• / 15
  • 下載費用:30 金幣  

一種FSH融合蛋白及其制備方法和用途.pdf

摘要
申請專利號:

CN201210476665.0

申請日:

2012.11.22

公開號:

CN103509121B

公開日:

2015.01.28

當前法律狀態:

授權

有效性:

有權

法律詳情: 授權|||實質審查的生效IPC(主分類):C07K 19/00申請日:20121122|||公開
IPC分類號: C07K19/00; C12N15/62; C12N15/63; A61K38/24; A61K47/48; A61P15/08 主分類號: C07K19/00
申請人: 蘇州康寧杰瑞生物科技有限公司
發明人: 徐霆; 郭康平; 汪皛皛; 吳杰; 季劍蕓; 黃艷; 須濤
地址: 215000 江蘇省蘇州市工業園區星湖街218號生物納米園C23
優先權:
專利代理機構: 中國國際貿易促進委員會專利商標事務所 11038 代理人: 劉向昕
PDF完整版下載: PDF下載
法律狀態
申請(專利)號:

CN201210476665.0

授權公告號:

103509121B||||||

法律狀態公告日:

2015.01.28|||2014.02.19|||2014.01.15

法律狀態類型:

授權|||實質審查的生效|||公開

摘要

本發明公開了一種FSH融合蛋白及其制備方法和用途,本發明的FSH融合蛋白的β亞基直接或者間接通過鏈接元件融合在FC片段上,FSH的α亞基則通過α亞基和β亞基的親和力或者鏈接元件與FSH的β亞基結合在一起,本發明的FSH融合蛋白為異二聚體或同二聚體,本發明的FSH融合蛋白的制備方法包括FSH-FC同二聚體、FSH-FC/FC異二聚體的質粒構建,FSH-FC同二聚體、FSH-FC/FC異二聚體蛋白瞬時表達及純化,本發明提供提高對象生育力的方法和治療具有對FSH治療有反應的疾病狀態的方法。

權利要求書

權利要求書
1.  一種FSH融合蛋白,其特征在于,所述的FSH融合蛋白的β亞基直接或者間接通過鏈接元件融合在FC片段上,FSH的α亞基則通過α亞基和β亞基的親和力或者鏈接元件與FSH的β亞基結合在一起。

2.  根據權利要求1所述的FSH融合蛋白,其特征在于所述的FSH融合蛋白包括三條肽鏈,為異二聚體,符合以下方程:αFSH@βFSH-L-FC:FC,其中αFSH指的是FSH的α亞基;@代表了FSHα亞基和β亞基兩條鏈之間的關系,βFSH指的是FSH的β亞基;L代表了連接FSHβ亞基和FC之間的直接或者間接鏈接元件,代表了將FSHβ亞基連接到了FC上;FC指的是免疫球蛋白的FC片段;冒號指的是融合蛋白βFSH-L-FC和FC兩條鏈之間的關系。

3.  根據權利要求1所述的FSH融合蛋白,其特征在于所述的FSH融合蛋白包括兩條肽鏈,為同二聚體,符合以下方程:(αFSH@βFSH-L-FC)2,其中αFSH指的是FSH的α亞基;@代表了FSHα亞基和β亞基兩條鏈之間的關系,βFSH指的是FSH的β亞基;L代表了連接FSHβ亞基和FC之間的直接或者間接鏈接元件,代表了將FSHβ亞基連接到了FC上;FC指的是免疫球蛋白的FC片段;括號內下標2代表著此蛋白為二價同二聚體。

4.  根據權利要求1到3任一所述的FSH融合蛋白,其所述的FSH為人FSH。

5.  根據權利要求1到3任一所述的FSH融合蛋白,其所述的FC片段包含氨基酸序列,其與SEQ ID NO:7的氨基酸序列至少具有80%的一致性。

6.  根據權利要求1到3任一所述的FSH融合蛋白,其特征在于所述的FC為人免疫球蛋白鏈恒定區。

7.  制備權利要求1所述的FSH融合蛋白的方法,其特征在于包括以下步驟:1)FSH-FC同二聚體、FSH-FC/FC異二聚體的質粒構建;FSH-FC 同二聚體的質粒構建步驟:對表達載體pcDNA4進行改造,消除其中的一個PvuII酶切位點;人工合成方法獲得人的FSHα基因SEQ ID NO:1,將FSHα基因克隆到表達載體pcDNA4m中,獲得重組質粒即:pcDNA4m-FSHα,將人工合成方法獲得人的FSHβ-Fc融合蛋白基因SEQ IDNO:4,克隆到表達載體pcDNA4m中,獲得重組質粒即:pcDNA4m-FSHβ-Fc;取pcDNA4m-FSHα、pcDNA4m-FSHβ-Fc,分別酶切,分離純化回收pcDNA4m-FSHα中含有FSHα基因的DNA片段;pcDNA4m-FSHβ-Fc含有FSHβ-Fc基因的DNA片段,隨后將FSHα和FSHβ-Fc外源基因表達原件整合于一個表達載體上,獲得重組質粒pcDNA4m-FSH-Fc,即FSH-FC同二聚體重組質粒;以pcDNA4m-FSHβ-Fc為模板,PCR擴增獲得FC基因,通過PCR引物在基因N端添加IgG1信號肽,在基因兩端分別添加酶切位點HindIII,EcoRI;PCR產物亞克隆到質粒pcDNA4m中,獲得重組質粒pcDNA4m-FC,質粒pcDNA4m-FC含有FC基因部分經酶切克隆到已構建好的pcDNA4m-FSH-Fc,獲得重組質粒pcDNA4m-FSH-Fc mono,即FSH-FC/FC異二聚體重組質粒;2)FSH-FC同二聚體、FSH-FC/FC異二聚體蛋白瞬時表達,純化。

8.  根據權利要求1所述的FSH融合蛋白的應用,是通過FSH治療降低任意對治療有反應的生殖障礙或疾病狀態的嚴重性;預防與這些障礙或疾病狀態相關的一種或多種癥狀;減少對FSH異常的疾病過程的治療時間;提高對象生育力的同時降低給藥頻率;給患有這些異常的對象提供有益幫助。

說明書

說明書一種FSH融合蛋白及其制備方法和用途
技術領域
本發明涉及人類生殖領域,更具體地說,本發明涉及促性腺激素及其制備方法及其在輔助生殖中的作用。
背景技術
促卵泡激素(Follicle Stimulating Hormone,簡稱FSH),是一種由腦垂體前葉嗜喊性細胞合成與分泌的高度糖基化蛋白,與腦垂體分泌的其他糖蛋白激素如促黃體激素(LH)、促甲狀腺激素(TSH),還有胎盤分泌的促絨毛膜激素(HCG)共同組成糖蛋白家族。都由α亞基和β亞基所組成,α亞基相同,而β亞基具有激素各自的特異性,是激素生物活性和免疫活性的決定因素。FSH的α亞基由92~96個氨基酸組成,β亞基由109-115個氨基酸組成。兩亞基通過內部二硫鍵維持自身正確的三級結構,C端殘基的位置決定其折疊的三維空間結構。糖基是以N-糖苷鍵的方式連接在α和β兩個亞基各自的區域。根據Qing R.Fan等人在nature上發表的FSH與其受體的三維結構,FSH主要通過β亞基的C端與其受體結合,同時β亞基的C端通過內部二硫鍵的固定與α亞基緊密結合,其中真正與受體的結合位點是β亞基的C端第89-105位氨基酸,它像三明治一樣,夾在α亞基的L2環和C端中間。女性卵泡顆粒細胞上含有FSH的特異性受體,FSH與受體結合后產生兩種作用,一方面活化芳香化酶,另一方面誘導LH受體生成。內膜細胞在LH作用下提供19-雄烯二酮或睪酮,這些底物通過基底膜進入顆粒細胞,活化的芳香化酶把它們轉變為17-β雄二醇。雌激素協同FSH使顆粒細胞增生,內膜細胞分化,卵泡液形成,卵泡腔擴大,從而促進卵泡生長和發育成熟。卵泡在生長過程中會釋放抑制素以阻斷卵泡刺激素的進一步合成,并呈劑量依賴關系。這一機制保證了排卵的選擇性。 男性曲細胞精管內的支持細胞是FSH的靶細胞,FSH與支持細胞上的特異性受體結合后將刺激曲細精管上皮和次級精母細胞的發育,在LH和雄激素的協同下促進精子發育成熟。因為FSH對女性的卵泡成熟和男性的精子發育有非常重要意義,因而可以單獨使用FSH或聯合LH應用治療不育不孕癥。
FSH可以從腦垂體或絕經后婦女尿液中分離得到(EP322,438),也可以重組生產(US5,639,640、US5,156,957、US4,923,805、US4,840,896、EP211,894)。通常為了獲得治療效果需要長期治療,刺激女性卵泡發生需要連續8-10天,有時高達21天,而對于低促性腺激素的男性,誘導精子發生需要高達18個月。重組hFSH通常是每天肌肉注射或皮下注射給藥,這樣的給藥方案經常伴有局部反應和不適。根據Bishop等人的總結,半衰期似乎是FSH體內活性的主要決定因素,因此開發長效rhFSH,減少給藥頻率具有實際臨床應用價值。
近年來有多篇專利及文章報道開發長效FSH,基本思路是通過增加FSH的糖基化位點來達到提高半衰期的目的。一種是在FSH分子內部增加糖基化修飾位點。WO01/58493公開了可以在FSH的a亞基進行的77種突變和可以在FSH的b亞基進行的51種突變。只是該專利沒有公開通過定點突變而引入糖基化位點的任何FSHa或b亞基的生產或測定情況。US7,740,862公開了在FSH a-亞基的氨基酸殘基第3和4位之間插入GNFT或GNRT序列,在大鼠體內半衰期約為17h,體外刺激重組表達FSH受體的CHO細胞產生環磷酸腺苷(cAMP)的能力與天然FSH相當。另外一種是在序列末端添加額外序列來增加糖基化修飾位點。目前開發比較成功的是2010年由德國默克公司上市的elonva,該類似物具有天然FSH的生物活性,但卻具有較長的循環半衰期,在人體內的半衰期約69h。蛋白具體序列在專利US5,338,835和US5,585,345中公開,是一種改造的FSH b-亞基,其C- 末端谷氨酸以hCG的羧基末端肽(CTP)基團延長。根據Pieter Verbost等人的實驗結果:該類似物在大鼠和狗體內的半衰期分別為17.3,46.9h,比重組FSH提高了1.5-2倍。Signe Perlman等人報道一種改造的FSH a-亞基,其N-末端添加“ANITVNITV”氨基酸序列。該類似物在大鼠體內半衰期為22h,比重組FSH提高了3-4倍。
IgG類免疫球蛋白為人體血液中最豐富的蛋白之一,半衰期達到21d,其穩定性是由于IgG的Fc片段可與新生Fc受體(FcRn)結合,避免IgG進入溶酶體中被降解(5-7)。因此,IgG的Fc片段被用來與活性蛋白連接構成融合蛋白,以提高活性蛋白的體內半衰期,達到長效的目的。根據鉸鏈區的長短及Fc片段氨基酸序列的不同,人IgG分為4個亞型,其中IgG Fcγ2具有較低的誘導細胞毒性作用,而IgG Fcγ1最強。IgG融合蛋白的構建方式大多是將IgG的Fc(Hinge-CH2-CH3)片段或CH(CH1-Hinge-CH2-CH3)片段的N端與活性蛋白的C端相連,以避免構建融合蛋白可能對活性蛋白生物活性造成的影響。此外,IgG的融合蛋白可以通過ProteinA親和層析得到高效便捷的純化。因此已有多篇專利報道將IgG Fc片段與其他蛋白融合可顯著延長目的蛋白的半衰期,提高體內生物活性(US5,155,027,5,428,130,5,480,981和5,808,029)
專利US0,186,662公布了通過構建FSH-FC融合蛋白同二聚體、異二聚體,在大鼠體內半衰期提高至60h。活性實驗:大鼠單次給藥后,72小時后測定卵巢重量,結果顯示FSH-FC融合蛋白相比重組FSH卵巢重量增加,從14.3mg提高至26.9mg,陰性對照為12.1mg。前面提到過,重組FSH半衰期很短,通常需要每天給藥,如果按照該實驗方案三天給藥一次,FSH基本已經代謝完畢,沒有活性。所以構建的FSH-FC融合蛋白在保證半衰期的前提下,活性還有待于提高。
臨床上需要一種產品,能夠提供FSH的部分或全部治療相關的效果, 可以比現有的FSH產品更低頻率給藥,并且和現有治療達到的FSH活性相比,可以提供更穩定的活性水平。
本發明旨在提供這類產品以及這類產品的制備方法。
發明內容
本發明提供了一種FSH的融合蛋白及其制備方法和用途,本發明的FSH融合蛋白,其特征在于,所述的FSH融合蛋白的β亞基直接或者間接通過鏈接元件融合在FC片段上,FSH的α亞基則通過α亞基和β亞基的親和力與FSH的β亞基結合在一起。
本發明的主要特征在于:本發明的FSH融合蛋白的的β亞基直接或者間接通過鏈接元件(linker)融合在FC片段上,FSH的α亞基則通過α亞基和β亞基的親和力與FSH的β亞基結合在一起(見附圖1)。通過這些FSH的融合蛋白,本發明實現了在盡量保留FSH的親和力的前提下,增強FSH的體內半衰期,在某種意義上說提供了一種通過減少有效劑量、有效地增強生育能力的方法。
本發明同US20050186662的FSH-FC融合蛋白的最大區別在于,US20050186662的融合蛋白通過間接或者直接的方法將α亞基固定在FC鏈上,而本發明的專利在于將α亞基游離出來,通過自身的親和力結合在β亞基上。本發明的原理是基于FSHα亞基的C端參與了FSH的β和α亞基與FSH受體(FSHR)的相互作用,而US20050186662的FSH-FC融合蛋白將α亞基的C端直接連在了FC的N端或者將之與β亞基串聯,使α亞基C端被FC或者β亞基遮蔽,最終造成了FSH與FSH受體親和力的丟失。本發明將α亞基游離出來,使α亞基的C端暴露出來,克服了US20050186662的缺點,使FSH能夠正常與FSH的受體結合,在增強FSH的體內半衰期的同時,最大程度的保留FSH的體內活性。
在一個方面,本發明的FSH融合蛋白包括三條肽鏈,為異二聚體(附圖1a),其特征符合以下方程:
αFSH@βFSH-L-FC:FC
其中αFSH指的是FSH的α亞基;@代表了FSHα亞基和β亞基兩條鏈之間的關系;βFSH指的是FSH的β亞基;L代表了連接FSHβ亞基和FC之間的直接或者間接鏈接元件,代表了將FSHβ亞基連接到了FC上;FC指的是免疫球蛋白的FC片段;冒號(:)指的是融合蛋白βFSH-L-FC和FC兩條鏈之間的關系。
在一個方面,本發明的FSH融合蛋白包括兩條肽鏈,為同二聚體(附圖1b),其特征符合以下方程:
(αFSH@βFSH-L-FC)2
其中αFSH指的是FSH的α亞基;@代表了FSHα亞基和β亞基兩條鏈之間的關系;βFSH指的是FSH的β亞基;L代表了連接FSHβ亞基和FC之間的直接或者間接鏈接元件,代表了將FSHβ亞基連接到了FC上;FC指的是免疫球蛋白的FC片段;括號內下標2代表著此蛋白為二價同二聚體。
本發明還涉及一種載體,該載體含有編碼SEQ ID NO:3的序列的FSHα亞基的DNA。該載體可以是表達載體。
本發明還涉及一種載體,該載體含有編碼SEQ ID NO:6的序列的FSHβ亞基的DNA。該載體可以是表達載體。
本發明還涉及一種載體,該載體含有編碼SEQ ID NO:8的序列的FC片段的DNA。該載體可以是表達載體。
本發明還涉及一種載體,該載體含有第一DNA、第二DNA及第三DNA,其中第一DNA編碼含有編碼SEQ ID NO:3的序列的FSHα的DNA,第二DNA編碼含有編碼SEQ ID NO:6的序列的FSHβ的DNA, 該載體可以是表達載體,第三DNA編碼含有編碼SEQ ID NO:8的序列的FC的DNA該載體可以是表達載體。
所述的FC包括人免疫球蛋白FC。
本發明涉及的FSH-FC融合蛋白可以用標準的實驗手段從宿主細胞中純化。例如,FSH-FC融合蛋白包含了FC,蛋白則可以用蛋白A來純化。純化方法包括但不限于色譜技術如體積排阻、離子交換、親和色譜法及超濾法。本發明涉及的融合蛋白的分離純化方法也包括上述各種方法的適當組合。
所述的FSH-FC融合蛋白包括FC,優選人免疫球蛋白FC。在一般情況下,人免疫球蛋白FC區域的CH3區域多肽來源于野生型的人免疫球蛋白FC區域。野生型的人免疫球蛋白FC指發生在人群中的氨基酸序列,當然FC序列在個體中會有一些細微的差異。本發明中人免疫球蛋白FC也包括對于野生型人免疫球蛋白FC序列的氨基酸個別的改變,比如,FC區域局部某些氨基酸的改變,如包括某些在糖基化位點突變的氨基酸,或者其他無義的突變;也包括根據“把手-孔洞”模型突變的個別氨基酸的改變。
本發明的人免疫球蛋白FC指的是人免疫球蛋白鏈恒定區,特別是免疫球蛋白重鏈恒定區的羧基端或其中的一部分。例如,免疫球蛋白FC區可包括重鏈CH1、CH2、CH3、CH4的兩個或更多結構域與免疫球蛋白鉸鏈區的組合。根據重鏈恒定區的氨基酸序列,免疫球蛋白可以分為不同的種類,主要有5類免疫球蛋白:IgA,IgD,IgE,IgG和IgM,其中一些還可進一步分成亞類(同種型),如IgG-1,IgG-2,IgG-3,IgG-4,IgA-1和IgA-2。從特定的免疫球蛋白類別和亞類中選擇特定的免疫球蛋白FC區在本領域技術人員所掌握的范圍之內。
在具體實施方式中,本發明所用的人免疫球蛋白FC包括至少一個免疫球蛋白絞鏈區,一個CH2結構域和一個CH3結構域,具體為人IgG1 FC。
本發明涉及的哺乳動物宿主細胞包括但不限于CHO,293,骨髓瘤細胞。宿主細胞也可以是酵母或者原核細胞如E.Coli。
本發明涉及的治療領域包括,通過FSH治療降低任意對治療有反應的生殖障礙或疾病狀態的嚴重性;預防與這些障礙或疾病狀態相關的一種或多種癥狀;減少FSH異常的疾病過程的治療時間;給患有這些異常的對象提供有益效果(例如:增強生育力),治愈FSH異常或生殖障礙。
本發明提供了一個在不丟失FSH的體內活性的基礎上增強FSH的體內半衰期的FSH-FC片段的融合的方法。具體方式是將FSH的β亞基融合于FC片段上,并利用FSHα亞基與β亞基的自身親和力的特性,單獨表達FSHα亞基。本發明將提供FSH的部分或全部治療相關的效果,可以比現有的FSH產品更低頻率給藥,并且和現有治療達到的FSH活性相比,可以提供更穩定的活性水平。
附圖說明
下面結合附圖和具體實施方式對本發明作進一步詳細的說明。
圖1為FSH-FC融合蛋白異二聚體及同二聚體示意圖。
圖2為FSH-FC同二聚體重組質粒。
圖3為FSH-FC/FC異二聚體重組質粒。
圖4為FSH-FC同二聚體、FSH-FC/FC異二聚體經一步純化后SDS-PAGE圖譜。
FSH-FC同二聚體SDS-PAGE圖譜1,非還原膠樣品不煮沸;2,非還原膠樣品煮沸;M,Marker;3,還原膠。
FSH-FC/FC異二聚體SDS-PAGE圖譜1,非還原膠樣品不煮沸;2,非還原膠樣品煮沸;M,Marker;3,還原膠。
圖5為FSH-FC/FC異二聚體平均C-T曲線。
圖6為FSH-FC/FC單克隆篩選還原SDS-PAGE圖譜。
具體實施方式
下面給出一種根據本發明制備的非限定性的實施例。
實施例一FSH-FC同二聚體、FSH-FC/FC異二聚體的質粒構建
1.FSH-FC同二聚體的質粒構建
商業化哺乳動物細胞表達載體pcDNA4/myc-HisA的改造。商業化載體pcDNA4/myc-HisA(Invitrogen,V863-20)含有兩個PvuII酶切位點,分別在大約1411,3160bp的位置。對質粒定點突變,將3106bp位置的堿基C突變為G,去除在該位置的PvuII酶切位點,只保留在大約1411bp處的一個酶切位點,新的載體命名為pcDNA4m。
根據基因庫中搜索到的人FSHα亞基基因序列(Gene bank No.NP_000726.1),人工合成方法獲得人的FSHα基因(SEQ ID NO:1),合成好的FSHα基因經Takara公司的HindIII與EcoRI雙酶切亞克隆到改造的載體pcDNA4m中,測序驗證構建質粒的準確性,獲得重組質粒DNA即:pcDNA4m-FSHα。
人的FSHα序列見SEQ ID NO:1,信號肽序列見(SEQ ID NO:2),編碼該序列的核苷酸序列見SEQ ID NO:3。
根據基因庫中搜索到的人FSHβ亞基基因序列(Gene bank No.NP_000501.1),人IgG1的Fc片段(hing-CH2-CH3)基因序列,人工合成方法獲得人的FSHβ-Fc融合蛋白基因(SEQ ID NO:4),合成好的FSHβ-Fc基因經Takara公司的HindIII與EcoRI雙酶切亞克隆到改造的載體pcDNA4m,測序驗證構建質粒的準確性,獲得重組質粒DNA即:pcDNA4m-FSHβ-Fc。
人的FSHβ-Fc融合蛋白基因序列見SEQ ID NO:4,信號肽序列見 SEQ ID NO:5,編碼該序列的核苷酸序列見SEQ ID NO:6。
取上述構建成功的單基因表達載體pcDNA4m-FSHα用Takara公司的Bgl II,Pvu II雙酶切。酶切產物通過0.8%的瓊脂糖電泳分離純化,并回收約1.6kb大小含有FSHα基因的DNA片段;pcDNA4m-FSHβ-Fc經BglII,NruI雙酶切回收約6kb大小含有FSHβ-Fc基因的DNA片段。隨后將酶切處理過的DNA片段進行連接,整合FSHα和FSHβ-Fc外源基因表達原件于一個表達載體上,獲得重組質粒pcDNA4m-FSH-Fc,即FSH-FC同二聚體重組質粒(見附圖2)。
2.FSH-FC/FC異二聚體的質粒構建
以pcDNA4m-FSHβ-Fc為模板,設計引物進行PCR擴增獲得FC基因,通過PCR引物在基因N端添加IgG1信號肽(5’METDTLILWRLLLWVPGSTLGSA3’),在基因兩端分別添加酶切位點HindIII,EcoRI,PCR產物經雙酶切亞克隆到改造的載體pcDNA4m中,獲得重組質粒pcDNA4m-Fc。用Takara公司的Nru I,Pvu II對重組質粒進行雙酶切,酶切產物通過0.8%的瓊脂糖電泳分離純化,回收約1.8kb大小含有Fc的DNA片段。通過平末端連接,將其連入經Nru I單酶切,并經過CIAP去磷酸化處理的pcDNA4m-FSH-Fc質粒中,獲得重組質粒pcDNA4m-FSH mono,即FSH-FC/FC異二聚體重組質粒。質粒圖譜如附圖3所示,基因FSHa,FSHβ-FC,FC以摩爾比1∶1∶1的方式構建至同一個質粒,最終表達的蛋白FSH-FC,FC以三種方式存在:FSH-FC同二聚體、FSH-FC/FC異二聚體和FC同二聚體,理論上三者之間的摩爾比為1∶2∶1。
采用Qiagen的中抽試劑盒,按照說明書操作,獲得去除內毒素的重組質粒pcDNA4m-FSH-Fc,pcDNA4m-FSH mono。
實施例二FSH-FC同二聚體、FSH-FC/FC異二聚體蛋白表達和純化
1.FSH-FC同二聚體、FSH-FC/FC異二聚體蛋白瞬時表達
轉染前兩天,準備500ml經懸浮馴化的HEK293(ATCC,CRL-1573TM)細胞用于瞬時轉染,接種密度為0.8×106cells/ml。兩天后對待轉染細胞懸液進行計數細胞密度為3.5~4×106cells/ml,取細胞懸液1000rpm離心5min,棄上清液。用100ml的新鮮的Freestyle293培養基重新懸浮細胞,再次1000rpm離心5min,棄上清液。用500ml Freestyle293培養基重新懸浮293細胞。分別用2.5ml Freestyle293培養基稀釋250ug pcDNA4m-FSH-Fc,pcDNA4m-FSH mono質粒,5ml Freestyle293培養基稀釋1.5mlPEI(Polyethylenimine),分別將2.5ml質粒和2.5ml的PEI混勻,室溫5分鐘。將質粒/PEI混合物分別加入250ml細胞懸液中,放置在37度,10%CO2,90rpm中培養;同時補加50ug/L IGF-1。四小時后分別補加250ml EX293培養基,2mM Glutamine和50ug/L IGF-1,135rpm培養。二十四小時后加3.8mM VPA,培養5~6天收集500mlSH-FC同二聚體、FSH-FC/FC異二聚體上清液準備純化。
2.FSH-FC同二聚體、FSH-FC/FC異二聚體蛋白純化
首先,FcRn蛋白交聯至NHS-activated agrose resin(Thermo),細胞液經離心,取上清0.22um過濾后上載到FcRn柱子上,然后用20mM PB,50mMNaCl,pH6.2漂洗后,最后用20mM PB,50mMNaCl,pH7.4洗脫目的蛋白。經一步純化后,SDS-PAGE結果如下圖所示。Fc融合蛋白是通過Fc之間二硫鍵結合的,在非還原膠即不加入DTT強還原劑的情況下,Fc的鏈接二硫鍵沒有被破壞,融合蛋白以二聚體的形式存在。而FSH的兩個亞基α、β是以非共價鍵的方式結合,在非還原膠樣品不經過煮沸的情況下,非共價鍵沒有遭到破壞;在非還原膠煮沸的情況下,兩個亞基之間的二硫鍵斷裂。所以電泳分別采取還原、非還原樣品煮沸及不煮沸的方式進行檢測。經一步純化后,FSH-FC同二聚體蛋白純度達90%以上;FSH-FC/FC異二聚體重組質粒,蛋白表達后以混合物的形式存在:FSH-FC同二聚體、 FSH-FC/FC異二聚體和FC同二聚體,摩爾比大致為1∶2∶1,與理論推測相符合(見附圖4)。
實施例三FSH-FC同二聚體,FSH-FC/FC異二聚體大鼠體內藥效動力學研究
評價FSH-FC同二聚體,FSH-FC/FC異二聚體蛋白體內生物學活性的模型是大鼠卵巢重量增加法。使用FSH或具有FSH活性的分子,治療未成熟的21日齡雌性大鼠,觸發卵巢卵泡生長和卵細胞產生。這種生長通過測量治療末期卵巢重量很容易探測。該方法作為給臨床產品標定FSH活性已經使用了數十年,它能衡量FSH的相關生理學作用,與臨床產品的表現有明確的相關性。
取健康合格,出生21天左右的Sprague-Dawley雌鼠,按照中國藥典附錄121的實驗方案進行FSH-FC同二聚體,FSH-FC/FC異二聚體蛋白動物體內研究。給藥劑量分高、中、低三組(依次為2.5、1.25、0.5U),對照品Gonal-F(比活預估10,000U/mg)每日給藥一次,樣品FSH-FC同二聚體、FSH-FC/FC異二聚體蛋白(比活預估1,000U/mg)只給藥一次,72小時后進行卵巢稱重,運用《中檢所藥典生物檢定統計BS2000程序3.3法》計算,結果顯示Gonal-F比活為11,000IU/mg,樣品FSH-FC/FC異二聚體蛋白比活為1,300IU/mg,樣品FSH-FC同二聚體蛋白比活100U/mg。結果表明:相對于Gonal-F連續三天每日給藥一次,FSH-FC/FC異二聚體蛋白在只給藥一次的情況下,仍然具有一定的FSH活性。根據Gonal-F的產品說明書,臨床推薦給藥劑量為75IU,即可以推算FSH-FC/FC異二聚體蛋白的臨床給藥劑量約為17微克,在合理給藥劑量范圍內。
實施例四FSH-FC/FC異二聚體大鼠體內藥代動力學研究
將具有一定FSH活性的FSH-FC/FC異二聚體蛋白進行大鼠體內藥代動力學研究。具體方案如下:采用16只出生21天左右的Sprague-Dawley 雌鼠,接受靜脈注射FSH-FC/FC異二聚體蛋白,注射劑量10U。選擇未成熟雌性大鼠是基于使用該年齡、性別來進行FSH體內活性測定。采用眼眶采血的方式,給藥0,1,2,4,12,24,48,72,96,144,192小時采血,每次采血體積100ul,離心后取血清凍存與-80度待ELISA分析。使用FSH ELISA試劑盒進行檢測,每個血清樣品重復分析三次。結果如下圖所示:FSH-FC/FC異二聚體蛋白的半衰期為30-40小時(文獻報道標準品重組FSH為12h)(見附圖5)。
實施例五FSH-FC/FC異二聚體高表達穩定細胞株的獲得
根據前期實驗結果,FSH-FC/FC異二聚體蛋白具有一定的FSH活性,同時在大鼠體內的半衰期約30-40h,是對照品Gnoal-F的3倍多,具有很好的臨床應用前景,因此試圖獲得FSH-FC/FC異二聚體穩定細胞株,為后期工藝開發及產業化做準備。穩定細胞株獲得的具體方案:將對數生長期的HEK293(ATCC,CRL-1573TM)細胞以1×105cell/孔濃度接種于24孔板,用完全培養基(含10%胎牛血清的DMEM培養基)培養24h,第二天使細胞匯合度達到75%~85%。使用Lipofectamine2000轉染試劑(Invitrogen,P/N52887)轉染重組質粒pcDNA4m-FSH mono。轉染5h后換液,每孔加入400ul完全培養基,24小時后將細胞以1∶10比例傳代到含有10ml新鮮完全培養基的細胞培養皿中,24小時后更換篩選培養基(含200ug/ml zeocin的完全培養基),每隔3-4天更換一次篩選培養基。4-6周以后挑取單克隆傳代到24孔板,約4-5天至匯合度達到80%-100%時進行單克隆篩選。單克隆篩選策略:第一輪檢測用Fc ELISA試劑盒檢測,共篩選了309個克隆。根據ELISA結果,結合菌落大小情況,選取102個Fc表達水平相對較高的克隆,傳代培養至6孔板,使用FSH ELISA試劑盒(DRG,E1A-1288)檢測FSH表達量,篩選陽性克隆。選取FSH表達水 平相對較高的克隆進行非還原SDS-PAGE電泳。
前面已提到過,基因FSHa,FSHb-FC,FC以摩爾比1∶1∶1的方式構建至質粒pcDNA4m-FSH-Fc mono,最終表達的蛋白FSH-FC,FC以三種方式存在:FSH-FC同二聚體、FSH-FC/FC異二聚體和FC同二聚體,一般情況下三者之間的摩爾比為1∶2∶1。我們最終的目的產物是FSH-FC/FC,蛋白具有FSH活性且半篩期在大鼠體內是FSH的3-4倍,另外,考慮到后續的蛋白純化工藝,FSH-FC/FC異二聚體和FC同二聚體蛋白的分離,比其與FSH-FC同二聚體的蛋白分離要容易的多。所以我們的蛋白電泳篩選標準是FSH-FC/FC異二聚體蛋白占主要部分,FSH-FC同二聚體含量較低。最終篩選到的部分非還原SDS-PAGE電泳圖譜如附圖6所示,根據電泳情況最終選取第2、3、6和9泳道的克隆進行后續細胞培養及純化工藝的開發。其中值得一提的是第6泳道的克隆,表達產物基本是以FSH-FC/FC異二聚體的形式存在,FSH-FC同二聚體蛋白含量很低,使后續的蛋白純化工藝開發變得簡單。以上所述,僅為本發明較佳的具體實施方式,但本發明的保護范圍并不局限于此,任何熟悉本技術領域的技術人員在本發明揭露的技術范圍內,可輕易想到的變化或替換,都應涵蓋在本發明的保護范圍之內。因此,本發明的保護范圍應該以權利要求書的保護范圍為準。



關 鍵 詞:
一種 FSH 融合 蛋白 及其 制備 方法 用途
  專利查詢網所有資源均是用戶自行上傳分享,僅供網友學習交流,未經上傳用戶書面授權,請勿作他用。
關于本文
本文標題:一種FSH融合蛋白及其制備方法和用途.pdf
鏈接地址:http://www.rgyfuv.icu/p-6419325.html
關于我們 - 網站聲明 - 網站地圖 - 資源地圖 - 友情鏈接 - 網站客服客服 - 聯系我們

[email protected] 2017-2018 zhuanlichaxun.net網站版權所有
經營許可證編號:粵ICP備17046363號-1 
 


收起
展開
山东11选5中奖结果走势图