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鐵皮石斛的藥用用途.pdf

摘要
申請專利號:

CN201210010975.3

申請日:

2012.01.16

公開號:

CN102552698B

公開日:

2015.01.07

當前法律狀態:

授權

有效性:

有權

法律詳情: 專利權的保全IPC(主分類):A61K 36/8984申請日:20120116授權公告日:20150107登記生效日:20180914|||專利權人的姓名或者名稱、地址的變更IPC(主分類):A61K 36/8984變更事項:專利權人變更前:廣東永生源生物科技有限公司變更后:廣東永生源生物科技有限公司變更事項:地址變更前:518048 廣東省深圳市福田區福華三路卓越世紀中心1號樓21層變更后:515736 廣東省潮州市饒平縣新豐鎮溁西村大坑洋|||文件的公告送達號牌文件類型代碼:1602號牌文件序號:101735925450IPC(主分類):A61K 36/8984專利號:ZL2012100109753專利申請號:2012100109753收件人:廣東永生源生物科技有限公司文件名稱:繳費通知書|||授權|||實質審查的生效IPC(主分類):A61K 36/8984申請日:20120116|||公開
IPC分類號: A61K36/8984; A61P15/08; A61P39/06 主分類號: A61K36/8984
申請人: 廣東永生源生物科技有限公司
發明人: 侯少貞; 黃松; 梁穎敏; 賴小平; 劉星華
地址: 518048 廣東省深圳市福田區福華三路卓越世紀中心1號樓21層
優先權:
專利代理機構: 代理人:
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法律狀態
申請(專利)號:

CN201210010975.3

授權公告號:

|||||||||102552698B||||||

法律狀態公告日:

2018.10.16|||2016.10.26|||2016.07.20|||2015.01.07|||2012.09.12|||2012.07.11

法律狀態類型:

專利權的保全及其解除|||專利權人的姓名或者名稱、地址的變更|||文件的公告送達|||授權|||實質審查的生效|||公開

摘要

本發明涉及中藥技術領域,具體涉及一種中藥的新用途,即石斛抗衰老的作用用途,本發明以D-半乳糖致亞急性衰老小鼠模型和自然衰老小鼠模型,從整體水平觀察石斛對衰老小鼠的影響,進行臟器系數的測定,對其重要臟器進行病理檢查,以從整體上體現衰老的現象以及石斛抗衰老的作用,表明石斛能改善D-半乳糖致亞急性衰老小鼠子宮、卵巢等生殖器官的病理變化。而對于自然衰老模型,經過近2月的給藥過程中,石斛也能明顯地改善生殖器官的病變,抑制衰老的發展。

權利要求書

1.鐵皮石斛在制備抗衰老藥物中的應用。
2.根據權利要求1所述的應用,其中衰老包括生殖器官衰老。
3.根據權利要求2所述的應用,其中生殖器官包括子宮。
4.根據權利要求2所述的應用,其中生殖器官包括卵巢。
5.根據權利要求2所述的應用,其中生殖器官包括睪丸。
6.根據權利要求2所述的應用,其中生殖器官包括前列腺。
7.根據權利要求2所述的應用,其中生殖器官包括精囊腺。

說明書

鐵皮石斛的藥用用途

技術領域

本發明屬于中藥技術領域,具體涉及中藥鐵皮石斛的一種新的藥用用途。

背景技術

《神農本草經》中記載:石斛“主傷中,除痹,下氣,補五臟,虛癆羸瘦,
強陰,久服厚腸胃”。李時珍的《本草綱目》記載:“強陰益精。久服,厚腸胃,
補內絕不足,平胃氣,長肌肉,逐皮膚邪熱痱氣,腳膝疼冷痹弱,定志除驚,
輕身延年。益氣除熱,健陽,逐皮膚風痹,骨中久冷,補腎益力。治發熱自汗,
癰疽排膿內塞”。唐開元年間的道家經典著作《道藏》中講到,鐵皮石斛位居“中
華九大仙草”之首(石斛、天山雪蓮、三兩重人參、百二十年首烏、花甲之茯
苓、蓯蓉、深山靈芝、海底珍珠、冬蟲夏草),其延年益壽,補五臟虛勞的功效
尤甚人參。

機體的衰老發生在整體水平,根據文獻資料的綜合報道,提出了“整體衰
老假說”,認為機體“組織再生性細胞”減少是導致機體衰老的原因。組織再生
性細胞的減少,不僅使組織從外觀上逐漸表現出衰老,而且也使組織代謝功能
不斷減弱,到了一定年齡階段后,由于整個組織細胞生長更新的減弱而使組織
發生萎縮。而高等動物和人體細胞均只保存部分的合成功能,不能單獨完成其
生命活動,組織細胞和組織細胞之間必須在代謝活動過程中相互交換物質和補
償。由于機體細胞在代謝上的互補性,就造成了機體各種細胞“牽一發而動全
身”的相互依存現象,任何組織出現功能衰退,都會直接影響到機體各種組織,
因為衰老對于人體而言,均是在整體水平發生的。

基于上述理論,研究開發抗衰老藥物,將會給臨床提供新的藥物。

發明內容

基于上述原因,申請人以D-半乳糖致亞急性衰老小鼠模型和自然衰老小鼠
模型從整體水平觀察鐵皮石斛對衰老小鼠的影響,進行臟器系數的測定,從整
體上體現衰老的現象以及鐵皮石斛抗衰老的作用,表明鐵皮石斛能改善D-半乳
糖致亞急性衰老小鼠子宮、卵巢、睪丸等生殖器官的病理變化。而對于自然衰
老模型,經過近2月的給藥過程中,鐵皮石斛也能明顯地改善生殖器官的病變,
抑制衰老的發展。

本發明通過下述技術方案實現的。

鐵皮石斛在制備抗衰老藥物中的應用。

上述所屬抗衰老藥物不限于鐵皮石斛,包括鮮品、干品(楓斗)、石斛多糖
等。

上述所述衰老包括但不限于生殖器官衰老。

上述所述的生殖器官包括但不限于子宮、卵巢、睪丸、前列腺、精囊腺等
生殖器官。

藥理試驗例

實施例1

對去勢雄性小鼠的影響

一、實驗材料:

動物:昆明小鼠、SD大鼠,由廣州中醫藥大學實驗動物中心提供,動物合
格證號:SCXK(粵)2008-0020,憑證號:0043393、0062553、0062559、0062571、
0062633、0064995、0065002、0065026、0065027。

7月齡昆明小鼠,由廣東省實驗動物檢測所提供,動物合格證號:SCXK(粵)
2008-0002,憑證號:0065751。

試藥:鐵皮石斛,永生源生物科技有限公司提供,來樣日期:2009.11、2010.3。

鐵皮石斛榨汁液,采用榨汁機榨新鮮鐵皮石斛,紗布過濾濾去藥渣取汁得
榨汁液。

鐵皮石斛水提液,取新鮮鐵皮石斛,加入十倍量的水煎煮30min,共煎煮兩
次,合并兩次煎煮液得水提液。

陽性藥:參維靈片(廣東永康藥業有限公司,批號:100301,每片含靈芝
菌干粉0.1g、蘑菇浸膏粉0.2g、維生素B62mg、人參粉0.1g);

二實驗方法

1.去勢小鼠

1.1對去勢雄性小鼠的影響

造模:腹腔注射水合氯醛0.02ml/10g(劑量200mg/kg)麻醉,背位固定,
局部以碘酊消毒,以75%酒精去碘,與陰囊兩側各作一0.5cm長縱行切口,分
離皮下組織,將睪丸拉出,于睪丸內側穿線結扎,在睪丸與結扎線之間剪斷,
取出睪丸(連同附睪一并剪除),分層或不分層縫合切口,局部涂以碘酊及75%
酒精去碘,術后肌肉注射青霉素G鈉1萬u/只,正常飼養,供實驗用。

分組:手術后15天,隨機分成假手術組(不取睪丸)、模型組、鐵皮石斛
高劑量組(2g生藥/kg)、鐵皮石斛低劑量組(0.5g生藥/kg)、陽性藥組(1片/kg),
按體重連續給藥30天,每天1次,每次灌胃容量為0.1ml/10g。

方法:于末次給藥后24h摘眼球取血,檢測血液中SOD、MDA含量。脫頸
椎處死,背部固定,在恥骨聯合向上作縱行切口,切開皮膚直至胸骨劍突下,
推開腹腔內腸道,暴露盆腔,找出前列腺和精液囊,在前列腺的底部剪斷、剝
離,放于濾紙上,剪除脂肪及其他不需要的組織器官(膀胱、尿道和輸精管),
在分析天平上稱重,然后仔細分離精液囊,稱重,總重量減去精液囊重量為前
列腺重量。比較各組的生殖器官/體重比值、SOD、MDA含量的差異。

1.2對去勢雌性小鼠的影響

造模:腹腔注射水合氯醛0.02ml/10g(劑量200mg/kg)麻醉,腹位固定,
剪去背部中線兩側毛,在軀干下1/3,局部以碘酊消毒,以75%酒精去碘,在脊
柱附近作縱行切口,長約1cm,分離皮膚后,在兩側各1-2cm處作兩個切口,
分離肌肉層后,可見淡黃色脂肪團,卵巢即在其中,此時用小鑷子拉出脂肪團,
可找到一團細線狀不規則呈肉色的組織即為卵巢,下接粗大管狀組織為子宮角,
此時在卵巢下端穿一絲線,結扎,剪去卵巢及余線,將組織推回腹腔,縫合肌
肉層及皮膚層切口,局部涂以碘酊及75%酒精去碘,術后肌肉注射青霉素G鈉
1萬u/只,正常飼養,供實驗用。讓動物恢復15d,以消除雌孕激素在體內的存
留。

分組:手術后15天,隨機分成假手術組(與其他切除卵巢的小鼠一樣進行
麻醉、消毒,剪開皮膚但不去卵巢,縫合,肌肉注射青霉素預防感染)、模型組、
鐵皮石斛高劑量組(2g生藥/kg)、鐵皮石斛低劑量組(0.5g生藥/kg)、陽性藥組
(1片/kg),按體重連續給藥30天,每天1次,每次灌胃容量為0.1ml/10g。

方法:于末次給藥后24h摘眼球取血,檢測血液中SOD、MDA含量。脫頸
椎處死,背部固定,打開腹腔,剪去整個子宮及陰道,放于濾紙上,除去系膜、
脂肪組織、陰道、卵巢,吸去子宮內液體,立即在電子天平上稱重。用游標卡
尺(精確到0.02mm)量取子宮外徑,每側至少測量3次,取平均值。然后放入福
爾馬林溶液中固定用于HE染色小鼠的子宮經固定后,用常規梯度乙醇脫水,經
二甲苯透明后用55℃低熔點石蠟包埋,石蠟切片厚度為4~5,恒溫箱60℃烤
60min,常規二甲苯脫蠟,梯度酒精水化;HE染色,中性樹膠封片,鏡下觀察
并拍照。

5)比較各組的生殖器官/體重比值、SOD、MDA含量的差異。

三、實驗結果與結論

1.去勢小鼠

1.1對去勢雌性小鼠的影響

1.1.1對臟器系數的影響

表1藥物對雌性小鼠胸腺、子宮等臟器指數的影響


注:與假手術組相比:*P<0.05?**P<0.01;與模型組相比:#P<0.05,##
P<0.01。

由表1可見,對于胸腺指數,鐵皮石斛高劑量能明顯增加雌性小鼠的胸腺
比例,體現更好的免疫作用。對于子宮指數,模型組與假手術比較,子宮指數
明顯減少,差異具有明顯顯著性差異。給藥后,各給藥組的子宮指數有增加的
趨勢,其中鐵皮石斛高低劑量組與模型組相比,有增加子宮重量的作用,差異
具有顯著性差異。

1.1.2對子宮的病理影響

表2對子宮直徑影響

??組別
??子宮直徑(顯微測量)×10-4mm
??假手術組
??1615±375
??模型組
??1117±147**

??高劑量組
??1305±186*#

注:與假手術組相比:*P<0.05?**P<0.01;與模型組相比:#P<0.05,##
P<0.01。

病理組織學檢測結果顯示:假手術組內膜層較厚,內膜腔彎曲,內膜上皮
增生呈高柱狀;腺體增生、密集,上皮增生呈高柱狀。模型組子宮內膜明顯變
薄,子宮外徑明顯減小,與正常組比較具有統計學意義(p<0.05);內膜腔小而
直,內膜上皮矮柱狀;腺體明顯稀疏、減少,上皮立方狀。高劑量組與模型組
相比,子宮內膜增厚,子宮外徑增大,與模型組比較具有統計學意義(p<0.05);
腺體稍增生、密集,上皮部分呈柱狀。

1.1.3對血清SOD、MDA的影響

表3藥物對雌性小鼠SOD、MDA的影響

??組別
??SOD活性單位(U/ml)
??MDA含量(nmol/ml)
??假手術組
??139.04±51.93
??12.77±4.78
??模型組
??117.67±22.63
??13.70±4.10
??陽性組
??161.39±16.79##
??10.49±1.43
??鐵皮石斛高劑量組
??169.00±30.96##
??10.65±1.98
??鐵皮石斛低劑量組
??143.17±16.77#
??11.47±2.00

注:與假手術組相比:*P<0.05?**P<0.01;與模型組相比:#P<0.05,##
P<0.01。

由表3可見,模型組的SOD較假手術組低,MDA含量較假手術高,說明
去勢手術對小鼠的影響。陽性藥參維靈片與鐵皮石斛高低劑量均能升高血清中
SOD活性,與模型組相比具有顯著性差異,鐵皮石斛高劑量效果更明顯。陽性
藥及鐵皮石斛高低劑量均能降低血清中過氧化產物MDA的含量,但差異沒有顯
著性區別。

2對去勢雄性小鼠的影響

2.1對臟器系數的影響

表4藥物對雄性小鼠精囊腺、前列腺、包皮腺等臟器指數的影響


注:與假手術組相比:*P<0.05?**P<0.01;與模型組相比:#P<0.05,##
P<0.01。

由表4可見,模型組及給藥組的精囊腺指數、前列腺指數、包皮腺指數均
明顯小于假手術組。鐵皮石斛高劑量給藥組能增加手術后的前列腺指數,與模
型組相比具有差異。而對于包皮腺,鐵皮石斛高劑量有增加的趨勢。

2.2對精囊腺、包皮腺的病理影響

病理組織學檢測結果顯示:假手術組精囊腺腺體分泌旺盛,腺腔明顯擴張,
腺腔內大量分泌物潴留。模型組精囊腺腺腔明顯縮小,腺體減少,僅少數腺腔
內可見分泌物。高劑量組精囊腺腺體與模型組比較有增多,腺腔部分擴張,腺
腔內較多分泌物潴留。

2.3對血清SOD、MDA的影響

表5藥物對雄性小鼠SOD、MDA的影響

??SOD活性單位(u/ml)
??MDA含量(nmol/ml)
??假手術組
??105.76±21.26
??10.68±1.23
??模型組
??86.21±23.98
??13.20±3.80
??陽性組
??114.44±22.77##
??9.53±1.12#

??鐵皮石斛高劑量組
??124.35±21.64##
??9.05±1.70##
??鐵皮石斛低劑量組
??126.26±17.82##
??8.78±1.66##

注:與假手術組相比:*P<0.05?**P<0.01;與模型組相比:#P<0.05,##
P<0.01。

由表5可見,模型組的SOD較假手術組低,MDA含量較假手術高,說明
去勢手術對小鼠的影響。陽性藥參維靈片與鐵皮石斛高低劑量均能升高血清中
SOD活性,與模型組相比具有顯著性差異。陽性藥參維靈片與鐵皮石斛高低劑
量均能降低血清中MDA含量,差異具有顯著性差異,鐵皮石斛高低劑量的效
果較陽性藥更明顯。

實施例2

鐵皮石斛對D-半乳糖致亞急性衰老小鼠生殖器官的作用研究

試藥

石斛汁:稱取鐵皮石斛鮮品(≤3mm的顆粒狀)約10g,加蒸餾水100ml,
榨汁至100ml,于電熱套上加熱至微沸,置4℃冰箱保存,可放置一周。

石斛水提液:稱取鐵皮石斛鮮品25g,加水250ml加熱回流3次,每次1h,
過濾,合并濾液,濃縮至200ml,備用。

石斛多糖:取鐵皮石斛鮮品300g,加水3000ml,加熱回流3次,每次1h,
過濾(棉花抽濾),合并濾液,置電磁爐上蒸去水分,濃縮至約2L,加95%乙
醇約9.5L,用乙醇計調醇度為80%,靜置36h,將乙醇醇沉液離心(3000r/min)
10分鐘,取濾渣置大蒸發皿中揮走乙醇,置60℃烘箱中烘干,干燥后用粉碎機
粉碎,取100目篩下粉末,置干燥器備用。

用時取0.5g粗多糖,加蒸餾水100ml,超聲60min,至完全溶解,備用。

石斛楓斗:取鐵皮石斛楓斗50g,用粉碎機粉碎后過3號篩(50目),取篩
下粉末,置干燥器備用。

楓斗水提液:取鐵皮石斛楓斗粉末5g,加水150ml,加熱回流3次,每次
1h,濾過,合并濾液,濃縮至200ml,備用。

陽性藥:青春寶抗衰老片,正大青春寶藥業有限公司,批號:0904002,生
產日期:09.04.08,有效期至2011.03。

藥物

D-半乳糖(廣州威佳科技有限公司,規格25g,CAS#:59-23-4,批號:
2K06D518);

氯化鈉注射液(昆明市宇斯藥業有限責任公司,規格:500ml,批號:
08091902,生產日期2008.09.19,有效期至2010.9.18);

氯化鈉注射液(中國廣州百特醫療用品有限公司,規格:500ml,批號:
GS1004006,有效期至2012.03);

甲醛溶液(廣州化學試劑廠,規格:500ml,批號:20090702-1)。

實驗動物

昆明小鼠,SPF級,18-22g,雌性,由廣東省醫學實驗動物中心提供,許
可證號:SCXK(粵)2008-0002,合格證號:0070152。動物放置在室溫18℃~
22℃,相對濕度為50~70%,12h明暗交替的環境下飼養。實驗期間自由飲水、
飲食,飼料為標準全價飼料。

實驗方法

取昆明種成年小鼠130只,體重20±2g,雌雄各半。將動物隨機分7組,
分別為:正常對照組、衰老模型組、陽性藥組、鮮品榨汁液組(以下簡稱鮮-榨
汁組)、鮮品水提液組(以下簡稱鮮-水提組)、楓斗水提液組(以下簡稱干-水提
組),(鮮品)粗多糖組,每組18只。除正常對照組外,各鼠每天在頸背部皮下
注射D-半乳糖(注射用水配制)125mg/kg,連續8周,普通飼料常規喂養。各
組動物在造模第10d后,同時每日灌胃相應受試藥液容量0.1ml/10g,正常對照
組以同等劑量的蒸餾水灌胃。

給藥9周后,取血后頸椎脫臼處死,稱取其生殖器官(包括卵巢、子宮),
計算臟器系數。將卵巢、子宮等臟器,放入福爾馬林溶液中固定用于HE染色(蘇
木精-伊紅染色法,hematoxylin-eosinstaining)。固定后,用55℃低熔點石蠟包埋,
石蠟切片厚度為3μm,常規二甲苯脫蠟,梯度酒精水化;HE染色,用常規梯度
乙醇脫水,中性樹膠封片,鏡下觀察并拍照。染色結果:細胞核呈藍色,細胞
漿、肌肉、結締組織、紅細胞和嗜伊紅顆粒呈不同程度的紅色,鈣鹽和各種微
生物染成藍色或藍紫色。依據各種臟器的病變程度進行評分,分“-,+,++,
+++”等四級,分數分別為“0,1,2,3”,分數越大表明病變越嚴重。

數據用均數±標準差表示,n為樣本量。統計作圖軟件用Microsoft?
Excel。統計方法用One-way?t?test,P<0.05表示差異有統計學意義。

實驗結果

(1)臟器系數

雄性情況見表6。

表6雄性小鼠情況

??組別
??胸腺系數(%)
??脾系數(%)
??腎系數(%)
??肝系數(%)
??腦系數(%)
??正常組
??1.74±0.57**
??2.55±0.52**
??13.00±2.05
??37.99±2.01*
??10.25±0.84*
??模型組
??1.05±0.36
??6.73±2.04
??13.24±2.29
??41.51±4.66*
??10.85±0.67
??陽性組
??1.27±0.46
??4.31±1.32*
??13.31±1.48
??37.34±3.80
??11.02±0.54
??鮮-榨汁組
??1.88±0.28**
??8.82±2.10
??13.04±1.86
??41.39±2.66
??10.67±0.99
??鮮-水提組
??1.58±0.38**
??6.59±2.06
??12.11±2.07
??37.28±5.55
??11.43±0.96
??干-水提組
??1.94±0.40**
??7.27±3.21
??14.30±2.64
??43.23±5.88
??11.57±1.63
??粗多糖組
??1.59±0.50*
??8.71±2.86
??13.97±1.34
??44.46±4.84
??10.59±0.54

注:與模型組相比:*P<0.05??**P<0.01

雌性情況見表7。

表7雌性小鼠情況

??組別
??胸腺系數(%)
??脾系數(%)
??腎系數(%)
??肝系數(%)
??腦系數(%)
??正常組
??2.84±0.60*
??4.59±1.16**
??9.88±1.83
??38.14±4.98
??14.67±1.47*
??模型組
??2.34±0.26
??6.94±1.61
??10.11±1.12
??40.10±4.63
??13.23±0.64
??陽性組
??2.65±0.68
??6.23±1.69
??10.95±1.16
??38.88±4.42
??13.03±1.09
??鮮-榨汁組
??2.72±0.45*
??5.15±2.43
??9.80±1.32
??36.59±5.51
??13.50±1.48
??鮮-水提組
??2.89±0.64*
??8.10±1.72
??10.08±1.25
??38.01±4.82
??13.74±0.93
??干-水提組
??2.67±0.40*
??7.74±3.67
??10.02±0.99
??38.69±3.04
??13.10±0.92
??粗多糖組
??3.05±0.28**
??6.58±2.13
??10.34±0.63
??36.35±3.13*
??12.42±0.71*

注:與模型組相比:*P<0.05?**P<0.01

結論:

1、胸腺系數:

①雄性:

模型組的胸腺系數明顯減少,與正常組相比,差異具有顯著性意義(P<0.01)。
其余各給藥組,除陽性藥組外,均能增加其胸腺系數,差異具有顯著性意義
(P<0.01),其中鮮榨汁和干水提更明顯。粗多糖的作用較明顯(P<0.05)

②雌性:

模型組的胸腺系數明顯減少(P<0.05),其余各給藥組,除陽性藥組外,均
能增加其胸腺系數,差異具有顯著性意義(P<0.05)。粗多糖的作用較明顯
(P<0.01)。

2、脾系數:

①雄性、雌性:

模型的脾系數與正常組相比明顯升高,差異具有顯著性意義(P<0.01)。陽
性藥對脾系數有減少的趨勢。

3、腎系數:

雌雄各組無明顯差異。

4、肝系數:

模型組與正常組相比,肝臟系數有所增加。

雌性的給藥組肝系數有減少的趨勢。

雌性肝系數減少有顯著性差異。

5、腦系數

各組腦系數差異不大。

2、雄性小鼠血清SOD含量情況見表8。

表8雄性小鼠血清SOD含量情況見表

??組別
??SOD含量(U/mgprot)
??正常組
??170.13±16.65**
??模型組
??139.31±15.85
??陽性組
??150.60±13.41
??鮮-榨汁組
??164.27±36.20*
??鮮-水提組
??168.75±15.04*
??干-水提組
??141.94±22.15
??粗多糖組
??147.73±23.17

注:與模型組相比:*P<0.05**P<0.01

雌性小鼠血清SOD含量情況見表9。

表9雌性小鼠血清SOD含量情況見表

??組別
??SOD含量(U/mgprot)
??正常組
??159.03±9.35
??模型組
??152.55±8.21
??陽性組
??171.23±17.72**

??鮮-榨汁組
??169.76±4.92**
??鮮-水提組
??163.77±21.91**
??干-水提組
??175.82±3.66**
??粗多糖組
??182.52±14.16**

注:與模型組相比:*P<0.05?**P<0.01

分析:血液SOD:SOD是酶促防御系統的重要組成部分,主要清除體內的
超氧陰離子自由基,催化其發生歧化反應,阻斷和防止一系列自由基連鎖反應
的加劇,抑制脂質過氧化反應。SOD對機體的氧化與抗氧化平衡起著至關重要
的作用,是反映機體抗氧化能力的重要指標。本研究顯示:

①雄性:

模型組的血清SOD明顯減少,與正常組相比,差異具有顯著性意義
(P<0.01)。鮮-榨汁組及鮮-水提組與模型組相比有改善(P<0.05)

②雌性:

模型組的血清SOD明顯減少,與正常組相比,差異具有顯著性意義
(P<0.01)。各給藥組與模型組相比,均增加其SOD活性(P<0.05)。

實驗結果說明試藥可提高小鼠血液抗氧化能力,雄性以鮮-榨汁組及鮮-水提
組血清SOD活性增強為主要表現,雌性所有給藥組血清SOD活性均明顯增強。

3.血清T-AOC

雄性小鼠血清T-AOC含量情況見表10。

表10雄性小鼠血清T-AOC含量情況見表

??組別
??T-AOC含量(單位/ml)
??正常組
??4.96±1.97
??模型組
??4.79±2.93
??陽性組
??5.82±2.78
??鮮-榨汁組
??3.60±1.15

??鮮-水提組
??3.05±2.85
??干-水提組
??5.04±3.06
??粗多糖組
??6.23±3.26

注:與模型組相比:*P<0.05**P<0.01

雌性小鼠血清T-AOC含量情況見表11。

表11雌性小鼠血清T-AOC含量情況見表

??組別
??T-AOC含量(單位/ml)
??正常組
??3.43±1.68*
??模型組
??1.17±2.00
??陽性組
??2.14±5.23
??鮮-榨汁組
??2.78±1.45*
??鮮-水提組
??3.05±2.85
??干-水提組
??2.39±2.29
??粗多糖組
??3.18±1.52*

注:與模型組相比:*P<0.05**P<0.01

結論:血液T-AOC:機體防御體系的抗氧化能力的強弱與健康程度存在著
密切聯系,該防御體系有酶促與非酶促兩個體系,許多酶是以微量元素為活性
中心,例如:超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)、
過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽S-轉移酶(GST)等,非酶促反應體系中主要
為維生素、氨基酸和金屬蛋白質。例如:VE、胡蘿卜素、VC、半胱氨酸、蛋氨
酸、色氨酸、組氨酸、葡萄糖、銅蘭蛋白、轉鐵蛋白、乳鐵蛋白等。這個體系
的防護氧化作用主要通過三條途徑:(1)消除自由基和活性氧以免引發脂質過
氧化;(2)分解過氧化物,阻斷過氧化鏈;(3)除去起催化作用的金屬離子。
防御體系各成份之間相互起到了協同作用,以及代償作用與依賴作用。本研究
顯示:

①雄性:

各組數據無明顯差異。

②雌性:

模型組的血清T-AOC明顯減少,與正常組相比,差異具有顯著性意義
(P<0.05)。其余各給藥組與模型組比較,鮮-榨汁組及粗多糖組T-AOC均明顯
增加,差異具有顯著性意義(P<0.05)。

實驗結果說明試藥可提高小鼠血液抗氧化能力,雌性以鮮-榨汁組及粗多糖
組T-AOC活性增強為主要表現。

4.血清GSH-PX

雄性小鼠血清GSH-PX含量情況見表12。

表12雄性小鼠血清GSH-PX含量情況見表

??GSH-PX含量(酶活力單位)
??正常組
??780.00±300.84
??模型組
??786.00±155.19
??陽性組
??1007.25±161.68**
??鮮-榨汁組
??1488.67±58.82**
??鮮-水提組
??1193.33±153.07**
??干-水提組
??1450.67±105.12**
??粗多糖組
??912.00±158.75

注:與模型組相比:*P<0.05**P<0.01

雌性小鼠血清GSH-PX含量情況見表13。

表13雌性小鼠血清GSH-PX含量情況見表

??GSH-PX含量(酶活力單位)
??正常組
??997.71±263.63
??模型組
??850.80±136.91
??陽性組
??1200.00±180.25*
??鮮-榨汁組
??1292.67±204.6**

??鮮-水提組
??1193.33±153.07*
??干-水提組
??888.75±334.90
??粗多糖組
??1092.75±114.54

注:與模型組相比:*P<0.05**P<0.01

結論:血液GSH-PX:谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)是機體內廣泛存在的
一種重要的過氧化物分解的酶,它特異地催化還原型谷胱甘肽(GSH)對氫過
氧化物的還原反應,一般認為它在細胞內能清除有害的過氧化物代謝產物,阻
斷脂質過氧化鏈鎖反應,從而起到保護細胞膜結構和功能完整的作用。此酶含
硒,硒是GSH-PX的必須組成部分。每克分子酶含4克原子硒。GSH-PX的
活性中心是硒半胱氨酸。測定GSH-PX活力可以作為衡量機體硒水平的一項生
化指標。本研究顯示:

①雄性:

與正常組相比,模型組的血清GSH-PX有所增加。其余各給藥組與模型組
相比,除粗多糖組外,GSH-PX均明顯增加,差異具有顯著性意義(P<0.01)。

②雌性:

與正常組相比,模型組的血清GSH-PX有所減少。其余各給藥組與模型組
比較,陽性組(P<0.05)、鮮-榨汁組(P<0.01)及鮮-水提組(P<0.05)GSH-PX
均明顯增加,差異具有顯著性意義。

實驗結果說明試藥可提高小鼠血液抗氧化能力,雄性除粗多糖組外,
GSH-PX均明顯增加,雌性以陽性組(P<0.05)、鮮-榨汁組(P<0.01)及鮮-水
提組(P<0.05)GSH-PX明顯增加為主要表現。

5病理檢查

5.1子宮

表14對其上皮病變、腺體改變、炎癥反應、纖維增生、血管增生等情
況進行評分。

??正常組
??模型組
??陽性組
??鮮榨汁
??干水提
??鮮水提
??粗多糖
?-
??15
??11
??9
??9
??14
??10
??14
?+
??0
??3
??3
??6
??1
??5
??1
?++
??0
??1
??3
??0
??0
??0
??0
?+++
??0
??0
??0
??0
??0
??0
??0

注:與模型組相比:*P<0.05**P<0.01

正常組:子宮內膜上皮完整,未見上皮細胞增生,未見細胞變性、壞死及
脫落;固有層腺體分布均勻,未見腺體增生或萎縮;間質未見炎細胞浸潤及纖
維組織增生;肌層未見炎癥反應,未見小血管增生。

模型組:與正常組相比,個別子宮管徑減小,粘膜上皮未見明顯變化,固
有層腺體萎縮減少,間質及肌層未見明顯病變。

陽性組:與模型組相比,子宮管徑增大;粘膜上皮增生呈高柱狀,并形成
皺襞;固有層腺體增生、密集,間質輕度水腫,間質細胞肥大;肌層未見明顯
病變。

鮮品榨汁組:與陽性組病變相似,程度稍輕。

鮮品水提組:與陽性組病變相似,程度稍輕。

干品水提組:與正常組基本相似。

粗多糖組:與正常組基本相似。

5.2卵巢

表15對卵巢大小、卵泡萎縮、黃體萎縮等情況進行評分

??正常組
??模型組
??陽性組
??鮮榨汁
??干水提
??鮮水提
??粗多糖
?-
??9
??0
??4
??9
??9
??8
??6
?+
??0
??0
??2
??0
??0
??1
??2
?++
??0
??0
??3
??0
??0
??0
??1
?+++
??0
??9
??0
??0
??0
??0
??0

??**
??**
??**
??**
??**
??**

注:與模型組相比:*P<0.05**P<0.01

正常組:卵巢體積較大,各級卵泡發育良好,黃體數目較多,體積較大,
排列緊密。

模型組:卵巢明顯萎縮,體積減小;各級卵泡及黃體數目明顯減小。

陽性組:卵巢體積、各級卵泡及黃體數目基本恢復正常。

鮮品榨汁組:與陽性組基本相似。

鮮品水提組:卵巢體積、各級卵泡及黃體數目輕度減小。

干品水提組:與陽性組基本相似。

粗多糖組:個別標本卵巢體積、各級卵泡及黃體數目減小,其余標本與陽
性組基本相似。

5.3睪丸

表15對曲細精管萎縮情況進行評分


注:與模型組相比:*P<0.05**P<0.01

正常組:睪丸曲細精管排列致密,支持細胞呈高柱狀,胞漿豐富,各級生
精細胞排列呈多層。

模型組:睪丸曲細精管明顯萎縮,排列疏松,支持細胞短縮,各級生精細
胞萎縮,細胞層變薄。

陽性組:曲細精管形態基本恢復正常。

鮮品榨汁組:曲細精管稍疏松,細胞形態基本正常。

鮮品水提組:曲細精管稍疏松,細胞形態基本正常。

干品水提組:與陽性組基本相似。

粗多糖組:曲細精管稍疏松,細胞層輕度萎縮、變薄。

5.4脾臟

表16對白髓萎縮情況進行評分


注:與模型組相比:*P<0.05**P<0.01

正常組:白髓較多,白髓/紅髓比例較大,白髓、紅髓界限清晰。

模型組:白髓明顯減少,白髓/紅髓比例明顯減小,白髓、紅髓界限不清。

陽性組:與模型組相比,白髓明顯增多,白髓/紅髓比例明顯增大,白髓、
紅髓界限較清晰。

鮮品榨汁組:病變恢復良好,與陽性組基本相似。

鮮品水提組:病變恢復良好,個別標本白髓輕度萎縮。

干品水提組:病變恢復良好,個別標本白髓輕度萎縮。

粗多糖組:與模型組相比,未見明顯改善。

5.5腎臟

表16對腎小球減少、腎小球萎縮/肥大、腎小管病變、間質病變等情況進行
評分

??正常組
??模型組
??陽性組
??鮮榨汁
??干水提
??鮮水提
??粗多糖
?-
??12
??9
??10
??11
??12
??11
??10
?+
??0
??3
??2
??1
??0
??1
??2

?++
??0
??0
??0
??0
??0
??0
??0
?+++
??0
??0
??0
??0
??0
??0
??0

注:與模型組相比:*P<0.05**P<0.01

正常組:腎小球未見減少,未見萎縮及代償性肥大,基底膜未見增厚,系
膜細胞未見增生;腎小管上皮細胞未見水腫及變性、壞死,未見管腔擴張及上
皮萎縮,未見管型;間質未見炎細胞浸潤及纖維組織增生。

模型組:腎小球數稍減少,未見明顯肥大及系膜增生,腎小管及間質未見
明顯病變。

陽性組:個別標本腎小球數稍減少,未見明顯肥大及系膜增生,腎小管及
間質未見明顯病變。

鮮品榨汁組:與陽性組基本相似。

鮮品水提組:與陽性組基本相似。

干品水提組:與正常組基本相似,未見明顯病變。

粗多糖組:與陽性組基本相似。

實施例3

鐵皮石斛對自然衰老雌性小鼠生殖器官的作用研究

試藥

鐵皮石斛榨汁液,給藥劑量:1g/kg(按生藥量算,即含多糖約0.3g/kg);
粗多糖溶液,給藥劑量:0.32g/kg(即含多糖約0.3g/kg),均由廣州中醫藥大學
新藥開發研究中心提供。

石斛汁:稱取鐵皮石斛鮮品(≤3mm的顆粒狀)約10g,加蒸餾水100ml,
榨汁至100ml,于電熱套上加熱至微沸,置4℃冰箱保存,可放置一周。

石斛水提液:稱取鐵皮石斛鮮品25g,加水250ml加熱回流3次,每次1h,
過濾,合并濾液,濃縮至200ml,備用。

石斛多糖:取鐵皮石斛鮮品300g,加水3000ml,加熱回流3次,每次1h,
過濾(棉花抽濾),合并濾液,置電磁爐上蒸去水分,濃縮至約2L,加95%乙
醇約9.5L,用乙醇計調醇度為80%,靜置36h,將乙醇醇沉液離心(3000r/min)
10分鐘,取濾渣置大蒸發皿中揮走乙醇,置60℃烘箱中烘干,干燥后用粉碎機
粉碎,取100目篩下粉末,置干燥器備用。

用時取0.5g粗多糖,加蒸餾水100ml,超聲60min,至完全溶解,備用。

石斛楓斗:取鐵皮石斛楓斗50g,用粉碎機粉碎后過3號篩(50目),取篩
下粉末,置干燥器備用。

楓斗水提液:取鐵皮石斛楓斗粉末5g,加水150ml,加熱回流3次,每次
1h,濾過,合并濾液,濃縮至200ml,備用。

實驗動物

青年組:昆明小鼠,SPF級,17-20g(2010.10.14),雌性,25只,由廣東
省醫學實驗動物中心提供,許可證號:SCXK(粵)2008-0002,合格證號:0073131。
普通飼料常規喂養1個月。

衰老組:昆明小鼠,9月齡,雌性,由廣東省醫學實驗動物中心提供,許可
證號:SCXK(粵)2008-0002,合格證號:0070142。普通飼料常規喂養3個月
至12月齡。

動物放置在室溫18℃~22℃,相對濕度為50~70%,12h明暗交替的環境
下飼養。實驗期間自由飲水、飲食,飼料為標準全價飼料。

實驗方法

將12月齡衰老動物隨機分3組,分別為:衰老模型組、榨汁液組(1g生藥
/kg)、多糖組(0.32g/kg,相當于1g生藥/kg),以3月齡青年小鼠作為青年對
照組,每組14只,普通飼料常規喂養。各組動物每日灌胃相應受試藥液
0.1ml/10g。衰老模型組和青年對照組以同等劑量的蒸餾水灌胃,給藥期間,每
周測定兩次體重。

給藥10周后,取血后頸椎脫臼處死,稱取其生殖器官(卵巢、子宮等),
計算臟器系數。取卵巢、子宮等臟器,按上述亞急性衰老模型小鼠中臟器病理
檢查的方法。

實驗結果

各組小鼠臟器系數的情況見表17。

(1)子宮系數

12月齡衰老小鼠的子宮隨著卵巢的水腫而重量明顯增加,解剖可見粗大的
子宮附近血絲明顯,而3月齡青年小鼠的子宮顏色較淡,彈性較好,附近不見
明顯血絲。青年小鼠和衰老小鼠的子宮系數兩者相比,差異具有統計學意義
(P<0.01)。

(2)卵巢系數

12月齡的衰老小鼠卵巢萎縮,與青年小鼠相比具有顯著性差異(P<0.05),
給衰老小鼠灌胃給藥鐵皮石斛榨和多糖后,小鼠的卵巢沒有明顯腫大,與衰老
模型組相比,差異具有統計學意義。

表17鐵皮石斛對自然衰老雌性小鼠臟器系數的情況(n=12)

??卵巢系數(‰)
??子宮系數(‰)
??青年組
??0.69±0.16**
??2.99±0.86*
??衰老組
??0.48±0.16
??3.71±0.97
??榨汁組
??0.56±0.31
??2.48±0.79**
??多糖組
??0.58±0.50
??2.37±0.76**

注:與衰老組相比:*P<0.05,**P<0.01

各臟器病理檢查

(1)子宮:

青年對照組:子宮內膜上皮完整,未見上皮細胞增生,未見細胞變性、壞
死及脫落;固有層腺體分布均勻,未見腺體增生或萎縮;間質未見炎細胞浸潤
及纖維組織增生;肌層未見炎癥反應,未見小血管增生。

模型組:與對照組相比,個別子宮管徑減小,粘膜上皮未見明顯變化,固
有層腺體發布不均,部分腺腔擴張;間質及肌層纖維組織及小血管增生,炎細
胞浸潤明顯。

榨汁組:與模型組病變相似,病變程度減輕。

多糖組:與模型組病變相似,病變程度減輕。

(2)卵巢:

青年對照組:卵巢體積較大,各級卵泡發育良好,黃體數目較多,體積較
大,排列緊密;間質細胞較肥大、致密。

模型組:卵巢萎縮,體積減小;各級卵泡及黃體明顯減少,黃體體積減小;
間質細胞萎縮、減少,纖維組織及小血管增生。

榨汁組:與模型組病變相似,病變程度減輕。

多糖組:與模型組病變相似,病變程度減輕。

表18雌性小鼠臟器病理損傷程度評分表(n=6)

??子官

??卵巢

??青年組
??0.00±0.00**
??0.00±0.00**
??衰老組
??2.83±1.60
??4.33±2.34
??榨汁組
??1.17±0.75*
??2.75±1.26
??多糖組
??1.33±1.21*
??2.60±1.95

注:與衰老組相比:*P<0.05,**P<0.01。

實驗結論:

D-半乳糖致衰老是一種易獲得的衰老模型。D-半乳糖誘導的衰老模型與糖
代謝紊亂、D-半乳糖醇中毒和活性氧自由基過剩等相關。衰老的代謝學說認為,
衰老是極度代謝性障礙的結果,糖代謝在三大物質代謝中具有很重要的意義;
糖代謝紊亂必然會引起心,肝,腎,腦,肺等重要臟器代謝異常,最終出現衰
老。

在一定時期內連續給動物注射D-半乳糖,使機體細胞內半乳糖濃度增高,
在醛糖還原酶催化下,還原成半乳糖醇,這種物質不能被細胞進一步代謝而堆
積在細胞內,影響正常滲透壓,導致細胞腫脹,功能障礙、代謝紊亂,破壞并
消耗機體抗氧化防御系統,使自由基積聚。同時在半乳糖還原成半乳糖醇的過
程中又產生(O2-),這樣使細胞膜脂質受損,過氧化脂質、脂褐質等增高,出現
衰老。

臟器病理檢查分析表明鐵皮石斛能改善D-半乳糖致亞急性衰老小鼠子宮、
卵巢等生殖器官的病理變化。

隨著增齡,動物機體的組織器官出現退行性變化而表現出老化征象,選用
老齡動物作為自然衰老動物模型,比人工造成的衰老模型在衰老的生理進程中
更符合人類衰老的特點,為最理想的衰老模型。但飼養周期較長,所受影響因
素較多,動物個體差異較大。實驗過程中,動物易感染疾病甚至出現死亡,因
此需嚴格控制飼養條件:保證通風及光照良好,室溫控制在18~25℃,配以營養
全面的混合飼料飼養,飲水、墊料每日更換,飲水器及鼠籠隔日清洗,保持清
潔。

由上述結果可見,12月齡小鼠的卵巢嚴重萎縮,子宮有腫大的現象,病理
檢查見卵巢各級卵泡及黃體明顯減少,黃體體積減小,間質細胞萎縮、減少,
子宮間質及肌層纖維組織及小血管增生,炎細胞浸潤明顯,表明其子宮、卵巢
出現明顯的病理改變。

鐵皮石斛能明顯改善雌性衰老小鼠生殖器官(子宮、卵巢)等發生老化的
病理組織學改變。在衰老的進程中,生殖器官最先出現病理學上的改變,而在
近2月的給藥過程中,鐵皮石斛能明顯地改善生殖器官的病變,抑制衰老的發
展。

動物機體的代謝合成,除神經組織細胞外,主要集中在生長旺盛的組織再
生細胞。組織再生性細胞總是隨著年齡的增加而在組織中的比例不斷減少,這
種減少不僅使組織外觀表現出逐漸衰老,而且也使組織代謝功能不斷減弱,到
了一定年齡階段后,由于整個組織細胞的生長更新減弱而使組織發生萎縮。再
生性細胞之所以在組織中的比例減少,原因是分化速率大于分裂速率之故。各
種組織中再生性細胞的減少,是組織的代謝合成功能降低,從而使體液中所含
的有效成分(維持生命活動的成分)隨之減少,反過來又影響組織再生性細胞
的合成速率,使分化加速,是機體進入進行性的衰老狀態。從各種器官的病理
檢查可看出,鐵皮石斛能從整體上改善衰老的狀態,促進組織再生性細胞的合
成,抑制其分化。

鐵皮石斛從整體和組織器官的層面上表現出其抗衰老的作用效果。

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鐵皮 石斛 藥用 用途
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