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一種構建中醫腎虛證艾滋病猴模型的方法及用途.pdf

摘要
申請專利號:

CN201110120463.8

申請日:

2011.05.11

公開號:

CN102210754B

公開日:

2015.01.28

當前法律狀態:

授權

有效性:

有權

法律詳情: 授權|||實質審查的生效IPC(主分類):A61K 36/708申請日:20110511|||公開
IPC分類號: A61K36/708; A61K31/573; A61K31/475; A61K49/00 主分類號: A61K36/708
申請人: 廣州中醫藥大學
發明人: 符林春; 李茂清; 胡英杰; 何金洋; 張苗苗; 陳芝喜; 劉政; 胡董仁; 陳津巖; 董伯振; 周紅燕; 李志強; 劉抗倫
地址: 510405 廣東省廣州市機場路12號大院
優先權:
專利代理機構: 廣州市南鋒專利事務所有限公司 44228 代理人: 劉媖
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法律狀態
申請(專利)號:

CN201110120463.8

授權公告號:

102210754B||||||

法律狀態公告日:

2015.01.28|||2011.11.30|||2011.10.12

法律狀態類型:

授權|||實質審查的生效|||公開

摘要

本發明公開了一種構建中醫腎虛證艾滋病猴模型的方法及用途。在現有艾滋病實驗動物中猴子最接近人類,發明人應用兩種方法都成功地構建了恒河猴艾滋病病毒感染中醫腎虛證復合模型。第一種方法是連續使用生大黃濃縮液灌胃,同時肌肉注射利血平和肌肉注射醋酸潑尼松龍造腎虛證后經靜脈注射感染猴艾滋病病毒。第二種方法是先經靜脈注射感染猴艾滋病病毒,然后連續使用生大黃濃縮液灌胃,同時肌肉注射利血平和肌肉注射醋酸潑尼松龍造腎虛證。通過了解艾滋病病毒在腎虛證模型體內感染過程、發病過程、病理變化,以研究包括感染的靶器官、靶組織和靶細胞,對免疫系統的攻擊,免疫系統細胞的反應,中醫證候的演變規律等。通過所建立的中醫腎虛證艾滋病病毒感染猴復合模型,對于研究艾滋病中醫發病機理、證候學演變,評價抗艾滋病中藥和復方的藥效有著不可替代作用。

權利要求書

權利要求書
1.  一種構建中醫腎虛證艾滋病猴模型的方法,其特征在于選擇健康成年雄性恒河猴,經血清學檢測猴艾滋病病毒SIV,猴逆轉錄D型病毒(SRV)和猴T淋巴細胞性I型病毒(STLV-I)抗體陰性,無中醫腎虛、氣虛癥狀體征;采用的毒株為SIVmac239病毒株,經健康猴PBMC體外擴增;連續使用生大黃濃縮液灌胃,同時肌肉注射利血平和肌肉注射醋酸潑尼松龍造腎虛證;生大黃濃縮液為將生大黃粉碎成的粗粉加沸水煎煮,制成1mL=1g生藥的濃縮液,灌胃平均劑量是0.5 g/kg.d 至4.0 g/kg.d;肌肉注射利血平的平均劑量是0.03 mg/kg.d 至0.10 mg/kg.d;肌肉注射醋酸潑尼松龍的平均劑量是3.0 mg/kg.d 至6.0 mg/kg.d;造成中醫腎虛模型所需平均時間是4周;采用靜脈注射方式進行病毒接種,接種量為1:(1000-5000)。

2.  根據權利要求1所述的構建中醫腎虛證艾滋病猴模型的方法,其特征在于用放射免疫學方法檢測三碘甲狀腺原氨酸(T3)、 四碘甲狀腺原氨酸(T4)、促甲狀腺素(TSH)、睪酮(T)、雌二醇(E2)、皮質醇(Cor)、促腎上腺皮質激素(ACTH)、環腺苷酸(cAMP)、 環鳥苷酸(cGMP)、 白介素2(IL-2)、白介素6(IL-6)、腫瘤壞死因子(TNF)等指標,用比色法測定D-木糖;每1-2周收集標本,接種CEMX174細胞,進行病毒分離;用RT-PCR方法測定體液和組織內的SIV病毒載量;用流式細胞術測定模型動物的淋巴細胞亞群數據,包括CD4、CD3、CD8計數;用活檢方法取模型動物的淋巴結,福爾馬林固定,石蠟包埋,常規病理組織切片處理后,染色,進行病理形態及半定量分析;中醫腎虛證艾滋病猴模型指標體系中的主要特異性指標為三碘甲狀腺原氨酸(T3)、皮質醇(Cor)、白介素6(IL-6)、病毒載量、CD4、CD4 /CD8比值。

3.  根據權利要求1或2所述的構建中醫腎虛證艾滋病猴模型的方法,用于腎虛造模后觀察中醫證候積分。

4.  根據權利要求1或2所述的構建中醫腎虛證艾滋病猴模型的方法,用于研究艾滋病的中醫病因、病機和證候。

5.  根據權利要求1或2所述的構建中醫腎虛證艾滋病猴模型的方法,用于抗艾滋病中藥和復方的藥效評價。

說明書

說明書一種構建中醫腎虛證艾滋病猴模型的方法及用途
技術領域
本發明涉及一種構建中醫模型的方法及用途,具體涉及一種構建中醫腎虛證艾滋病模型的方法及用途。
背景技術
目前艾滋病的治療主要是應用高效抗逆轉錄病毒療法(HARRT)治療、免疫治療、生物治療、疫苗、中醫藥治療等。其中,中醫臨床治療具有辨證論治的特點,可根據患者的自身體質特征和癥狀表現采用個體化治療,且中藥通過調節機體免疫系統,延長患者帶毒生存時間,毒副作用少,依從性好。中醫藥特別是在感染HIV病毒后的無癥狀期發揮積極的治療作用。近幾年中醫藥防治艾滋病的實驗取得了可喜的成績,通過體外抑制HIV病毒細胞培養、藥物篩選和動物實驗發現了多種具有抑制艾滋病病毒作用的中藥,臨床試驗研究也證實了中藥在穩定和提高免疫功能、消除和緩解癥狀、改善生活質量方面具有較好的效果。中醫藥通過多環節、多靶點的調節,從多個途徑介入,通過影響病毒——宿主網絡,改變疾病的病理狀態或推遲疾病的進程,在臨床治療中更強調對患者生活質量和生存期的改善,與西醫藥著重于抑制病毒有著較大的區別,因此,作為病因病機基礎研究和評價標準的動物模型應該有別于西醫藥研究所采納的動物模型。
然而,目前尚未建立適合中醫藥篩選抗艾滋病的動物模型,給中醫藥的篩選工作帶來了困難。艾滋病中醫動物模型應能夠和艾滋病的病因、病理變化相似;滿足中醫臨床的癥狀模擬,評價指標特異性強、客觀;模型應能夠被藥物反證。概括而言,應符合中醫動物模型的基本要求。另外,該模型應該價操作簡單、操作步驟和環節精煉,實驗結果的重復性好。中醫藥艾滋病動物模型必須始終以中醫理論為指導,體現中醫特色。中醫的證候是中醫藥理論和臨床的基礎,因此,動物模型應該符合中醫的證和病機變化。
目前,中醫艾滋病證候的研究已進行了多年,形成了多種學說,基本認為艾滋病的證候以復合證、虛實夾雜為特點,具有復雜的病機,體現了多樣性的特點。我們長期的臨床和實驗研究認為,AIDS病因病機為:HIV侵入人體,首先損傷脾臟,致脾氣虧虛,進而損及腎臟和其他三臟,終至五臟氣血陰陽俱虛,并伴有氣滯血瘀,或痰飲水濕,或風寒火熱等邪毒為其基本病機的疾病。
艾滋病復雜的臨床癥狀表現,說明除了HIV病毒之外,其他的因素也參與了證候的形成。利用當前成熟的技術,在動物身上復制能夠和臨床證候更為相似的動物模型,能夠更好地模擬臨床表現,提供與臨床“證”相似的模型,豐富艾滋病的中醫動物模型庫,切中中醫動物模型中“辨證”的要求。由于臨床上艾滋病的發生、發展過程中,癥狀、證型存在隨時空變化而改變的性質,提示某種因素復制的艾滋病動物模型在不同的時期,其所表現的證可能是不同的,這種證的變化盡量擬合臨床證的變化。除了客觀的癥狀指標外,應選擇科學、準確、量化的指標衡量證候,并應注意這些指標應該有較強的特異性。藥物反證(以下簡稱反證) ,又稱以藥測證也是衡量模型是否成功的有效手段。當建立穩定的動物模型后,再用該模型相對應的基本方藥進行觀察治療,如果治療能改善或消除模型的癥狀和檢測指標,則佐證了此模型成立,否則,不成立。
綜上所述,中醫艾滋病動物模型應在滿足模擬艾滋病病因、病理的基礎上,應能體現中醫證的特色,滿足中醫學的發病學原理,模型的癥狀、客觀指標和藥物反證比較一致,與中醫理論較為吻合。該模型的建立將有利于揭示艾滋病“證”的實質,驗證并探討中醫中藥的療效和機理,促進中醫藥防治艾滋病的理論研究。
猴艾滋病病毒SIV屬逆轉錄病毒科慢病毒亞科病毒, SIV 病毒株于1985年首先從恒河猴中成功地分離。SIV引起的癥狀和人AIDS明顯相似,第一階段為感染后第1~3周,其間會出現一個病毒復制的高峰,常表現在血漿中的P27核心蛋白大量增值,有明顯的病毒血癥,表現為發熱、皮疹、腹瀉和外周淺表淋巴結腫大等,類似于人感染的臨床癥狀。第二階段為持續無臨床癥狀期。該期時間長短不一,短的僅為2個月,長的可達幾年。其表現為P27核心蛋白水平下降而相應的抗體出現。第三階段為AIDS期,猴外周血中CD4 細胞逐漸下降,血漿病毒水平回升,并伴有體重下降、全身衰竭和機會感染(主要表現為頑固的腹瀉和肺炎) 。約有20%~30%的感染猴因缺乏有效的免疫應答而死亡。SIV在基因方面和人類有70%的類似度,是研究艾滋病的最佳動物模型。SIV和HIV同屬逆轉錄病毒科慢病毒亞科病毒, SIV與CD4受體和輔助受體CCR5, CXCR4密切相關,并可使猴子致病,還可以通過母猴喂養小猴傳播。SIV猴模型作為AIDS模型,得到了越來越多人認可。國內外艾滋病實驗大多數都是應用SIV猴模型,作為AIDS發病機理、藥物治療、疫苗研制的技術平臺。
本發明人克服了諸多技術問題,成功構建了一種艾滋病靈長類中醫腎虛證動物模型。在所述動物中復制的重復性、穩定性好;能體現中醫證的特色,模型的癥狀、客觀指標和藥物反證比較一致,與中醫理論較為吻合。該模型的建立將有利于揭示艾滋病“證”的實質,驗證并探討中醫中藥的療效和機理,促進中醫藥防治艾滋病的理論研究為中醫藥治療艾滋病療效評價和藥物篩選提供了比較理想的動物模型。
發明內容
本發明的目的,是構建一種中醫腎虛證艾滋病猴模型。這種中醫腎虛證艾滋病猴模型,是由同一造模動物中醫腎虛癥候模型和SIV感染模型疊加構建而成。具由中醫腎虛癥候和SIV感染艾滋病癥候雙重特點。
本發明的目的是這樣實現的:
本發明通過兩種方案構建了中醫腎虛證艾滋病猴模型。
第一種是連續使用生大黃濃縮液灌胃,同時肌肉注射利血平和肌肉注射醋酸潑尼松龍先造成腎虛證,然后感染靜脈注射感染SIV病毒,感染14天后檢測并最終確認病毒感染,達到構建復合模型。中醫腎虛癥候模型根據實驗要求和恒河猴自身身體狀況,連續使用生大黃濃縮液灌胃,同時注射利血平和醋酸潑尼松龍對恒河猴進行3到7周的造模可達實驗設計要求。
第二種是恒河猴經靜脈注射感染猴艾滋病病毒后再用連續使用生大黃濃縮液灌胃,同時肌肉注射利血平和肌肉注射醋酸潑尼松龍造腎虛證。SIV感染模型采用SIVmac239病毒株進行靜脈感染方式,感染14天后抽血檢測確認感染情況,然后用生大黃濃縮液灌胃進行中醫腎虛癥候模型構建,最終構建復合模型。
恒河猴感染艾滋病病毒后,表現和艾滋病人極為相似,猴感染SIV后病情發展有三個階段:急性感染、慢性感染早期和慢性感染中后期,產生抗艾滋病病毒抗體IgM 和IgG體液分離病毒陽性,檢測病毒陽性。
中醫腎虛SIV復合模型病毒構建前后血漿病毒載量與正常狀況下SIV感染猴模型的血漿病毒載量相比較無明顯差別,但CD4計數較正常狀況下SIV感染猴模型的更低。CD4/CD8比值倒置狀況也較正常狀況下SIV感染猴模型更加嚴重。整體來說,中醫腎虛SIV復合模型病情較正常狀況下SIV感染的恒河猴病情更為嚴重。
本發明的特點和突出優勢在于:
成功構建了一種中醫腎虛證艾滋病猴模型。在最接近于人類的動物模型上既能體現中醫腎虛證候特點及演變規律,并可從中獲得穩定的腎虛癥狀和腎虛證相關客觀指標,又能體現最接近人類艾滋病的感染與發病過程和癥狀,并可從中獲得穩定的病毒學、免疫學及病理學相關客觀指標。構建的病、證結合的艾滋病猴模型具有重復性和穩定性,有利于揭示艾滋病“證”的實質,驗證并探討中醫中藥的療效和機理,促進中醫藥防治艾滋病的理論研究。
以下通過實施例進一步說明本發明的內容,本領域技術人員能夠通過實施例了解本發明所說的一種中醫腎虛證艾滋病猴模型的建立方法和用途。但是這些實施例不得理解為對本發明權利要求的限制。
實施例1   第一種構建中醫腎虛證艾滋病猴模型的方法和用途

1 實驗動物:選擇健康成年雄性恒河猴,經血清學檢測SIV,猴逆轉錄D型病毒(SRV)和猴T淋巴細胞性I型病毒(STLV-I)抗體陰性,無腎虛、氣虛癥狀體征;
2 造模藥物:大黃灌胃濃縮液、利血平注射液(1mL: 1mg)、醋酸潑尼松龍注射液(5mL: 125mg)
2.1制備工藝:取生大黃藥材,粉碎成粗粉,稱取5 kg,加4倍量水,置不銹鋼桶中攪拌均勻,浸泡0.5 h,再將此桶置入沸水浴中,繼續加熱、保溫攪拌20 min,用紗布過濾,殘渣加沸水8000 mL,攪拌20 min,四層紗布過濾。先將第二次過濾的藥液常壓下濃縮至小體積,再并入第一次的過濾液,常壓濃縮至5000 mL,即得。濃度為1 mL = 1 g生藥。
給藥方式:大黃灌胃液經鼻插胃管,灌胃給藥。利血平注射液肌肉注射。醋酸潑尼松龍注射液肌肉注射。
感染模型構建
3.1 造模感染病毒株:SIVmac239病毒株
3.2 感染劑量及方式
感染的劑量為1:3000,使用1640稀釋液進行稀釋,將稀釋后呈粉紅色液體1ml進行靜脈注射,注射后壓按注射口防治血液倒流以確保注射病毒劑量準確,14天后抽血檢測確認感染情況。
造模效果評價
4.1 中醫證候積分
復合模型構建前恒河猴中醫癥候臨床觀察無特殊異常,中醫癥候積分一般在0~6分水平波動。復合模型構建啟動后,造模恒河猴群出現明顯的腹瀉、攝食量減少、進食速度減慢、厭食等典型中醫脾虛情況;隨著造模時間的延長,恒河猴群相繼出現腹瀉加重出現水樣便或粘液血便、攝食和食欲明顯下降、對外界刺激反應能力降低和減緩、蜷縮、嗜睡、體重下降等癥狀體征;在造模后期,造模恒河猴出現類似艾滋病猴終末期死亡前脾腎陽虛癥狀,主要表現為消化道癥狀明顯加重、毛發開始干澀、疏松、體重進一步下降、攝食明顯減少甚至不攝食、明顯蜷縮、怕冷、嗜睡、對外界刺激反應明顯減弱,甚至對輕度刺激無反應、抽血檢測時明顯感覺血液流速下降,血液難抽取。
體重變化
造模動物在造模后體重迅速下降,個體存在明顯差異。中醫腎虛造模前體重4.8545kg±0.54726kg,造模后體重4.7160kg±0.4824kg(配對T檢驗方法P=0.006)。臨床基線一致的10頭同期非造模健康猴造模前體重4.7270kg±0.72483kg,造模后體重5.1520kg±0.8099kg。
部分生化指標變化情況
4.3.1  T3指標變化情況
動物造模后T3 (nmol/L) 指標明顯下降。腎虛造模后T3下降的幅度較脾虛造模的幅度大,并與造模強度和臨床癥狀密切相關。可能為中醫腎虛證特異性指標。
造模動物中(n=30)T3指標在中醫腎虛造模前均數為6.02±1.09,造模后均數為2.65±0.49(P=0.000)。
指標變化情況
動物造模后T4 (nmol/L) 指標出現水平波動。
造模動物中(n=20)T4指標在中醫腎虛造模前均數為112.4±36.0,造模后均數為103.2±19.4(P=0.676)。
指標變化情況
動物造模后T (nmol/L)指標出現水平波動,變化未顯示特異性。
造模動物中(n=20)T指標在中醫腎虛造模前均數為0.31±0.09,造模后均數為0.21±0.12。
指標變化情況
動物造模后E2 (pmol/L)指標出現水平波動,整體水平較造模前有所升高。
造模動物中(n=20)E指標在中醫腎虛造模前均數為39.4±23.4,造模后均數為78.84±12.9。
指標變化情況
動物造模后Cor (nmol/L)指標出現水平波動,整體水平較造模后下降,已經下降到參考范圍下限以下,為腎虛模型特異性指標之一。
造模動物中(n=20)Cor指標在中醫腎虛造模前均數為1181.8±360.4,造模后均數為529.78±149.47。整體水平下降非常顯著。
指標變化情況
動物造模后ACTH (pmol/L)指標出現水平波動,整體水平較造模后明顯下降。但該指標仍在正常動物參考范圍內,臨床意義有待進一步研究。該指標是屬于水平波動還是可以作為腎虛模型特異性指標,尚待進一步研究。
造模動物中(n=20)ACTH指標在中醫腎虛造模前均數為19.2±8.8,造模后均數為10.8±3.3。
指標變化情況
動物造模后cAMP (pmol/L)指標出現水平波動,但該指標仍在正常動物參考范圍內,臨床意義有待進一步研究。
造模動物中(n=20)cAMP指標在中醫腎虛造模前均數為42.1±9.3,造模后均數為35.87±18.49,下降水平接近正常動物參考范圍的下限。
指標變化情況
動物造模后cGMP (pmol/L)指標出現下降趨勢,但該指標仍在正常動物參考范圍內,臨床意義有待進一步研究。該指標是屬于水平波動還是可以作為腎虛模型特異性指標,尚待進一步研究。
造模動物中(n=20)cGMP指標在中醫腎虛造模前均數為9.95±2.85,造模后均數為5.62±2.12,下降水平接近參考范圍的下限。
指標變化情況
動物造模后IL-2 (ng/mL)指標出現正常水平波動。
造模動物中(n=20)IL-2指標在中醫腎虛造模前均數為2.64±1.08,造模后均數為3.96±0.90。
指標變化情況
動物造模后IL-6 (ng/mL)指標出現水平波動,整體呈上升趨勢,可能為復合模型的特異性指標。
造模動物中(n=20)IL-6指標在中醫腎虛造模前均數為74.2±20.1,造模后均數為82.22±28.08。
指標變化情況
動物造模后BMG (μg/mL)指標出現水平波動,但該指標仍在正常動物參考范圍內,臨床意義有待進一步研究。該指標是屬于水平波動還是可以作為腎虛模型特異性指標,尚待進一步研究。
造模動物中(n=20)BMG指標在中醫腎虛造模前均數為0.57±0.13,造模后均數為0.83±0.14。
指標變化情況
動物造模后TNF (ng/mL)指標出現水平波動。但該指標仍在正常動物參考范圍內,臨床意義有待進一步研究。該指標是屬于水平波動還是可以作為腎虛模型特異性指標,尚待進一步研究。
造模動物中(n=20)TNF指標在中醫腎虛造模前均數為2.41±0.74,造模后均數為2.98±0.68。
血漿病毒載量和CD4計數、CD4/CD8比值
中醫腎虛SIV復合模型病毒構建后每2周收集標本,用RT-PCR方法測定病毒載量,證實了本發明使SIV病毒在該動物模型中復制。復合模型造模后病毒載量變化,為復合模型特異性指標。中醫腎虛SIV感染復合模型構建前后血漿病毒載量與正常狀況下感染自然癥候觀察組比較差別不顯著,但CD4計數結果比正常感染恒河猴計數低,而且CD4/CD8復合模型倒置嚴重,具統計學差異,證實腎虛造模后能加重SIV感染病情。
血漿病毒載量
造模動物中(n=20)病毒載量對數指標在造模前為0,造模后均數為4.2315±1.08221。
動物造模后CD4%出現下降,而且幅度較大,與造模和臨床相關,為中醫腎虛SIV感染復合模型特異性指標。
造模動物中(n=20)CD4%指標在造模前均數為27.08±7.28811,造模后均數為16.009±7.51131。
比值
動物造模后CD4+/CD8+比值出現下降,而且幅度較大,與造模和臨床相關,為中醫腎虛SIV感染復合模型特異性指標。
造模動物中(n=20)CD4+/CD8+比值指標在造模前均數為1.5695±0.72369,造模后均數為0.8905±0.43173。
中藥反證實驗
腎虛復合模型非治療組死亡比例4/4,同期病毒模型對照死亡比例4/10。補腎治療方案死亡比例1/15,清熱解毒死亡比例7/15,同期病毒模型對照死亡比例4/10,差異有統計學意義。數據說明,采用補腎方案死亡率最低,應該是艾滋病治療的關鍵。
模型具體應用
5.1  造模后觀察腎虛證對艾滋病感染急性期病毒高峰的改變,毒血癥的病理變化,觀察藥物或疫苗的預防效果,特別是觀察早期應用中藥對疾病進程的影響,為臨床窗口期的中醫藥治療提供依據。
5.2  SIV感染早期模型的應用:觀察證候對艾滋病進展的相關性和病理機制,觀察中藥或西藥的藥代動力學、療效或疫苗的效果,較普遍適用。
5.3  SIV感染中、后期模型的應用:觀察中藥或中西藥聯合應用的藥代動力學和療效,特別是中醫藥對艾滋病患者全身狀況的變化,病毒載量的下降,免疫學改善的影響及中藥對HAART治療減毒增效的研究。
5.4 不同時期淋巴結病理學活檢:觀察中醫證候演變與艾滋病病情輕重形態學指標的相關性。通過治療前后的對比,可以清楚知道抗艾滋病藥物的療效和藥效維持時間的長短;運用免疫組織化學的方法,可以測出幼稚淋巴細胞的再生的情況,具有說服力。
實施例2   第二種構建中醫腎虛證艾滋病猴模型的方法和用途

1 實驗動物:選擇健康成年雄性恒河猴,經血清學檢測SIV,猴逆轉錄D型病毒(SRV)和猴T淋巴細胞性I型病毒(STLV-I)抗體陰性,無腎虛、氣虛癥狀體征;
2 造模藥物:大黃灌胃濃縮液、利血平注射液(1mL: 1mg)、醋酸潑尼松龍注射液(5mL: 125mg)
2.1制備工藝:取生大黃藥材,粉碎成粗粉,稱取5 kg,加4倍量水,置不銹鋼桶中攪拌均勻,浸泡0.5 h,再將此桶置入沸水浴中,繼續加熱、保溫攪拌20 min,用紗布過濾,殘渣加沸水8000 mL,攪拌20 min,四層紗布過濾。先將第二次過濾的藥液常壓下濃縮至小體積,再并入第一次的過濾液,常壓濃縮至5000 mL,即得。濃度為1 mL = 1 g生藥。
給藥方式:大黃灌胃液經鼻插胃管,灌胃給藥。利血平注射液肌肉注射。醋酸潑尼松龍注射液肌肉注射。
感染模型構建
3.1 造模感染病毒株:SIVmac239病毒株
3.2 感染劑量及方式
感染的劑量為1:3000,使用1640稀釋液進行稀釋,將稀釋后呈粉紅色液體1ml進行靜脈注射,注射后壓按注射口防治血液倒流以確保注射病毒劑量準確,14天后抽血檢測確認感染情況。
造模效果評價
4.1 中醫證候積分
復合模型構建前恒河猴中醫癥候臨床觀察無特殊異常,中醫癥候積分一般在0~6分水平波動。復合模型構建啟動后,造模恒河猴群出現明顯的腹瀉、攝食量減少、進食速度減慢、厭食等典型中醫脾虛情況;隨著造模時間的延長,恒河猴群相繼出現腹瀉加重出現水樣便或粘液血便、攝食和食欲明顯下降、注意力下降、對外界刺激反應能力降低和減緩、蜷縮、嗜睡、體重下降等癥狀體征;在造模后期,造模恒河猴出現類似艾滋病猴終末期死亡前脾腎陽虛癥狀,主要表現為消化道癥狀明顯加重、毛發開始干澀、疏松、體重進一步下降、攝食明顯減少甚至不攝食、明顯蜷縮、怕冷、嗜睡、對外界刺激反應明顯減弱,甚至對輕度刺激無反應、抽血檢測時明顯感覺血液流速下降,血液難抽取。
體重變化
造模動物在造模后體重迅速下降,個體存在明顯差異。中醫腎虛造模前體重4.8545kg±0.54726kg,造模后體重4.7160kg±0.4824kg(配對T檢驗方法P=0.006)。臨床基線一致的10頭同期非造模健康猴造模前體重4.7270kg±0.72483kg,造模后體重5.1520kg±0.8099kg。
部分生化指標變化情況
4.3.1  T3指標變化情況
動物造模后T3 (nmol/L)指標明顯下降。腎虛造模后T3下降的幅度較脾虛造模的幅度大,并與造模強度和臨床癥狀密切相關。可能為中醫腎虛證特異性指標。
動物造模后T3指標明顯下降。腎虛造模后T3下降的幅度較脾虛造模的幅度大,并與造模強度和臨床癥狀密切相關。可能為中醫腎虛證特異性指標。
造模動物中(n=30)T3指標在中醫腎虛造模前均數為3.69±1.65,造模后均數為1.46±0.64。與第一種腎虛造模方法引起T3指標的變化趨勢相一致。
指標變化情況
動物造模后T4 (nmol/L)指標出現水平波動。
造模動物中(n=30)T4指標在中醫腎虛造模前均數為85.5±26.4,造模后均數為131.2±40.8。
指標變化情況
動物造模后T (nmol/L)指標出現水平波動,變化未顯示特異性。
造模動物中(n=30)T指標在中醫腎虛造模前均數為1.26±1.30,造模后均數為0.43±0.63。
指標變化情況
動物造模后E2 (pmol/L)指標出現水平波動,整體水平較造模前有所升高。
造模動物中(n=30)E指標在中醫腎虛造模前均數為46.8±47.1,造模后均數為64.51±22.69。與第一種造模方式產生的指標變化一致。
指標變化情況
動物造模后Cor (nmol/L)指標出現水平波動,整體水平較造模后下降,已經下降到參考范圍下限以下,為腎虛模型特異性指標之一。
造模動物中(n=30)Cor指標在中醫腎虛造模前均數為853.5±367.6,造模后均數為360.1±129.6。兩種腎虛造模方法引起Cor指標的變化趨勢相一致,整體水平下降非常顯著。而且以第二種腎虛艾滋病復合模型構建后的病情較正常猴SIV感染恒河猴的更嚴重。
指標變化情況
動物造模后ACTH (pmol/L)指標出現水平波動,整體水平較造模后明顯下降。但該指標仍在正常動物參考范圍內,臨床意義有待進一步研究。該指標是屬于水平波動還是可以作為腎虛模型特異性指標,尚待進一步研究。
造模動物中(n=30)ACTH指標在中醫腎虛造模前均數為12.4±5.75,造模后均數為15.05±3.78。
指標變化情況
動物造模后cAMP (pmol/L)指標出現水平波動,但該指標仍在正常動物參考范圍內,臨床意義有待進一步研究。
造模動物中(n=30)cAMP指標在中醫腎虛造模前均數為6.34±5.08,造模后均數為31.42±9.56。
指標變化情況
動物造模后cGMP (pmol/L)指標出現下降趨勢,但該指標仍在正常動物參考范圍內,臨床意義有待進一步研究。該指標是屬于水平波動還是可以作為腎虛模型特異性指標,尚待進一步研究。
造模動物中(n=30)cGMP指標在中醫腎虛造模前均數為8.66±2.71,造模后均數為6.25±1.59,下降水平接近參考范圍的下限。
指標變化情況
動物造模后IL-6 (ng/mL)指標出現水平波動,整體呈上升趨勢,可能為復合模型的特異性指標。
造模動物中(n=30)IL-6指標在中醫腎虛造模前均數為77.3±50.2,造模后均數為90.89.4±33.07。
指標變化情況
動物造模后BMG (μg/mL)指標出現水平波動,但該指標仍在正常動物參考范圍內,臨床意義有待進一步研究。該指標是屬于水平波動還是可以作為腎虛模型特異性指標,尚待進一步研究。
造模動物中(n=30)BMG指標在造模前均數為0.90±0.14,造模后均數為0.75±0.15。
指標變化情況
動物造模后TNF (ng/mL)指標出現水平波動。但該指標仍在正常動物參考范圍內,臨床意義有待進一步研究。該指標是屬于水平波動還是可以作為腎虛模型特異性指標,尚待進一步研究。
造模動物中(n=30)TNF指標在中醫腎虛造模前均數為4.48±0.84,造模后均數為3.33±0.41。
血漿病毒載量和CD4計數、CD4/CD8比值
中醫腎虛SIV復合模型病毒構建后每2周收集標本,用RT-PCR方法測定病毒載量,證實了本發明使SIV病毒在該動物模型中復制。復合模型造模后病毒載量變化,為復合模型特異性指標。中醫腎虛SIV感染復合模型構建前后血漿病毒載量與正常狀況下感染自然癥候觀察組比較差別不顯著,但CD4計數結果比正常感染恒河猴計數低,而且CD4/CD8復合模型倒置嚴重,具統計學差異,證實腎虛造模后能加重SIV感染病情。
血漿病毒載量
造模動物中(n=30)病毒載量對數指標在造模前均數為4.2276±1.257, 造模后均數為3.5347±1.62709。
動物造模后CD4%出現下降,而且幅度較大,與造模和臨床相關,為中醫腎虛SIV感染復合模型特異性指標。
造模動物中(n=30)CD4%指標在造模前均數為22.855±11.21, 造模后均數為15.7910±9.58292。與第一種腎虛艾滋病復合猴模型的變化趨勢一致。
比值
動物造模后CD4+/CD8+比值出現下降,而且幅度較大,與造模和臨床相關,為中醫腎虛SIV感染復合模型特異性指標。
造模動物中(n=30)CD4+/CD8+比值指標在造模前均數為1.0863±0.709, 造模后均數為0.6513±0.38174。與第一種腎虛艾滋病復合猴模型的變化趨勢一致。
中藥反證實驗
腎虛復合模型非治療組死亡比例4/4,同期病毒模型對照死亡比例4/10。補腎治療方案死亡比例1/15,清熱解毒死亡比例7/15,同期病毒模型對照死亡比例4/10,差異有統計學意義。數據說明,采用補腎方案死亡率最低,應該是艾滋病治療的關鍵。
模型具體應用
5.1  造模后觀察腎虛證對艾滋病感染急性期病毒高峰的改變,毒血癥的病理變化,觀察藥物或疫苗的預防效果,特別是觀察早期應用中藥對疾病進程的影響,為臨床窗口期的中醫藥治療提供依據。
5.2  造模后觀察疾病的證候演變規律及其對病毒復制的影響,觀察中藥預防效果。
5.3  SIV感染早期模型的應用:觀察證候對艾滋病進展的相關性和病理機制,觀察中藥或西藥的藥代動力學、療效或疫苗的效果,較普遍適用。
5.4  SIV感染中、后期模型的應用:觀察中藥或中西藥聯合應用的藥代動力學和療效,特別是中醫藥對艾滋病患者全身狀況的變化,病毒載量的下降,免疫學改善的影響及中藥對HAART治療減毒增效的研究。
5.5不同時期淋巴結病理學活檢:觀察中醫證候演變與艾滋病病情輕重形態學指標的相關性。通過治療前后的對比,可以清楚知道抗艾滋病藥物的療效和藥效維持時間的長短;運用免疫組織化學的方法,可以測出幼稚淋巴細胞的再生的情況,具有說服力。

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