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番鴨專用的三聯活疫苗.pdf

摘要
申請專利號:

CN201210046238.9

申請日:

2012.02.24

公開號:

CN103272230B

公開日:

2015.01.28

當前法律狀態:

授權

有效性:

有權

法律詳情: 授權|||實質審查的生效IPC(主分類):A61K 39/29申請日:20120224|||公開
IPC分類號: A61K39/29; A61K39/23; A61P31/20; A61P31/14 主分類號: A61K39/29
申請人: 福建省農業科學院畜牧獸醫研究所
發明人: 陳少鶯; 林鋒強; 程曉霞; 陳仕龍; 朱小麗; 胡奇林; 林天龍; 王劭; 程由銓
地址: 350000 福建省福州市晉安區新店埔垱
優先權:
專利代理機構: 代理人:
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法律狀態
申請(專利)號:

CN201210046238.9

授權公告號:

103272230B||||||

法律狀態公告日:

2015.01.28|||2013.10.09|||2013.09.04

法律狀態類型:

授權|||實質審查的生效|||公開

摘要

本發明公開了番鴨專用的三聯疫苗,該番鴨專用的三聯疫苗以番鴨肝白點病弱毒MWCA株、番鴨細小病毒弱毒P1株和番鴨源鵝細小病毒弱毒D株為種毒,分別應用SPF雞胚成纖維細胞或番鴨胚成纖維細胞轉瓶培養技術增殖病毒,收獲細胞毒液,按適當比例混合后加凍干保護劑冷凍干燥,制成番鴨專用的番鴨呼腸孤病毒病、番鴨細小病毒病和番鴨小鵝瘟病的三聯活疫苗,在流行番鴨呼腸孤病毒病、番鴨細小病毒病和番鴨小鵝瘟病的番鴨養殖地區應用,能達到一次免疫接種可同時預防和控制上述三種病的目的。

權利要求書

權利要求書
1.   番鴨專用的三聯活疫苗,其特征在于,所述的番鴨專用的三聯活疫苗是采用:
a、來源于人工致弱的番鴨肝白點病弱毒MWCA株,該毒株保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心,保藏日2001年12月18日,保藏編號:CGMCC0667;
b、來源于人工致弱的番鴨細小病毒弱毒P1株,保藏在中國典型培養物保藏中心,保藏日2010年6月2日,保藏編號:CCTCCNO:V201013;
c、來源于人工致弱的番鴨源鵝細小病毒弱毒D株,保藏在中國典型培養物保藏中心,保藏日2010年6月2日,保藏編號:CCTCCNO:V201014;
將上述的番鴨肝白點病弱毒MWCA株、番鴨細小病毒弱毒P1株和番鴨源鵝細小病毒弱毒D株用于制備番鴨專用的番鴨細小病毒病、番鴨呼腸孤病毒病和番鴨小鵝瘟病的三聯活疫苗。

2.   根據權利要求1所述的番鴨專用的三聯活疫苗,其特征在于,所述的番鴨專用的三聯活疫苗的制備方法如下:
a.MPV?P1株增殖,將MPV?P1株種毒按培養液量的1%同步接種番鴨胚成纖雛細胞(MDEF),37℃旋轉培養至細胞病變達75%以上,收獲MPV?P1細胞毒;
b  GPV?D株增殖,將GPV?D株種毒按培養液量的1%同步接種番鴨胚成纖維細胞(MDEF),37℃旋轉培養至細胞病變達75%以上,收獲GPV?D細胞毒;
c.MDRV?CA株增殖,將MDRV?CA株種毒按培養液量的1%同步接種SPF雞胚成纖維細胞(CEF),37℃旋轉培養至細胞病變達75%以上,收獲MDRV?CA細胞毒;
d.病毒含量TCID50測定,MDRV?CA、MPV?P1和GPV?D的TCID50分別≥10?50/0.1ml、≥10?45/0.1ml和≥10?40/0.1ml以上時,用于配制疫苗;
e.疫苗配制,將MDRV?CA、MPV?P1和GPV?D按適當比例混合后加凍干保護劑冷凍干燥而成,使每羽份疫苗中各種成份的病毒含量分別達MDRV CA1035TCID50、MPV?P11030TCID50和GPV?D 1025TCID50。

3.   根據權利要求1所述的番鴨專用的三聯活疫苗在防治番鴨細小病毒病、番鴨呼腸孤病毒病和番鴨小鵝瘟病上的應用。

說明書

說明書番鴨專用的三聯活疫苗
技術領域
本發明涉及番鴨專用的番鴨呼腸孤病毒病、番鴨細小病毒病和小鵝瘟病的三聯疫苗。
背景技術
番鴨呼腸孤病毒病(俗稱“肝白點病”、“花肝病”、“白點病”、“肝脾白點病”和“番鴨壞死性肝炎”等)是1997年以來,在福建省莆田、福清、福川、長樂和浙江金華、廣東佛山等地番鴨飼養區發生一種臨床上以軟腳為主要癥狀,以肝、脾表面有多量白點、腎臟腫大、出血、表面有黃色條斑為主要病理變化的傳染病。該病只發生于番鴨,發病日齡為7~45日齡,以10~30日齡的雛番鴨為最甚。發病率為30~90%,病死率為60~80%,發病未死鴨耐過后成為僵鴨,給番鴨業造成很大經濟損失。
番鴨細小病毒病(俗稱“三周病”)是1987年在我省首先發現的1?3周齡番鴨以喘瀉為臨床癥狀的一種新疫病。該病主要侵害7?21日齡的雛番鴨,發病率27?62%和病死率22?43%,病愈鴨大部分成為僵鴨,給番鴨業造成很大經濟損失。
番鴨小鵝瘟病是1997年以來在福建省莆田、福清等地的番鴨飼養區暴發流行,目前全國各養鴨地區均有發生。臨床上雛番鴨發生以腹瀉、腸粘膜脫落形成栓塞為特征,發病率50?70%、病死率40?65%。使用各種抗菌素、番鴨細小病毒疫苗及高免卵黃抗體等均不能控制病情,給養鴨業造成較大經濟損失。
鑒于番鴨呼腸孤病毒病、番鴨細小病毒病和番鴨小鵝瘟病均是嚴重危害番鴨養殖業的重要傳染病,我們首次研制出番鴨呼腸孤病毒病、番鴨細小病毒病和番鴨小鵝瘟病的三聯活疫苗。
發明內容
本發明的任務是提供番鴨專用的番鴨細小病毒病、番鴨呼腸孤病毒病和番鴨小鵝瘟病的三聯活疫苗,本發明是通過如下技術方案來實現的:
番鴨專用的番鴨細小病毒病、番鴨呼腸孤病毒病和番鴨小鵝瘟病三聯活疫苗(簡稱:番鴨專用的三聯活疫苗)是采用:
a、來源于人工致弱的番鴨肝白點病(番鴨呼腸孤病毒病)弱毒MWCA株,該毒株保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心,(簡稱CGMCC),地址在北京市朝陽區北辰西路1號院中國科學院微生物研究所,保藏日2001年12月18日,保藏編號:CGMCC0667。(見已授權中國專利號01144485.1,授權公告號CN1179751C);
b、來源于人工致弱的番鴨細小病毒弱毒P1株(MPV?P1株),保藏在中國典型培養物保藏中心(China Center for Type Culture Collection,簡稱CCTCC),保藏單位CCTCC地址在中國武漢市武漢大學,保藏日2010年6月2日,保藏編號:CCTCC NO:V201013;
c、來源于人工致弱的番鴨源鵝細小病毒弱毒D株(GPV?D株),保藏在中國典型培養物保藏中心(China Center for Type Culture Collection,簡稱CCTCC),保藏單位CCTCC地址在中國武漢市武漢大學,保藏日2010年6月2日,保藏編號:CCTCC NO:V201014;
將上述的番鴨肝白點病弱毒MWCA株、番鴨細小病毒弱毒P1株和番鴨源鵝細小病毒弱毒D株應用于制備番鴨細小病毒病、番鴨呼腸孤病毒病和番鴨小鵝瘟病三聯活疫苗。
與現有技術相比,本發明以番鴨肝白點病弱毒MWCA株(即:番鴨呼腸孤病毒弱毒CA株)、番鴨細小病毒弱毒P1株(MPV?P1株)和番鴨源鵝細小病毒弱毒D株(GPV?D株)為種毒,分別應用SPF雞胚成纖維細胞或番鴨胚成纖維細胞轉瓶培養技術增殖病毒,收獲細胞毒液,按適當比例混合后加凍干保護劑冷凍干燥,首次研制成遺傳性穩定、安全性好、免疫原性強且成本低的番鴨三聯活疫苗,在流行番鴨三周病、番鴨肝白點病(花肝病)和番鴨小鵝瘟病的番鴨養殖地區應用,能達到一次免疫接種即可同時預防和控制三種疫病的目的;1?2日齡雛番鴨免疫一次即可有效預防番鴨呼腸孤病毒病、番鴨細小病毒病和番鴨小鵝瘟病,減少了人力物力,減少了因多次免疫注射對鴨群造成的不良應激反應;本發明適于GMP條件下的大規模生產。
具體實施方式
以下結合具體實施例對本發明進一步說明。(但不是對本發明的限制)。
a.來源于人工致弱的番鴨肝白點病(番鴨呼腸孤病毒病)弱毒MWCA株,是利用番鴨胚成纖維細胞和雞胚成纖維細胞傳代誘變選育致弱而成,已失去對一日齡雛番鴨的致病性,并具有如下特性(1)病毒效價:MWCA株對雞胚成纖維單層細胞TCID50≥10?50/0.1ml;(2)安全性:用1日齡健康易感雛番鴨10羽,每羽腿部肌肉注射毒種原液0.2毫升,觀察20天,應全部存活;(3)免疫原性:一日齡健康敏感雛番鴨,腿部肌肉注射0.2毫升,其最小免疫量為600TCID50/0.2ml。該毒株保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心,(現名:中國普通微生物菌種保藏管理中心,China General Microbiological Culture Collection Center,簡稱:CGMCC),地址在北京市朝陽區北辰西路1號院中國科學院微生物研究所,保藏日2001年12月18日,保藏編號:CGMCC0667。(見已授權中國專利號01144485.1,授權公告號CN1179751C,番鴨肝白點病(番鴨呼腸孤病毒病)弱毒MWCA株在該專利文獻中也稱:CGMCC0667毒株);
b.來源于人工致弱的番鴨細小病毒弱毒P1株(MPV?P1株),是利用番鴨胚和番鴨胚成纖維細胞交替傳代等生物技術人工選育致弱而成,已失去對一日齡雛番鴨的致病性,并具有如下特性(1)病毒效價:MPV?P1株對番鴨胚成纖維單層細胞TCID50≥10?45/0.1ml;(2)安全性:用1日齡健康易感雛番鴨10羽,每羽腿部肌肉注射毒種原液0.2毫升,觀察20天,應全部存活;(3)免疫原性:一日齡健康敏感雛番鴨,腿部肌肉注射0.2毫升,其最小免疫量為100TCID50/0.2ml。MPV?P1株保藏在中國典型培養物保藏中心(China Center for Type Culture Collection,簡稱:CCTCC),保藏日2010年6月2日,保藏編號CCTCCV201013;
c.來源于人工致弱的番鴨源鵝細小病毒弱毒D株(GPV?D株),是利用番鴨胚成纖維細胞變量交互傳代選育致弱而成,已失去對一日齡雛番鴨的致病性,并具有如下特性(1)病毒效價:GPV?D株對番鴨胚成纖維單層細胞TCID50≥10?45/0.1ml;(2)安全性:用1日齡健康易感雛番鴨10羽,每羽腿部肌肉注射毒種原液0.2毫升,觀察20天,應全部存活;(3)免疫原性:一日齡健康敏感雛番鴨,腿部肌肉注射0.2毫升,其最小免疫量為300TCID50/0.2ml。GPV?D株保藏在CCTCC,保藏日2010年6月2日,保藏編號CCTCCV201014;
將上述的番鴨肝白點病(番鴨呼腸孤病毒病)弱毒MWCA株、番鴨細小病毒弱毒P1株和番鴨源鵝細小病毒弱毒D株用于制備番鴨細小病毒病、番鴨呼腸孤病毒病和番鴨小鵝瘟病的三聯活疫苗。
上述的番鴨專用的番鴨呼腸孤病毒病、番鴨細小病毒病和番鴨小鵝瘟病三聯疫苗的制備方法如下:
(1)MPV?P1株增殖,將MPV?P1株種毒按培養液量的1%同步接種番鴨胚成纖維細胞(MDEF),37℃旋轉培養至細胞病變達75%以上,收獲MPV?P1細胞毒。
(2)GPV?D株增殖,將GPV?D株種毒按培養液量的1%同步接種番鴨胚成纖維細胞(MDEF),37℃旋轉培養至細胞病變達75%以上,收獲GPV?D細胞毒。
(3)MDRV?CA株增殖,將MDRV?CA株種毒按培養液量的1%同步接種SPF雞胚成纖維細胞(CEF),37℃旋轉培養至細胞病變達75%以上,收獲MDRV?CA細胞毒。
(4)病毒含量TCID50測定,MDRV?CA、MPV?P1和GPV?D的TCID50分別≥10?50/0.1ml、≥10?45/0.1ml和≥10?40/0.1ml以上時,可用于配制疫苗。
(5)疫苗配制,將MDRV?CA、MPV?P1和GPV?D按適當比例混合后加凍干保護劑冷凍干燥而成。使每羽份疫苗中各種成份的病毒含量分別達MDRV CA1035TCID50、MPV?P11030TCID50和GPV?D 1025TCID50。
本發明的疫苗應用于防治番鴨細小病毒病、番鴨呼腸孤病毒病和番鴨小鵝瘟病,其免疫學指標測定如下:
1.無菌檢驗:按現行《中華人民共和國獸藥典》附錄進行,無菌生長。
2.安全性測定:用1日齡健康易感雛番鴨10羽,每羽腿部肌肉注射10倍劑量三聯疫苗,觀察20天,接種鴨均未見飲食欲和精神異常,且生長發育良好,全部存活。
3.免疫力測定:隨機取一日齡易感雛番鴨20羽,腿肌接種1羽份三聯活疫苗,其中10羽免疫鴨于接種0天、7天、14天、21天、28天、60天、90天連同不免疫對照鴨采血分離血清,供抗GPV?LPAI和抗MPV?LPAI抗體效價測定;另10羽免疫鴨于接種后7天連同不免疫對照組同時攻擊MDRV強毒,觀察20天,記錄發病死亡情況。結果:①一日齡雛番鴨免疫三聯苗后7天血清中全部測定出能有效抵抗GPV和MPV強毒攻擊的抗體水平,即抗GPV?LPAI和抗MPV?LPAI抗體均為22.0以上,至免疫后28天達到高峰的抗體水平分別為256(抗GPV?LPAI抗體)和262(抗MPV?LPAI抗體),隨后抗體水平仍維持在較高水平,并一直持續至免疫后90天即97日齡,此時已達到或超過番鴨出欄日齡。②一日齡雛番鴨免疫三聯苗后7天連同不免疫對照組同時攻擊MDRV強毒0.2ml/羽,對照攻毒鴨的發病率80%(8/10)、死亡率30%(3/10);而免疫攻毒鴨的發病率10%(1/10)、死亡率0%;表明一日齡雛番鴨免疫三聯疫苗后7天能有效抵抗MDRV強毒的攻擊。③三聯疫苗的免疫力測定結果表明,疫苗免疫力良好,免疫產生期7天,免疫持續期為90天以上。一次免疫即可保護雛番鴨安全渡過易感期,達到1次免疫注射可同時預防番鴨呼腸孤病毒病(番鴨肝白點病)、番鴨細小病毒病(番鴨三周病)和小鵝瘟病,不僅減少人力物力財力,也減少因多次免疫注射導致的應激反應。
本發明的應用效果評價:在試驗鴨場共免疫注射7000多羽份一日齡雛番鴨,跟蹤觀察20d,未見免疫鴨出現不良反應;且免疫組番鴨未發生番鴨呼腸孤病毒病、番鴨細小病毒病和小鵝瘟病,成活率達98%以上;而700羽的對照組番鴨均不同程度發生番鴨肝白點病、三周病和小鵝瘟病,成活率僅62%。進一步證明本發明的三聯活疫苗安全、有效,可用于臨床上預防番鴨呼腸孤病毒病(番鴨肝白點病)、番鴨細小病毒病(番鴨三周病)和番鴨小鵝瘟病。

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