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用羥胺切割法制備天蠶素AD和蛙BUFORINII融合抗菌肽及其用途.pdf

摘要
申請專利號:

CN201110364583.2

申請日:

2011.11.04

公開號:

CN102532325B

公開日:

2015.01.07

當前法律狀態:

授權

有效性:

有權

法律詳情: 授權|||實質審查的生效號牌文件類型代碼:1604號牌文件序號:101322547971IPC(主分類):C07K 19/00專利申請號:2011103645832申請日:20111104|||公開
IPC分類號: C07K19/00; C12N15/62; C12N15/70; C12N1/21; C07K14/435; C07K14/46; C07K1/12; A61K38/17; A61P31/04; A23K1/16; C12R1/19(2006.01)N 主分類號: C07K19/00
申請人: 山東省科學院中日友好生物技術研究中心
發明人: 扈進冬; 鄭凱; 楊合同; 李紀順; 魏艷麗; 周紅姿; 李紅梅
地址: 250014 山東省濟南市歷下區科院路19號
優先權: 2011.02.25 CN 201110045039.1
專利代理機構: 濟南舜源專利事務所有限公司 37205 代理人: 辛向東
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法律狀態
申請(專利)號:

CN201110364583.2

授權公告號:

102532325B||||||

法律狀態公告日:

2015.01.07|||2012.09.05|||2012.07.04

法律狀態類型:

授權|||實質審查的生效|||公開

摘要

本發明公開了一種將兩個不同殺菌機制的抗菌肽(CAD和Buforin?II)融合表達以及使用羥胺切割形成兩種抗菌肽復合制劑的工藝方法。利用羥胺可以專一性地切割蛋白中Asn-Gly肽鍵,我們在融合蛋白和附加序列(His標簽)的連接部引入Asn-Gly位點,并用大腸桿菌表達系統高效表達上述融合蛋白,經親和層析純化后,獲得重組的CAD-Buforin?II,再使用羥胺進行切割,繼續經分離純化后獲得純化的CAD和Buforin?II復合抗菌肽。本發明的融合蛋白可以作為動物飼料添加劑部分替代現有的抗生素添加劑。

權利要求書

1.一種含天蠶素AD和蛙Buforin?II的融合蛋白,其特征在于天蠶素AD和蛙Buforin?II
的之間引入羥胺切割位點,并直接相連。
2.如權利要求1所述含天蠶素AD和蛙BuforinII的融合蛋白,其特征在于:在天蠶素
AD和蛙Buforin?II之間以及天蠶素AD和蛙Buforin?II的融合蛋白N端序列之前各引入一
個羥胺位點Asn-Gly,從而使大腸桿菌表達融合蛋白可以使用羥胺來切割釋放天蠶素AD和蛙
Buforin?II。
3.如權利要求1所述含天蠶素AD和蛙Buforin?II的融合蛋白的制備方法,其特征在于
設計人工合成四對引物,通過3輪PCR,合成天蠶素AD和蛙Buforin?II的融合基因-
CAD-Buforin?II基因。
4.如權利要求3所述含天蠶素AD和蛙Buforin?II的融合蛋白的制備方法,其特征在于
所說的四對引物的序列如序列2-8所示。
5.如權利要求1所述含天蠶素AD和蛙Buforin?II的融合蛋白的表達質粒,其特征在于
由質粒pET-Trx與人工合成的CAD-Buforin?II基因片段,用BamH?I和EcoR?I雙酶切,連接
而成的質粒pET-Trx-CAD-Buforin?II,其N端有3個His形成立體His-patch,序列中有2個
羥胺切割位點,有利于表達純化。
6.如權利要求1所述含天蠶素AD和蛙Buforin?II的融合蛋白的表達工程菌株,其特征
是由表達質粒pET-Trx-CAD-Buforin?II轉化E.coli?BL21細胞獲得的最高表達量的菌株,該菌
株為已在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏;名稱為大腸埃希氏菌
(Escherichia?coli)Trx-PC6/BL21,保藏號為CGMCC?No.4588。
7.應用權利要求1所述含天蠶素AD和蛙Buforin?II的融合蛋白,制備天蠶素AD和蛙
Buforin?II復合抗菌肽的方法,其特征在于包括融合抗菌肽CAD-Buforin?II的大規模表達、
提取、分離純化、羥胺切割裂解各步驟,制得含有天蠶素AD和蛙Buforin?II的復合抗菌肽。
8.如權利要求7所說的準備復合抗菌肽的方法,其特征在于所說的羥胺切割條件為:加
入鹽酸羥胺濃度至1-4M,調pH值至7.0-9.5,在35-50℃下,切割1-12個小時。
9.如權利要求7所準備的天蠶素AD和蛙Buforin?II復合抗菌肽的用途,其特征在于用
于藥物和飼料添加劑。

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用羥胺 切割 法制 天蠶 AD BUFORINII 融合 抗菌 及其 用途
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