥基丙基, 或所述 2- 羥基丙基可通過在其上連接 ( 直接或間接 ) 本文所述部分 ( 例如二膦酸鹽和抗 血管生成劑 ) 來進行修飾。
     聚 ( 羥基烷基甲基丙烯酰胺 )(HPMA) 聚合物是一類水溶性合成聚合載體, 其可全 面地表征為生物相容、 無免疫原性和無毒。HPMA 聚合物相對于其它水溶性聚合物的一個優 點是, 它們可通過相對簡單的化學修飾來裁制, 以便調整其各自藥物及靶向部分的含量。 另 外, 可操控這些聚合物的分子量和電荷以便腎清除并從身體排泄, 或以便改變生物分布同 時允許靶向腫瘤。
     應該理解, 本文討論的聚合物闡述了以下聚合物 : 由同型或異型非功能化單體單 元形成的聚合物 ; 和構成聚合綴合物的聚合主鏈通過由相同的單體單元組成從而對應于所 述聚合物, 同時這些單體單元中若干如本文所述被功能化。 因此, 所述聚合綴合物的聚合主鏈與本文所述聚合物相似, 并通過使上述作用劑連接在其中的一些主鏈單元上而與所述聚 合物不同。
     在每一個本文所述綴合物中, 骨靶向部分和抗血管生成劑各自可直接或間接通過 接頭部分 ( 本文亦稱為接頭、 接頭基團或連接基團 ) 與聚合物主鏈的主鏈單元各部分連接, 因此, 在某些實施方案中, 將直接 / 間接連接設計為在表征所期望的身體位點條件下可裂 解 ( 例如通過某些酶或 pH), 其如下文所述。
     因此, 根據本發明某些實施方案, 至少一種抗血管生成劑和骨靶向部分經由接頭 與聚合物連接。在某些實施方案中, 抗血管生成劑和骨靶向部分各自經由接頭與聚合物連 接。連接抗血管生成劑與聚合物的接頭和連接骨靶向部分與聚合物的接頭可相同或不同。
     本文所述接頭指起讓抗血管生成劑和 / 或骨靶向部分與聚合物主鏈偶聯的作用 而對骨靶向部分的靶向功能或抗血管生成劑的治療作用無有害影響的化學部分。
     在某些實施方案中, 接頭為生物可降解接頭。
     本文所用短語″生物可降解接頭″闡述當暴露在生理條件時能夠被降解或裂解 的接頭。所述生理條件可為例如 pH、 某些酶等。
     在某些實施方案中, 接頭能夠被預先選擇的細胞酶裂解, 例如在造骨細胞、 破骨細 胞、 癌細胞溶酶體或增殖的內皮細胞中發現的那些酶。 或者, 酸可水解的接頭可包含酯或酰 胺連接, 例如順 - 烏頭基連接。通過允許僅在所需身體位點釋放抗血管生成藥物和 / 或阿 倫膦酸鹽, 所述接頭進一步提高本文所述綴合物的治療活性并降低其毒性。
     因此, 根據某些實施方案, 生物可降解接頭為 pH- 敏感的接頭或酶可裂解的接頭。
     pH- 敏感的接頭包含僅在遭受到某種 pH 條件例如酸性 pH( 例如低于 7)、 中性 pH(6.5-7) 或堿性 pH( 高于 7) 時被裂解或降解的化學部分。
     可例如將所述接頭設計為在酸性或堿性條件下經歷水解, 因此, 在所述綴合物未 到達 pH 分別為酸性或堿性的生理環境之前, 將會在身體內保持完整, 不釋放連接在聚合物 上的作用劑。
     例示性 pH- 敏感的接頭包括但不限于 : 腙鍵、 酯 ( 包括原酸酯 ) 鍵、 順 - 烏頭殘基 酰胺鍵、 三苯甲基、 乙縮醛、 縮酮、 Gly- 酯和 -[Gly-Phe-Gly]- 部分。
     在某些實施方案中, 生物可降解接頭為酶可裂解的接頭 .
     通常將所述接頭設計為包括 ( 通常但并非排它地 ) 被預先選擇的酶識別的氨基酸 序列的化學部分。本文通常稱所述氨基酸序列為″識別基序″。包含所述接頭的綴合物在 其環境中缺乏預先選擇的酶時通常基本上保持完整, 因此不會在與所述酶接觸之前裂解或 降解以釋放連接在其上的作用劑。
     在某些實施方案中, 酶可裂解接頭通過在腫瘤組織中表達的酶來裂解。在某些實 施方案中, 酶可裂解接頭通過在腫瘤組織中過表達的酶來裂解。包含所述接頭的綴合物確 保例如大量綴合的抗血管生成劑僅在腫瘤組織中從綴合物釋放, 因此降低了與非選擇性給 予藥物有關的副作用, 并進一步提高腫瘤位點的藥物濃度。
     適用于本發明實施方案情況的例示性酶包括但不限于組織蛋白酶 B、 組織蛋白酶 K、 組織蛋白酶 D、 組織蛋白酶 H、 組織蛋白酶 L、 legumain、 MMP-2 和 MMP-9。
     合適的接頭包括但不限于烷基鏈 ; 任選用一個或多個取代基取代的烷基鏈并其中 一個或多個碳原子任選被氮、 氧和 / 或硫雜原子間隔開。其它合適的接頭包括氨基酸和 / 或寡肽。
     所述烷基鏈和 / 或寡肽可任選功能化以使其與藉此連接的部分 ( 例如聚合物主鏈 和骨靶向部分、 聚合物主鏈和抗血管生成劑 ) 共價結合。所述功能化可包括納入或產生參 與所述共價結合的反應性基團, 其如下文所詳述。
     在某些實施方案中, 接頭為含有例如 2-10 個氨基酸殘基的生物可降解寡肽基團。
     在某些實施方案中, 接頭為組織蛋白酶 B- 可裂解接頭。
     組織蛋白酶 B 為在表皮腫瘤細胞和內皮腫瘤細胞中都過表達的溶酶體酶。合適的 接頭具有組織蛋白酶 -B 可裂解位點, 包括例如但不限于以下氨基酸序列 : -[Arg]-、 -[CitVal]--[Arg-Arg]-、 -[Phe-Lys]-、 [Gly-Phe-Leu-Gly]、 -[Gly-Phe-Ala-Leu]- 和 -[Ala-LeuAla-Leu]-、 -[Gly-Leu-Gly]-、 -[Gly-Phe-Gly]-、 -[Gly-Phe-Leu-Gly-Phe-Lys]- 及其組合。
     在 某 些 實 施 方 案 中,接 頭 包 含 氨 基 酸 序 列 -[Gly-Leu-Gly]-、 -[GlyPhe-Gly]- 、-[Gly-Leu-Phe-Gly]- 、-[Gly-Phe-Leu-Gly]- 、-[Phe-Lys]- 和 / 或 -[Gly-Phe-Leu-Gly-Phe-Lys]-。
     在某些實施方案中, 接頭為 -[Gly-Phe-Leu-Gly-Phe-Lys]-。 所述接頭包含組織蛋 白酶 B 的兩個″識別基序″及其裂解, 以使其僅在高酶濃度存在下實現釋放連接在其上的 部分。這種特點提高了連接部分在過表達酶的位點的選擇性釋放。
     在某些實施方案中, 接頭為 -[Gly-Phe-Leu-Gly]-。
     如下文實施例章節所證明, 使用的組織蛋白酶 B 可裂解接頭為 -[Gly-Phe-Leu-G ly-Phe-Lys]- 和 -[Gly-Phe-Leu-Gly]-, 其讓紫杉醇和阿倫膦酸鹽與 HPMA 連接 ( 參見圖 1)。 -[Gly-Phe-Leu-Gly-Phe-Lys]- 六肽不與紫杉醇藥物而與碳酸對氨基苯甲酯 (PABC) 間 隔基直接連接, 如下文所詳述。圖 1 所示為組織蛋白酶 B 裂解綴合物的示意圖, 藉此組織蛋 白酶 B 在以下位點裂解 HPMA 共聚物 - 紫杉醇 -FK-ALN 綴合物 : (1) 紫杉醇 - 六肽接頭的兩 個酰胺鍵 ( 在 Gly-Phe-Leu-Gly 和 Phe-Lys 氨基酸之間和 Phe-Lys 和 PABC 之間 ) ; 和 (2) ALN 四肽接頭的酰胺鍵 (Gly-Phe-Leu-Gly)。組織蛋白酶 B 的裂解產物為 PABC- 紫杉醇和 ALN。通過自發的 1, 6- 苯甲基消除從 PABC- 紫杉醇獲得最終產物游離紫杉醇, 其如下文所 詳述。
     應該理解, 本文稱為 HPMA 共聚物 - 紫杉醇 -FK-ALN 綴合物的聚合綴合物包含源自 HPMA 單體單元的聚合物主鏈, 而紫杉醇和阿倫膦酸鹽二者都經由組織蛋白酶 B- 生物可降 解接頭與所述聚合物主鏈連接, 由此紫杉醇經由包含 -[Phe-Lys]-( 稱為 FK) 的接頭與聚合 物主鏈連接。
     經由組織蛋白酶 B 依賴的機理從綴合物釋放紫杉醇為以下實施例章節所證明。具 體地, HPMA 共聚物 - 紫杉醇 -FK-ALN 綴合物與組織蛋白酶 B 孵育, 從所述綴合物釋放紫杉醇 的程度增加與組織蛋白酶 B 孵育時間相關 ( 圖 4)。 此外, 當紫杉醇經由不能為組織蛋白酶 B 識別的接頭序列 (GGGG) 與 HPMA 共聚物綴合時, 與具有被組織蛋白酶 B 裂解的接頭 (GGFK ; 參見圖 6) 的對應綴合物比較, 紫杉醇抗 HUVEC 的抗增殖的活性顯著降低。當加入組織蛋白 酶 B 抑制劑時綴合物的抗增殖活性降低, 這進一步證明了組織蛋白酶 B 與紫杉醇從綴合物 的釋放有關 ( 圖 7)。
     在某些實施方案中, 酶可裂解接頭被組織蛋白酶 K 裂解。
     組織蛋白酶 K 是參與骨重建和再吸收的溶酶體半胱氨酸蛋白酶, 主要在破骨細胞中表達。 組織損傷后及骨瘤中釋放的炎性細胞因子刺激其表達 [Pan 等 2006, J Drug Target 14 : 425-435 ; Husmann 等 2008, Mol Carcinog 47 : 66-73]。
     具有組織蛋白酶 K 可裂解位點的接頭的非限制性實例為 -[Gly-Gly-Pro-Nle]
     亦可構建含有預先選擇的氨基酸序列 ( 識別基序 ) 的寡肽接頭, 以使該識別基序 在接頭中重復若干次, 因此提高所連接的作用劑的選擇性釋放。亦可將相同或不同酶的不 同的識別基序納入到接頭中。同樣地, 接頭可包含多個 pH 敏感的鍵或部分。包含所述多個 可裂解位點的接頭可提高抗血管生成劑在所需身體位點的選擇性釋放, 因此降低有害副作 用, 并在其展現其活性時進一步提高所釋放的藥物在身體位點的相對濃度。
     在抗血管生成劑和 / 或骨靶向部分直接與聚合物結合的情況下, 連接這些部分的 鍵亦可為可生物降解的, 例如為酶可裂解的鍵或 pH- 敏感的鍵。所述鍵可在聚合物、 骨靶向 部分和 / 或抗血管生成劑功能化后形成, 以便包括用于形成所需鍵的相容的反應性基團。
     肽接頭亦可包括起增加接頭長度作用的肽序列。 由于較長肽的接頭與裂解酶的空 間相互作用更有效, 較長的肽可能有利。
     在某些實施方案中, 抗血管生成劑經由間隔基與聚合物主鏈或與接頭連接。在某 些實施方案中, 骨靶向部分經由間隔基與聚合物主鏈或與接頭連接。 間隔基可相同或不同。
     本文所用術語″間隔基″, 闡述與聚合物主鏈和接頭、 抗血管生成劑和 / 或骨靶 向部分共價連接并插入它們之間因此在聚合物主鏈和抗血管生成劑和 / 或骨靶向部分之 間形成橋樣結構的化學部分。或者, 間隔基可與接頭和抗血管生成劑和 / 或骨靶向部分共 價連接并插入它們之間。
     合適的間隔基包括但不限于亞烴基鏈, 其任選被一個或多個取代基取代, 其任選 被一個或多個氮、 氧和 / 或硫雜原子間隔開。
     其它合適的間隔基包括氨基酸和氨基酸序列, 任選用一種或多種用于讓聚合物主 鏈 / 抗血管生成劑 / 骨靶向部分 / 接頭偶聯的反應性基團功能化。
     在某些實施方案中, 間隔基具有式 G-(CH2)n-K, 其中 n 為 1-10 的整數 ; 和G和K各 自為反應性基團, 例如 NH、 O 或 S。在某些實施方案中, G 和 K 各自為 NH, n 為 2。
     在某些實施方案中, 間隔基為氨基酸序列, 任選為惰性氨基酸序列 ( 即不影響綴 合物的親和力或選擇性 )。可將所述間隔基用于延長接頭或使接頭功能化。
     在某些情況中, 從空間考慮 ( 為聚合物提供使偶聯阻礙更小的位點 ) 或化學反應 性考慮 ( 將相容的反應性基團加到實現偶聯的聚合物位點 ) 方面來說, 使用間隔基是為了 使骨靶向部分和 / 或抗血管生成劑與聚合物主鏈或接頭的連接更有效并更簡單。在某些情 況下, 間隔基可有助于所得到的綴合物的性能。 例如, 間隔基可使酶可裂解間隔基的空間阻 礙更小, 因此更易于酶相互作用。
     在某些情況中, 使用間隔基是為了通過例如改變間隔基所連接的抗血管生成劑和 / 或骨靶向部分的溶解性 ( 即更為疏水或更為親水 ), 使綴合物的合成更有效并更簡單。
     在某些實施方案中, 間隔基為可降解間隔基, 其能夠經受降解反應, 以釋放連接在 其上的作用劑。在某些實施方案中, 間隔基如本文所定義為生物可降解的。
     間隔基可為例如 : 取代或未取代環烷基、 取代或未取代雜脂環族基團、 取代或未取 代芳基和取代或未取代雜芳基 ; 其中取代基可為例如 : 羥基、 烷氧基、 硫代羥基、 硫代烷氧 基、 氰基、 硝基、 羰基、 硫代羰基、 C- 羧基、 O- 羧基、 O- 氨基甲酰基、 N- 氨基甲酰基、 O- 硫代氨基甲酰基、 N- 硫代氨基甲酰基、 亞磺酰基、 磺酰基、 C- 酰氨基、 N- 酰氨基、 氨基和 NRaRb, 其中 Ra 和 Rb 各自獨立為氫、 烷基、 環烷基、 芳基、 羰基、 磺酰基、 三鹵代甲基磺酰基, 當合在 一起時表示 5- 或 6- 元雜脂環, 藉此間隔基可直接通過環基團或經由一種或多種取代基與 抗血管生成劑 / 骨靶向部分 / 接頭 / 聚合物連接。
     術語″烷基″闡述包括直鏈和支鏈基團的飽和脂肪族烴。優選地, 烷基具有 1-20 個碳原子。 本文任何時候指定數值范圍例如″ 1-20″時, 意即該基團 ( 在本情況下為烷基 ) 可含有 1 個碳原子、 2 個碳原子、 3 個碳原子等至多包括 20 個碳原子。 在某些實施方案中, 烷 基具有 1-10 個碳原子。在某些實施方案中, 烷基具有 1-4 個碳原子。例示性烷基包括但不 限于甲基、 乙基、 丙基、 丁基、 戊基、 己基、 庚基、 辛基、 壬基、 癸基、 十一烷基、 十二烷基、 十三 烷基、 十四烷基、 十五烷基、 十七烷基、 十八烷基和十九烷基。
     術語″環烷基″闡述全碳單環或稠環 ( 即共享相鄰碳原子對的環 ) 基團, 其中一 個或多個環不具有完全共軛的 π 電子系統。環烷基的非限制性實例有環丙烷、 環丁烷、 環 戊烷、 環戊烯、 環己烷、 環己二烯、 環庚烷、 環庚三烯和金剛烷。
     術語″芳基″闡述全碳單環或稠環多環 ( 即共享相鄰碳原子對的環 ) 基團, 其具 有完全共軛的 π 電子系統。芳基的非限制性實例有苯基、 萘基和蒽基。芳基可被取代或不 被取代。
     術語″雜芳基″闡述環中具有一種或多種原子并另外具有完全共軛的 π 電子系 統的單環或稠環 ( 即共享相鄰碳原子對的環 ) 基團, 所述原子例如氮、 氧和硫。雜芳基的非 噻唑、 吡唑、 吡啶、 嘧啶、 喹啉、 異喹啉和嘌呤。 限制性實例包括吡咯、 呋喃、 噻吩、 咪唑、 唑、 術語″雜脂環″闡述環中具有一種或多種原子的單環或稠環基團, 所述原子例如 氮、 氧和硫。所述環亦可具有一個或多個雙鍵。然而, 所述環不具有完全共軛的 π 電子系 統。
     術語″羥基″闡述 -OH 基。
     術語″烷氧基″如本文所定義闡述 -O- 烷基和 -O- 環烷基兩者。
     術語″硫醇″闡述 -SH 基。
     術語″硫代烷氧基″闡述 -S- 烷基和 -S- 環烷基兩者, 其中烷基和環烷基如本文 所定義。
     術語″氰基″闡述 -C ≡ N 基團。
     術語″羰基″闡述 -C( = O)-R′基團, 其中 R′為如本文所定義的氫、 烷基、 環烷 基、 芳基、 雜芳基 ( 通過環碳鍵合 ) 或雜脂環 ( 通過環碳鍵合 )。
     術語″硫代羰基″闡述 -C( = S)-R′基團, 其中 R′如本文所定義。
     術語″ O- 氨基甲酰″闡述 -OC( = O)-NR′ R″基團, 其中 R′如本文所定義, R″ 為如本文所定義的氫、 烷基、 環烷基、 芳基、 雜芳基 ( 通過環碳鍵合 ) 或雜脂環 ( 通過環碳鍵 合 )。
     術語″ N- 氨基甲酰″闡述 R′ OC( = O)-NR″ - 基團, 其中 R′和 R″如本文所定 義。
     術語″ O- 硫代氨基甲酰″闡述 -OC( = S)-NR′ R″基團, 其中 R′和 R″如本文 所定義。
     術語 “N- 硫代氨基甲酰” 闡述 R″ OC( = S)NR′ - 基團, 其中 R′和 R″如本文所
     定義。 術語″ C- 酰氨基″闡述 -C( = O)-NR′ R″基團, 其中 R′和 R″如本文所定義。
     術語″ N- 酰氨基″闡述 R′ C( = O)-NR″基團, 其中 R′和 R″如本文所定義。
     術語″ C- 羧基″闡述 -C( = O)-O-R′基團, 其中 R′如本文所定義。
     術語″ O- 羧基″闡述 R′ C( = O)-O- 基團, 其中 R′如本文所定義。
     術語″硝基” 闡述 -NO2 基團。
     術語″氨基” 闡述 -NH2 基團。
     術語″磺酰基” 闡述 -S( = O)2-R′基團, 其中 R′如本文所定義。
     術語″鹵素″或″鹵代″闡述氟、 氯、 溴或碘原子。
     在某些實施方案中, 間隔基為取代或未取代芳基和取代或未取代雜芳基, 藉此取 代基可為碳酸鹽、 C- 酰氨基、 N- 酰氨基和胺, 藉此間隔基可直接通過芳香族基團或經由一 種或多種取代基與抗血管生成劑 / 骨靶向部分 / 接頭 / 聚合物連接。
     在某些實施方案中, 間隔基為所選擇的可降解間隔基, 由此在其從聚合綴合物裂 解后經受自發降解。
     所述間隔基可例如在一端與生物可降解接頭連接, 在另一端與抗血管生成劑或骨 靶向部分連接, 由此當生物可降解接頭被裂解以釋放間隔基和連接在其上的部分時, 所述 間隔基經受自發降解以釋放連接在其上的部分。
     經受所述自發降解的例示性間隔基包括但不限于可經由分解性電子反應級聯經 受自發 1, 4-、 1, 6-、 1, 8- 等消除的化學部分。所述化學基團為本領域已知, 或另外可由本領 域技術人員設計。
     在例示性實施方案中, 間隔基可經受自發 1, 6- 苯甲基消除。所述間隔基實例為碳 酸對氨基苯甲酯 (PABC)。
     在某些實施方案中, 間隔基促進抗血管生成劑或骨靶向部分與聚合物主鏈或接頭 的連接。這可通過給予所述待連接的部分反應性基團來實現, 所述反應性基團與聚合物主 鏈和 / 或連接在聚合物主鏈上的接頭上的官能團化學上相容, 和 / 或通過改變連接到聚合 物的部分的溶解性以促進聚合物 ( 或共聚物 ) 與所述部分之間的反應來實現。
     例如, 在某些情況中, 由聚合物主鏈構成的聚合物為水溶性聚合物, 而抗血管生成 劑疏水, 因此在水溶液或在極性有機溶劑中的溶解性有限。 在這種情況下, 可讓間隔基與抗 血管生成劑連接以提高其水溶性并促進其在水溶液或質子或極性有機溶劑中與聚合物綴 合。
     如 上 所 述,本 發 明 人 使 用 碳 酸 對 氨 基 苯 甲 酯 (PABC) 間 隔 基 通 過 -[Gly-Phe-Leu-Gly-Phe-Lys]- 接頭讓紫杉醇與 HPMA 聚合物連接 ( 參見圖 1)。如進一 步所述, 在組織蛋白酶 B 裂解綴合物時, 釋放 PABC- 紫杉醇, 并通過自發的 1, 6- 苯甲基消除 從 PABC- 紫杉醇獲得游離紫杉醇最終產物。
     因此, 所述 PABC 間隔基起以下兩種作用 : (i) 促進紫杉醇與接頭連接 ; 和 (ii) 使 得可在生物降解接頭后接著降解間隔基來自發釋放紫杉醇。
     間隔基亦可用于讓其它作用劑 ( 例如下文所述標記物質 ) 與綴合物連接。
     間隔基的長度和組成可視空間考慮而變化, 其可用于將抗血管生成劑和 / 或骨靶 向部分與聚合物主鏈間隔開。
     在 某 些 實 施 方 案 中, 本 文 所 述 綴 合 物 的 抗 血 管 生 成 劑 為 紫 杉 醇, 其通過接 頭 -[Gly-Phe-Leu-Gly-Phe-Lys]- 與源自 HPMA 的聚合物主鏈連接, 所述聚合物主鏈經 由 -[Gly-Phe-Leu-Gly]- 接頭與骨靶向部分連接。在某些實施方案中, 骨靶向部分為阿倫 膦酸鹽。
     本文短語″聚合物上的裝載″或簡單地″裝載″用于闡述與本文所述綴合物的 聚合物主鏈連接的作用劑的量, 在本文中通過綴合物中該作用劑的摩爾%來代表, 其如下 文所定義。
     本文所用術語″摩爾%″闡述每 1 摩爾聚合綴合物的連接部分的摩爾數量乘以 100。
     因此, 例如 1 摩爾%裝載的骨靶向部分闡述由 100 個主鏈單元組成的聚合綴合物, 其中 1 個主鏈單元具有連接在其上的靶向部分, 另外 99 個主鏈單元為游離或具有連接在其 上的其它作用劑。
     憑經驗確定給定綴合物和給定用途的抗血管生成劑和骨靶向部分的最佳裝載度, 其基于所需的綴合物的性質 ( 例如水溶解性、 治療功效、 藥代動力學性質、 毒性和給藥需 求 ) 并任選基于可與所選合成途徑中聚合物主鏈連接的綴合的部分的量。
     可通過本領域技術人員眾所周知的方法測量%裝載, 其中某些方法如以下實施例 的材料與方法項下所述。
     在某些實施方案中, 聚合物中抗血管生成劑的裝載大于 1 摩爾%。
     在某些實施方案中, 綴合物中抗血管生成劑的裝載介于 1 摩爾% -99 摩爾%、 1摩 爾% -50 摩爾%、 1 摩爾% -20 摩爾%、 1 摩爾% -10 摩爾%或 1 摩爾% -5 摩爾%之間。
     在某些實施方案中, 骨靶向部分的裝載大于 1 摩爾%。
     在某些實施方案中, 綴合物中骨靶向部分的裝載介于 1 摩爾% -99 摩爾%、 1摩 爾% -50 摩爾%、 1 摩爾% -20 摩爾%、 1 摩爾% -10 摩爾%或 1 摩爾% -5 摩爾%之間。
     本文將具有綴合在其上的抗血管生成劑的聚合物主鏈內的主鏈單元數量闡述 為″ y″, 將具有綴合在其上的骨靶向部分的聚合物主鏈內的主鏈單元數量闡述為″ w″, 本文將聚合物主鏈內的游離主鏈單元 ( 未與其它部分結合 ) 的數量闡述為″ x″。
     因此, 在某些實施方案中, 本文所述綴合物可由通式 I 代表 :
     [A1]x[A2-L1-B]y[A3-L2-D]w
     式I
     其中 :
     x 為具有使 x/(x+y+w) 乘以 100 在 0.01-99.9 范圍內的值的整數 ;
     y 為具有使 y/(x+y+w) 乘以 100 在 0.01-99.9 范圍內的值的整數 ; 和
     w 為具有使 w/(x+y+w) 乘以 100 在 0.01-99.9 范圍內的值的整數 ;
     A1、 A2 和 A3 為彼此共價連接的各個主鏈單元, 其形成聚合物主鏈, 其中 :
     B 為上文定義的抗血管生成劑 ;
     D 為上文定義的骨靶向部分 ; 和
     L1 和 L2 各自獨立為上文定義的接頭 ;
     由此 [A2-L1-B] 為具有連接在其上的抗血管生成劑的主鏈單元 ; 和
     [A2-L2-D] 為具有連接在其上的骨靶向部分的主鏈單元 ;其中 [A1]、 [A2-L1-B] 和 [A3-L2-D] 各自為與 [A1]、 [A2-L1-B] 和 [A3-L2-D] 中的一種 連接的末端主鏈單元, 或與 [A1]、 [A2-L1-B] 和 [A3-L2-D] 中的至少兩種連接, A1、 A2 和 / 或 A3 彼此連接而形成聚合物主鏈。
     在其中綴合物的聚合物主鏈源自 HPMA 的實施方案中, A1 為羥基丙基甲基丙烯酰胺 單元 ; A2 和 A3 各自為甲基丙烯酰胺單元。
     在某些實施方案中, 本文所述綴合物可由通式 II 代表 :
     式 II 其中 y、 w 和 x 如本文所定義。 在某些實施方案中, 綴合物具有以下結構 :其中 y、 w 和 x 如本文所定義。
     根據本發明某些實施方案, x 為具有使 x/(x+y+w) 乘以 100 在 70-99.9 范圍內的 值的整數 ; y 為具有使 y/(x+y+w) 乘以 100 在范圍內的值的整數 0.01-15 ; 和 w 為具有使 w/ (x+y+w) 乘以 100 在 0.01-15 范圍內的值的整數。
     例 如, x/(x+y+w) 乘 以 100 可 為 71、 72、 73、 74、 75、 76、 77、 78、 79、 80、 81、 82、 83、 84、 85、 86、 87、 88、 89、 90、 91、 92、 93、 94、 95、 96、 97、 98、 99 或 99.9 ; y/(x+y+w) 乘 以 100 可 為 0.01、 0.02、 0.03、 0.04、 0.05、 0.1、 0.2、 0.3、 0.4、 0.5、 0.6、 0.7、 0.8、 0.9、 1、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10、 11、 12、 13、 14 或 15 ; 和 w/(x+y+w) 乘 以 100 可 為 0.01、 0.02、 0.03、 0.04、 0.05、 0.1、 0.2、 0.3、 0.4、 0.5、 0.6、 0.7、 0.8、 0.9、 1、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10、 11、 12、 13、 14 或 15。
     應該理解, 可通過選擇用于形成下文所述的聚合綴合物的各種單體單元的摩爾比 率, 來按需控制 x、 y 和 w。
     根據某些實施方案, 本文所述綴合物進一步包含連接在其上的標記物質。
     標記物質與綴合物的連接使得能利用這些綴合物來監測骨相關疾病或病癥, 例如 監測本文所述綴合物表現的治療效果。
     本文所用短語″標記物質″闡述可檢測部分或探針。 適用于這些實施方案情況的 例示性標記物質包括但不限于 : 熒光劑、 放射性試劑、 磁化劑、 發色團、 生物發光劑、 化學發 光劑、 磷光劑和重金屬團簇。
     短語″放射性試劑″闡述通過發射電離粒子及輻射失去能量 ( 衰減 ) 的物質 ( 即 放射性核或放射性同位素 )。當所述物質衰減時, 其通過檢測其發射的輻射來測定它的存 在。為這些目的, 特別有用的放射性衰減類型為正電子放射。例示性放射性試劑包括 99mTc、 18 131 F、 I 和 125I。
     術語″磁化劑″闡述被吸引到外部施加的磁場的物質。 這些物質通常作為對比劑 用于改進磁共振成像 (MRI) 中內部身體結構的可視性。用于對比增強的最常用的化合物是 基于釓的化合物。 MRI 對比劑改變其所存在的組織和體腔的弛豫時間, 這可視圖像權重提供 較高或較低的信號。
     本文所用術語 “發色團” 闡述當其與另一分子連接時使后者顯示顏色因而當施用 各種光譜測量時可見的化學部分。
     術語″生物發光劑″闡述通過生化過程發光的物質。
     術語″化學發光劑″闡述因化學反應而發光的物質。
     短語 “熒光劑” 指當暴露于外部來源的輻射時在特定波長發光的化合物。
     短語 “磷光劑” 指通過磷的緩慢氧化不必有可觀的熱或外部激發就可發光的化合 物。
     重金屬團簇可例如為用于例如在電子顯微鏡技術中標記的金原子簇。
     如上所述, 由于 EPR 作用, 腫瘤血管系統具有提高的吸收具有高分子量和大的流 體力學直徑的大分子和膠狀藥物載體的能力。因此, 本文所述具有足夠大的流體力學直 徑的綴合物是有利的。本文術語″足夠大″用于闡述具有導致在腫瘤組織中的聚集的綴 合物比率比其它組織增加的流體力學直徑的綴合物。最佳比率的測定完全在本領域技術 人員能力內。例如, 所述比率可為 1.1、 2、 3、 4、 5 等。在某些實施方案中, 流體力學直徑在 15nm-200nm 范圍內。在某些實施方案中, 流體力學直徑在 50nm-150nm 范圍內。在某些實 施方案中, 流體力學直徑在 70nm-90nm 范圍內。在又一實施方案中, 流體力學直徑為 95nm。 可如下文中的實施例章節的材料及方法項下所述測量流體力學直徑。
     可在本發明的這方面或其它方面給予或另外使用上文所述綴合物, 可原樣給予或 作為其藥學可接受鹽、 對映異構體、 非對映異構體、 溶劑化物、 水合物或前藥給予。短語″藥學可接受鹽″指母體化合物的帶電荷物質及其反荷離子, 其通常用于修 飾母體化合物的溶解性特點, 和 / 或降低母體化合物對生物體的顯著刺激, 但不消除所給 予化合物的生物學活性和性質。 優選通過讓所述鹽與堿或酸接觸并以常規方式分離母體化 合物來再生化合物的中性形式。化合物的母體形式在某些物理性質方面與各種鹽形式不 同, 所述物理性質例如在極性溶劑中的溶解性, 但除此外所述鹽在用于本發明目的方面等 同于化合物的母體形式。
     短語″藥學可接受鹽″意即包括用相對無毒的酸或堿制備的部分和 / 或綴合物 的鹽, 所述鹽視本文所述化合物上存在的特定取代基而定。當本發明綴合物含有相對酸性 的官能團時, 可通過讓所述綴合物的中性形式 ( 即非離子化 ) 與所需的足量的堿 ( 純堿或 在合適的惰性溶劑中的堿 ) 接觸來獲得堿加成鹽。藥學可接受堿加成鹽實例包括鈉、 鉀、 鈣、 銨、 有機氨基的鹽或鎂鹽或類似鹽。當本發明綴合物含有相對堿性的官能團時, 可通過 讓所述綴合物的中性形式 ( 即非離子化 ) 與所需的足量的酸 ( 純酸或在合適的惰性溶劑 中的酸 ) 接觸來獲得酸加成鹽。藥學可接受酸加成鹽實例包括以下鹽 : 源自無機酸的鹽, 例如鹽酸鹽、 氫溴酸鹽、 硝酸鹽、 碳酸鹽、 碳酸氫鹽、 磷酸鹽、 磷酸單氫鹽、 磷酸二氫鹽、 硫酸 鹽、 硫酸氫鹽、 氫碘酸鹽或亞磷酸鹽等 ; 以及源自相對無毒的有機酸的鹽, 例如乙酸鹽、 丙 酸鹽、 異丁酸鹽、 馬來酸鹽、 丙二酸鹽、 苯甲酸鹽、 琥珀酸鹽、 辛二酸鹽、 富馬酸鹽、 乳酸鹽、 扁桃酸鹽、 酞酸鹽、 苯磺酸鹽、 對甲苯磺酸鹽、 檸檬酸鹽、 酒石酸鹽、 甲磺酸鹽等。還包括氨 基酸的鹽例如精氨酸鹽等和有機酸例如葡糖醛酸或半乳糖醛酸等的鹽 ( 參見例如, Berge 等,″ Pharmaceutical Salts( 藥用鹽 )″, Journal of Pharmaceutical Science, 1977, 66, 1-19)。本發明的某些特殊綴合物既含有堿性官能團又含有酸性官能團, 使得可將所述 綴合物轉化為堿加成鹽或酸加成鹽。
     優選通過讓所述鹽與堿或酸接觸并以常規方式分離母體綴合物來再生綴合物的 中性形式。綴合物母體形式在某些物理性質方面與各種鹽形式不同, 所述物理性質例如在 極性溶劑中的溶解性, 但除此外所述鹽在用于本發明目的方面等同于所述綴合物的母體形 式。
     在實施例中使用阿倫膦酸的藥學可接受鹽。例示性所述鹽為阿倫膦酸鈉。因此, 含有阿倫膦酸鹽的綴合物可包含阿倫膦酸的鈉鹽。
     術語″前藥″指在體內轉化為活性化合物 ( 活性母體藥物 ) 的作用劑。前藥通常 用于促進給予母體藥物。與母體藥物比較前藥亦可改進在藥物組合物中的溶解性。通常還 將前藥用于實現在體內持續釋放活性化合物。
     本文所述綴合物可具有不對稱碳原子 ( 光學中心 ) 或雙鍵 ; 外消旋物、 非對映異構 體、 幾何異構體和單獨的異構體涵蓋于本發明范圍內。
     本文所用術語″對映異構體″闡述僅通過彼此完全倒置 / 反映 ( 鏡像 ) 就可相對 于其對應物重疊的化合物的立體異構體。將對映異構體闡述為具有 “偏手性” , 因為他們彼 此象左右手。除存在于其本身具有偏手性的環境 ( 例如所有生命系統 ) 外, 在其它情況下 對映異構體具有同樣的化學和物理性質。
     本文所述綴合物可以以非溶劑化物形式以及溶劑化物形式 ( 包括水合物形式 ) 存 在。一般而言, 溶劑化形式等同于非溶劑化形式, 并包括在本發明范圍內。
     術語 “溶劑化物” 指化學計量不等的絡合物 ( 例如二 -、 三 -、 四 -、 五 -、 六 - 等 ),其由溶質 ( 本文所述綴合物 ) 和溶劑形成, 藉此溶劑不干擾所述溶質的生物學活性。合適 的溶劑包括例如乙醇、 乙酸等。
     術語 “水合物” 指如上文所定義的其中溶劑為水的溶劑化物。
     本發明某些綴合物可以以多晶型或非晶型形式存在。一般而言, 對于涵蓋在本發 明中的用途所有物理形式都是等同的, 其意欲落在本發明范圍內。
     當將本發明用于實踐時, 本發明人設計并成功實施了用于制備具有連接在其上的 抗血管生成劑、 骨靶向部分和任選標記物質的 HPMA 共聚物的新穎的方法。要注意合成所述 聚合綴合物受到各種限制, 這些限制由以下原因造成 : 待綴合的各部分的溶解性不同、 綴合 物最佳性能所需的理想結構特征復雜、 反應物不相容等。 因此, 設計克服這些限制并被設計 為獲得表現出至少合理的性能的綴合物的方法高度有利。
     因此, 本發明實施方案的另一方面提供合成本文所述綴合物的方法, 所述方法包 括:
     (a) 使多個形成聚合物主鏈的單體單元共聚合, 其中所述多個單體單元的一部分 包含以第一反應性基團為終端的單體單元, 所述多個單體單元的另一部分包含以第二反應 性基團為終端的單體單元, 因此獲得包含包含多個主鏈單元的聚合物主鏈的共聚物, 其中 主鏈單元的一部分具有第一反應性基團, 主鏈單元的另一部分具有第二反應性基團, 所述 第一反應性基團能夠與抗血管生成劑起反應, 所述第二反應性基團能夠與二膦酸鹽起反 應; (b) 讓該共聚物與抗血管生成劑或與其衍生物經由第一反應性基團反應, 因此獲 得具有連接在其上的所述抗血管生成劑的共聚物 ; 和
     (c) 讓該共聚物與二膦酸鹽或其衍生物經由第二反應性基團反應, 因此獲得具有 連接在其上的二膦酸鹽的共聚物, 由此獲得所述綴合物。
     共聚物與抗血管生成劑的反應 (b) 可在共聚物與二膦酸鹽骨靶向部分的反應 (c) 之后、 同時或之前進行。
     本文所述以反應性基團為終端的單體單元在本文中亦被稱為功能化單體或功能 化單體單元。
     由共聚合形成的共聚物本文亦被稱為功能化共聚物。
     在某些實施方案中, 可在形成聚合物主鏈并且未功能化的單體單元存在下實現共 聚合。
     本文所用″反應性基團″闡述能夠與另一基團反應以形成化學鍵 ( 通常共價鍵 ) 的化學基團。任選形成離子鍵或配位鍵。
     如果一個基團在化學上與應該如所期望連接在作用劑或部分上的反應性基團相 容, 就可以將其稱為反應性基團。例如羧基為適于與以胺基為終端的作用劑或部分綴合的 反應性基團, 反之亦然。
     反應性基團可固有地存在于形成主鏈單元的單體單元中, 或借助于對其上的化學 基團進行化學修飾在其內產生, 或借助于讓這些化學基團與間隔基或與以所需反應性基團 為終端的接頭連接在其內產生。
     抗血管生成劑或骨靶向部分通常可借助天然分子和 / 或聚合物主鏈單元上已經 存在的官能團與形成聚合物主鏈的單體單元或與共聚物主鏈單元連接, 或另外通過合成有
     機化學中眾所周知的方法引入而不改變所述作用劑的活性。
     例如, 骨靶向部分和抗血管生成劑可經由肽接頭的末端羧基和位于骨靶向部分 和 / 或抗血管生成劑的胺基之間的酰胺鍵與聚合物主鏈連接。或者, 如以下實施例章節所 證明, 將官能團對 - 硝基苯酚基團 (-ONp) 加到經包含肽接頭 Gly-Phe-Leu-Gly-ONp( 即 HPMA-Gly-Phe-Leu-Gly-ONp) 的 HPMA 共聚物這種聚合物上, 激活接頭的最后一個氨基酸 (Gly), 由此使得骨靶向部分阿倫膦酸鹽和抗血管生成劑紫杉醇經由與甘氨酸形成酰胺鍵 與聚合物的連接更有效更容易 ( 參見圖 2)。在某些實施方案中, 骨靶向部分和 / 或抗血管 生成部分在與功能化聚合物綴合之前被修飾, 以便包括分別與功能化的共聚物的第一及第 二反應性基團相容的反應性基團。
     可借助讓間隔基和 / 或接頭與骨靶向部分和 / 或抗血管生成劑在其與功能化的共 聚物綴合之前連接, 來實現所述修飾。
     因此, 在某些實施方案中, 所述方法進一步通過制備所述經修飾的骨靶向部分和 / 或抗血管生成劑來實現。
     設計插入聚合物主鏈和綴合在其上的部分之間的接頭和 / 或間隔基, 以便表現出 上文關于其所詳述的性質。
     用合適的聚合啟動子和任選鏈轉移劑通過本領域已知的任何聚合方法可實現不 同單體單元的共聚合。所述合適的聚合啟動子和鏈轉移劑可易于為本領域技術人員所確 認。
     如以下實施例章節所證明, 可經由兩種方法實施共聚合 : ″經典″法 - 熱聚合 和″可逆加成 - 斷裂鏈轉移″ (RAFT) 聚合技術。
     用 RAFT 方法使得可在室溫實施共聚合。
     為了經由可逆鏈 - 轉移過程介導聚合,″可逆加成 - 斷裂鏈轉移″ (RAFT) 聚合 技術通常涉及硫代羰基硫代 (thiocarbonylthio) 化合物, 例如二硫代酯、 二硫代氨基甲酸 酯、 三硫代碳酸酯和黃原酸酯。這使得可利用具有低多分散性和高官能性的聚合物。
     在某些實施方案中, 在各自與其綴合之前可讓反應性基團得到保護。在這些情況 下, 所述方法進一步包括在各自綴合之前對反應性基團去保護。
     這使得可區域性控制例如抗血管生成劑與包含生物可降解接頭的主鏈單元的綴 合。
     如上所述, 設計本文所述綴合物以使在所需的身體位點 ( 即骨相關疾病或病癥位 點 ) 釋放抗血管生成劑。因此, 可通過接頭基團經由直接連接或經由間接連接讓抗血管生 成劑和 / 或骨靶向部分與聚合物連接, 藉此, 在某些實施方案中, 將所述直接 / 間接連接設 計為在表征所需身體位點的條件下 ( 例如由某些酶或 pH) 可裂解。
     因此, 在某些實施方案中, 以第一反應性基團為終端的單體單元和 / 或以第二反 應性基團為終端的單體單元, 進一步包含以所述第一反應性基團或以所述第二反應性基團 為終端的接頭。
     因此, 在某些實施方案中, 所述方法進一步包括在 (a) 之前讓接頭與單體單元的 各自部分連接。
     在某些實施方案中, 所述接頭如下構建 : 可通過讓接頭的第一部分與聚合物連接 并讓接頭的第二部分與抗血管生成劑 / 骨靶向部分連接, 藉此在抗血管生成劑 / 骨靶向部分與聚合物連接后, 這兩部分彼此連接由此形成接頭。
     在某些實施方案中, 接頭首先與抗血管生成劑 / 骨靶向部分連接, 接著接頭與聚 合物連接。
     在某些實施方案中, 所述方法進一步包括讓本文所述間隔基與功能化的共聚物的 主鏈單元連接, 此后讓抗血管生成劑和 / 或骨靶向部分與該間隔基偶聯。或者, 可讓間隔基 在與聚合物主鏈綴合之前首先與抗血管生成劑和 / 或骨靶向部分連接。
     因此, 在某些實施方案中, 在抗血管生成劑和二膦酸鹽中至少一種經由間隔基與 聚合物主鏈和 / 或與接頭連接的情況下, 本文所述方法進一步包括在 (a) 之前讓間隔基與 單體單元的至少一個部分連接。
     應該理解, 設計用于讓抗血管生成劑和 / 或骨靶向部分與聚合物偶聯所用的間隔 基和接頭, 是為了使各個部分平穩有效地綴合并使獲得的綴合物具有最佳性能, 其如上文 所詳述。
     在聚合物和 / 或抗血管生成劑和 / 或骨靶向部分進一步包含接頭的情況下, 所述 方法通過讓間隔基與接頭部分連接來實現。
     在某些實施方案中, 本文所述方法進一步包括在 (a) 之前讓間隔基與抗血管生成 劑和 / 或與二膦酸鹽連接, 因此獲得抗血管生成劑和 / 或二膦酸鹽的衍生物。
     在某些實施方案中, 所述方法進一步包括讓本文所定義標記物質與形成的綴合物 連接。標記物質可與共聚合之前的功能化的單體單元連接或與形成的共聚物連接。
     在某些實施方案中, 讓標記物質與共聚物在連接骨靶向部分的同時連接。 或者, 其 可在連接骨靶向部分和 / 或抗血管生成劑之前或之后連接。
     在本發明任一實施方案中所述的每一個綴合物, 可進一步包括綴合在其上的另外 部分。所述另外部分可在聚合物主鏈內或在聚合物主鏈各處與單體單元綴合, 或可連接在 聚合物主鏈的一端或兩端。
     所述另外部分可為本文所述標記物質或另外的靶向部分或另外的治療活性劑, 它 們可改進所形成的綴合物的性能。
     如上所述, 本文所述綴合物包含使所述綴合物靶向骨和骨相關 ( 類骨質 ) 結構的 骨靶向部分。由于綴合物的抗血管生成 / 抗增殖活性, 它們可用于治療骨和骨相關疾病和 病癥。
     因此, 本發明某些實施方案另一方面提供在需要治療的受試者中治療骨相關疾病 或病癥方法。這些方法通過給予受試者治療有效量的任何本文所述綴合物來實現。
     因此, 本發明某些實施方案另一方面提供本文所述任何綴合物作為藥物的用途。 在某些實施方案中, 所述藥物用于治療骨 - 相關疾病或病癥。
     根據本發明某些實施方案另一方面, 確認本文所述綴合物用于治療骨相關疾病或 病癥。
     本文所用術語″方法″指完成給定任務的方式、 手段、 技術和程序, 所述方法包括 但不限于化學、 藥理學、 生物學、 生化學和醫學技術的從業人員已知的那些方式、 手段、 技術 和程序, 或這些從業人員易于從已知的方式、 手段、 技術和程序來開發的那些方式、 手段、 技 術和程序。
     短語″骨相關疾病或病癥″闡述其中骨形成、 沉積或再吸收異常的疾病或病癥,尤其是特征在于過度生成血管的疾病或病癥。 短語″骨相關疾病或病癥″包括發生在身體 位點而不是從骨相關疾病或病癥演變而來的骨中發生的疾病和病癥, 例如, 在另一器官中 的骨癌轉移。骨 - 相關病癥包括但不限于 : 骨癌和骨癌轉移、 因骨轉移引起的骨質減少癥、 牙周病、 風濕性關節炎關節周圍的磨損、 Paget 氏病、 惡性高血鈣癥、 由骨轉移產生的溶骨性 病變、 由癌癥治療引起的骨異常和骨肥大。
     本文所用術語 “治療” 包括消除、 基本上抑制、 減慢或逆轉病癥進展、 基本上減輕病 癥的臨床癥狀或美學癥狀或基本上防止病癥的臨床癥狀或美學癥狀出現。 當可治療的疾病 為骨癌時, 該術語應包括任何抑制腫瘤生長或轉移或任何試圖抑制、 減慢或消除腫瘤生長 或轉移的努力。
     本文應注意, 由于綴合物選擇性靶向骨組織, 通過經由本文所述方法靶向抗血管 生成劑, 抗血管生成劑的毒性大大降低。 因此, 本文所述綴合物除了任選與其它藥物聯合用 于臨床上明顯的疾病外, 對于因殘留的蟄伏癌癥而處于復發風險的個體, 這些綴合物可潛 在地用作長期預防。例如, 無毒靶向的綴合物在治療處于骨肉瘤復發風險的無癥狀個體中 的用途, 可成為癌癥治療從目前方法中改變的主要范例, 在目前方法中通常直到骨相關疾 病例如骨肉瘤在臨床上明顯后才開始治療。
     本文所用術語″受試者″ ( 或者本文稱為″患者″ ) 指成為治療、 觀察或實驗目 標的動物, 優選哺乳動物, 最優選人。
     如以下實施例章節所證明, 本文所述某些實施方案的例示性綴合物紫杉醇和阿倫 膦酸鹽的 HPMA 共聚物 (HPMA 共聚物 -PTX-FK-ALN 綴合物 ) 抑制血管生成以及細胞增殖, 因 此, 可用于治療特征在于病理性過量血管生成的骨相關疾病和病癥, 其中抑制血管生成和 / 或細胞增殖是有利的。
     因此, 在某些實施方案中, 骨相關疾病或病癥與血管生成有關。
     腫瘤生長和轉移特別依賴血管生成的程度。腫瘤血管生成是滲入癌腫瘤以便提 供營養及氧并移去廢物的血管網絡的增殖, 由此導致腫瘤生長。腫瘤血管生成涉及激素刺 激和致癌基因激活、 血管生成生長因子表達、 血漿蛋白溢出、 臨時性的細胞外基質 (ECM) 沉 積、 ECM 降解和內皮毛細管遷移、 增殖和拉伸。因此, 抑制更多的血管擴張是癌癥治療的主 動研究的焦點。
     如以下實施例章節所證明, 當將本文所述某些實施方案的例示性綴合物 - 紫杉醇 和阿倫膦酸鹽的 HPMA 共聚物 (HPMA 共聚物 -PTX-FK-ALN 綴合物 ) 給予罹患脛骨內注射的 DA3 鼠乳房癌的小鼠 ( 用作浸潤性腫瘤細胞遷向骨的模型 ) 時, 其能抑制 37%腫瘤生長, 而 單獨給予紫杉醇沒有治療作用 ( 參見圖 11)。
     因此, 在某些實施方案中, 骨相關疾病或病癥選自骨癌轉移和骨癌。
     術語″癌癥″和″腫瘤″在本文中互換使用, 其闡述其中一群細胞表現出不受控 制的生長 ( 分裂超出正常限制 ) 的疾病類型。術語″癌癥″包括惡性和良性腫瘤以及從 原發性或繼發性腫瘤形成的疾病狀態。術語″惡性腫瘤″闡述其生長不能自我限制、 能夠 侵入到鄰近組織并能擴散到遠端組織 ( 轉移 ) 的腫瘤。術語″良性腫瘤″闡述并非惡性 ( 即不能以無限制的浸潤性方式生長、 不侵入周圍組織和不轉移 ) 的腫瘤。術語″原發性 腫瘤″闡述位于其開始產生的原始位點的腫瘤。 術語″繼發性腫瘤″闡述從其生長的原始 ( 原發 ) 位點擴散到靠近或遠離原發位點的另一位點的腫瘤。術語″骨癌″闡述從骨組織產生的腫瘤。 本文所用術語″骨癌″進一步包括位于 骨結構鄰近組織中的腫瘤及與骨例如軟骨、 骨腔和骨髓有關的腫瘤。術語″骨癌″進一步 包括從骨細胞演變的癌癥 ( 即原發性腫瘤 ) 以及從位于骨的原發性腫瘤″掙脫″、″漏 出″或″溢出″進入淋巴和 / 或血管的癌癥細胞, 其通過淋巴系統和 / 或血流循環在身體 別處的正常組織內定居并增殖, 由此形成繼發性腫瘤。 例如, 可在肺及其它器官中經常發現 源自骨肉瘤的轉移。這些病灶產生類骨質, 因此同樣可用對骨礦物羥基磷灰石具有高親和 力的化合物 ( 例如阿倫膦酸鹽和其它二膦酸鹽以及寡天冬氨酸鹽 ) 來靶向。
     骨癌在手臂和腿骨中最常見, 但其可發生在任何骨中。
     骨癌也稱為肉瘤。視腫瘤發展的骨組織的類型而定, 有幾種類型的骨肉瘤。可按 照本發明實施方案治療的骨癌的例示性類型包括但不限于 : 骨肉瘤、 尤因肉瘤、 軟骨肉瘤、 纖維肉瘤、 惡性巨細胞腫瘤和脊索瘤。
     骨肉瘤是原發性骨癌的最常見類型, 分類為惡性間葉瘤, 其中腫瘤直接產生有缺 陷的類骨質 ( 不成熟骨 )。它是富含血管并極有破壞性的惡性腫瘤, 最常見于長骨的干骺 端。 推薦幾種策略, 例如基于免疫的治療、 腫瘤抑制劑或自殺基因療法或在骨肉瘤不常用的 抗癌藥物 [Quan 等 Cancer Metastasis Rev 2006 ; 10 : 707-713]。然而, 仍有三分之一的患 者死于這種破壞性癌癥, 對于患有不能切除腫瘤的這些患者沒有可治愈的系統療法。
     術語″骨轉移″闡述從位于身體位點而不是骨的原發性腫瘤演變但轉移到骨的 癌癥 ( 即繼發性腫瘤 )。常轉移或擴散到骨的癌癥包括乳腺癌、 肺癌、 胸腺癌、 前列腺癌、 某 些腦癌和腎癌。
     例如, 前列腺癌是工業國家最常見的男性癌癥, 是男性癌癥死亡率的第二位原因。 前列腺癌主要轉移到骨, 但其它器官位點包括肺、 肝和腎上腺也受影響。 晚期轉移性疾病患 者的骨轉移發生率大約 70%。骨轉移與大量的骨骼病態有關, 包括嚴重骨疼、 病理性骨折、 脊髓或神經根受壓和惡性高血鈣癥。
     如以下實施例章節所證明, 本文所述某些實施方案的例示性綴合物 - 紫杉醇和阿 倫膦酸鹽的 HPMA 共聚物 (HPMA 共聚物 -PTX-FK-ALN 綴合物 ), 有效抑制人前列腺 PC3 細胞 系 ( 參見圖 10), 因此提示本文所述綴合物在治療前列腺癌轉移到骨中的用途。
     如上所述, 可進一步將本文所述綴合物用于監測骨相關疾病或病癥。在這樣的情 況下, 所述綴合物進一步包含本文所定義的用于用眾所周知的成像技術方便地檢測患者身 體內的綴合物的標記物質。 例如, 在骨相關疾病或病癥為骨癌的情況下, 由標記物質信號水 平來評估的綴合物的檢測可起檢測不同于骨的身體位點的骨癌轉移的作用。
     因此, 本發明某些實施方案另一方面提供監測受試者的骨相關疾病或病癥的方 法。本發明這些實施方案的方法通過給予受試者任何本文所述綴合物來實現, 所述綴合物 具有本文所述與聚合物連接的標記物質, 和采用用于監測綴合物在身體或其部分內分布的 成像技術。
     因此, 本發明某些實施方案另一方面提供任何本文所述綴合物作為診斷劑和 / 或 在制備用于監測骨相關疾病或病癥的診斷劑中的用途, 所述綴合物具有本文所述標記物 質。
     根據本發明某些實施方案的另一方面, 確定包含標記物質的本文所述每一種綴合 物用作診斷劑用于監測骨相關疾病或病癥。合適的成像技術包括但不限于 : 正電子放射斷層掃描 (PET)、 γ- 閃爍掃描、 磁 共振成像 (MRI)、 功能性磁共振成像 (FMRI)、 腦磁圖 (MEG)、 單光子發射計算機斷層掃描 (SPECT)、 計算機軸向斷層 (CAT) 掃描、 超聲、 熒光顯微鏡和常規 X- 射線成像。合適的成像 技術的選擇視標記物質的性質而定, 其在本領域技術范圍內。例如, 若標記物質包含 Gd 離 子, 那么合適的成像技術為 MRI ; 若標記物質包含放射性核素, 則合適的成像技術為 γ- 閃 爍掃描 ; 若標記物質包含超聲物質, 則超聲是合適的成像技術 ; 等等。
     本發明另一方面提供藥物組合物, 所述藥物組合物包含作為活性成分的任何本文 所述綴合物和藥學可接受載體。
     因此, 在本文所述任何方法和用途中, 可將任何本文所述綴合物本身提供給個體, 或作為藥物組合物的部分在其中與藥學可接受載體混合提供給個體。
     本文所用″藥物組合物″指一種或多種本文所述綴合物 ( 作為活性成分 ) 或其生 理上可接受鹽或前藥與其它化學組分的制劑, 所述其它化學組分包括但不限于 : 生理上合 適的載體、 賦形劑、 潤滑劑、 緩沖劑、 抗菌劑、 膨脹劑 ( 例如甘露醇 )、 抗氧化劑 ( 例如抗壞血 酸或亞硫酸鈉 )、 抗炎劑、 抗病毒劑、 化療劑、 抗組胺等。藥物組合物的目的是促進將化合物 給予受試者。術語″活性成分″指負責生物學效應的化合物。 可互換使用的術語″生理上可接受載體″和″藥學可接受載體″, 指對生物體不 產生顯著刺激并且不消除所給予的化合物的生物學活性和性質的載體或稀釋劑。
     本文術語 “賦形劑” 指加到藥物組合物中以進一步促進給藥的惰性物質。賦形劑 的非限制性實例包括碳酸鈣、 磷酸鈣、 各種糖和淀粉類型、 纖維素衍生物、 白明膠、 植物油和 聚乙二醇。
     可在 “Remington’ s Pharmaceutical Sciences” Mack Publishing Co., Easton, PA, 最新版本中發現用于調配和給予藥物的技術, 該書在此引作參考。
     因此, 可以以常規方式用一種或多種藥學可接受載體調配符合本發明用途的藥物 組合物, 所述載體包含賦形劑和助劑, 它們有助于將所述化合物加工到可藥用的制劑中。 合 適制劑視所選給藥途徑而定。劑量可視所采用劑型及所用的給藥途徑而變化。可由各醫 生根據患者病癥選擇準確的制劑、 給藥途徑和劑量 ( 參見例如 Fingl 等, 1975, 載于 “The Pharmacological Basis of Therapeutics” , 第 1 章第 1 頁 )。
     可將藥物組合物調配為用于一種或多種給藥途徑, 這視局部或全身治療或給藥是 否是首選的, 及待治療區域而定。可經口、 通過吸入或胃腸外或局部給予 ( 包括眼部、 陰道、 直腸、 鼻內 ), 所述胃腸外給予例如通過靜脈內滴注或腹膜內、 皮下、 肌肉內或靜脈內注射。
     局部給予的制劑可包括但不限于 : 洗劑、 膏劑、 凝膠劑、 霜劑、 栓劑、 滴劑、 液體制 劑、 噴霧劑和散劑。 常規藥物載體、 水性、 粉質或油性基質、 增稠劑等可為必不可少的或合乎 需要的。
     用于口服的組合物包括散劑或顆粒劑、 水性或非水性基質中的混懸劑或溶液劑、 囊劑、 丸劑、 扁囊劑、 膠囊劑或片劑。增稠劑、 稀釋劑、 矯味劑、 分散助劑、 乳化劑或粘合劑可 為合乎需要的。
     胃腸外給予的制劑可包括但不限于無菌溶液劑, 其亦可含有緩沖劑、 稀釋劑和其 它合適的添加劑。擬想將緩慢釋放的組合物用于治療。
     當然, 給予的組合物的量將視待治療的受試者、 痛苦的嚴重程度、 給藥方式、 主治
     醫生的判斷等而定。
     藥物組合物可進一步包含另外的藥用活性劑或非活性劑, 例如但不限于抗菌劑、 抗氧化劑、 緩沖劑、 膨脹劑、 表面活性劑、 抗炎劑、 抗病毒劑、 化療劑和抗組胺劑。
     根據本發明實施方案, 上文所述藥物組合物包裝在包裝材料中, 并在包裝材料里 或表面用印刷物說明用于治療骨相關疾病或病癥的用途。
     根據本發明另一實施方案, 所述藥物組合物包裝在包裝材料中, 并在包裝材料里 或表面用印刷物說明用于監測骨相關疾病或病癥的用途。
     若需要, 本發明組合物可存在于包裝或分發裝置中, 例如 FDA 批準的藥盒, 其可含 有一種或多種含活性成分的單位劑型。 包裝可例如包含金屬或塑料薄片, 例如泡罩包裝。 包 裝或分發裝置還可附有給藥說明書。包裝或分發裝置還可容納與容器相聯的通告, 其采用 管理藥物制備、 使用或銷售的政府機構規定的形式, 所述通告闡明所述機構批準的組合物 的形式或人用或獸用給藥形式。例如, 所述通告可以是美國食品和藥品監督管理局批準的 用于處方藥的標簽或批準的產品插入物。
     在本文所述的任何方法、 用途和組合物中, 本文所述綴合物可與另外的治療活性 劑聯合使用。 所述另外的活性劑包括作為非限制性實例的 : 化療劑、 抗血管生成劑、 激素、 生 長因子、 抗生素、 抗微生物藥物、 抗鎮靜劑、 免疫刺激劑和可提高綴合物的治療效果和 / 或 提高待治療的受試者健康的任何其它作用劑。 本文所用術語 “約” 指 ±10%。
     術語″包含″、″涵蓋″、″包括″、″含有″、 “具有” 及其變化形式意即″包 括但不限于″。
     術語 “由 ... 組成” 意即 “包括并且限于” 。
     術語″基本由 ... 組成″意即組合物、 方法或結構可包括另外的成分、 步驟和 / 或 部分, 但必須另外的成分、 步驟和 / 或部分不會大大改變所聲明的組合物、 方法或結構的基 本特點及新的特點。
     除非上下文明確指出不是這樣, 否則本文所用單數形式″一個″、″一種″和″ 該″包括復數提及物。例如, 術語″一種化合物″或″至少一種化合物″可包括多種化合 物, 包括其混合物。
     在整個說明書中, 本發明各種實施方案可以以范圍形式表示。 應該理解, 以范圍形 式說明僅為了方便簡潔, 不應該理解為對本發明范圍的僵硬的限制。 因此, 應該認為范圍的 說明明確地公開了所有可能的亞范圍以及該范圍內的單個數值。例如, 應該認為例如 1-6 的范圍說明明確公開了亞范圍例如 1-3、 1-4、 1-5、 2-4、 2-6、 3-6 等, 以及該范圍內的單個數 值例如 1、 2、 3、 4、 5 和 6。這適用于任何范圍寬度。
     本文無論何時指定數值范圍, 意即包括所指定范圍內的任何引用的數值 ( 分數或 整數 )。本文互換使用短語 “介于 / 介于 ( 第一個指定數值與第二個指定數值 ) 之間” 和 “從 ( 第一個指定數值到第二個指定數值 )/ 從 ( 第一個指定數值到第二個指定數值 ) 的范 圍” , 意即包括所述第一個和第二個指定數值及在其間的所有分數和整數數值。
     應該理解, 為了清晰起見, 在不同實施方案情況中闡述的本發明某些特點, 亦可以 以單個實施方案的組合來提供。 相反, 為了簡潔起見, 在單個實施方案情況中闡述的本發明 不同特點, 亦可以分別提供或以任何合適的亞組合或如合適以任何本發明其它所述實施方案來提供。除非沒有這些要素實施方案就不可操作, 否則不同實施方案情況中所述的某些 特點不能認為對這些實施方案是必不可少的特點。
     上文所述和以下權利要求章節描述的本發明各種實施方案和方面, 在以下實施例 中找到實驗支持。 實施例 現在談及以下實施例, 它們與以上說明一起以非限制性方式闡明本發明。
     材料和方法
     材料
     所有需要無水條件的反應都在氬氣及氮氣氣氛下進行。
     從 聚 合 物 實 驗 室 (Church Stretton, UK) 獲 得 納 入 5 摩 爾 % 甲 基 丙 烯 酰 基 -Gly-Gly- 對 - 硝基苯酚酯單體單元的 HPMA 共聚物 -Gly-Gly- 對 - 硝基苯酚 (ONp) 和 納入 10 摩爾%甲基丙烯酰基 -Gly-Phe-Leu-Gly- 對 - 硝基苯酚酯單體單元的 HPMA 共聚 物 -Gly-Phe-Leu-Gly-ONp。HPMA 共聚物 -GFLG-ONp 具有 31, 600Da 的分子量和 1.66 的多 分散性。
     PTX 和 ALN 購自 Petrus Chemicals 和 Materials Ltd。
     牛脾組織蛋白酶 B、 羥基磷灰石 (HA)、 組織蛋白酶 B 抑制劑 (CA-074 甲酯 ) 和所有 化學試劑 ( 包括鹽和溶劑 ) 皆購自 Sigma-Aldrich。
     化學藥品和溶劑為分析純級別, 或通過標注技術來純化。
     薄層色譜法 (TLC) : 硅膠板 Merck 60F254 ; 通過用 UV 光照射和 / 或通過用磷鉬酸溶 液 ( 乙醇中 20% wt.) 處理接著加熱來使化合物顯現。
     快速色譜法 (FC) : 硅膠 Merck 60( 粒徑 0.040-0.063mm), 在括號中給出洗脫液。 1
     H NMR : Bruker AMX 200 或 400 儀器。以相對于 TMS(δ = 0ppm) 的 δ 來表示化 學位移, 耦合常數 J 以 Hz 表示。在室溫中以 CDCl3 作為溶劑記錄光譜。
     400 目的銅篩購自 SPI Supplies, West Chester, PA。
     細胞培養
     人 臍 帶 內 皮 細 胞 (HUVEC) 購 自 Lonza, Switzerland。 讓 細 胞 在 EGM-2 培 養 基 (Lonza, Switzerland) 中培養, 在 37℃、 5% CO2 中生長。人前列腺細胞系 PC3 購自美國典 型培養物保藏中心。在補充 10 % FBS、 100μg/ml 青霉素 (Penicillin)、 100U/ml 鏈霉素 (Streptomycin)、 12.5U/ml 制霉菌素 (Nystatin) 和 2mM L- 谷氨酰胺的 DMEM 中培養 PC3 細 胞。讓細胞在 37℃、 5% CO2 中生長。
     表征 HPMA 共聚物 - 紫杉醇 -FK-ALN 綴合物
     測定 ALN 含量
     讓 HPMA 共聚物 - 紫杉醇 -FK-ALN 綴合物 (3.4、 1.7 和 0.85mg) 溶于 0.8ml 的 0.2M 高氯酸 (HClO4) 和 0.1ml 的 4mM FeCl3 混合物中。針對 0-3mM ALN 系列稀釋的標定圖來測 定 HPMA 共聚物 - 紫杉醇 -FK-ALN 綴合物中的 ALN 含量。在 λ = 300nm 處分光光度測量樣 品的吸收率。
     定量評估 HPMA 共聚物 - 紫杉醇 -FK-ALN 綴合物的流體力學直徑和粒徑分布
     用實時顆粒分析儀 (NanoSight LM20TM) 評估綴合物的平均流體力學直徑, 所述
     分析儀含固態單模式激光二極管 ( < 20mW, 655nm), 配置所述二極管以發射精細定位的光 束來通過 500μL 的樣品室。讓 HPMA 共聚物 - 紫杉醇 -FK-ALN 綴合物溶于 PBS 到終濃度 為 2、 1、 0.5mg/ml。然后用注射器將樣品注射到樣品室中, 使其平衡到單元溫度 (230℃ )30 秒。通過 CCD 照相裝置以 640x 480 的分辨率以 30 幀畫面 / 秒 (fps) 使粒子動力學顯現 60 秒。用納米粒跟蹤分析 (NTA) 軟件分析布朗運動下顆粒隨時間采取的路徑。單獨測定每一 顆粒的分散系數, 并由此測定球體等效流體力學半徑 (sphere equivalent hydrodynamic radius), 產生粒徑分布曲線。以一式三份對每一樣品測量三次, 結果表示為平均直徑。
     細胞增殖測定
     將人臍靜脈內皮細胞 (HUVEC) 鋪到含補充 5%胎牛血清 (FBS) 的生長因子減少的 培養基 (EBM-2, Cambrex, USA) 的 24- 孔板 (1x 104 個細胞 / 孔 ) 上。孵育 (37℃; 5% CO2)24 小時后用 EGM-2(Cambrex, USA) 置換培養基。將 PC3 細胞鋪到含補充 5% FBS 的 DMEM 的 96 3 孔板 (2x 10 個細胞 / 孔 ) 上, 孵育 24 小時 (37℃ ; 5% CO2)。孵育 24 小時后, 用含 10% FBS 的 DMEM 置換培養基。用紫杉醇和 ALN 組合、 紫杉醇 -FK 和 ALN 組合、 單獨用每一種藥物 和用 HPMA 共聚物 - 紫杉醇 -FK-ALN 綴合物以系列濃度攻擊細胞 72 小時。對照細胞在含或 不含生長因子下生長。孵育后分別用庫爾特計數器或用 XTT 對 HUVEC 和 PC3 計數。
     毛細管樣管形成測定
     用基質膠基質 (50μl/ 孔 ; BD Biosecience, USA) 在冰上包被 24- 孔板表面, 然后 使其在 37℃聚合 30 分鐘。用紫杉醇和 ALN 組合、 紫杉醇 -FK 和 ALN 組合、 單用每一種藥物 4 和用 HPMA 共聚物 - 紫杉醇 -FK-ALN 綴合物攻擊 HUVEC(3x 10 ), 并在完全 EGM-2 培養基存 在下將其接種在包被的板上。孵育 (37℃ ; 5% CO2)8 小時后, 用裝有 NikonDS5 冷卻 CCD 照 相機的 Nikon TE2000E 倒置顯微鏡以 4X 物鏡亮視野技術給細胞成像。
     人臍靜脈內皮細胞 (HUVEC) 遷移測定
     用包被 10μg/ml 纖維連接蛋白 (Biological industries, Beit Haemek, Israel) 的改良 8μm Boyden chambers (Costar Inc., USA) 實施細胞遷移測定。 用紫杉醇和 ALN 組合、 紫杉醇 -FK 和 ALN 組合、 單用每一種藥物和用 HPMA 共聚物 - 紫杉 4 醇 -FK-ALN 綴合物攻擊 HUVEC(15x 10 個細胞 /100μl), 將它們加到轉移孔的上腔室孵 育 2 小時, 然后向血管內皮生長因子 (VEGF) 遷移。孵育后使細胞在下腔室存在或不存在 VEGF(20ng/ml) 時遷移 4 小時到腔室下側。然后用 Hema 3 染色系統 (Fisher Diagnostic, USA) 固定細胞并染色。用裝有 Nikon DS5 冷卻 CCD 照相機的 Nikon TE2000E 倒置顯微鏡以 10X 物鏡亮視野技術給染色的遷移細胞成像。用 NIH 圖像軟件從每片膜捕獲的圖像計數遷 移細胞。將遷移標準化為遷移百分比, 以 100%代表不與任何藥物孵育時的細胞的 VEGF 依 賴性遷移。 通過組織蛋白酶 B 從 HPMA- 紫杉醇 -FK-ALN 酶釋放紫杉醇及紫杉醇含量測定
     通過牛脾組織蛋白酶 B 在模擬溶酶體細胞內藥物釋放條件下從 HPMA 共聚物 - 紫 杉醇 -FK-ALN 釋放紫杉醇和 ALN。HPMA 共聚物 - 紫杉醇 -FK-ALN(7mg/ml 的 0.5mM 紫杉 醇 - 等同物 ) 在 37℃于磷酸鹽緩沖液 (0.1M 磷酸鈉、 0.05M NaCl、 1mM EDTA, pH 6)、 還原性 谷胱甘肽 (5mM) 和組織蛋白酶 B(0.5μM) 中孵育。在 12、 24 和 48 小時后采取 300μl 等份 試樣。在 0.2M Na2CO3/NaHCO3, pH 9.8 通過 100% EtOAc 提取游離紫杉醇。通過高壓液相
     色譜 (HPLC, AKTATMAmersham Biosciences, μBondapakTM C 183.9x 150mm 柱,Waters, 30-100%乙腈的乙腈 - 水梯度, 1ml/ 分鐘, λ = 245nm) 用未與組織蛋白酶 B 孵育 并在同樣條件下提取用于標定的紫杉醇標定曲線分析游離紫杉醇濃度。
     羥基磷灰石結合測定
     將 HPMA 共 聚 物 - 紫 杉 醇 -FK-ALN 綴 合 物 溶 于 磷 酸 鹽 緩 沖 鹽 水 (PBSX1), pH 7.4(1mg/ml) 中。綴合物溶液 (500μl) 與羥基磷灰石粉末 (15mg) 在 500μl PBS, pH 7.4 中孵育。用 HPMA 共聚物 -Gly-Phe-Leu-Gly 作為對照。以 6000RPM 將孵育樣品離心 3 分 鐘, 在選擇的時間點從上層收集樣品 (100μl)。將使用 HighTrapTM 脫鹽柱 的快速蛋白質液相色譜 (FPLC, AKTATM 未結合的綴合物 (FPLC 條件 : AKTATM 用 Amersham Biosceinces) 用于檢測樣品中 流動相 100% DDW, 2ml/ 分鐘, λ = 215nm)。AKTATM 軟件實施綴合物的羥基磷灰石 - 結合動力學分析。從色譜圖計算每一時間點的曲線下面積 (AUC)。將每一個羥基磷灰石 - 孵育的綴合物色譜圖的 AUC 標準化為 不存在羥基磷灰石的綴合物樣品的 AUC 的百分比。
     評估 HPMA 共聚物 -PTX-FK-ALN 綴合物體內的抗腫瘤活性
     用 5x105mCherry- 標記的 DA3 鼠乳房癌細胞脛骨內注射 9 只 Balb/c 雌性小鼠 ( 每 組 n = 3 只 )。用游離 ALN 和 PTX(1 ∶ 1.6, 1.25mg/kg ALN 和 2mg/kg PTX) 組合、 等劑量 的 HPMA 共聚物 -PTX-FK-ALN 綴合物或用溶媒 (1 ∶ 1 ∶ 8 克列莫佛 EL ∶乙醇∶鹽水 ) 腹 膜內注射荷有腫瘤的小鼠。在注射腫瘤細胞 10 天后開始治療。由 CRITM Maestro 非侵入式 活體內成像系統監測腫瘤進展。結束時給脛骨稱重并分析。將數據表示為平均值 ± 平均 標準誤差 (s.e.m.)。
     統計方法
     數據表示為平均值 ±SD。用不成對 t- 檢驗來測定統計顯著性。認為 p < 0.05 為 統計學顯著。所有統計學檢驗都為雙側檢驗。
     實施例 1
     合成 HPMA 共聚物 - 紫杉醇 -FK-ALN 綴合物
     圖 2A 描繪了 HPMA 共聚物 - 紫杉醇 -FK-ALN( 化合物 1) 的例示性通用合成。
     制備化合物 2 : 將 L-Boc-Phe-ONp(104.3mg, 0.27mM) 溶于 2ml 二甲基甲酰胺 (DMF) 中。然后加入市購的 L-Lys(alloc)-OH(62mg, 0.27mM) 和 Et3N(100μL)。將反應混合物攪 拌 12 小時, 同時用 TLC(AcOH ∶ MeOH ∶ EtOAc 0.5 ∶ 10 ∶ 89.5) 監測。在反應完成后, 減 壓下除去溶劑, 通過柱色譜在硅膠 (AcOH ∶ MeOH ∶ EtOAc 0.5 ∶ 10 ∶ 89.5) 上純化粗產 物, 得到化合物 2(107mg, 83% ), 為白色固體。 1
     H NMR(200MHz, CDCl3) : δ = 7.24-7.11(5H, m) ; 5.83(1H, m) ; 5.45-5.11(3H, m) ; 4.50-4.48(3H, m) ; 3.08-2.92(4H, m) ; 1.84-1.64(2H, m) ; 1.44-1.36(4H, m) ; 1.30(9H, s) ppm。 13
     C NMR(100MHz, CDCl3) : δ = 177.09, 164.91, 158.52, 157.61, 138.45, 134.82, 131.26, 130.50, 128.83, 120.24, 82.27, 67.51, 57.59, 53.98, 42.37, 38.60, 33.53, 33.44, 30.14, 22.63ppm。
     MS(FAB) : m/z : 478.3[M+H]+, 500.3[M+Na]+。
     制備化合物 3 : 將化合物 2(832.1mg, 1.74mM) 溶于無水四氫呋喃 (THF) 中, 讓溶液冷卻到 -15℃, 接著加入 NMM(0.19ml, 1.74mM) 和氯甲酸異丁酯 (0.27ml, 2.09mM)。將反應 攪拌 20 分鐘, 加入 4- 氨基苯甲醇 (321.85mg, 2.61mM) 的無水 THF 溶液。將反應混合物攪 拌 2 小時, 用 TLC(EtOAc 100% ) 監測。 在反應完成后, 減壓下除去溶劑, 通過柱色譜在硅膠 (EtOAc 100% ) 上純化粗產物, 得到化合物 3(835mg, 82% ), 為黃色固體。 1
     H NMR(200MHz, MeOD) : δ = 7.56(2H, d, J = 8Hz) ; 7.29(2H, d, J = 8Hz) ; 7.21-7.07(5H, m) ; 5.86(1H, m) ; 5.29-5.10(2H, m) ; 4.83(2H, s) ; 4.49-4.46(4H, m) ; 3.17-3.08(4H, m) ; 1.88-1.70(2H, m) ; 1.44(4H, m) ; 1.34(9H, s)ppm。 13
     C NMR(100MHz, CDCl3) : δ = 174.08, 171.45, 158.61, 157.79, 139.17, 138.87, 138.03, 134.79, 131.12, 130.71, 130.49, 129.90, 129.08, 122.15, 82.71, 67.48, 66.83, 58.08, 55.74, 42.09, 39.84, 32.70, 31.31, 30.16, 24.31ppm。 +
     MS(FAB) : m/z : 583.3[M+H] , 605.3[M+Na]+。
     制備化合物 4 : 將化合物 3(353.6mg、 0.60mM) 溶于無水 THF 中, 讓溶液冷卻到 0℃。 然后加入二異丙基乙基胺 (DIPEA ; 0.42ml, 2.42mM)、 PNP- 氯甲酸酯 (367mg, 1.82mM) 和催化 量的吡啶。將反應混合物攪拌 2 小時, 由 TLC(EtOAc ∶ Hex 3 ∶ 1) 監測。在反應完成后, 減 壓下除去溶劑。用 EtOAc 稀釋粗產物, 并用飽和 NH4Cl 洗滌。經硫酸鎂干燥有機層, 減壓下 除去溶劑。通過柱色譜在硅膠 (EtOAc ∶ Hex 3 ∶ 1) 上純化粗產物, 得到化合物 4(453.2m, 79% ), 為白色固體。 1
     H NMR(200MHz, CDCl3) : δ = 8.26(2H, d, J = 8Hz) ; 7.64(2H, d, J = 8Hz) ; 7.40-7.34(4H, m) ; 7.22-7.14(5H, m) ; 5.83(1H, m) ; 5.24(2H, s) ; 5.18-5.06(2H, m) ; 4.56-4.37(4H, m) ; 3.19-3.05(4H, m) ; 1.95-1.73(2H, m) ; 1.59-1.46(4H, m) ; 1.39(9H, s) ppm。 13
     C NMR(100MHz, CDCl3) : δ = 174.11, 171.51, 158.63, 157.60, 157.46, 154.36, 147.32, 140.70, 137.91, 134.76, 131.75, 131.53, 131.08, 130.78, 129.17, 127.21, 123.72, 122.05, 119.61, 82.86, 72.65, 67.50, 58.17, 55.84, 41.95, 39.71, 32.42, 31.40, 30.16, 24.27ppm。
     MS(FAB) : m/z : 770.4[M+Na]+。
     制備化合物 5 : 將化合物 4(360.3mg、 0.48mM) 溶于無水二氯甲烷 (DCM) 中。然后 加入紫杉醇 (494.06mg、 0.57mM) 和二甲基氨基吡啶 (DMAP)(70.61mg、 0.57mM)。 將反應混合 物攪拌 8 小時, 由 TLC(EtOAc 100% ) 監測。 在反應完成后, 減壓下除去溶劑, 通過柱色譜在 硅膠 (EtOAc 100% ) 上純化粗產物, 得到化合物 5(662mg, 94% ), 為白色固體。 +
     MS(FAB) : m/z : 1463.7[M], 1486.9[M+Na] 。
     制備化合物 6 : 將化合物 5(82.1mg, 56.1μM) 溶于 1.5ml 三氟乙酸酸 (TFA) 中, 于 0℃將溶液攪拌 2 分鐘。減壓下除去過量的酸, 讓粗胺鹽溶于 2ml DMF 中。加入 HPMA 共聚 物 -Gly-Phe-Leu-Gly-ONp(198mg, ONp = 66.0μmol), 接著加入 Et3N(100μl)。將反應混 合物攪拌 12 小時, 減壓下除去溶劑。粗產物無需進一步純化用于下一步。
     制備化合物 7 : 讓 ALN(100mg, 30.8μM) 溶于水 (1ml)。一邊攪拌樣品一邊將粗化 合物 6(80mg, ONp =最多 26.6μmol) 的 DMF(350μl) 溶液逐滴加入到該水溶液中, 然后將 NaOH(0.2M) 滴入到該溶液中。pH 值緩慢地上升到 7。然后在 1 小時內 pH 再上升到 8。此后 反應混合物的 pH 值快速上升到 9 以終結反應。用含 Sephadex LH20 的 XK26/70 柱以 FPLC柱色譜 (MeOH 100%, 1ml/l 分鐘 ) 除去游離胺化合物 6、 ONp 和 ALN, 得到化合物 7, 為白色 固體 (47mg)。
     制備化合物 1 : 讓化合物 7(47mg, alloc =最多 15.6μM) 溶于 DMF(1.5ml) 中。然 后加入乙酸 (4.46μl, 78μM)、 Bu3SnH(25.17μl, 93.6mM) 和催化量的 Pd(PPh3)4。 將反應混 合物攪拌 2 小時, 此后減壓下濃縮, 接著加入 10ml 丙酮。過濾掉沉淀, 用丙酮洗滌幾次。通 過 HPLC 用含 Sephadex LH20 的 XK26/70 柱 (MeOH 100%, 1ml/l 分鐘 ) 純化粗產物, 得到化 合物 1(32mg), 為白色固體。
     定量評估 HPMA 共聚物 - 紫杉醇 -FK-ALN 綴合物的粒徑分布
     于是, 通過激光散射顯微鏡用納米粒跟蹤分析 (NTA) 技術 (NanoSight LM20, Salisbury, UK) 來表征多分散的納米級 HPMA 共聚物 -PTX-FK-ALN 綴合物的流體力學直徑 和粒徑分布。綴合物的平均流體力學直徑為 95nm( 圖 2B)。
     在備選合成途徑中, 用上文詳述的 RAFT 方法制備 HPMA 共聚物 -PTX-ALN 綴合物, 其如圖 2C 所描繪。由 RAFT 方法制備的綴合物通常特征在于低 PDI( 例如低于 1.4)。
     實施例 2
     HPMA 共聚物 - 紫杉醇 -FK-ALN 綴合物與羥基磷灰石的結合 選擇已知為對骨具有強親和力的骨靶向部分二膦酸鹽 ALN 為骨靶向部分。評估了 綴合物與骨礦物的結合能力。用羥基磷灰石作為模擬骨組織的模型。用 Hitrap 脫鹽柱實 施體外羥基磷灰石結合測定和 FPLC 分析 ( 圖 3A)。未結合的綴合物作為保留時間為 2 分 鐘的單峰洗脫。對應于洗脫的未結合綴合物的量的曲線下面積 (AUC) 減小與羥基磷灰石孵 育時間相關。HPMA 共聚物 - 紫杉醇 -FK-ALN 被迅速吸附到羥基磷灰石。孵育 5 分鐘后, 溶 液中 43%的綴合物與羥基磷灰石結合 ( 圖 3B)。 與羥基磷灰石的這種快速結合率在孵育 30 分鐘后到達約 50%結合綴合物的平臺。
     實施例 3
     測定 HPMA 共聚物 - 紫杉醇 -FK-ALN 綴合物中阿倫膦酸鹽的裝載
     經由在高氯酸中的 ALN 和 Fe3+ 離子之間形成發色絡合物并用 ALN 標定圖, 分光光 度測定 ALN 在 HPMA 共聚物 - 紫杉醇 -FK-ALN 綴合物上的裝載。發現 HPMA 共聚物的 10 摩 爾% Gly-Phe-Leu-Gly-ONp 鏈中的 2.5 摩爾%結合 ALN。該百分比超過了先前所指出的靶 向骨所需的量 [ 參見 Wang 等 2003, Bioconjugate Chem14 : 853]。
     實施例 4
     通過組織蛋白酶 B 從 HPMA- 紫杉醇 -FK-ALN 酶釋放紫杉醇并測定紫杉醇的裝載
     體外用在腫瘤和內皮細胞中過表達的組織蛋白酶 B 在 37 ℃、 pH5.5 時于以下位 點裂解 HPMA 共聚物 - 紫杉醇 -FK-ALN 綴合物 : (1) 紫杉醇 - 六肽接頭的兩個酰胺鍵 ( 在 Gly-Phe-Leu-Gly 和 Phe-Lys 氨基酸之間和在 Phe-Lys 和碳酸對氨基苯甲酯 (PABC) 之間 ) ; 和 (2)ALN 四肽接頭 (Gly-Phe-Leu-Gly) 的酰胺鍵。組織蛋白酶 B 裂解產物為 PABC- 紫杉 醇和 ALN。通過自發的 1, 6- 苯甲基消除 ( 圖 1 中示意顯示 ) 從 PABC- 紫杉醇獲得終產物 游離紫杉醇。在 12、 24、 48 小時和 72 小時后采取樣品, 用 HPLC 分析測定 HPMA 共聚物 - 紫 杉醇 -FK-ALN 綴合物中紫杉醇的含量。游離紫杉醇作為保留時間 10.55 分鐘的單峰洗脫。 AUC 增加與組織蛋白酶 B 孵育時間相關 ( 圖 4A 和 4B)。
     同樣用游離紫杉醇標定曲線測定聚合物上的紫杉醇裝載。發現存在于 HPMA 共聚物中的 10 摩爾%的 Gly-Phe-Leu-Gly-ONp 鏈中 4 摩爾%與紫杉醇結合。
     實施例 5
     HPMA 共聚物 - 紫杉醇 -FK-ALN 對 HUVEC 增殖的作用
     作為評估紫杉醇和 ALN 與 HPMA 共聚物結合時是否保留其抗血管生成作用的嘗試, 實施了增殖、 遷移和毛細管樣管形成。
     HUVEC 增殖同樣受到與紫杉醇 /FK/ALN 等同濃度的紫杉醇 -FK+ALN 組合和 HPMA 共聚物 - 紫杉醇 -FK-ALN 綴合物的抑制, 分別表現出約 10nM 和約 2.5nM 的 IC50( 圖 5)。已 知以 1-100μM 濃度表現出抗血管生成作用的 ALN, 當與紫杉醇或與紫杉醇 -FK 組合時在所 測濃度 (10μM-0.001nM) 對 HUVEC 增殖沒有另外的作用。單獨的 ALN 僅在最高試驗劑量 6.25μM 時抑制 HUVEC 增殖。單獨的 HPMA 在體內和體外都無活性, 這與先前發表的資料一 致。
     實施例 6
     不 可 裂 解 HPMA 共 聚 物 -GGGG-PTX 與 可 用 組 織 蛋 白 酶 B 裂 解 的 HPMA 共 聚 物 -GGFK-PTX 綴合物比較
     為了證明 HPMA 共聚物 -PTX-FK-ALN 綴合物主要是通過組織蛋白酶 B 裂解而不 是通過自發的水解釋放 PTX 起作用, 合成了含不可裂解的 Gly-Gly(GG) 接頭的 HPMA 共聚 物 -GGGG-PTX 綴合物 (2D 化學結構示于圖 6A 中 ), 并與可裂解 HPMA 共聚物 -GGFK-PTX 綴合 物 (2D 化學結構示于圖 6B 中 ) 比較。HPMA 共聚物 -GGGG-PTX 綴合物以大約 10, 000nM 的 IC50 值抑制人臍靜脈內皮細胞 (HUVEC) 的增殖, 也就是以比組織蛋白酶 B 裂解的 ( 參見圖 6C)HPMA 共聚物 -GGFK-PTX 綴合物 (IC50_100nM) 高兩個數量級的濃度來抑制。72 小時后, 觀察到某些紫杉醇水解釋放, 這導致以高于 100nM 紫杉醇等同物的濃度抑制增殖。
     這些發現進一步支持與 HPMA 共聚物結合的 PTX-FK 主要通過組織蛋白酶 B 裂解來 釋放的觀點。
     實施例 7
     組織蛋白酶 B 抑制劑降低 PTX-FK 和 HPMA 共聚物 -PTX-FK-ALN 綴合物的細胞毒性
     為了進一步證明 HPMA 共聚物 -PTX-FK-ALN 綴合物主要是通過組織蛋白酶 B 裂解 而不是通過自發的水解釋放 PTX 起作用, 在組織蛋白酶 B 抑制劑存在和不存在時實施 HUVEC 的增殖測定。如圖 7 所示, 用 HPMA 共聚物 -PTX-FK-ALN 綴合物和用游離 PTX-FK+ 游離 ALN 組合分別以 500nM 和 300nM 的等同濃度來孵育 HUVEC。48 小時后, 在存在或不存在組織蛋 白酶 B 抑制劑時, HPMA 共聚物 -PTX-FK-ALN 綴合物分別抑制約 27%和約 40%的 HUVEC 增 殖。同樣地, 在有或沒有組織蛋白酶 B 抑制劑時, PTX-FK+ALN 相應地減少約 25%和約 50% 的 HUVEC 增殖。
     實施倒 8
     HPMA 共聚物 - 紫杉醇 -FK-ALN 綴合物體外對 HUVEC 遷向 VEGF 的影響
     測定了 HPMA 共聚物 -PTX-FK-ALN 綴合物對 HUVEC 遷向血管內皮生長因子 (VEGF) 的能力的影響。 HPMA 共聚物 -PTX-FK-ALN 綴合物和游離 PTX-FK+ 游離 ALN 組合, 分別以 100 和 60nM 的等同濃度抑制大約 35%的 HUVEC 遷向 VEGF, 如圖 8 所示。
     實施例 9
     HPMA 共聚物 - 紫杉醇 -FK-ALN 綴合物體外對 HUVEC 的毛細管樣管形成的影響業已證明游離及綴合的紫杉醇 -FK-ALN 通過抑制 HUVEC 增殖和遷移, 具有抗血管 生成潛力, 測定了這些藥物對 HUVEC 形成毛細管樣管狀結構的能力 ( 參見圖 9A)。HPMA 共 聚物 - 紫杉醇 -FK-ALN 和游離紫杉醇 -FK+ 游離 ALN 組合分別以 0.5 和 0.3nM 的等同濃度, 抑制約 65%的 HUVEC 形成管狀結構 ( 圖 9B)。HPMA 用作對照, 對 HUVEC 形成管狀結構的能 力沒有抑制作用。
     實施例 10
     HPMA 共聚物 - 紫杉醇 -FK-ALN 對人前列腺細胞系 PC3 增殖的作用
     有若干報道指出, PTX 作為有效藥物可用于治療晚期轉移性前列腺癌。評估了當 與 HPMA 共聚物結合時保留的 PTX 和 ALN 對人前列腺 PC3 細胞系增殖的細胞毒活性。HPMA 共聚物 -PTX-FK-ALN 綴合物和游離 PTX-FK+ 游離 ALN 組合以等同濃度抑制 PC3 細胞增殖, 表現出約 10mM PTX-FK 和約 6μM ALN 的 IC50( 圖 10)。單獨的 PTX 表現出 1μM 的 IC50。單 獨的 ALN 或當其與 PTX 或與 PTX-FK 組合時以 0.01nM-10μM 的測試濃度對 PC3 細胞增殖沒 有作用。
     實施例 11
     HPMA 共聚物 - 紫杉醇 -FK-ALN 綴合物在體內脛骨中抑制 DA3 乳腺腫瘤
     用游離和綴合的 ALN 和 PTX(1 ∶ 1.6, 每天 1.25mg/kg ALN 和 2mg/kg PTX) 治療 在脛骨內荷有 mCherry 標記的 DA3 腫瘤的 Balb/c 雌性小鼠。測量腫瘤生長速率, 并通過 TM mCherry 熒光信號用 CRI Maestro 非侵入性活體內成像系統監測。 游離 PTX 與 ALN 組合及 HPMA 共聚物 -PTX-FK-ALN 綴合物兩種治療都表現出抗腫瘤活性 ( 參見圖 11A)。9 天治療 后, 用 HPMA 共聚物 -PTX-FK-ALN 綴合物治療的小鼠中抑制 37%的腫瘤生長, 在用游離 ALN 和 PTX 治療的小鼠中未觀察到顯著抑制 ( 參見圖 11A)。HPMA 共聚物 -PTX-FK-ALN 綴合物 不引起重量減輕 ( 參見圖 11B)。因為重量減輕與藥物毒性有關, 所以這些結果提示降低了 綴合物毒性水平。
     脛骨內注射 DA3 鼠乳房癌是模擬臨床情景的極富侵略性的腫瘤模型, 其中浸潤性 腫瘤細胞向骨例如脛骨遷移, 并形成快速增長的轉移。游離 PTX 對該腫瘤模型沒有抗腫瘤 作用。 因此, 用 HPMA 共聚物 -PTX-FK-ALN 綴合物治療抑制 37%的腫瘤生長是史無前例的結 果。目前正在進行對小鼠中侵潤性小些的標準腫瘤模型的體內研究。
     盡管聯合其特定實施方案闡述了本發明, 但顯然很多備選、 修改和變化對本領域 技術人員顯而易見。 因此, 意欲涵蓋落入附加權利要求精神和廣泛范圍內的所有所述備選、 修改和變化。
     本說明書提及的所有出版物、 專利和專利申請以其整體在本文中引作參考, 引作 參考的程度與每一個單獨的出版物、 專利和專利申請明確和個別地指出在本文中引作參考 一樣。另外, 對本申請中的任何參考資料的引用或確認不應該理解為承認所述參考文獻作 為本發明的先前技術來使用。在使用章節標題程度方面, 不應該理解為必要的限制。

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