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細胞保護劑.pdf

摘要
申請專利號:

CN201180033686.9

申請日:

2011.08.12

公開號:

CN103118687B

公開日:

2015.01.07

當前法律狀態:

授權

有效性:

有權

法律詳情: 授權|||實質審查的生效IPC(主分類):A61K 35/74申請日:20110812|||公開
IPC分類號: A61K35/74; A61K8/99; A61P17/18; A61P39/06; A61P43/00; A61Q19/00 主分類號: A61K35/74
申請人: 株式會社益力多本社
發明人: 伊藤直樹; 倉澤智子; 曾根俊郎; 千葉勝由
地址: 日本東京都
優先權: 2010.08.27 JP 2010-190851
專利代理機構: 北京三友知識產權代理有限公司 11127 代理人: 丁香蘭;龐東成
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法律狀態
申請(專利)號:

CN201180033686.9

授權公告號:

103118687B||||||

法律狀態公告日:

2015.01.07|||2013.09.11|||2013.05.22

法律狀態類型:

授權|||實質審查的生效|||公開

摘要

本發明的目的在于從乳酸菌的培養上清中發現新穎且有用的成分,并提供該成分的有效利用方法。該利用方法為一種細胞保護劑,所述細胞保護劑以屬于嗜熱鏈球菌的乳酸菌的培養上清中的低分子級分作為有效成分。

權利要求書

權利要求書一種細胞保護劑,其以屬于嗜熱鏈球菌的乳酸菌的培養上清中的低分子級分作為有效成分。
如權利要求1所述的細胞保護劑,其中,低分子級分是通過對乳酸菌培養上清進行超濾或凝膠過濾而得到的。
如權利要求1或2所述的細胞保護劑,其中,低分子級分的分子量為20,000Da以下。
如權利要求1至3的任意一項所述的細胞保護劑,其中,屬于嗜熱鏈球菌的乳酸菌是保藏號為FERM BP?7538的嗜熱鏈球菌YIT2001株、或保藏號為FERMBP?10879的嗜熱鏈球菌YIT2084株。
如權利要求1至4的任意一項所述的細胞保護劑,其中,該細胞保護劑抑制細胞暴露于損傷物質時的細胞數降低。
如權利要求5所述的細胞保護劑,其中,損傷物質為活性氧。
如權利要求5所述的細胞保護劑,其中,損傷物質為羥基自由基。
一種皮膚外用劑,其含有權利要求1至7的任意一項所述的細胞保護劑。
如權利要求8所述的皮膚外用劑,其中,該皮膚外用劑為化妝品。
一種皮膚細胞的保護方法,其特征在于,將屬于嗜熱鏈球菌的乳酸菌的培養上清中的低分子級分應用在想要保護的皮膚上。
如權利要求10所述的皮膚細胞的保護方法,其特征在于,該方法抑制暴露于損傷物質時的細胞數降低。
屬于嗜熱鏈球菌的乳酸菌的培養上清中的低分子級分在用于制造細胞保護劑中的應用。

說明書

說明書細胞保護劑
技術領域
本發明涉及細胞保護劑,更具體地說,本發明涉及以屬于嗜熱鏈球菌的乳酸菌的培養上清中的低分子級分作為有效成分的細胞保護劑。
背景技術
已有報告指出,在乳酸菌的培養上清中、即將乳酸菌接種在主要以乳為主成分的培養基中而得到的培養物中,含有具有作為皮膚外用劑的效果的成分。例如據報告乳酸菌的培養上清具有抗氧化作用及光防護作用(專利文獻1、非專利文獻1和2)。另外還已知其有皺紋形成抑制作用(專利文獻2),進一步地,還已知在乳酸菌提取物中存在具有細胞增殖作用的成分(專利文獻3)。
但是,乳酸菌的種類很多,因此可預測其培養上清中所含有的有效成分也呈多樣化,并且,將其作為化妝料或外用劑的有效成分進行利用時,由于根據目的選擇活性特別高的部分來進行利用是有利的,因而需要對于乳酸菌的培養上清及乳酸菌提取物進一步進行研究,檢測出具有更為優異效果的成分。
現有技術文獻
專利文獻
專利文獻1:日本特開昭58?198584
專利文獻2:WO2008/026318
專利文獻3:日本專利第3172599
非專利文獻
非專利文獻1:日本香妝品科學會第7次學術學會講演要旨,59,1982
非專利文獻2:日本香妝品科學會第8次學術學會講演要旨,210,1983
發明內容
發明所要解決的課題
因而,本發明的課題在于從乳酸菌的培養上清中發現新穎且有用的成分,并提供該成分的有效利用方法。
解決課題的手段
本發明人對于各種乳酸菌的培養上清中所含有的有效成分進行了研究,結果發現,在屬于嗜熱鏈球菌的乳酸菌的培養上清的低分子級分中存在具有優異的細胞保護效果的物質,從而完成了本發明。
即,本發明提供一種細胞保護劑,其中,該細胞保護劑以屬于嗜熱鏈球菌的乳酸菌的培養上清中的低分子級分作為有效成分。
本發明還提供皮膚外用劑,其含有上述細胞保護劑。
本發明進一步提供皮膚細胞的保護方法,其特征在于,將屬于嗜熱鏈球菌的乳酸菌的培養上清中的低分子級分應用在想要保護的皮膚上。
發明的效果
利用本發明的細胞保護劑,即使在皮膚等的細胞暴露于羥基自由基等的情況下,也能夠由其對細胞進行保護,也不會引起細胞數減少以及隨之出現的細胞過度增殖,能夠防止皮膚肥厚、皮膚炎癥、皮膚干燥、干燥所致的皺紋形成、彈性降低、以及色素斑的產生及惡化。
附圖說明
圖1為示出實施例1中得到的透析液的HPLC結果的附圖。圖中,a表示分子量為10,000Da的位置、b表示分子量為342Da的位置、c表示分子量為180Da的位置。
圖2為示出實施例2中得到的透析液的HPLC結果的附圖。圖中a、b和c與上述相同。
具體實施方式
乳酸菌培養上清的低分子級分是本發明的細胞保護劑的有效成分,其是如下得到的:在培養基中對屬于嗜熱鏈球菌的乳酸菌進行培養,由所得到的培養物中除去固體物質,從而制造出乳酸菌培養上清,進一步對該乳酸菌培養上清進行超濾等,采集分子量為20,000Da以下的級分,由此得到所述低分子級分。
作為此處所使用的屬于嗜熱鏈球菌的乳酸菌,可以舉出嗜熱鏈球菌(Streptococcusthermophilus)YIT2001株(FERM BP?7538,保藏日:2001年1月31日)、嗜熱鏈球菌(Streptococcus thermophilus)YIT2084株(FERM BP?10879,保藏日:2006年8月18日)等,它們可以單獨使用或以2種以上進行使用。需要說明的是,這些屬于嗜熱鏈球菌的乳酸菌株被保藏在獨立行政法人產業技術綜合研究所專利生物保藏中心(日本國茨城縣筑波市東1丁目1番地1中央第6(郵政編碼305?8566))。
作為對該屬于嗜熱鏈球菌的乳酸菌進行培養的培養基,可以舉出下述物質作為適當的培養基:人乳、牛乳、山羊乳等動物乳;脫脂乳;來自奶粉或脫脂奶粉的還原乳;奶油等乳制品,并且也可以使用豆乳等大豆加工品,但優選以乳為主成分的培養基。另外,這些物質可直接作為培養基使用,也可根據需要稀釋成適當濃度進行使用。
進一步地,也可在這些培養基中另外配合在乳酸菌培養中出于補充營養源的目的而通常使用的成分。作為這樣的成分,可以舉出:酵母浸膏;綠藻萃取物;維生素A、維生素B族、維生素C、維生素E等維生素類;包含各種肽類的蛋白分解物;氨基酸類;鈣、鎂等鹽類。
使用上述培養基的屬于嗜熱鏈球菌的乳酸菌的培養可按常規方法進行,作為該培養的一例,可以舉出培養溫度為30℃~45℃、更優選為37℃~42℃,培養時間為1小時~48小時、更優選為4小時~24小時。另外,作為此時的其它培養條件,可以舉出靜置、攪拌、振蕩、通氣等,可由這些條件中適當選擇適于培養的方法。
用于本發明的乳酸菌的培養上清是通過按照過濾、離心分離等常規方法由如上得到的乳酸菌培養物中除去固體物質而得到的。另外,乳酸菌的培養上清的低分子級分可以通過利用超濾或凝膠過濾等常規方法從乳酸菌的培養上清中除去分子量大于20,000Da的成分來得到。
對于如此得到的本發明的細胞保護劑,通過在細胞暴露于過氧化氫等損傷物質之前或曝露過程中將該保護劑加入到細胞中,可以抑制暴露于損傷物質中所致的細胞數降低,但若在暴露于損傷物質之前添加,則可有效預防細胞數降低,因而優選在暴露于損傷物質之前將該保護劑加入到細胞中。
另外,上述細胞保護效果的詳細機理尚不明確,但由于在暴露于損傷物質時即使在本發明的細胞保護劑并未與細胞共存的情況下也可發揮出其效果,因而認為,利用本發明的細胞保護劑對細胞本身賦予針對損傷的耐性這一點也是機理之一。
對上述損傷物質并無特別限制,可以舉出羥基自由基、過氧化氫、單線態氧、過氧化物等活性氧。另外,下述各種會誘發細胞數降低的損傷要因也包含在損傷物質中:紫外線、放射線或誘變性物質等中的曝露;緊張壓力、吸煙等。
另外,對于作為本發明細胞保護劑的對象的細胞,只要為可能會暴露于損傷物質中的生物體細胞就沒有特別限制,可以舉出例如表皮細胞、樹狀細胞、成纖維細胞、肥大細胞、原生質細胞、朗格漢斯細胞、血管內皮細胞等。其中可適用于皮膚細胞、特別是成纖維細胞。
另外,作為本發明中所用的屬于嗜熱鏈球菌的乳酸菌的示例,如上所述為嗜熱鏈球菌YIT2001株和嗜熱鏈球菌YIT2084株,它們與前述專利文獻2中為了得到具有皺紋形成抑制作用的培養上清而使用的菌株是相同的。但是,專利文獻2中所用的培養上清是通過在乳酸菌培養后加入三氯乙酸(TCA)進行沉淀、進一步加入乙醇而得到的。
然后,通過進行TCA沉淀使蛋白質除去,進一步通過乙醇提取主要得到多糖類、且使低分子成分除去,因而專利文獻2的培養上清是不含有蛋白質且平均分子量為90萬左右的多糖類。
與此相對,本申請發明的屬于嗜熱鏈球菌的乳酸菌的培養上清的低分子級分(下文稱為“培養上清低分子級分”)中,如后所述,由于并未進行TCA沉淀,因而其中存在有蛋白質,并且由于采集分子量為20,000Da以下的級分,因而可知其為低分子級分,在構成成分及其分子量方面與專利文獻2是不同的。
本發明的細胞保護劑以上述培養上清低分子級分作為有效成分,作為所使用的培養上清低分子級分,可以從乳酸菌的培養上清中除去分子量超過20,000Da的部分,對其進行直接使用、或將其制成濃縮或稀釋的液態物進行使用,或者通過噴霧干燥或冷凍干燥等手段對其進行干燥,以粉末狀物的形式進行使用。
此外,對于本發明的細胞保護劑來說,可以將其配合在化妝品、藥品、準藥品(quasidrug)等皮膚外用劑組合物中。該皮膚外用劑組合物的制造可以按照常規方法進行,例如,可將本發明的細胞保護劑按照可發揮出所期望的作用效果的程度適量溶解或者分散在純凈水、化妝水基劑、乳霜基劑、乳液基劑等中。
作為更具體的皮膚外用劑組合物的示例,可以舉出:化妝水、乳液、各種乳霜、面膜、美容液等基礎化妝料;香波、潤發素、護發素、養發素、整發液、護發霜、護發乳等頭發用制品;沐浴露等浴用化妝品;粉底、口紅、睫毛膏、眼影等化妝用化妝品;防曬霜等。
對作為細胞保護劑的培養上清低分子級分在這些皮膚外用劑組合物中的混合量并無特別限定,可以根據所使用的細胞保護劑的劑型或用途來確定,在直接使用培養上清低分子級分的情況下,優選為0.01質量%~100質量%、特別優選為0.1質量%~90質量%左右、進一步優選為1質量%~20質量%。另外,在對培養上清低分子級分進行干燥來使用的情況下,其混合量為0.001質量%~10質量%、特別優選為0.01質量%~9質量%、進一步優選為0.1質量%~2質量%。
另外,在上述皮膚外用劑組合物中,除了作為必要成分的本發明的細胞保護劑之外,還可配合通常配合在皮膚外用劑中的任意成分。作為這樣的任意成分,可以舉出:表面活性劑、油分、醇類、保濕劑、增稠劑、防腐劑、抗氧化劑、螯合劑、pH調節劑、香料、色素、紫外線吸收·散射劑、粉體、維生素類、氨基酸類、水溶性高分子、發泡劑、顏料、植物提取物、動物來源成分、海藻提取物、各種藥劑、添加劑、水等。
此外,由于本發明的細胞保護劑以具有食用歷史的乳酸菌的培養上清低分子級分作為有效成分,因而還可進一步配合在各種飲食品中。例如,可以在上述培養上清低分子級分中添加適當的助劑,之后采用慣用的手段成形為適于食用的形態,例如成形為顆粒狀、粒狀、片劑、膠囊、糊劑等以供食用,并且可添加在各種食品中進行使用,所述食品例如為:火腿、香腸等食肉加工食品;魚糕、圓筒狀魚糕等水產加工食品;面包、糖果點心;等等,或者可添加在水、果汁、牛奶、冷飲等飲料中進行使用。
實施例
接下來舉出實施例更詳細地說明本發明,但本發明并不受這些實施例的任何限制。
實施例1
將保存在?80℃的嗜熱鏈球菌YIT2084菌株以1接種環的量接種在2mL試驗管中的MRS培養基(Difco)中,在40℃靜置培養一夜。接著將該培養物接種在2mL的10%脫脂奶粉水溶液(10%脫脂乳(Difco))中,使其濃度為1%,之后在40℃靜置培養一夜,作為第一次前培養。
進一步同樣地進行第二次前培養,將該第二次前培養物按1%接種在主培養培養基(3%脫脂奶粉水溶液)100mL中,在40℃進行24小時靜置培養。
在4℃、8,000×g的條件下對培養后的菌液進行15分鐘離心分離,除去沉淀物。使用Centricut Mini V?20(截留分子量20,000Da;倉敷紡織),在4℃、3000×g的條件下對所得到的沉淀物去除液進行1小時超濾,得到10mL透過液1。
對于所得到的透過液1進行冷凍干燥,將其溶解在50mM NaCl中后,在下述條件下進行HPLC。其結果見圖1。由HPLC結果可知,上述透過液1的平均分子量為300Da。
[HPLC條件]
裝置:Waters?600E
檢測器:ISI RI?980
柱:Shodex SUGAR KS?804
柱溫度:80℃
移動相:50mMNaCl
流速:1mL/分鐘
注入量:10μL
實施例2
除了將嗜熱鏈球菌YIT2084替換為嗜熱鏈球菌YIT2001以外,與實施例1同樣地得到10mL的透過液2。
對于該透過液2,也與實施例1同樣地進行HPLC,得到圖2的結果。可知該透過液2的平均分子量為300Da。
實施例3
利用過氧化氫進行的細胞的曝露試驗:
將小鼠皮膚來源成纖維細胞3T3以每孔1.3×104個播種在96孔培養板中,在含有10%FBS的D?MEM培養基中、在5%CO2氣氛下、在37℃進行24小時培養。
培養后,除去培養基,利用PBS進行2次清洗,之后交換為D?MEM培養基(100μL)。將透過液1和透過液2、以及使用PBS分別對其進行2倍稀釋后所得的液體各10μL添加到培養板的孔中,在5%CO2氣氛下、在37℃進行24小時培養。對于上述透過液,直接使用從乳酸菌的培養上清中除去分子量超過20,000Da的部分所得到的液體。
再次除去培養基,利用PBS進行2次清洗,之后添加H2O2和FeSO4使其最終濃度分別為400μM和5μM,在5%CO2氣氛下、在37℃進行6小時培養。另外,對于非曝露組,在僅添加PBS后在相同條件下進行培養。
最后,使用結晶紫對細胞進行染色,以590nm的吸光度作為活細胞數的指標。另外,作為對照,不使用透過液,僅利用PBS。其結果列于表1。
【表1】

如上所述,在透過液1和2中,590nm的吸光度濃度依賴性地增高,可知具有細胞保護作用。另外,若對表1中的過氧化氫曝露情況下相對于過氧化氫未曝露(無過氧化氫)情況下的細胞生存比例進行比較,則在透過液1中為1.04倍,即使在暴露于過氧化氫的情況下,細胞數也未減少。
實施例4
過氧化氫去除作用:
在50μM的H2O2液中分別加入透過液1和透過液2、以及利用PBS分別對它們進行2、4和8倍稀釋而成的稀釋液,測定在37℃進行30分鐘培養后的H2O2濃度。其結果列于表2。
【表2】

根據該結果,透過液1和透過液2對過氧化氫的作用大致相同。
該結果提示,上述實施例3中所觀察到的透過液1的效果并非基于過氧化氫的消除等,而是基于其它機理。
實施例5
化妝水的制備:
按下述組成制備化妝水。另外,在制備方法中,將(7)與(6)混合,向其中加入(1)~(5),進行充分攪拌,得到化妝水。透過液1直接使用培養上清低分子級分。
【表3】
 原料使用量(質量%)(1)乙醇5.0(2)1,3?丁二醇2.0(3)聚氧乙烯氫化蓖麻油0.05(4)對羥基苯甲酸甲酯0.1(5)香料0.1(6)透過液13.0(7)蒸餾水使整體成為100的量
實施例6
乳液的制備:
按下述組成制備乳液。另外,在制備方法中,在(11)中加入(7)、(8)和(10)進行加熱,在80℃加入(1)~(6)進行乳化,其后加入(9)進行攪拌,冷卻至室溫,得到乳液。透過液1直接使用培養上清低分子級分。
【表4】
 原料使用量(質量%)(1)硬脂酸2.0(2)液體石蠟5.0(3)角鯊烷2.0(4)脫水山梨醇單硬脂酸酯0.05(5)聚氧乙烯(20)脫水山梨醇單硬脂酸酯2.0(6)對羥基苯甲酸丁酯0.05(7)甘油2.0(8)對羥基苯甲酸甲酯0.1(9)香料0.15(10)透過液15.0(11)蒸餾水使整體成為100的量
實施例7
乳霜的制備:
按下述組成制備乳霜。另外,在制備方法中,向(14)中加入(9)、(10)、(12)和(13)進行加熱,在80℃加入(1)~(8)進行乳化,其后加入(11)進行攪拌,冷卻至室溫,得到乳霜。透過液1直接使用培養上清低分子級分。
【表5】
 原料使用量(質量%)(1)液體石蠟23.0(2)凡士林7.0(3)鯨蠟醇1.0(4)硬脂酸2.0(5)蜜蠟2.0(6)脫水山梨醇單硬脂酸酯3.5(7)聚氧乙烯(20)脫水山梨醇單硬脂酸酯2.5(8)對羥基苯甲酸丁酯0.05(9)1,3?丁二醇1.0(10)對羥基苯甲酸甲酯0.1(11)香料0.15(12)乳酸菌培養液5.0(13)透過液11.0(14)蒸餾水使整體成為100的量
工業實用性
如上述實施例顯示,本發明的細胞保護劑具有保護細胞免受過氧化氫等損傷物質的損傷的功能。并且,若細胞得到保護、細胞數得到維持,則可形成充分的細胞間脂質,可使角質層的屏障功能充分,因而可抑制水分損失、增加水分含量、改善表面粗糙等。此外,由于隨著老化的進展,細胞數會減少,因而還可期待通過本發明的細胞保護劑發揮出抗老化作用。
如此地,由于本發明的細胞保護劑具有保護細胞免受過氧化氫等損傷物質的損傷的作用,因而可作為皮膚外用劑或化妝品的有用配合成分加以利用。
此外,如上所述,由于作為上述細胞保護劑有效成分的屬于嗜熱鏈球菌的乳酸菌的培養上清中的低分子級分具有保護細胞免受損傷物質的損傷的作用,因而通過將其應用至所欲保護的皮膚上、例如應用至包括角質層、基底層等的表皮或真皮等處,可對皮膚細胞進行保護。

關 鍵 詞:
細胞 保護
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