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細胞移植.pdf

摘要
申請專利號:

CN200980150617.9

申請日:

2009.10.21

公開號:

CN102245765B

公開日:

2015.01.07

當前法律狀態:

授權

有效性:

有權

法律詳情: 授權|||實質審查的生效IPC(主分類):C12N 11/08申請日:20091021|||公開
IPC分類號: C12N11/08; C12N5/077; A61L31/16 主分類號: C12N11/08
申請人: 通用醫院公司
發明人: 威廉·G·小奧斯汀
地址: 美國馬薩諸塞州
優先權: 2008.10.21 US 61/107,023
專利代理機構: 北京律盟知識產權代理有限責任公司 11287 代理人: 劉國偉
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法律狀態
申請(專利)號:

CN200980150617.9

授權公告號:

102245765B||||||

法律狀態公告日:

2015.01.07|||2012.02.08|||2011.11.16

法律狀態類型:

授權|||實質審查的生效|||公開

摘要

本發明提供用于防止脂肪移植物中細胞膜損傷的聚合物。業內認為,將諸如泊洛沙姆(poloxymer)P?188等三嵌段共聚物與欲移植到個體體內的脂肪細胞或脂肪組織混合可使所述細胞的膜穩定,由此在軟組織重建或填充中進行較為成功的脂肪移植。所述方法還可用于成體干細胞或來源于脂肪組織的其它細胞的移植。也可將諸如硫辛酸等其它試劑添加到所述聚合物/細胞組合物中以進行細胞移植。

權利要求書

1.一種用于移植脂肪源性細胞的方法,所述方法包含:
對個體投予脂肪源性細胞與三嵌段共聚物的組合物,
其中所述共聚物包含側接兩個親水性尾的中央疏水性核心,且所述共聚物保護所
述細胞免受損傷并防止細胞死亡。
2.根據權利要求1所述的方法,其中所述聚合物密封所述細胞的膜。
3.根據權利要求1所述的方法,其中所述聚合物使所述細胞的膜穩定。
4.根據權利要求1所述的方法,其中所述脂肪源性細胞是脂肪細胞。
5.根據權利要求1所述的方法,其中所述脂肪源性細胞是干細胞。
6.根據權利要求1所述的方法,其中所述脂肪源性細胞是自體細胞。
7.根據權利要求1所述的方法,其中所述聚合物是聚醚。
8.根據權利要求1所述的方法,其中所述聚合物是聚烷基醚。
9.根據權利要求1所述的方法,其中所述聚合物是聚烷基醚與另一聚烷基醚的共聚
物。
10.根據權利要求1所述的方法,其中所述聚合物是聚乙二醇與另一聚合物的共聚物。
11.根據權利要求10所述的方法,其中所述另一聚合物的疏水性比聚乙二醇強。
12.根據權利要求1所述的方法,其中所述聚合物是聚丙二醇與另一聚合物的共聚物。
13.根據權利要求12所述的方法,其中所述另一聚合物的親水性比聚丙二醇強。
14.根據權利要求1所述的方法,其中所述聚合物為以下形式的三嵌段共聚物:聚乙二
醇-聚丙二醇-聚乙二醇。
15.根據權利要求1所述的方法,其中所述聚合物是泊洛沙姆(POLOXAMER)P188。
16.根據權利要求1所述的方法,其中所述聚合物是泊洛沙姆P108。
17.根據權利要求1所述的方法,其中所述聚合物是泊洛沙姆1107。
18.根據權利要求1所述的方法,其中所述聚合物的分子量范圍為約1,000g/mol到約
10,000g/mol。
19.根據權利要求1所述的方法,其中所述聚合物的分子量范圍為約2,000g/mol到約
10,000g/mol。
20.根據權利要求1所述的方法,其中所述聚合物的分子量范圍為約3,000g/mol到約
10,000g/mol。
21.根據權利要求1所述的方法,其中所述聚合物的分子量范圍為約5,000g/mol到約
10,000g/mol。
22.根據權利要求1所述的方法,其中所述聚合物是非離子性的。
23.根據權利要求1所述的方法,其中所述細胞與聚合物的組合物進一步包含硫辛酸。
24.根據權利要求1所述的方法,其中所述組合物包含每毫升細胞約1mg到約20mg
聚合物。
25.根據權利要求1所述的方法,其中所述組合物包含每毫升細胞約5mg到約15mg
聚合物。
26.根據權利要求1所述的方法,其中所述組合物包含每毫升細胞約15mg聚合物。
27.根據權利要求1所述的方法,其中所述組合物包含每毫升細胞約10mg聚合物。
28.根據權利要求1所述的方法,其中所述聚合物為至少95%純。
29.根據權利要求1所述的方法,其中所述聚合物為至少98%純。
30.根據權利要求1所述的方法,其中所述聚合物為至少99%純。
31.根據權利要求1所述的方法,其中所述個體為哺乳動物。
32.根據權利要求1所述的方法,其中所述個體為人類。
33.一種用于移植脂肪細胞的方法,所述方法包含:
對個體投予脂肪細胞與泊洛沙姆P188的組合物。
34.一種防止脂肪移植物再吸收的方法,其包含對個體投予脂肪源性細胞與三嵌段共聚
物的組合物,其中所述共聚物包含側接兩個親水性尾的中央疏水性核心。
35.一種密封脂肪源性細胞的細胞膜的方法,其包含使脂肪源性細胞與足以密封所述細
胞膜的量的三嵌段共聚物接觸,其中所述共聚物包含側接兩個親水性尾的中央疏水
性核心。
36.根據權利要求34或35所述的方法,其中所述細胞是脂肪細胞。
37.根據權利要求34或35所述的方法,其中所述細胞是干細胞。
38.根據權利要求34或35所述的方法,其中所述聚合物是泊洛沙姆P188。
39.一種用于移植脂肪組織的方法,所述方法包含:
對個體投予脂肪組織與三嵌段共聚物的組合物,
其中所述共聚物包含側接兩個親水性尾的中央疏水性核心,且所述共聚物保護所
述脂肪組織的細胞免受損傷并防止細胞死亡。
40.根據權利要求39所述的方法,其中所述聚合物是泊洛沙姆P188。
41.一種組合物,其包含脂肪源性細胞與泊洛沙姆P188。
42.根據權利要求41所述的組合物,其中所述脂肪源性細胞是脂肪細胞。
43.根據權利要求41所述的組合物,其中所述脂肪源性細胞是干細胞。
44.根據權利要求41所述的組合物,其中所述脂肪源性細胞是脂肪細胞與干細胞的組
合。
45.一種組合物,其包含泊洛沙姆P188和脂肪細胞。
46.根據權利要求45所述的組合物,其中脂肪細胞在所述組合物的細胞中占至少80%。
47.根據權利要求45所述的組合物,其中脂肪細胞在所述組合物的細胞中占至少90%。
48.根據權利要求45所述的組合物,其中脂肪細胞在所述組合物的細胞中占至少95%。
49.一種組合物,其包含泊洛沙姆P188和脂肪組織。
50.一種鑒別適用于脂肪移植的聚合物的方法,所述方法包含以下步驟:
使脂肪細胞與足夠濃度的測試聚合物接觸以使所述細胞穩定;和
分析細胞死亡或毒性。
51.一種鑒別適用于脂肪移植的聚合物的方法,所述方法包含以下步驟:
使脂肪細胞與足夠濃度的測試聚合物接觸以使所述細胞穩定;
將所述細胞/聚合物組合物移植到測試動物中;和
評估所述移植的成功率。
52.根據權利要求51所述的方法,其中所述測試動物為嚙齒動物。
53.根據權利要求51所述的方法,其中所述測試動物為裸小鼠。
54.根據權利要求51所述的方法,其中所述評估步驟包含評估所述移植細胞的重量、
體積、細胞死亡程度、線粒體水平、細胞凋亡標記物、DNA含量或者瘦素或PPARγ2
水平。

說明書

細胞移植

相關申請案

本申請案依據35?U.S.C.§119(e)主張2008年10月21日申請的美國臨時專利申請案
USSN?61/107,023的優先權,所述專利以引用的方式并入本文中。

背景技術

外傷、先天性缺陷、感染和腫瘤切除繼發的軟組織損傷和畸形是造成患者發病的重
要原因。目前,自體游離皮瓣(free?flap)重建或局部推進皮瓣是重大軟組織和骨缺損
重建模態的主要工具(workhorse)。盡管帶蒂皮瓣(pedicled?flap)和游離皮瓣重建提供
了進行重建的有力工具,但其有可能引起嚴重副作用和供體部位發病。

曾經在軟組織重建中使用自體脂肪移植,但這項技術是不可預測的。使用抽脂的脂
肪具有兩個優點:1)極低的供體部位發病,由此提供一個安全且易于獲得的自體細胞
來源;和2)這些程序相對易于進行,同時不會出現缺血性并發癥以及與血管化游離皮
瓣有關的早期移植失敗的問題。然而,到目前為止,游離脂肪移植受到不可預測的再吸
收水平和由此引起的不規則性問題的困擾。游離脂肪移植失敗和體積減小似乎與采集時
產生的機械應力導致膜損傷、早期缺血性改變以及營養缺失和移植物供血不足有關。這
些應激子導致細胞凋亡和細胞死亡。接下來,在再血管化后去除死亡的細胞碎片將引起
移植物再吸收。這一過程導致不協調且不合需要的軟組織修復結果。由于脂肪移植最初
是由紐博(Neuber)在1893年描述的,致使很少改善游離脂肪移植結果。迄今為止,
有關在建立充足的血管分布之前減少初始缺血損傷的細胞的嘗試已經取得了適度的成
果。因此,只改善脂肪移植物的供血不足以顯著改善脂肪移植的結果。在脂肪移植物取
得、處理和/或移植期間,防止細胞損傷也很重要。

仍需要能在美容手術和重建手術中較為成功地移植脂肪組織或來源于脂肪組織的
細胞(例如脂肪細胞、干細胞)。在軟組織重建中轉移大量自體脂肪組織的能力將為約
數百萬患者提供一個新穎的重建選擇,同時不會伴隨供體部位發病。此外,還為供體部
位選擇較少的患者以及不能耐受進行皮瓣重建所需的長時間手術的患者提供一個有利
工具。

發明內容

本發明基于可預測地成功移植脂肪組織和脂肪細胞的需求。本發明至少部分基于以
下發現:脂肪移植物中的受損細胞逐漸凋亡,并最終被接受者的身體所吸收。防止這些
移植物的細胞,尤其是細胞膜損傷,將允許更成功地進行可預測的脂肪移植。為防止移
植物細胞損傷,在本發明中,在移植物取得、移植物處理(例如洗滌、存儲)和/或最終
移植程序期間,將保護細胞膜免受損傷。已經研究了各種膜穩定劑,由此鑒別出使脂肪
移植物中細胞的死亡隨時間而減少的試劑。人們發現,疏水性部分側接兩個親水性部分
構成的三嵌段共聚物(例如泊洛沙姆P188(Poloxamer?P188),如圖1中所示)可使細
胞膜穩定,并且使脂肪移植物中細胞的死亡隨時間而減少。將這些聚合物與欲移植的脂
肪組織或脂肪細胞混合,會引起可預測且持久的脂肪移植。其它聚合物,諸如二嵌段共
聚物、四嵌段共聚物和聚乙二醇,也經過測試,并且發現其不能保護細胞免受損傷,或
者會溶解細胞。因此,本發明提供在軟組織重建或填充的脂肪移植過程中使用三嵌段共
聚物,尤其P188的組合物、方法和試劑盒。

細胞膜包括磷脂,其具有疏水性和親水性結構域。這些磷脂形成一個連續的脂質雙
層,包圍細胞。這一脂質雙層的完整性對于防止細胞損傷極為重要。本發明提供三嵌段
共聚物的組合物,其使細胞膜密封和/或穩定,并防止細胞受損。通常,這些聚合物與細
胞的磷脂雙層相互作用,并填塞損傷細胞膜中的孔。此外,經顯示,這些聚合物還降低
膜粘度。細胞粘度降低將使損傷的細胞變得更易溶解,而這樣又會降低受損膜上的張力。
本發明還提供在脂肪組織和脂肪細胞或其它組織和細胞(例如干細胞)移植過程中使用
所述組合物的方法。

一方面,本發明提供三嵌段共聚物,其有助于使細胞膜密封和/或穩定。本發明中所
用聚合物優選為生物可相容和/或生物可降解的。這種聚合物不應導致細胞溶解。在某些
實施例中,所述聚合物是非離子性聚合物。在某些實施例中,所述聚合物是聚醚。在某
些實施例中,所述聚合物是聚烷基醚。在某些實施例中,所述聚合物是聚烷基醚與另一
聚合物(例如聚烷基醚)的共聚物。具體說來,已經發現,泊洛沙姆可用于使細胞膜密
封和穩定。如以下化學結構中所示,泊洛沙姆是由中央疏水性聚氧丙烯
(polyoxypropylene,POP)(也稱為聚丙二醇)鏈側接兩個親水性聚氧乙烯
(polyoxyethylene,POE)(也稱為聚乙二醇(polyethylene?glycol,PEG))鏈構成的非離
子性三嵌段共聚物。在某些實施例中,優選將疏水性核心側接兩個親水性尾構成的三嵌
段共聚物用于脂肪移植。


在某些實施例中,使用泊洛沙姆P188來使脂肪移植物的細胞膜密封和/或穩定。已
經發現,泊洛沙姆P188能特別有效地修復受損的脂肪細胞膜,并改善受損脂肪細胞的
活力和存活可能性。不希望受特定理論的束縛,圖2中說明一種用P188修復細胞膜的
推薦機制。受損細胞膜的一部分中央脂質層(即,細胞膜的疏水性部分)暴露于其周圍
環境。P188的中央疏水性部分與細胞膜的這一疏水層相互作用,并且P188的側接親水
端本身沿細胞膜的外部親水性表面定位。這一密封/修復過程類似于常見的汽車輪胎補洞
膠塞修補(plug?repair),在輪胎修補過程中,柔性橡膠塞的中央被塞入輪胎的小孔中以
使其密封,同時橡膠塞的末端沿外胎面定位。可能需要不止一個P188分子來密封受損
膜中的孔。在某些實施例中,泊洛沙姆P188防止脂肪移植物細胞損傷。泊洛沙姆是巴
斯夫公司(BASF)以商品名PLURONIC銷售的產品。具體點說,泊洛沙姆188(P188)
是PLURONICF68。由于可以定制構成聚合物的嵌段的長度,故存在許多具有不同特
性的不同泊洛沙姆。這些共聚物常用有關在室溫下泊洛沙姆的狀態的字母(“P”表示
粉末,“L”表示液體,“F”表示薄片)后接三個數字命名。前兩個數字×100得到疏
水性聚氧丙烯核心的近似分子量,且最后一個數字×10得到聚氧乙烯含量的百分比。泊
洛沙姆188是聚氧丙烯分子質量為1800g/mol且聚氧乙烯含量為80%的泊洛沙姆,并且
泊洛沙姆188的平均分子量為7680-9510g/mol。為了將“Pxxy”名稱轉換成商品名
“Fzz”,將“Pxxy”中的xx乘以約3,即,P188為F68。適用于本發明中的其它泊洛
沙姆包括泊洛沙姆P108(PLURONICF38)、P184(PLURONICL64)、P401、P402、
P407(PLURONICF127)和P408(PLURONICF108)。具有較低分子量和大致相當
或較低PEG含量的其它泊洛沙姆可用于本發明中。聚合物通常是在從供體取出細胞后立
即添加到細胞中,以盡快地防止和/或修復膜損傷。添加到移植物細胞中的聚合物的濃度
范圍為每毫升細胞約1mg到約20mg聚合物。在某些實施例中,在供移植的聚合物/細
胞組合物中使用毫摩爾濃度的聚合物。通常使用達到所需膜穩定性的最低聚合物濃度。
所屬領域技術人員應理解,組合物中聚合物的濃度將視用于使移植細胞穩定的聚合物而
定。

將欲移植的細胞或組織與適宜濃度的聚合物混合,隨后移植到接受者(例如人類)
的所需移植部位(例如面部、唇、乳房)中。可以使用本發明技術移植任何細胞或組織。
在某些實施例中,所述組織是脂肪組織。在某些實施例中,所述細胞是來源于脂肪組織。
在某些實施例中,所述細胞是脂肪移植物(即,脂肪組織)的一部分,所述脂肪移植物
含有不同類型的細胞,包括(但不限于)脂肪細胞、基質細胞、上皮細胞、內皮細胞、
成纖維細胞和血細胞。在某些實施例中,細胞是脂肪細胞。在某些實施例中,細胞是成
纖維細胞。在某些實施例中,細胞是基質細胞。在某些實施例中,細胞是內皮細胞。在
某些實施例中,細胞是干細胞。在某些實施例中,細胞是來源于脂肪組織的干細胞。在
采集時,可將細胞與聚合物混合。在某些實施例中,在從供體取出脂肪組織之前,將包
括聚合物的組合物注射到欲取出組織的部位。在其它實施例中,在從供體取出細胞后,
將聚合物添加到細胞中。也可在加工或存儲時將聚合物添加到細胞中,或者可在即將移
植前,將細胞與聚合物混合。可用包括聚合物的組合物洗滌或以其它方式加工細胞或組
織。在某些實施例中,在移植前,洗掉移植物中的聚合物。

細胞/聚合物組合物還可包括其它試劑。舉例來說,組合物可包括進一步保護或穩定
欲移植細胞的試劑,或可保護聚合物的試劑。在某些實施例中,組合物包括維生素、礦
物質、抗氧化劑、滲透保護劑、增粘劑、輔酶、膜穩定劑、脂質、碳水化合物、激素、
生長因子、消炎劑、聚核苷酸、蛋白質、肽、醇、有機酸、有機小分子等。特別適用于
脂肪移植的組合為P188和硫辛酸(下文以還原和氧化形式顯示)。在某些實施例中,使
用還原形式的硫辛酸。在其它實施例中,使用氧化形式的硫辛酸。在其它實施例中,使
用兩種形式的混合物。


本發明提供用于脂肪移植的脂肪細胞與聚合物(例如P188)的組合物。在某些實施
例中,本發明提供干細胞與聚合物(例如P188)的組合物。干細胞可為來源于脂肪組織
的成體干細胞。來源于脂肪組織的其它細胞(例如干細胞、成纖維細胞、內皮細胞、基
質細胞)也可用于本發明中。本發明細胞/聚合物組合物可包括本文中所論述的使膜破壞
和/或自由基形成減到最少的其它試劑(例如抗氧化劑、維生素、脂質、蛋白質、肽、激
素、生長因子、碳水化合物、醫藥劑)。

另一方面,本發明提供適用于使用本發明組合物和方法移植脂肪的試劑盒。所述試
劑盒可包括將脂肪或脂肪源性細胞移植到個體體內必需的所有組分或所有組分的子集。
所述試劑盒可包括例如聚合物(例如P188)、用于洗滌細胞的緩沖溶液、用于洗滌細胞
的裝置、細胞、注射器、針、杯、容器、酒精擦片、麻醉劑、抗生素、抗氧化劑、維生
素、脂質、碳水化合物、激素、生長因子等。在某些實施例中,用于采集細胞的容器或
注射器中可具有聚合物(例如P188),以使采集的細胞與膜穩定劑立即接觸。在某些實
施例中,細胞是從接受這些細胞的患者獲取(即,自體移植)。在某些實施例中,試劑
盒的組分經無菌包裝以便利外科醫生或其它專業保健人員使用。試劑盒還可包括有關使
用聚合物(例如P188)和其它試劑進行采集/移植程序的說明。試劑盒可提供單次使用
必需的組件。試劑盒還可包括管理醫藥品和/或醫療裝置的政府管理機構所需的包裝和信
息。

附圖說明

圖1.A.聚合物P188的聚氧乙烯(POE)親水性亞單位。B.三嵌段P188結構,其具
有跨接兩個POE親水性尾的疏水性聚氧丙烯(POP)亞單位。

圖2.推定的P188膜插入過程。認為P188的疏水區插入受損膜的孔中,使細胞粘度
降低并使膜離子滲漏穩定,所述受損膜具有水合親水性長尾,延伸超過膜。

圖3.A.單一完整脂肪細胞的電子顯微鏡檢術(EM)圖像,其描述了完整的脂質雙
層。B.沿膜表面具有膜孔的脂肪細胞雙層的特寫EM,且其尺寸以納米標注(箭頭)。

圖4.細胞/泊洛沙姆P188、細胞/葡聚糖或細胞/生理鹽水的1mL組合物植入6周后
的再吸收情況。

圖5.細胞/泊洛沙姆P188、細胞/葡聚糖或細胞/生理鹽水的0.6mL組合物植入6周
后的再吸收情況。

圖6.經生理鹽水與經P188處理過的脂肪移植物(1.0cc,1.0g)的第6天共聚焦顯
微鏡檢術圖像的比較。使用免疫化學FLIVO-紅聚卡斯帕酶活化的細胞凋亡特異性染料
標記細胞。所示生理鹽水處理對照組(上圖)顯示大量標為紅色的凋亡小泡。相反,第
6天經P188處理過的樣品顯示相對較少量的標為紅色的凋亡液泡(綠色細胞質是正常自
體熒光的結果)。

圖7.早期移入期間的細胞凋亡事件。在早期移入期間脂肪移植物中的細胞凋亡水平。
當與生理鹽水處理對照組相比較時,P188第6天顯示細胞凋亡事件的統計學顯著降低。

圖8.與P188相比較,利用各種試劑進行圍移植(peri-transplant)期間細胞凋亡事
件增加。將各種聚合物和添加劑與P188相比較。上述系列顯示四個為期10天的獨立實
驗,其中各試劑的表現都不如P188。在早期移入期間增加細胞凋亡的試劑對脂肪細胞有
毒,并且不適于移植增強。(注意:PEG?8000、T1107實驗(左下圖)使用MitoPT細胞
凋亡標記,而其它實驗使用普洛麥格公司(Promega)的Apo-One細胞凋亡分析法。
Apo-One細胞凋亡分析法產生的信號平均起來是Mito-Pt信號的10倍,以致Mito-Pt信
號不如這種分析方法的亮。這一結果只是分析法差異,并不代表細胞凋亡量值的差異。)

圖9.硫辛酸在減少早期細胞凋亡方面具有附加作用。當與生理鹽水處理對照組相比
較時,經硫辛酸處理過的脂肪移植物在移入期間顯示較少的細胞凋亡。細胞凋亡方面的
這些改善使得為期6周的長期移植物性能得到改善。

圖10.重量與處理和植入后時間的關系。在植入后的前10天期間,每日稱取脂肪移
植物的重量。第1天后,移植物脫去約25%的水,所有組的重量在無血管期間保持穩定;
盡管在相同時間段期間細胞凋亡活性存在顯著差異。誤差棒表示標準偏差,早期的標準
偏差為約0.05g;在研究過程中,重量的總標準偏差為約0.10g。葡聚糖用作早期對照
物,因為其分子量類似于P188和PEG8000。證實與葡聚糖不存在差異后,在進一步實
驗中,將生理鹽水用作唯一的對照組。

圖11.累積的六周重量(P188對生理鹽水)。當與生理鹽水處理對照組相比較時,經
P188處理過的脂肪移植物的重量顯示統計學顯著的增加。

圖12.6周時以重量計的再吸收情況。在6周時觀察到,當與生理鹽水處理對照組相
比較時,用P188處理脂肪移植物導致移植物再吸收減少50%。

圖13.6周時P188與各種聚合物的再吸收情況的比較。進行P188與多種不同尺寸普
流尼克以及各種尺寸PEG和PEG混合物的比較測量。以重量計,P188是表現最好的聚
合物,盡管僅以重量計,P188與某些其它普流尼克(Pluronics)之間的差異較小。這些
小葉的組織學試樣顯示,一些樣品出現嚴重炎性浸潤,而在其它樣品中出現嚴重纖維化。
因此,僅僅重量不能作為脂肪移植物性能改善的清楚指示。

圖14.處理和植入(1.0cc/1.0g)后6周使用各種聚合物的活細胞信號。利用Cell-Titer?
Blue活力分析法,在6周時,與其它普流尼克相比較,P188顯示出優良的活細胞信號。
F127和L64顯示與生理鹽水相當或高于生理鹽水的活力水平,但未達到統計學顯著程
度。

圖15.植入和處理后2個月的活細胞信號。在處理和植入后2個月后,當與各種尺
寸和組合的PEG相比較時,P188顯示出優良的細胞活力。應注意,當與生理鹽水處理
對照組相比較時,PEG顯示較低的細胞活力水平。

圖16.植入和處理(1.0cc/1.0g)后6周的DNA含量。測量并比較6周時的DNA
含量。高DNA含量與細胞計數較高和脂肪細胞較多有關。當與其它普流尼克相比較時,
P188在6周時顯示最高的DNA水平。盡管在6周時觀察到某些重量略有差異,但就
DNA含量來說,P188勝過測試的所有其它聚合物。

圖17.生理鹽水處理對照組和經P188處理過的脂肪移植物的6周組織學。

圖18.生理鹽水對照組、P188和其它普流尼克在6周時的組織學評分。4名檢查人
在不知情的情況下針對樣品中正常脂肪、炎性浸潤和纖維化的存在進行評分。左圖為
P188與生理鹽水對照組的比較。圖中顯示出正常脂肪含量的統計學顯著增加以及纖維化
減少。當與其它聚合物相比較時,L64和F127得到類似分數,但不存在統計學顯著的
差異,且其余聚合物顯示的結果為從優于生理鹽水的某些改善到出現明顯毒性。

圖19.處理后6周的再吸收百分比(以重量計)。

具體實施方式

定義

本文中使用的“脂肪組織”是指由脂肪細胞構成的組織。脂肪組織通常是由脂肪細
胞構成的松散的結締組織。其在體內的主要作用是以脂肪形式存儲能量;但是,脂肪組
織也隔離和保護身體,并充當內分泌器官。脂肪組織可以是白色脂肪組織或褐色脂肪組
織。術語“脂肪組織(adipose?tissue)”可與“脂肪組織(fat?tissue)”互換使用。

本文中使用的“消炎劑”是指抑制炎癥的一種或一種以上病征或癥狀的任何物質。

除非另作規定,或另外從上下文中顯而易見,否則關于數字的術語“約”一般包括
在所述數字的任一方向(大于或小于所述數字)的5%范圍內的數字(所述數字將超過
可能值的100%的情形除外)。

“生物可相容”是指某種物質按所用量在所用位置對接受者的細胞實質上無毒,并
且也不會在接受者身體上的所用位置引發或引起明顯有害或不利的影響,例如不可接受
的免疫或發炎反應、形成不可接受的疤痕組織等。

“生物可降解”意思指物質能夠例如通過在生理條件下水解,和/或通過天然生物過
程(例如細胞內或體內存在的酶作用),和/或通過例如溶解、分散等過程,在細胞內或
在個體體內以物理和/或化學方式分解,從而形成通常可被身體代謝且任選使用和/或排
泄或以其它方式處置的較小化學物質。為本發明起見,分子量在體內因單體數量減少而
隨時間降低的聚合物或水凝膠可視為生物可降解的。

術語“聚核苷酸”、“核酸”或“寡核苷酸”是指核苷酸聚合物。術語“聚核苷
酸”、“核酸”與“寡核苷酸”可互換使用。通常,聚核苷酸包含至少兩個核苷酸。DNA
和RNA都是聚核苷酸。聚合物可包括:天然核苷(即,腺苷、胸苷、鳥苷、胞苷、尿
苷、脫氧腺苷、脫氧胸苷、脫氧鳥苷和脫氧胞苷)、核苷類似物(例如2-氨基腺苷、2-
硫代胸苷、肌苷、吡咯并嘧啶、3-甲基腺苷、C5-丙炔基胞苷、C5-丙炔基尿苷、C5-溴尿
苷、C5-氟尿苷、C5-碘尿苷、C5-甲基胞苷、7-脫氮腺苷、7-脫氮鳥苷、8-氧代腺苷、8-
氧代鳥苷、O(6)-甲基鳥嘌呤和2-硫代胞苷)、化學修飾的堿基、生物修飾的堿基(例如
甲基化堿基)、插入的堿基、經修飾的糖(例如2′-氟核糖、2′-甲氧基核糖、2′-氨基核糖、
核糖、2′-脫氧核糖、阿拉伯糖和己醣);,或經修飾的磷酸酯基(例如硫代磷酸酯和5′-N
氨基磷酸酯鍵)。也可使用天然或經修飾核苷的對映異構體。核酸還包括基于核酸的治
療劑,例如核酸配體、siRNA、短發夾RNA、反義寡核苷酸、核糖酶、適體和
SPIEGELMERSTM,沃特扎卡(Wlotzka)等人,美國國家科學院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.
USA),2002,99(13):8898(其完整內容以引用的方式并入本文中)中所述的寡核苷酸配
體。

“多肽”、“肽”或“蛋白質”包含至少三個氨基酸通過肽鍵連接在一起形成的
鏈。術語“多肽”、“肽”與“蛋白質”可互換使用。肽可以指個別肽或肽集合。本發
明的肽優選只含有天然氨基酸,但另外可使用此項技術中已知的非天然氨基酸(即,自
然界中不存在但可并入多肽鏈中的化合物)和/或氨基酸類似物。另外,可例如通過添加
化學實體,例如碳水化合物基團、磷酸酯基、法呢基(farnesyl?group)、異法呢基、脂肪
酸基團、供連結、官能化或其它修飾的連接基團等,來修飾肽中的一個或一個以上氨基
酸。在一個實施例中,修飾肽將產生更為穩定的肽(例如,更長的體內半衰期)。這些
修飾可包括肽環化、并入D-氨基酸或其它修飾。所述修飾都不應實質上干擾肽的所需生
物活性。

術語“多糖”與“碳水化合物”可互換使用。大部分的碳水化合物是具有許多羥基
(常常在分子的每一碳原子上具有一個羥基)的醛類或酮類。碳水化合物的分子式一般
為CnH2nOn。碳水化合物可為單糖、二糖、三糖、寡糖或多糖。最基本的碳水化合物是
單糖,例如葡萄糖、蔗糖、半乳糖、甘露糖、核糖、阿拉伯糖、木糖和果糖。二糖是連
接在一起的兩個單糖。示范性二糖包括蔗糖、麥芽糖、纖維二糖和乳糖。通常,寡糖包
括介于3與6個之間的單糖單元(例如棉子糖、水蘇糖),且多糖包括6個或6個以上
單糖單元。示范性多糖包括淀粉、糖原和纖維素。碳水化合物可含有經修飾的糖單元,
例如去除了羥基的2′-脫氧核糖、羥基經氟置換的2′-氟核糖,或N-乙酰基葡糖胺,即含
氮的葡萄糖形式。(例如,2′-氟核糖、脫氧核糖和己糖)。碳水化合物可以許多不同形式
存在,例如構象體、環狀形式、無環形式、立體異構體、互變異構體、異頭物和異構體。

“小分子”是指天然存在或人工創造(例如,經由化學合成)的有機化合物,其具
有相對較低的分子量且不為蛋白質、多肽或核酸。小分子通常不是具有重復單元的聚合
物。在某些實施例中,小分子的分子量小于約1500g/mol。在某些實施例中,聚合物的
分子量小于約1000g/mol。小分子通常還具有多個碳-碳鍵,并且可具有多個立體中心和
官能團。

本文中使用的“個體(subject)”是指欲傳遞藥劑例如以達到實驗、診斷和/或治療
目的的個體(individual)。優選個體為哺乳動物,尤其家養哺乳動物(例如狗、貓等)、
靈長類動物或人類。在某些實施例中,個體為人類。在某些實施例中,個體是實驗動物,
例如小鼠或大鼠。處于醫師或其它健康護理人員護理下的個體可稱為“患者”。

“醫藥劑”,也稱為“藥物”,在本文中用于指投予個體以治療疾病、病癥或其它
臨床上公認的對個體有害的病狀,或用于預防目的的藥劑,并且其對身體疾病、病癥或
病狀的治療或預防具有臨床上顯著的作用。治療劑包括(但不限于)以下文獻中所列的
藥劑:美國藥典(United?States?Pharmacopeia,USP)、古德曼(Goodman)和吉爾曼(Gilman)
治療學的藥理學基礎(The?Pharmacological?Basis?of?Therapeutics),第10版,(麥克勞希
爾出版社(McGraw?Hill)),2001;卡卓恩B.(Katzung,B.)(編)基礎與臨床藥理學(Basic?
and?Clinical?Pharmacology),麥克勞希爾/阿普爾頓和蘭格(Appleton?&?Lange)出版社;
第8版(2000年9月21日);醫師桌上手冊(Physician′s?Desk?Reference)(湯姆遜出版公
司(Thomson?Publishing)),和/或默克診療手冊(The?Merck?Manual?of?Diagnosis?and?
Therapy),第17版(1999)或其后出版的第18版(2006),馬克H.比爾(Mark?H.Beers)
和羅伯特·貝爾考(Robert?Berkow)(編),默克出版集團(Merck?Publishing?Group),或在
動物的情況下,默克獸醫手冊(The?Merck?Veterinary?Manual),第9版,卡恩C.A.(Kahn,
C.A.)(編),默克出版集團(Merck?Publishing?Group),2005。

本發明特定實施例的具體描述

本發明認識到,在美容和重建手術中,通過添加使移植物中的細胞膜穩定的聚合物,
可改善脂肪組織或脂肪細胞的移植。不希望受特定理論的束縛,認為聚合物與細胞膜相
互作用,并密封或防止膜缺損,由此防止細胞損傷(例如離子滲漏)或使之減到最少。
防止細胞損傷將降低移植物中細胞凋亡和細胞死亡的程度,并有助于改善軟組織修復、
重建或填充過程中脂肪移植的成功率和一致性。本發明提供用于改善個體(例如人類)
脂肪移植的聚合物、組合物、方法和試劑盒。

聚合物

本發明是基于發現某些聚合物可使脂肪移植物中的細胞或來源于脂肪組織的細胞
(例如干細胞、基質細胞、成纖維細胞、內皮細胞、上皮細胞)的細胞膜穩定。將足夠
濃度的聚合物與細胞混合,可使細胞膜穩定,并保護細胞膜免受損傷和/或密封已經受損
的膜。這些聚合物可與其它改善脂肪移植成功率的方法結合使用,包括例如改善移植物
供血,或添加有助于防止欲移植的細胞損傷的其它試劑(例如硫辛酸)。

與細胞膜相互作用并使細胞膜穩定的任何聚合物都可添加到脂肪移植所用細胞中;
然而,人們發現,具有疏水性中央部分側接兩個親水性尾的三嵌段共聚物特別適用于改
善脂肪移植物。在某些實施例中,聚合物是合成聚合物(即,非自然界產生的聚合物)。
在其它實施例中,聚合物是天然聚合物(例如蛋白質、多糖、橡膠)。在某些實施例中,
聚合物是表面活性聚合物。在某些實施例中,聚合物是非離子性聚合物。在某些實施例
中,聚合物是非離子性嵌段共聚物。

在某些實施例中,聚合物包括聚醚部分。在某些實施例中,聚合物包括聚烷基醚部
分。在某些實施例中,聚合物包括聚乙二醇尾。在某些實施例中,聚合物包括聚丙二醇
中央部分。在某些實施例中,聚合物包括聚丁二醇作為中央部分。在某些實施例中,聚
合物包括聚戊二醇作為中央部分。在某些實施例中,聚合物包括聚己二醇作為中央部分。
在某些實施例中,聚合物是由本文中所述的一種聚合物構成的三嵌段共聚物。

在某些實施例中,聚合物是由聚烷基醚(例如聚乙二醇、聚丙二醇)與另一聚合物
構成的三嵌段共聚物。在某些實施例中,聚合物是由聚烷基醚與另一聚烷基醚構成的三
嵌段共聚物。在某些實施例中,聚合物是由聚乙二醇與另一聚烷基醚構成的三嵌段共聚
物。在某些實施例中,聚合物是由聚丙二醇與另一聚烷基醚構成的三嵌段共聚物。在某
些實施例中,聚合物是具有至少一個聚烷基醚單元的三嵌段共聚物。在某些實施例中,
聚合物是由兩個不同的聚烷基醚構成的三嵌段共聚物。在某些實施例中,聚合物是包括
聚乙二醇單元的三嵌段共聚物。在某些實施例中,聚合物是包括聚丙二醇單元的三嵌段
共聚物。在某些實施例中,聚合物是由一個疏水性較強的單元側接兩個親水性較強的單
元構成的三嵌段共聚物。在某些實施例中,親水性單元是相同類型的聚合物。在某些實
施例中,聚合物包括一個聚丙二醇單元側接兩個親水性較強的單元。在某些實施例中,
聚合物包括兩個聚乙二醇單元側接疏水性較強的單元。在某些實施例中,聚合物是一個
聚丙二醇單元側接兩個聚乙二醇單元構成的三嵌段共聚物。在某些實施例中,聚合物具
有下式:


其中n是介于包括2與包括200之間的整數,且m是介于包括2與包括200之間的
整數。在某些實施例中,n為介于包括10與包括100之間的整數。在某些實施例中,n
為介于包括5與包括50之間的整數。在某些實施例中,n是m的約2倍。在某些實施
例中,n為約70,且m為約35。在某些實施例中,n為約50,且m為約30。在某些實
施例中,聚合物是泊洛沙姆P188,其為巴斯夫公司(BASF)以商品名PLURONICF68
銷售的產品。其它適用于本發明中的PLURONIC聚合物包括(但不限于)PLURONIC
F108、PLURONICF127、PLURONICF38、PLURONICF68、PLURONICF77、
PLURONICF87、PLURONICF88、PLURONICF98、PLURONICL10、PLURONIC
LI01、PLURONICL121、PLURONICL31、PLURONICL35、PLURONICL43、
PLURONICL44、PLURONICL61、PLURONICL62、PLURONICL64、PLURONIC
L81、PLURONICL92、PLURONICN3、PLURONICP103、PLURONICP104、
PLURONICP105、PLURONICP123、PLURONICP65、PLURONICP84和
PLURONICP85。泊洛沙姆一般是通過首先環氧丙烷且接著環氧乙烷連續添加到丙二醇
中而合成。

如下文的實例部分中所述,三嵌段聚合物能夠自身插入到損傷的脂肪細胞膜中,使
膜穩定(參看圖2)。此外,已知這些聚合物因具有高度水合的聚乙二醇尾,而能夠降低
膜粘度。細胞粘度降低將使損傷的細胞變得更易溶解,由此降低損傷膜上的張力。具體
點說,經顯示,市售三嵌段共聚物P188對于修復受損的細胞膜以及改善受損脂肪細胞
的活力和存活率特別有效。下文的實例中將從組織學、脂肪移植物隨時間的重量變化、
細胞凋亡事件、細胞活力和原始DNA含量方面描述P188用于拯救圍移植期(從采集到
穩定移入的時間)中受損的脂肪細胞的功效。經顯示,P188比測試的任何其它聚合物都
更有效,即使具有相同嵌段次序的較小和較大三嵌段共聚物表現也沒這么好。二嵌段和
四嵌段共聚物甚至對移植物有毒。

經顯示,P188在脂肪組織中具有弱溶解性,并且其不會被充分吸附到未受損的完整
細胞膜上。P188使經受采集過程引起的機械切變(mechanical?sheer)損傷的脂肪細胞保
持其正常的膜力學。一旦這些細胞能夠通過增加雙層中磷脂的量來修復其細胞膜,P188
就會被機械擠出[艾格瓦J.(Agarwal,J.),A.瓦爾希(A.Walsh)和R.C.李(R.C.Lee),
使受損細胞復蘇的多模式策略(Multimodal?strategies?for?resuscitating?injured?cells).紐
約科學院年報(Ann?N?Y?Acad?Sci),2005.1066:295-309;以引用的方式并入本文中]。通
過增加跨膜表面壓力,可擠出P188。一旦從移植的細胞中擠出,P188就會基本上不變
地被腎排出,其中少量是經由膽腸系統排出[辛格-喬伊S.D.(Singh-Joy,S.D.)和V.C麥
克萊恩(V.C.McLain),泊洛沙姆101、105、108、122、123、124、181、182、183、
184、185、188、212、215、217、231、234、235、237、238、282、284、288、331、
333、334、335、338、401、402、403和407、泊洛沙姆105苯甲酸酯和泊洛沙姆182
二苯甲酸酯當用于美容中時的安全性評估(Safety?assessment?of?poloxamers?101,105,108,
122,123,124,181,182,183,184,185,188,212,215,217,231,234,235,237,238,282,
284,288,331,333,334,335,338,401,402,403,and?407,poloxamer?105?benzoate,and?
poloxamer?182?dibenzoate?as?used?in?cosmetics).國際毒理學雜志(Int?J?Toxicol),2008.27
增刊2:93-128;以引用的方式并入本文中]。沒有證據證明使用適用于脂肪移植的濃度的
P188會引起不良作用或安全性問題。

本發明所用聚合物的分子量可在約500g/mol到多達約50,000g/mol的范圍內。在
某些實施例中,聚合物的分子量范圍為約1,000g/mol到約30,000g/mol。在某些實施例
中,聚合物的分子量范圍為約2,000g/mol到約15,000g/mol。在某些實施例中,聚合物
的分子量范圍為約2,000g/mol到約12,000g/mol。在某些實施例中,聚合物的分子量范
圍為約1,000g/mol到約5,000g/mol。在某些實施例中,聚合物的分子量范圍為約5,000
g/mol到約10,000g/mol。在某些實施例中,聚合物的分子量范圍為約7,500g/mol到約
10,000g/mol。在某些實施例中,聚合物的分子量范圍為約10,000g/mol到約15,000
g/mol。在某些實施例中,聚合物的分子量范圍為約15,000g/mol到約20,000g/mol。在
某些實施例中,聚合物的分子量為約20,000g/mol到約25,000g/mol。在某些實施例中,
聚合物的平均分子量為約5,000g/mol、約5,500g/mol、約6,000g/mol、6,500g/mol、7,000
g/mol、約7,500g/mol、約8,000g/mol、約8,500g/mol、約9,000g/mol、約9,500g/mol
或約10,000g/mol。在某些實施例中,P188的平均分子量為約8,400g/mol。此項技術中
已知其它市售泊洛沙姆的平均分子量。

本發明中所用聚合物組合物通常為用于人類和/或其它動物的醫藥級物質。在某些實
施例中,聚合物被批準用于人類和獸醫應用。在一些實施例中,聚合物獲美國食品和藥
品管理局(United?States?Food?and?Drug?Administration)批準。在一些實施例中,聚合物
為醫藥級物質。在一些實施例中,聚合物滿足美國藥典(USP)、歐洲藥典(EP)、英國
藥典和/或國際藥典的標準。在某些實施例中,聚合物為至少90%純。在某些實施例中,
聚合物為至少95%純。在某些實施例中,聚合物為至少98%純。在某些實施例中,聚合
物為至少99%純。在某些實施例中,聚合物為至少99.5%純。在某些實施例中,聚合物
為至少99.9%純。在某些實施例中,聚合物為至少99.99%純。在某些實施例中,聚合物
不含有毒或非生物相容性物質。

適用于本發明中的聚合物通常在體內降解成無毒降解產物,或被身體安全排出。聚
合物優選為生物可相容的,并且不會導致任何實質性的不必要副作用。聚合物的體內半
衰期可在約1天到約1個月的范圍內。在某些實施例中,聚合物的體內半衰期在約1天
到約1周的范圍內。在某些實施例中,聚合物的體內半衰期在約1周到約2周的范圍內。
在某些實施例中,聚合物的體內半衰期在約3周到約4周的范圍內。

可通過將測試化合物與欲移植的脂肪細胞混合,并將所得組合物移植到小鼠或其它
嚙齒動物體內,測定隨時間變化脂肪植入物的成功率,以此測試用于脂肪移植中的聚合
物(如下文實例中所述)。脂肪植入物可借助各種生物化學和病理學測量法評估,例如
植入物的重量、植入物的體積、組織學、評估細胞凋亡和/或細胞死亡的標記物、測量活
細胞數量、評估線粒體ATP水平、評估DNA水平,或進行實時PCR以測定瘦素(leptin)、
PPARγ2或其它標記物的水平。在某些實施例中,測試是在裸小鼠體內進行。也可通過
將細胞與測試聚合物混合,并分析細胞的細胞凋亡或細胞死亡標記物、分析細胞毒性等,
在體外篩選聚合物。在某些實施例中,將使用測試聚合物得到的結果與由對照組得到的
結果相比較。在某些實施例中,對照聚合物是P188。在某些實施例中,對照聚合物是葡
聚糖。在某些實施例中,對照脂肪移植物經生理鹽水處理。

聚合物可與其它生物活性劑和/或醫藥學上可接受的賦形劑組合,以形成適用于添加
到欲移植細胞中的組合物。這些生物活性劑也可用于防止脂肪移植物中的細胞死亡。所
用賦形劑應有助于將聚合物與欲移植的細胞混合,或有助于處理和存儲所得聚合物/細胞
組合物。

可與聚合物一起添加到欲移植的細胞中的生物活性劑包括(但不限于)抗氧化劑、
維生素、膜穩定劑、礦物質、滲透保護劑、輔酶、增粘劑、激素和生長因子。多種機制
牽涉到移植細胞的細胞死亡,例如,膜破壞和自由基形成。抗氧化劑可用于脂肪移植中
以減少自由基形成。抗氧化劑可清除自由基,并防止由活性氧物質引起的損傷。在某些
實施例中,聚合物/細胞組合物進一步包含抗氧化劑。據悉,聚合物和抗氧化劑可改善細
胞的防護,并由此改善脂肪移植的結果。抗氧化劑可以是酶促或非酶促抗氧化劑。酶促
抗氧化劑包括例如超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過氧化物酶和催化酶。示范性非酶促抗氧
化劑包括α-生育酚(維生素E)、維生素A、谷胱甘肽、類胡蘿卜素(例如番茄紅素、
葉黃素、多酚類、β-胡羅卜素)、類黃酮、黃酮、黃酮醇、谷胱甘肽、N-乙酰半胱氨酸、
半胱氨酸、硫辛酸、泛醇(ubiquinal)(輔酶Q)、泛醌(輔酶Q10)、褪黑激素、番茄紅
素、丁基化苯甲醚、丁基化羥基甲苯(butylated?hydroxytoluene,BHT)、苯甲酸酯、對
羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸丙酯、花青素原(proanthocyanidin)、甘露醇和乙二胺
四乙酸(ethylenediamine?tetraacetic?acid,EDTA)。在某些實施例中,抗氧化劑是金屬抗
氧化劑。在某些實施例中,抗氧化劑是硒。在某些實施例中,抗氧化劑是鋅。在某些實
施例中,抗氧化劑是銅。在某些實施例中,抗氧化劑是鍺。

在某些實施例中,聚合物/細胞組合物進一步包含維生素。維生素可以是一種抗氧化
劑。在某些實施例中,維生素是α-生育酚(維生素E)。在某些實施例中,維生素是輔
酶Q10。在某些實施例中,維生素是β-胡羅卜素。可添加到本發明聚合物/細胞組合物中
的其它維生素包括維生素A、維生素B1(硫胺)、維生素B2(核黃素)、維生素B3(煙
酸)、維生素B4(腺嘌呤)、維生素B5(泛酸)、維生素B6(吡哆醇)、維生素B7(生物
素)、維生素B9(葉酸)、維生素B12(氰鈷胺)、維生素D(鈣化醇)和維生素K。

在某些實施例中,聚合物/細胞組合物進一步包含激素或生長因子。在某些實施例中,
激素或生長因子是胰島素、格列酮類(glitazones)、膽固醇、VEGF、FGF、EGF、PDGF
等。在某些實施例中,聚合物/細胞組合物進一步包含有機酸(例如硫辛酸)。在某些實
施例中,聚合物/細胞組合物進一步包含含硫醇或含二硫化物的分子(例如硫辛酸、谷胱
甘肽)。在某些實施例中,聚合物/細胞組合物進一步包含有機小分子(例如花青素、辣
椒素)。

在某些實施例中,脂肪細胞與P188和谷胱甘肽組合移植到個體體內。在某些實施
例中,脂肪細胞與P188和硫辛酸組合移植到個體體內。在某些實施例中,脂肪細胞與
P188和維生素E組合移植到個體體內。

本文中所述聚合物的調配物可借助醫藥學領域中已知或此后開發的任何方法制備。
一般說來,所述制備方法包括以下步驟:使聚合物與一種或一種以上賦形劑和/或一種或
一種以上其它生物活性劑締合。本發明組合物中聚合物、醫藥學上可接受的賦形劑和/
或任何其它試劑的相對量可視聚合物身份、聚合物尺寸、植入部位和/或個體而變化。舉
個例子,打算與欲移植的細胞混合的組合物可包含介于1%與99%(重量比)之間的聚
合物。

聚合物的調配物可包含醫藥學上可接受的賦形劑,如本文中所用,所述賦形劑包括
適于所需特定調配物的任一種和所有溶劑、分散介質、稀釋劑或其它液體媒劑、分散或
懸浮助劑、表面活性劑、等滲劑、增稠劑或乳化劑、防腐劑、固體粘合劑、潤滑劑等。
雷氏藥學大全(Remington′s?The?Science?and?Practice?of?Pharmacy),第21版,A.R.吉納
羅(A.R.Gennaro),(利平科特·威廉斯&威爾金斯工作室(Lippincott,Williams?&?Wilkins),
馬里蘭州巴爾的摩(Baltimore,MD),2006;以引用的方式并入本文中)中揭露了用于調
配醫藥組合物的各種賦形劑以及其已知的制備技術。除非任何常規賦形劑與物質或其衍
生物不相容,例如通過產生任何不合需要的生物學作用或者另外以有害的方式與醫藥組
合物中的任何其它組分相互作用,否則賦形劑的使用都涵蓋在本發明的范圍內。

在一些實施例中,醫藥學上可接受的賦形劑為至少95%、96%、97%、98%、99%
或100%純。在一些實施例中,賦形劑被批準用于人類和獸醫應用。在一些實施例中,
賦形劑獲美國食品和藥品管理局批準。在一些實施例中,賦形劑為醫藥級。在一些實施
例中,賦形劑滿足美國藥典(USP)、歐洲藥典(EP)、英國藥典和/或國際藥典的標準。

用于制造聚合物組合物的醫藥學上可接受的賦形劑包括(但不限于)惰性稀釋劑、
分散劑、表面活性劑和/或乳化劑、崩解劑、防腐劑、緩沖劑、潤滑劑和/或油。所述賦
形劑可任選包括在本發明的調配物中。根據配方設計師的判斷,組合物中可存在例如著
色劑等賦形劑。

示范性稀釋劑包括(但不限于)碳酸鈣、碳酸鈉、磷酸鈣、磷酸二鈣、硫酸鈣、磷
酸氫鈣、磷酸鈉乳糖、蔗糖、纖維素、微晶纖維素、高嶺土、甘露糖醇、山梨糖醇、肌
醇、氯化鈉、干淀粉、玉米淀粉、糖粉等,和其組合。

示范性分散劑包括(但不限于)馬鈴薯淀粉、玉米淀粉、木薯淀粉、羥基乙酸淀粉
鈉、粘土、海藻酸、瓜爾膠、柑橘渣、瓊脂、膨潤土、纖維素和木制品、天然海綿(natural?
sponge)、陽離子交換樹脂、碳酸鈣、硅酸鹽、碳酸鈉、交聯聚(乙烯吡咯烷酮)(交聯聚
維酮(crospovidone))、羧甲基淀粉鈉(羥基乙酸淀粉鈉)、羧甲基纖維素、交聯羧甲基
纖維素鈉(交聯羧甲纖維素)、甲基纖維素、預膠化淀粉(淀粉1500)、微晶淀粉、水不
溶性淀粉、羧甲基纖維素鈣、硅酸鎂鋁(維格姆(Veegum))、月桂基硫酸鈉、季銨化合
物等,和其組合。

示范性防腐劑可包括抗氧化劑、螯合劑、殺菌防腐劑、殺真菌防腐劑、醇防腐劑、
酸性防腐劑和其它防腐劑。示范性抗氧化劑包括(但不限于)α生育酚、抗壞血酸、抗
壞血酸棕櫚酸酯、丁基羥基茴香醚、丁基羥基甲苯、單硫代甘油、焦亞硫酸鉀、丙酸、
沒食子酸丙酯、抗壞血酸鈉、亞硫酸氫鈉、焦亞硫酸鈉和亞硫酸鈉。示范性螯合劑包括
乙二胺四乙酸(EDTA)、單水合檸檬酸、依地酸二鈉(disodium?edetate)、依地酸二鉀、
依地酸、富馬酸、蘋果酸、磷酸、依地酸鈉、酒石酸和依地酸三鈉。示范性殺菌防腐劑
包括(但不限于)苯扎氯銨(benzalkonium?chloride)、芐索氯胺(benzethonium?chloride)、
苯甲醇、布羅泊爾(bronopol)、西曲溴銨(cetrimide)、西吡氯銨(cetylpyridinium?chloride)、
氯己定(chlorhexidine)、氯丁醇、氯甲酚、氯二甲酚、甲酚、乙醇、甘油、海克替啶
(hexetidine)、咪唑烷脲(imidurea)、苯酚、苯氧基乙醇、苯乙醇、硝酸苯汞、丙二醇和
硫柳汞(thimerosal)。示范性殺真菌防腐劑包括(但不限于)對羥基苯甲酸丁酯、對羥
基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸乙酯、對羥基苯甲酸丙酯、苯甲酸、羥基苯甲酸、苯甲酸
鉀、山梨酸鉀、苯甲酸鈉、丙酸鈉和山梨酸。示范性醇防腐劑包括(但不限于)乙醇、
聚乙二醇、苯酚、酚系化合物、雙酚、氯丁醇、羥基苯甲酸酯和苯乙醇。示范性酸性防
腐劑包括(但不限于)維生素A、維生素C、維生素E、β-胡蘿卜素、檸檬酸、乙酸、
脫氫乙酸、抗壞血酸、山梨酸和植酸。其它防腐劑包括(但不限于)生育醇、生育醇乙
酸酯、甲磺酸迪特奧希姆(deteroxime?mesylate)、西曲溴銨、丁基化羥基苯甲醚(BHA)、
丁基化羥基甲苯(BHT)、乙二胺、月桂基硫酸鈉(sodium?lauryl?sulfate,SLS)、月桂基
乙醚硫酸鈉(sodium?lauryl?ether?sulfate,SLES)、亞硫酸氫鈉、焦亞硫酸鈉、亞硫酸鉀、
焦亞硫酸鉀、Glydant?Plus、Phenonip、對羥基苯甲酸甲酯、杰馬115(Germall?115)、
極美II(Germaben?II)、NeoloneTM、KathonTM和Euxyl。在某些實施例中,防腐劑為一
種抗氧化劑。在其它實施例中,防腐劑是一種螯合劑。

示范性緩沖劑包括(但不限于)檸檬酸鹽緩沖液、乙酸鹽緩沖液、磷酸鹽緩沖液、
氯化銨、碳酸鈣、氯化鈣、檸檬酸鈣、葡乳醛酸鈣、葡庚糖酸鈣、葡糖酸鈣、D-葡糖酸、
甘油磷酸鈣、乳酸鈣、丙酸、乙酰丙酸鈣、戊酸、磷酸氫鈣、磷酸、磷酸三鈣、堿式磷
酸鈣、乙酸鉀、氯化鉀、葡糖酸鉀、鉀混合物、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、磷酸鉀混合
物、乙酸鈉、碳酸氫鈉、氯化鈉、檸檬酸鈉、乳酸鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、磷酸
鈉混合物、緩血酸胺、氫氧化鎂、氫氧化鋁、海藻酸、無熱原質水、等滲生理鹽水、林
格氏溶液、乙醇等,和/或其組合。

除與欲移植的細胞組合外,本發明聚合物還可與一種或一種以上生物活性劑組合。
在某些實施例中,聚合物與抗氧化劑組合。在某些實施例中,聚合物與維生素組合。在
某些實施例中,聚合物與脂質組合。在某些實施例中,聚合物與膜穩定劑組合。在某些
實施例中,聚合物與醫藥劑組合。在某些實施例中,聚合物與消炎劑組合。在某些實施
例中,聚合物與抗生素組合。在某些實施例中,聚合物與蛋白質或肽組合。在某些實施
例中,聚合物與激素組合。在某些實施例中,聚合物與生長因子組合。在某些實施例中,
聚合物與碳水化合物組合。在某些實施例中,聚合物與液體賦形劑組合以投予聚合物/
細胞組合物。在某些實施例中,賦形劑是一種水溶液。在某些實施例中,賦形劑是一種
緩沖水溶液。在某些實施例中,賦形劑是磷酸鹽緩沖生理鹽水溶液。在某些實施例中,
賦形劑與細胞外流體等滲。

用途

本發明提供在移植前使聚合物或聚合物組合物與欲移植的細胞締合的方法。本發明
系統特別適用于改善脂肪移植的成功率,或改善脂肪組織或來源于脂肪組織的細胞的移
植成功率。將欲移植的細胞與足夠濃度的聚合物混合,以在移植期間使細胞膜穩定并防
止細胞損傷。普遍認為,聚合物通過與細胞膜締合,來固定細胞膜或防止細胞膜損傷。
細胞或細胞組合物在移植到個體體內之前,與聚合物或包含聚合物的組合物混合。聚合
物可在取得細胞時、存儲或處理細胞期間或者在細胞即將植入個體體內之前與細胞混
合。

聚合物可與欲移植的組織或細胞在取得、處理、加工或植入移植物期間的任意時間
混合。在某些實施例中,在從供體部位采集細胞或組織之前,在打算獲取細胞或組織的
部位注射聚合物組合物。舉例來說,在脂肪采集期間,可將聚合物包括在腫脹性注射液
(tumescent?injection?solution)(即,在抽脂前注射到供體部位的流體)中。在某些實施
例中,在采集到打算移植的細胞或組織后,使其立即與聚合物接觸,以保護其免受損傷。
舉例來說,在從供體采集脂肪組織(例如通過抽脂或通過針抽吸)后,可使其立即與聚
合物接觸。在某些實施例中,聚合物是包括在抽脂收集容器中。在某些實施例中,從接
受欲移植細胞的同一人采集打算移植的細胞(即,自體捐贈)。在某些實施例中,從供
體的胃部、大腿或臀部采集細胞。在某些實施例中,將脂肪組織采集到已經包括了聚合
物或聚合物組合物的注射器或其它容器中。在其它實施例中,采集脂肪組織,并立即添
加到聚合物組合物中,或將聚合物組合物添加到脂肪組織中。在植入個體前,所得聚合
物/細胞組合物可經進一步加工。舉例來說,在植入個體之前,可對細胞進行洗滌、純化、
萃取或其它方式的處理。在某些實施例中,在供移植細胞的整個加工過程中,使細胞或
組織與過量聚合物保持接觸。在某些實施例中,例如通過離心,從欲移植的組織或細胞
去除過量的聚合物或聚合物溶液。在某些實施例中,在移植前,洗掉移植物中的聚合物。

在某些實施例中,在即將移植前,使欲移植的細胞與聚合物接觸。舉例來說,可在
即將植入個體之前,在手術室或診所中將細胞與聚合物混合。將無菌聚合物或其組合物
與欲移植的細胞混合。

與細胞混合的聚合物的濃度通常在每毫升細胞約1到20mg聚合物的范圍內。所屬
領域技術人員應理解,使欲移植細胞的細胞膜足夠穩定所需的聚合物濃度可視所用聚合
物、個體、植入部位等而變化。在某些實施例中,濃度在每毫升細胞約1到10mg聚合
物的范圍內。在某些實施例中,濃度在每毫升細胞約1到5mg聚合物的范圍內。在某
些實施例中,濃度在每毫升細胞約5到10mg聚合物的范圍內。在某些實施例中,濃度
在每毫升細胞約10到15mg聚合物的范圍內。在某些實施例中,濃度在每毫升細胞約
15到20mg聚合物的范圍內。在某些實施例中,濃度為每毫升細胞約5、6、7、8、9、
10、11、12、13、14或15mg聚合物。在某些實施例中,當使用泊洛沙姆P188時,濃
度為每毫升細胞約10mg聚合物。

在細胞與聚合物接觸后,將細胞/聚合物組合物投予或植入個體中。在某些實施例中,
在采集后0.5到6小時內,將細胞移植入接受者體內。在某些實施例中,個體為人類。
在某些實施例中,個體為哺乳動物。在某些實施例中,個體是測試動物,例如小鼠、大
鼠、兔或狗。通常將細胞/聚合物組合物投予需要脂肪移植的患者。個體可經歷重建或美
容手術。在某些實施例中,在除皺過程中,使用脂肪移植。在某些實施例中,在軟組織
置換或填充過程中,使用脂肪移植。在某些實施例中,在唇、臉頰、乳房、面部、臀部、
小腿、胸和陰莖填充中使用脂肪移植。通常,將自體脂肪細胞移植回供體與獲取細胞處
不同的部位。細胞或組織可以使用任何方法或技術(例如注射、手術植入)植入或投予。

除脂肪細胞外,已發現脂肪組織也是干細胞的來源(基姆博(Gimble)等人,“用
于再生醫學的脂肪源性干細胞(Adipose-Derived?Stem?Cells?for?Regenerative?Medicine)”,
循環研究(Circulation?Research)100:1249-1260,2007;以引用的方式并入本文中)。因
此,本發明系統可用于使來源于脂肪組織的干細胞或其它細胞穩定并防止這些細胞受
損。在某些實施例中,本發明系統可用于移植成體干細胞。在某些實施例中,本發明系
統可用于移植成纖維細胞。脂肪組織中發現的其它細胞包括(但不限于)基質細胞、平
滑肌細胞、血細胞(例如巨噬細胞)、上皮細胞和內皮細胞。本發明提供任何所述細胞
的移植。

試劑盒

本發明還提供包裝或試劑盒,其在容器中包含一種或一種以上本文中所述的聚合物
或聚合物組份。舉例來說,容器可包括備用于脂肪移植的聚合物或聚合物組合物。包裝
還可包括與容器聯合的通知,其通常呈管理醫療裝置和/或醫藥品制造、使用或銷售的政
府機構規定的形式,因此,所述通知將反映政府機構批準組合物用于人類或獸醫投藥進
行組織移植。還可包括有關聚合物使用的說明。所述說明可包括有關投予患者聚合物或
聚合物/細胞組合物的信息。具體點說,這些說明可包括關于使聚合物與細胞或組織接觸
以及投予患者細胞/聚合物組合物的信息。所述包裝還可包括一個或一個以上容器,這些
容器含有在投予前包括在聚合物/細胞組合物中的生物活性劑。

包裝可包括供制備聚合物/細胞組合物的裝置或貯藏器(receptacle)。所述裝置可例
如為測量或混合裝置。

包裝也可任選包括用于投予本發明聚合物/細胞組合物的裝置。示范性裝置包括專用
注射器、針和與多種喉鏡設計相配的導管。

試劑盒中各組件可提供于相對緊密封閉的單一較大容器(例如塑料或泡沫聚苯乙烯
(styrofoam)盒)中。通常,試劑盒宜經包裝以供專業保健人員使用。在某些實施例中,
試劑盒中各組件經無菌包裝以用于無菌環境中,例如手術室或醫師的診所。

實例

實例1:在脂肪移植過程中通過用泊洛沙姆P188處理增強脂肪保護和增加存活率

引言.自體脂肪移植是軟組織重建中的基本工具。然而,受損細胞和凋亡細胞最終被
體內所吸收,并且使軟組織修復產生不一致且不合需要的結果。泊洛沙姆P188是一種
與受損的細胞膜相互作用并將自身插入脂質單層中的試劑。這種非離子性表面活性劑可
有效密封受損細胞的膜,并且經顯示,其可提供針對損傷和細胞凋亡的防護。泊洛沙姆
與脂質膜相互作用的能力使人們得出一個假說,即,通過密封脂肪細胞在脂肪采集期間
損傷的部分,可以修復受損細胞和保護受損細胞的結構完整性,并由此改善細胞存活率。
本實例將研究P188有效恢復和保護受損組織、改善細胞存活率并改善移植結果的能力。

方法.從手術室抽脂吸出物中獲得脂肪,并在采集的1小時內移植到裸小鼠體內。將
0.6mL體積的脂肪經皮下放入每只小鼠的右側背部。研究包括三個小組:(1)用濃度為
10mg/mL?P188處理過的脂肪;(2)用濃度為10mg/mL的葡聚糖處理脂肪;和(3)用
生理鹽水處理脂肪。在6周時間后,對小鼠實行安樂死,并采集脂肪植入物。使用重量、
體積、活/死亡分析、線粒體ATP水平和針對瘦素和PPARγ2水平的實時PCR評價植入
之前和之后的脂肪植入物。

結果.6周時間后,移植的脂肪在每只動物體內長成劃分清晰邊界的結節。根據重量
和體積,生理鹽水對照組展現多達30%的吸收。葡聚糖處理過的脂肪移植物展現類似的
吸收率。用P188處理過的脂肪移植物顯示吸收下降67%。參看圖5。這是統計學顯著的
降低(p<0.001)。在分子水平和組織學方面也觀察到差異,其中脂肪細胞比例明顯增加,
且空泡面積或纖維化形成減少。

結論.在本實例中,使用裸小鼠移植模型研究人類脂肪移植物的功效和存活率。泊洛
沙姆P188,一種非離子性表面活性劑,使脂肪移植物吸收明顯減少并且改善細胞存活率。
相比之下,用葡聚糖(一種分子量相當的對照物)處理得到與生理鹽水類似的結果。使
用P188可修復和保護脂肪移植物,改善細胞存活率并減少脂肪移植物吸收。

實例2:在脂肪移植中P188與其它試劑的比較

引言

外傷、先天性缺陷、感染和腫瘤切除繼發的軟組織損傷和畸形是造成患者顯著發病
的原因。目前,自體游離皮瓣重建或局部推進皮瓣是重大軟組織和骨缺損重建模態的主
要工具。盡管帶蒂皮瓣和游離皮瓣重建提供了進行重建的有力工具,但其有可能引起嚴
重副作用和供體部位發病。轉移大量自體脂肪組織重建這些缺損的能力將為約數百萬患
者提供一個新穎的重建選擇,同時不會伴隨供體部位發病。此外,還為供體部位選擇較
少的患者以及不能耐受進行皮瓣重建所需的長時間手術的患者提供一個有利工具。

使用抽脂的脂肪具有兩個優點:1)最少的供體部位發病,由此提供一個安全且易
于獲得的自體細胞來源;和2)這些程序相對易于進行,同時不會出現缺血并發癥以及
與血管化游離皮瓣有關的早期移植失敗的問題。然而,到目前為止,游離脂肪移植物受
到不可預測的再吸收水平和由此引起的不規則性問題的困擾。游離脂肪移植失敗和體積
減小似乎與采集時產生的機械應力、早期缺血性改變以及營養缺失有關。這些應激子導
致細胞凋亡。接下來,在再血管化后去除死亡細胞的碎片將引起移植物再吸收。

迄今為止,有關在建立充足的血管分布之前減少初始缺血損傷和保護細胞的嘗試已
經取得了適度的成果。再吸收是長期脂肪移植物存活和較大軟組織創口重建工作的主要
障礙。為此,人們已經深入研究了包括聚合物在內的膜穩定劑。在實驗室中已經顯示,
這些聚合物中有一些可以減少凋亡細胞的死亡,由此隨時間產生大量脂肪移植物。這些
聚合物的混合物可提供一個細胞復蘇方案,這一方案將產生可預測且持久的游離脂肪移
植。

P188是一種三嵌段聚合物,其中央聚氧丙烯疏水區(POP單元,參看圖1A)跨接
兩個較長的聚氧乙烯親水性尾(POE單元,參看圖1B)。相信機械外傷和缺血性應力會
導致正常脂肪細胞的細胞膜破裂。這一破裂首先表現為孔隙度增加,并且使正常膜離子
梯度喪失。已知膜電性完整性的喪失是細胞凋亡級聯的有效活化因素。接著細胞經歷程
序性細胞死亡,并以脂質液滴集合的形式保留在移植物中,隨后被再吸收,導致移植物
體積減小。因此,P188能夠插入受損的脂肪細胞膜中,從而使膜穩定(參看圖2)。此
外,已知P188因具有高度水合的POE尾,而能夠降低膜粘度。所述POE尾通過降低細
胞粘度而使受損細胞變得更易溶解,由此降低受損膜上的張力。

已經證實,泊洛沙姆P188在修復受損的膜以及改善受損脂肪細胞的活力和存活率
方面特別有效。這一修復機制的可能構造在圖2中予以說明。受損細胞膜的一部分中央
脂質層可能暴露于周圍環境。附近P188鏈的中央疏水性部分可與這一疏水性脂質層相
互作用,并且P188鏈可“折疊”,從而使這條鏈的親水端沿細胞膜的外部親水性表面
定位。這一密封/修復過程類似于常見的汽車輪胎膠塞修補,在輪胎修補過程中,將柔性
橡膠塞的中央塞入輪胎的小孔中以使其密封,而橡膠塞的末端沿外胎面定位。多個P188
鏈可聚集起來,幫助密封具有不同尺寸受損區域的受損膜。

除抽脂細胞凋亡模型外,研究已在電穿孔模型[李(Lee)等人,體內電滲透化骨骼
肌膜的表面活性劑誘導密封(Surfactant-induced?sealing?of?electropermeabilized?skeletal?
muscle?membranes?in?vivo).美國國家科學院院刊(Proc?Natl?Acad?Sci?USA),1992.
89(10):4524-8;以引用的方式并入本文中]和電離輻射模型[漢尼格(Hannig)等人,電離
輻射滲透化膜的表面活性劑密封(Surfactant?sealing?of?membranes?permeabilized?by?
ionizing?radiation).輻射研究(Radiat?Res),2000.154(2):171-7;以引用的方式并入本
文中]二者中證實這一細胞膜補救方法。此外,研究鈍性外傷后神經元損傷的新研究顯示,
用P188進行膜保護可通過提供機械膜穩定作用來使剪切傷(sheer?injury)早期的細胞復
蘇[馬克(Marks)等人,兩親三嵌段共聚物提供有效的膜靶向神經保護(Amphiphilic,
tri-block?copolymers?provide?potent?membrane-targeted?neuroprotection).FASEB雜志
(FASEB?J),2001.15(6):1107-9;塞斯特G.(Serbest,G.),J.霍維茲(J.Horwitz)和K.
巴比(K.Barbee),泊洛沙姆188對神經元細胞機械損傷恢復的影響(The?effect?of?
poloxamer-188?on?neuronal?cell?recovery?from?mechanical?injury).神經外傷雜志(J?
Neurotrauma),2005.22(1):119-32;塞斯特等人,機械外傷后的細胞死亡和泊洛沙姆188
神經保護機制(Mechanisms?of?cell?death?and?neuroprotection?by?poloxamer?188?after?
mechanical?trauma).FASEB雜志,2006.20(2):308-10;各以引用的方式并入本文中]。與
本發明研究類似,這項研究顯示損傷后細胞凋亡減少且細胞活力增加。有趣的是,在這
項研究中,與未經處理過的受損細胞相比較,經處理細胞同樣看起來更像是未受損的,
即原始神經元。

在本實例中,描述了在圍移植期(從采集到穩定移入的時間),P188對于拯救受損
的脂肪細胞的功效。此外,還證實,尺寸和結構與P188密切相關的聚合物具有類似的
作用,但不如P188有效。

方法

細胞凋亡鑒別.使用免疫化學細胞凋亡特異性熒光標記FLIVOTM和MT?MitoTM來鑒
別脂肪細胞中的細胞凋亡情況。外植脂肪移植物,在38℃下用Blendzyme(羅氏應用科
學公司(Roche?Applied?Science)Liberase?Blendzyme?3)處理20分鐘,并使其通過100
微米的細胞粗濾器(用以去除消化后殘留的細胞外基質成分)。隨后,在標記后,于38℃
下培育這些細胞1小時,并洗滌1次。接著,將這些細胞放入96孔黑色板中,并在讀
板器上,在其染料特異性發射和激發波長(FLIVO-紅激發波長565/發射波長>590;
MITO-PT激發波長488/發射波長綠色530,紅色590)下讀取。

PICO綠色.使用購自英杰公司(Invitrogen)的Quant-iT?PicoGreendsDNA分析試
劑盒作為細胞計數的代用品,來定量DNA。在38℃下,在1.0cc?Blendzyme中消化每一
外植的小葉30分鐘。接著,利用含有1.0cc?FBS的細胞培養基停止Blendzyme反應。
為進行定量,取出75微升消化的脂肪,并使用Qiagen?Mini-prep離心吸附柱分離試劑盒
加工。隨后,根據試劑盒方案,將提取的DNA樣品與試劑A(PicoGreen熒光團)、B
(Tris緩沖液)和對于標準品用組分C(λdsDNA標準品,100μg/ml濃度)一起培育。
接著使用黑色96孔板,在讀板器上讀取這些樣品。

脂肪加工.從手術室直接獲取脂肪抽出物。將其分成數等分30cc試樣,并用等體積
生理鹽水洗滌1次,以去除血液和細胞碎片。隨后,在200G下離心管,并分離中間層,
且用各種試劑處理。在37℃下,在含有30cc脂肪的30cc洗滌液中處理這些試劑30分
鐘。選擇這種培育方法使缺血時間最少,同時允許與處理劑充分混合。培育和洗滌后,
再在200G下離心脂肪。再分離中間脂肪層,并放入1.0cc?1.0g等分試樣中,以便注射
到裸小鼠的肋腹中。這是依據批準使用除去鑒別(de-identified)的丟棄的組織的內部評
級法(IRB)進行。應注意,采集套管和采集壓力隨病例和外科醫師不同而不同。在從
手術室收集到脂肪的2小時內,將脂肪移入動物體內,以便使熱缺血時間減到最少。

實驗模型.將1.0cc/1.0g(+/-0.01gm)脂肪移植物植入裸小鼠的單一小葉中。用14
號血管導管對這些小鼠進行注射,以模擬臨床上相關的1cc注射。將兩個小葉植入本研
究中所用每一裸小鼠的兩側肋腹中。選擇14號血管導管以使注射期間脂肪移植物外傷
減到最少。許多臨床醫生目前使用16號和14號導管進行脂肪移植,因此使用這種尺寸
的導管接近臨床實踐。

最初,每天外植小葉,并測量重量和細胞凋亡活性。產生早期曲線后,在第3、第
6和第9天外植小葉,以初步測量細胞凋亡水平。此外,對這些樣品稱重,送交組織學
檢測,并測量DNA含量。將前10天的終點與6周時的終點相比較,以確定早期細胞凋
亡和細胞死亡是否能準確預測移植物性能。

每一實驗都由早期小鼠組和晚期小鼠組組成。每一組都在某一天注射來自某一患者
的相同脂肪。對于早期時間點,在每一取樣日,對每一組的兩只動物實行安樂死(每一
早期時間點n=4個小葉)。此外,接著在6周時對這些相同組的動物實行安樂死,以檢
查晚期終點(對于晚期時間點的每一組,使用8只動物產生的16個小葉)。一旦對動物
實行安樂死,就收集兩個小葉進行分析,并將動物從研究中去除。

測試的試劑.在本研究中,測試一系列各種試劑。具體點說,選擇多種聚合物來研究
不同普流尼克亞單位鏈長度和構造的作用。

普流尼克.測試多種尺寸、不同PEG組成(親水性)和嵌段構造的普流尼克。這些
普流尼克是市面上銷售最廣泛的非工業應用的泊洛沙姆。其測試劑量都為50μM的25cc
生理鹽水溶液。所檢查的試劑為P188(約8,000KDa/80%PEG含量)、F38(4,700KDa/80%
PEG含量)、F108(14,600KDa/80%PEG含量)、F127(12,600KDa/70%PEG含量)、
L64(2,900KDa/40%PEG含量)、T1107(70%PEG,較長的四嵌段泊洛沙姆)和P31R1
(3250KDa,逆嵌段次序)。還對二嵌段(PEG嵌段-聚己內酯嵌段)進行測試。

非普流尼克表面活性劑

非離子性.測試摩爾濃度與P188相同(50μM的25cc生理鹽水溶液)聚山梨醇酯
80(吐溫80(Tween?80)),這是一種具有長疏水性尾(油酸)和親水性頭(聚乙氧基脫
水山梨糖醇)的聚合物。也測試相同摩爾濃度的膽固醇。

陽離子性與陰離子性.測試50μM非普流尼克型帶電表面活性劑溴化十六碳烷基三
甲銨(Hexadecyltrimethylammonium?bromide,HCTA;陽離子性)和氯化鯨蠟基三甲銨
(cetyltrimethylammonium?chloride,CTA;陰離子性)的25cc生理鹽水溶液。這些分子
的尺寸在約360KDa范圍內,并具有短疏水性鏈和帶電銨鹽頭。

兩性離子.測試某些正常細胞膜中存在的磷脂酰膽堿(Phosphatidylcholine,PC;790
kDa),一種兩性離子表面活性劑。兩性離子表面活性劑可視pH值而具有帶電或不帶電
性。

聚乙二醇(PEG).測試10mg/ml的PEG?8000,因為其分子量與P188相同。此外,
如有關細胞保存應用中軟骨細胞膜保護的文獻中所公開,單獨測試PEG?600和PEG?3350
以及其組合,分別為1.3%和1.5%。PEG后的數字表示其分子量。PEG是泊洛沙姆的一
種組分,并且完全為親水性的。

添加劑.測試用于P188的數種添加劑。測試濃度為10%到1%的維生素C,測試每
100mg/kg脂肪500mM的硫辛酸(大鼠缺血再灌注模型中所用劑量)、白藜蘆醇(50μM
的25cc生理鹽水溶液)、果聚糖(經顯示可保護經受廣泛溫度變化的植物膜的有機分
子)。還檢查環孢霉素(cyclosporine,CsA)(有效的免疫抑制藥物)。

統計學.使用ANOVA或學生T檢驗分析樣品以測定各組之間的統計學顯著性。顯著
性設置在95%的置信區間,P<0.05視為統計學顯著的。

結果

電子顯微鏡檢術.將來自新鮮脂肪抽出物的脂肪細胞固定,并在透射型電子顯微鏡下
研究。檢查這些樣品中由抽脂采集引起的膜損傷的存在。采集后立即在電子顯微鏡下檢
查,注意到完整脂肪細胞的膜中具有小孔。所注意到的這些小孔在30到600nm的范圍
內(參看圖3)。還注意到這些小孔與脂肪細胞線粒體非常接近。

細胞凋亡

共聚焦顯微鏡檢術.將來自早期實驗的樣品外植用于共聚焦顯微鏡檢查。利用
Blendzyme消化這些小葉,并用細胞凋亡特異性標記FLIVO-紅標記;培育后,將這些細
胞固定于4%三聚甲醛中,并在共聚焦顯微鏡下檢查以定量評估細胞凋亡水平。當使用
FLIVO-紅SR(激發波長560nm且發射波長590nm)觀察脂肪細胞時,注意到處理組
與未處理組之間存在顯著差異(參看圖6)。生理鹽水處理樣品在整個細胞膜中顯示較大
的紅色凋亡小泡。相比之下,第6天時,經P188處理過的樣品顯示出相對較少的紅色
凋亡小泡。

細胞凋亡定量.最初,每天外植小葉,并使用Mito-PT測量細胞凋亡水平。每日測試
后,注意到在第5天到第7天之間出現細胞凋亡峰值水平,隨后細胞凋亡水平回落。這
些值大致符合鐘形曲線。一旦確定了這一曲線,隨后在第0天、第3天、第6天和第9
天測試樣品,以進行早期細胞凋亡取樣(參見圖7)。

當使用細胞凋亡特異性標記,來比較P188與生理鹽水處理過的對照組時,在第6
天時注意到細胞凋亡事件統計學顯著減少。假定各樣品之間無差異,使用學生t檢驗,
這一差異顯示p值為0.03。第6天,生理鹽水(NS)顯示41,000相對熒光單位(relative?
fluorescence?units,RFU),而P188為24,000RFU(對于NS,平均值的標準誤差+/-5,720
RFU;對于P188,+/-4485RFU)。這表示當與生理鹽水處理對照組相比較時,經P188
處理過的脂肪移植物中細胞凋亡事件平均減少40%。

還比較P188與數種其它治療劑對細胞凋亡水平的影響(參看圖8)。當將P188與以
HCTA和CTA為代表的陰離子性和陽離子性聚合物相比較時,其顯示細胞凋亡水平顯著
減少(第6天:HCTA?41,037RFU,CTA?35,338RFU且P188?32,158RFU)。此外,在較
早時間點時,HCTA和CTA顯示的細胞凋亡水平比生理鹽水對照組高(第3天:NS?25,987
RFU對HCTA?31,076RFU、CTA?35,338RFU)。這些結果與利用陰離子性和陽離子性聚
合物使早期細胞死亡和總體脂肪移植物毒性增加相符。

接下來,將P188與倒轉的三嵌段共聚物P31R1相比較。這一聚合物的尺寸與P188
大致相同;但其是由疏水性尾和親水性核心構成(與P188相反)。當將經P31R1處理過
的脂肪與P188處理組和生理鹽水處理過的對照組相比較時,在第3天、第6天和第9
天時也發現P31R1使細胞凋亡事件增加(分別為第3天34,000RFU,第6天44,000RFU
和47,000RFU對NS:8000RFU、57,000RFU和11,000RFU,以及P188:8,000RFU、
16,000RFU和10,000RFU)。在這一相同實驗中,評價磷脂酰膽堿(非離子性表面活性
磷脂并且是許多細胞膜的組分)對細胞凋亡的影響。與P188相比較,磷脂酰膽堿也使
細胞凋亡水平升高。與生理鹽水相比較,磷脂酰膽堿不顯示細胞凋亡增加(PC第3天:
52,000RFU,第6天:29,000RFU,參看圖8,右上圖)。應注意,還測試了免疫抑制
劑環孢霉素(CsA)的細胞凋亡活性。CsA也無法使脂肪移植物中的細胞凋亡水平降低。
在第1天到第9天,當與生理鹽水處理對照組相比較時,CsA顯示始終較高的細胞凋亡
水平。P31R1和CsA似乎對脂肪移植物有毒,且當與生理鹽水相比較時,PC可顯示細
胞凋亡略有降低,但不如P188。

P188也與聚乙二醇8000(PEG?8000)和四嵌段共聚物T1107相比較。在這一系列
實驗中,使用較老的細胞凋亡分析方法(MitoPt對Apo-one)。較老的MitoPT分析方法
得到的RFU值約是Apo-One法的1/10。當與P188相比較時,P188再次顯示細胞凋亡
減少(參看圖8,左下圖)。當P188與具有類似尺寸和構造的聚合物的組合相比較時,
這些組合也無法進一步改善細胞凋亡水平。當與單獨P188和生理鹽水處理對照組相比
較時,P188、F127與L64的組合顯示較高的細胞凋亡水平。這些研究結果表明,利用
PEG?8000、T1107以及聚合物P188、F127與L64的組合具有早期毒性。

此外,還研究P188與硫辛酸以及與維生素C對細胞凋亡的影響。P188與維生素C
的組合顯示細胞凋亡增加;但單獨維生素C也產生較高細胞凋亡水平(參看圖8,左下
圖)。當與單獨維生素C相比較時,P188與維生素C的組合顯示細胞凋亡減少。當與生
理鹽水處理對照組相比較時,P188與硫辛酸的組合顯示細胞凋亡減少(這些實驗也使用
亮度較低的Mito-PT標記,參看圖9)。

重量

早期階段.在前10天實驗期間,研究脂肪小葉的重量變化。注意到,在植入后立即
測量,在這一階段期間,所有組的重量都損失20%到25%。在最初24小時中,這些研
究得到以重量計總共23.6%再吸收,且平均重量為0.75g(+/-0.8g)。在第1天出現這
一重量損失后,沒有鑒別出顯著差異,且在前10天中,各處理組之間的重量具有極小
變化(參看圖10)。

P188.6周時,P188與生理鹽水相比較,顯示重量的統計學顯著的改善。6周時,在
分析的每一組65個小葉中,經P188處理過的移植物顯示平均重量為0.70g,與生理鹽
水處理移植物的0.64g形成比較,其中標準偏差分別為0.08g和0.12g(參看圖11)。
此外,在早期取樣期結束時,比較再吸收百分比與脫水移植物重量,P188相比對照組顯
示出50%的再吸收減少(參看圖12)。

其它普流尼克聚合物.當與其它普流尼克相比較時,6周時的重量如下:F127:0.74+/-
0.07g;L64:0.68+/-0.06g;F38:0.61+/-0.22g;F108:0.76+/-0.10g;T1107:0.62
+/-0.15g;P31R1:0.74+/-0.05g;二嵌段:0.44+/-0.16g;吐溫80:0.30+/-0.12g。
再吸收百分比顯示于圖13中。

聚乙二醇.當與PEG?600、PEG?3350、PEG?8000和PEG?600+3350相比較時,P188
顯示重量的統計學顯著改善。6周時,經PEG?600處理過的樣品重量為平均0.64+/-0.11
g(生理鹽水為0.64+/-0.12g),PEG?3350重0.58+/-0.21g,PEG?8000重0.53+/-0.06g,
且PEG?600+3350混合物重0.58+/-0.22g。再吸收百分比顯示于圖13中。

硫辛酸.在本研究中,平均10天重量為生理鹽水0.76g+/-0.09g;P188?0.76g+/-0.09
g;且硫辛酸0.72g+/-0.09g(1.0g+/-0.10g初始植入物)。隨后在6周時再檢查處理
組;此處注意到重量的顯著差異。6周時,每組平均重量為生理鹽水0.58+/-0.07g;P188?
0.71+/-0.06g;硫辛酸0.65+/-0.09g;且P188+LA?0.61+/-0.16g。在比較早期與晚期改
變時,使用在前10天內樣品的脫水重量比6周最終重量計算再吸收百分比。與生理鹽
水相比較,P188和硫辛酸顯示再吸收的統計學顯著差異(p值<0.05)(參看圖19)。

各種添加劑.當在P188下,測試其它試劑的潛在附加作用時,6周時的重量如下:
白藜蘆醇:0.73+/-0.03g;膽固醇:0.73+/-0.04g;胰島素:0.47+/-0.21g;果寡糖
(oligofructosaccharide):0.72+/-0.08g(在這一組實驗中,生理鹽水表現良好,其中平
均重量為0.74+/-0.04g)。在實驗中,這些試劑的表現不如生理鹽水對照組,且根據組
織結構(參看下文)發現,其通常為有毒的。

細胞活力

利用Cell-Titer?Blue分析6周時采集的樣品,Cell-Titer?Blue是一種濃縮藍色染料,
其在活的代謝活性細胞中轉化成發紅色熒光的染料。染料轉化顯示代謝活性,并與樣品
中的細胞數量相關。在6周后,當將P188與各種鏈長度的其它普流尼克相比較時,其
顯示信號的統計學顯著增加(參看圖14)。P188顯示12,971+/-2785RFU,而生理鹽水
對照組顯示4727+/-768RFU。其余聚合物如下:F127:4301+/-2785RFU;F108:3529
+/-373RFU;F38:3188+/-346RFU;L64:6137+/-1933RFU;T1107:5063+/-1496RFU;
吐溫80:4346+/-1231RFU。也分析二嵌段共聚物(聚乙二醇甲基醚嵌段聚己內酯)和
倒轉的三嵌段普流尼克(P31R1)。這些聚合物也劣于P188:二嵌段:1,666+/-1283RFU;
P31R1:1453+/-703RFU。

在本模型中,再針對細胞活力比較P188與各種尺寸的聚乙二醇(PEG),這些聚乙
二醇在其它研究中顯示出保護軟骨細胞的作用。6周時,P188又顯示出優良的細胞活力
(參看圖15)。PEG顯示出以下細胞活力信號:PEG?600:2892+/-1110RFU;PEG?3350:
1109+/-301RFU;PEG?600+3350:1291+/-289RFU(參看圖15)。

DNA含量

分析外植樣品的DNA含量,作為細胞計數的間接量度。在早期和晚期時間點時,
研究消化的樣品。與重量測量值類似,在前10天中各樣品之間的DNA含量不存在顯著
差異。

P188對生理鹽水對照組.在6周時,針對DNA含量比較P188與生理鹽水對照組,
結果如下:生理鹽水對照組:0.129+/-0.052μg?DNA;P188:0.320+/-0.060μg?DNA。
利用學生t檢驗發現,這些結果為統計學上顯著的,P=0.03。

普流尼克.接著,當將P188與其它普流尼克相比較時,注意到P188與其它聚合物之
間的統計學顯著差異(ANOVA分析p=0.0004,F臨界=2.299)。DNA含量如下:F127:
0.236+/-0.043μg?DNA;F108:0.082+/-0.033μg?DNA;F38:0.025+/-0.007μg?DNA;
L64:0.168+/-0.062mcg?DNA;T1107:0.124+/-0.048μg?DNA;吐溫80:0.134+/-0.023
μg?DNA。

PEGs.當針對DNA含量檢查PEGs時,PEG?8000顯示0.280+/-0.024μg?DNA。同樣
檢查PEG?600、PEG?3350和PEG?600+3350。

組織學

將外植的脂肪小葉固定,并使用H&E染色以對脂肪組織架構進行評分。與生理鹽
水處理對照組相比較,在經P188處理過的樣品中注意到正常脂肪含量統計學顯著改善。
當針對正常脂肪、炎性浸潤和纖維化進行評分時,P188的得分為:平均起來,58%正常
脂肪、30%浸潤和13%纖維化(10個小葉,每個小葉2個載片)。生理鹽水對照組得分
為:平均起來,41%正常脂肪、38%浸潤和21%纖維化(10個小葉,每個小葉2個載片)。
當進行學生t檢驗時,P=0.04。

其它普流尼克.在其它泊洛沙姆中,L64和F127得分最佳:L64:65%正常脂肪、31%
浸潤和4%纖維化;F127:52%正常脂肪、38%浸潤和10%纖維化。當與P188相比較時,
這些差異未達到統計學顯著性。其余泊洛沙姆得分如下:F38:45%正常脂肪、44%浸潤、
11%纖維化;F108:50%正常脂肪、42%浸潤、7%纖維化;T1107:15%正常脂肪、41%
浸潤、43%纖維化;吐溫80:17%正常脂肪、67%浸潤、16%纖維化(參看圖18,右圖)。

聚乙二醇.用PEG處理過的脂肪移植物顯示較高的炎性浸潤水平和破壞的脂肪組織
架構。PEG?8000得分為:42%正常脂肪、45%浸潤、14%纖維化。

硫辛酸.同樣檢查P188加硫辛酸(PLA)并進行評分。PLA得分為:90%正常脂肪、
9%浸潤、1%纖維化(n=2)。

各種添加劑.檢查的所有剩余添加劑顯示毒性以及重度纖維化和炎性浸潤。

討論

P188是一種三嵌段聚合物,其中央聚氧丙烯疏水區(POP單元,參看圖1)跨接兩
個較長的聚氧乙烯親水性尾(POE單元)。相信機械外傷和缺血性應力會導致正常脂肪
細胞的細胞膜破裂。這一破裂首先表現為孔隙度增加,并且使正常膜離子梯度喪失。已
知膜電性完整性的喪失是細胞凋亡級聯的有效活化因素。經歷程序性細胞死亡的細胞在
移植物中呈脂質液滴集合的形式。隨后,這些液滴被再吸收,導致移植物體積減小。三
嵌段共聚物能夠將自身插入損傷的脂肪細胞膜中,由此使膜穩定。此外,還已知三嵌段
共聚物因具有高度水合的POE尾,而能夠降低膜粘度。細胞粘度降低將使損傷的細胞變
得更易溶解,由此降低損傷膜上的張力。

經顯示,P188在脂肪組織中具有弱溶解性,并且其不會被充分吸附到未受損的完整
細胞膜上。P188使經受采集過程引起的機械切變損傷的脂肪細胞保持其正常的膜力學。
一旦這些細胞能夠通過增加雙層中磷脂的量來修復其細胞膜,P188就被機械擠出[艾格
瓦J.(Agarwal,J.),A.瓦爾希(A.Walsh)和R.C.李(R.C.Lee),使受損細胞復蘇的多
模式策略(Multimodal?strategies?for?resuscitating?injured?cells).紐約科學院年報(Ann?N?
Y?Acad?Sci),2005.1066:295-309]。通過增加跨膜表面壓力,可擠出P188。還應注意到,
P188似乎接著基本上不變地被腎排出,其中少量是經由膽腸系統排出。相信沒有證據證
實這些劑量的P188會對人類使用帶來不利影響或安全性問題[辛格-喬伊S.D.(Singh-Joy,
S.D.)和V.C麥克萊恩(V.C.McLain),泊洛沙姆101、105、108、122、123、124、181、
182、183、184、185、188、212、215、217、231、234、235、237、238、282、284、
288、331、333、334、335、338、401、402、403和407、泊洛沙姆105苯甲酸酯和泊
洛沙姆182二苯甲酸酯當用于美容中時的安全性評估(Safety?assessment?of?poloxamers?
101,105,108,122,123,124,181,182,183,184,185,188,212,215,217,231,234,235,
237,238,282,284,288,331,333,334,335,338,401,402,403,and?407,poloxamer?105?
benzoate,and?poloxamer?182?dibenzoate?as?used?in?cosmetics).國際毒理學雜志(Int.J.
Toxicol.),2008.27增刊2:93-128]。

另外,在用于評價P188安全性的毒理學分析中,對狗靜脈內投予多達50mg/kg劑
量P188,并分析這些狗的器官中的P188[辛格-喬伊S.D.(Singh-Joy,S.D.)和V.C麥克
萊恩(V.C.McLain),泊洛沙姆101、105、108、122、123、124、181、182、183、184、
185、188、212、215、217、231、234、235、237、238、282、284、288、331、333、
334、335、338、401、402、403和407、泊洛沙姆105苯甲酸酯和泊洛沙姆182二苯甲
酸酯當用于美容中時的安全性評估(Safety?assessment?of?poloxamers?101,105,108,122,
123,124,181,182,183,184,185,188,212,215,217,231,234,235,237,238,282,284,
288,331,333,334,335,338,401,402,403,and?407,poloxamer?105?benzoate,and?
poloxamer?182?dibenzoate?as?used?in?cosmetics).國際毒理學雜志(Int?J?Toxicol.),2008.
27增刊2:93-128]。在這些實驗中,看起來P188不溶于脂肪組織中,并且在脂肪組織中
幾乎注意不到放射性標記的P188。這進一步支持了所提出的作用機制,即,P188被吸
附于受損的脂肪細胞膜上,而不是進入脂肪細胞中。此外,還有許多研究表明,一旦這
些細胞膜自密封,并且表面壓力增加,P188就會從細胞膜中擠出[吳(Wu)等人,脂質
單層與泊洛沙姆188之間的相互作用:X射線反射和衍射研究(Interaction?between?lipid?
monolayers?and?poloxamer?188:an?X-ray?reflectivity?and?diffraction?study).生物物理學雜
志(Biophys?J),2005.89(5):3159-73;張Z.(Zhang,Z.),M.al-雷拜(M.al-Rubeai)和
C.R.托馬斯(C.R.Thomas),普流尼克F-68對哺乳動物細胞機械特性的影響(Effect?of?
Pluronic?F-68?on?the?mechanical?properties?of?mammalian?cells).酶與微生物技術
(Enzyme?Microb?Technol),1992.14(12):980-3;馬斯卡尼(Maskarinec)等人,泊洛沙姆
188插入脂質單層中的直接觀察結果(Direct?observation?of?poloxamer?188?insertion?into?
lipid?monolayers).生物物理學雜志,2002.82(3):1453-9;艾格瓦爾J.(Agarwal,J.),A.
瓦爾希(A.Walsh)和R.C.李(R.C.Lee),使受損細胞復蘇的多模式策略(Multimodal?
strategies?for?resuscitating?injured?cells).紐約科學院年報(Ann?N?Y?Acad?Sci),2005.
1066:295-309;各以引用的方式并入本文中]。

這種防止離子喪失和防止受損細胞進展到細胞凋亡階段的能力使脂肪細胞能保持
其充當軟組織填充物的能力。如果不使細胞膜穩定,則這些細胞會滲漏離子,并最終死
亡[漢尼格(Hannig)等人,表面活性劑密封電離輻射滲透的膜(Surfactant?sealing?of?
membranes?per?meabilized?by?ionizing?radiation).輻射研究(Radiat?Res),2000.154(2):
171-7;塞斯特(Serbest)等人,機械外傷后泊洛沙姆188的細胞死亡和神經保護機制
(Mechanisms?of?cell?death?and?neuroprotection?by?poloxamer?188?after?mechanical?trauma).
FASEB雜志(FASEB?J),2006.20(2):308-10;米娜(Mina)等人,泊洛沙姆188共聚物
膜密封劑在體外拯救淀粉樣寡聚物的毒性(Poloxamer?188?copolymer?membrane?sealant?
rescues?toxicity?of?amyloid?oligomers?in?vitro).分子生物學雜志(J?Mol?Biol),2009.
391(3):577-85;各以引用的方式并入本文中]。結果,脂肪移植物以不可預測的速率再吸
收。游離脂肪移植中這一固有的不可預測性將降低脂肪移植物在軟組織重建和填充中的
效用[寇勒曼(Coleman),結構性脂肪移植物:理想的填充物?(Structural?fat?grafts:the?
ideal?filler?)整形外科臨床(Clin?Plast?Surg),2001.28(1):111-9;格托瓦斯基(Gutowski),
當前自體脂肪移植物的應用和安全性:ASPS脂肪移植專題研究小組的報告(Current?
applications?and?safety?of?autologous?fat?grafts:a?report?of?the?ASPS?fat?graft?task?force).
整形外科(Plast?Reconstr?Surg),2009.124(1):272-80;各以引用的方式并入本文中]。

當與其它脂肪移植組相比較時,經P188處理過的脂肪移植物看起來像非移植的正
常脂肪。這最好由6周時的組織結構證實,其中經P188處理過的脂肪組織看起來最像
原生脂肪(并且通過Cell-Titer?Blue和噻唑藍溴化四唑(thiazolyl?blue?tetrazolium?bromide,
MTT)發現,其顯示高細胞活力)。如由大量纖維化所證實,生理鹽水處理過的脂肪組
織看起來有損傷。PEG(P188的一種組分且借助其它分析法顯示其有效保護某些細胞類
型)和四嵌段共聚物(類似于P188,具有親水性極強的尾)導致炎性浸潤和重度到中等
水平的纖維化。

在圍移植期機械防護脂肪細胞的能力將使脂肪移植物在組織學和生物化學分析中
看起來像正常脂肪。另一方面,未處理過的對照脂肪移植物變得纖維化,且其正常脂肪
組織架構變松散(參看圖17)。在用神經元進行的類似研究中,顯示在細胞受到機械損
傷后,經P188處理過的細胞表現得更像未受損的神經元[馬克(Marks)等人,兩親三嵌
段共聚物提供有效的膜靶向神經保護(Amphiphilic,tri-block?copolymers?provide?potent?
membrane-targeted?neuroprotection).FASEB雜志(FASEB?J),2001.15(6):1107-9;塞斯
特G.(Serbest,G.),J.霍維茲(J.Horwitz)和K.巴比(K.Barbee),泊洛沙姆188對神
經元細胞機械損傷恢復的影響(The?effect?of?poloxamer-188?on?neuronal?cell?recovery?from?
mechanical?injury).神經外傷雜志(J?Neurotrauma),2005.22(1):119-32;各以引用的
方式并入本文中]。基本上,機械膜穩定化會保護神經元信號傳導和軸突功能,而且不會
對細胞正常功能造成生理性改變。

如由實驗數據所證實,與經生理鹽水洗滌的細胞相比較,經P188處理過的脂肪移
植物在很大程度上保留了其初始重量、細胞功能(借助代謝活性、ATP水平等評估)和
正常架構。這表明在移植期間,細胞得到保護,使得其在新的位置中起到正常脂肪細胞
的作用。具體點說,當與生理鹽水處理對照組相比較時,P188在6周時顯示重量的統計
學顯著增加,而這與再吸收降低50%相關(n=170,P=0.03)。此外,P188在前10天里
顯示細胞凋亡事件的統計學顯著減少,在6周時顯示細胞活力的顯著增加,在6周時顯
示DNA含量的顯著增加且在6周時由組織結構所示的正常脂肪的統計學顯著增加。

當將P188與其它普流尼克相比較時,其也顯示優良的結果。在本研究中研究的其
它兩種聚合物的表現類似于P188,但總體上仍劣于P188。這些聚合物為L64和F127。
L64在室溫下呈液態,分子量為2900kDa,由40%PEG和60%POE構成。F127是P407,
因此F127為12600kDa,且具有70%PEG含量。這兩種試劑都顯示與P188類似的再吸
收特征(參看圖13),以及改善的細胞活力(L64對生理鹽水,參看圖14;F127傾向于
高于生理鹽水,但平均起來與對照組類似),當與生理鹽水對照組相比較時其不存在統
計學顯著性。此外,當與生理鹽水對照組相比較時,L64和F127顯示DNA含量的某種
改善(接近但當前n值不顯著),但仍劣于經P188處理過的樣品(參看圖16)。當通過
組織學方法檢查時,針對正常脂肪、纖維化和浸潤的存在對這些試劑進行評分,表現接
近P188。然而,由于顯示出較低細胞活力和較低DNA含量,故這些移植物仍劣于P188。
這些移植物具有總體較少的脂肪細胞計數,盡管根據組織結構,其相對比較健康,并且
具有與P188類似的重量。

這些聚合物顯示不同三嵌段共聚物的尺寸范圍和不同三嵌段共聚物對膜密封特性
的影響。L64較小(2900kDa)且疏水性較強;F127較大(約13,000kDa)且親水性較
強。P188在這兩種試劑中間,重量為約8000kDa,且具有80%PEG含量。因此,其具
有比F127長的親水性尾和略微較短的疏水區。L64是較輕的分子,具有較短的PEG鏈。
疏水區對于在膜小孔暴露的疏水區處膜密封活性至關重要。然而,一旦將分子放到暴露
的小孔中,親水鏈就可能提供額外的保護。這些鏈通過增加表面溶解性來幫助降低膜張
力(參看圖2)。

當將P188與泊洛沙姆F38和F108(P98和P308)相比較時,這些試劑顯示較強的
再吸收、較低的細胞活力和較低的DNA含量。盡管這些試劑都具有80%PEG,但其尺
寸差異極大。F38的重量是P188的一半,但保持相同的PEG含量。這樣就保持了疏水
性與親水性比,以致F38盡管較小,但仍具有與P188相同的PEG(親水性)含量。F108
為約15,000kDa,且因此較大,但仍具有相同的親水性組成。因此,鏈長度的兩種變化
都實現在脂肪細胞中的膜密封作用。通過組織結構發現,與P188和生理鹽水對照組相
比較,這些試劑都誘導較高的損傷水平。對于F108,鏈長度增加可導致較高的膜溶解,
最終產生清潔劑作用(細胞膜溶解),而F38則可能太小。盡管L64甚至更小,但其疏
水含量較高,可能使其聚集在敞開的小孔中。

在親水性含量較高的泊洛沙姆中觀察到的這一膜溶解作用轉化成在用純PEG處理
過的脂肪移植物中觀察到的結果。測試PEG?600、3350和8000。這些PEG代表著PEG
重量范圍(例如PEG?600=600kDa聚乙二醇)。在先前的研究中顯示,PEG?600與3350
的混合物可保護冷凍的軟骨細胞。美國專利申請公開案US2009/0017438。在本研究中,
脂肪細胞看起來比軟骨細胞更易受到清潔劑作用影響。當與P188和生理鹽水對照組相
比較時,所有PEG處理組(和多種PEG的組合)都顯示出較差的結果。PEG?3350和
PEG?8000顯示比生理鹽水處理對照組高的再吸收(參看圖13)和較低的細胞活力(參
看圖15)。另外,根據組織結構發現,這一樣品顯示嚴重的浸潤和受損的脂肪組織架構。
PEG?600是毒性最小的。其顯示與生理鹽水對照組類似的再吸收(以重量計)和類似的
細胞活力(參看圖13和15)。因此,在軟骨細胞保護中所述的劑量下,PEG?600可能太
小而無法產生有毒作用。較大的PEG?3350和PEG?8000缺乏如三嵌段共聚物那樣的疏水
區,并且可能溶解細胞膜,導致細胞溶解。

當分析其它共聚物,即二嵌段共聚物、倒轉的三嵌段共聚物(例如P31R1)和四嵌
段共聚物(例如T1107)時,這些聚合物也顯示細胞毒性(二嵌段和倒轉的三嵌段)或
無作用(四嵌段)。倒轉的三嵌段共聚物P31R1(3,300kDa)具有中央親水性嵌段和兩
個側接的疏水性尾。當與P188和生理鹽水相比較時,其在圍移植期的大部分時間中誘
導細胞凋亡(參看圖8,右上圖)。此外,盡管以重量計具有相對較低的再吸收,其還顯
示較低的活細胞信號(1454RFU對生理鹽水對照組中的4,000RFU)和較差的組織結構
(參看圖13)。當根據組織結構分析時,重量增加代表纖維化和炎性浸潤和少量的正常脂
肪。因此,聚合物的構造對于其膜密封特性很重要。二嵌段共聚物具有與肥皂相同的構
造:親水性頭和疏水性尾。這些共聚物似乎可充當清潔劑,并以重量計具有最高的再吸
收水平。非離子性非普流尼克型吐溫80也具有類似結果(參看圖13)。根據組織學評分,
吐溫80引起最高的損傷水平,并且明顯對脂肪移植物有毒(參看圖18B)。四嵌段共聚
物T1107具有4個PEG鏈以放射方式附接到4個POE鏈(像車輪上的輪輻)。就重量、
DNA含量和細胞活力來說,這一聚合物的表現不如生理鹽水對照組。然而,當根據組織
學對T1107評分時,存在最少的正常脂肪。因此,在移植物內,看起來相對正常的活力
和DNA含量只不過反映炎性細胞置換了正常脂肪。臨床上曾使用兩性離子性磷脂酰膽
堿作為抽脂過程中的脂肪溶解劑。在本發明為期10天的分析中,利用與P188相同的濃
度,其似乎具有某種保護作用,但作用的量值與P188不同(參看圖8,右上圖)。

由于L64和F127看起來具有某種保護作用,故將其與P188混合,并在早期細胞凋
亡模型中進行分析。人們認為,可能是有效聚合物的組合會對脂肪移植物產生協同作用。
但事實并非如此,當組合時,這一聚合物混合物似乎有毒。在10天的取樣期中,注意
到較高的細胞凋亡水平(參看圖8,右下圖)。因此,在進一步研究中排除所述聚合物混
合物。

同樣對P188的添加劑進行研究。果聚糖是植物來源的寡糖,經顯示,其可保護植
物細胞膜免受較大溫度變化影響。然而,在本發明研究中,這些試劑誘導大量脂肪細胞
損傷(根據組織結構)和以重量計較高的再吸收水平。維生素C(抗壞血酸)在一系列
劑量下也顯示細胞毒性。有趣的是,在10天模型中,P188似乎對經維生素C處理過的
細胞提供某種保護作用(參看圖6,右下圖)。第6天,在維生素C處理過的樣品與維
生素C加P188之間注意到細胞凋亡減少。

最后,也作為P188添加劑的硫辛酸進行測試。當添加硫辛酸時,似乎對細胞凋亡
的減少具有協同作用(參看圖7)。第6天時,這一組合引起的細胞凋亡事件比單獨P188
少。硫辛酸是一種有效的抗氧化劑,并在氧化應力(缺血再灌注損傷)下具有線粒體保
護作用。如通過電子顯微鏡檢術注意到,脂肪細胞線粒體與脂肪細胞膜小孔極為接近(參
看圖3)。因此,當利用P188使膜穩定時,硫辛酸對受損的線粒體提供額外的保護作用。
6周時,這一混合物也引起再吸收(以重量計)的顯著改善和DNA含量的改善。

結論

在本實例中,檢查基于聚合物的膜保護作用對脂肪移植的影響。實驗測試了多種泊
洛沙姆尺寸(約2500kDa到約14,000kDa)、多種疏水性(40%PEG到80%PEG)、各
種其它共聚物(二嵌段、三嵌段、倒轉的三嵌段和四嵌段)、陰離子性、陽離子性和兩
性離子性聚合物,加單獨PEG、組合和各種添加劑。在早期終點和晚期終點中,當與所
有其它組和生理鹽水處理對照組相比較時,P188顯示優良的細胞凋亡減少、以重量計改
善的再吸收、較高的DNA含量和細胞架構的改善。

似乎P188的尺寸是一個重要因素;F38(較小)和F108(較大)沒有同樣的表現。
疏水性增加有助于較小的泊洛沙姆(L64)和較大的親水性略微較弱的泊洛沙姆(F127);
但P188仍然是最佳的。結構和次序也至關重要,倒轉的三嵌段共聚物P31R1和二嵌段
共聚物PEG-聚己內酯也對移植物有毒。另外,四嵌段共聚物T1107似乎會產生毒性并
引起嚴重炎性浸潤。

當聚合物都為親水的并且較大時(PEG?3350、PEG?8000),其對脂肪移植物有毒。
較小PEG(PEG?600)不如生理鹽水。非嵌段型非離子表面活性劑(吐溫80)也對脂肪
有毒。在PEGs中觀察到的高親水性會由清潔劑作用引起膜溶解。吐溫80具有長疏水性
尾和較小的親水性頭。這一分子也可能充當經典清潔劑,并溶解細胞膜。

各種添加劑或是有毒,或是無作用,但硫辛酸除外。在本研究中,發現果聚糖、白
藜蘆醇、膽固醇和維生素C都有毒。有趣的是,P188似乎對維生素C誘導的損傷提供
某種保護作用。此外,硫辛酸當與P188組合使用時,似乎提供潛在的協同作用。因此,
當其用于經P188處理過的脂肪移植物中時,似乎提供額外的線粒體保護作用。

這一研究表明了P188在密封脂肪細胞膜損傷方面的功效。尺寸變化過大的分子看
起來不起作用,除非增加其疏水性;但當這些分子的表現不如P188好時,尺寸仍然很
重要,且組合可能會有毒。在完全不同的機制下起作用的硫辛酸當與P188組合時,可
能具有協同作用。

等效內容和范圍

所屬領域技術人員僅使用常規實驗就將認識到或能夠確定本文所述的本發明的特
定實施例的許多等效物。本發明的范圍不打算局限于上述描述,而是如所附權利要求書
所述。

在權利要求書中,除非另作相反說明,或另外由上下文顯而易見,否則例如“一”
和“所述”等詞可以指一種或一種以上。除非另作相反說明或另外從上下文顯而易見,
否則如果一組中一個、一個以上或所有組內成員存在于、用于或以其它方式相關于指定
產物或方法,那么認為在所述組中一個或一個以上成員之間包括“或”的權利要求項或
描述得到滿足。本發明包括所述組的正好一個成員存在于、用于或以其它方式相關于指
定產物或方法的實施例。本發明還包括所述組的一個以上或所有成員都存在于、用于或
者以其它方式相關于給定產物或方法的實施例。此外,應了解,本發明涵蓋將來自一個
或一個以上權利要求項或者來自相關描述部分的一個或一個以上限定、要素、條款、描
述性術語等引入另一權利要求項中的所有變化、組合和重排。例如,可對附屬于另一權
利要求項的任一權利要求項加以修改,以使其包括一個或一個以上在附屬于同一基礎權
利要求項的任何其它權利要求項中所見的限定。此外,當權利要求書描述組合物時,應
了解,除非另作指示,或者除非所屬領域技術人員顯而易見會引起矛盾或不一致,否則
包括出于本文所揭示的任一目的而使用所述組合物的方法,并且包括根據本文中所揭示
的制備方法或此項技術中已知的其它方法中的任一種來制備所述組合物的方法。舉例來
說,應了解,本發明任一組合物都可用于軟組織修復或填充。還應了解,根據本文中揭
示的組合物制備方法制備的任一組合物都可用于軟組織修復或填充。此外,本發明涵蓋
根據本文中揭示的供制備組合物的方法中的任一種制備的組合物。

在要素是以例如馬庫西群(Markush?group)格式等列表呈現的情況下,應了解,也
揭示所述要素的各個亞群,并且可從所述群中去除任何要素。還應注意,術語“包含”
擬為開放式的,并且容許包括其它要素或步驟。應了解,一般來說,在本發明或本發明
各方面提到包含特定要素、特征、步驟等時,本發明的某些實施例或本發明各方面是由
或基本上由所述要素、特征、步驟等組成。為簡潔起見,在本文中這些實施例并未用這
些文字特別說明。因此,對于包含一個或一個以上要素、特征、步驟等的本發明各實施
例來說,本發明還提供由或基本上由這些要素、特征、步驟等組成的實施例。

當給定范圍時,包括端點。此外,應了解,除非另作指示,或者另外從上下文和/
或所屬領域技術人員的理解顯而易見,否則以范圍表示的值在本發明不同實施例中可采
用所述范圍內的任何特定值,除非上下文中另外清楚指示,否則精確到所述范圍下限單
位的十分之一。還應了解,除非另作指示,或者另外從上下文和/或所屬領域技術人員的
理解顯而易見,否則以范圍表示的值可假定為在指定范圍內的任何子范圍,其中所表示
的子范圍的端點的精確度與所述范圍下限單位的十分之一相同。

此外,應了解,本發明的任何特定實施例可明確地從一個或一個以上權利要求中排
除。本發明組合物和/或方法的任一實施例、要素、特征、應用或方面都可從任一個或一
個以上權利要求項中排除。為簡短起見,排除一個或一個以上要素、特征、目的或方面
的所有實施例都未在本文中明確陳述。

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細胞 移植
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