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抗多型禽流感病毒的DNA疫苗及其組合物.pdf

摘要
申請專利號:

CN201210192637.6

申請日:

2012.06.12

公開號:

CN103372207B

公開日:

2015.01.28

當前法律狀態:

授權

有效性:

有權

法律詳情: 授權|||實質審查的生效IPC(主分類):A61K 39/145申請日:20120612|||公開
IPC分類號: A61K39/145; A61K48/00; A61P31/16 主分類號: A61K39/145
申請人: 吳夙欽
發明人: 吳夙欽; 林世昌
地址: 中國臺灣臺灣新竹市光復路二段101號
優先權: 2012.04.17 TW 101113644
專利代理機構: 永新專利商標代理有限公司 72002 代理人: 左路
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法律狀態
申請(專利)號:

CN201210192637.6

授權公告號:

103372207B||||||

法律狀態公告日:

2015.01.28|||2013.11.27|||2013.10.30

法律狀態類型:

授權|||實質審查的生效|||公開

摘要

本發明涉及一種包含高糖基化突變HA基因的DNA疫苗,該高糖基化突變HA基因系衍生自禽流感病毒。本發明亦涉及一種DNA疫苗組合物,其包含:(a)該DNA疫苗;及(b)一種加強劑。本發明更進一步涉及一種在個體中引發抗多型禽流感病毒的免疫反應的方法,其包含將該DNA疫苗或該DNA疫苗組合物施用至該個體的組織中。本發明利用突變技術產生具有免疫聚焦性的HA基因,接種本發明所提供的DNA疫苗或DNA疫苗組合物可于個體中引發抗多型禽流感病毒的免疫反應,預防多種亞型的禽流感病毒的感染。

權利要求書

權利要求書
1.  一種DNA疫苗,包含高糖基化突變HA基因,其衍生自禽流感病毒,
其中所述高糖基化突變HA基因編碼一種具有一或多個突變氨基酸殘基的蛋白質,所述氨基酸殘基選自由第83、86、94、127、138、161、182、252位氨基酸及其組合所組成的群組。

2.  權利要求1的DNA疫苗,其中所述高糖基化突變HA基因編碼一種蛋白質,其包含選自由SEQ ID NO:4、6、8、10、12、14、16、18及20所組成的群組的氨基酸序列。

3.  權利要求1的DNA疫苗,其中所述高糖基化突變HA基因編碼一種蛋白質,其包含SEQ ID NO:4、6或10的氨基酸序列。

4.  權利要求1的DNA疫苗,其在個體中引發一種抗多種禽流感病毒亞型的免疫反應。

5.  一種DNA疫苗組合物,包含:
a.一種權利要求1的DNA疫苗;及
b.一種加強劑。

6.  權利要求5的DNA疫苗組合物,其中所述加強劑是一種流感病毒樣顆粒(VLP)。

7.  權利要求6的DNA疫苗組合物,其中所述流感病毒樣顆粒衍生自被包含一或多個含有HA基因、M1基因、NA基因及FliC-M2基因的質粒的重組桿狀病毒感染的細胞,所述FliC-M2基因編碼FliC-M2融合蛋白。

8.  權利要求5的DNA疫苗組合物,其進一步包含一種佐劑。

9.  權利要求8的DNA疫苗組合物,其中所述佐劑是含鋁佐劑。

10.  權利要求5的DNA疫苗組合物,其中所述DNA疫苗與加強劑的質量比為5比3。

11.  權利要求5的DNA疫苗組合物,其在個體中引發一種抗多種禽流感病毒亞型的免疫反應。

說明書

說明書抗多型禽流感病毒的DNA疫苗及其組合物
技術領域
本發明關于一種DNA疫苗。更特定而言,本發明是關于一種包含高糖基化抗原的DNA疫苗。本發明亦關于一種DNA疫苗組合物及一種以其在個體內引發抗多種禽流感病毒亞型的免疫反應的方法。
背景技術
高致病性禽流感(Highly pathogenic avian influenza,HPAI)H5N1病毒及其從鳥類傳染給人類的能力引起世界各國的關注,并擔心可能引發人與人之間的流行。隨著H5N1流感病毒持續傳播,新的病毒株隨之出現,且未來尚會持續改變與進化。世界衛生組織將最近分離出來的H5N1病毒,依據其血凝素(hemagglutinin,HA)序列的演化樹分析結果,分類成10個分化支(clade,或稱sublineage)。因為從鳥類宿主持續有新的流感威脅出現,因此開發具有廣效型保護效力的疫苗變得格外重要。至目前為止,廣效型保護效力的H5N1疫苗主要是藉由新穎的佐劑配方達成。
然而,開發具有廣效型保護效力的疫苗時,免疫原(immunogen)的設計卻未將流感病毒抗原改變的固有特性納入考慮。已知再聚焦(Refocusing)抗體反應的原理為設計免疫原,保留該免疫原大致的折疊結構,但選擇性地將高度變異(通過突變躲開保護性免疫反應)、具有免疫抑制性(降低對感染的免疫反應)及會引起交叉反應(引發作用于和免疫原相似的蛋白質的免疫反應)等“不受歡迎”的抗原位置進行突變。以再聚焦抗體反應設計免疫原的方法已落實于HIV-1疫苗,該疫苗利用高糖基化HIV-1gp120蛋白質做為免疫原,并在該免疫原中選擇性地合并N連接聚糖以遮蔽不受歡迎的表位。上述聚糖遮蔽策略最近也被利用于設計流感病毒疫苗,這些疫苗可以強化抗各型H3N1病毒的廣效性抗體反應。然而,尚未有人將聚糖遮蔽免疫原設計的概念應用于H5N1疫苗。
DNA疫苗已被認定為劃時代的疫苗學,其具有提供抗原基因設計、制造時間較短、穩定性佳且不需冷鏈供應,以及免疫原性主要為經由內源性抗原處理過程引起T細胞反應等優點。DNA疫苗在大型動物(包括人類)中的免疫原性 明顯較低的特性,已利用基因槍或電穿孔等新穎的送遞系統克服。此外,DNA疫苗引發的免疫反應可進一步利用異源性初始/加強接種策略(prime-boost immunization regimen)放大,加強劑為一種包含相同或相似抗原的不同疫苗型式。已被報導的DNA疫苗初始/加強接種策略實例有滅活流感病毒、減毒流感病毒、重組腺病毒、病毒樣顆粒(VLP)及佐劑中的重組次單原蛋白。更進一步而言,初始接種H5DNA疫苗接著以滅活H5N1疫苗加強的人類疫苗,已證實會增強抗體反應的保護性(HAI),而且在某些案例中甚至會引發血凝素主干特異性(haemagglutinin-stem-specific)的中和抗體。
流感病毒樣顆粒(Influenza virus-like particle,VLP)不具感染性且大小及外型與自然病毒粒子結構相似,但他們不帶病毒復制用的基因組RNA。流感VLP的組裝倚賴M1蛋白質及/或其他病毒表面蛋白(例如:HA、NA及M2)與細胞脂質膜的相互作用。M1蛋白質與HA及NA棘狀突起結構的細胞質端的相互作用,可增加流感病毒組裝時M1蛋白質與脂質膜的結合。HA及NA對M1蛋白質的相互作用亦可減少細胞內細長狀不成熟粒子的形成,以及增進球狀成熟VLP的分泌。此外,M2蛋白質的細胞質端藉由與M1蛋白質相互作用,可進一步促進流感病毒粒子的出芽(budding)與釋放。近來發現M2蛋白質是流感病毒粒子出芽與釋出的細胞膜引導信號。最近的LC/MS/MS分析顯示,宿主細胞蛋白可被包覆到VLP中。因此,流感VLP的生物合成可說是牽涉病毒與細胞成份間復雜相互作用的自我組裝過程。
發明內容
本文中用語“野生型”代表自然生成的生物體。該術語亦關于從自然過程形成的自然生成群體的自然生成生物體中所發現的核酸及蛋白質,例如從自然突變形成并由基因漂移、自然選擇等等所保留的多態性,且不包括藉由如重組方法所得到的核酸或蛋白質。
“免疫原”或“抗原”在本文中可交互使用,代表一引發抗體(體液性)及/或T細胞源(細胞性)特定免疫反應的分子(例如:包含一種結合該分子的抗體或可辨認表達該分子的病毒感染細胞的CD4+或CD8+T細胞)。該分子可包含一或多個一特定抗體或T細胞結合的位置。如技術領域中所習知,該些位置被稱為抗原表位(epitope)或決定簇(determinant)。抗原可為多肽、多核苷酸、多糖類、脂質等及其組合,例如:糖蛋白或脂蛋白。免疫性化合物或產物,或 是抗原性化合物或產物,可引發特定免疫反應,該免疫反應可為體液性免疫反應、細胞性免疫反應或兩者皆是。
本文中“個體”或“主體”或“動物”代表負鏈RNA病毒可感染的脊椎動物,包括但不限于鳥類(例如:水禽與雞)及哺乳類的成員,例如:犬、貓、狼、貂、嚙齒類(拉辛(racine)及鼠類等等)、馬、牛、綿羊、山羊、豬以及靈長類,后者包括人類。
本文中的用語“多種”用于描述本發明中的組件及成分。本描述除非明確地另有所指,否則應理解為一個以上。
本文中的用語“一”或“一種”用以敘述本發明的組件及成分。此術語僅為了敘述方便及給予本發明的基本觀念。此敘述應被理解為包括一種或至少一種,且除非明顯地另有所指,表示單數時亦包括復數。
本文中的用語“或”用以描述“和/或”。
因此,本發明提供一種包含高糖基化突變HA基因的DNA疫苗,該高糖基化突變HA基因衍生自禽流感病毒,其中該突變HA基因編碼一種具有一或多個突變氨基酸殘基的蛋白質,該氨基酸殘基選自由第83、86、94、127、138、161、182、252位氨基酸殘基及其組合所組成的群組。
在一具體實施方案中,該高糖基化突變HA基因編碼一種蛋白質,其包含選自由SEQ ID NO:4、6、8、10、12、14、16、18及20所組成的群組的氨基酸序列。在另一具體實施例中,該突變HA基因編碼一種包含SEQ ID NO:4、6或10的氨基酸序列的蛋白質。
在一具體實施方案中,將該DNA疫苗送遞到個體,在該個體中引發一種抗復數禽流感病毒亞型的免疫反應。在另一具體實施方案中,該送遞系經由例如但不限于皮下注射、肌肉注射、口腔施用、噴灑或基因槍注射的方式所達成。
本發明亦提供一種DNA疫苗組合物,包含(a)一種上述的DNA疫苗;及(b)一種加強劑。
在一具體實施方案中,該加強劑是一種流感病毒樣顆粒(influenza virus-like particle,VLP)。在另一具體實施方案中,該流感病毒樣顆粒衍生自受包含一或多個含有HA基因、M1基因、NA基因及FliC-M2基因的質粒的重組桿狀病毒(baculovirus)感染的細胞,該FliC-M2基因編碼FliC-M2融合蛋白。
在一具體實施方案中,該DNA疫苗組合物進一步包含一種佐劑。在另一具體實施方案中,該佐劑是一種含鋁佐劑。
在一具體實施方案中,該DNA疫苗及該加強劑的質量比介于1∶2至17∶6之間。在另一具體實施方案中,該DNA疫苗及該加強劑的質量比介于5∶6至5∶2之間。在又一具體實施方案中,該DNA疫苗及該加強劑的質量比為5比3。
在一具體實施方案中,將該DNA疫苗送遞到個體,在該個體中引發一種抗多種禽流感病毒亞型的免疫反應。在另一具體實施方案中,該送遞是經由例如但不限于皮下注射、肌肉注射、口腔施用、噴灑或基因槍注射的方式所達成。
以下實例提供一些本發明的解釋性具體實施例。
附圖說明
圖1顯示DNA-HA及FliC-VLP的表達與定性。(A)將轉染DNA-HA或空載體的293A細胞溶解物以EndoH、PNGase F及胰蛋白酶處理,并藉由蛋白印跡法分析。全長HA蛋白質的分子量大約為75kDa,HA1蛋白質的分子量則約為46kDa。(B)藉由蔗糖梯度沉積法純化FliC-VLP,結果顯示蔗糖梯度沉積法的第6至10級分(fraction)包含所有4種蛋白質。(C)電子顯微鏡顯像呈現FliC-VLP的圓球狀型態,其粒子大小約為100納米。
圖2顯示DNA-HA及FliC-VLP所誘發的總體抗HA IgG抗體效價。星號表示具有統計上的顯著差異性(p<0.05)。
圖3以抗NIBRG-14(分化支1)H5N1流感病毒的(A)HI及(B)NT效價呈現經接種小鼠血清的中和活性。為了方便計算,未能測出的效價量皆定為1。分別計算各樣本的效價(點)及各組平均值(線)。
圖4顯示163個禽流感病毒株的HA變異氨基酸分析結果。HA1亞基中的11個氨基酸,包括第83、86、94、124、129、138、140、155、162、189及252位殘基具有相對較高的評分。
圖5顯示9個N連接糖基化位置:83NNT(SEQ ID NO:4)、86NNT(SEQ ID NO:6)、94NFT(SEQ ID NO:8)、127NSS(SEQ ID NO:10)、138NRT(SEQ ID NO:12)、140NSS(SEQ ID NO:14)、161NRS(SEQ ID NO:16)、182NDT(SEQ ID NO:18)及252NAT(SEQ ID NO:20)。箭頭自野生型序列畫底線的3個氨基酸,指向造成N連接糖基化序列的氨基酸變化。
圖6顯示血球吸附試驗(hemadsorption assay)的結果。(A)陽性對照組;(B)陰性對照組;(C)83NNT;(D)86NNT;(E)94NFT;(F)127NSS;(G)138NRT;(H)161NRS;(I)182NDT;及(J)252NAT。
圖7顯示高糖基化HA蛋白質的定性結果。由分子量的增加及于PNGase F處理后降低至原分子量,說明了6種突變蛋白質(83NNT、86NNT、94NFT、127NSS、138NRT、161NRS)附加有N連接聚糖。
圖8顯示高糖基化HA所誘發的抗HAIgG總體效價。分別計算各樣本的效價(點)及各組平均值(線)。
圖9以抗NIBRG-14(分化支1)H5N1流感病毒的(A)HI及(B)NT效價呈現經接種小鼠血清的中和活性。為了方便計算,未能測出的效價量皆定為1。分別計算各樣本的效價(點)及各組平均值(線)。星號表示具有統計上的顯著差異性(p<0.05)。
圖10以抗Mongolia/2/2006(分化支2.2)H5N1流感病毒的(A)HI及(B)NT效價呈現經接種小鼠血清的中和活性。為了方便計算,未能測出的效價量皆定為1。分別計算各樣本的效價(點)及各組平均值(線)。星號表示具有統計上的顯著差異性(p<0.05)。
具體實施方式
本發明可能以不同的形式來實施,并不僅限于下列文中所提及的實例。下列實施例僅作為本發明不同面向及特點中的代表。
實施例一
材料與方法
DNA-HA疫苗載體的構建
流感病毒A/Thailand/1(KAN-1)/2004/H5N1(分化支1)HA基因的cDNA序列(SEQ ID NO:1)由泰國Siriraj醫院的Prasert Auewarakul教授提供。將HA序列的全長利用KpnI/NotI切割位點插入pcDNATM3.1(+)載體(Invitrogen)中。將構建完成的含H5HA質粒利用Turbofect試劑(Fermentas)轉染到293A細胞中。轉染后48小時,以5000rpm轉速離心10分鐘以收集細胞溶解物,并利用蛋白印跡法以抗H5HA抗體(ab21297;Abcam)分析HA的表達。
HA糖基化模式和胰蛋白酶處理
為了描繪HA糖基化模式的特征,在轉染DNA-HA載體48小時之后收集293A細胞。在37°C以EndoH或PNGase F處理細胞溶解物2小時,并利用蛋 白印跡法測定H5HA糖基化模式。進行胰蛋白酶處理時,將細胞溶解物與胰蛋白酶一起在冰上培養30分鐘,以蛋白印跡法觀察HA0被切割成為HA1及HA2的情形。
VLP的制備
VLP的制備如先前文獻所述(Wei HJ et al.,Vaccine 29(2011):7163-7172)。簡而言之,將HA(SEQ ID NO:1)及M1(SEQ ID NO:21)克隆到一pFastBacTMDual載體(Invitrogen)中,而將NA(SEQ ID NO:27)及表達FliC-M2融合蛋白的FliC-M2(SEQ ID NO:25)克隆到另一載體中以制作重組桿狀病毒。在感染后的72小時收集共感染重組桿狀病毒的Sf9細胞,并以500kDa濾膜將含FliC-VLPs的上清液過濾濃縮。將濃縮液加至0-60%蔗糖梯度上并以33,000rpm轉速離心4小時。藉由蛋白印跡法利用抗H5HA抗體(ab21297;Abcam)、抗NA抗體(ab70759;Abcam)、抗M1抗體(ab25918;Abcam)及抗M2抗體(NB 100-2073;Novus)觀察想要的微粒。如先前文獻(Wei HJ et al.,Vaccine 29(2011):7163-7172)所述,亦使用透射電子顯微鏡(TEM)確認該微粒。
高糖基化H5HA的制備
使用編碼野生型H5HA基因(SEQ ID NO:1)的質粒作為模版,并利用定點突變(site-directed mutagenesis)在HA基因中導入突變位。50微升PCR反應溶液中含有100納克模版、2毫摩爾引物對、200毫摩爾dNTPs及2U的DNA聚合酶。純化PCR產物并進一步以DpnI在37°C處理2小時。將DpnI處理后的產物轉化到TOP10感受態細胞中,然后分離該突變質粒。
血球吸附試驗(Hemadsorption assay)
以野生型或突變的H5HA DNA載體轉染293A細胞,并在轉染后72小時收集細胞。以磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌之后,加入足夠的0.5%火雞紅細胞(RBC)覆蓋單層細胞并培養30分鐘。以PBS潤洗兩次后觀察吸附于經轉染細胞上的RBC。
小鼠免疫注射
利用異源初始-加強免疫法(heterologous prime-boost strategy),以混合于PBS中的50微克DNA、30微克純化VLP及鋁佐劑接種6至8周齡的母BALB/c品 系小鼠。免疫注射是在第0及第3周藉由肌肉注射進行。在免疫注射后第14天收集血液,并分離血清。將血清樣本在56°C滅活30分鐘并儲存在–20°C。所有實驗皆依照國立清華大學實驗動物中心的指導原則進行。動物實驗流程經國立清華大學實驗動物中心審核通過(核準號為09733)。
酶聯免疫吸附分析法(ELISA assay)
以如先前文獻所述的方式執行ELISA分析法(Lin SC et al.,PLoS One 6(2011):e20052)。簡言之,將2微克/毫升的純化蛋白質涂覆到96孔培養皿上,然后以BSA進行封閉。將系列稀釋度的各血清樣本在培養皿中培養1小時,并以3次洗滌移除。將與HRP綴合的山羊抗小鼠IgG(Bethyl Laboratories,Inc.)在培養皿中培養1小時,接著洗滌3次。在與TMB底物的反應停止后,測量培養皿在450納米的吸光值。終點效價(End-point titer)為最終稀釋度的倒數,最終稀釋度的吸光值為陰性對照組的兩倍。
血凝抑制試驗(Hemagglutinin inhibition assay,HI assay)及中和試驗(Neutralization assay,NT assay)
以如先前文獻所述的方式執行HI及NT試驗(Huang MH et al.,PLoS One 5(2010):e12279)。HI試驗中將血清樣本(以1:10為初始稀釋度開始兩倍稀釋)與四倍HA單元的流感病毒株一起培養。然后加入火雞紅細胞并對血球凝集反應的抑制程度進行評分。血清滴定濃度為最高稀釋度的倒數,該最高稀釋度可完全抑制HA。NT試驗中,在各培養孔中加入200TCID50的病毒與兩倍連續稀釋的小鼠血清一起培養,起始稀釋度為1∶40。將混合的病毒及血清轉移到單層MDCK細胞并培養4天。中和效價為最高血清稀釋度的倒數,在最高血清稀釋度時,有一半培養孔中的H5N1病毒感染力被中和。感染力藉由第4天細胞病(cytopathy)的存在而判斷,而利用Reed-Muench方法計算效價。
統計分析
所有結果皆利用雙尾Student’st檢驗進行分析,P值小于0.05即代表具有統計上的顯著性。
結果
DNA-HA疫苗載體以及用于初始-加強免疫法的FliC-VLP的構建與特性分析
編碼A/Thailand/1(KAN-1)/2004/H5N1(分化支1)HA基因的全長cDNA(SEQ ID NO:1)的DNA疫苗載體構建自pcDNATM3.1(+)載體。以蛋白印跡法分析DNA-HA載體轉染的293A細胞,證實全長HA蛋白質的表達且其分子量約為75kDa(圖1A)。293A細胞中所表達的HA對PNGase F處理敏感但對EndoH切割有抗性,暗示其為含有復雜N連接聚糖譜的糖蛋白(圖1A)。經DNA-HA轉染的293A細胞中所表達的HA亦對胰蛋白酶處理敏感,可從HA0被切割為HA1及HA2亞基,HA1顯示的分子量約為46kDa(圖1A)。
含有FliC的VLP(FliC-VLP)得自經兩種重組桿狀病毒感染的Sf9細胞,該兩種重組桿狀病毒編碼四種流感病毒基因:HA、NA及M1,以及M2與沙門氏桿菌fliC基因的融合物(Wei HJ et al.,Vaccine 29(2011):7163-7172)。FliC-VLP系取自經桿狀病毒感染的Sf9細胞的培養上清液,并利用超高速離心及蔗糖梯度沉積法純化。結果顯示蔗糖密度梯度的第6至第10個級分含有所有四種病毒蛋白或融合蛋白(圖1B)。電子顯微鏡觀察顯示FliC-VLP的球狀外型且粒子大小約為100納米(圖1C)。
為了研究以初始-加強免疫法合并使用DNA-HA疫苗載體及FliC-VLP,以三個星期為間距分為兩劑利用肌肉注射初始-加強免疫BALB/c小鼠:(i)PBS+PBS;(ii)FliC-VLP+FliC-VLP(iii)DNA-HA+DNA-HA(iv)DNA-HA+FliC-VLP。第二劑注射后兩個星期,收集免疫小鼠的血清。結果顯示,以DNA-HA疫苗載體進行初始,接著以FliC-VLP加強所得的HA特異性總體IgG效價,顯著高于利用DNA-HA載體及FliC-VLPs進行兩劑免疫注射所得的HA特異性總體IgG效價(圖2)。藉由測量抗NIBRG-14(分化支1)H5N1流感病毒的HI及NT效價揭示中和活性,結果顯示DNA-HA載體初始及FliC-VLP加強注射在小鼠體內引發最高強度的中和性抗體(圖3A-B)。
以從人類分離的H5N1的氨基酸序列為基準設計高糖基化HA
為了設計高糖基化HA DNA疫苗,首先以163株從人類分離的高致病性禽流感病毒H5N1進行序列比對分析(序列檢索自NCBI數據庫)。將這些HA1蛋白質序列中的氨基酸差異以下列分數為基準進行分析:4(不同氨基酸)、2(弱相似氨基酸)、1(強相似氨基酸)、0(相同氨基酸),如Vector NTI相似表所描繪。 依據圖4所顯示的比對圖,HA1蛋白質中有十一個氨基酸殘基被認為具有相對較高的分數,包括:第83、86、94、124、129、138、140、155、162、189及252位殘基。為了設計抗體再聚焦免疫原(antibody-refocused immunogen),以能夠增加N-X-S/T結構(N連接糖基化位置)的突變在這五個區域內分別進行定點突變,但避開受體結合位置(Yang ZY et al.,Science 317(2007):825-828;and Yang H et al.,PLoS Pathog 6(2010):e1001081)。因而將九個N-X-S/T結構導入HA1中,包括83NNT(SEQ ID NO:4)、86NNT(SEQ ID NO:6)、94NFT(SEQ ID NO:8)、127NSS(SEQ ID NO:10)、138NRT(SEQ ID NO:12)、140NSS(SEQ ID NO:14)、161NRS(SEQ ID NO:16)、182NDT(SEQ ID NO:18及252NAT(SEQ ID NO:20)(圖5)。將各種含有指定N連接糖基化位置的再聚焦性(refocusing)高糖基化HA基因克隆到DNA-HA疫苗載體中。然而,在轉染到293A細胞中以后,九種免疫聚焦性HA中只有六種保留了火雞紅細胞的血球凝集作用特性(圖6)。同時也研究這六種HA突變基因(83NNT、86NNT、94NFT、127NSS、138NRT及161NRS)以探討HA抗原中N連接聚糖的導入,其可由分子量的上升并在PNGaseF處理后回復到原分子量而描繪出來(圖7)。
以高糖基化HA DNA疫苗進行初始注射接著以FliC-VLP進行加強
為了研究這六種高糖基化HA突變體所引發的抗體反應(83NNT、86NNT、94NFT、127NSS、138NRT及161NRS),以三個星期為間隔將小鼠以各種DNA-HA載體接種兩次,接著以FliC-VLP給予第三次的加強注射。結果顯示,當與野生型對照組做比較時,所有以高糖基化HA DNA疫苗進行接種的組別,其HA特異性總體IgG效價皆無顯著差別(圖8)。83NNT及86NNT HA變體引發較高的HI效價(圖9A),但是只有83NNT HA變體對屬于相同H5N1分化支1的NIBRG-14病毒具有較高的NT效價(圖9B)。同時也測量這些血清抗Mongolia/2/2006H5N1病毒(分化支2.2)的HI及NT效價。以跨分化支功能性抗體(cross-clade functional antibodies)呈現的實驗數據顯示,83NNT、86NNT、127NSS HA突變體引發較高的HI效價(圖10A)而83NNT、86NNT、127NSS、161NRS HA突變體具有較高的NT效價(圖10B)。綜合上述,83NNT突變體可引發較有效的抗NIBRG-14(分化支1)及抗Mongolia/2/2006(分化支2.2)高致病性H5N1病毒的HI及NT效價。
本領域技術人員能很快體會到本發明可很容易達成目標,并獲得所提到的 結果及優點,以及那些存在于其中的東西。本發明中的DNA疫苗及其制造程序與使用方法乃優選實施例的代表,其為示范性且不僅局限于本發明領域。本領域技術人員將會想到其中可修改之處及其他用途。這些修改都蘊含在本發明的精神中,并在權利要求中界定。
本發明的內容敘述與實施例均詳細公開,得使任何本領域技術人員能夠制造及使用本發明,即使其中有各種不同的改變、修飾、及進步之處,仍應視為不脫離本發明的精神及范圍。
說明書中提及的所有專利及出版品,都以和發明有關領域的一般技藝為準。所有專利和出版品都在此以相同程度援引加入,就如同每一個個別出版品都被具體且個別地指出援引加入。
在此所適當地舉例說明的發明,可能得以在缺乏任何要件,或許多要件、限制條件或并非特定為本文中所公開的限制情況下實施。所使用的名詞及表達是作為說明書的描述而非限制,同時并無意圖使用這類排除任何等同于所示及說明的特點或其部份的名詞及表達,但需認清的是,在本發明的范圍內有可能出現各種不同的改變。因此,應了解到雖然已根據優選實施例及任意的特點來具體揭示本發明,但是本領域技術人員仍會修改和改變其中所揭示的內容,諸如此類的修改和變化仍在本發明的范圍內。









































































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抗多型 禽流感 病毒 DNA 疫苗 及其 組合
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本文標題:抗多型禽流感病毒的DNA疫苗及其組合物.pdf
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