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用于治療腫瘤的組合物和方法.pdf

摘要
申請專利號:

CN200780027843.9

申請日:

2007.07.25

公開號:

CN101495633B

公開日:

2015.01.07

當前法律狀態:

終止

有效性:

無權

法律詳情: 未繳年費專利權終止IPC(主分類):C12N 15/11申請日:20070725授權公告日:20150107終止日期:20150725|||授權|||實質審查的生效|||公開
IPC分類號: C12N15/11; A61K31/7105; A61K39/00; A61P35/00 主分類號: C12N15/11
申請人: 塞諾菲-安萬特股份有限公司
發明人: P·奧古斯特; W·J·黃; S·納特森; S·利伯曼
地址: 法國巴黎
優先權: 2006.07.28 US 60/833,879
專利代理機構: 中國專利代理(香港)有限公司 72001 代理人: 李連濤
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法律狀態
申請(專利)號:

CN200780027843.9

授權公告號:

|||101495633B||||||

法律狀態公告日:

2016.09.07|||2015.01.07|||2009.09.23|||2009.07.29

法律狀態類型:

專利權的終止|||授權|||實質審查的生效|||公開

摘要

本發明涉及用于治療腫瘤的組合物,制備這種組合物的方法,以及使用這種組合物的方法。本發明還涉及一種用于檢測核心蛋白1和/或線粒體呼吸復合體III的其他蛋白質活性的抑制劑的檢測方法。

權利要求書

權利要求書
1.  一種組合物,其含有:(A)抑制復合體III蛋白活性的抑制劑;以及(B)載體。

2.  如權利要求1所述的組合物,其中所述復合體III蛋白是核心蛋白1。

3.  如權利要求1所述的組合物,其中所述抑制劑是抑制復合體III蛋白表達的反義核酸。

4.  如權利要求1所述的組合物,其中所述抑制劑是編碼反義核酸的核酸;該反義核酸抑制編碼復合體III蛋白的基因的表達。

5.  如權利要求4所述的組合物,其中所述核酸包括啟動子區域。

6.  如權利要求4所述的組合物,其中所述核酸包含于載體中。

7.  如權利要求1所述的組合物,其中所述抑制劑是抑制編碼復合體III蛋白的基因表達的siRNA。

8.  如權利要求1所述的組合物,其中所述抑制劑是能與復合體III蛋白結合并降低其活性的抗體。

9.  如權利要求1所述的組合物,其中所述抑制劑是核酸,其編碼能與復合體III蛋白結合并降低其活性的抗體。

10.  如權利要求9所述的組合物,其中所述核酸包括啟動子。

11.  如權利要求9所述的組合物,其中所述核酸包含于載體中。

12.  如權利要求1所述的組合物,其中所述抑制劑是能降低復合體III蛋白表達的核酶。
13 如權利要求1所述的組合物,其中所述抑制劑是核酸,其編碼能降低復合體III蛋白表達的核酶。

14.  如權利要求13所述的組合物,其中所述核酸包括啟動子。

15.  如權利要求13所述的組合物,其中所述核酸包含于載體中。

16.  如權利要求1所述的組合物,其還含有腫瘤壞死因子超家族的成員。

17.  如權利要求16所述的組合物,其中所述成員是TRAIL。

18.  如權利要求16所述的組合物,其中所述成員是Fas配體。

19.  一種治療患者腫瘤的方法,包括向該患者施用組合物的步驟,該組合物含有抑制復合體III蛋白活性的抑制劑和載體。

20.  如權利要求19所述的方法,其中所述復合體III蛋白是核心蛋白1。

21.  如權利要求19所述的方法,其中所述組合物含有抑制腫瘤壞死因子超家族成員活性的抑制劑。

22.  如權利要求21所述的方法,其中所述成員是TRAIL。

23.  如權利要求21所述的方法,其中所述成員是Fas配體。

24.  如權利要求19所述的方法,其還包括施用腫瘤壞死因子超家族的成員。

25.  如權利要求21所述的方法,其中所述成員是TRAIL。

26.  如權利要求21所述的方法,其中所述成員是Fas配體。

27.  一種制備含有抑制復合體III蛋白活性的抑制劑和載體的組合物的方法,其包括將所述抑制劑與所述載體混合。

28.  如權利要求27所述的方法,其中所述復合體III蛋白是核心蛋白1。

29.  一種制備含有抑制復合體III蛋白活性的抑制劑、載體以及腫瘤壞死因子超家族成員的組合物的方法,其包括將所述抑制劑、所述載體及所述超家族成員混合。

30.  如權利要求29所述的方法,其中所述復合體III蛋白是核心蛋白1。

31.  一種進行檢測以確定化合物是否是復合體III蛋白的TNF抑制活性的抑制劑的方法,包括將在TNF超家族成員存在條件下生長并已與所述化合物接觸的表達所述復合體III蛋白的(A)細胞的生存力與在TNF超家族成員不存在的條件下生長并已與所述化合物接觸的屬于同一細胞系且表達所述復合體III蛋白的(B)細胞的生存力作比較。

32.  如權利要求31所述的方法,其中所述復合體III蛋白是核心蛋白1。

33.  如權利要求32所述的方法,其中所述細胞來自HCT116細胞系并已由編碼核心蛋白1的外源性轉基因所轉染。

34.  如權利要求33所述的方法,其中所述轉基因是人類轉基因。

35.  如權利要求32所述的方法,其中所述細胞來自HCT116細胞系并已由編碼核心蛋白1一部分的外源性轉基因所轉染。

36.  如權利要求31所述的方法,其中所述TNF超家族成員是TRAIL。

37.  一種進行檢測以確定化合物是否是復合體III蛋白的TNF抑制活性的抑制劑的方法,其包括:
(A)使所述化合物與在TNF超家族成員存在條件下生長的表達所述蛋白質的細胞接觸一段預定的時間;
(B)使該化合物與在TNF超家族成員不存在條件下生長的且屬于如上所述同一細胞系并表達所述蛋白質的細胞接觸一段相同的預定時間;以及
(C)將上面(B)中所述細胞的生存力與上面(A)中所述細胞的生存力作比較。

38.  如權利要求37所述的方法,其中所述復合體III蛋白是核心蛋白1。

39.  一種進行檢測以確定化合物是否是復合體III蛋白的活性的抑制劑的方法,其包括:
(A)在TNF超家族成員存在條件下培養表達所述蛋白質的來自某細胞系的細胞;
(B)在TNF超家族成員不存在的條件下培養表達所述蛋白質的屬于同一細胞系的細胞;
(C)使所述化合物與上面(A)中所述的細胞接觸;
(D)使所述化合物與上面(B)中所述的細胞接觸;以及
(E)在一段預定的時間之后,將上面(B)中所述細胞的生存力與上面(A)中所述細胞的生存力作比較。

40.  如權利要求39所述的方法,其中所述復合體III蛋白是核心蛋白1。

41.  一種進行檢測以確定化合物是否是復合體III蛋白的TNF抑制活性的抑制劑的方法,其包括將已與TNF超家族成員及所述化合物接觸的表達所述蛋白質的細胞的生存力與已與所述化合物接觸但未與TNF超家族成員接觸的且屬于同一細胞系的表達所述蛋白質的細胞的生存力作比較。

42.  如權利要求41所述的方法,其中所述復合體III蛋白是核心蛋白1。

43.  一種進行檢測以確定化合物是否是復合體III蛋白的TNF抑制活性的抑制劑的方法,其包括:
(A)使來自某細胞系的表達所述蛋白質的細胞與TNF超家族成員及所述化合物接觸。
(B)使屬于同一細胞系的表達所述蛋白質的細胞與所述化合物接觸但不與TNF超家族成員接觸;以及
(C)將上面(B)中所述細胞的生存力與上面(A)中所述細胞的生存力作比較。

44.  如權利要求36所述的方法,其中所述復合體III蛋白是核心蛋白1。

說明書

說明書用于治療腫瘤的組合物和方法
發明領域
腫瘤是組織的異常增生,其可以是惡性的或是良性的。良性腫瘤僅局部地生長,而惡性腫瘤則會擴散至其他組織。
癌癥是遺傳病。抗凋亡的能力是癌細胞的特征。已知許多遺傳性病變使得癌細胞對程序性細胞死亡(凋亡)產生抗性。在細胞凋亡期間,稱為胱天蛋白酶的一些酶執行分解細胞的過程。起始子胱天蛋白酶剪切無活性的效應子胱天蛋白酶的前體,從而將其活化。然后,激活的效應子胱天蛋白酶對細胞內的蛋白質進行分裂。在正常組織中,細胞凋亡的速率與細胞增長的速率平衡,從而調控組織的生長。如果細胞的凋亡過程受到干擾,則細胞可以繼續分裂,從而導致組織生長的失控。
腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體(TRAIL)是治療腫瘤很有希望的治療劑。TRAIL是腫瘤壞死因子(TNF)超家族的成員,該家族包括有效的凋亡誘導物TNF和Fas配體(FasL)。TRAIL之所以受到特別關注,不僅是因為其誘導多種人類腫瘤和癌細胞系的快速凋亡,還因為其對正常細胞和組織具有很小的毒性。
通常TRAIL由身體中許多組織表達,但也可在腫瘤治療期間外源性施用。將可溶性的活性形式TRAIL注射入攜帶實體瘤的小鼠誘導了凋亡、抑制了腫瘤的進展并改善了存活。還有證據顯示,使用TRAIL和各種化療藥物的組合治療能進一步促進腫瘤退化。
TRAIL與腫瘤和癌細胞系上的死亡受體DR4和DR5結合,并迅速地、特異性地誘導凋亡。取決于細胞的類型,TRAIL與死亡受體的結合可同時誘導外源性和內源性凋亡途徑,或只誘導兩者之一。在這兩種途徑中,TRAIL與其受體的結合產生了銜接蛋白FADD(具有死亡結構域的Fas相關蛋白)的結合位點,該銜接蛋白募集并激活起始子胱天蛋白酶8。在某些細胞內,胱天蛋白酶8激活外源性凋亡途徑,從而直接導致足以誘導凋亡的效應子胱天蛋白酶3、6和7的激活。TRAIL也可通過內源性途徑誘導凋亡,在此途徑中胱天蛋白酶8的激活引發了涉及線粒體及凋亡體形成的凋亡。胱天蛋白酶8剪切Bcl-2抑制性含BH3結構域蛋白(Bid),從而導致了截短的Bid蛋白從細胞質轉移至線粒體外膜并誘導Bax和Bak的寡聚反應。由Bax(Bcl-2-相關X蛋白)和Bak(Bcl-2-拮抗劑/殺傷因子1)所形成的孔道,引起線粒體膜極化狀態的消失和細胞色素C的釋放,導致該細胞線粒體的代謝故障。然后,細胞質內的細胞色素C與胱天蛋白酶9相互作用,以激活下游的效應子胱天蛋白酶3、6和7。
然而,利用TNF超家族成員實施的治療具有某些局限性:多種腫瘤細胞對TNF超家族成員(包括TRAIL)誘導的凋亡具有抗性。本發明則旨在消除這些局限性。
已報導的進展
已知存在于體內的某些分子以抑制TNF超家族成員的活性的方式起作用(在本文中這樣的化合物稱為“TNF抑制因子”)。例如據報導,細胞FLICE抑制蛋白(c-FLIPs)、Bax抑制因子1以及Bcl-XL能抑制TRAIL的凋亡活性。Burns,T.F.和W.S.El-Deiry,J.Biol.Chem.,276:37879-37886(2001)。又據報導,AKT和MIRSA基因也能抑制TRAIL的凋亡活性。參閱Aza-Blanc等人,Molecular Cell,12:627-637(2003)。
此外還已知,抑制TNF抑制因子活性的生物分子以改善TRAIL的凋亡活性的方式敏化細胞。例如,施用靶向細胞中AKT和MIRSA基因的siRNA已顯示出使細胞對TRAIL的凋亡活性敏化。參閱Aza-Blanc等人,Molecular Cell,12:627-637(2003)。
本發明涉及提供也改善TRAIL的凋亡活性的方法。
發明內容
本發明涉及組合物,其包括:(A)抑制復合體III蛋白(如核心蛋白1)活性的抑制劑;以及(B)載體。
此外,本發明涉及制備組合物的方法,該組合物含有抑制復合體III蛋白(如核心蛋白1)活性的抑制劑和載體,該方法包括將所述抑制劑與所述載體混合。
在另一方面,本發明涉及制備組合物的方法,該組合物含有抑制復合體III蛋白(如核心蛋白1)活性的抑制劑、載體以及腫瘤壞死因子超家族的成員,該方法包括將所述抑制劑、所述載體及所述超家族成員混合。
本發明的另一方面涉及進行檢測以確定化合物是否是復合體III蛋白(如核心蛋白1)的TNF抑制活性的抑制劑的方法,其包括將在TNF超家族成員存在條件下生長并已與所述化合物接觸的表達復合體III蛋白的細胞的生存力與在TNF超家族成員不存在的條件下生長并已與所述化合物接觸的屬于同一細胞系且也表達所述復合體III蛋白的細胞的生存力作比較。
本發明的另一方面涉及進行檢測以確定化合物是否是復合體III蛋白(如核心蛋白1)的TNF抑制活性的抑制劑的方法,其包括:使化合物與表達所述蛋白質并在TNF超家族成員存在條件下生長的細胞接觸一段預定的時間;使該化合物與跟如上所述的屬于同一細胞系且表達所述蛋白質但在TNF超家族成員不存在條件下生長的細胞接觸相同的預定時間;并比較這些細胞的生存力。
本發明的又一方面涉及進行檢測以確定化合物是否是復合體III蛋白(如核心蛋白1)的活性的抑制劑的方法,其包括:在TNF超家族成員存在條件下培養表達該蛋白質的屬于某細胞系的細胞;在TNF超家族成員不存在的條件下培養表達該蛋白質的屬于同一細胞系的細胞;使所述化合物與這些細胞接觸;以及在一段預定的時間之后比較這些細胞的生存力。
本發明的又一方面涉及進行檢測以確定化合物是否是復合體III蛋白(如核心蛋白1)的TNF抑制活性的抑制劑的方法,其包括將已與TNF超家族成員和化合物均接觸的表達所述蛋白質的細胞的生存力與已與化合物接觸但未與TNF超家族成員接觸的屬于同一細胞系且表達所述蛋白質的細胞的生存力作比較。
本發明的另一方面涉及進行檢測以確定化合物是否是復合體III蛋白(如核心蛋白1)的TNF抑制活性的抑制劑的方法,其包括:使表達該蛋白質的屬于某細胞系的細胞與TNF超家族成員及所述化合物接觸;使表達該蛋白質的屬于同一細胞系的細胞與該化合物接觸但不與TNF超家族成員接觸;以及比較這些細胞的生存力。
附圖說明
圖1A是流程圖,其描述了篩選cDNA文庫以獲得對TRAIL所誘導凋亡具有抗性的基因的方法。示意圖顯示了為獲得抗TRAIL所誘導凋亡的基因而進行的小鼠E14cDNA文庫的遺傳篩選過程。分離、測序及驗證取自TRAIL抗性細胞的cDNA。
圖1B顯示了與人的全長UQCRC1cDNA比較的小鼠UQCRC1(核心蛋白1)cDNA的一部分氨基酸序列。兩者均含有線粒體定位序列(MLS)。
圖1C是顯示多種腫瘤組織中核心蛋白1過表達水平的表格(資料引自Ascenta數據庫)。
圖2A是顯示表達顯性陰性的FADD(dnFADD)、綠色熒光蛋白(GFP),或部分核心蛋白1的HCT116細胞的生存力(以膜聯蛋白V陰性的細胞百分比計)的柱形圖。這些細胞分別經TRAIL處理(10ng/ml或50ng/ml)或未經TRAIL處理(0ng/ml)。
圖2B是顯示表達顯性陰性的FADD(dnFADD)、綠色熒光蛋白(GFP),或部分核心蛋白1的HCT116細胞的生存力(以細胞中極化線粒體的百分比計)的柱形圖。這些細胞分別經TRAIL處理(10ng/ml或50ng/ml)或未經TRAIL處理(0ng/ml)。
圖2C是使用核心蛋白1、COX1(線粒體標記)以及SOD1(細胞質標記)的抗體,在細胞質和線粒體成分上進行Western印跡試驗的結果。該細胞質和線粒體成分由表達黃色熒光蛋白(YFP)或人的全長核心蛋白1(FL)的穩定細胞系制備。
圖2D是顯示表達黃色熒光蛋白(YFP)或人的全長核心蛋白1的HT116細胞的生存力(以膜聯蛋白V陰性的細胞百分比計)的柱形圖。這些細胞分別經TRAIL處理(10ng/ml或50ng/ml)或未經TRAIL處理(0ng/ml)。
圖3A是使用胱天蛋白酶8、胱天蛋白酶9、胱天蛋白酶3以及微管蛋白的抗體(印跡洗脫后使用微管蛋白的抗體再次探測并作為加載量的參照),在由表達黃色熒光蛋白(YFP)或人的全長核心蛋白1(FL)的穩定HCT116細胞系制備的成分上進行的Western印跡試驗。該細胞系或者已用200ng/ml TRAIL處理24小時,或未經TRAIL處理。
圖3B是顯示表達黃色熒光蛋白(YFP)或表達核心蛋白1的細胞中細胞色素C存在量的柱形圖。該細胞已用100ng/ml TRAIL處理或未用TRAIL(0ng/ml)處理。裂解物中細胞色素C的量用ELISA定量。
圖3C是顯示表達黃色熒光蛋白(YFP)或表達核心蛋白1的細胞的生存力的柱形圖。該細胞已用100ng/ml TRAIL或16ng/ml FasL處理,或未經TRAIL或FasL處理。細胞的生存力用Cell Titer Blue檢測法測定。
圖3D是顯示表達黃色熒光蛋白(YFP)或表達人的全長核心蛋白1的細胞的生存力的柱形圖。該細胞已用200nM喜樹堿、10nM多西他賽或DMSO處理,或未經處理。細胞的生存力用Cell Titer Blue檢測法測定。
圖4A是使用核心蛋白1和微管蛋白的抗體(印跡洗脫后使用微管蛋白的抗體再次探測并作為加載量的參照),在從HCT116野生型細胞制備的成分上進行的Western印跡試驗的結果。該細胞已與單獨的lipofectamine(對照細胞)、3.75nM無效siRNA或核心蛋白1siRNA一起孵育了72小時。
圖4B是顯示在上文圖4A中所述每種細胞中核心蛋白1表達水平的柱形圖。
圖4C是顯示lipofectamine單獨、無效siRNA或核心蛋白1siRNA處理,繼而再以濃度增加的TRAIL處理之后的細胞的生存力的圖。
圖5A顯示了人類UQCRC1 cDNA的核酸序列(SEQ ID NO:1)。
圖5B顯示了人類核心蛋白1的氨基酸序列(SEQ ID NO:2)。
發明的詳細描述
本發明涉及一種抑制劑的用途,該抑制劑抑制線粒體呼吸復合體III某成員蛋白質的TNF抑制活性。為方便起見,本文將此蛋白質稱為“復合體III”蛋白。本發明既適用于與復合體III相締合的蛋白質形式,也適用于與復合體III未締合的蛋白質形式(例如分離的蛋白質形式)。在本發明的一個實施方案中,該復合體III蛋白是核心蛋白1。
本發明的組合物包含藥物有效量的抑制劑,其抑制復合體III蛋白(如核心蛋白1)的TNF抑制活性。實質上,任何能夠抑制復合體III蛋白(如核心蛋白1)的TNF抑制活性的化合物皆可用于本發明的實施。可用于本發明實施的化合物實例包括:抑制編碼復合體III蛋白(如核心蛋白1)的基因表達的反義核酸;編碼抑制編碼復合體III蛋白(如核心蛋白1)的基因表達的反義核酸的核酸;抑制編碼復合體III蛋白(如核心蛋白1)的基因表達的siRNA;編碼此siRNA的核酸;能夠結合復合體III蛋白(如核心蛋白1)并降低其活性的抗體;編碼能夠結合復合體III蛋白(如核心蛋白1)并降低其TNF抑制活性的抗體的核酸;能夠降低復合體III蛋白(如核心蛋白1)表達的核酶;編碼能夠降低復合體III蛋白(如核心蛋白1)表達的核酶的核酸;能夠降低復合體III蛋白(如核心蛋白1)的TNF抑制活性的小分子化合物。
抑制劑以有效抑制復合體III蛋白(如核心蛋白1)的TNF抑制活性的濃度存在于組合物中。考慮到此有效濃度將隨所用的具體抑制劑和組合物其他組分的含量和性質而變化,此有效濃度可由本領域普通技術人員確定。出于指導的目的,據信大多數應用皆涉及使用含量為組合物重量的約0.01%至約15%的抑制劑。在某些實施方案中,抑制劑的量按重量計為組合物的約0.01%至約10%,或約0.1%至約5%。
在以反義核酸作為抑制劑的一些實施方案中,該反義核酸與編碼復合體III蛋白(如核心蛋白1)的脫氧核糖核酸(DNA)的至少一部分雜交,從而抑制蛋白質的表達。反義核酸也可以是一種通過抑制復合體III蛋白(如核心蛋白1)原始轉錄物的剪接過程而降低編碼復合體III蛋白(如核心蛋白1)的基因表達的反義核酸。反義核酸可含有DNA或核糖核酸(RNA),或兼含兩者。任何長度的反義核酸序列均適合于本發明的實施,前提是其能抑制復合體III蛋白(如核心蛋白1)的表達。優選的反義核酸序列的長度為至少20個核苷酸。在優選的實施方案中,反義核酸是寡核苷酸。
反義核酸可以合成方式制備,例如通過以相反的方向表達編碼復合體III蛋白(如核心蛋白1)的核酸的全部或部分的方式制備,如歐洲第140308號專利所述。核心蛋白1的編碼核酸序列見圖5A。第WO 92/15680號國際申請公開文本總體上公開了合成的反義核酸的制備和使用。
反義核酸可以化學方式修飾以改善性能,例如穩定性和/或選擇性。例如,一種此類的修飾涉及用硫基替代磷酸二酯鍵上的游離氧,從而產生硫代磷酸酯鍵。硫代磷酸酯反義核酸為水溶性、聚陰離子的核酸,并對內源性核酸酶具有抗性。此外,含有亞磷酰胺和聚酰胺(肽)鍵的反義核酸也可以合成。這類核酸通常對核酸酶的降解具有很強的抗性。而且,可以將化學基團增添至糖部分的第2個碳原子和嘧啶的第5個碳原子(C-5)上,以增強反義核酸的穩定性并便于反義核酸與其靶位點的結合。修飾可包括2′脫氧、O-戊氧基,O-丙氧基、O-甲氧基、氟基、甲氧基乙氧基硫代磷酸酯、經修飾的堿基,以及本領域技術人員已知的其他修飾方式。
反義核酸以有效抑制編碼復合體III蛋白(如核心蛋白1)的核酸表達的濃度存在于組合物中。
在以編碼反義核酸的核酸作為抑制劑的實施方案中,該核酸是一種編碼上述類型反義核酸的核酸。該核酸以有效濃度存在于組合物中,該有效濃度的核酸表達能有效抑制復合體III蛋白(如核心蛋白1)表達的數量的反義核酸。
在以siRNA(小分子干擾RNA)作為抑制劑的實施方案中,siRNA與編碼復合體III蛋白(如核心蛋白1)的mRNA的一部分雜交,并能整合入識別和抑制mRNA表達的RNA誘導的沉默復合體(RISC)中。siRNA以有效抑制編碼該蛋白質的核酸表達的濃度存在于組合物中。
在本發明另一個實施方案中,編碼上述siRNA的核酸可用作抑制劑。
在以抗體用作抑制劑的實施方案中,該抗體是與核心蛋白1結合并抑制其TNF抑制活性的抗體。例如,抗體可以是單克隆或多克隆的、嵌合的、Fab片段、Fv片段,或Fab或Fv表達文庫的產物。
可以制備抗復合體III蛋白(如核心蛋白1)的抗原片段或全長蛋白質的多克隆抗體。單克隆抗體例如可以使用Mishell,B.B.等人,SelectedMethods in Cellular Immunology(細胞免疫學的某些方法),(W.H.Freeman,編著)San Francisco(1980)中描述的方法制備。本發明的單克隆抗體可以進行“人源化”,以防宿主對該抗體產生免疫反應。“人源化抗體”指其互補決定區(CDR)和/或輕鏈和/或重鏈可變區構架的其他部分來源于非人類免疫球蛋白,而分子的其余部分則來源于一種或多種人類免疫球蛋白的抗體。人源化抗體還包括特征為人源化重鏈與供體或受體未加修飾的輕鏈或嵌合輕鏈相締合的抗體,反之亦然。抗體的人源化可以采取本領域已知的方法來實現[參閱例如G.E.Mark和E.A.Padlan,“Chapter4.Humanization of Monoclonal Antibodies”,The Handbook ofExperimental Pharmacology Vol.113(實驗藥理學手冊,第113卷,第4章,單克隆抗體的人源化)Springer-Verlag,New York,1994]。轉基因動物可用于表達人源化抗體。
抗體可以是單鏈抗體。本領域已知的用于生產單鏈抗體的技術可經改進而用于生產復合體III蛋白(如核心蛋白1)的單鏈抗體。
抗體以有效抑制復合體III蛋白(如核心蛋白1)活性的濃度存在于組合物中。
在以編碼抗體的核酸用作抑制劑的實施方案中,核酸是編碼與復合體III蛋白(如核心蛋白1)結合并抑制其活性的抗體的核酸。該核酸以有效表達能有效抑制蛋白質活性的數量的抗體的濃度存在于組合物中。
在將核酶(核糖核酸酶)用作抑制劑的實施方案中,核酶是含有催化結構域與底物結合結構域的核酶。底物結合結構域是一種與編碼復合體III蛋白(如核心蛋白1)的mRNA的至少一部分雜交的結構域。催化結構域是一種能夠剪切mRNA的結構域。
在本發明一些優選實施方案中,核酶以錘頭模體形式形成。其他形式包括發夾模體、丁型肝炎病毒模體、I型內含子模體或RnaseP RNA(與RNA引導序列相關)模體,或鏈孢霉(Neurospora)VS RNA模體。錘頭模體描述于Rossi等人,Aids Research and Human Retroviruses,8:183(1992)。發夾模體描述于Hampel和Tritz,Biochemistry,28:4929(1989),以及Hampel等人,Nucleic Acids Res.,18:299(1990)。丁型肝炎病毒模體描述于Perrotta和Been,Biochemistry,31:16(1992),RnaseP模體描述于Guerrier-Takada等人,Cell,35:849(1983),鏈孢霉VS RNA核酶模體描述于Collins的文獻[Saville和Collins,Cell,61:685-696(1990);Saville和Collins,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,88:8826-8830(1991);Collins和Olive,Biochemistry,32,2795-2799(1993)];關于I型內含子模體的敘述可參閱Cech等人美國第4,987,071號專利。
制備核酶的一個代表性方法是以化學方式合成一段具有核酶催化結構域(約20個核苷酸)的寡脫氧核糖核苷酸,該催化結構域兩側的序列可雜交到轉錄后的靶核心蛋白1的mRNA分子上。寡脫氧核糖核苷酸通過使用作為引物的底物結合序列進行擴增。將擴增產物克隆到真核表達載體上。本發明的核酶可在真核細胞中自適當的DNA載體表達。如果需要,核酶的活性可通過第二種核酶將其從原始轉錄物釋放而得到加強[Ohkawa等人,Nucleic Acids Symp.Ser.,27:15-6(1992);Taira等人,Nucleic AcidsRes.,19:5125-30(1991);Ventura等人,Nucleic Acids Res.,21,3249-55(1993)]。
核酶以有效抑制編碼復合體III蛋白(如核心蛋白1)的核酸表達的濃度存在于組合物中。
在將編碼核酶的核酸用作抑制劑的實施方案中,該核酸是一種編碼能夠雜交并剪切編碼復合體III蛋白(如核心蛋白1)的mRNA的核酶的核酸。核酸以有效產生能抑制蛋白質表達的量的核酶的濃度存在于組合物中。這可由本技術領域的普通技術人員來決定。
在使用抑制復合體III蛋白(如核心蛋白1)活性的小分子化合物的實施方案中,該化合物是通過抑制線粒體復合體III的功能(例如通過抑制上述蛋白質的活性),使細胞對TRAIL誘導的凋亡致敏的化合物。該小分子化合物以有效濃度存在于組合物中,該有效濃度的小分子抑制復合體III蛋白(如核心蛋白1)的活性,或者提高TRAIL對腫瘤細胞的作用,無論這些細胞中復合體III蛋白的活性如何。
在使用編碼小分子化合物的核酸的實施方案中,該核酸是編碼抑制復合體III蛋白(如核心蛋白1)的TNF抑制活性的小分子化合物的核酸。核酸以有效產生抑制蛋白質活性的量的上述化合物的濃度存在于組合物中。這可以由本技術領域的普通技術人員來決定。
在上述諸實施方案中,涉及使用編碼反義核酸或蛋白質(例如抗體、核酶、或小分子化合物,其用于抑制復合體III蛋白,如核心蛋白1的TNF抑制活性)的核酸;該核酸也可能含有一個或多個調控核酸編碼部分表達的調控區。選擇一個或多個合適的調控區是一項常規事項,而且屬于本領域普通技術水平的范圍。調節區包括啟動子、增強子、抑制因子等等。
可用于本發明的啟動子包括組成型啟動子與調節型(可誘導性)啟動子。可用于本發明實施的啟動子實例包括:普遍存在的啟動子(如HPRT、波形蛋白、肌動蛋白、微管蛋白的啟動子)、中間絲啟動子(如結蛋白、神經絲、角蛋白、GFAP的啟動子)、治療性基因啟動子(如MDR型啟動子、CFTR、VIII因子的啟動子);以及組織特異性啟動子(如平滑肌細胞中的肌動蛋白啟動子,或者在內皮細胞中有活性的Flt與Flk啟動子)。
組織特異性啟動子包括表現組織特異性的轉錄控制區,例如:在胰腺腺泡細胞中有活性的彈性蛋白酶I基因控制區(Swift等人,1984,Cell 38:639-646;Ornitz等人,1986,Cold Spring Harbor Symp.Qu ant.Biol.,50:399-409;MacDonald,1987,Hepatology 7:425-515);在胰腺β細胞中有活性的胰島素基因控制區(Hanahan,1985,Nature 315:115-122);在淋巴細胞中有活性的免疫球蛋白基因控制區(Grosschedl等人,1984,Cell 38:647-658;Adames等人,1985,Nature 318:533-538;Alexander等人,1987,Mol.Cell.Biol.,7:1436-1444),在睪丸、乳房、淋巴細胞與肥大細胞中有活性的小鼠乳癌病毒控制區(Leder等人,1986,Cell 45:485-495),在肝臟中有活性的白蛋白基因控制區(Pinkert等人,1987,Genes and Devel.1:268-276);在肝臟中有活性的甲胎蛋白基因控制區(Krumlauf等人,1985,Mol.Cell.Biol.,5:1639-1648;Hammer等人,1987,Science 235:53-58);在肝臟中有活性的α1抗胰蛋白酶基因控制區(Kelsey等人,1987,Genes and Devel.,1:161-171);在髓樣細胞中有活性的β珠蛋白基因控制區(Mogram等人,1985,Nature 315:338-340;Kollias等人,1986,Cell 46:89-94);在大腦少突膠質細胞中有活性的髓鞘基礎蛋白基因控制區(Readhead等人,1987,Cell 48:703-712);在骨骼肌細胞中有活性的肌球蛋白輕鏈2基因控制區(Sani,1985,Nature314:283-286),以及在下丘腦中有活性的促性腺激素釋放激素基因控制區(Mason等人,1986,Science 234:1372-1378)。
其他可用于本發明實施的啟動子包括,例如優先于分裂細胞中有活性的啟動子、對刺激產生應答的啟動子(如類固醇激素受體、視黃酸受體)、四環素調控的轉錄調節因子的啟動子、巨細胞病毒立即早期的啟動子、反轉錄病毒LTR的啟動子、金屬硫蛋白啟動子、SV-40啟動子、E1a啟動子以及MLP啟動子。關于四環素調控的轉錄調節因子與CMV啟動子的敘述可參閱WO 96/01313號國際專利申請公開文本,以及美國第5,168,062號與第5,385,839號專利。
在本發明的實施方案中,組合物包括載體,其又含有上述核酸。載體是指將核酸轉移進細胞的任何手段。術語“載體”包括將核酸導入細胞的病毒性手段與非病毒性手段。非病毒性載體包括,例如質粒、脂質體、帶電荷的脂質(細胞轉染劑)、DNA-蛋白質復合物以及生物多聚體等。病毒性載體包括,例如反轉錄病毒、腺相關病毒、痘病毒、桿狀病毒、痘苗病毒、單純皰疹病毒、EB病毒以及腺病毒載體。除了核酸之外,載體還可包含一或多個選擇性標記,其用于選擇、測量與監控核酸轉移結果(如轉移至何種組織、表達持續時間等)。
關于病毒性載體的使用,其可能是復制缺陷的,也就是說,其不能在靶細胞中進行自主復制。通常,復制缺陷型病毒載體的基因組缺乏至少一個病毒在感染細胞內復制所必需的核酸區域。這些區域可由本領域技術熟練人員通過任何已知的技術加以(完全或部分)剔除,或使其失去功能。這些技術包括對(用于復制的)必需區域進行完全剔除或替代(替代為其他序列,尤其是插入的核酸)、部分缺失,或添加一個或多個堿基等。借助于基因操作技術或通過誘變劑處理,這些技術操作可以在體外(在分離的DNA上)或在體內實施。優選復制缺陷型病毒保留包被病毒顆粒所必需的基因組序列。
至于使用反轉錄病毒,其是感染分裂細胞的整合性病毒。反轉錄病毒基因組包括兩個LTR,一個衣殼包裝序列,以及三個編碼區(gag、pol和env)。關于重組反轉錄病毒載體構建的敘述可參閱,例如第453242號與第178220號歐洲專利以及Bernstein等人,Genet.Eng.,7:235(1985)與McCormick,BioTechnology,3:689(1985)兩篇文獻。在重組反轉錄病毒載體中,gag、pol與env基因一般都會(全部或部分)缺失,并且由目的異源核酸序列替代。這些載體可以由不同類型的反轉錄病毒構建,例如MoMuLV(“鼠莫洛尼白血病病毒”)、MSV(“鼠莫洛尼肉瘤病毒”)、HaSV(“哈威肉瘤病毒”)、SNV(“腎臟壞死病毒”)、RSV(“勞斯肉瘤病毒”)以及“Friend病毒”。慢病毒載體系統也可以用于實施本發明。該慢病毒基因組是具有9000-10000個堿基對的正鏈多聚腺苷酸RNA,含有三個從5′至3′端方向排列的所有典型反轉錄病毒的結構基因(gag、pol、env)。欲詳細了解慢病毒系統,請參閱Fields Virology,SecondEdition,Volume 2,Chapter 55,“Lentiviruses”(慢病毒),第1571-1589頁,Raven Press,New York,1990。
通常,為了構建包含本發明核酸的重組反轉錄病毒,需構建包含LTR、衣殼包裝序列以及編碼序列的質粒。此構建體用于轉染能夠反向提供質粒所缺乏的反轉錄病毒功能的包裝細胞系。通常,該包裝細胞系因此可以表達gag、pol與env基因。這類包裝細胞系已經在先前技術中介紹,尤其是PA317細胞系(美國第4,861,719號專利)、PsiCRIP細胞系(WO90/02806號國際專利申請公開文本)以及GP+envAm-12細胞系(WO89/07150號國際專利申請公開文本)。另外,重組反轉錄病毒載體可以包含在LTR內抑制轉錄活性的修飾成分,以及包含外延的可能攜帶部分gag基因序列的衣殼包裝序列(Bender等人,J.Virol.61(1987)1639)。重組反轉錄病毒載體可由本領域普通技術人員已知的標準技術予以純化。
至于腺相關病毒(AAV)的使用,其是相對較小的DNA病毒,可以穩定地以位點特異的方式整合到受其感染的細胞基因組內。其能夠感染廣譜的細胞類型,而不會對細胞的生長、形態或分化造成任何影響;其似乎并未涉及人類病理學。AAV基因組已經被克隆、測序以及特征鑒定。其包含大約4700個堿基,并在兩端各含有一個長度大約為145個堿基的末端反向重復(ITR)區,可以作為病毒的復制起點。其余的基因組部分可分成兩個攜帶衣殼包裝功能的必需區域:該基因組的左手邊部分含有與病毒復制以及病毒基因表達有關的rep基因;該基因組的右手邊部分含有編碼病毒衣殼蛋白的cap基因。
已有文獻介紹使用來源于AAV的載體進行體外及體內基因轉移(參閱WO 91/18088與WO 93/09239號國際專利申請公開文本;美國第4,797,368號與第5,139,941號專利;以及歐洲第488528號專利)。這些文獻介紹了rep和/或cap基因缺失并由目的基因替代的多種不同的AAV衍生構建體,以及這些構建體在體外(進入培養的細胞)或體內(直接進入有機體)目的基因轉移方面的應用。本發明中所用的復制缺陷型重組AAV可通過將含有兩側分別帶一個AAV末端反向重復(ITR)區域的目的核酸序列的質粒與攜帶AAV衣殼包裝基因(rep與cap基因)的質粒共轉染進入以人類輔助病毒(例如腺病毒)感染的細胞系而制備。然后,所得的AAV重組子再以標準技術予以純化。
在優選實施方案中,本發明所用的載體是腺病毒載體。腺病毒屬于真核DNA病毒,可以加以修飾以便有效地將核酸輸送進多種類型的細胞中。
腺病毒存在各種各樣的血清型。用于實施本發明的優選血清型為2型或5型人源腺病毒(Ad2或Ad5)或動物源腺病毒(參閱WO 94/26914號國際專利申請公開文本)。動物源腺病毒包括,例如犬源腺病毒、牛源腺病毒、鼠源腺病毒(如Mav1,Beard等人,Virology 75:81(1990))、羊源腺病毒、豬源腺病毒、鳥源腺病毒以及猿源腺病毒(如SAV)。動物源腺病毒優選犬源腺病毒,更優選CAV2腺病毒(例如Manhattan或A26/61病毒株(ATCC VR-800))。
優選復制缺陷型腺病毒載體包含ITR、衣殼包裝序列,以及目的核酸。更優選腺病毒載體至少在E1區沒有功能活性。E1區的缺失優選位于Ad5腺病毒核酸序列的第455并延伸至第3329位核苷酸。其他區域也可以修飾,尤其是:E3區(參閱WO 95/02697號國際專利申請公開文本);E2區(參閱WO 94/28938號國際專利申請公開文本);E4區(參閱WO 94/28152、WO 94/12649以及WO 95/02697號國際專利申請公開文本),或晚期基因L1-L5中的任何區域。WO 95/02697號國際專利申請公開文本披露了缺陷型反轉錄病毒載體。
在優選的實施方案中,腺病毒載體在E1區和E4區有缺失。在另一項優選實施方案中,腺病毒載體在E1區有缺失,在該缺失區域插入了E4區以及目的核酸的編碼序列(參閱第9413355號法國專利公開文本)。
任何適宜的技術都可以用于制備復制缺陷型重組腺病毒。典型的技術可參閱Levrero等人,Gene 101:195(1991);歐洲第185573號專利;以及Graham,EMBO J.,3:2917(1984)。尤其是,腺病毒可以通過腺病毒與除了其它之外還攜帶目的核酸的質粒之間的同源重組而制備。同源重組可以在將所述腺病毒與質粒共轉染入適當的細胞系后而實現。所用的細胞系優選是(i)可以由所述元件轉化,以及(ii)含有能夠與該復制缺陷型腺病毒基因組的部分(優選完整形式的)核酸序列互補的序列,以免出現重組的危險。可以使用的細胞系的實例包括人胚腎細胞系293(參閱Graham等人,J.Gen.Virol.,36:59(1977)),其基因組中整合有Ad5腺病毒基因組的左手邊部分(12%),以及能夠與E1和E4功能區互補的細胞系(參閱WO 94/26914號與WO 95/02697號國際專利申請公開文本)。重組腺病毒的回收及純化可采用本領域普通術人員熟知的標準分子生物學技術進行。
某些非病毒體系也應用于本技術領域,它們亦有助于將核酸導入細胞。
例如,可用脂質體借助于脂質轉染法將核酸導入細胞。使用陽離子脂質可以促進帶負電荷的核酸的包被,并可促進與帶負電荷的細胞膜的融合(參閱Felgner和Ringold,Nature 337:387-388(1989))。關于特別有利于核酸轉移的脂質化合物及組合物的敘述參閱WO 95/18863與WO96/17823號國際專利申請公開文本以及美國第5,459,127號專利。使用脂質轉染法體內將外源基因導入特定器官具有其一定的實用優勢。脂質體針對特定細胞的分子靶向轉染代表了一個有利的方面。顯然,在具有細胞異質性的組織(例如胰腺、肝臟、腎臟以及大腦)中,將特定細胞類型的定向轉染將具有特別的優越性。為了實現靶向轉染的目的,可將脂質以化學方法偶聯到其他分子上。靶向肽(如激素或神經遞質)和蛋白質(如抗體)或非肽性分子,都可以化學方法偶聯到脂質體上。
其他分子也可用于促進體內轉染核酸,例如陽離子寡肽分子(參閱例如WO 95/21931號國際專利申請公開文本)、從DNA結合蛋白質衍生的肽(參閱例如WO 96/25508號國際專利申請公開文本),以及陽離子多聚體(參閱例如WO 95/21931號國際專利申請公開文本)。
也可以將核酸以裸露核酸載體的方式導入細胞(參閱美國第5,693,622號、第5,589,466號以及第5,580,859號專利)。供基因治療用的裸露核酸載體可通過本領域已知的方法導入預定的宿主細胞,例如轉染、電穿孔、顯微注射、轉導、細胞融合、DEAE葡聚糖、磷酸鈣沉淀、使用基因槍、或者使用DNA載體運載工具等(參閱例如Wilson等人,J.Biol.Chem.267:963-967(1992);Wu和Wu,J.Biol.Chem.263:14621-14624(1988);Hartmut等人,Canadian Patent No.2,012,311;Williams等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:2726-2730(1991))。亦可使用受體介導的DNA轉移方法(Curiel等人,Hum.Gene Ther.3:147-154(1992);Wu和Wu,J.Biol.Chem.262:4429-4432(1987))。
本發明體提供了組合物,其含有本發明的抑制劑以及載體。載體是使得存在于其中的抑制劑處于活性形式,例如處于能夠發揮生物活性形式的物質。例如,核酸可以復制、翻譯信息,或者可以與互補核酸雜交;載體可以轉染靶細胞;抗體可以結合核心蛋白1。通常,這種載體是含水緩沖液,如含有鹽離子的Tris緩沖液、磷酸鹽緩沖液、或HEPES緩沖液等。通常,鹽離子濃度會與生理水平相似。出于指導的目的,據信大多數應用皆涉及使用占組合物重量約40%至約98%的載體。在某些實施方案中,載體占組合物重量的約50%至約98%。
該組合物還可含有穩定劑、防腐劑以及其他賦形劑。
本發明組合物可以配制成以口服或胃腸外給藥(如以局部、經鼻、皮下以及眼內途徑給藥)的劑量形式。胃腸外給藥包括靜脈內注射、肌內注射、動脈內注射或灌注給藥技術。組合物可以劑量單位的形式以胃腸外方式給藥,該劑量單位根據需要含有標準的、眾所周知且在生理上可接受的無毒性載體、佐劑以及媒介物。
優選的無菌可注射性制劑可以是在一種無毒、胃腸外方式給藥可接受的載體中的抑制劑的溶液或懸浮液。藥學上可接受的載體的實例為生理鹽水、緩沖型生理鹽水、等滲型生理鹽水(如磷酸二氫鈉或磷酸氫二鈉、氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣或氯化鎂,或這類鹽的混合物),Ringer氏溶液、葡萄糖、水、無菌水、甘油、乙醇以及其組合等。1,3-丁二醇以及無菌固定油(fixed oils)可以很方便地作為溶劑或懸浮介質使用。任何溫和的固定油都可以使用,包括合成的單酰甘油或二酰甘油。脂肪酸(例如油酸)也可用于可注射制劑。
載體也可以是水凝膠,其由任何生物相容性或非細胞毒性(同相或異相)聚合物制成,例如作為海綿體其中吸附抑制劑而起作用的親水性聚丙烯酸聚合物。關于這些聚合物的敘述,可參閱WO 93/08845號國際專利申請公開文本。水凝膠可以直接沉積到所治療組織的表面。
本發明另一個優選實施方案包括含有作載體用的泊洛莎姆的藥物組合物。該泊洛莎姆經過浸漬載有攜帶了本發明核酸序列的復制缺陷型重組病毒。優選的泊洛莎姆為市售的Poloxamer 407(BASF,Parsippany,NJ),其是無毒的生物相容性多元醇。泊洛莎姆實質上具有與水凝膠同樣的優點,但粘度較低。
本發明提供了一種治療方法,包括向人或其他動物施用有效劑量的本發明組合物。取決于年齡、所治療疾病的類型和嚴重程度、體重、所需的治療時間、施用方法以及其他參數的差異,組合物的有效劑量可能會有所不同。有效的施用劑量由醫師或其他有資格醫學專業人員確定。
本發明還提供了檢測化合物的方法,以確定它們是否能夠作為復合體III蛋白(如核心蛋白1)的TNF抑制活性的抑制劑而起作用。在檢測方法中,比較對于表達復合體III蛋白(如核心蛋白1)、已知對TNF誘導的凋亡有天然抗性,以及與TNF超家族(以下簡稱為“TNF”)成員和該化合物兩者都已接觸的細胞的生存力,與來源于同一細胞系并同樣表達復合體III蛋白、且接觸了該化合物但未接觸TNF的對照細胞的生存力。細胞的生存力可采用Cell Titer Blue檢測法測定。該方法通過細胞將刃天青染料還原成強熒光性形式的試鹵靈(可使用分光光度計檢測)的能力檢測細胞的代謝能力(從而確定細胞的生存力)。
如果化合物顯著地降低了兩種細胞(與TNF接觸過的細胞以及對照細胞)的生存力,那么可以認為該化合物的活性與TNF無關,且該化合物并非是值得關注的化合物。如果化合物顯著地降低了與TNF接觸過的細胞的生存力,但沒有影響對照細胞的生存力,那么可以認為該化合物使細胞對TNF的凋亡活性變得敏感,因為已知該細胞系以前對TNF有抗性。由于細胞表達復合體III蛋白,故可以推論,受試化合物通過抑制復合體III蛋白的TNF抑制活性而起作用。
當接觸過TRAIL和該受試化合物的細胞的生存力比對照細胞的生存力至少低大約30%時,可以認為該化合物顯著地降低了細胞的生存力。
在本發明的實施方案中,將表達復合體III蛋白(如核心蛋白1)并且來源于已知對TNF誘導的凋亡具有天然抗性的細胞系的細胞在TNF存在的條件下培養(例如培養24小時),然后再與受試化合物接觸。將來源于同一細胞系的對照細胞在沒有TNF存在的條件下培養相同的時間,并與同樣的化合物接觸。然后檢測和比較細胞的生存力。
實質上,任何已知對TRAIL誘導的凋亡具有天然抗性、表達目的復合體III蛋白或已經修飾(例如通過轉染表達該蛋白的轉基因)為表達該蛋白質的細胞系,皆可用于實施此項檢測。這種細胞系的一個實例是HCT116結腸癌細胞系,其經過工程改造以穩定地表達核心蛋白1。核心蛋白1轉基因可通過例如用本領域中使用的標準慢病毒、反轉錄病毒或腺病毒表達載體感染HCT116細胞系的方式導入細胞。本發明還包含不必表達整個蛋白質的細胞,只要其表達能夠抑制TNF的凋亡誘導活性的那部分蛋白質即可。因此,細胞可以只包含或經改造只包含編碼復合體III蛋白這一部分的核酸。
細胞可以于37℃與納摩爾至微摩爾濃度的受試化合物接觸24至96小時,且細胞的生存力可用市售的試劑(例如WST-1、MTT以及胱天蛋白酶-3試劑)檢測。化合物對細胞周期進程的影響可以通過FACS分析或通過本領域內使用的其他標準基于影像技術的分析法進行檢測。上述所有基于該化合物的實驗也可在低氧(1-2%氧含量)條件下實施,以確定在TRAIL存在條件下低氧條件是否增加或誘導細胞死亡。
通過將溶于適當載體溶液(如磷酸鹽緩沖溶液)的TRAIL以約50至約200ng/ml的濃度直接添加到裝有細胞的容器內,并在此條件下培養細胞至多約96小時而使細胞與TRAIL接觸。
實施例
實施例1
此實例敘述了一項發現,即核心蛋白1涉及對TRAIL介導的凋亡的抵抗。
小鼠E14cDNA文庫g HCT116結腸癌細胞系是已知對TRAIL誘導的凋亡敏感的細胞系,對其進行了功能遺傳篩選(圖1A)。此篩選發現編碼核心蛋白1的UQCRC1涉及對TRAIL介導的凋亡的抵抗。
將HCT116細胞(來自位于美國弗吉尼亞州馬納薩斯的美國典型培養物保藏中心)和293EBNA包裝細胞系(Invitrogen)分別在DMEM培養基(Dulbecco’s modified Eagle’s Medium)中于37℃和5%CO2的條件中培養。該DMEM培養基含有10%熱滅活的胎牛血清(FBS)和1%的青霉素-鏈霉素(Gibco)。
將第14天的小鼠胚胎反轉錄病毒cDNA文庫(馬薩諸塞州劍橋麻省理工學院George Daley贈)克隆進pEYK反轉錄病毒載體,并使用Lipofectamine脂質體(Invitrogen)將其轉染入上述293EBNA包裝細胞系。于轉染后48至72小時收集上清液。將該上清液與10mg/mL Polybene混合并用于感染上述HCT116細胞,該細胞在感染前已培養了48小時。感染后48小時,將1.0X 106細胞置于15cm培養皿中,并用200ng/mL重組人TRAIL(BioMol,Plymouth Meeting,賓夕法尼亞州)處理10天。每隔48小時更換新鮮培養基和TRAIL。分別收獲抵抗TRAIL誘導的凋亡的克隆產物。
將細胞重新懸浮在消化緩沖液(100nM NaCl,10mM Tris pH8,25mM EDTA,0.5%SDS)中,再以蛋白酶K于最終濃度100μg/ml于50℃處理12小時,從而將基因組DNA從該抵抗性克隆產物中分離出。以苯酚-氯仿萃取樣品并以乙醇沉淀。然后使用文庫特異性引物擴增候選cDNA,或直接利用回收的反轉錄病毒質粒重復進行另一次篩選。發現可能對TRAIL誘導的凋亡產生抵抗的一個令人感興趣的候選cDNA,是泛醌醇細胞色素c還原酶核心亞單位1(UQCRC1)的cDNA,其編碼核心蛋白1(圖1B)。
實施例2
為了進一步鑒定核心蛋白1抵御TRAIL誘導的凋亡的能力,將含有篩選所分離的UQCRC1的部分cDNA的pEYK載體直接用于感染HCT116細胞。表達顯性陰性的FADD(dnFADD)的細胞用作為對照物,該dnFADD抑制TRAIL受體發信號。以0、10或50ng/mL TRAIL處理細胞48小時,并檢測作為凋亡早期標記的膜聯蛋白V(圖2A)。dnFADD的表達抑制了TRAIL誘導的凋亡,當TRAIL濃度為50ng/ml時,78%的細胞為膜聯蛋白V陰性或呈非凋亡性。在表達綠色熒光蛋白(GFP)的細胞中,當TRAIL濃度為50ng/ml時,只有2%的細胞為膜聯蛋白V陰性,相比之下,在表達核心蛋白1的細胞中則14.5%的細胞為膜聯蛋白V陰性,對TRAIL誘導的凋亡的保護增加了7倍。這說明部分核心蛋白1的表達提供了一定程度的保護作用,但并未完全抑制TRAIL誘導的凋亡。
實施例3
由于核心蛋白1是線粒體呼吸復合體III的一個亞單位,故還進行了一些工作以確定核心蛋白1的表達是否抗線粒體的去極化,其為線粒體介導的凋亡中的關鍵步驟。使用JC-1分析試劑盒(Molecular Probes)研究了TRAIL處理過程中線粒體膜電位的變化。JC-1(5,5’,6,6’-四氯-1,1’,3,3’-四乙基苯并咪唑基羰花青)是一種陽離子染料,其在細胞質內產生漫射綠色熒光。JC-1在線粒體內的積累(取決于完整和極化的線粒體)導致了紅色熒光聚集體的形成。對上述實施例2中描述的細胞,以熒光激活細胞分選法(FACS)測量了綠色熒光與紅色熒光的比率。FACS是以細胞表面特殊標記(例如紅色或綠色熒光)為基礎分選細胞的方法。將上述比率作為極化線粒體的百分比作圖。
在所有各種TRAIL濃度處理之下,dnFADD的表達都完全抵御線粒體的去極化,而當TRAIL的濃度為50ng/ml時,表達GFP的細胞僅有7%的細胞保留了極化的線粒體。部分核心蛋白1的表達顯示出38%的細胞保留極化的線粒體,對線粒體去極化的保護作用5倍于GFP(圖2B)。因此,核心蛋白1也能抗線粒體去極化。
實施例4
為了確證從部分核心蛋白1觀察到的保護作用表明了其功能,將人的全長核心蛋白1克隆進pLenti載體(含有HA標記)并用于感染HCT116,以產生表達核心蛋白1的穩定細胞系。以類似方式制備了表達黃色熒光蛋白(YFP)的對照細胞系。為了確證全長核心蛋白1的蛋白質表達,將細胞勻質化以制備線粒體和細胞質裂解液,并用核心蛋白1的抗體做Western印跡試驗(圖2C)。在表達YFP和核心蛋白1的細胞的線粒體成分上都檢測到了內源性核心蛋白1。外源性表達的核心蛋白1帶HA標記,并在線粒體成分和細胞質成分中都作為一種較高的遷移帶而檢出。這種表述模式并非是細胞質成分由線粒體蛋白質污染的結果,因為COX1(復合體IV亞單位I)僅在線粒體成分內檢出,而作為細胞質標記的SOD1(超氧化物歧化酶1),不能在線粒體成分內檢測出細胞質的蛋白質。因此,核心蛋白1在這些HCT116穩定細胞系中表達。為了確定全長核心蛋白1是否也能抵抗TRAIL誘導的凋亡,用TRAIL處理細胞并以FACS分析法分析膜聯蛋白V為陽性或陰性的細胞而檢測凋亡情況。當TRAIL濃度為50ng/ml時表達核心蛋白1的細胞顯示了2.5倍的抵抗TRAIL誘導的凋亡的能力(圖2D)。這些資料顯示,核心蛋白1在HCT116內的表達抵抗了TRAIL誘導的凋亡及線粒體去極化。
實施例5
這一實施例顯示了核心蛋白1對胱天蛋白酶8、胱天蛋白酶9及胱天蛋白酶3的活性的抑制作用。
將穩定表達YFP或人類全長核心蛋白1的細胞用200ng/ml TRAIL處理24小時、裂解,并用數種胱天蛋白酶的抗體做Western印跡試驗。通過將全長胱天蛋白酶原裂解為較小的活性形式,檢測出胱天蛋白酶的激活。當受到TRAIL刺激時,與表達YFP的細胞相比,表達人類全長核心蛋白1的HCT116顯示出活性較弱的胱天蛋白酶8(圖3A)。而且,核心蛋白1的表達類似地導致了胱天蛋白酶9和胱天蛋白酶3的活性降低。因此,當受到TRAIL刺激時,核心蛋白1的表達抑制了胱天蛋白酶8、胱天蛋白酶9及胱天蛋白酶3的完整活性。
實施例6
這一實施例顯示了核心蛋白1對細胞色素c從線粒體釋放的影響。
將穩定表達YFP或人類全長核心蛋白1的HCT116細胞用100ng/mlTRAIL處理24小時。穩定表達YFP或人類全長核心蛋白1的對照細胞則未用TRAIL處理。然后收獲細胞。先將含有懸浮細胞的培養液移至新的試管。使用細胞刮將其余的貼壁細胞刮入冰冷的PBS內并加入上述含有懸浮細胞的培養液中。將細胞于4℃和1000Xg離心10分鐘使其沉淀,并重新懸浮于等滲緩沖液內(0.3M蔗糖、10mM Tris pH7.5、1mM EDTA及不含EDTA的蛋白酶片)。在冰上培育5分鐘之后,使用杜恩斯勻漿器裂解細胞直至約90%的細胞膜裂解。這一步驟是為了分離出細胞質成分。通過將10μl裂解液與錐蟲藍混合并在血細胞計數器上觀察的方式監視細胞裂解的程度。將上清液轉移至干凈試管并于4℃和8000Xg離心10分鐘,以使線粒體沉淀。使用BioRad DC蛋白質分析法(BioRad)或BCA法(Pierce,Rockford,Illinois)測定了裂解液的濃度。為了定量檢測細胞色素c的含量,使用功能性ELISA細胞色素c試劑盒(Active Motif,Carlsbad,加利福尼亞州),以檢測裂解液中的細胞色素c(圖3B)。在未經處理的細胞中,在細胞質中檢測出低的細胞色素c基線含量。當用TRAIL處理時,在表達YFP的細胞中釋放至細胞質成分的細胞色素c量增加了10倍,而表達核心蛋白1的細胞僅釋放了一半的細胞色素c(圖3B)。這項工作表明當用TRAIL處理時,核心蛋白1的表達也降低了從線粒體釋放至細胞質的細胞色素c的量。
實施例7
為了確定核心蛋白1是抵抗TRAIL誘導的凋亡還是抵抗通過其他途徑誘導的凋亡,用數種不同的凋亡誘導劑處理細胞并檢測了細胞的生存力。Fas配體(FasL)也是通過死亡受體發出信號的TNFα家族成員,其利用同樣的銜接蛋白FADD來誘導胱天蛋白酶的激活和凋亡。將穩定表達黃色熒光蛋白(YFP)或人類全長核心蛋白1的細胞用100ng/ml TRAIL或16ng/mlFasL處理24小時。用Cell-Titer Blue檢測法檢測細胞生存力,利用指示劑染料刃天青的轉化來測量作為細胞生存力指示的細胞代謝能力。核心蛋白1的表達對類似于TRAIL的FasL所誘導的凋亡產生了大約3倍的抵抗作用(圖3C)。這一結果表明核心蛋白1能夠抵抗由死亡受體發信號誘導的凋亡。
然后,用兩種通過非死亡受體途徑誘導凋亡的化合物處理細胞。喜樹堿抑制DNA拓撲異構酶I,最終導致DNA損傷和死亡,而多西他賽則是微管解聚的抑制劑,其阻止細胞分裂并導致有絲分裂死亡。當用200nM喜樹堿的二甲基亞砜溶液或10nM多西他賽的二甲基亞砜溶液處理時,在表達YFP或人類全長核心蛋白1的細胞之間未見到生存力方面的區別(圖3D)。這些結果表明核心蛋白1不能抵御由DNA損傷或微管解聚的抑制而引起的其他非死亡受體介導的凋亡。這些資料有力地表明核心蛋白1在TRAIL誘導的凋亡的調控過程中發揮作用,并與核心蛋白1對TRAIL誘導的凋亡產生了部分抵御作用的觀察結果相一致。
實施例8
此實施例說明使用siRNA來抑制核心蛋白1的表達。
將含有內源性核心蛋白1(且不含外源性核心蛋白1)的HCT116細胞在轉染前按照每孔1×105個細胞的方式分配于6孔培養皿中,在不含青霉素/鏈霉素的培養基中培養24小時。按照制造商的說明用Lipofectamine2000脂質體(Invitrogen)轉染細胞。將細胞分別與單獨含有Lipofectamine(對照細胞)、含有3.75nM針對UQCRC1的siRNA(SMARTpool),或非靶向siRNA(無效)(Dharmacon,Lafayette,CO)的轉染混合物培養72小時。通過制備裂解液和使用核心蛋白1抗體進行Western印跡試驗來測定蛋白質的濃度(圖4A)。將印跡再次洗脫并使用微管蛋白的抗體再次探測以作為加載量的參照。核心蛋白1的轉染導致核心蛋白1下降90%,而單獨用Lipofectamine轉染或用無效siRNA轉染卻未影響核心蛋白1的水平(圖4B)。
然后,將以上每組細胞用各種濃度的TRAIL再處理24小時,并用Cell Titer Blue檢測法(Promega,Madison,威斯康辛州)檢測細胞的生存力。此檢測法根據其將染料刃天青還原為熒光性強的試鹵靈的能力,測量細胞的代謝能力(從而測量其生存力)。所加入Cell Titer Blue試劑(一種含有高純度刃天青的緩沖溶液)的量是培養基體積的20%。將細胞于37℃溫育2至3小時,并使用底部讀數的熒光讀板器于560nm激發波長和590nm發射波長檢測。將細胞一式三份進行實驗。然后用2倍冷PBS(Gibco)洗滌該細胞,并在100μl冰冷的裂解緩沖液(50nM HEPES pH7.4,250nM NaCl,2nM EDTA,1%Triton X-100,不含EDTA的蛋白酶抑制劑(Roche))中裂解。將裂解液于4℃以3500轉/分鐘離心10分鐘。將上清液與4倍LDS樣本緩沖液(Invitrogen)混合并于90℃加熱10分鐘,然后于-20℃儲存。檢測結果如圖4C所示。所顯示的結果是4次單獨實驗的平均值。核心蛋白1敲除的細胞于25ng/mL TRAIL濃度下僅顯示出60%的生存力,而在同樣濃度下的對照或無效轉染的細胞的生存力則為90至95%(圖4C)。核心蛋白1敲除的細胞于50ng/ml時顯示出低于50%的生存力,而在無效轉染的細胞中則需要兩倍量的TRAIL才能誘導50%的生存力。雖然單獨用無效siRNA的轉染似乎比單獨用Lipofectamine轉染產生對TRAIL的敏感性的影響,但這一資料明確地顯示,核心蛋白1的降低使細胞對TRAIL誘導的凋亡敏感化,尤其是在較低的濃度時。這些資料有力地證明,核心蛋白1在調節TRAIL誘導的凋亡過程中發揮作用。
實施例9
此實施例敘述了確定化合物是否抑制核心蛋白1活性的檢測方法。
待分析的化合物以在適宜載體(如二甲基亞砜、乙醇、緩沖鹽水)中的10μM濃度加入預先用核心蛋白1DNA感染的HCT116細胞(來自位于美國弗吉尼亞州馬納薩斯的美國典型培養物保藏中心)中。然后將該細胞置于含10%FBS的DMEM培養基中,在適宜濃度(最高為200ng/ml)的TRAIL存在條件下培養24小時。也以10μM濃度將該化合物加入到預先用核心蛋白1DNA感染的HCT116細胞中。再將該細胞置于含10%FBS的DMEM培養基中,在無TRAIL存在條件下培養(對照細胞),并保持24小時。
然后在PBS中洗滌該細胞,并以WST-1分析法測定這些細胞的生存力。WST-1分析法通過測量化學底物WST還原為可溶性甲鹽的程度來測量細胞生存力;該甲鹽則以分光光度計檢測。Cell-Titer Blue檢測法可作為WST-1分析法的一種替代方法。
如果該化合物既能顯著地降低在TRAIL存在條件下培養的細胞的生存力,也能降低在無TRAIL存在條件下培養的對照細胞的生存力,則認為該化合物的活性與TRAIL無關,而且將不認為該化合物是所感興趣的化合物。如果該化合物能顯著地降低在TRAIL存在條件下培養的細胞的生存力,但不能降低上述對照細胞的生存力,那么認為其能使該細胞對TRAIL的凋亡活性敏化,因為先前已知表達核心蛋白1的HCT116細胞系抗TRAIL。由于先前還已知細胞對TRAIL誘導的凋亡的抗性是由核心蛋白1引起的,因此可以推論,受試化合物通過抑制核心蛋白1的TRAIL抑制活性而起作用。

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