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用于治療膠質細胞瘤GBM和其它癌癥的腫瘤相關肽組合物及相關抗癌疫苗.pdf

摘要
申請專利號:

CN200980139420.5

申請日:

2009.09.28

公開號:

CN102170901B

公開日:

2015.01.07

當前法律狀態:

授權

有效性:

有權

法律詳情: 授權|||實質審查的生效IPC(主分類):A61K 39/00申請日:20090928|||公開
IPC分類號: A61K39/00; A61P35/00; A61K38/08; A61K38/16 主分類號: A61K39/00
申請人: 伊瑪提克斯生物技術有限公司
發明人: 奧利弗·斯赫爾; 諾波特·希爾夫; 托尼·懷申克; 克勞迪婭·特勞特魏因; 斯特芬·沃爾特; 哈伯利特·辛格
地址: 德國蒂賓根
優先權: 2008.10.01 EP 08017305.7; 2008.10.16 US 61/105,970
專利代理機構: 上海天翔知識產權代理有限公司 31224 代理人: 劉粉寶
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法律狀態
申請(專利)號:

CN200980139420.5

授權公告號:

102170901B||||||

法律狀態公告日:

2015.01.07|||2011.10.12|||2011.08.31

法律狀態類型:

授權|||實質審查的生效|||公開

摘要

本發明涉及免疫治療肽及其在免疫療法中的用途,特別是在癌癥免疫療法中的用途。本發明披露了腫瘤相關T輔助細胞肽表位,為單獨或與其它腫瘤相關肽(刺激抗腫瘤免疫反應疫苗組合物的活性藥物成分)聯合。特別是本發明的肽組合物可用于引發腦膠質瘤抗腫瘤免疫反應的疫苗組合物之中。

權利要求書

1.一種藥物組合物,包含至少兩種肽,肽含有選自SEQ?ID?NO?1至SEQ?ID?NO?8構成的組中的一個氨基酸序列、和/或含有與SEQ?ID?NO?1至SEQ?ID?NO?8至少80%相同的一個變異氨基酸序列,和/或含有編碼SEQ?ID?NO?1至SEQ?ID?NO?8的核酸的一種多聚核苷酸或變異氨基酸序列,以及一種藥用載體。2.根據權利要求1所述的藥物組合物,進一步包含至少另外一種肽,該肽含有選自SEQ?ID?NO?9至SEQ?ID?NO?20構成的組中的一個氨基酸序列、或含有與SEQ?IDNO?9至SEQ?ID?NO?20至少80%相同的一個變異氨基酸序列,或含有編碼SEQ?IDNO?9至SEQ?ID?NO?20的核酸的一個多聚核苷酸或變異氨基酸序列。3.根據權利要求1或2所述的藥物組合物,其中該等肽總長度為8至100個氨基酸、優選為8至30個氨基酸,最優選為8至17個氨基酸。4.根據權利要求1-3任一項所述的藥物組合物,其中至少一種肽包括非肽鍵。5.根據權利要求1-4任一項所述的藥物組合物,包含至少兩種由根據SEQ?ID?NO?1至SEQ?ID?NO?20的氨基酸序列構成的肽。6.根據權利要求1-5任一項所述的藥物組合物,包含至少兩種含有一個根據SEQ?IDNO?1的氨基酸序列和一個根據SEQ?ID?NO?17的氨基酸序列、或一個根據SEQ?IDNO?2的氨基酸序列和一個根據SEQ?ID?NO?17的氨基酸序列、或一個根據SEQ?IDNO?3的氨基酸序列和一個根據SEQ?ID?NO?17的氨基酸序列的肽。7.根據權利要求1-6任一項所述的藥物組合物,其中組合物中存在的肽的選擇、數目和/或數量根據組織、癌癥和/或患者而特定。8.根據權利要求1-7任一項所述的藥物組合物,進一步包括至少一種合適的佐劑,佐劑從一組中選擇,該組包含1018ISS、鋁鹽、Amplivax、AS?15、BCG、CP-870,893、CpG7909、CyaA、dSLIM、GM-CSF、IC30、IC31、Imiquimod、ImuFact?IMP321、IS?Patch、ISCOMATRIX、JuvImmune、LipoVac、MF59、單磷酰脂A、MontanideIMS?1312、Montanide?ISA?206、Montanide?ISA?50V、Montanide?ISA-51、OK-432、OM-174、OM-197-MP-EC、ONTAK、載體系統、PLG微粒、resiquimod、SRL172、病毒顆粒和其它病毒樣顆粒、YF-17DBCG、Aquila公司的QS21刺激子、Ribi′s?Detox。Quil、Superfos、Freund′s、GM-CSF、霍亂毒素、免疫佐劑、MF59和細胞因子。9.根據權利要求8所述的藥物組合物,其中佐劑選自由集落刺激因子構成的組,如粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)、或咪喹莫特或resimiquimod。10.根據權利要求1-9任何一項所述的藥物組合物,另外含有至少有一種抗原提呈細胞。11.根據權利要求10所述的藥物組合物,其中該抗原提呈細胞為樹突狀細胞。12.根據權利要求10或11所述的藥物組合物,其中至少有一種抗原提呈細胞為a)用肽沖擊或加載,或b)包含一種編碼肽的表達載體。13.根據上述任一權利要求所述的藥物組合物,其中該組合物被給予,其中疫苗給予方式為靜脈注射、動脈注射、腹腔注射、肌肉注射、皮內注射、瘤內注射、口服、經皮、經鼻腔、經口腔、經直腸、經陰道、吸入、或外用。14.一種治療或預防患者癌癥的方法,包括給予患者一個有效治療量的以上任一權利要求所述的藥物組合物。15.根據權利要求14所述的方法,其中該藥物組合物為一種抗癌疫苗。16.根據權利15所述的方法,其中該癌癥為口腔癌、咽癌,消化道癌、結腸癌、直腸癌、肛門癌、呼吸道癌、乳腺癌、宮頸癌、陰道癌、外陰癌、子宮體癌、卵巢癌、男性生殖道癌、尿道癌、骨癌、軟組織癌、卡波西肉瘤、皮膚黑色素瘤、眼黑色素瘤、非黑色素瘤眼癌、腦癌、中樞神經系統癌、甲狀腺癌、其它內分泌腺癌、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、骨髓瘤,優選為腎癌、結直腸癌、肺癌、乳腺癌、胰腺癌、前列腺癌、胃癌、腦癌、胃腸道間質瘤或膠質母細胞瘤。17.根據權利要求16所述的方法,其中該癌癥為直腸癌。

說明書

用于治療膠質細胞瘤(GBM)和其它癌癥的腫瘤相關肽組合物及相關抗癌疫苗

發明內容

本發明涉及免疫治療肽及其在免疫療法中的用途,特別是癌癥免疫療法中的用途。本發明披露了腫瘤相關T輔助細胞肽表位,為單獨或與其它腫瘤相關肽(刺激抗腫瘤免疫反應疫苗組合物的活性藥物成分)聯合。特別是,本發明肽的組合物可用于引發腦膠質瘤抗腫瘤免疫反應的疫苗組合物之中。

為了本發明之目的,所有參考文獻均以完整引用的形式并入本文。

發明背景

神經膠質瘤是源自神經系統膠質細胞的腦腫瘤。神經膠質細胞(Glial?cell),通常稱為神經膠質(neuroglia)或簡單地稱為膠質(glia),是提供支持和營養、保持動態平衡、形成髓鞘和參與神經系統信號傳輸的非神經元細胞。神經膠質瘤的兩個最重要亞群為星形細胞瘤和少突膠質細胞瘤,根據其來源的正常膠質細胞類型(分別為星形膠質細胞和少突膠質細胞)而得名。多形性膠質母細胞瘤(以下簡稱膠質母細胞瘤)屬于星形細胞瘤的亞群,是成人中最常見的惡性腦腫瘤,約占所有惡性腦腫瘤的40%,約占膠質瘤的50%。它對中樞神經系統有很強的侵襲性,是所有膠質瘤中惡性水平最高(IV級)的腫瘤。由于神經影像學、顯微外科學、各種治療方案(如替莫唑胺或放射)的進步,在該疾病的治療方法上已經取得了穩步發展,雖然如此,膠質母細胞瘤仍無法治愈。這種腦腫瘤的致死率非常高:自首次確診后的預期平均存活時間為9至12個月。在1986年到1990年的觀察期,5年存活率為8.0%。截至目前,侵入性治療,包括腫瘤全切除,治療后五年存活率仍然不足10%。因此,醫學上強烈需要其它有效治療方法。

膠質母細胞瘤的腫瘤細胞是腦腫瘤中分化最低的腫瘤細胞,所以,腫瘤細胞很可能遷移和增殖,并且具有高度的侵襲性,從而導致預后非常差。由于膠質母細胞瘤在大腦中呈快速、侵襲性及浸潤性生長,因此會導致死亡。浸潤性生長模式導致這些腫瘤具有不可切除的特性。同時,膠質母細胞瘤對放療、化療也具有相對的抗性,因此,治療后復發率高。此外,在手術切除和放療后,腫瘤細胞的免疫反應對徹底消除腫瘤細胞無效。

膠質母細胞瘤分為原發性膠質母細胞瘤(新腫瘤)和繼發性膠質母細胞瘤,這取決于在未分化星形膠質細胞或膠質前體細胞的惡性轉化期間基因機制上的差異。繼發性膠質母細胞瘤發生在年齡最大達45歲的較年輕的人群中。平均在4到5年期間,繼發性膠質母細胞瘤從低級別的星形細胞瘤發展為未分化的星形細胞瘤。相比之下,原發性膠質母細胞瘤主要發生在較年長的人群中,平均年齡為55歲。一般來說,原發性膠質母細胞瘤作為暴發性膠質母細胞瘤而發生,特點是在3個月內就可從無任何臨床或病理異常狀態進展為膠質母細胞瘤。

膠質母細胞瘤沿有髓神經遷移并在中樞神經系統中廣泛擴散。在大多數情況下,手術治療持續療效有限。

惡性膠質瘤細胞通過產生免疫抑制物、削弱T細胞的增殖以及免疫刺激因子IL-2的產生,從而逃逸宿主免疫系統的偵測。

顱內腫瘤可發生于CNS的任何結構或細胞類型,包括腦、腦膜、腦垂體、頭骨、甚至殘留的胚胎組織。在美國,原發性腦腫瘤的總體年發病率是每10萬人中有14例。最常見的原發性腦腫瘤為腦膜瘤,占所有原發性腦腫瘤的27%,以及膠質母細胞瘤,占所有原發性腦腫瘤的23%(而成人中,膠質母細胞瘤占惡性腦瘤的40%)。這些腫瘤中,很多都具有侵襲性,并且級別高。原發性腦腫瘤是兒童中最常見的實體瘤,在兒童中,是僅次于白血病的第二位最常見癌癥死亡原因。

如今,對膠質母細胞瘤患者有效治療方法的探究工作仍在進行。已有研究對抗這些腫瘤細胞的免疫療法或通過征募免疫系統的治療方法。首先,在人類的免疫治療研究中,Northwest?Therapeutics使用“DCVax?Brain”(腦癌疫苗)治療膠質母細胞瘤獲得了令人鼓舞的成果,在該研究中,可誘導抗原特異性CTL反應,與采用標準治療相比,延長了中位存活時間,同時最大限度地降低了毒性(Heimberger?et?al.,2006)。

結直腸癌

根據美國癌癥協會的報道,在美國,結直腸癌(CRC)是排在第三位的最常見癌癥,受罪的新患者每年超過175,000名。在美國、日本、法國、德國、意大利、西班牙和英國,每年有超過480,000例患者罹患該疾病。它是發達國家癌癥死亡的最常見原因之一。研究表明,結直腸癌的發病是遺傳和環境因素之間相互作用的結果。在大多數病例中,結直腸腫瘤似乎由腺瘤息肉演變而來;但是這個演變過程可能需要很多年。結直腸癌的主要風險因素是年齡,90%的病例在50歲之后診斷患有此病。根據美國癌癥協會的報道,結直腸癌的其它風險因素包括飲酒、飲食中脂肪和/或紅色肉類含量高、水果和蔬菜的攝取量不足。結直腸癌的發病率持續上升,特別是日本等地區,這些地區接受西化飲食,攝入過多的脂肪和肉類而纖維攝入量減少,這些因素可能是罪魁禍首。但是發病率的上升速度不如以前快,這可能是由于進行了更多的篩查和息肉切除從而防止了息肉發展成為癌癥。

像大多數實體腫瘤的治療,一線治療為手術治療,然而,手術受益者仍局限于早期患者,而很大一部分患者在確診時已是晚期。基于氟尿嘧啶的化療方案是晚期結直腸癌的標準治療。這些治療方案的大多數為所謂的FOLFOX方案(輸注5-FU/亞葉酸+奧沙利鉑)和FOLFIRI(伊立替康、亞葉酸,團注和連續輸注5-FU)方案。

第三代細胞毒素類藥物的引入,如伊立替康和奧沙利鉑,增加了顯著改善療效的希望,但預后仍較差,轉移癌的存活率一般仍只有大約20個月,因此,治療該疾病的需求仍遠未滿足。

最近出現了新一代藥物,即靶向分子藥物,如阿瓦斯丁(貝伐單抗)和愛必妥(西妥昔單抗),而且大約有40種針對不同階段結直腸癌的化合物處于后期臨床開發階段。這些化合物中的幾種相結合可增加未來潛在治療選擇的數量。絕大部分藥物都處于開發的2期階段,這些化合物與開發中的任何其它結直腸癌藥物相比,更經常地針對表皮生長因子受體(EGFR),這是由于在約80%的結直腸癌患者中,EGRF表達都上調。

對II期患者采用化療結合最近批準的單克隆抗體(mAb)(西妥昔單抗+伊立替康或FOLFOX4;貝伐單抗單藥或與FOLFOX4聯合)的臨床試驗目前正在進行。經過三至四年的觀察,預計這些試驗會得出有統計學意義的結果。

目前腫瘤科所用的單克隆抗體(mAb)一般都很可能不會干擾積極免疫治療。事實上,有臨床前證據表明,用貝伐單抗去除VEGF是DC-介導的T細胞激活的積極結果。

前列腺癌和其它腫瘤

據估計,2007年有27050人死于前列腺癌,它是男性癌癥死亡的首要原因。雖然自20世紀90年代初以來,其死亡率在白人和非裔美國男性中一直下降,但是,非裔美國男性的死亡率仍然比白人男性高兩倍以上。前列腺癌是男性中最常見的癌癥。非裔美國男性的發病率顯著高于白人男性,其原因不明。在過去20年里,前列腺癌的發病率發生了很大的變化:在1988-1992年期間迅速上升、1992-1995年期間急劇下降、自1995年以來略有增加。這些趨勢在很大程度上反映了采用前列腺特異抗原(PSA)血液檢查進行前列腺癌篩查的增加。過去10年中發病率增加趨緩最有可能是由于在65歲以上的男性中普遍開展PSA篩查。在65歲以上的男性中,前列腺癌的發病率趨于穩定。在白人男性中,發病率于1992年達到高峰(每100000人男性中有237.6人),而在非裔美國男性中,于1993年達到高峰(每100000人男性中有342.8人)。

前列腺癌的治療包括觀察等待、手術、放射治療、高強度聚焦超聲(HIFU)、化療、冷凍手術、激素治療、或一些組合療法。哪種方案最佳取決于疾病的階段、Gleason評分和PSA水平。其它重要因素是男性的年齡、一般健康狀況、以及對潛在治療及其可能副作用的感覺。由于所有的治療均可能有一定的副作用,如:勃起功能障礙和尿失禁,因此治療討論往往注重于治療目標與生活方式改變風險之間的平衡。

如果癌癥已擴散出前列腺,治療選擇會發生明顯的變化,因此,大多數治療前列腺癌的醫生使用各種諾模圖來預測擴散概率。觀察等待、HIFU、放射治療、冷凍手術和外科手術一般在癌癥仍然局限在前列腺內的男性中進行。激素療法和化療常常在疾病已經擴散出前列腺的患者中進行。但是,也有特例:對于一些晚期腫瘤,可使用放射治療,對于一些早期腫瘤,可使用激素治療。如果初始的治療失敗并且癌癥進展,也可使用冷凍療法、激素療法、化療。

在因臨床懷疑器官有限生長而接受前列腺癌根治術的前列腺癌患者中,很多人的手術準備確診性病理檢驗顯示,局部擴展性腫瘤擴展超出器官的邊界。這些患者有早期局部復發的高風險,就生化復發而言,由于PSA水平不斷增高,通常可以檢測。在這種情況下的治療性選擇包括外部放療和激素治療;然而,這些治療方法的價值,特別是延長患者的長期存活率方面,不能認為已經得到證實。此外,可能的治療相關并發癥,如尿道狹窄的發展(放療)、性欲喪失和陽痿、骨質疏松方面的骨骼中鈣鹽降低的風險、以及病理性骨折風險明顯增加(激素消融),也必須予以考慮。

在所有前列腺癌中,有90%以上在發現時處于局部性和區域性階段;腫瘤在此階段確診的患者5年相對存活率接近100%。在過去25年中,所有階段腫瘤組合在一起的5年存活率從69%上升至接近90%。根據最新的數據,10年相對存活率為93%,15年相對存活率為77%。存活率,特別是5年存活率的巨大提升,部分歸因于早期診斷和治療的改進。但是,在腫瘤擴散至其它組織和器官后,患者的存活率顯著下降。

肺癌

2007年美國預計新發病例為21萬例,約占確診癌癥病例的15%。男性發病率顯著下降,從1984年的每10萬人102例高點,下降到2003年的78.5例。在女性中,這一發病率在一段長期的增長之后正趨向于平穩。為了治療之目的,臨床上肺癌分為小細胞肺癌(13%)和非小細胞肺癌(87%)。

在男性和女性中,大多數癌癥相關死亡均為肺癌。據估計,2007年有16.039萬人死亡,約占所有癌癥死亡人數的29%。自1987年以來,每年死于肺癌的女性多于乳腺癌患者。從1991年至2003年,男性的死亡率持續下降,每年約下降1.9%。女性肺癌死亡率在連續增長幾十年后正趨于平穩。肺癌死亡率的這些趨勢反映了過去30年吸煙率的下降。

治療選擇根據癌癥的類型(小細胞和非小細胞肺癌)和階段進行確定,包括手術、放療、化療、靶向生物治療,如貝伐單抗和埃羅替尼對于局部癌,通常選擇外科手術治療。最近的研究表明,手術隨后化療可提高早期非小細胞肺癌的存活率。由于該疾病在發現時通常已經擴散,因此,常常使用放射和化療,有時與手術聯合使用。化療單療或與放療結合是治療小細胞肺癌的通常選擇;采用這一方案,有很大比例的患者獲得緩解,在一些病例中,緩解為持久緩解。

肺癌的1年相對存活率在1975-1979年期間為37%,至2002年,略上升至42%,這主要是由于手術技術的改進和組合療法的使用。然而,所有階段的肺癌組合在一起,5年存活率僅為16%。對于疾病在檢出時仍為局部性的病例,存活率為49%;但是僅有16%的肺癌在此早期得到確診。

表1:2007年美國按性別估計的新發癌癥病例和死亡人數(American?CancerSociety.Cancer?Facts?&?Figures?2007.Atlanta:American?Cancer?Society;2007.)

因此,對于膠質母細胞瘤、前列腺腫瘤、乳腺癌、食管癌、結直腸癌、透明細胞腎細胞癌、肺癌、中樞神經系統腫瘤、卵巢癌、黑色素瘤、胰腺癌、鱗狀細胞癌、白血病和髓母細胞瘤以及表現出過度表達生存素的其它腫瘤仍然需要有效且安全的新治療方案,從而在不使用化療藥物或其它可能導致嚴重副作用的藥物的情況下,增強患者的安康。

發明的詳細說明

除非另有說明,否則本文使用的所有術語具有下述定義。本文所用“肽”這一術語,系指一系列氨基酸殘基,通常通過α-氨基酸與相鄰氨基酸的羰基團之間的肽鍵相互連接。這些肽的長度優選為9個氨基酸,但長度至短可為8個氨基酸,至長可為10、11、12、13、14、15、16、17、或18個氨基酸。

本文所用“寡肽”這一術語,系指一系列氨基酸殘基,通常通過α-氨基酸與相鄰氨基酸的羰基團之間的肽鍵相互連接。寡肽的長度對于本發明來說并不十分關鍵,只要在寡肽中保持正確的表位即可。通常,寡肽長度約小于30個氨基酸殘基,約長于14個氨基酸。術語“多肽”系指一系列氨基酸殘基,通常通過α-氨基酸與相鄰氨基酸的羰基團之間的肽鍵相互連接。多肽的長度對于本發明來說并不十分關鍵,只要保持正確的表位即可。

與術語肽或寡肽相對,術語“多肽”是指包含多于約30個氨基酸殘基的分子。

肽、寡肽、蛋白質或編碼此類分子的核苷酸如果能誘導免疫反應,則具有“免疫原性”(因此是本發明中的一種“免疫原”)。在本發明的情況下,免疫原性的更具體定義是誘導T細胞反應的能力。因此,“免疫原”是一種能夠誘導免疫反應的分子,并且在本發明的情況下,是一種能誘導T細胞反應的分子。

T細胞“表位”要求的是一種結合至MHC?I或II類受體上的短肽,從而形成一種三元復合體(MHC?I類α鏈、β-2-微球蛋白和肽),其可由載有以相應親和力結合至MHC/肽復合體的匹配T細胞受體的一種T細胞進行識別。結合至MHC?I類分子的肽的典型長度為8-14個氨基酸,最典型為9個氨基酸長度。與MHC?II類分子結合的T細胞表位長度通常為12-30個氨基酸。對于表位結合至MHC?II類分子的情況,同一個肽與相應的T細胞表位可共享一個共同的核心節段,但是由于核心序列的氨基末端上游和核心序列的羧基端下游的側翼序列分別具有不同的長度,因而總體長度不同。MHC?II類受體具有更開放的構造,結合至MHC?II類受體上的肽相應地不完全埋沒于MHC?II類分子的肽結合槽裂結構中,因為它們位于MHC?I類分子的肽結合槽裂之中。出人意料的是,對于根據SEQ?ID?NO:1的肽,情況并非如此,因為肽長度的微小差異會導致活性的極度降低(見下文)。

在人類中,有三種編碼MHC?I類分子的不同基因位點(人MHC分子也是指定的人白細胞抗原(HLA)):HLA-A、HLA-B和HLA-C。HLA-A*01、HLA-A*02和HLA-A*11是可從這些基因位點表達的不同MHC?I類等位基因的例子。

MHC?II類基因的人基因組有三種不同基因位點:HLA-DR、HLA-DQ和HLA-DP。MHCII類受體是異源二聚體,包含一個α鏈和一個β鏈,兩者均通過跨膜區在細胞膜中錨定。HLA-DRB1*04和HLA-DRB1*07是兩種不同的MHC?II類β等位基因的例子,它們已知在這些位點被編碼。II類等位基因非常多態,例如,已經描述的有數百種不同的HLA-DRB1等位基因。對于HLA-A*02和最常見的HLA-DR血清型,不同人群中的表達頻率如表2所示。

表2:HLA-A*02和最常見HLA-DR血清型的表達頻率F。頻率根據Mori等人(Mori?et?al.,1997)使用的Hardy-Weinberg公式F=1-(1-Gf)2改編,由美國人群范圍內的單體型頻率推導出。由于聯結不平衡,A*02與某些HLA-DR等位基因的組合可能是濃縮的或頻率低于其預期單一頻率。有關詳細信息,請參閱Chanock等人的文獻(Chanock?et?al.,2004).

因此,為了治療和診斷目的,與數種不同HLA?II類受體以合適親和力結合的肽是高度可取的。與數種不同HLA?II類分子結合的肽被稱為混雜結合劑。

本文提到的DNA序列既包括單鏈DNA也包括雙鏈DNA。因此,除非本文另有所指,否則具體的序列是該類序列的單鏈DNA、該類序列與其互補序列的雙工(雙鏈DNA)以及該類序列的互補序列。術語“編碼區”系指在自然基因組環境中自然或正常編碼基因表達產物的那一基因部分,即,體內編碼該基因的天然表達產物的區域。

編碼區可來自正常基因、突變基因或異常基因,甚至還可以來自DNA序列,完全可在實驗室中使用本領域熟知的DNA合成方法合成。

術語“核苷酸序列”系指脫氧核苷酸的雜聚物。

編碼特定肽、寡肽或多肽的核苷酸序列可為天然核苷酸序列,也可為合成核苷酸序列。

一般來說,編碼肽、多肽以及本發明蛋白的DNA片段由cDNA片段和短寡核苷酸銜接物,或一系列寡核苷酸組成,以提供一種合成基因,該基因能夠在包含源自微生物或病毒操縱子的調節元素的重組轉錄單元中被表達。

術語“表達產物”系指多肽或蛋白,它是基因序列和任何核酸序列的翻譯產物,這些序列編碼遺傳密碼退化所造成的同等物,從而編碼同樣的氨基酸。

術語“片段”當指的是一種編碼序列時,表示包含少于完整編碼區的DNA的一部分,其表達產物與完整編碼區表達產物基本上具有相同的生物學功能或活性。

術語“DNA片段”系指一種DNA聚合物,以單獨的片段形式或一種較大DNA結構的組分形式存在,它們至少從分離過一次的DNA中以基本純凈的形式獲得,即,未污染內源性材料并且其數量或濃度使得能使用標準生化方法(如,使用克隆載體)識別、處理和回收片段及其組分核苷酸序列。此等片段以開放閱讀框架(未被內部非翻譯序列打斷)或內含子(通常提呈于真核基因中)的形式存在。非翻譯DNA序列可能存在于開放閱讀框架的下游,在那里其不會干預編碼區的操縱或表達。

術語“引物”表示一種短核酸序列,可配有一個DNA鏈,并在DNA聚合酶開始合成脫氧核糖核酸鏈的地方含有一個游離的3′OH端。

術語“啟動子”表示參與RNA聚合酶的結合從而啟動轉錄的DNA區域。

“開放閱讀框架(ORF)”這一術語是指編碼無終密碼子的氨基酸的一系列三聯體,并且是一種(潛在地)可翻譯成蛋白質的序列。

術語“分離”表示一種物質從其原來的環境(例如,如果是天然發生的則是天然環境)中被移走。例如,活體動物中的天然核苷酸或多肽不是分離的,但是,從天然系統中一些或所有共存物質中分離出來的核苷酸或多肽是分離的。此類多核苷酸可能是載體的一部分和/或此類多核苷酸和多肽可能是一種組合物的一部分,并且由于該載體或組合物不是其天然環境的一部分,因此它仍然是分離的。

本發明中披露的多核苷酸和重組或免疫原性多肽也可能以“純化”的形式存在。術語“純化”并非要求絕對的純度;它只是一個相對的定義,可以包括高度純化或部分純化的制劑,相關領域技術人員能理解這些術語。例如,各個從已用傳統方法純化為具有電泳同質性的cDNA庫中分離出的各種克隆物。明確考慮到將起始材料或天然物質純化至少一個數量級,優選為兩或三個數量級,更優選為四或五個數量級。此外,明確考慮到所述多肽的純度優選為99.999%,或至少為99.99%或99.9%;甚而適宜為以重量計99%或更高。

根據本發明披露的核酸和多肽表達產物,以及包含此類核酸和/或多肽的表達載體可能以“濃縮的形式”存在。本文中所使用的術語“濃縮”系指材料的濃度至少是其自然濃度的大約2、5、10、100或1000倍,更方便地來說,即按體重計為0.01%,優選為至少0.1%。也明確考慮到,按重量計約為0.5%、1%、5%、10%和20%的濃縮制劑。序列、構型、載體、克隆物以及包含本發明的其它材料可有優勢地以濃縮或分離的形式存在。

“活性片段”這一術語是指產生免疫反應的片段(即具有免疫原性活性),不論是單獨或可選地與合適的佐劑一起給予一種動物,比如哺乳動物,例如兔子或小鼠,也包括人;這種免疫反應采用的形式是在接受動物(如:人)體內刺激T細胞反應。或者,“活性片段”也可用于誘導體外T細胞反應。

本文中所使用的術語“部分”(portion)、“段”(segment)、“片段”(fragment),如果與多肽相關,指的是殘基的連續序列(如:氨基酸殘基),其序列是構成較大序列的一部分。例如,如果一個多肽以任一種肽鏈內切肽酶(如胰蛋白酶或糜蛋白酶)進行處理,則該處理獲得的寡肽會代表起始多肽的部分、節段或片段。這表示,任何此類片段必定包含與SEQ?ID?NO:1至20序列基本相同(如果不是完全相同)的一個節段、片段或部分作為其氨基酸序列的一部分,其對應于SEQ?ID?NO:1至20的天然蛋白或“親本”蛋白。當與多核苷酸相關地使用時,這些術語系指用任何共同核酸內切酶處理所述多核苷酸產生的產物。

根據本發明,術語“百分比同一度”或“百分比同一”,如果指的是序列,則表示在擬對比序列(“對比序列”)與所述序列或權利要求的序列(“參考序列”)排隊比對后,把一種序列與所述序列或權利要求的序列進行比較。然后根據下列公式計算等同度百分比:

等同度百分比=100[I-(C/R)]

其中C是參考序列與被對比序列之間對準長度上參考序列與被對比序列之間的差異數量,其中

(i)參考序列中每個堿基或氨基酸序列在被對比序列中沒有對應的對準堿基或氨基酸;

(ii)參考序列中每個空隙,以及

(iii)參考序列中每個對準堿基或氨基酸與被比對比序列中對準堿基或氨基酸不同,即構成一個差異;

并且R是參考序列與被對比序列對準長度上在參考序列中產生任何空隙也計算為一個堿基或氨基酸的參考序列中的堿基或氨基酸數目。

如果“被對比序列”和“參考序列”之間存在的一個對準按上述計算的等同度百分比大致等于或大于指定的最低等同度百分比,則被對比序列與參考序列具有指定的最低等同度百分比,雖然可能存在按本文上述計算的等同度百分比低于指定等同度百分比的對準。

如果無另有說明,那么本文公開的原始肽可以通過在肽鏈內的不同(可能為選擇性)位點上取代一個或多個殘基而被修飾。此取代可能是保守性的,例如,其中一個氨基酸被具有類似結構和特點的另一個氨基酸所取代,比如其中一個疏水性氨基酸被另一個疏水性氨基酸取代。更保守的取代是具有相同或類似的大小和化學性質的氨基酸間的取代,例如,亮氨酸被異亮氨酸取代。在天然同源蛋白質家族序列變異的研究中,某些氨基酸的取代往往比其它氨基酸更具有耐受性,這些氨基酸往往表現出與原氨基酸的大小、電荷、極性和疏水性之間的相似性相關,這是確定“保守取代”的基礎。

在本文中,保守取代定義為在以下五種基團之一的內部進行交換:基團1-小脂肪族、非極性或略具極性的殘基(Ala,Ser,Thr,Pro,Gly);基團2-極性、帶負電荷的殘基及其酰胺(Asp,Asn,Glu,Gln);基團3-極性、帶正電荷的殘基(His,Arg,Lys);基團4-大脂肪族非極性殘基(Met,Leu,Ile,Val,Cys)以及基團5-大芳香殘基(Phe,Tyr,Trp)。

較不保守的取代可能涉及一個氨基酸被另一個具有類似特點但在大小上有所不同的氨基酸所取代,如:丙氨酸被異亮氨酸殘基取代。高度不保守的取代可能涉及一個酸性氨基酸被另一個具有極性或甚至具有堿性性質的氨基酸所取代。然而,這種“激進的”取代不能認為是無效的而不予考慮,因為化學作用是不完全可預測的,激進的取代可能會帶來其簡單化學原理中無法預見的偶然效果。

當然,這種取代可能涉及普通L-氨基酸之外的其它結構。因此,D-氨基酸可能被本發明的抗原肽中常見的L-氨基酸取代,也仍在本公開的范圍之內。此外,具有非標準R基團的氨基酸(即,除了天然蛋白的20個常見氨基酸之外的R基團)也可以用于取代之目的,以生產根據本發明的免疫原和免疫原性多肽。

如果在一個以上位置上的取代發現導致肽的抗原活性基本上等于或大于以下定義值,則對這些取代的組合進行測試,以確定組合的取代是否產生對肽抗原性的疊加或協同效應。肽內被同時取代的位置最多不能超過4個。

術語“T細胞反應”是指由一種肽在體外或體內誘導的效應子功能的特異性擴散和激活。

對于MHC?I類限制性CTL,效應子功能可能為溶解肽脈沖的、肽前體脈沖的或天然肽提呈的靶細胞、分泌細胞因子,優選為肽誘導的干擾素γ、TNF-α或IL-2,分泌效應分子、優選為肽或脫顆粒作用誘導的顆粒酶或穿孔素。對于MHC?II類限制輔助性T細胞效應子功能可能為肽誘導的細胞因子分泌,優選為,IFN-γ、TNF-α、IL-4、IL5、IL-10或IL-2或肽誘導的脫顆粒作用。CTL和輔助性T細胞的可能效應子功能不僅限于此列表所述功能。

免疫治療方法

是否能刺激免疫反應取決于是否存在被宿主免疫系統視為異物的抗原。發現腫瘤相關抗原的提呈增加了運用宿主免疫系統干預腫瘤生長的可能性。對于癌癥免疫療法,目前正在探索控制免疫系統中的體液和細胞免疫的各種機制。

細胞免疫反應的特定元素能特異性地識別和破壞腫瘤細胞。從腫瘤浸潤細胞群或外周血中分離出的細胞毒性T-細胞(CTL)表明,這些細胞在癌癥的天然免疫防御中發揮了重要作用。特別是CD8陽性T細胞在這種反應中發揮重要作用,TCD8+能識別細胞液8至10個源自蛋白或缺損核糖體產物(DRIPS)(Schubert?U,Antón?LC,Gibbs?J,Norbury?CC,Yewdell?JW,Bennink?JR.;Rapid?degradation?of?a?large?fraction?of?newly?synthesized?proteinsby?proteasomes;Nature?2000;404(6779):770-774)的殘基中載有主要組織相容性復合體(MHC)的肽中所含的I類分子。人MHC分子也稱為人白細胞-抗原(HLA)。

有兩類MHC分子:MHC?I類分子,在細胞核提呈因主要內源性、細胞質或細胞核蛋白質、DRIPS和較大肽蛋白裂解產生的肽的細胞上都能發現此類分子。然而,源自內體結構或外源性來源的肽也經常在MHC?I類分子上發現。這種I類分子非經典提呈方式在文獻中被稱為交叉提呈。

MHC?II類分子,主要發現于專職抗原提呈細胞(APC)上,并主要提呈內吞作用過程中被APC攝取并隨后被加工的外源性蛋白肽。

對于I-類分子,抗原加工的其它方法描述為:其允許MHC?II類分子提呈來自外源性肽(如:自吞作用)。肽和MHC?I類分子的復合物由CD8陽性細胞毒性T淋巴細胞的相應TCR識別,肽和MHC?II類分子的復合物由CD4陽性輔助T細胞的相應TCR識別。CD4陽性輔助T細胞在安排抗腫瘤T細胞反應的效應子功能中發揮重要作用,因此,腫瘤相關抗原(TAA)衍生的CD4陽性T細胞表位的識別對開發能引發抗腫瘤免疫反應的藥物可能非常重要(Gnjatic,S.,D.Atanackovic,E.,M.Matsuo,A.Selvakumar,N.K.Altorki,R.G.Maki,B.Dupont,G.Ritter,Y.T.Chen,A.Knuth,and?L.J.Old.Survey?ofnaturally?occurring?CD4+T-cell?responses?against?NY-ESO-1?in?cancer?patients:Correlationwith?antibody?responses.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.2003,100(15):8862-7)。CD4+T細胞可局部提高IFN-γ的水平。

哺乳動物(如小鼠)模型顯示,即使沒有細胞毒性T淋巴細胞(CTL)效應細胞(如,CD8陽性T淋巴細胞),CD4陽性T細胞也能通過分泌干擾素-γ(IFNγ)抑制血管生成,從而抑制腫瘤的出現(Qin,Z.and?T.Blankenstein.CD4+T-cell- mediated?tumor?rejectioninvolves?inhibition?of?angiogenesis?that?is?dependent?on?IFN?gamma?recepto

由于HLA?II類分子的組成性表達通常僅限于免疫系統的細胞,因此,直接從原發腫瘤中分離II類肽被認為是不可能的事。然而,發明家最近成功地在腫瘤中直接識別了MHCII類表位(EP?1642905,EP?1760088;Dengjel?J,Nastke?MD,Gouttefangeas?C,Gitsioudis?G,Schoor?O,Altenberend?F,Müller?M,B,Missiou?A,Sauter?M,Hennenlotter?J,WernetD,Stenzl?A,Rammensee?HG,Klingel?K,S.;Unexpected?abundance?of?HLA?classII?presented?peptides?in?primary?renal?cell?carcinomas;Clin?Cancer?Res.2006;12:4163-4170).

在沒有炎癥的情況下,MHC?II類分子的表達主要局限于免疫系統細胞,尤其是專業抗原提呈細胞(APC),例如,單核細胞、單核細胞源性細胞、巨噬細胞、樹突狀細胞。令人吃驚的是,在腫瘤患者的腫瘤細胞中發現有MHC?II類分子的表達(Dengjel?J,NastkeMD,Gouttefangeas?C,Gitsioudis?G,Schoor?O,Altenberend?F,Müller?M,B,Missiou?A,Sauter?M,Hennenlotter?J,Wernet?D,Stenzl?A,Rammensee?HG,Klingel?K,S.;Unexpected?abundance?of?HLA?class?II?presented?peptides?in?primary?renal?cell?carcinomas;Clin?Cancer?Res.2006;12:4163-4170)

對于觸發(引發)細胞免疫反應的肽,它必須與MHC分子結合。這一過程依賴于MHC分子的等位基因以及肽氨基酸序列的特異性多態性。MHC-I類-結合肽的長度通常為8-10個氨基酸殘基,并且在其與MHC分子相應結合溝槽相互作用的序列中通常包含兩個保守殘基(“錨”)。這樣,每個MHC的等位基因都有“結合基序”,從而確定哪些肽能與結合溝槽特異性結合(Rammensee?HG,Bachmann?J,Stevanovic?S.MHC?ligandsand?peptide?motifs,Landes?Bioscience,USA,1997)。

在MHC依賴性免疫反應中,肽不僅必須能與腫瘤細胞表達的某些MHC分子結合,而且它們還必須能被T細胞特異性T細胞受體(TCR)識別。

腫瘤特異性T淋巴細胞識別的抗原,也就是說,它們的表位,可以是所有蛋白質類中的分子,如,酶、受體、轉錄因子等。此外,腫瘤相關抗原也可以只存在于腫瘤細胞中,如突變基因產物中。另一種重要的腫瘤相關抗原是組織特異性抗原,如,表達于不同類型腫瘤和健康睪丸組織中的癌睪丸(CT)抗原。

多種腫瘤相關抗原已經得到確定。此外,在識別其它腫瘤相關抗原方面也做了大量研究。有些腫瘤相關抗原,在本領域中也稱作腫瘤特異性抗原,具有組織特異性。例子包括但(不僅限于)黑色素瘤的酪氨酸酶、前列腺癌的PSA和PSMA、淋巴瘤中諸如bcr/abl的染色體交叉(易位)部位。但是,許多得到確定的腫瘤相關抗原出現于多種類型腫瘤中,有些抗原,如,實際上導致轉化事件的致癌蛋白和/或腫瘤抑制基因(例如,在LinehanWM,Walther?MM,Zbar?B中進行了關于腎癌的腫瘤抑制基因綜述。The?genetic?basis?ofcancer?of?the?kidney.J?Urol.2003?Dec;170(6Pt1):2163-72)幾乎出現于所有腫瘤類型中。例如,控制細胞生長和分化的正常細胞蛋白,如p53(一種腫瘤抑制基因)、ras、c-met、myc、pRB、VHL和HER-2/neu可累積突變,導致這些基因產物的表達上調,從而致癌(McCartey?et?al.Cancer?Research,1998,15:58?2601-5;Disis?et?al.Ciba?Found.Symp.1994,187:198-211)。這些突變蛋白也可是多種癌癥的腫瘤特異性免疫反應的一個靶標。

癌癥患者免疫治療的目標是特異性激活免疫系統細胞,特別是作用于腫瘤細胞而不作用于健康組織的所謂細胞毒性T細胞(CTL,稱為“殺傷細胞”、也稱為CD8陽性T細胞)。腫瘤細胞因表達腫瘤相關蛋白而與健康細胞不同。細胞表面的HLA分子將細胞內容物提呈出細胞外,從而使細胞毒性T細胞辨別出健康細胞和腫瘤細胞。這通過把細胞內的所有蛋白分解為短肽,然后再粘附到HLA分子并提呈到細胞表面上而實現(Rammensee?et?al.,1993))。提呈于腫瘤細胞但在人體健康細胞上沒有或少得多的肽稱為腫瘤相關肽(TUMAP)。

對于被細胞毒性T淋巴細胞識別為腫瘤特異性抗原或相關性抗原以及用于治療的蛋白質,必須具備特殊的條件。該抗原應主要由腫瘤細胞表達,而正常健康組織根本不表達或表達數量較少。更為可取的情況是,該相應抗原不僅出現于一種腫瘤中,而且濃度(即每個細胞的相應肽拷貝數目)高。腫瘤特異性抗原和腫瘤相關抗原通常是源于由于細胞周期調控或凋亡等功能在正常細胞轉化為腫瘤細胞中直接受累的蛋白。另外,這些直接導致轉化的蛋白的下游靶標也可能會被上調,因此間接與腫瘤相關。這些間接腫瘤相關抗原也可能是預防接種方法的靶標。至關重要的是,在這兩種情況中,都存在抗原氨基酸序列的表位,所以這種來自腫瘤相關抗原的肽(“免疫原性肽”)可導致體外或體內T細胞反應。

基本上,任何能與MHC分子結合的肽都可能充當一個T細胞表位。誘導體外或體內T細胞反應的前提是存在有著相應TCR的T細胞并且沒有這個特定表位的免疫耐受性。輔助T細胞在編排抗腫瘤免疫的CTL效應子功能中發揮著重要作用。觸發TH1細胞反應的輔助T細胞表位支持CD8陽性殺傷T細胞的效應子功能,其中包括直接作用于腫瘤細胞的細胞毒性功能(該類腫瘤細胞表面顯示有腫瘤相關肽/MHC復合物)。這樣,單獨形式的或與其它腫瘤相關肽形成組合物的腫瘤相關T輔助細胞肽表位可作為刺激抗腫瘤免疫反應疫苗組合物的活性藥物成分。

由于CD8及CD4依賴型反應共同和協同促進抗腫瘤作用,因此,CD8+CTL(MHC?I類分子)或CD4陽性CTL(MHC?II類分子)對腫瘤相關抗原的識別和鑒定對開發腫瘤疫苗非常重要。因此,提出含有與任一類MHC復合物結合的肽組合物是本發明的一個目標。

使用腫瘤相關肽進行的臨床試驗最初由Boon及其同事在20世紀90年代中期進行,主要適應癥為黑色素瘤。試驗的最佳臨床有效率為10%至30%。使用基于肽的疫苗單一治療的任何臨床試驗中,都未曾報告有嚴重的副作用或嚴重的自身免疫性。用黑色素瘤相關肽治療的一些患者報告有輕度的白癜風。

但是,使用一種CTL通常不足以消滅所有腫瘤細胞。腫瘤具有很強的誘變性,能快速對CTL的攻擊作出反應,通過改變CTL的蛋白質模式以逃避被CTL識別。為了反擊腫瘤逃逸機制,在接種疫苗中,運用各種特異性肽。這樣,可同時使用數種CTL克隆物對腫瘤進行廣泛的同時攻擊。這可能會減少腫瘤逃避免疫反應打擊的機會。這一假設最近已經在治療晚期黑色素瘤患者的一項臨床研究中得到證實。除了少數情況之外,至少有三次不同T細胞反應的患者顯示出客觀的臨床有效率或穩定病情(Banchereau?et?al.,2001)以及生存期延長(與J.Banchereau個人性交流),而絕大多數少于三次T細胞反應的患者被診斷有進展性疾病。

申請人的一項研究顯示,當使用一種由13種不同肽組成的疫苗接種腎細胞癌患者時,得到了類似結果(H.Singh-Jasuja,S.Walter,T.Weinschenk,A.Mayer,P.Y.Dietrich,M.Staehler,A.Stenzl,S.Stevanovic,H.Rammensee,J.Frisch;Correlation?of?T-cell?response,clinical?activity?and?regulatory?T-cell?levels?in?renal?cell?carcinoma?patients?treated?withIMA901,a?novel?multi-peptide?vaccine;ASCO?Meeting?2007?Poster?#?3017;M.Staehler,A.Stenzl,P.Y.Dietrich,T.Eisen,A.Haferkamp,J.Beck,A.Mayer,S.Walter,H.Singh,J.Frisch,C.G.Stief; An?open?label?study?to?evaluate?the?safety?and?immunogenicity?of?the?peptide?basedcancer?vaccine?IMA901,ASCO?meeting?2007;Poster?#?3017)。

因此,開發一種腫瘤疫苗的主要任務不僅要識別和鑒定新型腫瘤相關抗原及其免疫原T輔助表位,而且還要組合不同抗原表位以增加每位患者對一種以上表位產生反應的可能性。因此,本發明的一個目標是提出有能力與人主要組織相容性復合體(MHC)I類(HLAI類)或II類(HLA?II類)分子結合的肽氨基酸序列的組合物。本發明的另一目標是提出一種基于肽組合物的有效抗癌疫苗。

在本發明中,發明人分離和描述了與直接來自于哺乳動物腫瘤(主要為膠質母細胞瘤主要患者的樣本)中的HLA?I類或II類分子結合的肽,腫瘤樣本還包括大腸癌、腎細胞癌、肺癌、胰腺癌、惡性黑色素瘤和胃癌的樣本。

本發明提出了這樣的肽:它們來源于致瘤相關抗原并且有能力與MHC(HLA)II類分子充分結合,觸發人白細胞免疫反應,特別是淋巴細胞、T淋巴細胞、CD4陽性T淋巴細胞、介導Th1型免疫反應的CD4陽性T淋巴細胞。

本發明還提出了這樣的肽:它們來源于致瘤相關抗原,并且有能力與MHC(HLA)I類分子充分結合,觸發人白細胞免疫反應,特別是淋巴細胞、T淋巴細胞、CD8陽性細胞毒性T淋巴細胞以及對癌癥患者接種疫苗有益的兩種肽的組合物。

根據本發明,其目標通過這樣方式達成:提供了一種至少包含兩種肽的藥物組合物,這兩種肽含有選自SEQ?ID?NO?1至SEQ?ID?NO?8構成的組中的一個氨基酸序列、和/或含有與SEQ?ID?NO?1至SEQ?ID?NO?8具有至少80%同源性的一個變異氨基酸序列,和/或含有編碼SEQ?ID?NO?1至SEQ?ID?NO?8的核酸的一個多聚核苷酸或變異氨基酸序列,以及一種藥用載體。同時,本發明的藥物組合物還可包括至少一種額外的肽,它含有選自SEQ?ID?NO?9至SEQ?ID?NO:20構成的組中的一個氨基酸序列、或包含與SEQ?ID?NO?9至SEQ?ID?NO:20至少80%相同的一個變異氨基酸序列或含有編碼SEQ?ID?NO?9至SEQID?NO:20的核酸的一個多聚核苷酸或變異氨基酸序列。這些肽的總長度可為8至100個氨基酸、優選為8至30個氨基酸,最優選為8至17個氨基酸。這些肽也可含有非肽鍵。如下文所述,除了含MET-005的肽之外,構成本發明基礎的肽都已確定為由MHC-I類或II類承載細胞提呈的肽。因此,這些特殊肽以及其它含有序列的肽(即衍生肽)都能引發特異性T細胞反應,雖然其誘導的反應程度可能會因不同的肽和患者而不同。差異可能因肽的突變等原因造成。本領域技術人員熟知可應用于確定各個肽誘導反應程度的方法,特別是參照本文實施例和相應的文獻。

優選情況是,發明中的變體可誘導T細胞與發明中各個肽發生交叉反應。

肽來源于腫瘤相關抗原,特別是具有蛋白酶解、血管生成、細胞生長、細胞周期調控、細胞分裂、轉錄調控、翻譯調控、組織侵襲等功能的腫瘤相關抗原。表3描述了這些肽及生成這些肽的蛋白的功能。

表3:本發明中的肽及其親本蛋白的功能

硫酸軟骨素蛋白多糖4(CSPG4)

CSPG4(硫酸軟骨素蛋白多糖)為完整膜硫酸軟骨素蛋白多糖。它被稱為細胞表面黑色素瘤早期發展的標志物,刺激腫瘤細胞增殖、遷移和侵襲。CSPG4在90%以上的人類黑色素瘤病變中呈強烈表達。雖然嚴格來說,CSPG4并不具有腫瘤特異性,但是在黑色素瘤患者和健康人群中的腫瘤反應性CD4+T細胞反應可識別表達黑色素瘤細胞并缺乏自體免疫的HLA-DR11上的CSPG4693-709(Erfurt?et?al.,2007)。

CSPG4的表達增強了整合素介導的細胞擴散、FAK(焦點粘附激酶)磷酸化、以及ERK1/2(細胞外信號調節激酶)的激活(Yang?et?al.,2004)。此外,體外實驗數據積累了CSPG4在腫瘤血管生成中發揮重要作用的證據。因此,CSPG4陽性腫瘤已經被發現血管新生率和血管量顯著增加,并且CSPG4顯示可吸收血管增生抑制素,從而抑制血管內皮細胞的增殖與血管新生。不成熟的血管還包含CSPG4陽性周細胞,這表明在血管發育過程中可通過阻滯血管抑制素的抑制作用而在此細胞群中發揮調節血管內皮細胞增殖的作用(Chekenya?et?al.,2002b)。

除了激活的周細胞,CSPG4的表達也在一些正常組織中得到描述,如:內皮細胞、軟骨細胞、平滑肌細胞、表皮內的某些基底角質形成細胞、以及毛囊內的細胞(Campoli?et?al.,2004)。

在血管生成和對CNS疾病反應過程中,高度能動CSPG4細胞迅速發生形態學變化,并被招募至發生血管生長和修復的地方。CSPG4在腫瘤細胞和惡性腦腫瘤血管上的周細胞中均呈過度表達(Chekenya?and?Pilkington,2002)。通過將CSPG4陽性人腦膠質瘤細胞中的細胞植入免疫缺陷的裸鼠大腦后,其顯示,這些腫瘤與對照組相比具有較高的微血管密度,這意味著CSPG4的表達對源自宿主的腫瘤脈管系統的功能和結構均有調節作用(Brekke?et?al.,2006)。在將GBM活檢材料植入裸鼠的異種移植實驗中,CSPG4被確定為主要與周細胞的血管和腫瘤脈管系統的基膜成分相關,并且其表達也與細胞高度增殖區域相關(Chekenya?et?al.,2002a)。此外,CSPG4的表達與神經膠質瘤植入模型中的腫瘤發展相對應(Wiranowska?et?al.,2006)。腫瘤及其間質之間的交叉應答維持著惡性進展,其中激活的間質細胞通過形成新生血管、細胞外基質成分以及刺激性生長因子而為增殖和侵襲性腫瘤細胞提供營養。在這種情況下,CSPG4透過細胞黏附、遷移、增殖和血管形態的改變而發揮著主要的瘤間質活化作用(Chekenya?and?Immervoll,2007)。

在人腦膠質瘤中,CSPG4的表達不同,與低級別膠質瘤相比,在高級別膠質瘤中的表達較高(Chekenya?et?al.,1999)。CSPG4的高表達與α3β1整合素活化/PI3K信號及其下游靶標加強介導的多藥耐藥相關,從而促進了細胞的存活期(Chekenya?et?al.,2008)。

脂肪酸結合蛋白,腦(IMA-FABP7-001)

脂肪酸結合蛋白(FABP)為細胞質14-15kDa蛋白,應該參與脂肪酸(FA)吸收、傳輸和定位。當脂肪酸在膜室之間轉運時,則被認為可增加細胞質中脂肪酸的溶解度,并將脂肪酸帶至其細胞核的靶標(Glatz?et?al.,2002)。FABP可調節脂肪酸的濃度,并以這種方式影響各種細胞功能,如:酶的活性、基因表達、細胞生長與分化(Glatz?and?Storch,2001)。神經組織含有九種已知FABP中的四種,并且具有獨特的時空分布(Veerkamp?andZimmerman,2001)。FABP7在中樞神經系統整個發育過程中在橈神經膠質細胞中呈高表達,并在成人中逐漸下降(Feng?and?Heintz,1995;Shimizu?et?al.,1997)。在神經元誘導的膠質細胞分化以及隨后神經元沿膠質細胞遷移過程中需要該蛋白,但是其對細胞增殖和粘附沒有作用(Feng?et?al.,1994;Kurtz?et?al.,1994)。在雪旺細胞中,FABP7表達于RAS獨立型EGFR信號通路的下游,并且調節正常周圍神經和周圍神經瘤中的雪旺細胞和軸突之間的相互作用(Miller?et?al.,2003)。

FABP7?mRNA表達于源自神經上皮的組織以及惡性膠質瘤腫瘤中(WHO第III和第IV級)。該基因被映射至染色體帶6q22-23,該區域也包含原癌基因c-myc并在惡性膠質瘤中經常丟失雜合性。對惡性膠質瘤細胞系的分析顯示,FABP7往往與膠質纖維酸性蛋白(GFAP)共同表達,這表明源自惡性膠質瘤的細胞可能為星形膠質細胞前體細胞,而該細胞可能正常表達兩種蛋白或形成腫瘤(Godbout?et?al.,1998)。FABP7蛋白在GBM中顯示有中度到強度的細胞核和細胞質表達。FABP7轉染的膠質瘤細胞與對照細胞相比,顯示了5倍以上的遷移程度。因此,FABP7過度表達特別是在GBM中表達所導致的整體生存期較短可能是腫瘤細胞向周圍腦實質的遷移和侵襲增加所致(Liang?et?al.,2005)。FABP7在星形細胞瘤中分布的進一步分析表明,FABP7在腫瘤浸潤區域的水平升高在推動惡性細胞浸潤到相鄰的腦組織中發揮著重要作用(Mita?et?al.,2007)。FABP7在膠質組織和各級別星形細胞瘤中的表達水平及亞細胞位置不同。盡管如此,特別是FABP7在細胞核中的位置似乎與膠質瘤細胞和EGFR路徑的浸潤顯型相關,因為其細胞核遷移在EGFR活化后被發現到并且與EGFR陽性GBM預后較差相關。而且,FABP7的細胞核免疫反應在I級星形細胞瘤中不能觀察到(Liang?et?al.,2006;Kaloshi?et?al.,2007)。

神經膠質素4,X-連鎖(IMA-NLGN4X-001)

X-連鎖神經膠質素是細胞粘附蛋白家族中的一員,似乎在神經突觸的成熟和功能中發揮著作用。神經膠質素家族成員的結構組織有相關性,具有N-端信號肽、含有兩個位點選擇剪接的酯酶樣域、在跨膜域前有序列同源性低的小型連接區域、以及具有高度保守C-端的短胞質部分。在心臟中發現有最高的神經膠質素4mRNA相對水平。在肝臟、骨骼肌和胰腺中檢測為低表達,而腦、胎盤、肺臟和腎臟中神經膠質素4mRNA很難檢測到(Bolliger?et?al.,2001)。

X-連鎖NLGN4基因突變是自閉癥的潛在原因,并且在數例患有自閉癥、亞斯伯格綜合癥、精神發育遲滯的患者中報告有該突變(Jamain?et?al.,2003;Laumonnier?et?al.,2004;Lawson-Yuen?et?al.,2008)。

NLGN4X與癌癥的關系有以下很少的描述:在胃腸道間質腫瘤中,在兒科和年輕病例中與年齡較長病例相比發現有NLGN4X的過度表達(Prakash?et?al.,2005)。

細胞粘合素C(健生蛋白)(IMA-TNC-001)

腫瘤細胞周圍的細胞外基質與正常組織中的細胞外基質不同。細胞粘合素C(TNC)是一種細胞外基質蛋白,在與遷移活性升高密切相關的過程中高度上調,這些過程如:胚胎發展(Bartsch?et?al.,1992)、傷口愈合(Mackie?et?al.,1988)及腫瘤進程(Chiquet-Ehrismann,1993;Chiquet-Ehrismann?and?Chiquet,2003)。另外,TNC在具有高增殖指數的腫瘤血管中過度表達,這表明,TNC參與瘤血管生成(Kim?et?al.,2000)。在正常人腦中,很少發現有TNC表達,但在惡性膠質瘤中表達水平高(Bourdon?et?al.,1983)。TNC的表達可由缺氧(Lal?et?al.,2001)、TGF-β1誘導,形成了高級別膠質瘤侵入健康實質的機制(Hau?et?al.,2006);或由胃泌素誘導,這顯著調節人體GBM細胞的遷移(Kucharczak?et?al.,2001)。TNC下調原肌球蛋白-1,從而破壞肌動蛋白應力纖維的穩定性。另外,它還導致Wnt抑制劑Dickkopf1的下調。由于原肌球蛋白-1表達下降以及Wnt信號增強與轉化和腫瘤發生有密切聯系,因此,TNC特異性調節這些信號通路以增加膠質瘤細胞的增殖(Ruiz?et?al.,2004)。

在GBM組織中發現到腫瘤供血血管附近有TNC周圍血管染色,但在WHO?II級和III級膠質瘤中不常見,這表明TNC染色強度與腫瘤分級相關并且最強的染色表明預后不良(Herold-Mende?et?al.,2002)。TNC還使室下區(SVZ)內產生干細胞巢,協調生長因子信號以加快神經干細胞的發育。TNC對SVZ內的細胞主要作用為調節發育進程(Garcionet?al.,2004)。TNC是人神經干細胞(NSC)定向遷移的最強誘導劑。因此,腫瘤產生的ECM為NSC定向至傳播腫瘤細胞提供了不受約束的環境(Ziu?et?al.,2006)。

神經細胞粘附分子(IMA-NRCAM-001)

NRCAM(神經細胞粘附分子)是一種神經元跨膜細胞粘附分子,含多個免疫球蛋白樣C2-型和纖維連接蛋白III型域。它通過形成與其它IgCAM的嗜同種和嗜異性相互作用(Volkmer?et?al.,1996;Sakurai?et?al.,1997;Zacharias?et?al.,1999)而參與神經元細胞的指導、過速生長和自發性收縮(Grumet?et?al.,1991;Morales?et?al.,1993;Stoeckli?and?Landmesser,1995;Perrin?et?al.,2001;Sakurai?et?al.,2001)。錨定蛋白結合NRCAM(Davis?and?Bennett,1994)在形成內皮細胞的管道中上調,表明可能具有形成管道和血管生成的作用(Aitkenhead?et?al.,2002)。

NRCAM是β-catenin和斑珠主蛋白-LEF/TCF復合物的靶基因,易致癌(Conacci-Sorrell?etal.,2002)。NRCAM胞外域可因為金屬蛋白酶樣活性從細胞表面脫落。該脫落域能在小鼠中激活各種信號通路、促進細胞運動、并導致瘤變(Conacci-Sorrell?et?al.,2005))。與正常腦組織相比,NRCAM在間變性星形細胞瘤和GBM腫瘤組織中表達上調,并且表達水平上升與侵襲性行為相關(Sehgal?et?al.,1998)。作用于NRCAM的反義RNA降低了人GBM細胞的腫瘤形成能力(Sehgal?et?al.,1999)。

胰島素樣生長因子2mRNA結合蛋白3(IMA-IGF2BP3-001)

IGF2BP3是胰島素樣生長因子-II?mRNA結合蛋白家族中的一員,涉及mRNA定位、轉換及翻譯控制。該蛋白包含數個KH(鉀同源)域,這些域在RNA結合中起著重要作用,并已知參與RNA合成和代謝。表達主要在胚胎發育期間發生,并在一些腫瘤中有描述。因此,IGF2BP3被認為是一種癌胚蛋白(Liao?et?al.,2005)。與對照組織相比,在許多癌癥組織中存在IGF2BP3的高水平轉錄,這表明IGF2BP3蛋白可能在轉化細胞的增殖中發揮著功能性作用。該假說由這一發現得到支持,即,表達IGF2BP3轉錄物的唯一非惡性人體組織是人胎盤,這是以細胞生長和增殖為特征的組織(Mueller-Pillasch?etal.,1997)。

科學文獻中沒有關于IGF2BP3在GBM中表達的具體資料,但該蛋白質被描述為在其它數種惡性腫瘤中過度表達。

例如,IGF2BP3在腎透明細胞癌標本中表達,其表達與原發腫瘤的晚期階段和級別相關。

此外,IGF2BP3陽性表達與遠處轉移風險增加5-10倍以及腎細胞癌死亡風險增加42%-50%相關(Hoffmann?et?al.,2008;Jiang?et?al.,2006;Jiang?et?al.,2008)。與良性痣相比,IGF2BP3在惡性黑色素瘤中也可檢測到,但即使存在發育不良的特點,表達也不明顯(Pryor?et?al.,2008)。在所有食道鱗狀細胞癌患者中,有40%患者的腫瘤浸潤淋巴細胞(TIL)、區域淋巴結淋巴細胞和外周血淋巴細胞中可觀察到來自IGF2BP3的HLA-A*2402限制表位肽的特異性T細胞(Mizukami?et?al.,2008)。

IGF2BP3在胰腺癌中也呈高表達。在2項研究中,>90%的胰腺腫瘤組織樣本在免疫染色后顯示IGF2BP3表達,而非腫瘤胰腺組織的IGF2BP3為陰性。此外,該表達隨著腫瘤分期的發展而逐步升高(Yantiss?et?al.,2005;Yantiss?et?al.,2008)。

IGF2BP3表達在高級別尿道上皮腫瘤中也發現有顯著上升,而在良性尿道上皮或低級別尿道上皮腫瘤中一般沒有表達。此外,IGF2BP3陽性腫瘤的患者的無進展生存率和無疾病生存率比IGF2BP3陰性腫瘤患者低得多(Li?et?al.,2008;Sitnikova?et?al.,2008;Zheng?etal.,2008)。

BCAN-短蛋白聚糖(IMA-BCA-002)

短蛋白聚糖(BCAN)是硫酸軟骨素蛋白多糖的凝集蛋白聚糖家族中的一種大腦特異性成員。已經報道過兩種BCAN的異構體:全長異構體,它分泌到細胞外基質;較短的異構體,它含有一個預測糖磷脂酰肌醇錨的序列。分泌的異構體自出生到8歲整個期間呈高表達,到20歲時下調至低水平,該水平在成人正常皮質中維持。GPI異構體在整個發育期間均一直處于低水平(Gary?et?al.,2000)。BCAN屬于蛋白多糖家族,通常作為屏障分子,阻止成人神經系統中的細胞和神經突運動(Viapiano?and?Matthews,2006)。在體內,BCAN在延髓遷移流邊界周圍表達(Jaworski?and?Fager,2000),在神經元損傷后,它是膠質瘢痕的一種主要上調成分(Jaworski?et?al.,1999)。

BCAN在膠質瘤中大量上調,可檢測到其表達上升超過正常水平的7倍(Gary?et?al.,2000;Gary?et?al.,1998)。該表達在試驗中誘導腫瘤的侵襲性邊緣可檢測到(Glass?et?al.,2005),并在高浸潤性腫瘤中表達升高(Phillips?et?al.,2006)。臨床上,BCAN上調與高級別膠質瘤患者存活率較差相關(Liang?et?al.,2005)。BCAN除了在膠質瘤中上調,全長蛋白質的水解過程也可能導致侵襲(Gary?et?al.,1998;Nutt?et?al.,2001)。ADAMTS家族的金屬蛋白酶對BCAN的裂解是膠質瘤中介導促侵襲作用性的必然步驟。通過生成抵抗ADMATS裂解的位點特異性突變形式,其表明,這種“不可裂解的”BCAN無法提高體內膠質瘤的侵襲性以及體外腫瘤進展(Zhang?et?al.,1998;Viapiano?et?al.,2008)。分子水平上,BCAN促進了EGFR的活化,增加了細胞粘附分子的表達,并促進了纖維連接蛋白的分泌(Huet?al.,2008)。

在未發生神經系統并發癥而死亡者的人腦皮層樣本中未檢測到BCAN?mRNA。與之形成鮮明對比的是,在27份人膠質瘤手術樣本中,每個樣本中都檢測到BCAN?mRNA,這表明BCAN可能是膠質瘤中一種獨特而有選擇性的標記物(Jaworski?et?al.,1996)。BCAN在膠質瘤中上調不僅導致其表達總體增加,而且導致膠質瘤特異性表達不同糖基化異構體。因此,B/bΔg是BCAN?mRNA的一種全長產物,引起核心蛋白的糖基化不完全或降低。在產前發育的后半段以及產后發育的頭幾天期間,B/bΔg的表達水平很低,在一歲后消失,在正常成人大腦中不存在,但發現于高級別膠質瘤樣本中。一項研究顯示,在高級別(3級和4級)膠質瘤的每個樣本中均含有B/bΔg,占非裂解BCAN中表達高于對照水平總量的一半。B/bΔg陰性樣本對應的是診斷有低級別腫瘤的患者(Viapiano?et?al.,2005)。因此,高級別膠質瘤中的這種特異表達表明早期發展計劃的再激活,這是一種提示膠質瘤進展的機制(Seyfried,2001)。IMA-BCA-002包含其序列內的一個潛在糖基化位點。與源自沒有糖基化位點的BCAN(IMA-BCA-001)的另一種肽相比,它被證明具有非常強的免疫原性。此外,BCAN已被描述為在一種GBM癌干細胞類型中選擇性過度表達,顯示在體內具有最高多能性和致瘤性(Gunther?et?al.,2008)。

Met原癌基因(肝細胞生長因子受體)(IMA-MET-005)

MET原癌基因c-Met編碼一種跨膜酪氨酸激酶受體,具有調節細胞增殖、分化、運動、黏附和侵襲的能力。它被肝細胞生長因子(HGF)激活(Giordano?et?al.,1989;Trusolino?andComoglio,2002)。

c-Met的信號通路參與器官再生-這在肝和腎、胚胎發育、造血、肌肉發育中得到證實,并且參與正常激活B細胞及單核細胞的遷移和粘附的調節(Naldini?et?al.,1991;Mizuno?etal.,1993;Bladt?et?al.,1995;Schmidt?et?al.,1995;Zarnegar?and?Michalopoulos,1995;van?derVoort?et?al.,1997;Beilmann?et?al.,2000)。

不同類型腫瘤的研究已證明了激活c-Met的若干機制,包括HGF/c-Met的自分泌循環、激活位點突變、TPR-Met融合蛋白以及將c-MET分裂為α和β鏈失敗(Park?et?al.,1986;Mondino?et?al.,1991;Ebert?et?al.,1994;Schmidt?et?al.,1997;Olivero?et?al.,1999;Park?et?al.,1999;Di?Renzo?et?al.,2000)。c-Met通過磷酸化的組成性激活也被認定為人類透明腎細胞癌的一種重要發生機制(Nakaigawa?et?al.,2006)。

此外,大量研究表明,c-Met過度表達參與惡性腫瘤細胞轉化以及惡性細胞的侵襲。c-Met介導HGF的多功能性和潛在性致癌活動(Bottaro?et?al.,1991;Rubin?et?al.,1993;Zarnegarand?Michalopoulos,1995)。通過與該受體結合,HGF誘導c-Met的自身磷酸化并激活下游信號事件,包括ras、磷脂酰肌醇3′-激酶、磷脂酶C和絲裂原活化蛋白激酶相關途徑(Naldini?et?al.,1991;Ponzetto?et?al.,1993;Montesano?et?al.,1998;Furge?et?al.,2000;Dong?etal.,2001;Furge?et?al.,2001)。c-Met基因主要在上皮細胞中表達,并且在數種腫瘤組織和細胞系中過度表達(Di?Renzo?et?al.,1995;Ferracini?et?al.,1995;Tuck?et?al.,1996;Koochekpour?et?al.,1997;Fischer?et?al.,1998;Ramirez?et?al.,2000;Li?et?al.,2001;Maulik?et?al.,2002;Qian?et?al.,2002)。

往往由腫瘤缺氧誘導的c-Met過度表達可導致受體的組成性活化并與較差預后具有相關性。使內源性c-MET基因沉默導致體外完全侵襲性生長計劃實施受損、缺乏腫瘤生長以及體內實驗性轉移發生的減少(Corso?et?al.,2008)。

在GBM中已經描述有c-MET的過度表達(Tso?et?al.,2006)。c-Met與腫瘤的組織學分級具有相關性,這表明,HGF/c-MET自分泌環隨著星形細胞腦腫瘤的進展而建立。因此,HGF被認為對承載c-Met受體的GBM細胞表現出強大的遷移/侵襲誘導活性(Moriyamaet?al.,1999)。c-Met啟動子含有缺氧誘導因子1的結合位點,因此,缺氧可以激活c-Met啟動子并上調其表達。所有人類GBM中大約有一半被認為由于誘導c-Met而響應缺氧,這可增強HGF對腫瘤細胞遷移的刺激作用(Eckerich?et?al.,2007),并可能將神經元干細胞吸引到腫瘤(Kendall?et?al.,2008)。c-Met和EGFR經常在惡性星形細胞瘤中共同表達(Reznik?et?al.,2008)。研究表明,激活c-Met受體上的磷酸化位點對EGFRvIII水平具有高度反應性,提示在膠質母細胞瘤中EGFRvIII和c-Met受體之間存在交叉應答(Huanget?al.,2007a;Huang?et?al.,2007b)。有人建議將MET作為GBM癌癥干細胞的一種標記物(Nam?et?al.,2008)。另有一項研究顯示,MET在不同亞型GBM衍生癌干細胞中選擇性過度表達(Gunther?et?al.,2008)。

一項在復發GBM患者中使用AMG102進行的一項II期研究的中間結果(人類HGF中和抗體)表明,在18名得到治療的患者中,有些患者的疾病可能依賴于c-MET:HGF信號通路,1例部分緩解、1例有輕微反應、2例疾病穩定(Reardon?et?al.,2008)。有趣的是,有些證據表明,MET信號與Wnt/β-catenin途徑的相互作用經常在結腸癌中加強。前列腺素E2(PGE2)可激活MET,并且前列腺素E2激活的c-Met與β-catenin相關而且增加其酪氨酸磷酸化,從而誘導結腸癌細胞的浸潤性(Pai?et?al.,2003)。最近,有研究說明了MET和β-catenin可相互激活,導致結直腸腫瘤癌變中這兩個主要因素間的正反饋環路(Rasola?et?al.,2007)。

原發性結直腸癌(n=36)中的c-MetmRNA表達水平是早期浸潤和疾病局部轉移的預測性標記物,這與結腸癌的期別直接相關((Takeuchi?et?al.,2003))。另一項對130個結直腸癌樣本中c-Met表達的分析顯示,c-Met在69%的原發性結直腸癌中過度表達(T/N>2.0)并且在有血管浸潤(P=0.04)以及晚期(P=0.04)的結直腸癌中c-Met水平顯著增高,這支持了c-Met在人結直腸癌進展和轉移中的作用((Zeng?et?al.,2004))。另一項研究顯示,60名結腸腺癌患者中,有69%和60%的患者癌中c-Met表達比鄰近正常粘膜分別高2倍和10倍((Kammula?et?al.,2007))。因此,c-Met信號傳導增強在早期結直腸癌中經常發生,但在晚期和轉移性癌腫中表達大大提高。

表4:本發明組合物中其它有用的免疫原性肽

在WO?2007/028574中披露了SEQ?ID?NO?14、SEQ?ID?NO?15和SEQ?ID?NO?16,CDC42(細胞分裂周期42)是參與調解細胞周期的一種蛋白質。該蛋白質是Rho-子家族的一種小GTP酶,調節控制多種細胞功能的信號通路,其中包括細胞形態、遷移、內吞作用和細胞周期進展。CDC42被發現在膠質母細胞瘤中高度過度表達。

WO2004/067023介紹了腫瘤相關抗原生存素衍生的MHCI類限制肽,這些肽能與HLAI類分子高親和性結合。

分泌磷蛋白1(SPP1),亦稱為骨涎蛋白(BSP-1)、早期T淋巴細胞激活(ETA-1),最經常稱為骨橋蛋白(OPN),是一種人類基因產物,其它物種中也含有。骨橋蛋白是骨重塑中重要的因子。具體來說,研究表明具有將破骨細胞錨固至骨礦物質基質的作用。除了骨橋素外,骨頭的有機成分大約是I型膠原、骨鈣素、骨連接素、骨唾液酸蛋白和堿性磷酸酶干重和計數的20%。I型膠原占蛋白質量的90%。

OPN與數種整合素受體結合,包括白血球表達的α4β1、α9β1和α9β4。這些受體在這些細胞中有效地執行細胞黏附、遷移和生存的功能。因此,近期的研究工作主要集中于OPN在介導這些反應中的作用。

骨橋蛋白表達于廣泛的免疫細胞中,包括巨噬細胞、中性粒細胞、樹突狀細胞,T細胞和B細胞,動力學各不相同。據報道,OPN可以不同方式充當免疫調節劑。首先,它具有趨化特性,促進將細胞征募至發炎部位。它還具有粘附蛋白的功能,參與細胞附著和傷口愈合。另外,OPN介導細胞活化和細胞因子產生,并通過調節細胞凋亡促進細胞存活。

IL-12促進活化T細胞向Th1型分化,從而產生包括IL-12和IFNγ的細胞因子。OPN可抑制Th2細胞因子IL-10的產生,從而加強Th1應答。OPN影響細胞介導的免疫,并具有Th1細胞因子的功能。它增強了B細胞免疫球蛋白的產生和增殖。2008年的最新研究表明,OPN還會引起肥大細胞脫顆粒。[Nagasaka?A,Matsue?H,Matsushima?H,etal.(February?2008)。“骨橋蛋白由肥大細胞產生并影響IgE介導的肥大細胞脫顆粒和遷移”。Eur.J.Immunol.38(2):489-99]研究人員觀察到,與野生型小鼠相比,IgE介導的過敏性反應在剔除OPN的小鼠中顯著降低。一項癌癥研究也提示了OPN在巨噬細胞活化中的作用,研究人員發現,與OPN缺乏腫瘤相比,產生OPN的腫瘤能夠誘導巨噬細胞活化。[21]

在很多情況下,OPN是一種重要的抗凋亡因子。OPN阻止巨噬細胞和T細胞以及暴露于有害刺激物的成纖維細胞和血管內皮細胞的激活誘導的細胞死亡。OPN可阻止炎癥性結腸炎中的非程序性細胞死亡。

OPN與廣泛表達的多種細胞表面受體相互作用的事實使其在許多生理和病理過程中發揮著積極作用,包括傷口愈合、骨轉換、腫瘤的發生、炎癥、缺血和免疫反應。因此,操縱血漿OPN水平可能有利于治療自身免疫性疾病、癌轉移、骨質疏松癥和某些形式的應急。

研究表明,OPN促進IL-17的產生;OPN在多種癌癥中過度表達,包括肺癌、乳腺癌、結直腸癌、胃癌、卵巢癌、黑色素瘤和間皮瘤;OPN還可導致腎小球腎炎和腎小管間質腎炎;并且OPN可在動脈內的粥樣硬化斑塊中發現。因此,操縱血漿OPN水平可能有利于治療自身免疫性疾病、癌轉移、骨質疏松癥和某些形式的應急。

蛋白酪氨酸磷酸酶受體型ξ-1(PTPRZ1,PTP-ξ)

PTPRZ1是受體型蛋白酪氨酸磷酸酶家族的成員,編碼一次通過(single-pass)I型膜蛋白,該被編碼蛋白含兩個細胞質酪氨酸蛋白磷酸酶區域,一個α-碳酸酐酶區域和一個纖維連接蛋白III型區域。在以下細胞中該基因被誘導表達:胃癌細胞(Wu?et?al.,2006)、乳腺癌(Perez-Pinera?et?al.,2007)、多發性硬化病變的再髓鞘化少突膠質細胞(Harroch?et?al.,2002)、以及組織缺氧情況下的人胚胎腎細胞(Wang?et?al.,2005)。

蛋白和轉錄物都在膠質母細胞瘤細胞中過度表達,這促進了它們按絡合點次序進行遷移(haptotactic?migration)(Lu?et?al.,2005)以及膠質細胞瘤中基因組DNA的擴增(Mulholland?et?al.,2006)。

幾丁質酶3樣2(CHI3L2)

CHI3L2最初確定源自軟骨細胞并在骨關節炎等時上調(Steck?et?al.,2002)。雖然該蛋白的特點尚不鮮明,但是它很有可能分泌到細胞外間隙中。常作為類風濕關節炎的靶抗原。siRNA轉染(VEGF-A)人膠質瘤細胞系誘導實驗性抗血管生成造成CHI3L2上調。

生存素(BIRC5)

在胎兒組織和各種人癌癥組織中,BIRC5(生存素)-細胞凋亡抑制蛋白(IAP)家族中的一員-表達升高。生存素似乎具有同時調節細胞增殖和凋亡的能力。特別是在膠質母細胞瘤中,可檢測到非常高水平的生存素表達(Angileri?et?al.,2008)。這表明,生存素在腦膠質瘤中的過度表達可能在惡性增殖、抗凋亡和血管生成中起著重要作用(Zhen?etal.,2005;Liu?et?al.,2006)。尤其是對于膠質母細胞瘤以及其它腫瘤實體,與罹患生存素陰性腫瘤的患者相比,生存素的表達與惡性程度(在膠質母細胞瘤中生存素表達最高)和較短的總存活時間顯著相關(Kajiwara?et?al.,2003;Saito?et?al.,2007;Uematsu?et?al.,2005;Mellai?et?al.,2008;Grunda?et?al.,2006;Xie?et?al.,2006;Sasaki?et?al.,2002;Chakravarti?et?al.,2002)。

乙肝核心抗原

對于乙型肝炎病毒(HBV)核心蛋白HBc,致免疫肽為眾所周知(Bertoletti?et?al.,1993;Livingston?et?al.,1997)。根據本發明,來自HBc的10-氨基酸肽可能納入作為患者免疫活性的陽性對照,并成功接種入癌癥疫苗。

在本發明的一個優選實施方案中,藥物組合物包括至少兩種含有根據SEQ?ID?NO?1的氨基酸序列以及根據SEQ?ID?NO?12或SEQ?ID?No?17的氨基酸序列的肽。

在本發明的一個優選實施方案中,藥物組合物包括至少兩種含有根據SEQ?ID?NO?1的氨基酸序列以及根據SEQ?ID?NO?2和/或SEQ?ID?No?17的氨基酸序列的肽。

在本發明的一個優選實施方案中,藥物組合物包括至少兩種含有根據SEQ?ID?No?SEQ?IDNo?3的氨基酸序列以及根據SEQ?ID?NO?2和/或SEQ?ID?No?17的氨基酸序列的肽。

在本發明的一個優選實施方案中,藥物組合物包括至少兩種含有根據SEQ?ID?No?SEQ?IDNo?1的氨基酸序列以及根據SEQ?ID?NO?7和可選SEQ?ID?No?17的氨基酸序列的肽。

在本發明的一個優選實施方案中,藥物組合物包括至少兩種含有根據SEQ?ID?No?SEQ?IDNo?2的氨基酸序列以及根據SEQ?ID?NO?7和可選SEQ?ID?No?17的氨基酸序列的肽。

在本發明的一個優選實施方案中,藥物組合物包括至少兩種含有根據SEQ?ID?No?SEQ?IDNo?3的氨基酸序列以及根據SEQ?ID?NO?7和可選SEQ?ID?No?17的氨基酸序列的肽。

在更為優選的實施方案中,藥物組合物包括至少有一種以上肽,肽含有選自SEQ?ID?NO2至SEQ?ID?NO?11和SEQ?ID?No?14至SEQ?ID?No?20構成的組中的一個氨基酸序列、和/或與SEQ?ID?NO?2至SEQ?ID?NO?11或SEQ?ID?No?14至SEQ?ID?No?20至少80%相同的一個氨基酸序列,和/或含有編碼SEQ?ID?NO?2至SEQ?ID?NO?11或SEQ?ID?No?14至SEQID?No?20核酸的一個多聚核苷酸或變異氨基酸序列,以及一種藥用載體。

本發明的進一步優選實施方案包括至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17或18個肽,肽含有選自SEQ?ID?NO?1至SEQ?ID?NO?12和SEQ?ID?No?14至SEQ?ID?No?20構成的組中的一個氨基酸序列、和/或與SEQ?ID?NO?1至SEQ?ID?NO?12至少80%相同的一個氨基酸序列、和/或含有編碼SEQ?ID?NO?1至SEQ?ID?NO?12和SEQID?No?14至SEQ?ID?No?20的核酸的一個多聚核苷酸或變異氨基酸序列,以及一種藥用載體。

該藥物組合物還可包含更有效的其它肽和/或賦形劑,將進一步解釋如下。

發明人用給定氨基酸序列的“變種氨基酸序列”表示,一個或多個氨基酸殘基等的側鏈通過取代另一個自然產生的氨基酸殘基的側鏈或其它側鏈而改變,這樣,這種肽仍然能夠以含有給定氨基酸序列的肽大致同樣的方式與HLA分子結合。例如,一種肽可能被修飾以便至少維持(如果不提升的話)其與HLA-A或HLA-DR等合適的MHC分子互動和結合,以及至少維持(如果不提升的話)其產生能識別和殺傷細胞(這些細胞表達含本發明中所定義的一種氨基酸序列的多肽)的激活CTL的能力。從數據庫中可得知,HLA-A結合肽的某些位點通常為錨定殘基,可形成一種與HLA結合槽的結合基序相稱的核心序列。

這些不與T細胞受體互動的氨基酸殘基可通過取代另一個幾乎不影響T細胞反應并不妨礙與相關MHC結合的氨基酸而得到修飾。因此,除了特定限制性條件外,本發明中的肽可能為任何包括給定氨基酸序列或段或變體的肽(發明人所用的這個術語包括寡肽或多肽)。

MHC-II類提呈肽更為大家熟知,這些肽由具有某種HLA特異性氨基酸基序并且N和/或C-端隨意延伸(不干擾肽核心序列功能,如,被視為與肽和T細胞相互作用無關)的“核心序列”組成。N-和/或C端可分別延伸1至10個氨基酸的長度。這些肽可直接用于加載MHC-II類分子或其序列可克隆入下文所述載體。由于這些肽可在細胞內形成較大肽加工過程的最終產物,因此,也可用長肽。本發明的肽的大小不限,但通常它們的分子量可能小于100000,優選為小于50000,更優選為小于10000,更優選為小于5000,更優選為小于2500,通常約為1000至2000。對于氨基酸殘基數目,本發明中的肽可能少于1,000個殘基,優選為少于500個殘基,更優選為少于100個殘基。因此,本發明還提出了總長度為8至100個、優選為8至30個、最優選為8至17個(即8、9、10、11、12、13、14、15或16個)氨基酸的肽或變體的復合物。優選情況是,這些肽含有一個核心序列,其選自SEQ?ID?NO?8、SEQ?ID?NO?12和SEQ?ID?No?14至SEQ?ID?No20構成的組并且C端和/或N端上有1至10個氨基酸的延長,更優選的情況是,這些側翼氨基酸的總數為1至12個,更優選1至10個,更優選1至8個,更優選1至6個,其中側翼氨基酸可在C端和N端以任意比例分布(例如所有側翼氨基酸可以被添加至一個末端,或氨基酸可均等地或以任何其它比例加入兩種末端),但前提是,該肽仍然能根據SEQ?ID?NO?8、SEQ?ID?NO?12和SEQ?ID?No?14至SEQ?ID?No?20任何一個序列所得肽的同樣方式與HLA分子結合。

相應地,誘導T細胞與本發明中的肽發生交叉反應的變體往往為長度可變的變體。如果長度約為12個氨基酸殘基的肽直接與MHC-II類分子結合,那么,兩側有核心HLA結合區、且不會對該肽與MHC-II類分子的結合槽特異性結合能力或該肽提呈至CTL的能力產生重大影響的殘基則為優選。但是,正如上所述,應了解,可使用較大的肽(特別是核苷酸進行編碼時),因為這些較大的肽可被適當的抗原提呈細胞分成片段。另外,側翼氨基酸可以降低體內肽降解速度,以使提供給CTL的肽實際量高于無側翼氨基酸的肽。

MHC?I類表位(通常長度為8至10個氨基酸)也可能由肽從較長的肽或包含實際表位的蛋白中加工而產生。與MHC-II類表位相似,首選情況是,實際表位N-和C-端的拉長前體肽上游和/或下游的側翼殘基不會對該肽提呈至CTL產生重大影響、也不會掩蓋加工拉長肽介導的產生實際表位所需的蛋白裂解位點。

優選情況是,這些肽含有一個核心序列,其由SEQ?ID?NO?1至SEQ?ID?NO?7和SEQ?ID?No9至SEQ?ID?No?11組成并且C端和/或N端上有1至10個氨基酸的延長,更優選的情況是,這些側翼氨基酸的總數為1至12個,更優選1至10個,更優選1至8個,更優選1至6個,其中側翼氨基酸可在C端和N端以任意比例分布(例如所有側翼氨基酸可以被添加至一個末端,或氨基酸可均等地或以任何其它比例加入兩種末端),但前提是,該肽仍然能根據SEQ?ID?NO?1至SEQ?ID?NO?7和SEQ?ID?No?9至SEQ?ID?No?11任何一個序列所得肽的同樣方式與HLA分子結合。

因此,本發明還提出了總長度為8至100個、優選為8至30個、最優選為8至18個(即8、9、10、11、12、13、14、15、16或17個)氨基酸的MHC-I類表位的肽或變體。當然,本發明的肽或變體能與人MHC?I或II類分子結合。肽或變體與MHC復合物結合性可用本領域內的已知方法進行測試,例如,本發明下列實施例中所述的方法或文獻中所述的檢測不同MHC-II類等位基因的方法(例如,Vogt?AB,KropshoferH,KalbacherH,Kalbus?M,Rammensee?HG,Coligan?JE,Martin?R;Ligand?motifs?of?HLA-DRB5*0101?andDRB1*1501?molecules?delineated?from?self-peptides;J?Immunol.1994;153(4):1665-1673;Malcherek?G,Gnau?V,Stevanovic?S,Rammensee?HG,Jung?G,Melms?A;Analysis?ofallele-specific?contact?sitesofnatural?HLA-DR17?ligands;J?Immunol.1994;153(3):1141-1149;Manici?S,Sturniolo?T,Imro?MA,Hammer?J,Sinigaglia?F,Noppen?C,Spagnoli?G,Mazzi?B,Bellone?M,Dellabona?P,Protti?MP;Melanoma?cells?present?a?MAGE-3?epitope?to?CD4(+)cytotoxic?T?cells?in?association?with?histocompatibility?leukocyte?antigen?DR11;J?Exp?Med.1999;189(5):871-876;Hammer?J,Gallazzi?F,Bono?E,Karr?RW,Guenot?J,Valsasnini?P,NagyZA,Sinigaglia?F;Peptide?binding?specificity?of?HLA-DR4?molecules:correlation?withrheumatoid?arthritis?association;.J?Exp?Med.1995?181(5):1847-1855;Tompkins?SM,Rota?PA,Moore?JC,Jensen?PE;A?europium?fluoroimmunoassay?for?measuring?binding?of?antigen?toclass?II?MHC?glycoproteins;J?Immunol?Methods.1993;163(2):209-216;Boyton?RJ,LohmannT,Londei?M,Kalbacher?H,Halder?T,Frater?AJ,Douek?DC,Leslie?DG,Flavell?RA,AltmannDM; Glutamic?acid?decarboxylase?T?lymphocyte?responses?associated?with?susceptibility?orresistance?to?ty

氨基酸其它N和/或C端延伸處不一定能形成作為MHC分子實際表位的肽,但對有效將本發明中的肽引進細胞具有重要作用(見上文)。在本發明的一實施案中,本發明的肽為融合蛋白,含來自NCBI、GenBank登錄號X00497的HLA-DR抗原相關不變鏈(p33,以下稱為“Ii”鏈)的80個N-端氨基酸等(Strubin,M.,Mach,B.and?Long,E.O.Thecomplete?sequence?of?the?mRNA?for?the?HLA-DR-associated?invariant?chain?reveals?apolypeptide?with?an?unusual?transmembrane?polarity?EMBO?J.3(4),869-872(1984)。

優選的藥物組合物是,其中這些肽的總長度可為8至100個氨基酸、優選為8至30個氨基酸,最優選為8至17個(即9、10、11、12、13、14、15或16個)氨基酸。

此外,該肽或變體可進一步修飾以提高穩定性和/或與MHC分子結合,從而引發更強的免疫反應。肽序列的該類優化方法是本領域內所熟知的,包括,例如,反式肽鍵和非肽鍵的引入。

因此,另一方面,本發明提出了一種藥物組合物,其中,至少有一個含非肽鍵的肽或變體。

在反式肽鍵氨基酸中,肽(-CO-NH-)并未連接其殘基,但是其肽鍵是反向的。這種逆向反向模擬肽(retro-inverso?peptidomimetics)可通過本領域已知的方法制備,例如:Meziere等在《免疫學雜志》((1997)J.Immunol.159,3230-3237)中所述的方法,以引用的方式并入本文。這種方法涉及制備包含骨架(而并非側鏈)改變的模擬肽。Meziere等人(1997年)的研究顯示,這些模擬肽有利于MHC和輔助性T細胞的反應。以NH-CO鍵替代CO-NH肽鍵的逆向反向肽大大地提高了抗水解性能。

非肽鍵為-CH2-NH、-CH2S-、-CH2CH2-、-CH=CH-、-COCH2-、-CH(OH)CH2-和-CH2SO-等。美國4897445號專利提出了多肽鏈中非肽鍵(-CH2-NH)的非固相合成法,該方法涉及按標準程序合成的多肽以及通過氨基醛和一種含NaCNBH3的氨基酸相互作用而合成的非肽鍵。

含上述本發明序列的肽可與其氨基和/或羧基末端的其它化學基團進行合成,從而提高肽的穩定性、生物利用度、和/或親和力等。例如,芐氧羰基、丹酰基等疏水基團或叔丁氧羰基團可加入肽的氨基末端。同樣,乙酰基或9-芴甲氧羰基可能位于肽的氨基末端。此外,例如,疏水基團、叔丁氧羰基團或氨基團都可能被加入肽的羧基末端。

另外,本發明中的所有肽都可能經合成而改變其空間構型。例如,可能使用這些肽的一個或多個氨基酸殘基的右旋體,通常不是其左旋體。更進一步地,本發明中肽的至少一個氨基酸殘基可被熟知的一個非天然氨基酸殘基取代。諸如此類的改變可能有助于增加本發明肽的穩定性、生物利用度和/或結合作用。

同樣,本發明中的肽或變體可在合成肽之前或之后通過特異氨基酸的反應而進行化學修飾。此類修飾的實施例為本領域所熟知,例如,在R.Lundblad所著的《Chemical?Reagentsfor?Protein?Modification》(3rd?ed.CRC?Press,2005)中有概述,以參考文獻的方式并入本文。雖然氨基酸的化學修飾方法無限制,但其包括(但不限于)通過以下方法修飾:酰基化、脒基化、賴氨酸吡哆基化、還原烷基化、以2,4,6-三硝基苯磺酸(TNBS)三硝基苯基化氨基團、通過將半胱氨酸過甲酸氧化為磺基丙氨酸而對羧基團和巰基進行氨基修飾、形成易變衍生物、與其它巰基化合物形成混合二硫化合物、與馬來酰亞胺反應,與碘乙酸或碘乙酰胺羧甲基化、在堿性pH值下與氰酸鹽甲氨酰化。在這方面,技術人員參考了《Current?Protocols?In?Protein?Science》(Eds.Coligan?et?al.(John?Wiley?&?Sons?NY1995-2000))中第15章所述的在蛋白質化學修飾相關的廣泛方法。

當蛋白與戊二醛、聚乙二醇二丙烯酸酯和甲醛的交聯用于配制水凝膠時,治療性蛋白和含聚乙二醇的肽的成功修飾往往可延長循環半衰期。針對免疫治療的變態反應原化學修飾往往通過氰酸鉀的氨基甲酰化實現。

一般來說,肽和變體(至少含氨基酸殘基之間的肽聯接)可使用Lu等人(1981)J.Org.Chem.46,3433)以及此處列出的參考文獻所披露的固相肽合成Fmoc-聚酰胺模式等方法進行合成。

純化可通過以下技術的任何一種或組合方法實現,如:再結晶法、體積排阻色譜法、離子交換色譜法、疏水作用色譜法以及(通常)反相高效液相色譜法(如使用乙腈/水梯度分離)。

肽分析可使用以下方法進行:薄層色譜法、電泳法、特別是,毛細管電泳法、固相萃取法(CSPE)、反相高效液相色譜法、酸水解后的氨基酸分析、快原子轟擊(FAB)質譜分析法以及MALDI、ESI-Q-TOF質譜分析法。

另一方面,本發明提出了一種編碼本發明中肽或變體的核酸(如多聚核苷酸)。多聚核苷酸可能為DNA、cDNA、PNA、CAN、RNA等或為單鏈和/或雙鏈,或多聚核苷酸的原生或穩定形式,如:具有硫代磷酸骨架的多聚核苷酸,或其組合物,并且只要它編碼肽,就可能包含也可能不包含內含子。當然,多聚核苷酸只能編碼加入天然肽鍵并含有天然氨基酸殘基的肽。另一個方面,本發明提出了一種可根據本發明表達多肽的表達載體。不同類型細胞的表達載體為本領域所熟知并且無需過度不當實驗就可選定。

一般來說,DNA可以適當的方向和正確的表達閱讀框架附著到一種表達載體(如質粒)中。如有必要,該DNA可能與所需宿主所識別的相應轉錄和翻譯調節控制核苷酸序列連接,盡管表達載體中一般存在此類控制功能。然后,該載體通過標準方法被引入宿主。指導可參閱,如:Sambrook等(1989)所著Molecular?Cloning,A?Laboratory?Manual,ColdSpring?Harbor?Laboratory,Cold?Spring?Harbor,NY。

但是,在本發明的一個特別優選實施方案中,藥物組合物至少包含兩種由根據SEQ?IDNO?1至SEQ?ID?NO?12的氨基酸序列構成的肽。

疫苗所含每種肽的最佳量以及最佳給藥方案可由一名對本領域技術人員確定,而無需進行過度不當實驗。例如,肽或其變體可制備為靜脈(i.v.)注射劑、皮下(s.c.)注射劑、皮內(i.d.)注射劑、腹腔(i.p.)注射劑、肌肉(i.m.)注射劑。肽注射的優選途徑為s.c.、i.d.、i.p.、i.m.和i.v.注射。DNA注射的優選途徑為i.d.、i.m.、s.c.、i.p.和i.v.注射。例如,給予1至500mg、50μg至1.5mg,優選為125μg至500μg的肽或DNA,這取決于具體的肽或DNA。上述劑量范圍在以前的試驗中成功使用(Brunsvig?PF,Aamdal?S,GjertsenMK,Kvalheim?G,Markowski-Grimsrud?CJ,Sve?I,Dyrhaug?M,Trachsel?S,M,EriksenJA,Gaudernack?G;.Telomerase?peptide?vaccination:a?phase?I/II?study?in?patients?withnon-small?cell?lung?cancer;Cancer?Immunol?Immunother.2006;55(12):1553-1564;M.Staehler,A.Stenzl,P.Y.Dietrich,T.Eisen,A.Haferkamp,J.Beck,A.Mayer,S.Walter,H.Singh,J.Frisch,C.G.Stief;An?open?label?study?to?evaluate?the?safety?and?immunogenicity?ofthe?peptide?based?cancer?vaccine?IMA901,ASCO?meeting?2007;Abstract?No?3017)本發明的藥物組合物可能會進行匯編,其中,從而組合物中肽的選擇和所含數量都能特異性地針對組織、癌癥和/或患者。例如,特定組織中親本蛋白的表達模式可引導肽的準確選擇,從而避免副作用。這種選擇可能會依賴于待治療患者具體的癌癥類型、以及疾病狀態、早期治療方案、患者免疫狀態,當然,還有患者的HLA單倍型。此外,根據特定患者的個人需求,本發明的疫苗可包含個性化成分。根據特定患者的相關TAA的表達、由于個人過敏或其它治療方法而產生的意外副作用、以及第一輪治療后對二次治療或治療方案的調整,各實施例中的肽含量有所不同。

對于用作GBM疫苗的一種組合物,例如,親本蛋白在正常組織中高表達的肽在本發明的組合物中將會避免使用或含量較低。另一方面,如果已知某個患者的腫瘤高表達某種蛋白,則治療這種癌癥的各藥物組合物可能含有大量和/或一個以上針對這種特定蛋白的肽,或者可能含有這種蛋白的通路。技術人員可通過以下測試選擇免疫原性肽的優選組合,如:測試體外T細胞的代及其效果和總量、針對某些肽的某些T細胞的增殖、親和力和擴增,以及通過分析IFN-γ的產生(參閱下文實施例)測試.細胞的功能性。通常為了上述之目的,最有效的肽然后組合為一種疫苗。

一種合適的疫苗將優選為包含1至20個肽,更優選為2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個不同的肽,進一步優選為6、7、8、9、10、11、12、13或14個不同的肽,最優選為10、11、12、13或14個不同的肽。用于癌癥疫苗的肽長度為任何合適的肽。特別是,它可能是一種合適的9-mer肽或一種合適的8-mer或9-mer或10-mer或11-mer肽或12-mer、13-mer、14-mer或15-mer肽.。較長的肽也可能適合,附表1和2中所述的9-mer或10-mer肽優選為MHC-I類肽,而12-至15-mer肽優選為MHC-II類肽。

肽組成了腫瘤或癌癥疫苗。該疫苗可直接給到患者的受影響器官,也可全身給藥,或體外應用到來自患者或其細胞株的細胞(隨后再將這些細胞注入到患者中),或體外用于從來自患者的免疫細胞的一個細胞亞群(然后再將細胞重新給予患者)。

該肽可能為純肽,也可能是與免疫刺激佐劑的組合物(見下文)、或與免疫刺激細胞因子聯合使用、或以適當的輸送系統給藥,例如脂質體。該肽也可共軛形成一種合適的載體(如鑰孔蟲戚血藍蛋白(KLH)或甘露)到合適的載體(參閱WO?95/18145及Longenecker等(1993)Ann.NY?Acad.Sci.690,276-291)。該肽也可進行標記、或是一種融合蛋白或是雜合分子。本發明中給出肽序列的肽預期會刺激CD4或CD8CTL。但是,有反向CD陽性T細胞提供幫助時,刺激更為有效。因此,對于刺激CD4T細胞的MHC-II類表位,一種雜合分子的融合伙伴或片段提供了刺激CD8陽性T細胞的適當表位。另一方面,對于刺激CD8CTL的MHC-I類表位,一種雜合分子的融合伙伴或片段提供了刺激CD4陽性T細胞的適當表位。CD4-和CD8刺激表位為本領域所熟知、并包括本發明中確定的表位。

藥用載體通常是已熟知的液體,可配制其中的一種有效治療劑制。劑型中的載體雖然可能具有化學和/或生物穩定性、釋放特性等等,但是一般不具備任何藥理活性。典型配方可在諸如Alfonso?R.Gennaro.Remington:The?Science?and?Practice?of?Pharmacy,20thEditionBaltimore,MD:Lippincott?Williams?&?Wilkins,2000等書籍中找到,包括(但不限于)鹽水、水、緩沖水、0.3%甘氨酸、透明質酸、葡萄糖等。最近,人們發現在人類患者中用作靜脈營養很多年的某些脂肪乳劑也可充當一種肽賦形劑。有兩種此類乳劑已用作商用脂肪乳劑,名叫Intralipid、Lipofundin。″Intralipid″是瑞典Kabi?Pharmacia公司一種靜脈營養脂肪乳劑的注冊商標,美國專利號為3169094。″Intralipid″是德國B.BraunMelsungen公司的注冊商標。兩者均包含大豆油脂肪(1000蒸餾水中含100或200克:即含量分別為10%或20%)。Intralipid中卵黃磷脂用作乳化劑(12g/l蒸餾水),Lipofundin中蛋黃卵磷脂用作乳化劑(12g/l蒸餾水)。Intralipid和Lipofundin的等滲性均是在它們中加入甘油(25g/l)的結果。

為了引發免疫反應,通常疫苗有必要包括使該組合物具有更多免疫原性的佐劑。因此,在本發明的一個優選實施方案中,本藥物組合物進一步包括了至少一種合適的佐劑。佐劑是那些非特異性地增強或加強免疫反應的物質(例如,通過CTL和輔助T(TH)細胞介導的對一種抗原的免疫應答),因此被視為對本發明的藥劑有用。適合的佐劑包括(但不僅限于)1018ISS、鋁鹽、Amplivax、AS15、BCG、CP-870,893、CpG7909、CyaA、dSLIM、GM-CSF、IC30、IC31、Imiquimod、ImuFact?IMP321、干擾素-α或β、IS?Patch、ISS、ISCOM、JuvImmune、LipoVac、MF59、單磷酰脂A、和其它非毒性LPS衍生物、Montanide?IMS?1312、Montanide?ISA?206、Montanide?ISA?50V、Montanide?ISA-51、OK-432、OM-174、OM-197-MP-EC、ONTAK、載體系統、PLG微粒、resiquimod、SRL172、病毒顆粒和其它病毒樣顆粒、YF-17D、VEGF?trap、R848、β-葡聚糖、Pam3Cys、源自皂角苷、分支桿菌提取物和細菌細胞壁合成模擬物的Aquila公司的QS21刺激子(Aquila生物技術公司,Worcester,MA,USA),以及其它專有佐劑,如:Ribi公司的Detox、Quil或Superfos。Imiquimod、Resimiquimod、弗氏不完全佐劑、干擾素-α或GM-CSF為優選佐劑。前面一對一些樹突狀細胞特異性免疫佐劑(如MF59)及其制備方法進行了描述(Dupuis?M,Murphy?TJ,Higgins?D,Ugozzoli?M,van?Nest?G,Ott?G,McDonald?DM;Dendritic?cells?internalize?vaccine?adjuvant?after?intramuscular?injection;Cell?Immunol.1998;186(1):18-27;Allison?AC;The?mode?of?action?of?immunological?adjuvants;Dev?BiolStand.1998;92:3-11).也可使用細胞因子。一些細胞因子直接影響樹突狀細胞向淋巴組織遷移(如,TNF-α),加速樹突狀細胞成熟為T淋巴細胞的有效抗原提呈細胞(如,GM-CSF、IL-1和IL-4)(美國5849589號專利,特別以其參考文獻的完整形式并入本文),并充當免疫佐劑(如,IL-12)(Gabrilovich?DI,Cunningham?HT,Carbone?DP;IL-12and?mutant?P53?peptide-pulsed?dendritic?cells?for?the?specific?immunotherapy?of?cancer;JImmunother?Emphasis?Tumor?Immunol.1996(6):414-418)。

據報告,CpG免疫刺激寡核苷酸可提高佐劑在疫苗中的作用。如果沒有理論的約束,CpG寡核苷酸可通過Toll樣受體(TLR)(主要為TLR9)激活先天(非適應性)免疫系統從而起作用。CpG引發的TLR9活化作用提高了對各種抗原的抗原特異性體液和細胞反應,這些抗原包括肽或蛋白抗原、活病毒或被殺死的病毒、樹突狀細胞疫苗、自體細胞疫苗以及預防性和治療性疫苗中的多糖結合物。更重要的是,它會增強樹突狀細胞的成熟和分化,導致TH1細胞的活化增強以及細胞毒性T淋巴細胞(CTL)生成加強,甚至CD4T細胞幫助的缺失。甚至有疫苗佐劑的存在也能維持TLR9活化作用誘發的TH1偏移,這些佐劑如:正常促進TH2偏移的明礬或弗氏不完全佐劑(IFA)。CpG寡核苷酸與以下其它佐劑或配方一起制備或聯合給藥時,表現出更強的佐劑活性,如微粒、納米粒子、脂肪乳或類似制劑,當抗原相對較弱時,這些對誘發強反應尤為必要。他們還能加速免疫反應,使抗原劑量減少約兩個數量級,在有些實驗中,對不含CpG的全劑量疫苗也能產生類似的抗體反應(Arthur?M.Krieg,Therapeutic?potential?of?Toll-like?receptor?9activation,Nature?Reviews,Drug?Discovery,2006,5,471-484)。美國6406705?B1號專利對CpG寡核苷酸、非核酸佐劑和抗原結合使用促使抗原特異性免疫反應進行了描述。市售CpGTLR9拮抗劑為Mologen公司(德國柏林)的dSLIM(雙干環免疫調節劑),這是本發明藥物組合物的優選成分。也可使用其它如TLR結合分子,如:RNA結合TLR7、TLR8和/或TLR9。

其它有用的佐劑例子包括(但不限于)化學修飾性CpG(如CpR、Idera)、Poly(I:C)(如polyI:C12U)、非CpG細菌性DNA或RNA以及免疫活性小分子和抗體,如:咪唑喹啉、環磷酰胺、舒尼替單抗、西樂葆、NCX-4016、西地那非、他達拉非、伐地那非、索拉非尼、XL-999、CP-547632、帕唑帕尼、ZD2171、AZD2171、ipilimumab、tremelimumab和SC58175,這些藥物都可能有治療作用和/或充當佐劑。技術人員無需過度進行不當實驗就很容易確定本發明中有用的佐劑和添加劑的數量和濃度。

優選佐劑為dSLIM、BCG、OK432、咪喹莫特、resimiquimod、GM-CSF、干擾素-α、PeviTer和JuvImmune或其組合物。

本發明藥物組合物的一個優選實施方案中,佐劑選自集落刺激因子構成的組,如粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF,沙格司亭)、咪喹莫特、resiquimod和干擾素-α。

在本發明藥物組合物的一個優選實施方案中,佐劑為咪喹莫特或resimiquimod。在本發明藥物組合物的一個優選實施方案中,佐劑為GM-CSF和咪喹莫特的組合物。

此組合藥物為非腸道注射使用,如皮下、皮內、肌肉、腹腔注射,也可口服。為此,肽和其它選擇性分子在藥用載體中分解或懸浮,優選為水載體。此外,組合物可包含輔料,如:緩沖劑、結合劑、沖擊劑、稀釋劑、香料、潤滑劑等。這些肽也可與免疫刺激物質合用,如:細胞因子。可用于此類組合物的更多輔料可在從A.Kibbe所著的Handbook?ofPharmaceutical?Excipients(第3版,2000年,美國醫藥協會和制藥出版社)等書中獲知。此組合藥物可用于阻止、預防和/或治療腺瘤或癌性疾病,優選為結直腸癌。

細胞毒性T細胞(CTL)可識別與MHC分子而不是與完整外來抗原本身結合的以一種肽形式出現的抗原。MHC分子本身位于抗原提呈細胞的細胞表面。因此,只有出現肽抗原、MHC分子和APC三聚體復合物時,才可能激活CTL。相應地,如果并非只有該肽用于激活CTL,而是添加了含各MHC分子的額外APC,則可提高免疫反應。

因此,在本發明藥物組合物的一個優選實施方案中,另外至少包含一種抗原提呈細胞。抗原提呈細胞(或刺激因子細胞)通常在其表面有一個MHC-I類或II類分子,在一個實施方案中,該抗原提呈細胞自身基本上不能向MHC-I類或II類分子載入選定抗原。正如下面的更為詳細描述,MHC-I類或II類分子在體外可很容易載入選定抗原。

優選情況是,哺乳動物細胞的TAP肽轉運載體缺乏或水平下降或功能降低。缺乏TAP肽轉運載體的適合細胞包括人體肽載入缺陷細胞株T2,從屬美國菌種保藏中心(12301Parklawn?Drive,Rockville,Maryland?20852,美國)目錄號CRL1992;諸如T2的TAP缺陷細胞株可用作APC,并且由于缺乏TAP,幾乎所有由MHC?I類分子提呈的肽均受到關注,用于外部載入這些細胞株的空載MHC-I類分子,因此所有作用都將無疑地歸因于使用的肽。

抗原提呈細胞優選為樹突狀細胞。適當的樹突狀細胞為自體樹突狀細胞,用抗原肽作脈沖處理。抗原肽可以是產生適當T細胞反應的任何合適的抗原肽。Murphy等人(1996)在《前列腺》雜志(The?Prostate?29,371-380以及The?Prostate?32,272-278)中披露了一種使用自體樹突狀細胞的T細胞療法,自體樹突狀細胞由一種抗原相關腫瘤的肽進行脈沖處理。

因此,在本發明的一個優選實施方案中,至少包含一種抗原提呈細胞的藥物組合物以該肽進行脈沖處理或進行加載,例如,通過實施例4的方法。

作為一種替代物,抗原提呈細胞包括一個編碼肽的表達載體。多聚核苷酸可能選為任何合適的多聚核苷酸,優選為能轉導樹突狀細胞,從而提呈一種肽并誘導免疫性。

本發明的核酸優選為由一種病毒核苷酸或病毒組成。例如,腺病毒轉導的樹突狀細胞表明可誘導與MUC1相關的抗原特異性抗腫瘤免疫(參閱Gong?et?al(1997)Gene?Ther.4,1023-1028)。同樣地,也可使用基于腺病毒的系統(例如參閱,Wan?et?al(1997)Hum.GeneTher.8,1355-1363);可使用逆轉錄病毒系統(Specht?et?al(1997)J.Exp.Med.186,1213-1221和Szabolcs?et?al(1997)(也可使用血液顆粒介導移轉至樹突狀細胞的方法(Tuting?et?al(1997)Eur.J.Immunol.27,2702-2707);亦可使用RNA(Ashley?et?al(1997)J.Exp.Med.186,1177?1182)。

一般來說,本發明中,含有發明中的一種(多種)核酸的藥物組合物可用本發明中那些含有肽的藥物復合物的相似給藥方式給予,如:靜脈注射、動脈注射、腹腔注射、肌肉注射、皮內注射、瘤內注射、口服、經皮、經鼻腔、經口腔、經直腸、經陰道、吸入、或外用。

由于逃逸機制的原因,腫瘤往往對治療藥物產生耐藥。耐藥性可能在治療期間出現,并轉移和復發腫瘤中表現出來。為了避免這種耐藥性,腫瘤通常通過聯合給藥治療,轉移瘤和無病期后復發的腫瘤后往往需要不同的藥物組合來治療。因此,在本發明的一方面,藥物組合物與第二種抗癌藥物結合使用。第二種藥物可在本發明中的藥物組合物給藥之后給予,也可同時給藥。例如,如果化學性質相容,本發明中的藥物組合物可與第二種抗癌藥物混合使用,從而實現同時給藥。同時給藥的另一種方法是,本組合物與抗癌藥物同一天給藥,給藥途徑可不同,例如,本發明的藥物組合物可注射給藥,而第二種抗癌藥物可口服。藥物組合物和第二種抗癌藥物也可在同一療程給藥,但是不在同一天和/或在不同的療程內給藥。

另一個方面,本發明提出了一種治療或預防患者癌癥的方法,包括給予患者本發明中的任何一種藥物組合物的有效治療量。

有效治療量是指能引發免疫反應的量,特別是激活CTL亞群。本領域的技術人員可使用免疫學標準方法很容易確定使用量是否有效,如:本說明書實施例中的方法。監測本藥物組合物某種量效果的方法是觀察受治療腫瘤的生長和/或其復發情況。

在本發明藥物組合物的一個特別優選實施方案中,本藥物組合物作為抗癌疫苗使用。

含肽組合物或肽編碼的核酸也可以構成腫瘤或癌癥的疫苗。該疫苗可直接給到患者的受影響器官,也可全身給藥,或體外應用到來自患者或其細胞株的細胞(隨后再將這些細胞注入到患者中),或體外用于從來自患者的免疫細胞的一個細胞亞群(然后再將細胞重新給予患者)。

本發明的藥物組合物可用于治療癌癥或作為癌癥疫苗使用。癌種可能是口腔癌、咽癌,消化道癌、結腸癌、直腸癌、肛門癌、呼吸道癌、乳腺癌、宮頸癌、陰道癌、外陰癌、子宮體癌、卵巢癌、男性生殖道癌、尿道癌、骨癌、軟組織癌、卡波西肉瘤、皮膚黑色素瘤、眼黑色素瘤、非黑色素瘤眼癌、腦癌、中樞神經系統癌、甲狀腺癌、其它內分泌腺癌、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、骨髓瘤,優選為腎癌、結直腸癌、肺癌、乳腺癌、胰腺癌、前列腺癌、胃癌、腦癌、胃腸道間質瘤或膠質母細胞瘤,優選為腦瘤,更優選為膠質母細胞瘤。

根據本發明,治療方法或疫苗的一個最優選實施方案中,疫苗為治療GBM的一種多肽腫瘤疫苗。該疫苗優選包括從SEQ?ID?No.1至SEQ?ID?No.12選定的一系列腫瘤相關肽,它們已經被確定位于原發性膠質母細胞瘤細胞中。這些肽包括HLA-I類和II類肽。這些肽還可至少包括乙肝病毒核心抗原中的一種肽,這種肽為正性控制肽,是檢測皮內給藥療效的免疫標記物。在一個特別的實施方案中,疫苗包括14種肽(根據SEQ?ID?No.1至SEQ?ID?No.12),每種肽含量約為1500μg至75μg,優選為約1000μg至175μg,更優選為約500μg至600μg,最優選為約578μg,所有的肽都可用HPLC和離子交換色譜法進行純化,外觀為白色或類白色粉末。真空凍干粉最好溶于碳酸氫鈉,在室溫下重組后30分鐘用于皮內注射。根據本發明,肽的首選含量約為0.1至100mg,優選為約0.1至1mg,最優選為每500mg的溶液中約300μg至800μg。在此,如果未具體說明,“約”一詞系指給定值的+/-10%。技能嫻熟的人能根據以下因素調整肽的實際使用量,如:患者個體的免疫狀態和/或特定癌種所提呈的TUMAP含量。本發明的肽可能有其它形式(無菌溶液等),而不是真空凍干粉。

藥品組合物包括游離形式或以一種藥用鹽形式存在的肽。

此處使用的“藥用鹽”系指所公開的肽的一種衍生物,其中該肽由制酸或藥劑的堿鹽進行改性。例如,酸性鹽采用自由基(通常其中藥物的中性形式具有一種中性-NH2基團)通過與合適酸發生反應而制得。適合制備酸鹽的酸包括有機酸,如:乙酸、丙酸、羥基酸、丙酮酸、草酸、蘋果酸、丙二酸、丁二酸、馬來酸、富馬酸、酒石酸、檸檬酸、苯甲酸酸、肉桂酸、扁桃酸、甲磺酸、甲磺酸、苯磺酸、水楊酸等等、以及無機酸,如:鹽酸、氫溴酸、硫酸、硝酸和磷酸等。相反,可在一種肽上提呈的酸性基團的堿鹽制劑使用藥用堿基進行制備,如氫氧化鈉、氫氧化鉀、氫氧化銨、氫氧化鈣、三甲胺等等。

在特別優選的實施例中,藥物組合物包括乙酸(醋酸鹽)銨或鹽酸(氯化物)形式的肽。

在一個實施方案中,本發明的藥物組合物可能包括糖、糖醇、氨基酸(如:甘氨酸、精氨酸、谷氨酸等)作為骨架形成劑。這些糖可能為單糖、雙糖或三糖。這些糖可單獨使用,也可與糖醇組合。糖的實例包括:單糖(如:葡萄糖、甘露糖、半乳糖、果糖或山梨糖)、雙糖(如:蔗糖、乳糖、麥芽糖或海藻糖)以及三糖(如:棉子糖)。糖醇可能為,例如,甘露糖。優選成分為蔗糖、乳糖、麥芽糖、海藻糖、甘露醇和/或山梨醇,更優選為甘露醇。

此外,本發明的藥物組合物可能包括生理耐受性好的輔料(參見《藥用輔料手冊(Handbook?of?Pharmaceutical?Excipients)》,第五版,Raymond?Rowe、Paul?Sheskey和SianOwen編著,醫藥出版社(2006年)),抗氧化劑如:抗壞血酸或谷胱甘肽,防腐劑如:苯酚、間甲酚、甲基或對羥苯甲酸丙酯、氯丁醇、硫柳汞或苯扎氯銨、穩定劑,骨架形成劑如:蔗糖、乳糖、麥芽糖、海藻糖、甘露糖、甘露醇和/或山梨醇,甘露醇和/或乳糖及增溶劑如:聚乙二醇(PEG),即PEG?3000、3350、4000或6000或環糊精,即羥丙基-β-環糊精、磺丁基醚-β-環糊精和γ環糊精、或右旋糖酐或泊洛沙姆,即泊洛沙姆407、泊洛沙姆188、或吐溫20、吐溫80。在一項優選實施方案中,本發明的藥物組合物包括一種或多種從抗氧化劑、骨架形成劑和穩定劑構成的組之中所選的耐受性良好的輔料。靜脈和肌注給藥可接受的pH值范圍為pH?2-12,但皮下給藥的pH范圍降至2.7-9.0,這是因為體內稀釋率降低,導致注射部位產生放射的可能性加大。Strickley?Robert?G.,Pharm.Res.,21,NO:2,201-230(2004)。

本發明中含肽和/或核酸的藥物制劑給予罹患與各種肽或抗原相關的腺瘤或癌性疾病患者。通過這種方法可以觸發T細胞介導的免疫反應。

根據本發明,優選的一種藥物組合物,其中(尤其是腫瘤相關的)肽、核酸或表達載體含量為組織、癌癥和/或患者特異性含量。

本發明的另一實施方案中,疫苗為核酸疫苗。接種核酸疫苗(如DNA疫苗)編碼多肽會導致T細胞反應。該疫苗可直接給到患者的受影響器官,也可全身給藥,或體外應用到來自患者或其細胞株的細胞(隨后再將這些細胞注入到患者中),或體外用于從來自患者的免疫細胞的一個細胞亞群(然后再將細胞重新給予患者)。如果核酸給予體外細胞,可能有益于細胞轉染,以共同表達免疫刺激細胞因子,如白細胞介素-2或GM-CSF。核酸可完全單獨給藥,也可與免疫刺激佐劑或與免疫刺激細胞因子聯合使用,或以適當的輸送系統給藥,例如脂質體。核酸疫苗可與佐劑一起使用,如上述與肽疫苗一起使用的佐劑。核酸疫苗優選為不與佐劑聯合給藥。

多聚核苷酸可為基本純化形式,也可包被于載體或輸送系統。合適的載體和輸送系統包括病毒系統,如基于腺病毒、牛痘病毒、逆轉錄病毒、皰疹病毒、腺相關病毒或含一種以上病毒元素的混合病毒的系統。非病毒輸送系統包括陽離子脂質體和陽離子聚合物,都是DNA輸送本領域內熟知的方法。也可使用物理輸送系統,如通過“基因槍”。肽或核酸編碼的肽可以是一種融合蛋白,例如,含破傷風類毒素的一個表位(刺激CD-4陽性T細胞)。

適當的情況是,給予患者的任何核酸都是無菌、無熱原的。裸DNA可肌肉注射、皮內注射或皮下注射。核酸疫苗優選可包括任何合適的核酸輸送工具。核酸,優選為DNA,也可用一種脂質體或病毒載體輸送系統輸送。如果是核酸疫苗(如DNA疫苗),首選注入肌肉,而肽疫苗首選皮下注射。疫苗也優選注入皮內。

我們認為,核酸的吸收和專業抗原提呈細胞(如樹突狀細胞)編碼的肽的表達可能是免疫反應的啟動機制所致;然而,樹突狀細胞可能不會被轉染,但是由于它們可能會從組織中的轉染細胞中挑選出被表達的肽,因此仍然很重要(“交叉啟動”,例如,ThomasAM,Santarsiero?LM,Lutz?ER,Armstrong?TD,Chen?YC,Huang?LQ,Laheru?DA,Goggins?M,Hruban?RH,Jaffee?EM.Mesothelin-specific?CD8(+)T?cell?responses?provide?evidence?of?invivo?cross-priming?by?antigen-presenting?cells?in?vaccinated?pancreatic?cancer?patients.J?ExpMed.2004?Aug?2;200(3):297-306)。

Conry等(1996年)在《腫瘤學論文集》(Seminars?in?Oncology?23,135-147)中、Condon等(1996年)在《自然-醫學》(Nature?Medicine?2,1122-1127)中、Gong等(1997年)在《自然-醫學》(Nature?Medicine?3,558-561)中、Zhai等(1996年)在《免疫學雜志》(J.Immunol.156,700-710)中、Graham等(1996年)在《國際癌癥雜志》(Int?J.Cancer?65,664-670)中、Burchell等(1996)309-313在Breast?Cancer,Advances?in?biology?and?therapeutics一文中、Calvo等(Eds)、John?Libbey?Eurotext都對多聚核苷酸介導的癌癥免疫化治療進行了描述,以完整引用形式并入本文。

這也可能有益于疫苗特異性靶向作用于細胞群(例如抗原提呈細胞),可使用局部注射、使用靶向性載體和輸送系統、或對患者該類細胞群的選擇性純化以及體外給予肽或核酸(例如,樹突狀細胞可按Zhou等人(1995年)在Blood?86,3295-3301中、Roth等人(1996年)在Scand.J.Immunology?43,646-651中所述的方法進行分類)。例如,靶向性載體可包括一個組織或腫瘤特異性啟動子,引導抗原在適當的位置表達。

最后,本發明的疫苗可由待治療患者具體的癌癥類型、以及疾病狀態、早期治療方案、患者免疫狀態所決定,當然,還有患者的HLA單倍型。此外,根據特定患者的個人需求,本發明的疫苗可包含個性化成分。根據特定患者的相關TAA的表達、由于個人過敏或其它治療方法而產生的意外副作用、以及第一輪治療后對二次治療或治療方案的調整,各實施例中的肽含量有所不同。

本發明的肽除了用于治療癌癥,也可用于診斷。由于肽由膠質母細胞瘤產生,并且已確定這些肽在正常組織中不存在,因此這些肽可用于診斷癌癥是否存在。

組織切片上存在本發明的肽可有助于病理師診斷癌癥。用抗體、質譜或其它本領域內已知的方法檢測本發明的某些肽可使病理師判斷該組織為惡性的、炎癥還是一般病變。本發明肽基團的存在使得能對病變組織進行分類或子分類。

對病變標本中本發明肽的檢測使得能對免疫系統治療方法的利益進行判斷,特別是如果T淋巴細胞已知或預計與作用機制有關。MHC表達的缺失是一種機制,充分說明了哪些受感染的惡性細胞逃避了免疫監視。因此,本發明肽的提出表明,分析過的細胞并沒有利用這種機制。

本發明的肽可用于分析對本發明肽發生的淋巴細胞反應(如T細胞反應),或對本發明肽發生的抗體反應,或分析本發明中與MHC分子絡合的肽。這些淋巴細胞反應可以作為預后指標,決定是否采取進一步的治療。這些反應也可以用作免疫療法中的替代指標,旨在以不同方式誘導淋巴細胞反應,如接種蛋白疫苗、核酸、自體材料、淋巴細胞過繼轉移。基因治療中,對本發明肽發生的淋巴細胞反應可以在副作用的評估中考慮。淋巴細胞反應監測也可能成為移植療法隨訪檢查中的一種有價值的工具,如,用于檢測移植物抗宿主和宿主抗移植物疾病。

在另一個方面,本發明涉及一個套件,包括(a)一個容器,包含上述溶液或凍干粉形式的藥物組合物;(b)可選項,第二個容器,含凍干粉劑型的稀釋劑或重組溶液;及(c)可選項,(i)使用溶液或(ii)重組和/或使用凍干粉劑型的說明書。該套件可進一步包括一個或多個(iii)緩沖劑,(iv)稀釋劑,(v)過濾液,(vi)針,或(v)注射器。容器優選為瓶子、西林瓶、注射器或試管;也可為多用途容器。藥物組合優選為凍干粉劑。

本發明中的套件優選包含一種置于合適容器中的凍干制劑以及重組和/或使用說明。適當的容器包括,例如瓶子、西林瓶(如雙室瓶)、注射器(如雙室注射器)和試管。該容器可能由多種材料制成,如玻璃或塑料。優選情況是,套件和/或容器上有說明,表明重組和/或使用的指示。例如,標簽可能表明凍干劑型將重組為上述肽濃度。該標簽可進一步表明制劑用于皮下注射。

存放制劑的容器可使用多用途西林瓶,使得可重復給予(例如,2-6次)重組劑型。該套件可進一步包括裝有合適稀釋劑(如碳酸氫鈉溶液)的第二個容器。

稀釋液和凍干制劑混合后,重組制劑中的肽終濃度優選為至少0.15mg/mL/肽(=75μMg),不超過3mg/mL/肽(=1500μMg)。該套件還可包括商業和用戶角度來說可取的其它材料,包括其它緩沖劑、稀釋劑,過濾液、針頭、注射器和帶有使用說明書的包裝插頁。

本發明中的套件可能有一個單獨的容器,其中包含本發明所述的藥物組合物制劑,該制劑可有其它成分(例如,其它化合物或及其藥物組合物),也可無其它成分,或者每種成分都有其不同容器。

優選情況是,本發明的套件包括與本發明的一種制劑,包裝后與第二種化合物(如佐劑(例如GM-CSF)、化療藥物、天然產品、激素或拮抗劑、抗血管生成劑或抑制劑、凋亡誘導劑或螯合劑)或其藥物組合物聯合使用。該套件的成分可進行預絡合或每種成分在給予患者之前可放置于單獨的不同容器。該套件的成分可以是一種或多種溶液,優選為水溶液,更優選為無菌水溶液。該套件的成分也可為固體形式,加入合適的溶劑后轉換為液體,最好放置于另一個不同的容器中。

治療套件的容器可能為西林瓶、試管、燒瓶、瓶子、注射器、或任何其它盛裝固體或液體的工具。通常,當成分不只一種時,套件將包含第二個西林瓶或其它容器,使之可以單獨定量。該套件還可能包含另一個裝載藥用液體的容器。優選情況是,治療套件將包含一個設備(如,一個或多個針頭、注射器、滴眼器、吸液管等),使得可注射本發明的藥物(本套件的組合物)。

本發明的藥物配方適合以任何可接受的途徑進行肽給藥,如口服(腸道)、鼻內、眼內、皮下、皮內、肌內,靜脈或經皮給藥。優選為皮下給藥,最優選為皮內給藥,也可通過輸液泵給藥。

應該認識到,此處披露和描述的本發明特點不僅可聯合使用,而且也可以單獨的方式使用,只要在本發明的預期用途范疇內。為了本發明之目的,所有參考文獻均以完整引用的形式并入本文。

下列參考圖、序列表和實施例將對本發明進行詳細描述。以下實施例僅作為說明之用,而不是為了限制本發明。

附圖簡要說明

圖1:微球四聚體技術分析促進了健康供體外周血CSP-001和NLGN4X-001特異性CD8+淋巴細胞增殖。與抗CD28+高密度腫瘤抗原A*0201/CSP-001(左板)或抗CD28+高密度腫瘤抗原A*0201/NLGN4X-001(右板)耦合的微球每周對每孔中1x106CD8+濃縮PBMC進行了刺激。經過三次體外刺激,所有的細胞用抗體CD8?FITC+熒光標記的四聚體A*0201/CSP-001和A*0201/NLGN4X-001進行染色。細胞在CD8+淋巴細胞上得到門控;數字代表CD8+淋巴細胞指定象限內的細胞百分比。

圖2:HLA-A*0201等位基因編碼的本發明HLA-I類肽對MHC分子的親和性。IMA950HLA?I類TUMAP、對照肽IMA-MUC-001(中等強度結合劑)以及病毒標志物肽HBV-001(強力結合劑)的解離常數(KD)用基于ELISA的MHC重折疊檢測法測得。該法重復三次,結果相似。

圖3:IMA-BIR-002和IMA-MET-005衍生15-聚體與最常見HLA-DR等位基因的體外相對結合。為了確定MHC的速率,ProImmune?REVEALTM技術采用了HLA-DR裝配檢測法:肽復合物作為各個肽結合常數的主要決定因素。該法是由ProImmune(Oxford,UK)執行。在固定時間點,完整MHC的量:對肽復合物進行測量并與合格/不合格對照劑(較弱結合劑)的量進行比較。強力混雜性HLA-DR結合劑作為陽性對照。數值表示各個肽和HLA-DR分子相對于合格/不合格對照劑的結合量。由于REVEALTM技術只限于15聚體,因此只測試了兩個重疊的15聚體(第2-16、6-20位置),而并非測試了全長MET-005。

圖4a和4b描述了外周血單核細胞(PBMC)中PSMA和生存素特異性IFN-分泌CD4+T細胞的提呈,它們于不同時間點取自使用IFN-EliSpot檢測的免疫患者中。時間點:疫苗接種前(a)以及疫苗接種后3.(b)、6.(c)、7.(d)、8.(e)、9.(f)、10.(g)、11.(h)。

圖5顯示了PBMC中生存素特異性IFN-、IL-5、IL-10、TNFα-分泌CD4+T細胞的提呈,它們于三個不同時間點取自使用細胞內染色法(ICS)檢測的接種患者中。時間點:疫苗接種后1.(a)、3.(b)、7.(c)。

實施例

1.合成

肽通過使用Fmoc化學以標準、廣為接受的固相合成法合成。制備液HPLC純化之后,進行離子交換純化程序從而加入生理相容性反離子(例如,醋酸、氨或氯化物)。最后,在凍干后制得白色至類白色固體。所有的TUMAP優選作為醋酸鹽進行給藥,其它鹽形式也可以。

重要的是,肽的身份和純度可很容易使用質譜、氨基酸分析法和HPLC分析法確定,并且確認精確度高。根據分析結果,IMA950疫苗所用的所有肽都顯示出正確的結構,純度為95%以上。

肽FTELTLGEF(HLA-A1,PolyPeptide?Laboratories公司,德國沃爾芬比特爾)、LMLGEFLKL(HLA-A2;Clinalfa公司,瑞士Sissach)和EPDLAQCFY(HLA-B35;PolyPeptide?Laboratories公司)獲得了藥用質量。

表5:IMA950肽的物理化學特征

2.典型藥物組合物IMA950的組成

IMA950由合成腫瘤相關肽(TUMAP)的混合物組成,其中大部分已在原發性結直腸癌細胞中得到確定。TUMAP包括10種能激活細胞毒性T細胞(CD8+T細胞)的HLA-I類結合肽、1種能激活T輔助細胞(CD4+T細胞)的HLA-II類結合肽、以及1種具有上述兩種能力的HLA-I類結合肽。輔助性T細胞通過釋放細胞因子而輔助細胞毒性T細胞的功能,此類細胞因子能提高CD8+T細胞殺傷力,也可直接作用于腫瘤細胞(Knutsonand?Disis,2005)。除了這12種TUMAP外,IMA950包含一種病毒控制肽。

手術切除的惡性腫瘤樣本和GBM患者的正常組織以及健康供體的血液以循序漸進的方法進行分析:

首先,使用微陣列全基因組mRNA表達分析法來確定惡性腫瘤組織與一系列正常器官和組織相比過度表達的基因。在第二個步驟中,惡性腫瘤的HLA配體用質譜法確定。隨后,確定的HLA配體與基因表達數據進行比較。第1步中檢測到的選擇性表達或過度表達基因所編碼的肽考慮為多肽疫苗的合適候選TUMAP。

最后,使用多種免疫檢測方法(體外T細胞檢測法)檢測健康個體中的外周血CD8+T細胞對腫瘤相關HLA配體的活性。

表6:IMA950TUMAP組合物。

典型IMA950含有10種HLA-A*02結合肽(I類)、1種HLA-DR結合肽(II類)和1種拉長的HLA-A*02肽。此外,也包括HBV-001病毒標志物肽,在此未羅列。

表6:蛋白質功能、TUMAP來源于

3.腫瘤樣本IMA950所包含的細腫瘤相關肽(TUMAP)的提呈

組織樣本

患者腫瘤組織由Cantonal?Universitaire?de?Gen¨¨ve(醫學腫瘤學(腫瘤免疫學)實驗室)和Neurochirurgische-Klinik?Heidelberg(Molekularbiologisches?Labor)提供。所有患者在手術前都獲得了書面知情同意。手術后立即用液態氮對組織進行冷休克處理,在分離TUMAP前儲存于-80下。

從組織樣本中分離HLA肽

根據方案(Falk,K.et?al?1991;Seeger,F.H.et?al.T?1999)略加修改,使用HLA-A*02特異性抗體BB7.2或HLA-A、-B、-C特異性抗體W6/32、CNBr活化的瓊脂糖凝膠、酸處理和超濾方法以固體組織的免疫沉淀法獲得了冷休克組織樣本的HLA肽庫。

用電噴霧-液相色譜質譜(ESI-LCMS)檢測TUMAP

方法一:

獲得的HLA肽庫根據其疏水性用反相色譜(CapLC,Waters)分離,洗脫肽用裝備電噴霧源的四極桿-飛行時間串聯質譜(Q-TOF?Ultima,Waters)進行了分析。肽庫被載到C18預處理柱進行濃縮和脫鹽。載入后,C18預處理柱排成一行,用填充5μm?C18反相材料(Dionex)的熔煉石英微毛細管柱(75μm內徑x?250mm)進行分離。溶劑A為4mM醋酸銨/水。溶劑B為2M濃度為80%乙腈/水中的醋酸銨。這兩種溶劑均用甲酸將pH值調整為3.0。對15%至60%的溶劑B在90分鐘內進行二元梯度色譜法分析,分流系統將應用流量從5μl/min降低至200nl/min。金鍍膜玻璃毛細管(PicoTip,New?Objective)用于引入到微電噴霧源。TOF分析儀的積分時間為1.9秒,掃描間延遲時間為0.1秒。隨后,用碰撞誘導解離(CID)質譜(ESI-LCMS/MS)揭示肽序列。生成的天然TUMAP的片段模式與合成序列相同參考肽的片段模式進行比較后,確保了識別TUMAP的序列。

方法二:

獲得的HLA肽庫根據其疏水性用反相色譜(Acquity?UPLC?system,Waters)分離,洗脫肽用裝有電噴霧源的LTQ-Orbitrap雜交質譜(ThermoElectron)進行了分析。肽庫被直接載入填充有1.7μm?C18反相材料(Waters)的分析用熔煉石英微毛細管柱(75μm內徑x?250mm),應用流速為400nL每分鐘。隨后,使用來自流速為300nL每分鐘、濃度為10%至33%溶劑B中的兩步180分鐘二元梯度法對肽進行分離。梯度由溶劑A(含0.1%甲酸的水)和溶劑B(含0.1%甲酸的乙腈)。金鍍膜玻璃毛細管(PicoTip,New?Objective)用于引入到微電噴霧源。使用前5(TOP5)策略在數據依賴模式下操作LTQ-Orbitrap質譜儀。簡言之,首先以高精確質量完全掃描在orbitrap開始一個掃描周期(R=30,000),之后用先前選定離子的動態排除技術在orbitrap中對5種含量最為豐富的前體離子進行MS/MS掃描(R=7.500)。串聯質譜以SEQUEST和另一種手動控制器進行解讀。生成的天然TUMAP的片段模式與合成序列相同參考肽的片段模式進行比較后,確保了識別TUMAP的序列。圖1a和b顯示了從腫瘤組織中獲得的MHC-I類相關TUMAP的典型表達譜。

表7顯示了膠質母細胞瘤樣本的分析結果,大部分樣本均來自原發性GBM腫瘤。18份經過分析的樣本中,有三份或以上樣本發現了所有的HLA-A*02TUMAP,經過分析的GBM樣本中50%以上均檢測到5種TUMAP。

表7:檢測GBM樣本中的I類TUMAP

只納入了進行I類配體分析的腫瘤樣本(“-”=未檢測到IMA950I類TUMAP;“+”=檢測到IMA950I類TUMAP)

4.IMA950MHC-I類提呈肽的體外免疫原性

為了獲知關于IMA950包括的肽免疫原性方面的信息,我們使用了Walter,S、Herrgen,L、Schoor,O、Jung,G、Wernet,D、Buhring,HJ、Rammensee,HG和Stevanovic,S等人2003年在Cutting?edge:predetermined?avidity?of?human?CD8T?cells?expanded?on?calibratedMHC/anti-CD28-coated?microspheres,J.Immunol.,171,4974-4978一文中所述的被廣為接受的體外刺激平臺進行了研究。用這種方法,IMA950中得到檢測的10種HLA-A*0201限制肽都顯示出正向免疫原性,這表明這些肽為人CD8+前體T細胞的T細胞表位。MET-005免疫原性不能用此方法檢測,因為它在拉長肽中不與HLA-A*02結合。所以,不能產生體外刺激不可缺少的含MET-005的四聚體。然而,對于納入的HLA-A*02表位MET-001(YVDPVITSI,參見EP?1507795B1),體外免疫原性已得到證實。MET-005在經過APC適當和自然加工后,應可刺激MET-001特異性CTL。MET-001的免疫原性提示,健康供體中提呈MET-001特異性CTL,這也是MET-005成為癌癥疫苗有效組成部分的先決條件。因此,MET-001的免疫原性是MET-005免疫原性的重要指標。

CD8+T細胞體外啟動

為了用載有肽-MHC復合物(pMHC)和抗CD28抗體的人工抗原提呈細胞(aAPC)進行體外刺激,我們首先運用標準密度梯度分離介質(德國科爾貝PAA公司)從新鮮HLA-A*02+血沉棕黃層中分離出PBMC(外周血單核細胞)。血沉棕黃層從T¨1bingen或Katharinenhospital?Stuttgart的血庫獲得。分離出的PBMC在T細胞培養基(TCM)中培養過夜,在體外填裝,包括RPMI-Glutamax(Invitrogen公司,卡爾斯魯厄,德國)并補充10%熱滅活人AB血清(PAA公司,科爾貝,德國),100U/ml青霉素/100μg/ml鏈霉素(Cambrex公司,韋爾維耶,比利時),1mM丙酮酸鈉(CC?Pro公司,Neustadt,德國)和20μg/ml慶大霉素(Cambrex公司)。CD8+淋巴細胞根據制造商的說明使用CD8+MACS陽性選擇套件(Miltenyi公司,Bergisch?Gladbach,德國)進行分離。獲得的CD8+T細胞培養,直到TCM補充了2.5ng/ml的IL-7(PromoCell公司,海德堡,德國)和10U/ml的IL-2(Chiron公司,慕尼黑,德國)后才使用。pMHC/抗-CD28涂層珠的生成、T細胞的刺激和讀出方法如前所述(Walter?et?al.,2003)并作微小改動。簡言之,缺乏跨膜域和在重鏈羧基端中生物素化的生物素化重組HLA-A*0201分子用以下所述方法制成((Altman?et?al.,1996))。純化的共刺激小鼠IgG2a抗人CD28抗體9.3(Junget?al.,1987)使用制造商(Perbio公司,波恩,德國)推薦的N-羥基琥珀酰亞胺生物素進行化學生物素化處理。所用珠為5.60μm的大鏈霉抗生物素蛋白包裹的多聚苯乙烯顆粒(Bangs?Labooratories,伊利諾伊州/美國)。作為陽性和陰性對照的pMHC分別為A*0201/MLA-001(從Melan-A/MART-1中修飾制得的肽ELAGIGILTV)和A*0201/DDX5-001(從DDX5中獲得的YLLPAIVHI)或A*0201/HBV-001(FLPSDFFPSV)。

800.000珠/200μl包裹于96孔板,以600ng生物素抗CD28+200ng相關生物素pMHC(高密度珠)或2ng相關+200ng不相關(pMHC庫)MHC(低密度珠)存在。在37℃下,在含5ng/ml?IL-12(PromoCell)的200μl?TCM中共培養1x106CD8+T細胞與2x105的清洗涂層珠3至4天,從而在96孔板中啟動刺激。之后,一半培養基與補充80U/ml?IL-2的新鮮TCM進行交換,并且在37℃下持續培養3至4天。這種刺激周期總共進行3次。最后,在四色流式細胞儀(BD公司)上用熒光MHC四聚體(Altman?et?al.,1996)+抗體CD8-FITC克隆SK1(BD公司,海德堡,德國)進行四聚體分析。肽特異性細胞以占總CD8+T細胞的百分比形式進行計算。四聚體分析結果用FCS?Express軟件(DeNovoSoftware公司)進行評估。特定四聚體+CD8+淋巴細胞的體外填裝用適當的門控技術以及與陰性對照刺激組比較而進行檢測。如果健康供體中的至少一個可評價的體外刺激孔在體外刺激后發現含有特異性CD8+T細胞株(即該孔包含至少1%特定四聚體+CD8+細胞,并且特定四聚體+的百分比至少為陰性對照刺激中位數的10倍),則檢測給定抗原的免疫原性。

IMA950肽的體外免疫原性

對于受到測試的HLA-I類肽,可通過肽特異性T細胞株的生成證明其體外免疫原性。代表性染色顯示了特異性T細胞系的生成,如圖1所示。結果總結見表8。

表8:IMA950所含HLA-I類肽的免疫原性

Immatics公司針對IMA950所含的所有HLA-I類肽進行了體外免疫原性實驗,結果總結如下。所示結果通過刺激高密度珠CD8+細胞而獲得。由于不同批次的血清可能會大大影響免疫原性的結果,所以只評價了那些只使用同一批次血清的化驗結果。

除了來自健康獻血者的這些結果外,肽BCA-002、CHI-001和NLGN4X-001還在少數膠質母細胞瘤患者中進行了測試。與健康供體相比,所有的肽均被證實具有相似程度的免疫原性,這證實,在相關目標人群中存在疫苗所需的前體T細胞。

5.IMA950II類TUMAP?BIR-002的免疫原性

為了確認含有SEQ?ID?NO:12肽的免疫原性,進行了一項臨床研究。

主要研究目標是:在未檢測到明確的轉移病灶且前列腺癌根治術后出現生物化學復發的患者中,對皮下注射前列腺特異性肽(接種療法)的基于PSA(前列腺特異抗原)的反應(PSA-R)。

次要研究目標是:在患有特別考慮為T細胞反應相關的免疫現象的前列腺癌患者中,研究給予接種療法的耐受性和可行性。

該研究設計為前瞻性、隨機I/II期研究,適應癥為“未檢測到明確的轉移病灶且前列腺癌根治術后出現生物化學復發”。

研究人群

作為本I/II期研究的一部分,我們試圖通過在前列腺癌根治術后出現生物化學復發的HLA-A*02+患者中接種前列腺特異性肽從而誘導PSA衰退作為腫瘤生長停止的指標。

前列腺特異性肽的組合物經皮下注射,并在抗原性結構的各種給藥方式下評估各自的免疫反應程度。

相對于以前的疫苗接種研究,本研究計劃的目標是治療腫瘤負荷小且影像學程序不能檢測出的患者。所有的患者都使用已知的前列腺特異性抗原結構的同樣方式進行免疫,以增強對惡性轉化細胞的免疫反應。19例患者接受了治療。

表9:研究人群的特征


??總共
??%
??中位數
??范圍
??年齡
??19

??63
??55-77
??在新/輔助治療之前




??無
??11
??58


??放療
??3
??16


??間歇性荷爾蒙療法
??2
??11


??放療+間歇性荷爾蒙療法
??2
??11


??放療+化療
??1
??5


??RPX?TNM分期




??T2a-cR0
??6
??32


??T3a-cR0
??6
??32


??T2a-cR1
??3
??16


??T3a-cR1
??3
??16


??T3aN2?R0
??1
??5


??Gleason評分




??5-7
??10
??53


??8-10
??3
??16


??未知
??6
??32


??接種前RPX月數


??41
??9-124
??OP后首次復發月數


??14
??1-90
??開始接種時的PSA


??0.76
??0.14-10.8

治療計劃

在使用電腦斷層掃描和骨骼顯像排除明顯的轉移病灶后,根據不同的給藥方式將前列腺特異性肽疫苗皮下注射至在前列腺根治術后檢測到PSA復發的患者中(PSA在至少14天間隔的兩次測量中上升了50%)。該疫苗在每8天的倍數給予,即第0、7、14、28、42和56天給予(每個肽以及每次注射量約為100微克)。每次接種治療以及在第70天,測定PSA以評估治療反應。

如果檢測到了腫瘤反應(完全緩解[PSA-CR]、部分緩解[PSA-PR]、或病程穩定[無變化,PSA-NC]),則接受了疫苗的患者根據所選擇的給藥方式每月維持一次。對患者的免疫治療反應進行了評估,詳細如下:

完全緩解(PSA-CR):在間隔至少4周后測量確定:最初升高的PSA水平正常化。正常化定義為PSA最低值<0.2ng/ml,這是完全摘除腫瘤或前列腺的前列腺癌根治術后的預期值。

部分緩解:a)PSA-PR≤80%(在間隔至少4周后測量確定最初升高的PSA水平下降80%);以及b)PSA-PR≤50%(在間隔至少4周后測量確定最初升高的PSA水平下降50%。)

病情穩定(PSA-SD):在至少四周后無顯著變化。這包括在間隔至少4周后測量確定具有穩定性以及下降小于50%、升高小于10%。

進展(PSA-PD):PSA水平上升超過10%。如果PSA進展,則終止研究。

在患者進入研究后,使用表位特異性疫苗;考慮在前列腺上皮細胞(如:PSMA/PSCA)中特異性表達的蛋白。除了研究注射疫苗的一般療效(PSA監測方法評估的殘留腫瘤生長分數),本研究還研究了各種接種方法的效果(免疫系統的有效調制)。除了僅僅單獨皮下注射該肽之外,還使用了佐劑的各種組合物。特別是,用了Montanide(適合用于人身上的一個經典的不完全弗氏佐劑)肽疫苗的長效和輔助活性,最近其被描述為十分有利。為此,500μl肽溶液以500μl?Montanide混合,之后給藥。因此,制成油水乳劑,在數周內緩慢釋放水相中所含的抗原。該乳劑的物理穩定性非常高,可在4的環境下儲存3個月以上,并且無明顯相位分離。Montanide的長效功能數個疫苗接種試驗中得到了使用,并且獲得良好效果(Oka?et?al.,2004)。

有一個研究組研究了以生長因子、GM-CSF、注射液伴隨刺激期間的接種療效。GM-CSF是肽接種試驗中非常常用的一種佐劑,這些研究中有幾個研究報告提高了臨床及T細胞反應。最初,GM-CSF為樹突狀細胞招募和分化因子,被認為可增加疫苗注射部位的樹突狀細胞的數量。雖然GM-CSF不能自身激活抗原,將細胞提呈為樹突狀細胞和巨噬細胞,但是有體內間接激活的報道(Molenkamp?et?al.,2005)。

另一個研究組研究了經上皮細胞使用咪喹莫特伴隨活化樹突狀細胞期間接種的療效。咪喹莫特以5%軟膏(Aldara)給予。它通過對TLR7陽性細胞(如:漿細胞樣DC、朗格漢斯細胞、皮膚DC)的作用而具有強免疫刺激性,激活MyD88依賴性途徑。被激活的APC釋放T細胞刺激性和炎癥細胞因子,上調共刺激和遷移到引流淋巴結。通過將抗原混合至軟膏或通過向皮下或皮內注射抗原部位應用Aldara,從而使咪喹莫特有可能加強肽誘導的CTL反應,這已經在動物模型中得到證明。

另一個研究組通過將樹突狀細胞與魚精蛋白穩定的mRNA編碼粘蛋白-1混合以將其伴隨激活以活化TLR?7/8,該組研究了在所述伴隨激活期間接種的療效。mRNA顯示了小鼠和人免疫細胞群的廣泛激活。該制劑中聚堿性蛋白魚精蛋白的存在提高了mRNA的半衰期并誘導了可能長效粒子的形成。因此,這種佐劑可與長效特性和APC激活特性結合。

總之,該疫苗的給予方式包括以下方法:

-Montanide乳化肽疫苗的皮下注射

-500μl?Montanide中乳化肽疫苗的皮下注射聯合外用225μl?GM-CSF,以期達到伴隨生長因子給藥所引發的更強的免疫反應

-500μlMontanide中乳化肽疫苗的皮下注射聯合局部熱療,后者的目的是達到熱誘導的更強的免疫反應

-500μl?Montanide中乳化肽疫苗的皮下注射聯合經上皮給予咪喹莫特,以通過TLR?7激活樹突狀細胞

-500μl?Montanide中乳化肽疫苗與55μl粘蛋白-1mRNA/魚精蛋白一起皮下注射,以通過TLR?7/8激活樹突狀細胞

日程表:本研究為期3年。

前列腺特異性肽疫苗在第0、7、14、28、42和56天給予患者。對于病情穩定或獲得客觀腫瘤反應(PSA-CR或PSA-PR)的患者,每月皮內注射接種一次疫苗直到發生可檢測到的進展。根據迄今為止的經驗,肽注射液可耐受且沒有明顯不良反應。由于對接種療法的反應僅根據PSA測量進行了血清學評估,因此,在研究開始時進行一項測試以確定注射的疫苗是否干擾體外的PSA測量值,這可刺激臨床反應。在第0、7、14、28、42、56和70天,抽取血液樣本做化驗、PSA水平、血細胞分類計數、FACS分析和細胞因子測試。如果連續治療到第70天,則進行為期6周的PSA監測,以便及時發現治療失敗。

如果疾病進展得到證明且伴有PSA持續升高,則結束治療。

從第84天開始,繼續運用免疫療法,間隔時間為4周,直到發生可證明的進展或至第420天(第15個月)。在本研究外繼續治療(在成功病例中)的決定在逐個病例的基礎上作出。本研究未發生意料之外的不良反應。

該實驗室測試包括凝血、電解質、LDH、β2-M、CK、肝酶、膽紅素、肌酐、尿酸、總蛋白、CRP、涂片血細胞分類計數、PSA水平、細胞因子、FACS、Elispot。

皮膚對定義細菌和真菌抗原的反應(注射48-72小時后,T細胞介導的遲發型超敏反應(DTH))的分析在本研究開始前將作為患者細胞免疫系統的分析。

研究所需的肽(九肽)由PD?Dr.Stefan?Stevanovic實驗室在Prof.H.-G.Rammensee部制造。這些肽用HPLC法進行純化并進行質譜分析。這些肽的純度也可用HPLC、質譜和Edman測序法進行檢查。使用這些方法,純度可高達98%(根據當前方法的狀態必須視為最高值)。所合成的肽溶于DMSO(CryoSure,WAK?ChemieMedical?GmbH;10mg/ml)中,在Ampuwa(Fresenius?Kabi)中稀釋為1∶10,并在無菌條件下分成等份。

臨床反應

在兩名患者中,在連續直腸指檢發現局部腫瘤后,PET-CT掃描可顯示局部復發。在其余的17名患者中,在終止研究時,無法證實疾病活躍部位。

血細胞分類計數或大量臨床化學的的重復實驗室評估未發現研究期間有任何異常。

在這19例患者中,有16例對根據SEQ?ID?NO:12所述的生存素II肽(IFN-g?ELISPOT,+/-ICS)發生反應。其中,有12名患者在疫苗接種后,誘導了抗生存素T細胞反應。有2名患者之前存在抗T細胞以及2名患者未確定之前是否存在豐富的抗生存素T細胞。

生化反應

根據PSA初次升高后合作實驗室最低可檢測值,完全反應被視為不可檢測的PSA值。測量值必須在至少間隔4周后確認。PR>80%和>50%必須在四周后做相應的重新評估。PSA下降小于50%或升高小于10%反映了病情穩定(如果在至少四周后確認)。

疾病進展被視為在治療開始時PSA上升超過10%。

終止研究的患者的生化反應得到跟蹤,直到他們獲得了放射或抗荷爾蒙療法的進一步治療。

19例患者同意參加并且對數據進行了分析,隨訪最長為時約3.75年。

PSA穩定性和DT升高

根據上述生化反應的標準:治療開始時PSA值上升不超過10%,2例(10.2%)患者在研究結束時PSA值表現出穩定性(圖6,表10、11、12)。在最后一次注射疫苗后的14和16月分別對上述兩名病例進行了隨訪。在數據截止時,穩定的平均時間為24個月(28和31個月),平均接種了18(14和20)次疫苗。

在這兩個患者中,1例患者顯示部分反應>50%的時間為9個月,之后,一段時間PSA緩慢上升,時間為20.5個月,是疫苗接種之前9.8個月的2倍。初始PSA在pT2pN0?Gleason5腫瘤手術后18個月開始復發。

分析數據發現,8號患者自28個月前接種計劃開始以來病情穩定。在第10個月以及第14次疫苗接種后因過敏反應而停止了治療。他存在不利的pT3b?Gleason?3+4情況,在前列腺癌根治術后PSA值不低于0.6ng/ml,在術后首次下降后PSA很快進展。倍增時間從6.6個月減緩至148個月。

這兩名患者在每次接種肽疫苗時都在給藥部位皮下注射咪喹莫特。

PSA?DT升高,PSA不穩定

第11號患者的PSA?DT在研究的六個月期間從1.5個月上升至10.1個月。開始時他的PSA值為10.8ng/ml,在終止研究程序接受抗雄激素單一療法時,進展至17.8ng/ml,但PET-CT未發現可見的惡性病變。他接受了Aldara作為佐劑。

第16號患者開始進入疫苗治療+粘蛋白-1-mRNA/魚精蛋白,倍增時間為6.1個月間。五個月期間的PSA速率下降至半衰期為2.7個月,之后,PSADT經統計學計算為上升14.4個月,且在治療后持續16個月。最初PSA為0.29ng/ml,在治療期間的前5個月內下降至0.19ng/ml,在以后的8個月內上升至0.4ng/ml,在治療開始19個月后按研究方案終止研究時,為0.41ng/ml。

PSA進展

根據接種疫苗前估計的PSA倍增時間,第5號患者在研究期間出現了進展。但是,截止數據顯示,在治療結束繼續10個月后,他的PSA值下降,半衰期為20.2個月。他在接種疫苗結束后仍未接受任何二次治療。他接受了montanide疫苗注射作為唯一的佐劑。

表10:按月計算的PSA倍增時間

*研究結束或隨訪結束時的PSA?DT未納入患者數據。5由于PSA下降

7.將本發明中的HLA-I類限制肽與HLA-A*0201結合

目的和摘要

本分析的目的是評價HLA-I類肽對HLA-A*0201等位基因編碼的MHC分子的親和力,因為這是IMA950作用模式的一項重要參數。IMA950和MET-001中全部10種HLA-I類限制肽都對HLA-A*0201具有中度至高度的親和力,解離常數(KD)范圍為0.14(MET-001)到2.05nM(CSP-001)。所有值均在0.1(強力結合劑HBV-001)至4.4(中等強度結合劑MUC-001)。這些結果證實了IMA950候選疫苗和MET-005衍生的MET-001的所有HLA?I類肽均對HLA-A*02具有結合親和力。

測試原理

穩定HLA/肽復合物包括三種分子:HLA重鏈、β-2微球蛋白(b2m)和肽類配體。變性重組HLA-A*0201重鏈分子的活性便可進行保存,使之功能與“空載HLA-A*”相當。被稀釋為包含b2m和相應肽的水緩沖液后,這些分子以完全肽依賴方式迅速有效地折疊。這些可用的分子用于基于ELISA的檢測方法中,來衡量肽和HLA-I類分子相互作用間的親和力(Sylvester-Hvid等,2002)。

純化的重組HLA-A*0201分子與b2m、不同等級劑量的肽一起培養。與不具備HLA-I類結合能力的全長MET-005相反,通過自然抗原加工、MET-005體內產生并被證實的A*0-結合產物MET-001被納入分析。從頭折疊HLA/肽復合物的量用定量ELISA法測定。解離常數(KD值)使用從校準HLA/肽復合物稀釋液中記錄的標準曲線進行計算。

結果

結果如圖2所示。較低的KD值反映了對HLA-A*0201具有較高的親和力。大多數IMA950肽對HLA-A*0201都具有相似的較強親和力,范圍為0.1(HBV-001,強力結合劑)到44.4nM(MUC-001,中等強度結合劑)。因而,所有IMA950I類TUMAP均對MHC分子A*02具有中等至較強的親和力。

8.本發明HLA?II類限制肽與HLA-DR的結合

目的和摘要

II類TUMAP激活輔助性T細胞,輔助性T細胞在協助I類限制TUMAP引發的CTL功能中起到了至關重要的作用。IMA950II類肽與集中不同的HLA-II類分子結合(混雜結合)對于確保多數接受候選疫苗IMA950的患者能夠從支持性輔助T細胞反應中獲益非常重要。例如,最顯性表達的人類HLA-II類分子HLA-DR具有高度多態性,含有數百種已知等位基因。基于HLA-DRB1單體型的已知等位基因頻率和完善的結合算法,可預測,IMA950——IMA-BIR-002和IMA-MET-005——中的HLA?II類配體均是混雜HLA-DR結合肽。具體來說,對于兩種IMA950II類TUMAP,HLA-A*02-陽性白種人表達至少一種適當的HLA-DR等位基因的概率大于90%。至于其余的人II類等位基因HLA-DQ和HLA-DP,由于缺乏頻率數據或結合預測算法,從在此計算中忽略,實際混雜比例很有可能更高。對于已知的泛DR表位(PADRE,基因型頻率Fproiected=93.1%),兩種IMA950O?II類TUMAP計算所得的混雜性范圍相同。此外,這些肽的混雜結合在實驗中通過體外結合方法進行了確認。另外,對于IMA-BIR-002,證實了體內高免疫原性(見前文)。總而言之,這些結果確認了MET-005和BIR-002是混雜HLA-DR結合肽。

結合預測定律

使用Tübingen大學開發的SYFPEITHI算法(Rammensee?et?al.,1997;Rammensee?et?al.,1999),對IMA950?II類TUMAP與幾種常見HLA-DR等位基因的結合進行等級排列。該算法已被成功地用于確定來自廣泛抗原,如,來自人類腫瘤相關抗原TRP2(I類)(Sunet?al.,2000)和SSX2(II類)(Neumann?et?al.,2004)的I類和II類表位。結合閾值根據對公布的已知混雜HLA-DR配體的結合分數分析而被定義為18分。

使用了HLA-A*02陽性白種人人群中的已公布的HLA-DR單體型頻率(Mori?et?al.,1997)以及高清晰度單體型頻率(Chanock?et?al.,2004)(見表2)。該單體型頻率是個體染色體上獨特等位基因的頻率。由于哺乳動物細胞內的二倍體染色體組,該等位基因的基因型出現頻率較高,可以使用Hardy-Weinberg定律進行計算(基因型出現頻率F中的單體型頻率Gf結果(F=2Gf-Gf2])。

已知SYFPEITHI矩陣的DRB1-單體型頻率和A*02+白種人人群中的已知個體頻率之和為47.8%。因此,預計II類TUMAP與這些等位基因的結合分布為剩余的52%DRB1等位基因,這些數據尚未獲得。

最后,混雜結合被定義為一種肽與幾種HLA-DR等位基因結合,并且其中之一在白種人群中表達的概率至少為50%。

體外結合檢測方法原則(ProImmune?REVEALTM)

IMA-BIR-002和IMA-MET-005與HLA-DR寬抗原(HLA-DR1至DR7,也包括分裂抗原HLA-DR11至-DR15(Mori?et?al.,1997))集合,并使用REVEALTM?MHC:肽結合分析方法(ProImmune,Oxford,UK)以確定合并入MHC分子的水平。在此檢測方法中,結合力與合格/不合格對照結合劑、以及每種HLA-DR抗原陽性對照肽的結合力進行比較。

結果

根據SYFPEITHI算法預測,IMA-BIR-002和IMA-MET-005可能分別與含已知結合基序的7/8、8/8HLA-DR等位基因結合(表11)。對于IMA-BIR-002或IMA-MET-005,HLA-A*02陽性白種人表達至少一種適當的HLA-DRB1等位基因的概率分別為92.6%和接近100%。因此,兩種IMA950II類肽被預測為是混雜HLA-DR結合劑。

如果結合HLA-DRB1等位基因的單體型頻率通過本方法的第二個因數被估計過高,則其在IMA950中對于所有II類TUMP的基因型發生率仍然高于50%。此外,IMA-BIR-002與HLA-DR1、3、4和11的混雜結合的實驗性確認通過體外結合數據進行(圖3)。覆蓋完整序列的兩種重疊15聚體的IMA-MET-005體外結合數據表明與HLA-DR11結合;然而,ProImmune?REVEALTM旨在作為一種確認潛在HLA?II類表位的篩選工具。用此檢測方法,性能良好速度慢的HLA-DR結合劑可報告為假陰性并且為非結合劑。因此,從ProImmune?REVEALTM體外陰性數據中不能推導出IMA-MET-005體內HLA-DR結合的非混雜性。因此,很可能在基于IMA950的免疫接種中,有IMA-MET-005的混雜性HLA-DR結合。由于缺乏其它II類基因位點、HLA-DQ和-DP的結合性質和頻率方面的數據,這些分子在計算中忽略。然而,這些分子對于IMA950II類TUMAP有進一步的結合機會。

由于在針對含不同HLA-DR等位基因的前列腺癌患者的臨床試驗中已經證明IMA-BIR-002具有廣譜免疫原性,該II類肽的混雜性已在體內得到明確證實。總之,IMA950包含的這兩種II類肽的HLA-DR結合特性的電腦模擬分析以及體外檢測和BIR-002臨床試驗的其它實驗證據強有力地表明,這些TUMAP是人II類HLA分子的混雜結合劑。

表11:IMA950II類TUMP與含已知結合基序的HLA-DR等位基因的結合分數。表中顯示的是白種人群中最常見HLA-DRB1等位基因的SYFPEITHI結合分數。p為HLA-A*02陽性白種人的單體型頻率。如果分數等于或大于18,則肽被視為與HLA分子結合。結合DRB1等位基因的p值累積為最小單體型頻率pmin。所有DRB1等位基因(包括含不完全結合預測矩陣或頻率數據的等位基因)的這些頻率的外推法獲得了與基因型出現頻率Fprojected對應的預計單體頻率pprojected。n.d.=無數據

引用文獻列表

About?I,Laurent-Maquin?D,Lendahl?U,Mitsiadis?TA(2000).Nestin?expression?in?embryonicand?adult?human?teeth?under?normal?and?pathological?conditions.Am?J?Pathol.157,287-295.

Aghi?M,Gaviani?P,Henson?JW,Batchelor?TT,Louis?DN,Barker?FG(2005).Magneticresonance?imaging?characteristics?predict?epidermal?growth?factor?receptor?amplification?statusin?glioblastoma.Clin?Cancer?Res.11,8600-8605.

Agosti?RM,Leuthold?M,Gullick?WJ,Yasargil?MG,Wiestler?OD(1992).Expression?of?theepidermal?growth?factor?receptor?in?astrocytic?tumours?is?specifically?associated?withglioblastoma?multiforme.Virchows?Arch.A?Pathol.Anat.Histopathol.420,321-325.

Al-Joudi?FS,Iskandar?ZA,Imran?AK(2007).Survivin?expression?correlates?with?unfavourableprognoses?in?invasive?ductal?carcinoma?of?the?breast.Med?J?Malaysia?62,6-8.

Al-Nedawi?K,Meehan?B,Micallef?J,Lhotak?V,May?L,Guha?A,Rak?J(2008).Intercellulartransfer?of?the?oncogenic?receptor?EGFRv?III?by?microvesicles?derived?from?tumour?cells.Nat.Cell?Biol.

Altman?JD,Moss?PA,Goulder?PJ,Barouch?DH,Heyzer-Williams?MG,Bell?JI,McMichael?AJ,Davis?MM(1996).Phenotypic?analysis?of?antigen-specific?T?lymphocytes.Science?274,94-96.

Amoh?Y,Yang?M,Li?L,Reynoso?J,Bouvet?M,Moossa?AR,Katsuoka?K,Hoffman?RM(2005).Nestin-linked?green?fluorescent?protein?transgenic?nude?mouse?for?imaging?human?tumorangiogenesis.Cancer?Res.65,5352-5357.

Angileri?FF,Aguennouz?M,Conti?A,La?TD,Cardali?S,Crupi?R,Tomasello?C,Germano?A,Vita?G,Tomasello?F(2008).Nuclear?factor-kappaB?activation?and?differential?expression?ofsurvivin?and?Bcl-2?in?human?grade?2-4?astrocytomas.Cancer.

Appay?V,Speiser?DE,Rufer?N,Reynard?S,Barbey?C,Cerottini?JC,Leyvraz?S,Pinilla?C,Romero?P(2006).Decreased?specific?CD8+T?cell?cross-reactivity?of?antigen?recognitionfollowing?vaccination?with?Melan-A?peptide.Eur.J?Immunol.36,1805-1814.

Arnold?SE,Trojanowski?JQ(1996).Human?fetal?hippocampal?development:II.The?neuronalcytoskeleton.J?Comp?Neurol.367,293-307.

ARONSON?SM,ARONSON?BE(1965).CENTRAL?NERVOUS?SYSTEM?IN?DIABETESMELLITUS:LOWERED?FREQUENCY?OF?CERTAIN?INTRACRANIAL?NEOPLASMS.Arch.Neurol.12,390-398.

Asheuer?M,Bieche?I,Laurendeau?I,Moser?A,Hainque?B,Vidaud?M,Aubourg?P(2005).Decreased?expression?of?ABCD4?and?BG1?genes?early?in?the?pathogenesis?of?X-linkedadrenoleukodystrophy.Hum.Mol.Genet.14,1293-1303.Asklund?T,Appelskog?IB,Ammerpohl?O,Ekstrom?TJ,Almqvist?PM(2004).Histonedeacetylase?inhibitor?4-phenylbutyrate?modulates?glial?fibrillary?acidic?protein?and?connexin?43expression,and?enhances?gap-junction?communication,in?human?glioblastoma?cells.Eur.JCancer?40,1073-1081.

Barker?FG,Simmons?ML,Chang?SM,Prados?MD,Larson?DA,Sneed?PK,Wara?WM,BergerMS,Chen?P,Israel?MA,Aldape?KD(2001).EGFR?overexpression?and?radiation?response?inglioblastoma?multiforme.Int.J?Radiat.Oncol?Biol.Phys.51,410-418.

Bertelli?E,Regoli?M,Fonzi?L,Occhini?R,Mannucci?S,Ermini?L,Toti?P(2007).Nestinexpression?in?adult?and?developing?human?kidney.J?Histochem.Cytochem.55,411-421.

Blum?R,Jacob-Hirsch?J,Rechavi?G,Kloog?Y(2006).Suppression?of?survivin?expression?inglioblastoma?cells?by?the?Ras?inhibitor?farnesylthiosalicylic?acid?promotes?caspase-dependentapoptosis.Mol.Cancer?Ther.5,2337-2347.

Bourdon?MA,Wikstrand?CJ,Furthmayr?H,Matthews?TJ,Bigner?DD(1983).Humanglioma-mesenchymal?extracellular?matrix?antigen?defined?by?monoclonal?antibody.Cancer?Res.43,2796-2805.

Bowen?AR,Hanks?AN,Murphy?KJ,Florell?SR,Grossman?D(2004).Proliferation,apoptosis,and?survivin?expression?in?keratinocytic?neoplasms?and?hyperplasias.Am?J?Dermatopathol.26,177-181.

Boyton?RJ,Lohmann?T,Londei?M,Kalbacher?H,Halder?T,Frater?AJ,Douek?DC,Leslie?DG,Flavell?RA,Altmann?DM(1998).Glutamic?acid?decarboxylase?T?lymphocyte?responsesassociated?with?susceptibility?or?resistance?to?type?I?diabetes:analysis?in?disease?discordanthuman?twins,non-obese?diabetic?mice?and?HLA-DQ?transgenic?mice.Int.Immunol.10,1765-1776.

Brekke?C,Lundervold?A,Enger?PO,Brekken?C,Stalsett?E,Pedersen?TB,Haraldseth?O,KrugerPG,Bjerkvig?R,Chekenya?M(2006).NG2?expression?regulates?vascular?morphology?andfunction?in?human?brain?tumours.Neuroimage.29,965-976.

Brenner?AV,Linet?MS,Fine?HA,Shapiro?WR,Selker?RG,Black?PM,Inskip?PD(2002).History?of?allergies?and?autoimmune?diseases?and?risk?of?brain?tumors?in?adults.Int.J?Cancer?99,252-259.

Brommeland?T,Rosengren?L,Fridlund?S,Hennig?R,Isaksen?V(2007).Serum?levels?of?glialfibrillary?acidic?protein?correlate?to?tumour?volume?of?high-grade?gliomas.Acta?Neurol.Scand.116,380-384.

Bronger?H,Konig?J,Kopplow?K,Steiner?HH,Ahmadi?R,Herold-Mende?C,Keppler?D,NiesAT(2005).ABCC?drug?efflux?pumps?and?organic?anion?uptake?transporters?in?human?gliomasand?the?blood-tumor?barrier.Cancer?Res.65,11419-11428.

Brychtova?S,Fiuraskova?M,Hlobilkova?A,Brychta?T,Hirnak?J(2007).Nestin?expression?incutaneous?melanomas?and?melanocytic?nevi.J?Cutan.Pathol.34,370-375.

Buchner?A,Castro?M,Hennig?A,Popp?T,Assmann?G,Hofstetter?A,Stief?C,Zimmermann?W(2007).[Transcriptome?analyses?in?renal?cell?carcinoma.Combination?of?laser?microdissectionand?microarrays].Urologe?A?46,1170-1175.

Calvo?A,Catena?R,Noble?MS,Carbott?D,Gil-Bazo?I,Gonzalez-Moreno?O,Huh?JI,Sharp?R,Qiu?TH,Anver?MR,Merlino?G,Dickson?RB,Johnson?MD,Green?JE(2008).Identification?ofVEGF-regulated?genes?associated?with?increased?lung?metastatic?potential:functionalinvolvement?of?tenascin-C?in?tumor?growth?and?lung?metastasis.Oncogene.

Campoli?MR,Chang?CC,Kageshita?T,Wang?X,McCarthy?JB,Ferrone?S(2004).Human?highmolecular?weight-melanoma-associated?antigen(HMW-MAA):a?melanoma?cell?surfacechondroitin?sulfate?proteoglycan(MSCP)with?biological?and?clinical?significance.Crit?Rev.Immunol.24,267-296.

Carnemolla?B,Castellani?P,Ponassi?M,Borsi?L,Urbini?S,Nicolo?G,Dorcaratto?A,Viale?G,Winter?G,Neri?D,Zardi?L(1999).Identification?of?a?glioblastoma-associated?tenascin-Cisoform?by?a?high?affinity?recombinant?antibody.Am?J?Pathol.154,1345-1352.

Carriere?C,Seeley?ES,Goetze?T,Longnecker?DS,Korc?M(2007).The?Nestin?progenitorlineage?is?the?compartment?of?origin?for?pancreatic?intraepithelial?neoplasia.Proc?Natl.Acad.Sci.U.S.A?104,4437-4442.

Casati?C,Dalerba?P,Rivoltini?L,Gallino?G,Deho?P,Rini?F,Belli?F,Mezzanzanica?D,Costa?A,Andreola?S,Leo?E,Parmiani?G,Castelli?C(2003).The?apoptosis?inhibitor?protein?survivininduces?tumor-specific?CD8+and?CD4+T?cells?in?colorectal?cancer?patients.Cancer?Res.63,4507-4515.

Castellino?F,Huang?AY,tan-Bonnet?G,Stoll?S,Scheinecker?C,Germain?RN(2006).Chemokines?enhance?immunity?by?guiding?naive?CD8+T?cells?to?sites?of?CD4+Tcell-dendritic?cell?interaction.Nature?440,890-895.

Chakravarti?A,Noll?E,Black?PM,Finkelstein?DF,Finkelstein?DM,Dyson?NJ,Loeffler?JS(2002).Quantitatively?determined?survivin?expression?levels?are?of?prognostic?value?in?humangliomas.J?Clin?Oncol?20,1063-1068.

Cheever?MA,Chen?W,Disis?ML,Takahashi?M,Peace?DJ(1993).T-cell?immunity?tooncogenic?proteins?including?mutated?ras?and?chimeric?bcr-abl.Ann?N.Y.Acad.Sci.690,101-112.

Chekenya?M,Enger?PO,Thorsen?F,Tysnes?BB,Al-Sarraj?S,Read?TA,Furmanek?T,Mahesparan?R,Levine?JM,Butt?AM,Pilkington?GJ,Bjerkvig?R(2002a).The?glial?precursorproteoglycan,NG2,is?expressed?on?tumour?neovasculature?by?vascular?pericytes?in?humanmalignant?brain?tumours.Neuropathol.Appl.Neurobiol.28,367-380.

Chekenya?M,Hjelstuen?M,Enger?PO,Thorsen?F,Jacob?AL,Probst?B,Haraldseth?O,PilkingtonG,Butt?A,Levine?JM,Bjerkvig?R(2002b).NG2?proteoglycan?promotesangiogenesis-dependent?tumor?growth?in?CNS?by?sequestering?angiostatin.FASEB?J?16,586-588.

Chekenya?M,Immervoll?H(2007).NG2/HMP?proteoglycan?as?a?cancer?therapeutic?target.Methods?Mol.Biol.361,93-117.

Chekenya?M,Krakstad?C,Svendsen?A,Netland?IA,Staalesen?V,Tysnes?BB,Selheim?F,WangJ,Sakariassen?PO,Sandal?T,Lonning?PE,Flatmark?T,Enger?PO,Bjerkvig?R,Sioud?M,Stallcup?WB(2008).The?progenitor?cell?marker?NG2/MPG?promotes?chemoresistance?byactivation?of?integrin-dependent?PI3K/Akt?signaling.Oncogene.

Chekenya?M,Pilkington?GJ(2002).NG2?precursor?cells?in?neoplasia:functional,histogenesisand?therapeutic?implications?for?malignant?brain?tumours.J?Neurocytol.31,507-521.

Chekenya?M,Rooprai?HK,Davies?D,Levine?JM,Butt?AM,Pilkington?GJ(1999).The?NG2chondroitin?sulfate?proteoglycan:role?in?malignant?progression?of?human?brain?tumours.Int?JDev.Neurosci.17,421-435.

Chiquet-Ehrismann?R,Tucker?RP(2004).Connective?tissues:signalling?by?tenascins.Int.JBiochem.Cell?Biol.36,1085-1089.

Chu?C,Li?JY,Boado?RJ,Pardridge?WM(2008).Blood-brain?barrier?genomics?and?cloning?of?anovel?organic?anion?transporter.J?Cereb.Blood?Flow?Metab?28,291-301.

Colin?C,Baeza?N,Bartoli?C,Fina?F,Eudes?N,Nanni?I,Martin?PM,Ouafik?L,Figarella-BrangerD(2006).Identification?of?genes?differentially?expressed?in?glioblastoma?versus?pilocyticastrocytoma?using?Suppression?Subtractive?Hybridization.Oncogene?25,2818-2826.

Colombetti?S,Basso?V,Mueller?DL,Mondino?A(2006).Prolonged?TCR/CD28?engagementdrives?IL-2-independent?T?cell?clonal?expansion?through?signaling?mediated?by?the?mammaliantarget?of?rapamycin.J?Immunol.176,2730-2738.

Conacci-Sorrell?M,Kaplan?A,Raveh?S,Gavert?N,Sakurai?T,Ben-Ze′ev?A(2005).The?shedectodomain?of?Nr-CAM?stimulates?cell?proliferation?and?motility,and?confers?celltransformation.Cancer?Res.65,11605-11612.

Conacci-Sorrell?ME,Ben-Yedidia?T,Shtutman?M,Feinstein?E,Einat?P,Ben-Ze′ev?A(2002).Nr-CAM?is?a?target?gene?of?the?beta-catenin/LEF-1?pathway?in?melanoma?and?colon?cancer?andits?expression?enhances?motility?and?confers?tumorigenesis.Genes?Dev.16,2058-2072.

Coskun?U,Yamac?D,Gulbahar?O,Sancak?B,Karaman?N,Ozkan?S(2007).Locally?advancedbreast?carcinoma?treated?with?neoadjuvant?chemotherapy:are?the?changes?in?serum?levels?ofYKL-40,MMP-2?and?MMP-9?correlated?with?tumor?response?Neoplasma?54,348-352.

Cresswell?P(1994).Assembly,transport,and?function?of?MHC?class?II?molecules.Annu.Rev.Immunol.12,259-293.

Dahlstrand?J,Collins?VP,Lendahl?U(1992).Expression?of?the?class?VI?intermediate?filamentnestin?in?human?central?nervous?system?tumors.Cancer?Res.52,5334-5341.

Dengjel?J,Nastke?MD,Gouttefangeas?C,Gitsioudis?G,Schoor?O,Altenberend?F,Muller?M,Kramer?B,Missiou?A,Sauter?M,Hennenlotter?J,Wernet?D,Stenzl?A,Rammensee?HG,KlingelK,Stevanovic?S(2006).Unexpected?Abundance?of?HLA?Class?II?Presented?Peptides?inPrimary?Renal?Cell?Carcinomas.Clin?Cancer?Res.12,4163-4170.

Dixon?DN,Izon?DJ,Dagger?S,Callow?MJ,Taplin?RH,Kees?UR,Greene?WK(2007).TLX1/HOX11?transcription?factor?inhibits?differentiation?and?promotes?a?non-haemopoieticphenotype?in?murine?bone?marrow?cells.Br.J?Haematol.138,54-67.

Domoto?T,Miyama?Y,Suzuki?H,Teratani?T,Arai?K,Sugiyama?T,Takayama?T,Mugiya?S,Ozono?S,Nozawa?R(2007).Evaluation?of?S100A10,annexin?II?and?B-FABP?expression?asmarkers?for?renal?cell?carcinoma.Cancer?Sci.98,77-82.

Dudley?ME,Wunderlich?JR,Robbins?PF,Yang?JC,Hwu?P,Schwartzentruber?DJ,Topalian?SL,Sherry?R,Restifo?NP,Hubicki?AM,Robinson?MR,Raffeld?M,Duray?P,Seipp?CA,Rogers-Freezer?L,Morton?KE,Mavroukakis?SA,White?DE,Rosenberg?SA(2002).Cancerregression?and?autoimmunity?in?patients?after?clonal?repopulation?with?antitumor?lymphocytes.Science?298,850-854.

Dudley?ME,Wunderlich?JR,Yang?JC,Sherry?RM,Topalian?SL,Restifo?NP,Royal?RE,Kammula?U,White?DE,Mavroukakis?SA,Rogers?LJ,Gracia?GJ,Jones?SA,Mangiameli?DP,Pelletier?MM,Gea-Banacloche?J,Robinson?MR,Berman?DM,Filie?AC,Abati?A,RosenbergSA(2005).Adoptive?cell?transfer?therapy?following?non-myeloablative?but?lymphodepletingchemotherapy?for?the?treatment?of?patients?with?refractory?metastatic?melanoma.J.Clin.Oncol.23,2346-2357.

Eppenberger?U,Mueller?H(1994).Growth?factor?receptors?and?their?ligands.J?Neurooncol.22,249-254.

Erfurt?C,Sun?Z,Haendle?I,Schuler-Thurner?B,Heirman?C,Thielemans?K,van?der?BP,SchulerG,Schultz?ES(2007).Tumor-reactive?CD4+T?cell?responses?to?the?melanoma-associatedchondroitin?sulphate?proteoglycan?in?melanoma?patients?and?healthy?individuals?in?the?absenceof?autoimmunity.J?Immunol.178,7703-7709.

Florenes?VA,Holm?R,Myklebost?O,Lendahl?U,Fodstad?O(1994).Expression?of?theneuroectodermal?intermediate?filament?nestin?in?human?melanomas.Cancer?Res.54,354-356.

Fong?L,Hou?Y,Rivas?A,Benike?C,Yuen?A,Fisher?GA,Davis?MM,Engleman?EG(2001).Altered?peptide?ligand?vaccination?with?Flt3?ligand?expanded?dendritic?cells?for?tumorimmunotherapy.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A?98,8809-8814.

Galli?R,Binda?E,Orfanelli?U,Cipelletti?B,Gritti?A,De?VS,Fiocco?R,Foroni?C,Dimeco?F,Vescovi?A(2004).Isolation?and?characterization?of?tumorigenic,stem-like?neural?precursorsfrom?human?glioblastoma.Cancer?Res.64,7011-7021.

Galon?J,Costes?A,Sanchez-Cabo?F,Kirilovsky?A,Mlecnik?B,Lagorce-Pages?C,Tosolini?M,Camus?M,Berger?A,Wind?P,Zinzindohoue?F,Bruneval?P,Cugnenc?PH,Trajanoski?Z,Fridman?WH,Pages?F(2006).Type,density,and?location?of?immune?cells?within?humancolorectal?tumors?predict?clinical?outcome.Science?313,1960-1964.

Garcion?E,Halilagic?A,Faissner?A,ffrench-Constant?C(2004).Generation?of?an?environmentalniche?for?neural?stem?cell?development?by?the?extracellular?matrix?molecule?tenascin?C.Development?131,3423-3432.

Gary?SC,Kelly?GM,Hockfield?S(1998).BEHAB/brevican:a?brain-specific?lecticanimplicated?in?gliomas?and?glial?cell?motility.Curr.Opin.Neurobiol.8,576-581.

Gary?SC,Zerillo?CA,Chiang?VL,Gaw?JU,Gray?G,Hockfield?S(2000).cDNA?cloning,chromosomal?localization,and?expression?analysis?of?human?BEHAB/brevican,a?brainspecific?proteoglycan?regulated?during?cortical?development?and?in?glioma.Gene?256,139-147.

Gattinoni?L,Powell?DJ,Jr.,Rosenberg?SA,Restifo?NP(2006).Adoptive?immunotherapy?forcancer:building?on?success.Nat.Rev.Immunol.6,383-393.

Ghosh?JC,Dohi?T,Kang?BH,Altieri?DC(2008).Hsp60?regulation?of?tumor?cell?apoptosis.JBiol.Chem.283,5188-5194.

Gipp?J,Gu?G,Crylen?C,Kasper?S,Bushman?W(2007).Hedgehog?pathway?activity?in?theLADY?prostate?tumor?model.Mol.Cancer?6,19.

Gleiberman?AS,Michurina?T,Encinas?JM,Roig?JL,Krasnov?P,Balordi?F,Fishell?G,RosenfeldMG,Enikolopov?G(2008).Genetic?approaches?identify?adult?pituitary?stem?cells.Proc?Natl.Acad.Sci.U.S.A?105,6332-6337.

Gnjatic?S,Atanackovic?D,Jager?E,Matsuo?M,Selvakumar?A,Altorki?NK,Maki?RG,Dupont?B,Ritter?G,Chen?YT,Knuth?A,Old?LJ(2003).Survey?of?naturally?occurring?CD4+T?cellresponses?against?NY-ESO-1?in?cancer?patients:correlation?with?antibody?responses.Proc?Natl.Acad.Sci.U.S.A?100,8862-8867.

Godbout?R,Bisgrove?DA,Shkolny?D,Day?RS,III(1998).Correlation?of?B-FABP?and?GFAPexpression?in?malignant?glioma.Oncogene?16,1955-1962.

Gorka?B,Skubis-Zegadlo?J,Mikula?M,Bardadin?K,Paliczka?E,Czarnocka?B(2007).NrCAM,a?neuronal?system?cell-adhesion?molecule,is?induced?in?papillary?thyroid?carcinomas.Br.JCancer?97,53l-538.

Goto?Y,Matsuzaki?Y,Kurihara?S,Shimizu?A,Okada?T,Yamamoto?K,Murata?H,Takata?M,Aburatani?H,Hoon?DS,Saida?T,Kawakami?Y(2006).A?new?melanoma?antigen?fattyacid-binding?protein?7,involved?in?proliferation?and?invasion,is?a?potential?target?forimmunotherapy?and?molecular?target?therapy.Cancer?Res.66,4443-4449.

Grunda?JM,Nabors?LB,Palmer?CA,Chhieng?DC,Steg?A,Mikkelsen?T,Diasio?RB,Zhang?K,Allison?D,Grizzle?WE,Wang?W,Gillespie?GY,Johnson?MR(2006).Increased?expression?ofthymidylate?synthetase(TS),ubiquitin?specific?protease?10(USP10)and?survivin?is?associatedwith?poor?survival?in?glioblastoma?multiforme(GBM).J?Neurooncol.80,261-274.

Gu?G,Yuan?J,Wills?M,Kasper?S(2007).Prostate?cancer?cells?with?stem?cell?characteristicsreconstitute?the?original?human?tumor?in?vivo.Cancer?Res.67,4807-4815.

Gunther?HS,Schmidt?NO,Phillips?HS,Kemming?D,Kharbanda?S,Soriano?R,Modrusan?Z,Meissner?H,Westphal?M,Lamszus?K(2008).Glioblastoma-derived?stem?cell-enriched?culturesform?distinct?subgroups?according?to?molecular?and?phenotypic?criteria.Oncogene?27,2897-2909.

Hammer?J,Gallazzi?F,Bono?E,Karr?RW,Guenot?J,Valsasnini?P,Nagy?ZA,Sinigaglia?F(1995).Peptide?binding?specificity?of?HLA-DR4?molecules:correlation?with?rheumatoidarthritis?association.J?Exp.Med?181,1847-1855.

Hanada?K,Yewdell?JW,Yang?JC(2004).Immune?recognition?of?a?human?renal?cancer?antigenthrough?post-translational?protein?splicing.Nature?427,252-256.

Hau?P,Kunz-Schughart?LA,Rummele?P,Arslan?F,Dorfelt?A,Koch?H,Lohmeier?A,Hirschmann?B,Muller?A,Bogdahn?U,Bosserhoff?AK(2006).Tenascin-C?protein?is?induced?bytransforming?growth?factor-betal?but?does?not?correlate?with?time?to?tumor?progression?inhigh-grade?gliomas.J?Neurooncol.77,1-7.

Heimberger?AB,Hussain?SF,Aldape?K,Sawaya?R,Archer?GA,Friedman?H,Reardon?D,Friedman?A,Bigner?DD,Sampson?JH.Tumor-specific?peptide?vaccination?in?newly-diagnosedpatients?with?GBM.Journal?of?Clinical?Oncology,2006?ASCO?Annual?Meeting?ProceedingsPart?I?Vol?24,No.18S(June?20?Supplement),2006:2529.6-20-2006.

Herold-Mende?C,Mueller?MM,Bonsanto?MM,Schmitt?HP,Kunze?S,Steiner?HH(2002).Clinical?impact?and?functional?aspects?of?tenascin-C?expression?during?glioma?progression.Int.J?Cancer?98,362-369.

Herrera?MB,Bruno?S,Buttiglieri?S,Tetta?C,Gatti?S,Deregibus?MC,Bussolati?B,Camussi?G(2006).Isolation?and?characterization?of?a?stem?cell?population?from?adult?human?liver.StemCells?24,2840-2850.

Hoffmann?NE,Sheinin?Y,Lohse?CM,Parker?AS,Leibovich?BC,Jiang?Z,Kwon?ED(2008).External?validation?of?IMP3?expression?as?an?independent?prognostic?marker?for?metastaticprogression?and?death?for?patients?with?clear?cell?renal?cell?carcinoma.Cancer?112,1471-1479.

Hormigo?A,Gu?B,Karimi?S,Riedel?E,Panageas?KS,Edgar?MA,Tanwar?MK,Rao?JS,FleisherM,DeAngelis?LM,Holland?EC(2006).YKL-40?and?matrix?metalloproteinase-9?as?potentialserum?biomarkers?for?patients?with?high-grade?gliomas.Clin?Cancer?Res.12,5698-5704.

Huang?J,Hu?J,Bian?X,Chen?K,Gong?W,Dunlop?NM,Howard?OM,Wang?JM(2007).Transactivation?of?the?epidermal?growth?factor?receptor?by?formylpeptide?receptor?exacerbatesthe?malignant?behavior?of?human?glioblastoma?cells.Cancer?Res.67,5906-5913.

Huang?Y,Fan?J,Yang?J,Zhu?GZ(2008).Characterization?of?GPR56?protein?and?its?suppressedexpression?in?human?pancreatic?cancer?cells.Mol.Cell?Biochem.308,133-139.

Huncharek?M,Kupelnick?B(2000).Epidermal?growth?factor?receptor?gene?amplification?as?aprognostic?marker?in?glioblastoma?multiforme:results?of?a?meta-analysis.Oncol?Res.12,107-112.

Hwang?ML,Lukens?JR,Bullock?TN(2007).Cognate?memory?CD4+T?cells?generated?withdendritic?cell?priming?influence?the?expansion,trafficking,and?differentiation?of?secondaryCD8+T?cells?and?enhance?tumor?control.J?Immunol.179,5829-5838.

Iguchi?T,Sakata?K,Yoshizaki?K,Tago?K,Mizuno?N,Itoh?H(2008).Orphan?G?protein-coupledreceptor?GPR56?regulates?neural?progenitor?cell?migration?via?a?Galpha?12/13?and?Rho?pathway.J?Biol.Chem.

Ilja?Boor?PK,de?GK,Mejaski-Bosnjak?V,Brenner?C,van?der?Knaap?MS,Scheper?GC,PronkJC(2006).Megalencephalic?leukoencephalopathy?with?subcortical?cysts:an?update?andextended?mutation?analysis?of?MLC1.Hum.Mutat.27,505-512.

Ishiuchi?S,Tsuzuki?K,Yoshida?Y,Yamada?N,Hagimura?N,Okado?H,Miwa?A,Kurihara?H,Nakazato?Y,Tamura?M,Sasaki?T,Ozawa?S(2002).Blockage?of?Ca(2+)-permeable?AMPAreceptors?suppresses?migration?and?induces?apoptosis?in?human?glioblastoma?cells.Nat.Med?8,971-978.

Ishizaki?M,Ishiwata?T,Adachi?A,Tamura?N,Ghazizadeh?M,Kitamura?H,Sugisaki?Y,Yamanaka?N,Naito?Z,Fukuda?Y(2006).Expression?of?nestin?in?rat?and?human?glomerularpodocytes.J?Submicrosc.Cytol.Pathol.38,193-200.

Janssen?EM,Lemmens?EE,Wolfe?T,Christen?U,von?Herrath?MG,Schoenberger?SP(2003).CD4+T?cells?are?required?for?secondary?expansion?and?memory?in?CD8+T?lymphocytes.Nature?421,852-856.

Jaworski?DM,Kelly?GM,Piepmeier?JM,Hockfield?S(1996).BEHAB(brain?enrichedhyaluronan?binding)is?expressed?in?surgical?samples?of?glioma?and?in?intracranial?grafts?ofinvasive?glioma?cell?lines.Cancer?Res.56,2293-2298.

Jiang?Z,Chu?PG,Woda?BA,Rock?KL,Liu?Q,Hsieh?CC,Li?C,Chen?W,Duan?HO,McDougalS,Wu?CL(2006).Analysis?of?RNA-binding?protein?IMP3?to?predict?metastasis?and?prognosisof?renal-cell?carcinoma:a?retrospective?study.Lancet?Oncol?7,556-564.

Jiang?Z,Lohse?CM,Chu?PG,Wu?CL,Woda?BA,Rock?KL,Kwon?ED(2008).Oncofetal?proteinIMP3:a?novel?molecular?marker?that?predicts?metastasis?of?papillary?and?chromophobe?renalcell?carcinomas.Cancer?112,2676-2682.

Johansen?JS,Jensen?BV,Roslind?A,Nielsen?D,Price?PA(2006).Serum?YKL-40,a?newprognostic?biomarker?in?cancer?patients?Cancer?Epidemiol.Biomarkers?Prev.15,194-202.

Johansen?JS,Jensen?BV,Roslind?A,Price?PA(2007).Is?YKL-40?a?new?therapeutic?target?incancer?Expert.Opin.Ther.Targets.11,219-234.

Jung?CS,Foerch?C,Schanzer?A,Heck?A,Plate?KH,Seifert?V,Steinmetz?H,Raabe?A,Sitzer?M(2007).Serum?GFAP?is?a?diagnostic?marker?for?glioblastoma?multiforme.Brain?130,3336-3341.

Jung?G,Ledbetter?JA,Muller-Eberhard?HJ(1987).Induction?of?cytotoxicity?in?resting?human?Tlymphocytes?bound?to?tumor?cells?by?antibody?heteroconjugates.Proc?Natl?Acad?Sci?U?S?A?84,4611-4615.

Junker?N,Johansen?JS,Hansen?LT,Lund?EL,Kristjansen?PE(2005).Regulation?of?YKL-40expression?during?genotoxic?or?microenvironmental?stress?in?human?glioblastoma?cells.CancerSci.96,183-190.

Kajiwara?Y,Yamasaki?F,Hama?S,Yahara?K,Yoshioka?H,Sugiyama?K,Arita?K,Kurisu?K(2003).Expression?of?survivin?in?astrocytic?tumors:correlation?with?malignant?grade?andprognosis.Cancer?97,1077-1083.

Kaloshi?G,Mokhtari?K,Carpentier?C,Taillibert?S,Lejeune?J,Marie?Y,Delattre?JY,Godbout?R,Sanson?M(2007).FABP7?expression?in?glioblastomas:relation?to?prognosis,invasion?andEGFR?status.J?Neurooncol.84,245-248.

Kato?Y,Fujita?N,Kunita?A,Sato?S,Kaneko?M,Osawa?M,Tsuruo?T(2003).Molecularidentification?of?Aggrus/T1alpha?as?a?platelet?aggregation-inducing?factor?expressed?incolorectal?tumors.J?Biol.Chem.278,51599-51605.

Kato?Y,Kaneko?MK,Kunita?A,Ito?H,Kameyama?A,Ogasawara?S,Matsuura?N,Hasegawa?Y,Suzuki-Inoue?K,Inoue?O,Ozaki?Y,Narimatsu?H(2008).Molecular?analysis?of?thepathophysiological?binding?of?the?platelet?aggregation-inducing?factor?podoplanin?to?the?C-typelectin-like?receptor?CLEC-2.Cancer?Sci.99,54-61.

Kato?Y,Kaneko?MK,Kuno?A,Uchiyama?N,Amano?K,Chiba?Y,Hasegawa?Y,Hirabayashi?J,Narimatsu?H,Mishima?K,Osawa?M(2006).Inhibition?of?tumor?cell-induced?plateletaggregation?using?a?novel?anti-podoplanin?antibody?reacting?with?itsplatelet-aggregation-stimulating?domain.Biochem.Biophys.Res.Commun.349,1301-1307.

Ke?N,Sundaram?R,Liu?G,Chionis?J,Fan?W,Rogers?C,Awad?T,Grifman?M,Yu?D,Wong-Staal?F,Li?QX(2007).Orphan?G?protein-coupled?receptor?GPR56?plays?a?role?in?celltransformation?and?tumorigenesis?involving?the?cell?adhesion?pathway.Mol.Cancer?Ther.6,1840-1850.

Kennedy?RC,Shearer?MH,Watts?AM,Bright?RK(2003).CD4+T?lymphocytes?play?a?criticalrole?in?antibody?production?and?tumor?immunity?against?simian?virus?40?large?tumor?antigen.Cancer?Res.63,1040-1045.

Kim?CH,Bak?KH,Kim?YS,Kim?JM,Ko?Y,Oh?SJ,Kim?KM,Hong?EK(2000).Expression?oftenascin-C?in?astrocytic?tumors:its?relevance?to?proliferation?and?angiogenesis.Surg?Neurol.54,235-240.

Kim?SH,Das?K,Noreen?S,Coffman?F,Hameed?M(2007).Prognostic?implications?ofimmunohistochemically?detected?YKL-40?expression?in?breast?cancer.World?J?Surg?Oncol?5,17.

Kleeberger?W,Bova?GS,Nielsen?ME,Herawi?M,Chuang?AY,Epstein?JI,Berman?DM(2007).Roles?for?the?stem?cell?associated?intermediate?filament?Nestin?in?prostate?cancer?migration?andmetastasis.Cancer?Res.67,9199-9206.

Klein?T,Ling?Z,Heimberg?H,Madsen?OD,Heller?RS,Serup?P(2003).Nestin?is?expressed?invascular?endothelial?cells?in?the?adult?human?pancreas.J?Histochem.Cytochem.51,697-706.

Klein?WM,Wu?BP,Zhao?S,Wu?H,Klein-Szanto?AJ,Tahan?SR(2007).Increased?expression?ofstem?cell?markers?in?malignant?melanoma.Mod.Pathol.20,102-107.

Kobayashi?H,Omiya?R,Ruiz?M,Huarte?E,Sarobe?P,Lasarte?JJ,Herraiz?M,Sangro?B,Prieto?J,Borras-Cuesta?F,Celis?E(2002).Identification?of?an?antigenic?epitope?for?helper?Tlymphocytes?from?carcinoembryonic?antigen.Clin?Cancer?Res.8,3219-3225.

Kono?T,Shimoda?M,Takahashi?M,Matsumoto?K,Yoshimoto?T,Mizutani?M,Tabata?C,Okoshi?K,Wada?H,Kubo?H(2007).Immunohistochemical?detection?of?the?lymphatic?markerpodoplanin?in?diverse?types?of?human?cancer?cells?using?a?novel?antibody.Int?J?Oncol?31,501-508.

Kosari?F,Parker?AS,Kube?DM,Lohse?CM,Leibovich?BC,Blute?ML,Cheville?JC,VasmatzisG(2005).Clear?cell?renal?cell?carcinoma:gene?expression?analyses?identify?a?potentialsignature?for?tumor?aggressiveness.Clin?Cancer?Res.11,5128-5139.

Kroes?RA,Dawson?G,Moskal?JR(2007).Focused?microarray?analysis?of?glyco-geneexpression?in?human?glioblastomas.J?Neurochem.103?Suppl?1,14-24.

Krona?A,Aman?P,Orndal?C,Josefsson?A(2007).Oncostatin?M-induced?genes?in?humanastrocytomas.Int.J?Oncol?31,1457-1463.

Kucharczak?J,Pannequin?J,Camby?I,Decaestecker?C,Kiss?R,Martinez?J(2001).Gastrininduces?over-expression?of?genes?involved?in?human?U373?glioblastoma?cell?migration.Oncogene?20,7021-7028.

Kucur?M,Isman?FK,Balci?C,Onal?B,Hacibekiroglu?M,Ozkan?F,Ozkan?A(2008).SerumYKL-40?levels?and?chitotriosidase?activity?as?potential?biomarkers?in?primary?prostate?cancerand?benign?prostatic?hyperplasia.Urol.Oncol?26,47-52.

Kurihara?H,Zama?A,Tamura?M,Takeda?J,Sasaki?T,Takeuchi?T(2000).Glioma/glioblastoma-specific?adenoviral?gene?expression?using?the?nestin?gene?regulator.GeneTher.7,686-693.

Lal?A,Peters?H,St?CB,Haroon?ZA,Dewhirst?MW,Strausberg?RL,Kaanders?JH,van?der?KogelAJ,Riggins?GJ(2001).Transcriptional?response?to?hypoxia?in?human?tumors.J?Natl.CancerInst.93,1337-1343.

Lemmel?C,Weik?S,Eberle?U,Dengjel?J,Kratt?T,Becker?HD,Rammensee?HG,Stevanovic?S(2004).Differential?quantitative?analysis?of?MHC?ligands?by?mass?spectrometry?using?stableisotope?labeling.Nat.Biotechnol.22,450-454.

Lendahl?U,Zimmerman?LB,McKay?RD(1990).CNS?stem?cells?express?a?new?class?ofintermediate?filament?protein.Cell?60,585-595.

Li?JY,Wang?H,May?S,Song?X,Fueyo?J,Fuller?GN,Wang?H(2008a).Constitutive?activationof?c-Jun?N-terminal?kinase?correlates?with?histologic?grade?and?EGFR?expression?in?diffusegliomas.J?Neurooncol.88,11-17.

Li?L,Xu?H,Spaulding?BO,Cheng?L,Simon?R,Yao?JL,di?Sant′agnese?PA,Bourne?PA,HuangJ(2008b).Expression?of?RNA-binding?protein?IMP3(KOC)in?benign?urothelium?andurothelial?tumors.Hum.Pathol.

Liang?ML,Ma?J,Ho?M,Solomon?L,Bouffet?E,Rutka?JT,Hawkins?C(2008).Tyrosine?kinaseexpression?in?pediatric?high?grade?astrocytoma.J?Neurooncol.87,247-253.

Liang?Y,Bollen?AW,Aldape?KD,Gupta?N(2006).Nuclear?FABP7?immunoreactivity?ispreferentially?expressed?in?infiltrative?glioma?and?is?associated?with?poor?prognosis?inEGFR-overexpressing?glioblastoma.BMC.Cancer?6,97.

Liang?Y,Diehn?M,Watson?N,Bollen?AW,Aldape?KD,Nicholas?MK,Lamborn?KR,BergerMS,Botstein?D,Brown?PO,Israel?MA(2005).Gene?expression?profiling?reveals?molecularlyand?clinically?distinct?subtypes?of?glioblastoma?multiforme.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A?102,5814-5819.

Liao?B,Hu?Y,Herrick?DJ,Brewer?G(2005).The?RNA-binding?protein?IMP-3?is?a?translationalactivator?of?insulin-like?growth?factor?II?leader-3?mRNA?during?proliferation?of?human?K562leukemia?cells.J?Biol.Chem.280,18517-18524.

Littaua?RA,Takeda?A,Cruz?J,Ennis?FA(1992).Vaccinia?virus-specific?human?CD4+cytotoxic?T-lymphocyte?clones.J?Virol.66,2274-2280.

Liu?M,Parker?RM,Darby?K,Eyre?HJ,Copeland?NG,Crawford?J,Gilbert?DJ,Sutherland?GR,Jenkins?NA,Herzog?H(1999).GPR56,a?novel?secretin-like?human?G-protein-coupled?receptorgene.Genomics?55,296-305.

Liu?S,Ginestier?C,Charafe-Jauffret?E,Foco?H,Kleer?CG,Merajver?SD,Dontu?G,Wicha?MS(2008).BRCA1?regulates?human?mammary?stem/progenitor?cell?fate.Proc?Natl.Acad.Sci.U.S.A?105,1680-1685.

Liu?W,Putnam?AL,Xu-Yu?Z,Szot?GL,Lee?MR,Zhu?S,Gottlieb?PA,Kapranov?P,GingerasTR,de?St?Groth?BF,Clayberger?C,Soper?DM,Ziegler?SF,Bluestone?JA(2006a).CD127expression?inversely?correlates?with?FoxP3?and?suppressive?function?of?human?CD4(+)T?regcells.J?Exp.Med?203,1701-1711.

Liu?X,Chen?N,Wang?X,He?Y,Chen?X,Huang?Y,Yin?W,Zhou?Q(2006b).Apoptosis?andproliferation?markers?in?diffusely?infiltrating?astrocytomas:profiling?of?17?molecules.JNeuropathol.Exp.Neurol.65,905-913.

Lo?ML,Staibano?S,Pannone?G,Mignogna?MD,Mariggio?A,Salvatore?G,Chieffi?P,Tramontano?D,De?RG,Altieri?DC(2001).Expression?of?the?apoptosis?inhibitor?survivin?inaggressive?squamous?cell?carcinoma.Exp.Mol.Pathol.70,249-254.

Lubensky?IA,Vortmeyer?AO,Kim?S,Lonser?RR,Park?DM,Ikejiri?B,Li?J,Okamoto?H,Walbridge?S,Ryschkewitsch?C,Major?E,Oldfield?EH,Zhuang?Z(2006).Identification?oftumor?precursor?cells?in?the?brains?of?primates?with?radiation-induced?de?novo?glioblastomamultiforme.Cell?Cycle?5,452-456.

Mach?B,Steimle?V,Martinez-Soria?E,Reith?W(1996).Regulation?of?MHC?class?II?genes:lessons?from?a?disease.Annu.Rev.Immunol.14,301-331.

Maderna?E,Salmaggi?A,Calatozzolo?C,Limido?L,Pollo?B(2007).Nestin,PDGFRbeta,CXCL12?and?VEGF?in?Glioma?Patients:Different?Profiles?of(Pro-Angiogenic)MoleculeExpression?Are?Related?with?Tumor?Grade?and?May?Provide?Prognostic?Information.CancerBiol.Ther.6.

Mahlamaki?EH,Barlund?M,Tanner?M,Gorunova?L,Hoglund?M,Karhu?R,Kallioniemi?A(2002).Frequent?amplification?of?8q24,11q,17q,and?20q-specific?genes?in?pancreatic?cancer.Genes?Chromosomes.Cancer?35,353-358.

Malcherek?G,Gnau?V,Stevanovic?S,Rammensee?HG,Jung?G,Melms?A(1994).Analysis?ofallele-specific?contact?sites?of?natural?HLA-DR17?ligands.J?Immunol.153,1141-1149.

Manici?S,Sturniolo?T,Imro?MA,Hammer?J,Sinigaglia?F,Noppen?C,Spagnoli?G,Mazzi?B,Bellone?M,Dellabona?P,Protti?MP(1999).Melanoma?cells?present?a?MAGE-3?epitope?toCD4(+)cytotoxic?T?cells?in?association?with?histocompatibility?leukocyte?antigen?DR11.J?Exp.Med?189,871-876.

Mao?Y,Zhou?L,Zhu?W,Wang?X,Yang?G,Xie?L,Mao?X,Jin?K(2007).Proliferative?status?oftumor?stem?cells?may?be?correlated?with?malignancy?grade?of?human?astrocytomas.FrontBiosci.12,2252-2259.

Marzo?AL,Kinnear?BF,Lake?RA,Frelinger?JJ,Collins?EJ,Robinson?BW,Scott?B(2000).Tumor-specific?CD4+T?cells?have?a?major″post-licensing″role?in?CTL?mediated?anti-tumorimmunity.J?Immunol.165,6047-6055.

Mellai?M,Caldera?V,Patrucco?A,Annovazzi?L,Schiffer?D(2008).Survivin?expression?inglioblastomas?correlates?with?proliferation,but?not?with?apoptosis.Anticancer?Res.28,109-118.

Mishima?K,Kato?Y,Kaneko?MK,Nishikawa?R,Hirose?T,Matsutani?M(2006).Increasedexpression?of?podoplanin?in?malignant?astrocytic?tumors?as?a?novel?molecular?marker?ofmalignant?progression.Acta?Neuropathol.111,483-488.

Mita?R,Coles?JE,Glubrecht?DD,Sung?R,Sun?X,Godbout?R(2007).B-FABP-expressingradial?glial?cells:the?malignant?glioma?cell?of?origin?Neoplasia.9,734-744.

Miyawaki?T,Uemura?A,Dezawa?M,Yu?RT,Ide?C,Nishikawa?S,Honda?Y,Tanabe?Y,TanabeT(2004).Tlx,an?orphan?nuclear?receptor,regulates?cell?numbers?and?astrocyte?development?inthe?developing?retina.J?Neurosci.24,8124-8134.

Mizukami?Y,Kono?K,Daigo?Y,Takano?A,Tsunoda?T,Kawaguchi?Y,Nakamura?Y,Fujii?H(2008).Detection?of?novel?cancer-testis?antigen-specific?T-cell?responses?in?TIL,regionallymph?nodes,and?PBL?in?patients?with?esophageal?squamous?cell?carcinoma.Cancer?Sci.

Mokhtari?K,Paris?S,guirre-Cruz?L,Privat?N,Criniere?E,Marie?Y,Hauw?JJ,Kujas?M,RowitchD,Hoang-Xuan?K,Delattre?JY,Sanson?M(2005).Olig2?expression,GFAP,p53?and?1p?lossanalysis?contribute?to?glioma?subclassification.Neuropathol.Appl.Neurobiol.31,62-69.

Mokry?J,Cizkova?D,Filip?S,Ehrmann?J,Osterreicher?J,Kolar?Z,English?D(2004).Nestinexpression?by?newly?formed?human?blood?vessels.Stem?Cells?Dev.13,658-664.

Morgan?RA,Dudley?ME,Wunderlich?JR,Hughes?MS,Yang?JC,Sherry?RM,Royal?RE,Topalian?SL,Kammula?US,Restifo?NP,Zheng?Z,Nahvi?A,de?Vries?CR,Rogers-Freezer?LJ,Mavroukakis?SA,Rosenberg?SA(2006).Cancer?Regression?in?Patients?After?Transfer?ofGenetically?Engineered?Lymphocytes.Science.

Mortara?L,Castellani?P,Meazza?R,Tosi?G,De?Lerma?BA,Procopio?FA,Comes?A,Zardi?L,Ferrini?S,Accolla?RS(2006).CIITA-induced?MHC?class?II?expression?in?mammaryadenocarcinoma?leads?to?a?Th1?polarization?of?the?tumor?microenvironment,tumor?rejection,and?specific?antitumor?memory.Clin?Cancer?Res.12,3435-3443.

Novellino?L,Castelli?C,Parmiani?G(2005).A?listing?of?human?tumor?antigens?recognized?by?Tcells:March?2004?update.Cancer?Immunol.Immunother.54,187-207.

Nutt?CL,Betensky?RA,Brower?MA,Batchelor?TT,Louis?DN,Stemmer-Rachamimov?AO(2005).YKL-40?is?a?differential?diagnostic?marker?for?histologic?subtypes?of?high-gradegliomas.Clin?Cancer?Res.11,2258-2264.

Nutt?CL,Matthews?RT,Hockfield?S(2001).Glial?tumor?invasion:a?role?for?the?upregulationand?cleavage?of?BEHAB/brevican.Neuroscientist.7,113-122.

O′Driscoll?L,Linehan?R,Clynes?M(2003).Survivin:role?in?normal?cells?and?in?pathologicalconditions.Curr.Cancer?Drug?Targets.3,131-152.

Ohike?N,Sato?M,Hisayuki?T,Imataka?H,Sato?S,Wada?Y,Saito?K,Takahashi?M,Tajiri?T,Kunimura?T,Morohoshi?T(2007).Immunohistochemical?analysis?of?nestin?and?c-kit?and?theirsignificance?in?pancreatic?tumors.Pathol.Int.57,589-593.

0kada?Y,Ohno?C,Ueki?K,Ogino?M,Kawamoto?S,Kim?P(2007).Comparison?of?numericalchange?of?epidermal?growth?factor?receptor?gene?among?pre-and?postradiation?glioma,andgliosis,and?its?clinical?use.Brain?Tumor?Pathol.24,15-18.

Ozerdem?U(2006).Targeting?of?pericytes?diminishes?neovascularization?andlymphangiogenesis?in?prostate?cancer.Prostate?66,294-304.

Pei?Z,Oey?NA,Zuidervaart?MM,Jia?Z,Li?Y,Steinberg?SJ,Smith?KD,Watkins?PA(2003).Theacyl-CoA?synthetase″bubblegum″(lipidosin):further?characterization?and?role?in?neuronalfatty?acid?beta-oxidation.J?Biol.Chem.278,47070-47078.

Pelloski?CE,Lin?E,Zhang?L,Yung?WK,Colman?H,Liu?JL,Woo?SY,Heimberger?AB,Suki?D,Prados?M,Chang?S,Barker?FG,III,Fuller?GN,Aldape?KD(2006).Prognostic?associations?ofactivated?mitogen-activated?protein?kinase?and?Akt?pathways?in?glioblastoma.Clin?Cancer?Res.12,3935-3941.

Pelloski?CE,Mahajan?A,Maor?M,Chang?EL,Woo?S,Gilbert?M,Colman?H,Yang?H,LedouxA,Blair?H,Passe?S,Jenkins?RB,Aldape?KD(2005).YKL-40?expression?is?associated?withpoorer?response?to?radiation?and?shorter?overall?survival?in?glioblastoma.Clin?Cancer?Res.11,3326-3334.

Penar?PL,Khoshyomn?S,Bhushan?A,Tritton?TR(1997).Inhibition?of?epidermal?growth?factorreceptor-associated?tyrosine?kinase?blocks?glioblastoma?invasion?of?the?brain.Neurosurgery?40,141-151.

Penna?A,Fowler?P,Bertoletti?A,Guilhot?S,Moss?B,Margolskee?RF,Cavalli?A,Valli?A,Fiaccadori?F,Chisari?FV,.(1992).Hepatitis?B?virus(HBV)-specific?cytotoxic?T-cell(CTL)response?in?humans:characterization?of?HLA?class?II-restricted?CTLs?that?recognizeendogenously?synthesized?HBV?envelope?antigens.J?Virol.66,1193-1198.

Peris?L,Thery?M,Faure?J,Saoudi?Y,Lafanechere?L,Chilton?JK,Gordon-Weeks?P,Galjart?N,Bornens?M,Wordeman?L,Wehland?J,Andrieux?A,Job?D(2006).Tubulin?tyrosination?is?amajor?factor?affecting?the?recruitment?of?CAP-Gly?proteins?at?microtubule?plus?ends.J?Cell?Biol.174,839-849.

Perry?J,Ho?M,Viero?S,Zheng?K,Jacobs?R,Thorner?PS(2007).The?intermediate?filamentnestin?is?highly?expressed?in?normal?human?podocytes?and?podocytes?in?glomerular?disease.Pediatr.Dev.Pathol.10,369-382.

Piesche?M,Hildebrandt?Y,Zettl?F,Chapuy?B,Schmitz?M,Wulf?G,Trumper?L,Schroers?R(2007).Identification?of?a?promiscuous?HLA?DR-restricted?T-cell?epitope?derived?from?theinhibitor?of?apoptosis?protein?survivin.Hum.Immunol.68,572-576.

Pizzagalli?F,Hagenbuch?B,Stieger?B,Klenk?U,Folkers?G,Meier?PJ(2002).Identification?of?anovel?human?organic?anion?transporting?polypeptide?as?a?high?affinity?thyroxine?transporter.Mol.Endocrinol.16,2283-2296.

Pryor?JG,Bourne?PA,Yang?Q,Spaulding?BO,Scott?GA,Xu?H(2008).IMP-3?is?a?novelprogression?marker?in?malignant?melanoma.Mod.Pathol.21,431-437.

Purow?B,Sundaresan?TK,Burdick?MJ,Kefas?B,Comeau?L,Hawkinson?M,Su?Q,Kotliarov?Y,Lee?J,Zhang?W,Fine?HA(2008).Notch-1?Regulates?Transcription?of?the?Epidermal?GrowthFactor?Receptor?Through?p53.Carcinogenesis.

Qin?Z,Blankenstein?T(2000).CD4+T?cell--mediated?tumor?rejection?involves?inhibition?ofangiogenesis?that?is?dependent?on?IFN?gamma?receptor?expression?by?nonhematopoietic?cells.Immunity.12,677-686.

Qin?Z,Schwartzkopff?J,Pradera?F,Kammertoens?T,Seliger?B,Pircher?H,Blankenstein?T(2003).A?critical?requirement?of?interferon?gamma-mediated?angiostasis?for?tumor?rejection?byCD8+T?cells.Cancer?Res.63,4095-4100.

Quaranta?M,Divella?R,Daniele?A,Di?TS,Venneri?MT,Lolli?I,Troccoli?G(2007).Epidermalgrowth?factor?receptor?serum?levels?and?prognostic?value?in?malignant?gliomas.Tumori?93,275-280.

Rammensee?HG,Bachmann?J,Emmerich?NP,Bachor?OA,Stevanovic?S(1999).SYFPEITHI:database?for?MHC?ligands?and?peptide?motifs.Immunogenetics?50,213-219.

Rammensee,H.G.,Bachmann,J.,and?Stevanovic,S.(1997).MHC?Ligands?and?Peptide?Motifs.Springer-Verlag,Heidelberg,Germany).

Rammensee?HG,Friede?T,Stevanoviic?S(1995).MHC?ligands?and?peptide?motifs:first?listing.Immunogenetics?41,178-228.

Reyaz?N,Tayyab?M,Khan?SA,Siddique?T(2005).Correlation?of?glial?fibrillary?acidic?protein(GFAP)with?grading?of?the?neuroglial?tumours.J?Coll.Physicians?Surg.Pak.15,472-475.

Ringsholt?M,Hogdall?EV,Johansen?JS,Price?PA,Christensen?LH(2007).YKL-40?proteinexpression?in?normal?adult?human?tissues--an?immunohistochemical?study.J?Mol.Histol.38,33-43.

Rosenberg?SA,Lotze?MT,Muul?LM,Chang?AE,Avis?FP,Leitman?S,Linehan?WM,RobertsonCN,Lee?RE,Rubin?JT,.(1987).A?progress?report?on?the?treatment?of?157?patients?withadvanced?cancer?using?lymphokine-activated?killer?cells?and?interleukin-2?or?high-doseinterleukin-2?alone.N.Engl.J.Med.316,889-897.

Rosenberg?SA,Packard?BS,Aebersold?PM,Solomon?D,Topalian?SL,Toy?ST,Simon?P,LotzeMT,Yang?JC,Seipp?CA,.(1988).Use?of?tumor-infiltrating?lymphocytes?and?interleukin-2?inthe?immunotherapy?of?patients?with?metastatic?melanoma.A?preliminary?report.N.Engl.J?Med319,1676-1680.

Roslind?A,Johansen?JS,Christensen?IJ,Kiss?K,Balslev?E,Nielsen?DL,Bentzen?J,Price?PA,Andersen?E(2008).High?serum?levels?of?YKL-40?in?patients?with?squamous?cell?carcinoma?ofthe?head?and?neck?are?associated?with?short?survival.Int.J?Cancer?122,857-863.

Ruiz?C,Huang?W,Hegi?ME,Lange?K,Hamou?MF,Fluri?E,Oakeley?EJ,Chiquet-Ehrismann?R,Orend?G(2004).Growth?promoting?signaling?by?tenascin-C[corrected].Cancer?Res.64,7377-7385.

Sabatini?F,Petecchia?L,Tavian?M,Jodon?dV,V,Rossi?GA,Brouty-Boye?D(2005).Humanbronchial?fibroblasts?exhibit?a?mesenchymal?stem?cell?phenotype?and?multilineagedifferentiating?potentialities.Lab?Invest?85,962-971.

Saidi?A,Javerzat?S,Bellahcene?A,De?VJ,Bello?L,Castronovo?V,Deprez?M,Loiseau?H,Bikfalvi?A,Hagedorn?M(2007).Experimental?anti-angiogenesis?causes?upregulation?of?genesassociated?with?poor?survival?in?glioblastoma.Int.J?Cancer.

Saito?T,Arifin?MT,Hama?S,Kajiwara?Y,Sugiyama?K,Yamasaki?F,Hidaka?T,Arita?K,KurisuK(2007).Survivin?subcellular?localization?in?high-grade?astrocytomas:simultaneousexpression?in?both?nucleus?and?cytoplasm?is?negative?prognostic?marker.J?Neurooncol.82,193-198.

Sakurada?K,Saino?M,Mouri?W,Sato?A,Kitanaka?C,Kayama?T(2007).Nestin?expression?incentral?nervous?system?germ?cell?tumors.Neurosurg.Rev.

Sarlomo-Rikala?M,Tsujimura?T,Lendahl?U,Miettinen?M(2002).Patterns?of?nestin?and?otherintermediate?filament?expression?distinguish?between?gastrointestinal?stromal?tumors,leiomyomas?and?schwannomas.APMIS?110,499-507.

Sasaki?T,Lopes?MB,Hankins?GR,Helm?GA(2002).Expression?of?survivin,an?inhibitor?ofapoptosis?protein,in?tumors?of?the?nervous?system.Acta?Neuropathol.104,105-109.

Sato?F,Abraham?JM,Yin?J,Kan?T,Ito?T,Mori?Y,Hamilton?JP,Jin?Z,Cheng?Y,Paun?B,BerkiAT,Wang?S,Shimada?Y,Meltzer?SJ(2006).Polo-like?kinase?and?survivin?are?esophagealtumor-specific?promoters.Biochem.Biophys.Res.Commun.342,465-471.

Schacht?V,Dadras?SS,Johnson?LA,Jackson?DG,Hong?YK,Detmar?M(2005).Up-regulationof?the?lymphatic?marker?podoplanin,a?mucin-type?transmembrane?glycoprotein,in?humansquamous?cell?carcinomas?and?germ?cell?tumors.Am?J?Pathol.166,913-921.

Schiffer?D,Manazza?A,Tamagno?I(2006).Nestin?expression?in?neuroepithelial?tumors.Neurosci.Lett.400,80-85.

Schlegel?J,Merdes?A,Stumm?G,Albert?FK,Forsting?M,Hynes?N,Kiessling?M(1994).Amplification?of?the?epidermal-growth-factor-receptor?gene?correlates?with?different?growthbehaviour?in?human?glioblastoma.Int.J?Cancer?56,72-77.

Schlehofer?B,Blettner?M,Preston-Martin?S,Niehoff?D,Wahrendorf?J,Arslan?A,Ahlbom?A,Choi?WN,Giles?GG,Howe?GR,Little?J,Menegoz?F,Ryan?P(1999).Role?of?medical?history?inbrain?tumour?development.Results?from?the?international?adult?brain?tumour?studv.Int.JCancer?82,155-160.

Schmitt?A,Gofferje?V,Weber?M,Meyer?J,Mossner?R,Lesch?KP(2003).The?brain-specificprotein?MLC1?implicated?in?megalencephalic?leukoencephalopathy?with?subcortical?cysts?isexpressed?in?glial?cells?in?the?murine?brain.Glia?44,283-295.

Schoenberger?SP,Toes?RE,van?d,V,Offringa?R,Melief?CJ(1998).T-cell?help?for?cytotoxic?Tlymphocytes?is?mediated?by?CD40-CD40L?interactions.Nature?393,480-483.

Schwartzbaum?J,Jonsson?F,Ahlbom?A,Preston-Martin?S,Lonn?S,Soderberg?KC,FeychtingM(2003).Cohort?studies?of?association?between?self-reported?allergic?conditions,immune-related?diagnoses?and?glioma?and?meningioma?risk.Int.J?Cancer?106,423-428.

Schwartzbaum?J,Jonsson?F,Ahlbom?A,Preston-Martin?S,Malmer?B,Lonn?S,Soderberg?K,Feychting?M(2005).Prior?hospitalization?for?epilepsy,diabetes,and?stroke?and?subsequentglioma?and?meningioma?risk.Cancer?Epidemiol.Biomarkers?Prev.14,643-650.

Schwechheimer?K,Huang?S,Cavenee?WK(1995).EGFR?gene?amplification--rearrangementin?human?glioblastomas.Int.J?Cancer?62,145-148.

Scrideli?CA,Carlotti?CG,Jr.,Okamoto?OK,Andrade?VS,Cortez?MA,Motta?FJ,Lucio-Eterovic?AK,Neder?L,Rosemberg?S,Oba-Shinjo?SM,Marie?SK,Tone?LG(2008).Geneexpression?profile?analysis?of?primary?glioblastomas?and?non-neoplastic?brain?tissue:identification?of?potential?target?genes?by?oligonucleotide?microarray?and?real-time?quantitativePCR.J?Neurooncol.

Sehgal?A,Boynton?AL,Young?RF,Vermeulen?SS,Yonemura?KS,Kohler?EP,Aldape?HC,Simrell?CR,Murphy?GP(1998).Cell?adhesion?molecale?Nr-CAM?is?over-expressed?in?humanbrain?tumors.Int?J?Cancer?76,451-458.

Sehgal?A,Ricks?S,Warrick?J,Boynton?AL,Murphy?GP(1999).Antisense?human?neurogliarelated?cell?adhesion?molecule?hNr-CAM,reduces?the?tumorigenic?properties?of?humanglioblastoma?cells.Anticancer?Res.19,4947-4953.

Shashidhar?S,Lorente?G,Nagavarapu?U,Nelson?A,Kuo?J,Cummins?J,Nikolich?K,Urfer?R,Foehr?ED(2005).GPR56?is?a?GPCR?that?is?overexpressed?in?gliomas?and?functions?in?tumorcell?adhesion.Oncogene?24,1673-1682.

Shedlock?DJ,Shen?H(2003).Requirement?for?CD4?T?cell?help?in?generating?functional?CD8?Tcell?memory.Science?300,337-339.

Shibahara?J,Kashima?T,Kikuchi?Y,Kunita?A,Fukayama?M(2006).Podoplanin?is?expressed?insubsets?of?tumors?of?the?central?nervous?system.Virchows?Arch.448,493-499.

Shih?AH,Holland?EC(2006).Notch?signaling?enhances?nestin?expression?in?gliomas.Neoplasia.8,1072-1082.

Shiras?A,Chettiar?ST,Shepal?V,Rajendran?G,Prasad?GR,Shastry?P(2007).Spontaneoustransformation?of?human?adult?nontumorigenic?stem?cells?to?cancer?stem?cells?is?driven?bygenomic?instability?in?a?human?model?of?glioblastoma.Stem?Cells?25,1478-1489.

Shostak?K,Labunskyy?V,Dmitrenko?V,Malisheva?T,Shamayev?M,Rozumenko?V,Zozulya?Y,Zehetner?G,Kavsan?V(2003).HC?gp-39?gene?is?upregulated?in?glioblastomas.Cancer?Lett.198,203-210.

Singh?SK,Clarke?ID,Hide?T,Dirks?PB(2004a).Cancer?stem?cells?in?nervous?system?tumors.Oncogene?23,7267-7273.

Singh?SK,Clarke?ID,Terasaki?M,Bonn?VE,Hawkins?C,Squire?J,Dirks?PB(2003).Identification?of?a?cancer?stem?cell?in?human?brain?tumors.Cancer?Res.63,5821-5828.

Singh?SK,Hawkins?C,Clarke?ID,Squire?JA,Bayani?J,Hide?T,Henkelman?RM,Cusimano?MD,Dirks?PB(2004b).Identification?of?human?brain?tumour?initiating?cells.Nature?432,396-401.

Singh-Jasuja?H,Emmerich?NP,Rammensee?HG(2004).The?Tubingen?approach:identification,selection,and?validation?of?tumor-associated?HLA?peptides?for?cancer?therapy.CancerImmunol.Immunother.53,187-195.

Sitnikova?L,Mendese?G,Liu?Q,Woda?BA,Lu?D,Dresser?K,Mohanty?S,Rock?KL,Jiang?Z(2008).IMP3?predicts?aggressive?superficial?urothelial?carcinoma?of?the?bladder.Clin?CancerRes.14,1701-1706.

Sjo?A,Magnusson?KE,Peterson?KH(2005).Association?of?alpha-dystrobrevin?withreorganizing?tight?junctions.J?Membr.Biol.203,21-30.

Span?PN,Sweep?FC,Wiegerinck?ET,Tjan-Heijnen?VC,Manders?P,Beex?LV,de?Kok?JB(2004).Survivin?is?an?independent?prognostic?marker?for?risk?stratification?of?breast?cancerpatients.Clin?Chem.50,1986-1993.

Standifer?NE,Ouyang?Q,Panagiotopoulos?C,Verchere?CB,Tan?R,Greenbaum?CJ,Pihoker?C,Nepom?GT(2006).Identification?of?Novel?HLA-A*0201-Restricted?Epitopes?in?Recent-OnsetType?1?Diabetic?Subjects?and?Antibody-Positive?Relatives.Diabetes?55,3061-3067.

Strojnik?T,Rosland?GV,Sakariassen?PO,Kavalar?R,Lah?T(2007).Neural?stem?cell?markers,nestin?and?musashi?proteins,in?the?progression?of?human?glioma:correlation?of?nestin?withprognosis?of?patient?survival.Surg?Neurol.68,133-143.

Su?W,Chen?J,Yang?H,You?L,Xu?L,Wang?X,Li?R,Gao?L,Gu?Y,Lin?S,Xu?H,Breyer?MD,Hao?CM(2007).Expression?of?nestin?in?the?podocytes?of?normal?and?diseased?human?kidneys.Am?J?Physiol?Regul.Integr.Comp?Physiol?292,R1761-R1767.

Sugawara?K,Kurihara?H,Negishi?M,Saito?N,Nakazato?Y,Sasaki?T,Takeuchi?T(2002).Nestin?as?a?marker?for?proliferative?endothelium?in?gliomas.Lab?Invest?82,345-351.

San?G,Yu?RT,Evans?RM,Shi?Y(2007).Orphan?nuclear?receptor?TLX?recruits?histonedeacetylases?to?repress?transcription?and?regulate?neural?stem?cell?proliferation.Proc?Natl.Acad.Sci.U.S.A?104,15282-15287.

Sun?JC,Bevan?MJ(2003).Defective?CD8?T?cell?memory?following?acute?infection?withoutCD4?T?cell?help.Science?300,339-342.

Suzuki?H,Kato?Y,Kaneko?MK,Okita?Y,Narimatsu?H,Kato?M(2008).Induction?ofpodoplanin?by?transforming?growth?factor-beta?in?human?fibrosarcoma.FEBS?Lett.582,341-345.

Suzuki?T,Maruno?M,Wada?K,Kagawa?N,Fujimoto?Y,Hashimoto?N,Izumoto?S,Yoshimine?T(2004).Genetic?analysis?of?human?glioblastomas?using?a?genomic?microarray?system.BrainTumor?Pathol.21,27-34.

Takano?T,Becker?LE(1997).Developmental?change?of?the?nestin-immunoreactive?midlineraphe?glial?structure?in?human?brainstem?and?spinal?cord.Dev.Neurosci.19,202-209.

Tan?HY,Liu?J,Wu?SM,Luo?HS(2005).Expression?of?a?novel?apoptosis?inhibitor-survivin?incolorectal?carcinoma.World?J?Gastroenterol.11,4689-4692.

Tanwar?MK,Gilbert?MR,Holland?EC(2002).Gene?expression?microarray?analysis?revealsYKL-40?to?be?a?potential?serum?marker?for?malignant?character?in?human?glioma.Cancer?Res.62,4364-4368.

Teranishi?N,Naito?Z,Ishiwata?T,Tanaka?N,Furukawa?K,Seya?T,Shinji?S,Tajiri?T(2007).Identification?of?neovasculature?using?nestin?in?colorectal?cancer.Int.J?Oncol?30,593-603.Teratani?T,Domoto?T,Kuriki?K,Kageyama?T,Takayama?T,Ishikawa?A,Ozono?S,Nozawa?R(2007).Detection?of?transcript?for?brain-type?fatty?Acid-binding?protein?in?tumor?and?urine?ofpatients?with?renal?cell?carcinoma.Urology?69,236-240.

Thompson?DM,Gill?GN(1985).The?EGF?receptor:structure,regulation?and?potential?role?inmalignancy.Cancer?Surv.4,767-788.

Tohyama?T,Lee?VM,Rorke?LB,Marvin?M,McKay?RD,Trojanowski?JQ(1992).Nestinexpression?in?embryonic?human?neuroepithelium?and?in?human?neuroepithelial?tumor?cells.LabInvest?66,303-313.

Tompkins?SM,Rota?PA,Moore?JC,Jensen?PE(1993).A?europium?fluoroimmunoassay?formeasuring?binding?of?antigen?to?class?II?MHC?glycoproteins.J?Immunol.Methods?163,209-216.

Toti?P,Regoli?M,Nesi?G,Occhini?R,Bartolommei?S,Fonzi?L,Bertelli?E(2005).Nestinexpression?in?normal?adrenal?gland?and?adrenocortical?tumors.Histol.Histopathol.20,1115-1120.

Tsujimura?T,Makiishi-Shimobayashi?C,Lundkvist?J,Lendahl?U,Nakasho?K,Sugihara?A,Iwasaki?T,Mano?M,Yamada?N,Yamashita?K,Toyosaka?A,Terada?N(2001).Expression?of?theintermediate?filament?nestin?in?gastrointestinal?stromal?tumors?and?interstitial?cells?of?Cajal.Am?J?Pathol.158,817-823.

Uematsu?M,Ohsawa?I,Aokage?T,Nishimaki?K,Matsumoto?K,Takahashi?H,Asoh?S,Teramoto?A,Ohta?S(2005).Prognostic?significance?of?the?immunohistochemical?index?ofsurvivin?in?glioma:a?comparative?study?with?the?MIB-1?index.J?Neurooncol.72,231-238.

van?Bilsen?JH,van?DH,Lard?LR,van?d,V,Elferink?DG,Bakker?AM,Miltenburg?AM,Huizinga?TW,de?Vries?RR,Toes?RE(2004).Functional?regulatory?immune?responses?againsthuman?cartilage?glycoprotein-39?in?health?vs.proinflammatory?responses?in?rheumatoidarthritis.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A?101,17180-17185.

van?der?Bruggen?P,Traversari?C,Chomez?P,Lurquin?C,De?PE,Van?den?EB,Knuth?A,Boon?T(1991).A?gene?encoding?an?antigen?recognized?by?cytolytic?T?lymphocytes?on?a?humanmelanoma.Science?254,1643-1647.

Vanderwinden?JM,Gillard?K,De?Laet?MH,Messam?CA,Schiffmann?SN(2002).Distributionof?the?intermediate?filament?nestin?in?the?muscularis?propria?of?the?human?gastrointestinal?tract.Cell?Tissue?Res.309,261-268.

Veerkamp?JH,Zimmerman?AW(2001).Fatty?acid-binding?proteins?of?nervous?tissue.J?Mol.Neurosci.16,133-142.

Veselska?R,Kuglik?P,Cejpek?P,Svachova?H,Neradil?J,Loja?T,Relichova?J(2006).Nestinexpression?in?the?cell?lines?derived?from?glioblastoma?multiforme.BMC.Cancer?6,32.

Viapiano?MS,Bi?WL,Piepmeier?J,Hockfield?S,Matthews?RT(2005).Novel?tumor-specificisoforms?of?BEHAB/brevican?identified?in?human?malignant?gliomas.Cancer?Res.65,6726-6733.

Viapiano?MS,Hockfield?S,Matthews?RT(2008).BEHAB/brevican?requiresADAMTS-mediated?proteolytic?cleavage?to?promote?glioma?invasion.J?Neurooncol.

Vigneron?N,Stroobant?V,Chapiro?J,Ooms?A,Degiovanni?G,Morel?S,van?der?BP,Boon?T,Van?Den?Eynde?BJ(2004).An?antigenic?peptide?produced?by?peptide?splicing?in?theproteasome.Science?304,587-590.

Vogt?AB,Kropshofer?H,Kalbacher?H,Kalbus?M,Rammensee?HG,Coligan?JE,Martin?R(1994).Ligand?motifs?of?HLA-DRB5*0101?and?DRB1*1501?molecules?delineated?fromself-peptides.J?Immunol.153,1665-1673.

Walter?S,Herrgen?L,Schoor?O,Jung?G,Wernet?D,Buhring?HJ,Rammensee?HG,Stevanovic?S(2003).Cutting?edge:predetermined?avidity?of?human?CD8?T?cells?expanded?on?calibratedMHC/anti-CD28-coated?microspheres.J.Immunol.171,4974-4978.

Wang?JC,Livingstone?AM(2003).Cutting?edge:CD4+T?cell?help?can?be?essential?for?primaryCD8+T?cell?responses?in?vivo.J?Immunol.171,6339-6343.

Wei?LC,Shi?M,Cao?R,Chen?LW,Chan?YS(2008).Nestin?small?interfering?RNA(siRNA)reduces?cell?growth?in?cultured?astrocytoma?cells.Brain?Res.1196,103-112.

Weinschenk?T,Gouttefangeas?C,Schirle?M,Obermayr?F,Walter?S,Schoor?O,Kurek?R,LoeserW,Bichler?KH,Wernet?D,Stevanovic?S,Rammensee?HG(2002).Integrated?functionalgenomics?approach?for?the?design?of?patient-individual?antitumor?vaccines.Cancer?Res.62,5818-5827.

Wicki?A,Lehembre?F,Wick?N,Hantusch?B,Kerjaschki?D,Christofori?G(2006).Tumorinvasion?in?the?absence?of?epithelial-mesenchymal?transition:podoplanin-mediated?remodelingof?the?actin?cytoskeleton.Cancer?Cell?9,261-272.

Winer?S,Tsui?H,Lau?A,Song?A,Li?X,Cheung?RK,Sampson?A,Afifiyan?F,Elford?A,Jackowski?G,Becker?DJ,Santamaria?P,Ohashi?P,Dosch?HM(2003).Autoimmune?isletdestruction?in?spontaneous?type?1?diabetes?is?not?beta-cell?exclusive.Nat.Med?9,198-205.

Wiranowska?M,Ladd?S,Smith?SR,Gottschall?PE(2006).CD44?adhesion?molecule?andneuro-glial?proteoglycan?NG2?as?invasive?markers?of?glioma.Brain?Cell?Biol.35,159-172.

Xie?D,Zeng?YX,Wang?HJ,Wen?JM,Tao?Y,Sham?JS,Guan?XY(2006).Expression?ofcytoplasmic?and?nuclear?Survivin?in?primary?and?secondary?human?glioblastoma.Br.J?Cancer94,108-114.

Xu?L,Begum?S,Hearn?JD,Hynes?RO(2006).GPR56,an?atypical?G?protein-coupled?receptor,binds?tissue?transglutaminase,TG2,and?inhibits?melanoma?tumor?growth?and?metastasis.ProcNatl.Acad.Sci.U.S.A?103,9023-9028.

Xu?L,Hynes?RO(2007).GPR56?and?TG2:possible?roles?in?suppression?of?tumor?growth?by?themicroenvironment.Cell?Cycle?6,160-165.

Yamashita?S,Masuda?Y,Kurizaki?T,Haga?Y,Murayama?T,Ikei?S,Kamei?M,Takeno?S,Kawahara?K(2007).Survivin?expression?predicts?early?recurrence?in?early-stage?breast?cancer.Anticancer?Res.27,2803-2808.

Yang?J,Price?MA,Neudauer?CL,Wilson?C,Ferrone?S,Xia?H,Iida?J,Simpson?MA,McCarthyJB(2004).Melanoma?chondroitin?sulfate?proteoglycan?enhances?FAK?and?ERK?activation?bydistinct?mechanisms.J?Cell?Biol.165,881-891.

Yantiss?RK,Cosar?E,Fischer?AH(2008).Use?of?IMP3?in?identification?of?carcinoma?in?fineneedle?aspiration?biopsies?of?pancreas.Acta?Cytol.52,133-138.

Yantiss?RK,Woda?BA,Fanger?GR,Kalos?M,Whalen?GF,Tada?H,Andersen?DK,Rock?KL,Dresser?K(2005).KOC(K?homology?domain?containing?protein?overexpressed?in?cancer):anovel?molecular?marker?that?distinguishes?between?benign?and?malignant?lesions?of?thepancreas.Am?J?Surg?Pathol.29,188-195.

Yee?C,Thompson?JA,Byrd?D,Riddell?SR,Roche?P,Celis?E,Greenberg?PD(2002).Adoptive?Tcell?therapy?using?antigen-specific?CD8+T?cell?clones?for?the?treatment?of?patients?withmetastatic?melanoma:in?vivo?persistence,migration,and?antitumor?effect?of?transferred?T?cells.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A?99,16168-16173.

yuso-Sacido?A,Graham?C,Greenfield?JP,Boockvar?JA(2006).The?duality?of?epidermalgrowth?factor?receptor(EGFR)signaling?and?neural?stem?cell?phenotype:cell?enhancer?or?celltransformer?Curr.Stem?Cell?Res.Ther.1,387-394.

Zangen?I,Kneitz?S,Monoranu?CM,Rutkowski?S,Hinkes?B,Vince?GH,Huang?B,RoggendorfW(2007).Ependymoma?gene?expression?profiles?associated?with?histological?subtype,proliferation,and?patient?survival.Acta?Neuropathol.113,325-337.

Zaremba?S,Barzaga?E,Zhu?M,Soares?N,Tsang?KY,Schlom?J(1997).Identification?of?anenhancer?agonist?cytotoxic?T?lymphocyte?peptide?from?human?carcinoembryonic?antigen.Cancer?Res.57,4570-4577.

Zawrocki?A,Biernat?W(2005).Epidermal?growth?factor?receptor?in?glioblastoma.FoliaNeuropathol.43,123-132.

Zeh?HJ,III,Perry-Lalley?D,Dudley?ME,Rosenberg?SA,Yang?JC(1999).High?avidity?CTLsfor?two?self-antigens?demonstrate?superior?in?vitro?and?in?vivo?antitumor?efficacy.J?Immunol.162,989-994.

Zhen?HN,Zhang?X,Hu?PZ,Yang?TT,Fei?Z,Zhang?JN,Fu?LA,He?XS,Ma?FC,Wang?XL(2005).Survivin?expression?and?its?relation?with?proliferation,apoptosis,and?angiogenesis?inbrain?gliomas.Cancer?104,2775-2783.

Zheng?W,Yi?X,Fadare?O,Liang?SX,Martel?M,Schwartz?PE,Jiang?Z(2008).The?oncofetalprotein?IMP3:a?novel?biomarker?for?endometrial?serous?carcinoma.Am?J?Surg?Pathol.32,304-315.

Zhou?R,Skalli?O(2000).TGF-alpha?differentially?regulates?GFAP,vimentin,and?nestin?geneexpression?in?U-373?MG?glioblastoma?cells:correlation?with?cell?shape?and?motility.Exp.CellRes.254,269-278.

Zimmerman?L,Parr?B,Lendahl?U,Cunningham?M,McKay?R,Gavin?B,Mann?J,Vassileva?G,McMahon?A(1994).Independent?regulatory?elements?in?the?nestin?gene?direct?transgeneexpression?to?neural?stem?cells?or?muscle?precursors.Neuron?12,11-24.

Ziu?M,Schmidt?NO,Cargioli?TG,Aboody?KS,Black?PM,Carroll?RS(2006).

Glioma-produced?extracellular?matrix?influences?brain?tumor?tropism?of?human?neural?stemcells.J?Neurooncol.79,125-133.

Zukiel?R,Nowak?S,Wyszko?E,Rolle?K,Gawronska?I,Barciszewska?MZ,Barciszewski?J(2006).Suppression?of?human?brain?tumor?with?interference?RNA?specific?for?tenascin-C.Cancer?Biol.Ther.5,1002-1007.

Zulewski?H,Abraham?EJ,Gerlach?MJ,Daniel?PB,Moritz?W,Muller?B,Vallejo?M,ThomasMK,Habener?JF(2001).Multipotential?nestin-positive?stem?cells?isolated?from?adultpancreatic?islets?differentiate?ex?vivo?into?pancreatic?endocrine,exocrine,and?hepaticphenotypes.Diabetes?50,521-533.

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