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大豆轉錄因子GMMYB174A及其編碼基因與應用.pdf

摘要
申請專利號:

CN201210293058.0

申請日:

2012.08.16

公開號:

CN103588867B

公開日:

2015.01.28

當前法律狀態:

授權

有效性:

有權

法律詳情: 授權|||實質審查的生效IPC(主分類):C07K 14/415申請日:20120816|||公開
IPC分類號: C07K14/415; C12N15/29; C12N15/63; C12N5/10; C12N1/15; C12N1/19; C12N1/21; C12N15/11; A01H5/00 主分類號: C07K14/415
申請人: 中國科學院遺傳與發育生物學研究所
發明人: 陳受宜; 張勁松; 王昉; 陳昊偉; 張萬科; 馬彪; 林晴
地址: 100101 北京市朝陽區北辰西路1號院2號
優先權:
專利代理機構: 北京紀凱知識產權代理有限公司 11245 代理人: 關暢
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法律狀態
申請(專利)號:

CN201210293058.0

授權公告號:

103588867B||||||

法律狀態公告日:

2015.01.28|||2014.03.19|||2014.02.19

法律狀態類型:

授權|||實質審查的生效|||公開

摘要

本發明公開了一種大豆轉錄因子GmMYB174a及其編碼基因與應用。本發明提供了一種蛋白,是如下(a)或(b):(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質;(b)將序列表中序列1所示的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物耐逆性相關的由序列1衍生的蛋白質。本發明的實驗證明,本發明發現了一個GmMYB174a基因,其在大豆中的表達受到高鹽、干旱、低溫及植物激素ABA處理的誘導。本發明對培育耐非生物脅迫(耐鹽)的作物、林草等新品種具有重要價值,可用于農牧業和生態環境治理所需的耐逆性植物品種的培育和鑒定,對在干旱/高鹽土壤中農作物產量的提高有重要意義。

權利要求書

權利要求書
1.  一種蛋白,是如下(a)或(b):
(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質;
(b)將序列表中序列1所示的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物耐逆性相關的由序列1衍生的蛋白質。

2.  編碼權利要求1所述蛋白的基因。

3.  如權利要求2所述的基因,其特征在于:所述基因是如下(1)或(2)或(3)的DNA分子:
(1)序列表中序列2所示的DNA分子;
(2)在嚴格條件下與(1)限定的DNA序列雜交且編碼植物耐逆性相關蛋白的DNA分子;
(3)與(1)限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有99%同源性且編碼植物耐逆性相關蛋白的DNA分子。

4.  含有權利要求2或3所述基因的重組載體、表達盒、轉基因細胞系或重組菌。

5.  如權利要求4所述的重組載體,其特征在于:
所述重組載體為將權利要求1所述蛋白的編碼基因插入表達載體中,得到表達權利要求1所述蛋白的重組載體。

6.  擴增權利要求2或3所述基因全長或其任意片段的引物對。

7.  如權利要求6所述的引物對,其特征在于:所述引物對中的一條引物的核苷酸序列為序列表中的序列3,所述引物對中的另一條引物的核苷酸序列為序列表中的序列4。

8.  權利要求1所述蛋白、權利要求2或3所述基因或權利要求4所述重組載體、表達盒、轉基因細胞系或重組菌在培育耐逆性植物中的應用。

9.  如權利要求8所述的應用,其特征在于:
所述耐逆性為耐旱性和/或耐鹽性;
所述植物為雙子葉植物或單子葉植物。

10.  如權利要求8或9所述的應用,其特征在于:所述雙子葉植物為大豆。

說明書

說明書大豆轉錄因子GmMYB174a及其編碼基因與應用
技術領域
本發明涉及生物技術領域,尤其涉及一種大豆轉錄因子GmMYB174a及其編碼基因與應用。
背景技術
環境中物理化學因素的變化,例如干旱、鹽堿、低溫等對植物的生長發育有重要影響,嚴重時會造成農作物大規模減產,培育耐逆性作物是種植業的主要目標之一。目前,基因工程育種已經成為增強作物耐逆性的重要方法之一。高等植物細胞有多種途徑應答環境中的各種逆境脅迫,其中轉錄因子起著調控耐逆相關效應基因表達的作用。植物中已經發現了多類轉錄因子與植物耐逆性相關,例如:EREBP/AP2中的DREB類,bZIP,MYB,WRKY等等。
MYB類轉錄因子家族是指含有MYB結構域的一類轉錄因子。MYB結構域是一段約51~53個氨基酸的肽段,包含一系列高度保守的氨基酸殘基和間隔序列。
自從1987年克隆了玉米與色素合成有關的ZmMYBC1基因后,又從很多植物中分離到功能各異的MYB因。植物的MYB蛋白大都只含有兩個MYB結構域,它們是一個大轉錄因子家族,參與許多生物學過程,例如,次生代謝的調節,控制細胞分化,應答激素刺激和外界環境脅迫以及抵抗病原菌的侵害。植物中還發現了含一個MYB結構域的MYB蛋白以及含3個MYB結構域的MYB蛋白。它們可能分別在維持染色體結構的完整性、調節基因轉錄和參與細胞周期的控制和調節細胞的分化上起重要作用。
MYB是植物中最大的轉錄因子家族之一,研究表明,MYB參與非生物脅迫的應答。在非生物脅迫調控信號途徑中,MYB基因存在受ABA誘導和不受ABA誘導或甚至受抑制表達,表明MYB轉錄因子對非生物脅迫應答時可能參與ABA調控途徑,也可參與非ABA調控途徑。擬南芥MYB家族成員Atmyb2受干旱脅迫快速誘導,并且也受高鹽和外源ABA誘導表達。過量表達能增強轉基因植株的干旱耐性;擬南芥MYB成員HOS10的突變植株hos10-1對冷害的適應能力急劇減弱,并對脫水和NaCl處理高度敏感;在脫水脅迫條件下,ABA的含量增加。這表明HOS10對冷害適應是必需的,并通過控制ABA生物合成來影響植株的脫水脅迫的耐性。而下列基因是不受ABA誘導,擬南芥HPPBF-1是受鹽誘導表達的單一MYB類型的MYB轉錄因子基因;水稻Osmyb4受低溫誘導,在擬南芥中過量表達能夠增加轉基因植株的冷害和凍害抗性。對擬南芥1500個鹽效應基因進行分類,發現受NaCl誘導的MYB基因僅四個。
發明內容
本發明的一個目的是提供一種大豆轉錄因子GmMYB174a及其編碼基因。
本發明提供種蛋白,名稱為GmMYB174a,來源于大豆屬大豆(Glycine max(L.)Merrill),是如下(a)或(b):(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質;(b)將序列表中序列1所示的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物耐逆性相關的由序列1衍生的蛋白質。
上述序列表中的序列1由361個氨基酸殘基組成。
上述(a)或(b)中的蛋白可人工合成,也可先合成其編碼基因,再進行生物表達得到。上述(b)中的蛋白的編碼基因可通過將序列表中序列1所示的DNA序列缺失一個或幾個氨基酸殘基的密碼子,和/或進行一個或幾個堿基對的錯義突變,和/或在其5′端和/或3′端連上表2所示的標簽的編碼序列得到。
上述蛋白的氨基酸序列中一個或幾個氨基酸殘基的取代、替換和/或添加,有的是由于自然發生的變異引起的,有的是由人工誘變處理引起的。
編碼是上述蛋白的基因也是本發明保護的范圍。
上述基因是如下(1)或(2)或(3)的DNA分子:
(1)序列表中序列2所示的DNA分子;
(2)在嚴格條件下與(1)限定的DNA序列雜交且編碼植物耐逆性相關蛋白的DNA分子;
(3)與(1)限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有99%同源性且編碼植物耐逆性相關蛋白的DNA分子。
上述序列表序列2由1086個核苷酸組成,且編碼區為自5’末端第1-1086位核苷酸。
上述嚴格條件可為如下:50℃,在7%十二烷基硫酸鈉(SDS)、0.5M NaPO4和1mM EDTA的混合溶液中雜交,在50℃,2×SSC,0.1%SDS中漂洗;還可為:50℃,在7%SDS、0.5M NaPO4和1mM EDTA的混合溶液中雜交,在50℃,1×SSC,0.1%SDS中漂洗;還可為:50℃,在7%SDS、0.5M NaPO4和1mM EDTA的混合溶液中雜交,在50℃,0.5×SSC,0.1%SDS中漂洗;還可為:50℃,在7%SDS、0.5M NaPO4和1mM EDTA的混合溶液中雜交,在50℃,0.1×SSC,0.1%SDS中漂洗;還可為:50℃,在7%SDS、0.5M NaPO4和1mM EDTA的混合溶液中雜交,在65℃,0.1×SSC,0.1%SDS中漂洗;也可為:在6×SSC,0.5%SDS的溶液中,在65°C下雜交,然后用2×SSC,0.1%SDS和1×SSC,0.1%SDS各洗膜一次。
含有上述基因的重組載體、表達盒、轉基因細胞系或重組菌均屬于本發明的保護范圍。
上述重組載體為將上述蛋白的編碼基因插入表達載體中,得到表達上述蛋白的重 組載體;上述重組載體可以pPROK-II為出發載體,在pPROKII的多克隆位點XbaⅠ和KpnⅠ間插入自序列表中序列1的自5’末端的第1-1086位脫氧核苷酸得到的重組質粒pPROKII-GmMYB174a。
上述植物表達載體包括雙元農桿菌載體和可用于植物微彈轟擊的載體等。所述植物表達載體還可包含外源基因的3’端非翻譯區域,即包含聚腺苷酸信號和任何其它參與mRNA加工或基因表達的DNA片段。所述聚腺苷酸信號可引導聚腺苷酸加入到mRNA前體的3’端,如農桿菌冠癭瘤誘導(Ti)質粒基因(如胭脂合成酶Nos基因)、植物基因(如大豆貯存蛋白基因)3’端轉錄的非翻譯區均具有類似功能。
使用GmMYB174a構建重組植物表達載體時,在其轉錄起始核苷酸前可加上任何一種增強型啟動子或組成型啟動子(如花椰菜花葉病毒(CAMV)35S啟動子、玉米的泛素啟動子(Ubiquitin)),或組織特異表達啟動子(如種子特異表達的啟動子),它們可單獨使用或與其它植物啟動子結合使用。此外,使用本發明的基因構建植物表達載體時,還可使用增強子,包括翻譯增強子或轉錄增強子,這些增強子區域可以是ATG起始密碼子或鄰接區域起始密碼子等,但必需與編碼序列的閱讀框相同,以保證整個序列的正確翻譯。所述翻譯控制信號和起始密碼子的來源是廣泛的,可以是天然的,也可以是合成的。翻譯起始區域可以來自轉錄起始區域或結構基因。
為了便于對轉基因植物細胞或植物進行鑒定及篩選,可對所用植物表達載體進行加工,如加入可在植物中表達的編碼可產生顏色變化的酶或發光化合物的基因(GUS基因、螢光素酶基因等)、具有抗性的抗生素標記物(慶大霉素標記物、卡那霉素標記物等)或是抗化學試劑標記基因(如抗除莠劑基因)等。
擴增上述基因全長或其任意片段的引物對也屬于本發明的保護范圍。
上述引物對中的一條引物的核苷酸序列為序列表中的序列3,所述引物對中的另一條引物的核苷酸序列為序列表中的序列4。
上述蛋白、上述基因或上述重組載體、表達盒、轉基因細胞系或重組菌在培育耐逆性植物中的應用也是本發明保護的范圍。
上述應用中,所述耐逆性為耐旱性和/或耐鹽性;
上述應用具體為將所述基因通過所述重組載體導入所述目的植物中,得到轉基因毛狀根,所述轉基因毛狀根的增長率大于與轉空載體毛狀根;其中,轉空載體毛狀根為將pROKⅡ轉入目的植物得到的轉空載體毛狀根。
所述植物為雙子葉植物或單子葉植物;所述雙子葉植物優選為豆科植物,如大豆、百脈根、苜蓿、花生、綠豆、蕓豆、菜豆等;或其它雙子葉植物,如油菜、黃瓜、番茄、白菜、煙草、茄子等;所述單子葉植物優選為水稻、小麥、玉米、草坪草等;也可以為樹,如楊樹、合歡、槐樹、水黃皮等。
上述轉化的細胞、組織或植物理解為不僅包含轉化過程的最終產物,也包含其轉基因子代。
本發明中所述的“多核苷酸”、“多核苷酸分子”、“多核苷酸序列”、“編碼序列”、“開放閱讀框(ORF)”等包括單鏈或雙鏈的DNA和RNA分子,可包含一個或多個原核序列,cDNA序列,包含外顯子和內含子的基因組DNA序列,化學合成的DNA和RNA序列,以及有義和相應的反義鏈。
本發明基因可通過如下方式導入宿主中:將本發明基因插入表達盒中,再將表達盒通過植物表達載體、非致病自我復制的病毒或農桿菌導入宿主。攜帶本發明基因的表達載體可通過使用Ti質粒、Ri質粒、植物病毒載體、直接DNA轉化、顯微注射、電導、農桿菌介導等常規生物學方法轉化植物細胞或組織。
轉入本發明基因的植物,可以在該物種中繁殖該基因,也可用常規育種技術將該基因轉移進入相同物種的其它品種,特別包括商業品種中。
本發明基因可通過如下方式導入宿主中:將本發明基因插入表達盒中,再將表達盒通過植物表達載體、非致病自我復制的病毒或農桿菌導入宿主。攜帶本發明基因的表達載體可通過使用Ti質粒、Ri質粒、植物病毒載體、直接DNA轉化、顯微注射、電導、農桿菌介導等常規生物學方法轉化植物細胞或組織。
本發明的基因可以在序列2的基礎上進行以下修飾,再導入宿主中,以達到更好的表達效果:
1)為了在轉基因植物中表達本發明核苷酸序列,本發明核苷酸序列可根據實際需要進行修飾和優化。如可根據受體植物所偏愛的密碼子,在保持本發明所述核苷酸序列編碼的氨基酸的同時改變其密碼子以符合植物偏愛性。而且,優化過程中,最好能使優化后的編碼序列中保持一定的GC含量,以最好地實現植物中導入基因的高水平表達,其中GC含量可為35%,優選為多于45%,更優選為多于50%,最優選多于約60%。
2)為了翻譯的有效起始,可以修飾鄰近起始甲硫氨酸的基因序列。例如,利用在植物中已知的有效的序列進行修飾。
3)將本發明基因與各種植物表達的啟動子連接,以利于其在植物中的表達。所述啟動子可包括組成型、誘導型、時序調節、發育調節、化學調節、組織優選和組織特異性啟動子。啟動子的選擇將隨著表達時間和空間需要而變化,而且也取決于靶物種。例如組織或器官的特異性表達啟動子,根據需要受體在發育的什么時期而定。盡管證明了來源于雙子葉植物的許多啟動子在單子葉植物中是可起作用的,反之亦然,但是理想地,選擇雙子葉植物啟動子用于雙子葉植物中的表達,單子葉植物的啟動子用于單子葉植物中的表達。
優選的組成型啟動子包括CaMV 35S和19S啟動子。所述啟動子還可為來源于在大多數細胞類型中表達的幾種肌動蛋白基因中的啟動子。另一個優選的組成型啟動子為泛素啟動子。上述啟動子還可為在根、木髓、葉或花粉中引導表達的啟動子,即組織特異性啟動子。棉花核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶啟動子(美國專利US 6,040,504)、水稻蔗糖合酶啟動子(美國專利US 5,604,121)、夜香樹黃化葉卷曲病毒啟動子(WO 01/73087)。
化學誘導型啟動子可為Rab29A啟動子(美國專利US 5,614,395)。
4)將本發明基因與適合的轉錄終止子連接,也可以提高本發明基因的表達效率。例如來源于CaMV的tml,來源于rbcS的E9。任何已知在植物中起作用的可得到的終止子都可以與本發明基因進行連接。
5)可向本發明基因中引入增強子序列,如內含子序列(例如來源于Adhl和bronzel)和病毒前導序列(例如來源于TMV,MCMV和AMV)。
在實際操作中,也可以將本發明基因進行細胞靶向定位。可利用本領域現有的技術實現。例如,將來源于靶向細胞器的靶基因序列與本發明基因序列融合,再導入植物細胞中,就可定位了。
上述重組載體中的出發載體可根據所使用的轉化技術及靶植物物種的特性進行選擇。上述選擇可體現在載體中的抗性標記的選擇上。對于一些靶物種,可以優選不同的抗生素或除草劑選擇性標記。通常用在轉化中的選擇性標記包括賦予對卡那霉素和相關抗生素抗性的nptII基因,賦予對除草劑膦絲菌素抗性的bar基因,,賦予對抗生素潮霉素抗性的hph基因,和賦予對methatrexate抗性的dhfr基因,賦予對草甘磷抗性的EPSPS基因,和提供代謝甘露糖能力的甘露糖-6-磷酸異構酶基因。
本發明的實驗證明,本發明發現了一個GmMYB174a基因,其在大豆中的表達受到高鹽、干旱、低溫及植物激素ABA處理的誘導。將GmMYB174a基因導入大豆科豐一號根中,獲得轉GmMYB174a基因的毛狀根。在鹽和干旱分別脅迫后的毛狀根的表型分析證明,轉GmMYB174a基因的毛狀根生長狀態均明顯好于對照(轉空載體毛狀根),說明本發明提供的轉GmMYB174a基因的毛狀根能夠顯著提高植物的耐鹽/旱性。本發明對于培育耐逆植物品種,特別是培育耐非生物脅迫(耐鹽)的作物、林草等新品種具有重要價值,可用于農牧業和生態環境治理所需的耐逆性植物品種的培育和鑒定,對在干旱/高鹽土壤中農作物產量的提高有重要意義。
下面結合附圖及具體實施例對本發明做進一步說明。
附圖說明
圖1為GmMYB174a基因在各種處理下的表達特征
圖2為植物表達載體pPROKII-GmMYB174a示意圖
圖3為GmMYB174a過表達毛狀根在正常條件下的生長
圖4為轉GmMYB174a基因毛狀根的耐鹽性分析
圖5為轉GmMYB174a基因毛狀根的耐旱性分析
具體實施方式
下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明,均為常規方法。
下述實施例中所用的材料、試劑等,如無特殊說明,均可從商業途徑得到。
下述實施例中的%,如無特殊說明,均為質量百分含量。以下實施例中的定量試驗,均設置三次重復實驗,數據為三次重復實驗的平均值或平均值±標準差。
所有植物材料均生長于22°C每天的光照為16h/8h(光照/黑暗)。
大豆科豐1號(Glycine max L.Merr.Kefeng 1)記載在W.K.Zhang,Y.J.Wang,G.Z.Luo,J.S.Zhang,C.Y.He,X.L.Wu,J.Y.Gai,S.Y.Chen,QTL mapping of ten agronomic traits on the soybean(Glycine max L.Merr.)genetic map and their association with EST markers,Theor.Appl.Genet,2004,108:1131-1139;也記載在王修強、蓋鈞鎰、喻德躍,廣譜抗源科豐1號對大豆花葉病毒強毒株系群SC-8抗性的遺傳研究,大豆科學,2003年03期;公眾可從中科院遺傳與發育生物學研究所獲得;
pROKII載體(雙元表達載體)記載在D.C.Baulcombe,G.R.Saunders,M.W.Bevan,M.A.Mayo and B.D.Harrison,Expression of biologically active viral satellite RNA from the nuclear genome of transformed plants.Nature 321(1986),pp.446–449中,公眾可以從中國科學院遺傳與發育生物學研究所獲得。
發根農桿菌K599記載在Attila Kereszt,et al.,Agrobacterium rhizogenes-mediaded transformation of soybean to study of root biology,Nature Protocols,2007,2(4),549-552)中,公眾可從Peter M Gressnon教授,The University of Queensland,St Lucia,Queensland 4072,Australia,獲得,或經Peter M Gressnon教授同意(書面同意書)后由中科院遺傳與發育生物學研究所獲得。
哥倫比亞生態型擬南芥(col-0):種子購自Arabidopsis Biological Resource Center(ABRC)。
實施例1、大豆轉錄因子GmMYB174a基因的克隆和表達
在對大豆轉錄因子MYB家族在高鹽、干旱和低溫脅迫應答反應研究中發現有個基因受上述處理的誘導,將其命名為GmMYB174a;具體如下:
一、大豆轉錄因子GmMYB174a基因的克隆
大豆科豐1號3周齡幼苗經200mM NaCl處理6小時,取2克新鮮葉片,在液氮中 研碎,懸于4mol/L硫氫酸胍水溶液中,混合物用酸性苯酚、氯仿抽提,上清液中加入無水乙醇沉淀得到總RNA。提取的總RNA,反轉錄為cDNA。以cDNA為模板,用Primer-F和Primer-R進行PCR擴增,得到PCR擴增產物。PCR擴增產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測,得到分子量約為1Kb的條帶,用瓊脂糖凝膠回收試劑盒(TIANGEN)回收該片段。
Primer-F:5’-CCCTCTAGA ATGGCGATTCAAGATCAAAATG-3’(下劃線標注XbaⅠ酶切識別位點)(序列3);
Primer-R:5’-CCCGGTACC CTACAAGGAAAGATGGATGCAT-3’(下劃線標注KpnⅠ酶切識別位點)(序列4)。
PCR擴增體系(50μl):cDNA 1μl,10×buffer 5μl,dNTP(10mM)1μl,Primer-F1μl,Primer-R 1μl,Pfu DNA Polymerase(TaKaRa)1μl,ddH2O 40μl。擴增條件為:94℃3min;94℃30s,50℃30s,72℃30s,30個循環;72℃10m。
將該回收片段(PCR產物)與pGEM-T Easy(Promega)連接,將連接產物轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞,根據pGEM-T Easy載體上的羧卞青霉素抗性標記篩選陽性克隆,得到含有回收片段的重組質粒。以該重組質粒載體上的T7和SP6啟動子序列為引物對其進行核苷酸序列測定,測序結果表明該PCR產物具有序列表中序列2所示的核苷酸,該PCR產物的基因命名為GmMYB174a,該基因的編碼區為序列表中序列2自5’末端第1-1086位核苷酸,該基因編碼的蛋白命名為GmMYB174a,該蛋白的氨基酸序列為序列表中的序列1所示。序列表中序列2由1086個核苷酸組成,序列表中序列1由361個氨基酸殘基組成。
也可人工合成序列表中序列2,用Primer-F和Primer-R進行PCR,得到同樣的PCR產物。
二、大豆轉錄因子GmMYB174a基因的表達受非生物脅迫誘導
將大豆科豐1號3周齡幼苗作如下脅迫處理:
1)鹽脅迫處理(200mM NaCl處理):將幼苗移入200mM NaCl水溶液中,室溫,約25°C;
2)滲透脅迫處理(干旱處理):將幼苗根部小心的吸去水分,置于濾紙上暴露于室溫空氣(25℃)中;
3)低溫脅迫處理(4℃低溫處理):將幼苗浸入預冷的水中,置于4℃冰箱;
4)脫落酸(ABA)處理(100μM ABA處理),將幼苗根浸入100μM ABA水溶液中,室溫,約25°C。
5)CK處理:幼苗未經任何處理記作CK;
6)水處理:將幼苗浸入蒸餾水中,處理溫度約25℃;
每種處理在1、3、6、12小時分別收集新鮮葉片1g在液氮中研碎(CK組直接收集葉片),懸于4mol/L硫氫酸胍水溶液中,混合物用酸性苯酚、氯仿抽提,上清液中加入無水乙醇沉淀得到總RNA。對GmMYB174a基因在上述處理時的表達特征進行定量PCR分析,引物為Primer-F和Primer-R。大豆GmTubulin基因為內標,所用引物為Primer-TF和Primer-TR。Q-PCR得到的值是基因相對于GmTubulin的表達量。RT-PCR需要先通過調整模板cDNA的量來使GmTubulin的表達量一致,再進行基因的擴增。實驗重復三次,結果取平均值±標準差。
Primer-F:5’-ATGGCGATTCAAGATCAAAATG-3’
Primer-R:5’-CTACAAGGAAAGATGGATGCAT-3’
Primer-TF:5’-AACTCCATTTCGTCCATTCCTTC-3’
Primer-TR:5’-TTGAGTGGATTCCCAACAACG-3’
結果如圖1所示,A為干旱處理;B為200mM NaCl處理;C為4℃低溫處理;D為100μM ABA處理;從圖中看出,GmMYB174a基因對低溫、干旱、高鹽和ABA處理均有應答反應,但是應答反應的模式不同。除了ABA處理外,GmMYB174a表達在上述處理1小時時均明顯受誘導,GmMYB174a表達在干旱處理時持續升高至12小時,高鹽和低溫處理3小時時均升至最高,之后下降,高鹽處理12時時將至最低,而低溫處理12小時時復又升高。在ABA處理1小時時,略下降,至3小時明顯升高,至6小時復又下降。
實施例2、大豆轉錄因子GmMYB174a基因的應用
一、轉GmMYB174a毛狀根的獲得
1、重組表達載體pPROKII-GmMYB174a的構建
用限制性內切酶XbaⅠ和KpnⅠ雙酶切由實施例1用Primer-F和Primer-R作為引物獲得的PCR產物,回收酶切產物,將該酶切產物與經過同樣酶切植物表達載體pROKⅡ得到的載體骨架連接,得到連接產物。將連接產物轉入大腸桿菌中,得到轉化子。提取轉化子的質粒,送去測序,該質粒為將序列表中的序列2插入pROKⅡ的XbaⅠ和KpnⅠ酶切位點之間得到的載體,將該載體命名為pROKⅡ-GmMYB174a,且序列表中的序列2位于CaMV 35S啟動子之后。重組表達載體pROKⅡ-GmMYB174a結構示意圖如圖2所示。
2、轉GmMYB174a毛狀根(過量表達GmMYB174a基因毛狀根)的獲得
1)將上述1得到的重組表達載體pROKⅡ-GmMYB174a,通過電擊法導入發根農桿菌K599,得到重組農桿菌。
提取重組農桿菌的質粒,經測序驗證,結果為該質粒為pROKⅡ-GmMYB174a,將含有該質粒的重組農桿菌命名為K599/pROKⅡ-GmMYB174a。
2)用注射器將重組農桿菌K599/pROKⅡ-GmMYB174a接種生長6天含兩片真葉的大豆科豐1號幼苗,保濕生長:光照16小時,溫度25℃,濕度50%。2周后,長出毛狀根即為轉化的毛狀根。共獲得32個轉GmMYB174a毛狀根根系,待毛狀根生長至4-6cm時可進一步作轉基因鑒定和耐逆性檢測。以相同的方法將空載體pROKⅡ轉入大豆科豐1號幼苗,得到27個轉空載體毛狀根根系,以作為實驗對照。
3)分別提取編號為1-32的轉GmMYB174a毛狀根和編號為1-27的轉空載體毛狀根的總RNA,將其反轉錄為cDNA。以cDNA為模板,用Primer-F和Primer-R進行GmMYB174a基因表達量分析。Real-Time PCR反應使用TOYOBO公司的RealTime PCR Master Mix試劑盒,并按照說明進行操作。GmMYB174a基因表達量檢測所用引物為Primer-F和Primer-R;大豆GmTubulin基因為內標,所用引物為Primer-TF和Primer-TR。實驗重復三次,結果取平均值±標準差。
Primer-F:5’-ATGGCGATTCAAGATCAAAATG-3’
Primer-R:5’-CTACAAGGAAAGATGGATGCAT-3’
Primer-TF:5’-AACTCCATTTCGTCCATTCCTTC-3’
Primer-TR:5’-TTGAGTGGATTCCCAACAACG-3’
編號為1-15的轉GmMYB174a毛狀根和編號為1-15的轉空載體毛狀根分子鑒定中的GmMYB174a的平均相對表達量如圖4A所示,其中,OE為轉GmMYB174a毛狀根,對照為轉空載體毛狀根,從圖中看出,轉GmMYB174a毛狀根中GmMYB174a的相對表達量為3.65±0.3;轉空載體毛狀根中檢測出的GmMYB174a的相對表達量是大豆原有的GmMYB174a的表達,為0.50±0.15。
編號為16-32的轉GmMYB174a毛狀根和編號為16-27的轉空載體毛狀根分子鑒定中的GmMYB174a的平均相對表達量如圖5A所示,其中,OE為轉GmMYB174a毛狀根,對照為轉空載體毛狀根,從圖中看出,轉GmMYB174a毛狀根中GmMYB174a的相對表達量為3.35±0.25;轉空載體毛狀根中GmMYB174a的相對表達量為0.40±0.2。
上述結果表明,轉GmMYB174a基因根系中GmMYB174a的表達量遠高于轉空載體根系中GmMYB174a的表達量。
二、轉GmMYB174a毛狀根系的耐旱、耐鹽和耐低溫鑒定
實驗樣本如下:轉空載體毛狀根,記為對照;轉GmMYB174a毛狀根,記為OE。
在水中培養10天的對照和OE的毛狀根生長沒有明顯差異,長度為8.1±3.9cm和7.8±3.7cm,見圖3。
1、耐鹽性鑒定
將轉GmMYB174a毛狀根(OE)和轉空載體毛狀根(對照)各取10個經100mM NaCl水溶液處理3天,即浸入100mM NaCl水溶液中25°處理3天。每個株系各10個單株。
處理3天后,拍照觀察,結果如圖4B所示,經100mM NaCl處理3天的轉空載體毛狀根和轉GmMYB174a毛狀根的表型,可以看出,在100mM NaCl處理下,二者毛狀根的生長速度有顯著差異。
測量毛狀根長度,實驗重復三次,結果取平均值±標準差,具體如下:經100mM NaCl水溶液處理前轉GmMYB174a基因毛狀根和轉空載體毛狀根的長度分別為4.3±2.8cm和4.5±2.7cm,兩者間沒有顯著差異;經100mM NaCl水溶液處理后轉GmMYB174a基因毛狀根和轉空載體毛狀根的長度分別為6.2±2.3cm和5.2±2.1cm;
毛狀根的增長率=(處理后根長-處理前根長)/處理前根長
將增長率作圖如圖4C所示,經100mM NaCl水溶液處理轉GmMYB174a基因毛狀根的長度增長率為42±28%。而經100mM NaCl水溶液處理轉空載體毛狀根的長度增長率為16±35%,兩者有顯著差異。
2、耐旱性鑒定:
將轉GmMYB174a基因毛狀根(OE)和轉空載體毛狀根(對照)分別浸入1%(體積百分含量)PEG(聚乙二醇6000)25°處理3天。每個株系各10個單株。
處理3天后,拍照觀察,結果如圖5B所示,經1%PEG處理3天的轉空載體毛狀根和轉GmMYB174a毛狀根的表型,可以看出,在1%PEG處理下二者的生長狀態有顯著差異。
測量毛狀根長度,實驗重復三次,結果取平均值±標準差,具體如下:經1%PEG處理前轉GmMYB174a基因毛狀根和轉空載體毛狀根的長度分別為4.6±2.1cm和4.1±2.3cm;經1%PEG處理后轉GmMYB174a基因毛狀根和轉空載體毛狀根的長度分別為6.4±2.0cm和5.7±2.4cm;
毛狀根的增長率=(處理后根長-處理前根長)/處理前根長
將增長率作圖如圖5C所示,PEG濃度為1%時,轉空載體毛狀根(對照)增長率約為3923%,而轉GmMYB174a毛狀根(OE)的增長率約為63±21%。
轉GmMYB174a基因毛狀根的增長率與轉空載體毛狀根的增長率有明細差異。




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大豆 轉錄 因子 GMMYB174A 及其 編碼 基因 應用
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