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OSOAT基因在控制水稻抗旱性及抗重金屬汞中的應用.pdf

摘要
申請專利號:

CN201210138418.X

申請日:

2012.05.05

公開號:

CN103382478B

公開日:

2015.01.28

當前法律狀態:

終止

有效性:

無權

法律詳情: 未繳年費專利權終止IPC(主分類):C12N 15/54申請日:20120505授權公告日:20150128終止日期:20150505|||授權|||實質審查的生效IPC(主分類):C12N 15/54申請日:20120505|||公開
IPC分類號: C12N15/54; C12N9/10; C12N15/82; A01H5/00 主分類號: C12N15/54
申請人: 華中農業大學
發明人: 熊立仲; 游均
地址: 430070 湖北省武漢市洪山區獅子山街1號
優先權:
專利代理機構: 武漢宇晨專利事務所 42001 代理人: 張紅兵
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法律狀態
申請(專利)號:

CN201210138418.X

授權公告號:

|||103382478B||||||

法律狀態公告日:

2016.06.22|||2015.01.28|||2013.12.18|||2013.11.06

法律狀態類型:

專利權的終止|||授權|||實質審查的生效|||公開

摘要

本發明屬于水稻基因工程技術領域。具體涉及分離、克隆和通過功能驗證得到一種能夠提高水稻對干旱耐受能力和抗重金屬汞的能力的OsOAT基因在水稻遺傳改良中的應用。所述的OsOAT基因的核苷酸序列如序列表SEQ?ID?NO:1所示,其蛋白質的序列如SEQ?ID?NO:2所示。本發明采用候選基因篩選方法,克隆到控制水稻抗旱基因OsOAT,通過超量表達OsOAT基因,可以提高轉基因水稻對抗干旱和抗重金屬汞的能力,證實了該基因的功能及應用途徑。

權利要求書

權利要求書
1.  一種分離的OsOAT基因在調控水稻抗旱和抗重金屬汞中的應用,其特征在于該基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:1所示。

2.  一種分離的OsOAT基因在調控水稻抗旱和抗重金屬汞中的應用,其特征在于該基因蛋白質的序列如序列表SEQ ID NO:2所示。

說明書

說明書OsOAT基因在控制水稻抗旱性及抗重金屬汞中的應用
技術領域
本發明屬于水稻基因工程技術領域。具體涉及分離、克隆和通過功能驗證得到一種能夠提高水稻對干旱耐受能力和抗重金屬汞的能力的OsOAT基因在水稻遺傳改良中的應用。本發明采用候選基因篩選方法,克隆到控制水稻抗旱基因OsOAT,通過超量表達OsOAT基因,可以提高轉基因水稻對抗干旱和抗重金屬汞的能力,證實了該基因的功能及應用途徑。
背景技術
植物在生長的過程中會受到諸多環境因素的影響,干旱、冷害和高溫會導致農作物的大規模減產,在許多地區是農業發展的瓶頸。培育耐逆性的作物品種一直是農業科學技術研究的主要目標之一。為了抵抗或適應這些不利的因素,植物體感受細胞外環境條件的變化并通過多種途徑將其傳遞到細胞內,會誘導表達一些應答基因,產生一些使細胞免受干旱、高鹽、低溫等脅迫傷害的功能蛋白、滲透調節物質以及傳遞信號和調控基因表達的轉錄因子,從而對外界的變化做出相應的反應(Xiong等,Cell signaling during cold,drought and salt stress.Plant Cell.2002.14(suppl),S165–S183)。對于植物在逆境脅迫下的滲透調節特指植物通過增加溶質而降低滲透勢的作用。通過滲透調節防止水分過度散失,維持細胞膨壓,保護植物的代謝活動,使之在不利環境消除后能迅速恢復生長。因此,滲透調節被認為是植物適應干旱等逆境脅迫的重要過程之一。植物可以通過吸收環境中的離子和主動在細胞內合成小分子有機滲透調節物質來增加溶質,然而吸收過多的離子對細胞是不利的,吸收的離子大多富集到液泡中,而細胞質中還是主要通過合成透調節物質來進行滲透調節。滲透調節物質主要包括氨基酸(如脯氨酸,天冬氨酸和谷氨酸),甲基化的季銨化合物(如甘氨酸甜菜堿和丙氨酸甜菜堿),親水性蛋白(如胚胎晚期豐富蛋白),糖(如果聚糖和蔗糖)和環多醇(如甘露醇)(Chaves等,Understanding plant responses to drought—from genes to the whole plant.Functional Plant Biology.2003.30(3),239264)。通過基因工程,部分滲透調節物質基因或合成相關基因已經成功應用于水稻抗逆遺傳育種。如將來源于球形節桿菌的膽堿氧化酶導入水稻,使轉基因水稻能夠合成甜菜堿。顯著提高了轉基因水稻對干旱,高鹽和低溫的抗性(Sakamoto等,Metabolic engineering of rice leading to biosynthesis of glycinebetaine and tolerance to salt and cold.Plant Mol Biol.1998.38(6):10111019;Kathuria等,Glycinebetaine-induced water-stress tolerance in codA-expressing transgenic indica rice is associated with up-regulation of several stress responsive genes.Plant Biotechnol J.2009. 7(6):512-526)。超量表達胚胎晚期豐富蛋白基因LEA3同樣提高了水稻在大田環境中對干旱的抗性(Xiao等,Over-expression of a LEA gene in rice improves drought resistance under the field conditions.Theor Appl Genet.2007.115(1):35-46)。
植物中脯氨酸的合成主要起始于谷氨酸,谷氨酸被吡咯啉-5-羧酸合成酶(P5CS)催化生成吡咯啉-5羧酸(P5C),P5C被P5C還原酶(P5CR)催化生成脯氨酸。脯氨酸的合成也可以起始于鳥氨酸,鳥氨酸在鳥氨酸氨基轉移酶(OAT)的作用下生成P5C,然后進一步反應形成脯氨酸。脯氨酸的降解包括脯氨酸脫氫酶催化脯氨酸形成P5C,P5C脫氫酶(P5CDH)進一步催化P5C形成谷氨酸。植物中脯氨酸的代謝呈現出區室化的特點。谷氨酸合成途徑發生在細胞質或葉綠體中,而鳥氨酸合成途徑和脯氨酸降解發生在線粒體中。特異的氨基酸轉運子在不同的細胞區室之間轉運氨基酸,使得脯氨酸的代謝形成了一個循環。植物體內游離脯氨酸的含量決定于這個循環中的兩個合成途徑,脯氨酸的降解以及在不同細胞區室之間的轉運(Szabados等,Proline:a multifunctional amino acid.Trends Plant Sci.2010.15(2):89-97)。
水稻是重要的糧食作物和模式植物,在極端氣候條件頻發的今天,培育抗逆性增強的水稻具有重要的意義。雖然脯氨酸積累與植物逆境抗性的關系已經清晰,但是水稻鳥氨酸氨基轉移酶基因OsOAT能否提高水稻抗逆性目前尚無報道。因此,從水稻中分離OsOAT基因,并鑒定它在提高水稻抗逆性方面所發揮的功能,對于培育抗逆水稻新品種將具有非常重要的意義。
發明內容
本發明的目的涉及一個鳥氨酸氨基轉移酶基因OsOAT在調控水稻抗旱性和抗重金屬汞的能力改良中的應用。本發明分離和應用一種包含OsOAT基因的DNA片段,該片段賦予水稻在干旱條件下抗旱性和抗重金屬汞的能力增強。其中,本發明分離和克隆的OsOAT基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:1所示,其序列長度為1652bp,它對應的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示,該基因對應的氨基酸序列為473個,它編碼的蛋白質的序列如SEQ ID NO:2所示。
攜帶有本發明OsOAT基因的表達載體可通過使用Ti質粒,植物病毒載體,直接DNA轉化,微注射,電穿孔等常規生物技術方法導入植物細胞(Weissbach,1998,Method for Plant Molecular Biology VIII,Academy Press,New York,pp.411-463;Geiserson and Corey,1998,Plant Molecular Biology(2nd Edition)。
可使用包括本發明的OsOAT基因的表達載體轉化宿主是包括水稻在內多種植物,培育抗旱植物品種。
本發明克隆的OsOAT基因是受干旱誘導表達的,因此可將本發明的基因與任何感興趣的干旱誘導啟動子結合后連入合適的表達載體,并轉化植物宿主,在干旱條件下可誘導表達基因,提高植物抗旱性。
下面結合附圖和實施例對本發明做進一步說明。
附圖說明
序列表SEQ ID NO:1是本發明分離克隆的包含有OsOAT基因的核苷酸序列,序列長度為1652bp,從 90-1511位是它的編碼區,共計編碼473個氨基酸。
序列表SEQ ID NO:2是OsOAT基因的蛋白質的序列。
圖1:是OsOAT基因在多種逆境下的表達情況。各處理樣品為:干旱(drought)處理0d,3d,5d,7d;高鹽(salt)處理0h,3h,6h,12h;低溫(cold)處理0h,6h,12h,24h;高溫(heat)處理0min,10min,30min,2h;淹水脅迫(submerge)處理0h,12h,24h,72h;氧化脅迫(H2O2)處理0h,1h,3h,6h;紫外線(UV)處理0h,3h,6h,12h;ABA即脫落酸(100μM)處理0h,0.5h,3h,6h。
圖2:是OsOAT超表達載體構建示意圖及轉化植株表達量檢測。圖中:A為OsOAT超表達載體構建示意圖。B為OsOAT超表達植株(1-18)中OsOAT基因的表達情況。水稻品種中花11(ZH11)為野生型家系(即非轉基因)。
圖3:是OsOAT超表達植株滲透脅迫表型及OsOAT超表達植株滲透脅迫后株高的統計結果。圖中:A為OsOAT超表達植株滲透脅迫表型。OsOAT-OE-7,-10,-17為3個獨立超量表達轉基因家系,水稻品種中花11(ZH11)為野生型家系。B為OsOAT超表達植株滲透脅迫后株高的統計結果。OsOAT-OE-7,-10,-17為3個獨立超量表達轉基因家系,中花11(ZH11)為野生型家系。
圖4:是水稻OsOAT超表達植株苗期干旱脅迫表型和OsOAT超表達植株苗期干旱脅迫后存活率的統計。圖中:A為水稻OsOAT超表達植株苗期干旱脅迫表型。OsOAT-OE-7,-10,-17為3個獨立超量表達轉基因家系,中花11(ZH11)為野生型家系。B為水稻OsOAT超表達植株苗期干旱脅迫后存活率的統計結果。OsOAT-OE-7,-10,-17為3個獨立超量表達轉基因家系,中花11(ZH11)為野生型家系。
圖5:是水稻OsOAT超表達植株開花期干旱脅迫表型和OsOAT超表達植株開花期干旱脅迫后相對結實率的統計。圖中:A為OsOAT超表達植株開花期干旱脅迫前(左圖)和脅迫后(右圖)表型。OsOAT-OE-10為1個獨立超量表達轉基因家系,中花11(ZH11)為野生型家系。B為OsOAT超表達植株開花期干旱脅迫后相對結實率的統計結果。OsOAT-OE-7,-10,-17為3個獨立超量表達轉基因家系,中花11(ZH11)為野生型家系。
圖6:是水稻OsOAT超表達植株苗期汞脅迫表型和OsOAT超表達植株苗期汞脅迫后鮮重和葉綠素含量的統計。圖中:A為水稻OsOAT超表達植株苗期在不同濃度汞脅迫下表型。OsOAT-OE-7,-17為2個獨立超量表達轉基因家系,中花11(ZH11)為野生型家系。B為水稻OsOAT超表達植株苗期在不同濃度汞脅迫后鮮重和葉綠素含量的統計結果。OsOAT-OE-7,-17為2個獨立超量表達轉基因家系,中花11(ZH11)為野生型家系。
圖7:是pCAMBIA1301載體的質粒圖譜。
圖8:是以pCAMBIA1301載體為骨架的pU1301U-OsOAT超表達載體的質粒圖譜。
具體實施方式
以下實施例定義了本發明,并描述了本發明在克隆包含有OsOAT基因完整編碼區段的DNA片段,以及驗證OsOAT基因功能的方法。根據以下的描述和這些實施例,本領域技術人員可以確定本發明的基本特征,并且在不偏離本發明精神和范圍的情況下,可以對本發明做出各種改變和修改,以使其適用不同的用途和條件。
1、檢測水稻內源OsOAT基因的表達水平
申請人選用粳稻品種“中花11號”(中國農業科學院作物科學研究所培育的一個公開推廣應用的水稻品種)作為表達譜分析的材料。生長至4葉期的水稻中花11(ZH11)幼苗進行各種逆境處理。干旱處理是不澆水讓其自然干燥,0d,3d,5d,7d后取樣;高鹽脅迫是將中花11(ZH11)幼苗根部浸泡在200mM NaCl的溶液,0h,3h,6h,12h后取樣;低溫脅迫試驗是將中花11(ZH11)幼苗放入4℃人工氣候室(人工氣候室為水稻科研的常用設備,沒有特殊要求,按照常規的光照、溫度及相對濕度管理),0h,6h,12h,24h后取樣。高溫脅迫試驗是將幼苗放入42℃人工氣候室,0min,10min,30min,2h后取樣。淹水脅迫試驗是將水稻幼苗置于裝滿水的四面透光容器內,0h,12h,24h,72h后取樣。紫外線處理是將幼苗置于紫外燈下,0h,3h,6h,12h后取樣。氧化脅迫是將中花11(ZH11)幼苗根部浸泡在1%H2O2溶液中,0h,1h,3h,6h后取樣。脫落酸(ABA)處理是100μM的脫落酸(ABA)溶液均勻噴灑水稻中花11(ZH11)植株表面后并加到水稻中花11(ZH11)幼苗根部,0h,0.5h,3h,6h后取樣。總RNA的提取采用TRIZOL試劑(購自Invitrogen公司)提取,提取方法按照上述TRIZOL試劑的說明書進行操作),利用反轉錄酶SSIII(購自Invitrogen公司)將其反轉錄合成cDNA(方法根據Invitrogen公司反轉錄酶試劑的說明書操作),反應條件為:65℃5min,50℃120min,70℃10min。以上述反轉錄合成的cDNA為模板,用設計的引物(OsOAT-F:5’-GATTGGGAAAACATACGACCTGAT-3’和OsOAT-R:5’-AACCGCACTGACAGGAACTACTC-3’)對OsOAT基因進行特異的PCR擴增。同時利用引物(AF:5’-TGGCATCTCTCAGCACATTCC-3’和AR:5’-TGCACAATGGATGGGTCAGA-3’)對水稻Actinl基因做特異擴增(擴增產物長76bp),以作為內對照進行定量分析。反應條件為:95℃30sec;95℃5sec,60℃34sec,40個循環。反應過程中進行熒光檢測實時定量分析。結果表明,OsOAT基因(其核苷酸序列如序列表SEQ NO:1所示)在干旱,高鹽,高溫,淹水和ABA處理后表達量上升(見圖1)。
2、OsOAT基因超量表達載體的構建和遺傳轉化
為了分析OsOAT基因的功能,申請人將其在水稻中超量表達。從轉基因植株的表型研究該基因的功能。
超量表達載體構建方法如下:首先通過查找水稻基因組注釋網站RGAP(http://rice.plantbiology.msu.edu/)OsOAT基因注釋號:LOC_Os03g44150,與KOME(http://cdna01.dna.affrc.go.jp/cDNA/)OsOAT注釋號:AK099445,預測為一個鳥氨酸氨基轉移酶基因,以此為參考設計引物。以KOME獲得的全長cDNA克隆(登錄號:AK099445)為模板,用引物OATFLF(5’-CAGGGTACCCCTCCAGACCTCCACG-3’,序列特異引物外加接頭KpnI位點)和OATFLR(5’-CAGGGTACCGTCCCAGACATCGCAAC-3’,序列特異引物外加接頭KpnI位點),擴增出包含OsOAT基因完整編碼區的cDNA片斷,擴增產物就是本發明SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列(1-1652bp)。PCR反應條件為:94℃預變性5min;94℃30sec,55℃30sec,72℃100sec,32個循環;72℃延伸5min。將擴增獲得的PCR產物連入pGEM-T載體(購自Promega公司),篩選陽性克隆并測序,獲得所需的全長基因。將該克隆命名為PGEM-OsOAT。陽性克隆PGEM-OsOAT質粒用KpnI酶切,回收外源片段;同時,用同樣的方法酶切攜帶ubiquitin啟動子的遺傳轉化載體pU1301(pU1301是在國際上常用的植物遺傳轉化載體pCAMBIA1301(見圖6)基礎上改建的,攜帶具有組成型和超量表達特征的玉米ubiquitin啟動子的農桿菌介導的遺傳轉化載 體,其圖譜見圖7),酶切完畢,用氯仿:異戊醇(體積比24:1)抽提,純化酶切產物。用包含OsOAT基因的酶切片段和酶切的pU1301載體做連接反應,其后轉化大腸桿菌DH10β(該大腸桿菌DH10β菌株購自Invitrogen公司)。通過酶切篩選陽性克隆,將獲得的重組質粒載體被命名為OsOAT-OE-pU1301(載體上的OsOAT基因序列就是SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列,其序列長度為1652bp,見圖2A)。
通過農桿菌介導的水稻遺傳轉化方法(其具體步驟如下所述)將上述超表達載體OsOAT-OE-pU1301轉入到水稻品種“中花11”(中國農業科學院作物科學研究所培育的一個公開使用的水稻品種)中,經過預培養、侵染、共培養、篩選具有潮霉素抗性的愈傷、分化、生根、練苗、移栽,得到轉基因植株。上述農桿菌介導的水稻(中花11)遺傳轉化方法(體系)在Hiei等人報道的方法(Hiei等,Efficient transformation of rice,Oryza sativa L.,mediated by Agrobacterium and sequence analysis of the boundaries of the T-DNA.Plant J.1994.6:271-282)基礎上改良進行。
本實施例的具體遺傳轉化步驟如下:
(1)電轉化:將最終超表達目標載體OsOAT-OE-pU1301(質粒圖譜見圖7),用1800v電壓,電轉化入農桿菌EHA105菌株,涂到帶有對應抗性選擇的常用的LA培養基上,篩選出陽性克隆,用于下述轉化愈傷。
(2)愈傷組織誘導:將成熟的水稻種子中花11去殼,然后依次用70%的乙醇處理1分鐘,0.15%氯化汞(HgCl2)種子表面消毒15分鐘;用滅菌水洗種子4-5次;將該消過毒的種子放在誘導培養基上(成分見后);將接種后的愈傷組織誘導培養基(成分見后)置于黑暗處培養4周,溫度25±1℃。
(3)愈傷繼代:挑選亮黃色、緊實且相對干燥的胚性愈傷,放于繼代培養基(成分見后)上黑暗下培養2周,培養溫度25±1℃。
(4)預培養:挑選緊實且相對干燥的胚性愈傷,放于預培養基(成分見后)上黑暗下培養2周,培養溫度25±1℃。
(5)農桿菌培養:在帶有對應抗性選擇的LA培養基上(成分見后)預培養農桿菌EHA105(來源于澳大利亞CAMBIA實驗室商用菌株,攜帶有本發明的超表達載體OsOAT-OE-pU1301)兩天,培養溫度28℃;將所述的農桿菌轉移至懸浮培養基(成分見后)里,于28℃搖床上培養2-3小時。
(6)農桿菌侵染:將預培養的愈傷轉移至滅菌好的瓶子內;調節農桿菌的懸浮液至OD6000.8-1.0;將愈傷在農桿菌懸浮液中浸泡30分鐘;轉移愈傷至滅菌好的濾紙上吸干;然后放置在共培養基(成分見后)上培養3天,培養溫度19-20℃。
(7)愈傷洗滌和選擇培養:滅菌水洗滌愈傷至看不見農桿菌;浸泡在含400ppm羧芐青霉素(CN)的滅菌水中30分鐘;轉移愈傷至滅菌好的濾紙上吸干;轉移愈傷至選擇培養基(成分見后)上選擇2-3次,每次2周(第一次篩選用的羧芐青霉素濃度為400ppm,第二次及以后為250ppm,潮霉素濃度為250ppm)。
(8)分化:將抗性愈傷轉移至預分化培養基(成分見后)上黑暗處培養5-7周;轉移預分化培養的愈傷至分化培養基上(成分見后),光照(按照水稻組織培養苗的常規光照條件,沒有特殊要求)下培養,溫度26℃。
(9)生根:剪掉分化時產生的根;然后將其轉移至生根培養基中光照(按照水稻組織培養苗的常規光照條件,沒有特殊要求)下培養2-3周,溫度26℃。
(10)移栽:洗掉根上的殘留培養基,將具有良好根系的幼苗轉入溫室,同時在最初的幾天保持水分 濕潤。
培養基組分及其配方:(1)試劑和溶液縮寫:本發明中培養基所用到的植物激素的縮寫表示如下:6-BA(6-BenzylaminoPurine,6-芐基腺嘌呤);CN(Carbenicillin,羧芐青霉素);KT(Kinetin,激動素);NAA(Napthalene acetic acid,萘乙酸);IAA(Indole-3-acetic acid,吲哚乙酸);2,4-D(2,4-Dichlorophenoxyacetic acid,2,4-二氯苯氧乙酸);AS(Acetosringone,乙酰丁香酮);CH(Casein Enzymatic Hydrolysate,水解酪蛋白);HN(Hygromycin B,潮霉素);DMSO(Dimethyl Sulfoxide,二甲基亞砜);N6max(N6大量成分溶液);N6mix(N6微量成分溶液);MSmax(MS大量成分溶液);MSmix(MS微量成分溶液)。(2)主要溶液配方:
1)N6培養基大量元素母液[10倍濃縮液(10X)]的配制:

逐一溶解,然后室溫下定容至1000ml。
2)N6培養基微量元素母液[100倍濃縮液(100X)]的配制

室溫下溶解并定容至1000ml。
3)鐵鹽(Fe2EDTA)貯存液(100X)的配制
準備800ml雙蒸水并加熱至70℃,加入乙二銨四乙酸二鈉(Na2EDTA·2H2O)3.73克,充分溶解后在70℃水浴中保持2小時,定容至1000ml,4℃保存備用。
4)維生素貯存液(100X)配制

加水定容至1000ml,4℃保存備用。
5)MS培養基大量元素母液(10X)的配制


室溫下溶解并定容至1000ml。
6)MS培養基微量元素母液(100X)的配制

室溫下溶解并定容至1000ml。
7)2,4-D貯存液,6-BA貯存液,萘乙酸(NAA)貯存液,吲哚乙酸(IAA)貯存液:1均為mg/ml。
8)葡萄糖貯存液:0.5g/ml。
9)AS貯存液的配制:秤取AS 0.392g,DMSO 10ml。
(3)用于水稻遺傳轉化的培養基配方
1)愈傷組織誘導培養基

加蒸餾水至900ml,1N氫氧化鉀調節pH值到5.9,煮沸并定容至1000ml,分裝到50ml三角瓶(25ml/瓶),封口滅菌。
2)繼代培養基


加蒸餾水至900ml,1N氫氧化鉀調節pH值到5.9,煮沸并定容至1000ml,分裝到50ml三角瓶(25ml/瓶),封口滅菌。
3)預培養基

加蒸餾水至250ml,1N氫氧化鉀調節pH值到5.6,封口滅菌。使用前加熱溶解培養基并加入5ml葡萄糖貯存液和250μl AS貯存液,分裝倒入培養皿中(25ml/皿)。
4)共培養基

加蒸餾水至250ml,1N氫氧化鉀調節pH值到5.6,封口滅菌。使用前加熱溶解培養基并加入5ml葡萄糖貯存液和250μl AS貯存液,分裝倒入培養皿中(25ml/每皿)。
5)懸浮培養基


加蒸餾水至100ml,調節pH值到5.4,分裝到兩個100ml的三角瓶中,封口滅菌。使用前加入1ml葡萄糖貯存液和100μl AS貯存液。
6)選擇培養基

加蒸餾水至250ml,調節pH值到6.0,封口滅菌。使用前溶解培養基,加入250μl HN和400ppmCN,分裝倒入培養皿中(25ml/皿)。
7)預分化培養基

加蒸餾水至250ml,1N氫氧化鉀調節pH值到5.9,封口滅菌。使用前溶解培養基,加入250μl HN和200ppm CN,分裝倒入培養皿中(25ml/皿)。
8)分化培養基


加蒸餾水至900ml,1N氫氧化鉀調節pH值到6.0。煮沸并定容至1000ml,分裝到50ml三角瓶(50ml/瓶),封口滅菌。
9)生根培養基

加蒸餾水至900ml,1N氫氧化鉀調節pH值到5.8。煮沸并定容至1000ml,分裝到生根管中(25ml/管),封口滅菌。
3、OsOAT超量表達轉基因家系滲透脅迫表型鑒定
本發明采用熒光實時定量的方法對部分轉基因水稻植株中OsOAT基因的表達進行檢測,RNA的提取,反轉錄和熒光實時定量PCR的具體步驟同實施例1(圖2B為表達量檢測結果),結果顯示,獲得了OsOAT基因的表達量相對于野生型顯著提高的轉基因植株。
本實施例選取了轉OsOAT基因(序列見序列表SEQ NO:1)的超量表達的3個家系(編號為OsOAT-OE-7,OsOAT-OE-10,OsOAT-OE-17)進行了滲透脅迫實驗。具體步驟如下:將超量表達轉基因家系(OsOAT-OE-7,OsOAT-OE-10,OsOAT-OE-17)種子去殼消毒(用濃度為70%的酒精處理1min,再用0.15%氯化汞處理10min,無菌水清洗數次),在含有50mg/L潮霉素的1/2MS培養基上發芽;將野生型中花11(ZH11)家系的種子晚一天播于不含潮霉素的1/2MS培養基上,23天后挑選發芽好且長勢一致的種子轉移到含有或不含150mM甘露醇的1/2MS培養基中繼續生長。7天后拍照并調查植株的株高(見圖3中A)。在含甘露醇培養基上超量表達轉基因ZH11植株的株高顯著高于野生型ZH11家系,而在不含甘露醇培養基上沒有顯著差異(見圖3中B)。說明超表達OsOAT基因的確具有提高轉基因植株抗滲透脅迫的能力。
4、OsOAT超量表達轉基因家系干旱脅迫表型鑒定
將經過潮霉素篩選的3個陽性OsOAT超表達轉基因家系(OsOAT-OE-7,OsOAT-OE-10,OsOAT-OE-17)和ZH11野生型家系發芽后移栽到小圓桶中。試驗用的土壤為中國南方常規的水稻土與粗沙按體積比為2:3混合而成,每圓桶等量均勻沙土加等體積水,水自行滲漏確保土壤的緊實度一致。對健康生長的4葉期的 植株進行斷水干旱脅迫6-10天(具體根據天氣情況而定),然后復水恢復7天,拍照并調查植株的存活率。結果顯示OsOAT超表達家系較野生型家系(即非轉基因植株)對干旱有較強的抗性(見圖4中A)。復水后,野生型家系存活率低于30%,而OsOAT超表達轉基因ZH11家系仍有70%以上的存活率(見圖4中B)。該試驗設3次生物學重復,結果一致。說明超表達OsOAT基因的確具有提高轉基因植株苗期抗干旱脅迫的能力
為了鑒定OsOAT超表達轉基因家系開花期的表型,將陽性OsOAT超表達轉基因ZH11家系及野生型ZH11家系種植于上面有可移動遮雨棚的沙土大田中(南方水稻土與粗沙按體積比為1:2混合而成),每行10株每家系種植2行,試驗設3次生物學重復做嚴重干旱脅迫實驗。干旱脅迫是對健康生長的開花期植株進行斷水處理15-20天(具體根據天氣情況而定,雨天有可移動遮雨棚覆蓋),再復水生長。因為在正常生長條件下,超表達轉基因ZH11植株與野生型ZH11植株對照的結實率不一致,用相對結實率(干旱脅迫下植株的結實率除以正常條件下生長植株的結實率)進行比較。結果顯示超表達轉基因ZH11植株相對結實率顯著高于野生型ZH11對照(圖5)。
5、OsOAT超量表達轉基因家系重金屬脅迫表型鑒定
將超量表達轉基因家系(OsOAT-OE-7,OsOAT-OE-17)種子去殼消毒(用濃度為70%的酒精處理1min,再用0.15%氯化汞處理10min,無菌水清洗數次),在含有50mg/L潮霉素的1/2MS培養基上發芽;將野生型(非轉基因)ZH11家系的種子晚一天播于不含潮霉素的1/2MS培養基上,2-3天后挑選發芽好且長勢一致的種子轉移到不含或含有不同濃度汞的1/2MS培養基中繼續生長。7天后拍照(見圖6中A),并調查植株的鮮重和葉綠素含量。在不同濃度汞培養基上超量表達轉基因ZH11植株的鮮重及葉綠素含量顯著高于野生型ZH11植株,而在正常培養基上沒有顯著差異(見圖6中B)。說明超表達OsOAT基因的確具有提高轉基因ZH11植株抗重金屬汞脅迫的能力。






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OSOAT 基因 控制 水稻 抗旱性 重金屬 中的 應用
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