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靶向性抗腫瘤藥物和基因共載載體材料及制備和應用.pdf

摘要
申請專利號:

CN201210531834.6

申請日:

2012.12.12

公開號:

CN102949727B

公開日:

2015.01.14

當前法律狀態:

終止

有效性:

無權

法律詳情: 未繳年費專利權終止IPC(主分類):A61K 47/02申請日:20121212授權公告日:20150114終止日期:20151212|||授權|||實質審查的生效IPC(主分類):A61K 47/02申請日:20121212|||公開
IPC分類號: A61K47/02; A61K47/36; A61K47/42; A61K48/00; A61P35/00 主分類號: A61K47/02
申請人: 天津醫科大學
發明人: 楊曉英; 曹秀芬; 王銀松; 段宏泉; 陳永勝
地址: 300070 天津市和平區氣象臺路22號天津醫科大學藥學院
優先權:
專利代理機構: 天津市杰盈專利代理有限公司 12207 代理人: 王小靜
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法律狀態
申請(專利)號:

CN201210531834.6

授權公告號:

|||102949727B||||||

法律狀態公告日:

2017.02.01|||2015.01.14|||2013.04.03|||2013.03.06

法律狀態類型:

專利權的終止|||授權|||實質審查的生效|||公開

摘要

本發明涉及一種基于氧化石墨烯的靶向性抗腫瘤藥物和基因共載載體材料及制備和應用。將葉酸、乳糖酸等腫瘤細胞靶向或肝靶向的分子與可溶性殼聚糖的部分氨基通過酰胺鍵連接制備偶聯物,再與氧化石墨烯連接,用帶季銨基團的環氧化合物對其季銨化。用殼聚糖的季銨化部分通過靜電引力負載基因分子;再用非共價鍵方法通過π-π共軛、氫鍵、疏水效應作用負載抗腫瘤藥物。利用靶向分子的靶向性以及特定尺寸氧化石墨烯在腫瘤組織的增強滲透滯留效應,同時結合氧化石墨烯對所載藥物的pH響應控制釋放性能,達到在腫瘤細胞內釋放藥物,從協同用藥出發合成具有腫瘤靶向或肝靶向的抗腫瘤藥物和基因共載智能輸送體系,為腫瘤的聯合治療提供理論基礎和方法依據。

權利要求書

權利要求書一種基于功能化氧化石墨烯的靶向性抗腫瘤藥物和基因共載載體材料,其特征在于它是將靶向分子與可溶性殼聚糖的部分氨基通過酰胺鍵連接,制備二者偶聯物,然后再將其與氧化石墨烯連接,最后利用一個帶季銨基團的環氧化合物對其進一步季銨化而制成,利用殼聚糖的季銨化部分通過靜電引力負載基因分子;再采用非共價鍵方法,通過π-π共軛、氫鍵、疏水效應作用負載抗腫瘤藥物,其中,靶向分子、殼聚糖、氧化石墨烯與帶季銨基團的環氧化合物的質量比:1:1?50:0.2?20:0.1?100;制備方法是:在脫水劑存在下,將靶向分子與可溶性殼聚糖在水溶液中攪拌反應,旋蒸,濃縮物過葡聚糖凝膠柱,產物靶向分子和殼聚糖偶聯物濃縮凍干后在脫水劑的存在下與氧化石墨烯超聲攪拌反應,分離,洗滌產物,再與帶季銨基團的環氧化合物在80℃下超聲攪拌反應,反應結束后固體產品經反復離心洗滌,得到帶正電荷的功能化氧化石墨烯,分散在水或培養基RPMI 1640中與抗腫瘤藥物和基因分子混合,孵育即可;所述的抗腫瘤藥物的負載量為0.05~2.0 mg/mg;所述的基因分子的負載量為0.01~50 μmol/g;所述的靶向分子是指具有腫瘤靶向或肝靶向的各種分子:葉酸、乳糖酸、半乳糖苷、甘草次酸或腫瘤細胞靶向的各種抗體和小肽。
根據權利要求1所述的載體材料,其特征在于所述的含有季銨基團的環氧化合物指2,3?環氧丙基三甲基氯化銨(2,3?Epoxypropylttrimethylam monium Chloride)等帶有環氧基或季銨基的所有化合物。
根據權利要求1所述的載體材料,其特征在于所述的藥物是指具有水溶性的各種藥物:(鹽酸)阿霉素及其衍生物類藥物、(鹽酸)道諾霉素、(鹽酸)米托蒽醌、甲氨喋呤、(硫酸)長春堿及其衍生物類藥物、(鹽酸)羥基喜樹堿、(鹽酸)阿糖胞苷、5-氟尿嘧啶等中的一種或兩種。
根據權利要求1所述的載體材料,其特征在于所述的基因分子是指:抑制腫瘤生長的端粒酶反轉錄酶siRNA、抑制腫瘤細胞多藥耐藥性的多藥耐藥siRNA、抑制腫瘤細胞生長或誘導腫瘤細胞凋亡的siRNA和具有免疫調節作用的各種siRNA等中的一種或兩種,或抑癌基因Pdcd4(programmed cell death 4)、RECK、轉錄調節因子Rb、轉錄調節因子p53、負調控轉錄因子WT;或周期蛋白依賴性激酶抑制因子(CKI):p15、p16、p21、信號通路的抑制因子ras GTP酶活化蛋白(NF?1)、磷脂酶(PTEN)、DNA修復因子BRCA1、DNA修復因子BRCA2;或與發育和干細胞增殖相關的信號途徑組分:APC、Axin。
根據權利要求1所述的載體材料,其特征在于所述的氧化石墨烯是指分子骨架由六邊形晶格排列的單層石墨原子組成,且經過功能化而得到的含有含氧基團的二維平面材料,其厚度分布在0.3nm到2nm之間,大小分布在10nm2到400μm2之間;該功能化氧化石墨烯材料可采用機械剝離法、晶體外延生長法及化學氧化等方法制備;該氧化石墨烯材料能很好的分散到水溶液中。
一種權利要求1所述的基于氧化石墨烯的靶向性抗腫瘤藥物和基因共載載體材料的制備方法,其特征在于包括如下的步驟:
1)靶向分子和可溶性殼聚糖偶聯物的制備:在脫水劑的存在下,將靶向分子和可溶性殼聚糖混溶于水溶液中,室溫攪拌一天,體系旋蒸脫溶,濃縮物過葡聚糖凝膠柱以除去小分子雜質,將產物濃縮凍干,獲得二者偶聯產物;
2)將步驟1)制備的偶聯產物修飾在氧化石墨烯上,在脫水劑的存在下,將靶向分子和可溶性殼聚糖偶聯物與氧化石墨烯混合超聲溶于水中,水浴超聲60W,1小時,室溫攪拌四天,產物通過反復離心、超聲分散,水浴超聲60W,2分鐘,循環,進行洗滌,除去未反應的偶聯物;
3)將步驟2)制備的功能化氧化石墨烯與2,3?環氧丙基三甲基氯化銨混溶于水溶液中,加氫氧化鈉調pH值至7?8,80℃攪拌反應24小時,產物通過反復離心、超聲分散,水浴超聲60W,2分鐘,循環,進行洗滌,除去未反應的2,3?環氧丙基三甲基氯化銨;
所述的靶向分子和可溶性殼聚糖偶聯物和脫水劑的質量比為1:1?1000:0.1?10。
根據權利要求6所述的方法,其特征在于所述的氧化石墨烯和步驟1)制備的偶聯產物和脫水劑的質量比為1:5?50:0.5?5。
根據權利要求6所述的方法,其特征在于所述的可溶性殼聚糖分子量在1000?10000。
根據權利要求6所述的方法,其特征在于所述的脫水劑為1?ethyl?3(3?dimethy amino?propyl) carbodiimide(EDC)及其鹽酸鹽, 1,3?dicyclohexylcarbodi?imide (DCC)及其鹽酸鹽, 1,3?diisopropylcarbodi?imide(DIC)及其鹽酸鹽,1,3?dihexylcarbodi?imide(DHC)及其鹽酸鹽,N?hydroxy succinimide(NHS)及其鈉鹽, N?hydroxysulfosuccinimide(sulfo?NHS)及其鈉鹽, 1?hydroxybenzotriazole hydrate (HOBt)中的一種或多種。
權利要求1所述的載體材料用于制備治療腫瘤的藥物。
 

說明書

說明書靶向性抗腫瘤藥物和基因共載載體材料及制備和應用
技術領域
 本發明涉及一種靶向性抗腫瘤藥物和基因共載載體材料及制備和應用,具體說是基于功能化氧化石墨烯的靶向性抗腫瘤藥物和基因等負電性治療用生物分子共載載體材料及其制備方法和應用。
背景技術
將基因和抗腫瘤藥物組合后共同進行靶向輸送,可模擬臨床腫瘤治療的聯合用藥模式,分別通過不同途徑協同作用,可以使二者達到微觀水平上的序貫聯合作用,提高了各自的抗腫瘤療效,同時降低藥物對人體正常器官、組織的毒副作用。例如多藥耐藥是多種癌癥化療無效或漸失效的主要原因,如果將抗腫瘤藥物和逆轉腫瘤細胞多藥耐藥的小干擾RNA(MDR siRNA)進行共載輸送,可以用來逆轉腫瘤多藥耐藥,增加耐藥細胞對抗腫瘤藥物的敏感性,提高化療藥物的抗腫瘤療效。或者將抗腫瘤藥物與抑制腫瘤細胞生長的端粒酶逆轉小干擾RNA(TERT siRNA)、誘導腫瘤細胞調亡的小干擾RNA(Bcl-2靶向的siRNA)或者抗腫瘤的蛋白藥物等進行共載輸送,可以使化療藥與這些基因或大分子蛋白藥物一起協同殺死腫瘤細胞,從而提高抗腫瘤療效。另一方面常用的化療藥物由于其全身分布,要達到病灶部位的藥物有效濃度,會對人體的其它部位產生較大的毒副作用,一些病人往往死于化療藥物對其他臟器的傷害。因而能夠達到靶向輸送對于提高藥效和降低藥物副作用更重要。導向治療屬于靶向給藥系統,是指讓治療藥物與靶向載體相結合,在載體的導向下把藥物運送到靶器官或靶組織,使藥物有選擇的集中于人體的病變部位,以減少藥物在非靶向組織的無效流失,從而提高藥效,更重要的是避免對正常器官和組織的毒副作用。因而就需要尋找一種能實現靶向輸送的多功能高效的藥物和基因共載輸送體系。
要對抗腫瘤藥物和基因進行共載靶向輸送,就需要找到可以進行多種功能化的適合的載體,由于新型碳納米材料氧化石墨烯(Graphene Oxide,GO)具有大比表面積、可同時進行多種功能化、極好的水溶液分散性、無生物毒性、可進入細胞并具有酸敏性等特點,可用來負載大量的各種分子,包括各種金屬、生物分子、熒光分子和多種藥物等,從而使其在藥物及基因的靶向輸送以及生物分子的檢測、分離和純化等方面具有許多潛在的應用。
要實現用氧化石墨烯攜帶抗腫瘤藥物和基因共同進入腫瘤細胞,首先需要氧化石墨烯先載著抗腫瘤藥物和基因到達腫瘤細胞。一種常見的實現基因或藥物靶向輸送的方法是在轉運載體上連接能夠與腫瘤細胞表面的某些特定分子相互作用的特異性配體,例如作用于腫瘤細胞表面抗原的單克隆抗體、作用于細胞表面葉酸受體的葉酸或作用于細胞表面鐵傳遞蛋白受體的鐵傳遞蛋白等都可以增強載體材料的腫瘤細胞靶向傳輸效果。其中葉酸是一種常用且效果較好的腫瘤細胞靶向分子,與它特異性相互作用的葉酸受體在大部分惡性腫瘤中具有高度表達,有時可比正常組織高出100~300倍。細胞膜共振提示葉酸納米粒子在腫瘤細胞中的濃度比游離葉酸高10倍, 葉酸對于卵巢癌、子宮內膜癌、乳腺癌、頭頸部腫瘤及粒細胞白血病等多種腫瘤細胞都有很好的靶向效果。而甘草次酸受體介導的和多糖介導的輸送體系能夠實現肝靶向藥物和基因輸送。
為了增加氧化石墨烯的生物相容性并降低毒性,通常采用聚乙二醇、普魯蘭多糖和殼聚糖等生物相容性大分子對其進行修飾。其中殼聚糖是自然界唯一的氨基多糖甲殼素的脫乙酰產物, 具有優良的生物學性質(良好的生物相容性和可生物降解性、無毒性及被動的腫瘤靶向性等)和物理化學特性(高反應活性及pH 敏感性等), 是一種理想的藥物靶向和緩控釋高分子載體。因此,用殼聚糖對氧化石墨烯進行修飾,能很好的增加其生物相容性。在殼聚糖的側鏈有多個氨基,如對其部分氨基偶聯乳糖酸、甘草次酸、葉酸,或具有腫瘤靶向性的小肽,則可以實現氧化石墨烯載體體系的靶向輸送。而對殼聚糖側鏈剩余的部分氨基進一步季銨化,則能增強其正電性,從而能夠更高效的攜載基因。
此外,文獻(Nano Lett. 2010, 10, 3318–3323.)報道,一定大小的功能化氧化石墨烯能夠在腫瘤組織中高度富集,具有明顯的腫瘤組織滯留性,即增強滲透滯留效應(Enhanced permeability and retention effect,EPR)效應。因而采用連接靶向分子的殼聚糖修飾氧化石墨烯,可以使其主動靶向到腫瘤部位,再利用特定尺寸氧化石墨烯對腫瘤組織的EPR效應,結合主動靶向與被動靶向協同作用,增強多功能化氧化石墨烯載體對腫瘤的靶向作用。同時,氧化石墨烯和殼聚糖本身都對某些抗腫瘤藥具有酸敏性,因而殼聚糖修飾的氧化石墨烯可以實現抗腫瘤藥物和基因在腫瘤細胞內的最大釋放。
因此本發明制備一種基于氧化石墨烯的具有靶向性的抗腫瘤藥物和基因的共載輸送體系,在載體的導向下把抗腫瘤藥物和基因共同輸送到靶組織,使其有選擇的集中于人體的特殊部位,從而提高其抗腫瘤療效,此項研究為腫瘤的聯合治療提供理論基礎和方法依據。
發明內容
本發明的目的是提供一種基于氧化石墨烯的靶向性抗腫瘤藥物和基因共載載體材料及制備和應用,它是針對解決化療藥物對人體正常組織具有極大副作用及容易產生多藥耐藥等問題,將抗腫瘤藥物和基因分子組合后共同進行靶向輸送,使二者達到微觀水平上的序貫聯合作用,提高了各自的抗腫瘤療效,同時降低藥物對人體正常器官、組織的毒副作用。
本發明采用功能化氧化石墨烯做載體,以具有良好生物相容性的天然多糖—殼聚糖為修飾材料,制備抗腫瘤藥物和基因分子的共載體系,利用各種靶向分子的靶向性以及特定尺寸氧化石墨烯在腫瘤組織的增強滲透滯留效應,同時結合氧化石墨烯對所載藥物的pH響應控制釋放性能,達到在腫瘤細胞內釋放藥物,從協同用藥的層面出發,合成出一種具有腫瘤靶向或肝靶向的抗腫瘤藥物和基因共載智能輸送體系,為腫瘤的聯合治療提供理論基礎和方法依據。
本發明提供的一種基于功能化氧化石墨烯的靶向性抗腫瘤藥物和基因共載載體材料是將葉酸、乳糖酸等腫瘤細胞靶向或肝靶向的分子與可溶性殼聚糖的部分氨基通過酰胺鍵連接,制備二者偶聯物,然后再將其與氧化石墨烯連接,最后利用一個帶季銨基團的環氧化合物對其進一步季銨化而制成,利用殼聚糖的季銨化部分通過靜電引力負載基因分子;再采用非共價鍵方法,通過π-π共軛、氫鍵、疏水效應等作用負載抗腫瘤藥物。其中葉酸等靶向分子、殼聚糖、氧化石墨烯與帶季銨基團的環氧化合物的質量比:1:1?50:0.2?20:0.1?100。
制備方法是:在脫水劑存在下,將葉酸、乳糖酸等腫瘤細胞靶向或肝靶向的分子與可溶性殼聚糖在水溶液中攪拌反應,旋蒸,濃縮物過葡聚糖凝膠柱,產物葉酸或乳糖酸等靶向分子和殼聚糖偶聯物濃縮凍干后在脫水劑的存在下與氧化石墨烯超聲攪拌反應,分離,洗滌產物,再與帶季銨基團的環氧化合物在80℃下超聲攪拌反應,反應結束后固體產品經反復離心洗滌,得到帶正電荷的功能化氧化石墨烯,分散在水或培養基RPMI 1640中與抗腫瘤藥物和基因分子混合,孵育即可。
所述的靶向分子是指具有腫瘤靶向或肝靶向的各種分子,優選的有葉酸、乳糖酸、半乳糖苷、甘草次酸、腫瘤細胞靶向的各種抗體和小肽等。
所述的含有季銨基團的環氧化合物指2,3?環氧丙基三甲基氯化銨(2,3?Epoxypropylttrimethylam monium Chloride)等帶有環氧基和季銨基的所有化合物。
所述的抗腫瘤藥物的負載量為0.05~2.0 mg/mg。
所述的藥物是指具有水溶性的各種藥物,優選的有具有共軛體系的藥物,如(鹽酸)阿霉素及其衍生物類藥物、(鹽酸)道諾霉素、(鹽酸)米托蒽醌、甲氨喋呤、(硫酸)長春堿及其衍生物類藥物、(鹽酸)羥基喜樹堿、(鹽酸)阿糖胞苷、5-氟尿嘧啶等中的一種或兩種等。
所述的基因分子的負載量為0.01~50 μmol/g。 
所述的基因分子是指具有RNA干擾作用的各種小干擾RNA、各種抑制腫瘤生長的抑癌基因以及抗腫瘤的蛋白藥物等。優選的有抑制腫瘤生長的端粒酶反轉錄酶siRNA、抑制腫瘤細胞多藥耐藥性的多藥耐藥siRNA、抑制腫瘤細胞生長或誘導腫瘤細胞凋亡的siRNA和具有免疫調節作用的各種siRNA等中的一種或兩種等,抑癌基因Pdcd4(programmed cell death 4)、RECK、轉錄調節因子,如Rb、p53,負調控轉錄因子,如WT,周期蛋白依賴性激酶抑制因子(CKI),如p15、p16、p21,信號通路的抑制因子,如ras GTP酶活化蛋白(NF?1),磷脂酶(PTEN),DNA修復因子,如BRCA1、BRCA2,與發育和干細胞增殖相關的信號途徑組分,如:APC、Axin等。
所述的氧化石墨烯是指分子骨架由六邊形晶格排列的單層石墨原子組成,且經過功能化而得到的含有含氧基團(羧基、羥基、環氧基和羰基)的二維平面材料,其厚度分布在0.3nm到2nm之間,大小分布在10nm2到400μm2之間。該功能化氧化石墨烯材料可采用機械剝離法、晶體外延生長法及化學氧化等方法制備。該氧化石墨烯材料能很好的分散到水溶液中。
 
本發明提供的一種基于功能化氧化石墨烯的靶向性抗腫瘤藥物和基因共載載體材料的制備方法包括如下的步驟:
1)靶向分子和可溶性殼聚糖偶聯物的制備:在脫水劑的存在下,將葉酸等靶向分子和可溶性殼聚糖混溶于水溶液中,室溫攪拌一天,體系旋蒸脫溶,濃縮物過葡聚糖凝膠柱以除去小分子雜質,將產物濃縮凍干,獲得二者偶聯產物。
2)將步驟1)制備的偶聯產物修飾在氧化石墨烯上,在脫水劑的存在下,將靶向分子和可溶性殼聚糖偶聯物與氧化石墨烯混合超聲溶于水中(水浴超聲60W,1小時),室溫攪拌四天,產物通過反復離心、超聲分散(水浴超聲60W,2分鐘)循環,進行洗滌,除去未反應的偶聯物。
3)將步驟2)制備的功能化氧化石墨烯與2,3?環氧丙基三甲基氯化銨混溶于水溶液中,加氫氧化鈉調pH值至7?8,80℃攪拌反應24小時,產物通過反復離心、超聲分散(水浴超聲60W,2分鐘)循環,進行洗滌,除去未反應的2,3?環氧丙基三甲基氯化銨。
其中,氧化石墨烯的制備過程可參考(ACSNano,2008,2,463?470)。
所述的靶向分子和可溶性殼聚糖偶聯物和脫水劑的質量比為1:1?1000:0.1?10。
所述的氧化石墨烯和步驟1)制備的偶聯產物和脫水劑的質量比為1:5?50:0.5?5。
所述的可溶性殼聚糖分子量在1000?10000。
所述的脫水劑為1?ethyl?3(3?dimethy amino?propyl) carbodiimide(EDC)及其鹽酸鹽, 1,3?dicyclohexylcarbodi?imide (DCC)及其鹽酸鹽, 1,3?diisopropylcarbodi?imide(DIC)及其鹽酸鹽,1,3?dihexylcarbodi?imide(DHC)及其鹽酸鹽,N?hydroxy succinimide(NHS)及其鈉鹽, N?hydroxysulfosuccinimide(sulfo?NHS)及其鈉鹽, 1?hydroxybenzotriazole hydrate (HOBt)中的一種或多種。
本發明基于功能化氧化石墨烯的靶向性的抗腫瘤藥物和基因共載載體材料作為一種低毒高效的藥物載體材料,用于制備腫瘤治療的藥物。
本發明基于功能化氧化石墨烯的靶向性的抗腫瘤藥物和基因共載載體材料的顯著優點是: 
1、該載體材料充分利用新型碳納米材料氧化石墨烯具有大比表面積、可多重修飾、高穩定性、無免疫原性的特點,制備基于多功能化氧化石墨烯的靶向性抗腫瘤藥物和基因共載智能載體材料。該功能化高效氧化石墨烯納米基因載體采用天然多糖可溶性殼聚糖修飾,具有很好的生物相容性和水溶性,高效負載抗腫瘤藥物和基因分子,實現高度靶向、可控釋放及聯合用藥的高效藥物輸送途徑。
2、利用抗腫瘤藥物和基因共載智能輸送,利用其協同作用達到腫瘤聯合治療的效果。
3、基于氧化石墨烯對藥物的pH敏感控制釋放性能,實現藥物胞內釋藥,避免化療藥在輸送過程中大量釋放,降低其對正常組織的毒副作用。
總之,本發明針對針對解決化療藥物對人體正常組織具有極大副作用及容易產生多藥耐藥等問題,將抗腫瘤藥物和基因分子組合后共同進行靶向輸送,使二者達到微觀水平上的序貫聯合作用,提高了各自的抗腫瘤療效,同時降低藥物對人體正常器官、組織的毒副作用,同時也為基因的體內靶向輸送提供了新方法。
 
附圖說明
圖1、實施例1中合成的具有肝靶向性的功能化氧化石墨烯的原子力顯微鏡照片。
圖2、實施例1中合成的功能化氧化石墨烯的熱重分析。
圖3、實施例1中合成的功能化氧化石墨烯的紅外光譜圖。
圖4、實施例1中合成的功能化氧化石墨烯負載抗腫瘤藥物鹽酸阿霉素后在不同pH值下的藥物釋放性能。
圖5、實施例1中合成的功能化氧化石墨烯負載熒光標記的DNA后被人肝癌細胞QGY?7703吸收的共聚焦熒光顯微鏡照片。
圖6、實施例1中合成的功能化氧化石墨烯負載鹽酸阿霉素前后對人肝癌細胞QGY?7703的毒性作用。
     圖7、實施例2中制備的功能化氧化石墨烯載多藥耐藥MDR1 siRNA后對耐藥人乳腺癌細胞的靶基因表達的影響。
     圖8、實施例2中合成的功能化氧化石墨烯負載鹽酸阿霉素及多藥耐藥MDR1 siRNA后對耐藥人乳腺癌細胞MCF?7/MDR的毒性作用。
具體實施方式
下面通過實施例對本發明進行具體描述,它們只用于對本發明進行進一步的說明,不能理解為對本發明保護范圍的限制。除特別標明外,所用試劑和測試設備均為市售。
實施例1: 
第一步:合成氧化石墨烯材料,制備過程可參考(ACSNano,2008,2,463?470);這一步的核心是獲得氧化石墨烯材料。類似地,利用其它方法獲得氧化石墨烯材料也可采用。
第二步:乳糖酰化殼聚糖的制備:
乳糖酸0.2671 g,1?ethyl?3(3?dimethy amino?propyl) carbodiimide(EDC)0.1715 g,N?hydroxy succinimide(NHS)0.1030 g溶解在5 mL蒸餾水中,超聲溶解后,電磁攪拌1小時活化。稱取1 g純化的殼聚糖,溶在3 mL蒸餾水中,超聲溶解后,與活化的乳糖酸混合在一起,加入三乙胺調pH值至8?9,電磁攪拌反應48小時。體系旋蒸脫溶,濃縮物過葡聚糖凝膠柱,收集流出的黃色溶液,將產物濃縮凍干,獲得二者偶聯產物。
第三步:氧化石墨烯與上述第二步產物連接:
稱取3 mg氧化石墨烯,分散在10 mL蒸餾水中,加氫氧化鈉調pH值至6?7,加入EDC 95.85 mg,NHS 57.5 mg,超聲溶解后,溫水浴攪拌40分鐘活化。在氧化石墨烯溶液中加入80 mg 上述第二步產物乳糖酰化殼聚糖。超聲溶解后,用三乙胺調pH值至8?9, 35 ℃油浴反應120小時。待反應完全后,對反應體系進行離心,得到的沉淀物用蒸餾水進行洗滌,反復數次(3?5次)。偶聯產物修飾氧化石墨烯的結構通過熱重分析和紅外光譜證明,見附圖2和3。
第四步:第三步產物進行季銨化反應:
將第三步產物超聲分散在50 mL蒸餾水中,加入400 mg 2,3?環氧丙基三甲基氯化銨,加氫氧化鈉調pH值至7?8, 80℃油浴回流,電磁攪拌反應24小時。待反應完全后,對反應體系進行離心,得到的沉淀物用蒸餾水進行洗滌,反復數次。產物通過激光粒度儀表征Zeta電位。
第五步:抗腫瘤藥物鹽酸阿霉素在功能化氧化石墨烯上的負載和在不同pH條件下的釋放性能:
將6 mL濃度為0.33 mg/ml的功能化氧化石墨烯與12 mL濃度0.45 mg/ml的鹽酸阿霉素溶液混合并超聲30分鐘,室溫避光攪拌12小時。然后樣品在14000轉/分鐘下離心,用紫外光譜測定上清液中鹽酸阿霉素的濃度。計算藥物在多功能單層氧化石墨上的負載量為0.477mg/mg。將該載藥體系置于透析袋中分別在pH=5和7.4的溶液中進行體外釋放實驗。檢測結果見附圖4。
第六步:用熒光素FAM標記的DNA負載在上述功能化氧化石墨烯上,進行體外靶向性檢測:
將4 μL的20 μmol/L熒光素FAM標記的DNA(5’?TGC?ATT?TTT?AAT?GGT?ATT ?TA?3’?FAM,上海生工生物工程技術服務有限公司)與25 μL的1 mg/mL上述功能化氧化石墨烯混合孵育2小時。用該負載熒光素標記的DNA的功能化氧化石墨烯與人肝癌細胞QGY?7703共同孵育30分鐘后進行熒光顯微鏡檢測。作為對照,未連接乳糖酸的功能化氧化石墨烯進行同樣操作。體外靶向檢測結果見附圖5。
第七步:不同濃度的功能化氧化石墨烯載藥前后對腫瘤細胞的毒性作用。
采用WST?1試劑進行不同濃度的功能化氧化石墨烯載藥前后對人肝癌細胞QGY?7703的毒性作用表征。取對數生長期細胞以4×103個/孔接種于96孔板,每組設3個復孔。將不同濃度的負載鹽酸愛霉素前后的氧化石墨烯分別與Hela細胞孵育48小時后,加入10 μL WST?1試劑進行孵育2小時后,用酶標儀(Promega,GloMax??Multi)進行吸光檢測。毒性檢測結果見附圖6。
測試結果如圖1~6所示。其中,圖1、實施例1中合成的功能化氧化石墨烯的原子力顯微鏡照片。(A:為功能化的氧化石墨烯;B:功能化后的氧化石墨烯)
圖2、實施例1中合成的功能化氧化石墨烯的熱重分析圖。(A:氧化石墨烯;B:乳糖酰化殼聚糖;C:乳糖酰化殼聚糖修飾的氧化石墨烯)。
圖3、實施例1中合成的功能化氧化石墨烯的紅外光譜圖。(a::氧化石墨烯;b:功能化的氧化石墨烯;c:殼聚糖;d:乳糖酰化殼聚糖)。
圖4、實施例1中合成的功能化氧化石墨烯負載抗腫瘤藥物鹽酸阿霉素后分別在pH為5.0和7.4下的藥物釋放性能。
圖5、實施例1中合成的功能化氧化石墨烯負載熒光標記的DNA后被人肝癌細胞QGY?7703吸收的共聚焦熒光顯微鏡照片(A:有乳糖酸酸連接的功能化氧化石墨烯負載熒光標記的DNA后;B:無乳糖酸連接的功能化氧化石墨烯負載熒光標記的DNA后;C:游離熒光標記的DNA)。左側為熒光顯微鏡照片,右側為光鏡下照片。
圖6、實施例1中合成的功能化氧化石墨烯負載鹽酸阿霉素前后對人肝癌細胞QGY?7703的毒性作用。(A:不同功能化氧化石墨烯負載鹽酸阿霉素前對人肝癌細胞QGY?7703的毒性作用;B:不同功能化氧化石墨烯負載鹽酸阿霉素后和游離鹽酸阿霉素對人肝癌細胞QGY?7703的毒性作用。)
實施例2:
第一步:合成氧化石墨烯材料,制備過程可參考(ACSNano,2008,2,463?470);這一步的核心是獲得氧化石墨烯材料。類似地,利用其它方法獲得氧化石墨烯材料也可采用。
第二步:葉酸與殼聚糖偶聯物的制備:
葉酸109.4 mg,1?ethyl?3(3?dimethy amino?propyl) carbodiimide(EDC)95.85 mg,N?hydroxy succinimide(NHS)57.5 mg溶解在10 mL DMSO中,超聲溶解后,電磁攪拌1小時活化。稱取500 mg純化的殼聚糖,超聲溶解后,加入三乙胺200 μL,30~40 ℃電磁攪拌反應72小時。體系旋蒸脫溶,加入80 mL丙酮沉淀,沉淀物用丙酮洗兩次。沉淀溶于水中,離心5分鐘(1000 轉/分鐘),將上清液凍干,獲得二者偶聯產物。
第三步:氧化石墨烯與上述第二步產物連接:
稱取5 mg氧化石墨烯,分散在10 mL蒸餾水中,加入EDC 95.85 mg,NHS 57.5 mg,超聲溶解后,溫水浴攪拌1小時活化。在氧化石墨烯溶液中加入120 mg 上述第二步產物葉酸與殼聚糖偶聯物。超聲溶解后,用三乙胺調pH值至8?9, 35 ℃油浴反應4天。待反應完全后,對反應體系進行離心,得到的沉淀物用蒸餾水進行洗滌,反復數次。偶聯產物修飾氧化石墨烯的結構通過熱重分析和紅外光譜證明。
第四步:第三步產物進行季銨化反應:
將第三步產物超聲分散在20 mL蒸餾水中,加入1 g 2,3?環氧丙基三甲基氯化銨, 80 ℃油浴反應,電磁攪拌反應24小時。待反應完全后,對反應體系進行離心,得到的沉淀物用蒸餾水進行洗滌,反復數次。產物通過激光粒度儀表征Zeta電位為+34.98 eV。
第五步:抗腫瘤藥物鹽酸阿霉素在功能化氧化石墨烯上的負載和在不同pH條件下的釋放性能:
將12 mL濃度為0.5 mg/ml的功能化氧化石墨烯與12 mL濃度0.84 mg/ml的鹽酸阿霉素溶液混合并超聲1 小時,室溫避光攪拌12小時。然后樣品在14000轉/分鐘下離心,用紫外光譜測定上清液中鹽酸阿霉素的濃度。計算藥物在多功能單層氧化石墨上的負載量為0.79 mg/mg。將該載藥體系置于透析袋中分別在pH=5和7.4的溶液中進行體外釋放實驗。
第六步:用熒光素FAM標記的DNA負載在上述功能化氧化石墨烯上,進行體外靶向性檢測:
將10 μL的20 μmol/L熒光素FAM標記的DNA(5’?TGC?ATT?TTT?AAT?GGT?ATT ?TA?3’?FAM,上海生工生物工程技術服務有限公司)與25 μL的0.5 mg/mL上述功能化氧化石墨烯混合孵育1小時。用該負載熒光素標記的DNA的功能化氧化石墨烯與人耐藥乳腺癌細胞MCF?7/MDR共同孵育30分鐘后進行熒光顯微鏡檢測。作為對照,未連接葉酸的功能化氧化石墨烯進行同樣操作。
第七步:功能化氧化石墨烯負載多藥耐藥小干擾RNA(MDR1 siRNA)后對人耐藥乳腺癌細胞的靶基因表達的影響。
將濃度為0.5 mg/ml的功能化氧化石墨烯200 μL與50 nmol MDR1 siRNA(Santa Cruz 生物技術有限公司)在RPMI 1640基本培養基中室溫混合2 h,與人耐藥乳腺癌細胞共同孵育轉染6小時后換RPMI 1640完全培養基。24 小時后消化離心,收集并提取細胞總RNA,通過RT?PCT實驗檢測多藥耐藥MDR1 mRNA的表達。48小時后消化離心,收集并提取細胞總蛋白,通過Western Blot實驗檢測P-gp糖蛋白的表達。作為對照,未連接葉酸的功能化氧化石墨烯和轉染劑Liposome進行同樣操作。(功能化氧化石墨烯負載多藥耐藥MDR1 siRNA后對人耐藥乳腺癌細胞的靶基因表達的影響檢測結果見附圖7)
第八步:不同濃度的功能化氧化石墨烯載藥及對抗腫瘤藥物和MDR1 siRNA共載后對腫瘤細胞的毒性作用。
采用WST?1試劑進行不同濃度的功能化氧化石墨烯載藥及對抗腫瘤藥物和MDR1 siRNA共載后對人耐藥乳腺癌細胞MCF?7/MDR的毒性作用表征。取對數生長期細胞以4×103個/孔接種于96孔板,每組設3個復孔。將不同濃度的負載鹽酸愛霉素前后的氧化石墨烯分別與MCF?7/MDR細胞孵育48小時后,加入10 μL WST?1試劑進行孵育2小時后,用酶標儀(Promega,GloMax??Multi)進行吸光檢測。(毒性檢測結果見附圖8)
其中,圖7、實施例2中制備的功能化氧化石墨烯載多藥耐藥MDR1 siRNA后對耐藥人乳腺癌細胞的靶基因表達的影響。(a:有葉酸連接的功能化氧化石墨烯轉染的細胞,終濃度為0.006 mg/ml;b:有葉酸連接的功能化氧化石墨烯轉染的細胞,終濃度為0.018 mg/ml;c:有葉酸連接的功能化氧化石墨烯轉染的細胞,終濃度為0.036 mg/ml;d:有葉酸連接的功能化氧化石墨烯轉染的細胞,終濃度為0.06 mg/ml;e:liposome轉染的細胞;f:功能化氧化石墨烯負載對照siRNA處理的細胞;g:游離MDR1 siRNA;h:未處理的對照細胞。siRNA的終濃度均為100 nM。)上:轉染24小時后耐藥人乳腺癌細胞的MDR1 mRNA的表達。下:轉染48小時后耐藥人乳腺癌細胞P-gp糖蛋白的表達。
圖8、實施例2中合成的功能化氧化石墨烯負載鹽酸阿霉素及多藥耐藥MDR1 siRNA后不同濃度下對耐藥人乳腺癌細胞MCF?7/MDR的毒性作用。(Dox:游離的鹽酸阿霉素;GO?FACO+?Dox:有葉酸連接的功能化氧化石墨烯負載鹽酸阿霉素后對耐藥人乳腺癌細胞MCF?7/MDR的毒性作用;GO?FACO+?Dox?siRNA:有葉酸連接的功能化氧化石墨烯負載鹽酸阿霉素和MDR1 siRNA后對耐藥人乳腺癌細胞MCF?7/MDR的毒性作用。)
結果表明,功能化的氧化石墨烯負載MDR1 siRNA后降低了耐藥人乳腺癌細胞MCF?7/MDR相應的MDR1 mRNA和P-gp糖蛋白的表達水平。功能化的氧化石墨烯負載鹽酸阿霉素及其共載鹽酸阿霉素和多藥耐藥MDR1 siRNA后都比單純使用鹽酸阿霉素對耐藥人乳腺癌細胞MCF?7/MDR具有更高的毒性作用,說明鹽酸阿霉素的pH敏感釋放也對逆轉腫瘤多藥耐藥具有一定作用。而在較低濃度下,共載鹽酸阿霉素和多藥耐藥MDR1 siRNA的功能化氧化石墨烯比單純負載鹽酸阿霉素的功能化氧化石墨烯具有更好的殺死腫瘤細胞的作用,其IC50值比單純載藥的要低;在較高濃度下,二者均能殺死90%以上的腫瘤細胞,因而共載抗腫瘤藥物和MDR1 siRNA在一定程度上起到了逆轉腫瘤多藥耐藥的作用,能夠更好的殺死耐藥腫瘤細胞。
實施例3: 
第一步:合成氧化石墨烯材料,制備過程可參考(ACSNano,2008,2,463?470);這一步的核心是獲得氧化石墨烯材料。類似地,利用其它方法獲得氧化石墨烯材料也可采用。
第二步:葉酸與殼聚糖偶聯物的制備:
葉酸109.4 mg,1?ethyl?3(3?dimethy amino?propyl) carbodiimide(EDC)95.85 mg,N?hydroxy succinimide(NHS)57.5 mg溶解在10 mL DMSO中,超聲溶解后,電磁攪拌1小時活化。稱取400 mg純化的殼聚糖,超聲溶解后,加入三乙胺200 μL,30~40 ℃電磁攪拌反應72小時。體系旋蒸脫溶,加入80 mL丙酮沉淀,沉淀物用丙酮洗兩次。沉淀溶于水中,離心5分鐘(1000 轉/分鐘),將上清液凍干,獲得二者偶聯產物。
第三步:氧化石墨烯與上述第二步產物連接:
稱取6 mg氧化石墨烯,分散在10 mL蒸餾水中,加入EDC 95.85 mg,NHS 57.5 mg,超聲溶解后,溫水浴攪拌1小時活化。在氧化石墨烯溶液中加入240 mg 上述第二步產物葉酸與殼聚糖偶聯物。超聲溶解后,用三乙胺調pH值至8?9, 35 ℃油浴反應4天。待反應完全后,對反應體系進行離心,得到的沉淀物用蒸餾水進行洗滌,反復數次。偶聯產物修飾氧化石墨烯的結構通過熱重分析和紅外光譜證明。
第四步:第三步產物進行季銨化反應:
將第三步產物超聲分散在20 mL蒸餾水中,加入1 g 2,3?環氧丙基三甲基氯化銨, 80 ℃油浴反應,電磁攪拌反應24小時。待反應完全后,對反應體系進行離心,得到的沉淀物用蒸餾水進行洗滌,反復數次。產物通過激光粒度儀表征Zeta電位為+31.25 eV。
第五步:抗腫瘤藥物鹽酸阿霉素在功能化氧化石墨烯上的負載和在不同pH條件下的釋放性能:
將12 mL濃度為0.5 mg/ml的功能化氧化石墨烯與12 mL濃度0.84 mg/ml的鹽酸阿霉素溶液混合并超聲1 小時,室溫避光攪拌12小時。然后樣品在14000轉/分鐘下離心,用紫外光譜測定上清液中鹽酸阿霉素的濃度。計算藥物在多功能單層氧化石墨上的負載量為0.79 mg/mg。將該載藥體系置于透析袋中分別在pH=5和7.4的溶液中進行體外釋放實驗。
第六步:用熒光素Cy3標記的RNA寡核苷酸(廣州市銳博生物科技有限公司)負載在上述功能化氧化石墨烯上,進行體外靶向性檢測:
將3 μL的20 μmol/LCy3標記的DNA與500 μL的0.06 mg/mL上述功能化氧化石墨烯混合孵育1小時,用該負載Cy3標記的DNA功能化氧化石墨烯與人宮頸癌細胞共同孵育0.5小時后進行共聚焦熒光顯微鏡檢測,作為對照未連接葉酸的功能化氧化石墨烯進行同樣操作。同時用連接葉酸的功能化氧化石墨烯分別對葉酸受體表達較高的Hela細胞和葉酸受體表達較低的A549細胞進行對照。
第七步:功能化氧化石墨烯負載Bcl?2靶向的siRNA(Bcl?2 targeted siRNA)后對人宮頸癌細胞的靶基因表達的影響。
將濃度為0.5 mg/ml的功能化氧化石墨烯200 μL與50 nmol Bcl?2 targeted siRNA(Santa Cruz 生物技術有限公司)在RPMI 1640 培養基中室溫混合2 h,與人宮頸癌細胞共同孵育轉染6小時后換RPMI 1640完全培養基。48小時后消化離心,收集并提取細胞總蛋白,通過Western Blot實驗檢測Bcl?2蛋白的表達。作為對照,未連接葉酸的功能化氧化石墨烯和轉染劑Liposome進行同樣操作。
第八步:不同濃度的功能化氧化石墨烯載藥前后對腫瘤細胞的毒性作用。
采用WST?1試劑進行不同濃度的功能化氧化石墨烯載藥前后對人宮頸癌細胞Hela的毒性作用表征。取對數生長期細胞以4×103個/孔接種于96孔板,每組設3個復孔。將不同濃度的負載鹽酸愛霉素前后的氧化石墨烯分別與Hela細胞孵育48小時后,加入10 μL WST?1試劑進行孵育2小時后,用酶標儀(Promega,GloMax??Multi)進行吸光檢測。
實施例4:
第一步:合成氧化石墨烯材料,制備過程可參考(ACSNano,2008,2,463?470);這一步的核心是獲得氧化石墨烯材料。類似地,利用其它方法獲得氧化石墨烯材料也可采用。
第二步:甘草次酸與殼聚糖偶聯物的制備:
甘草次酸0.14g,1?ethyl?3(3?dimethy amino?propyl) carbodiimide(DCC)0.12 g,1 g純化的殼聚糖,溶解在10 mL乙醇中超聲溶解后,電磁攪拌反應48小時。體系旋蒸脫溶,濃縮物過葡聚糖凝膠柱,產物濃縮凍干,獲得二者偶聯產物。
第三步:氧化石墨烯與上述第二步產物連接:
稱取5 mg氧化石墨烯,分散在10 mL蒸餾水中,加氫氧化鈉調pH值至6?7,加入EDC 95.85 mg,NHS 57.5 mg,超聲溶解后,溫水浴攪拌40分鐘活化。在氧化石墨烯溶液中加入60 mg 上述第二步產物。超聲溶解后,用三乙胺調pH值至8?9, 35 ℃油浴反應120小時。待反應完全后,對反應體系進行離心,得到的沉淀物用蒸餾水進行洗滌,反復數次。偶聯產物修飾氧化石墨烯的結構通過熱重分析和紅外光譜證明。
第四步:第三步產物進行季銨化反應:
將第三步產物超聲分散在50 mL蒸餾水中,加入400 mg 2,3?環氧丙基三甲基氯化銨,加氫氧化鈉調pH值至7?8, 80℃油浴回流,電磁攪拌反應24小時。待反應完全后,對反應體系進行離心,得到的沉淀物用蒸餾水進行洗滌,反復數次。產物通過激光粒度儀表征Zeta電位。
第五步:抗腫瘤藥物鹽酸阿霉素在功能化氧化石墨烯上的負載和在不同pH條件下的釋放性能:
將6 mL濃度為0.33 mg/ml的功能化氧化石墨烯與12 mL濃度0.45 mg/ml的鹽酸阿霉素溶液混合并超聲30分鐘,室溫避光攪拌12小時。然后樣品在14000轉/分鐘下離心,用紫外光譜測定上清液中鹽酸阿霉素的濃度。計算藥物在多功能單層氧化石墨上的負載量為0.477mg/mg。將該載藥體系置于透析袋中分別在pH=5和7.4的溶液中進行體外釋放實驗。
第六步:用綠色熒光蛋白基因(EGFP)負載在上述功能化氧化石墨烯上,進行體外靶向性檢測:
將1 μL的0.5 μg/mL EGFP基因與5 μL的0.1 mg/mL上述功能化氧化石墨烯混合孵育2小時。用該負載EGFP的功能化氧化石墨烯與人肝癌細胞HepG2和人宮頸癌Hela細胞分別孵育48小時后進行熒光顯微鏡檢測,觀察轉染效率。
第七步:不同濃度的功能化氧化石墨烯載藥前后對腫瘤細胞的毒性作用。
采用WST?1試劑進行不同濃度的功能化氧化石墨烯載藥前后對人肝癌細胞HepG2的毒性作用表征。取對數生長期細胞以4×103個/孔接種于96孔板,每組設3個復孔。將不同濃度的負載鹽酸愛霉素前后的氧化石墨烯分別與HepG2細胞孵育48小時后,加入10 μL WST?1試劑進行孵育2小時后,用酶標儀(Promega,GloMax??Multi)進行吸光檢測。毒性檢測結果見附圖6。

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靶向 腫瘤 藥物 基因 載體 材料 制備 應用
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