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一種藥物組合物及其用途.pdf

摘要
申請專利號:

CN201410075924.8

申請日:

2014.03.04

公開號:

CN103861107B

公開日:

2015.01.14

當前法律狀態:

有效性:

法律詳情: 授權|||專利申請權的轉移IPC(主分類):A61K 45/06變更事項:申請人變更前權利人:肖文華變更后權利人:中國人民解放軍總醫院第一附屬醫院變更事項:地址變更前權利人:100048 北京市海淀區阜成路51號變更后權利人:100048 北京市海淀區阜成路51號登記生效日:20140904|||實質審查的生效IPC(主分類):A61K 45/06申請日:20140304|||公開
IPC分類號: A61K45/06; A61K38/55; A61K39/00; A61K39/39; A61P35/00; A61K31/245(2006.01)N 主分類號: A61K45/06
申請人: 中國人民解放軍總醫院第一附屬醫院
發明人: 肖文華; 董偉偉
地址: 100048 北京市海淀區阜成路51號
優先權:
專利代理機構: 北京中譽威圣知識產權代理有限公司 11279 代理人: 叢芳
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法律狀態
申請(專利)號:

CN201410075924.8

授權公告號:

103861107B|||||||||

法律狀態公告日:

2015.01.14|||2014.10.01|||2014.07.16|||2014.06.18

法律狀態類型:

授權|||專利申請權、專利權的轉移|||實質審查的生效|||公開

摘要

本發明公開了一種藥物組合物及其用途,所述藥物組合物包含DNA甲基轉移酶抑制劑和組蛋白去乙酰化酶抑制劑。本發明還公開了該藥物組合物的新用途,采用所述藥物組合物共同處理腫瘤細胞獲得exosomes腫瘤疫苗。本發明還公布了一種使用所述藥物組合物制備腫瘤疫苗的方法,包括使用普魯卡因聯合MS-275處理腫瘤細胞,分離與純化腫瘤細胞分泌的exosomes。本發明的藥物組合物提高exosomes腫瘤疫苗治療效果,具有重要的臨床應用價值。

權利要求書

權利要求書
1.  一種藥物組合物,所述藥物組合物包含DNA甲基轉移酶抑制劑和組蛋白去乙酰化酶抑制劑,其特征在于,所述DNA甲基轉移酶抑制劑可選自下列藥物中的一種或幾種:阿扎胞苷(5-azacytidine)、5-氮雜-2’-脫氧胞苷(又名地西他濱decitabine)、Zebularine、5-F-CdR、Hydralazine、SGI-1027、RG108、EGCC、普魯卡因胺(procainamide)、普魯卡因(procaine)、MG-98、PsammaplinA、姜黃素(curcumin);所述組蛋白去乙酰化酶抑制劑可選自下列藥物中的一種或幾種:丁酸、戊酸和苯丁酸及其鹽類化合物、曲古抑菌素(trichostatin A,TSA)、MS-275(suberoylanilide hydroxamic)、NVP-LAQ824、Pyroxamide、CBHA、Oxamflatin、Scriptaid、MM232、Trapoxin、Apicidin、FK228、WF3161、CHAP31、HC-toxin、LBH589、PDX-101、Tubacin、ACY-1215、MGCD0103、MS-275、Pomidepsin、Plitidepsin。

2.  根據權利要求1所述的藥物組合物,其特征在于,所述DNA甲基轉移酶抑制劑為普魯卡因;所述組蛋白去乙酰化酶抑制劑為MS-275。

3.  根據權利要求1-2任意一項所述的藥物組合物,其特征在于,所述DNA甲基轉移酶抑制劑與組蛋白去乙酰化酶抑制劑比例為1∶1。

4.  權利要求1-3中任意一項所述的藥物組合物在制備腫瘤疫苗中的用途。

5.  一種制備腫瘤疫苗的方法,其特征在于,所述方法包括:使用權利要求1-3任意一項所述的藥物組合物處理腫瘤細胞;分離與純化腫瘤細胞分泌的exosomes。

6.  根據權利要求5所述的制備腫瘤疫苗的方法,包括:腫瘤細胞用含100ml/L胎牛血清的DMEI培養液,在37℃50ml/L CO2孵箱中培養,細胞呈單層貼壁生長,每3-4天傳代1次,待細胞生長至對數期時接種;接種24h后用權利要求1-3任意一項所述的藥物組合物處理細胞,分別在加藥后24h收集培養上清液,并4℃保存;將收集到的腫瘤細胞培養上清液離心去除細胞,取上清液;再離心去除細胞碎片,收集上清液,通過100kU MWCO Centriplus離心超濾管濃縮超濾,離心得到濃縮液,將分離純化的濃縮液移至1.5ml的離心管中,4℃下用水平轉角以100kg超速離心,所得沉淀即含有exosomes。

7.  一種根據權利要求5-6任意一項所述的制備腫瘤疫苗的方法制得的腫瘤疫苗。

8.  如權利要求7所述的腫瘤疫苗,其特征在于,所述腫瘤疫苗包含佐劑。

9.  如權利要求7-8任意一項所述的腫瘤疫苗在制備抗腫瘤藥物中的應用。

10.  如權利要求9所述的應用,其特征在于,所述抗腫瘤藥物為抗肝癌藥物。

說明書

說明書一種藥物組合物及其用途
技術領域
本發明涉及一種藥物組合物及其用途,具體涉及一種藥物組合物及其在制備腫瘤疫苗的新用途,更具體的涉及一種包含普魯卡因和MS-275的藥物組合物及其在制備exosomes腫瘤疫苗的用途。
背景技術
普魯卡因(procaine),化學名4一氨基苯甲酸2-(二乙氨基)乙醋,是一種在臨床上用了近百年的普通局麻藥,該藥能使細胞膜穩定,降低其對離子的通透性,使神經沖動達到時,鈉、鉀離子不能進出細胞膜產生去極化和動作電位,從而產生局麻作用。此外,普魯卡因在臨床各科許多疾病治療當中也有廣泛的應用,如在兒科的臨床用于治療百日咳,在皮膚科的臨床用于治療帶狀疤疹、過敏性紫癱、皮膚瘙癢癥、神經性皮炎,在婦產科的臨床用于治療宮頸性難產、宮頸水腫、催產,在消化科的臨床用于治療胰腺炎,在呼吸科的臨床用于治療咯血等。雖然普魯卡因也有抗癌的作用,但是這需要較高的濃度才能發揮理想的藥效,使得他在此方面的應用受到限制。
MS-275是一種新型的組蛋白去乙酞化酶抑制劑(Histone deacetylase inhibitor,HDACIs),HDACIs通過抑制組蛋白去乙酰化酶的活性,改變組蛋白的乙酰化水平,進而改變染色質結構及功能,從而解除特殊基因的轉錄抑制,調控基因的表達。MS-275屬于苯酰胺類組蛋白去乙酰化酶抑制劑,他以苯甲酰胺基團作為功能基團,與鋅離子結合,發揮作用。
近年來,腫瘤作為一種嚴重威脅人們生命的疾病,其治療方法已成為眾多科研工作者致力于研究的課題,隨著免疫學、細胞生物學與分子生物學的飛速發展,繼腫瘤手術、放療及化療三大療法之后,腫瘤的生物治療已經成為第四大療法。腫瘤生物治療中包括免疫治療、基因治療、干細胞治療、誘導腫瘤細胞分化及凋亡、抑制腫瘤新生血管治療等。免疫方法治療腫瘤,因其毒性較低而備受關注, 其中腫瘤疫苗的研制開發更是人們關注的焦點。
腫瘤疫苗主要通過激活患者自身免疫系統,利用腫瘤細胞或腫瘤抗原物質誘導機體的特異性細胞免疫和體液免疫反應,增強機體的抗癌能力,阻止腫瘤的生長、擴散和復發,以達到清除或控制腫瘤的目的。腫瘤疫苗大致可分為腫瘤細胞疫苗、腫瘤抗原及抗原類分子疫苗、核酸疫苗、重組病毒、病菌疫苗以及樹突狀細胞(dendritic cell,DC)疫苗。腫瘤細胞疫苗是從機體腫瘤組織中提取腫瘤細胞,滅活處理后使腫瘤細胞喪失致瘤性,但仍保持其免疫原性,然后對機體進行免疫;腫瘤抗原及抗原類分子疫苗是利用腫瘤抗原或類抗原決定簇多肽、抗獨特型抗體制備的疫苗接種病人誘導免疫應答;核酸疫苗是指將含有編碼某種抗原蛋白基因序列的質粒作為疫苗,直接導入動物細胞內,通過宿主細胞的轉錄系統合成抗原蛋白,誘導宿主產生對該抗原蛋白的免疫應答,從而使被接種動物獲得相應的免疫保護;重組病毒、病菌疫苗以及樹突狀細胞疫苗是指人們將攜帶編碼腫瘤抗原、細胞因子、共刺激分子的基因的病毒接種患者,通過他們在體內的表達誘發機體針對腫瘤的免疫應答;樹突狀細胞疫苗是指被激活的來源于骨髓的樹突細胞在細胞表面表達高水平的MHC I、MHC II及細胞間黏附因子和B7,并能激活初始T細胞增殖,誘導免疫應答。
雖然國內外對腫瘤疫苗的相關研究很多,但到目前為止取得突破性進展的卻不多見,存在的主要問題有:將DNA導入到特定細胞進行表達這一技術尚不成熟,并且使用外源DNA的安全性問題尚未解決;由于腫瘤細胞呈現高度異質性,屬于同一類型腫瘤的多個瘤細胞上可以表達不同的抗原,由一種腫瘤抗原所激活的T細胞只能殺傷一部分的腫瘤細胞,不表達該抗原的瘤細胞則不能被殺傷;腫瘤細胞疫苗雖然可以包含幾乎全部的腫瘤抗原,但目前的研究表明其激活T細胞的作用有限,將其作為疫苗的效果并不理想。
exosomes是一類起源于內吞體系統并被排出于細胞外,直徑在40-100nm之間的雙層膜性囊泡。exosomes可以由包括樹突狀細胞、腫瘤細胞等在內的多種細胞分泌。含有大量與其來源和功能密切相關的蛋白質和脂質成分,做為細胞間傳遞信息的重要載體,參與多種病理生理過程。腫瘤細胞來源的exosomes含有腫瘤共同抗原、熱體克蛋白等重要的免疫分子,可以通過多種途徑表現出抗腫瘤的作用,且其做為一種新型的腫瘤疫苗,較DC疫苗有明顯的優勢。
exosomes是由細胞內的多泡體(multivesicular bodies,MVB)與細胞膜融 合后,釋放到細胞外環境中的囊泡,可由多種細胞分泌,如樹突狀細胞、B細胞、T細胞、肥大細胞、腫瘤細胞等。exosomes可表達抗原呈遞相關分子MHCI和MHCII類分子,并帶有相關的腫瘤抗原信息,具有抗原提呈能力。不同細胞來源的exosomes所含蛋白不同,其功能也不相同。exosomes除含有細胞非特異性蛋白成分外,還含有腫瘤抗原如MAGE,NY-ESO-1及抗原遞呈過程中的分子伴侶-熱休克蛋白(heat shock protein,HSP),可作為新的腫瘤抗原,呈遞給DC而活化產生腫瘤特異性CD8+T細胞免疫反應,且這種免疫效應具有交叉治療作用。此外,exosomes為非細胞結構,理化性質穩定、耐高溫、制備時可質控,較細胞性瘤苗更具優越性。
然而,近年來卻有一些相關實驗顯示,一些腫瘤來源的exosomes可以抑制甚至是破壞在腫瘤中發揮作用的免疫細胞,比如下調一些NK受體的表達,影響到腫瘤免疫中一些固有免疫細胞的激活,還有的可以顯著抑制IL-2從而抑制人類淋巴細胞的增殖,因而在腫瘤的免疫治療中起到一些負面作用。這些由腫瘤來源的exosomes可能就是腫瘤組織逃逸機體免疫系統清除的關鍵因素,給腫瘤的免疫治療帶來很多困難和挑戰。因此,如何提高腫瘤細胞來源exosomes的免疫刺激能力,而減少它的免疫抑制能力在腫瘤的免疫治療中有重大的實際意義。
本發明創造性的用普魯卡因聯合MS-275處理肝癌細胞系H22細胞獲得其分泌的exosomes,結果顯示,未經本發明藥物組合物處理的肝癌細胞H22分泌的納米級小囊泡——exosomes對淋巴細胞增殖功能具有顯著的抑制作用;而經本發明藥物組合物處理肝癌細胞系H22細胞分泌的exosomes能顯著改善這種抑制作用。本發明提供的藥物組合物顯著提高exosomes治療腫瘤效果,具有重要的臨床應用價值。
發明內容
本發明的目的在于提供一種藥物組合物及其用途。
本發明的目的在于提供一種藥物組合物,所述藥物組合物包含DNA甲基轉移酶抑制劑和組蛋白去乙酰化酶抑制劑。
作為本領域的基本知識,DNA甲基轉移酶抑制劑是指能抑制DNA甲基轉移酶活性,阻斷DNA的高度甲基化來抑制或殺死腫瘤細胞的化合物。正在研究開發的DNA甲基轉移酶抑制劑較多,其化學結構主要有核苷及非核苷兩大類,按作用機 制分為:摻入DNA并與DNA甲基轉移酶共價結合;非共價地阻斷DNA甲基轉移酶的活性位點;干擾DNA甲基轉移酶與DNA的結合位點;抑制DNA甲基轉移酶的基因表達等。
作為本領域的基本知識,組蛋白去乙酰化酶抑制劑是指通過調節組蛋白N-端的賴氨酸殘基的乙酰化和去乙酰化,激活抑癌基因,抑制癌癥基因,從而抑制腫瘤細胞生長,誘導腫瘤細胞凋亡的一類化合物。
所述藥物處理腫瘤細胞優選采用常見的DNA甲基轉移酶抑制劑(DNAmethyltransferase inhibitor,DNMTi)進行處理。常見的DNA甲基轉移酶抑制劑包括但不限于:阿扎胞苷(5-azacytidine)、5-氮雜-2’-脫氧胞苷(又名地西他濱decitabine)、Zebularine、5-F-CdR、Hydralazine、SGI-1027、RG108、EGCC、普魯卡因胺(procainamide)、普魯卡因(procaine)、MG-98、Psammaplin A、姜黃素(curcumin)等。
所述藥物處理腫瘤細胞優選采用常見的組蛋白去乙酰化酶抑制劑(histone deacetylase inhibitor,HDACi)進行處理。常見的組蛋白去乙酰化酶抑制劑包括但不限于:丁酸、戊酸和苯丁酸及其鹽類化合物、曲古抑菌素(trichostatin A,TSA)、MS-275(suberoylanilide hydroxamic)、NVP-LAQ824、Pyroxamide、CBHA、Oxamflatin、Scriptaid、MM232、Trapoxin、Apicidin、FK228、WF3161、CHAP31、HC-toxin、LBH589、PDX-101、Tubacin、ACY-1215、MGCD0103、MS-275、Pomidepsin、Plitidepsin等。
進一步藥物組合物優選DNA甲基轉移酶抑制劑普魯卡因和組蛋白去乙酰化酶抑制劑MS-275。
更進一步優選藥物組合物DNA甲基轉移酶抑制劑普魯卡因和組蛋白去乙酰化酶抑制劑MS-275摩爾比1∶1。
本發明提供一種exosomes腫瘤疫苗的制備方法,包括藥物處理腫瘤細胞,分離與純化腫瘤細胞分泌的exosomes。
進一步優選采用含有普魯卡因和MS-275的藥物組合物處理腫瘤細胞獲得exosomes腫瘤疫苗。
進一步的,所述腫瘤細胞包括卵巢癌細胞、黑色素瘤細胞、乳腺癌細胞、肺癌細胞、胃癌細胞、結腸癌細胞、肝癌細胞、膀胱癌細胞、白血病細胞或膠質瘤細胞。
優選加藥后12-48小時后收集上清液,更優選24小時后收集上清液。
優選通過可行的方法使所收集的exosomes的粒徑基本為40-100納米的微顆粒。更優選的,將收集到的腫瘤細胞培養上清液以300g離心10min去除細胞,取上清液;以1500g離心30min去除細胞碎片,收集上清液,通過100kU MWCOCentriplus離心超濾管濃縮超濾,以1500g離心30min得到6ml濃縮液,將分離純化的濃縮液移至1.5ml的離心管中,4℃下用水平轉角以100kg超速離心60min所得沉淀即含有exosomes。
優選的exosomes腫瘤疫苗的制備方法,包括:腫瘤細胞用含100ml/L胎牛血清的DMEI培養液,在37℃50ml/L CO2孵箱中培養,細胞呈單層貼壁生長,每3-4天傳代1次,待細胞生長至對數期時,按3×106/100ml接種;接種24h后用1×10-6mol/L的藥物組合物處理,分別在加藥后24h收集培養上清液,并4℃保存。將收集到的腫瘤細胞培養上清液以300g離心10min去除細胞,取上清液;以1500g離心30min去除細胞碎片,收集上清液,通過100kU MWCO Centriplus離心超濾管濃縮超濾,以1500g離心30min得到6ml濃縮液,將分離純化的濃縮液移至1.5ml的離心管中,4℃下用水平轉角以100kg超速離心60min所得沉淀即含有exosomes。
本發明提供的腫瘤疫苗可以是任何適于臨床應用的劑型和用藥規格,例如,可以是注射劑。所述腫瘤疫苗的制備方法還包括按照常規的疫苗制備方法制成所需要的劑型,例如制成注射劑,可以是通過加入生理鹽水制成注射針劑,也可以制成粉針劑等。
進一步的,exosomes腫瘤疫苗加入相應佐劑。
進一步的,所述佐劑為鋁佐劑。
本發明提供的腫瘤疫苗可以通過皮下或肌肉注射給藥,對個體進行免疫,以抑制腫瘤發生或殺傷腫瘤細胞。
本發明提供所述腫瘤疫苗在制備抗腫瘤藥物中的應用。
進一步所述抗腫瘤可以是抗血癌、骨癌、淋巴癌、腸癌、肝癌、胃癌、盆腔癌、肺癌、腦癌、神經癌、乳腺癌、食道癌、腎癌的一種或幾種。
進一步所述的抗腫瘤為抗肝癌。
本發明提供的方案具有以下優點:
(1)本發明提供的藥物組合物制備的腫瘤疫苗抗原譜廣泛、全面,能實現 對幾乎所有腫瘤細胞的有效殺傷。
(2)本發明提供的藥物組合物制備的腫瘤疫苗,對機體的毒副作用小,使用安全。
(3)本發明提供的藥物組合物制備的腫瘤疫苗,可以作為治療性疫苗也可以作為預防性疫苗,在不同的腫瘤治療階段使用,通過激活機體免疫系統,預防腫瘤的發生或對已有腫瘤細胞進行有效殺傷。
附圖說明
圖1exosomes小體電鏡圖
具體實施方式
下面詳細描述本發明的實施例僅用于解釋本發明,而不能理解為對本發明的限制,應當指出,對于本技術領域的普通技術人員來說,在不脫離本發明原理的前提下,還可以做出若干改進,這些改進也應視為本發明的保護范圍。
實施例1細胞培養
實驗材料:H22細胞株、10%胎牛血清、青鏈霉素混合液(北京泰格美公司)。
實驗方法:將H22細胞株培養于含10%胎牛血清、青霉素100IU/mL、鏈霉素10O×μg/mL的培養液中,在37℃5%CO2孵箱中培養,待細胞生長至對數期時,按3×106/100ml接種。
實施例2藥物處理
實驗材料:普魯卡因、MS-275(均購自sigma公司)。
實驗分組:細胞培養液體積每組嚴格一致,空白對照組、exosomes對照組(不加藥組)、exosomes實驗組1(加藥普魯卡因)、exosomes實驗組2(加藥MS-275)、exosomes實驗組3(普魯卡因和MS-275聯合加藥)。
實驗方法:對照組,接種后不加藥物,24h后收集上清液150ml作為對照;加藥組1,接種24h后用濃度1×10-6mol/L的普魯卡因處理,分別在加藥后24h收集培養上清液各150ml;加藥組2,接種24h后用濃度1×10-6mol/L的MS-275處理,分別在加藥后24h收集培養上清液各150ml;加藥組3,接種24h后用1×10-6mol/L 的普魯卡因和1×10-6mol/L的MS-275處理,分別在加藥后24h收集培養上清液各150ml,并4℃保存。
實施例3exosomes的分離與純化
實驗儀器:HMAC-CP70G低溫超高速離心機,100KU MW CO Millipore Amicon高回收率高流速切向流超濾離心管(Millipore公司)。
實驗方法:將收集到的實驗組和對照組細胞培養上清液以300g離心10min去除細胞,取上清液;以1500g離心30min去除細胞碎片,收集上清液,通過100kUMWCO Centriplus離心超濾管濃縮超濾,以1500g離心30min得到6ml濃縮液,將分離純化的濃縮液移至1.5ml的離心管中,4℃下用水平轉角以100kg超速離心60min所得沉淀即含有exosomes。
實施例4exosomes的電鏡鑒定
滴20-30μl exosomes懸液于載樣銅網上,室溫靜置lmin用濾紙從側而吸干液體,滴加20ml/L磷鎢酸溶液(pH6.8)約30μl于銅網上,室溫負染lmin濾紙吸干負染液,室溫下晾干約lOmin透射電鏡下觀察照相。結果如圖1所示。電鏡下H22細胞分泌的exosomes小體直徑為30-80nm的膜性微囊結構,呈圓形或橢圓形,腔內為低電子密度成分。(增加結果的描述及討論部分)
實施例5H3-TdR摻入法檢測PBMC細胞增殖狀況
實驗材料:H3-TdR(上海原子核研究所)、青鏈霉素混合液(北京泰格美公司)、胎牛血清
實驗儀器:β-液體閃爍計數器測量(FJ-2107G型)
實驗分組:空白對照組(只加植物凝集素和PBMC細胞)、exosomes對照組(不加藥組)、exosomes實驗組1(加藥普魯卡因)、exosomes實驗組2(加藥MS-275)、exosomes實驗組3(普魯卡因和MS-275聯合加藥)、exosomes提取后上清對照組(不加藥組),exosomes提取后上清實驗組1(加藥普魯卡因)、exosomes提取后上清實驗組2(加藥MS-275)、exosomes提取后上清實驗組3(普魯卡因和MS-275聯合加藥),每組分為三復孔。
實驗方法:分離好的PBMC細胞加入5ml含10%胎牛血清的新鮮RPMI1640培養基, 細胞計數后,稀釋為5000個/50微升,按照先前做好的標記,以50微升/孔加入96孔板中,同時以1∶1000的比例加入青霉素100IU/mL、鏈霉素10O×μg/mL的混合液,再加入50μl樣本,最后加入100μlIPHA。放入37℃50%CO2孵箱過夜,第二天可在lO×的倒置顯微鏡下觀察到PBMC細胞呈團狀增殖,將H3-TdR加入培養板中,每孔3.7×104個Bq繼續培養6h后,去培養基,用1×PBS洗3次,lmol/L的NaOH破細胞膜,加入閃爍液及適量反淬滅劑,用β-液體閃爍計數器測量,記錄cpm值(分鐘計數)。結果如表1所示。
表1經聯合藥物處理前后的exosomes及提取后的上清對PBMC細胞增殖的影響
組別組數cpm值(X±S)空白對照324016±2001.25exosomes對照組33635±19.98exosomes實驗組1319012±775.62exosomes實驗組2319125±763.51exosomes實驗組3323768±701.21exosomes提取后上清對照組32987±501.99exosomes提取后上清實驗組1321532±6482.36exosomes提取后上清實驗組2320461±6621.89exosomes提取后上清實驗組3323998±6006.21
結果顯示:與空白對照組相比,未經過藥物處理的exosomes與PBMC細胞共培養后,對淋巴細胞增殖有顯著影響,明顯降低(P<0.05);經過藥物處理,可明顯改善exosomes對淋巴細胞增殖功能的抑制,其中經藥物組合物處理后獲得的exosomes(exosomes實驗組3)對淋巴細胞增殖功能的抑制最小,明顯小于單獨藥物處理后獲得exosomes(exosomes實驗組1和exosomes實驗組2)對淋巴細胞增殖的抑制,PBMC增殖值與exosomes對照組比較統計學存在顯著差異(P<0.05),與空白對照組比較無顯著差異(P>0.05)。在實驗組,經exosomes提取后的藥物處理的上清液與PBMC細胞共培養后,對細胞增殖幾乎無影響,與空白對照組比較無顯著統計學差異(P>0.05),未經藥物處理的上清液則對淋巴細胞增殖功能有顯著性影響,與空白對照組或上清實驗組相比統計學上均有顯著 差異(P<0.05)。
實施例6體內抑瘤實驗
實驗材料:健康昆明系小鼠,小鼠肝癌細胞(H22),RPMI1640培養基(購自GIBCO),胎牛血清
實驗方法:
(1)建立荷瘤鼠模型:無菌操作取H22小鼠腹水,臺盼藍染色,光鏡下瘤細胞計數,活瘤細胞9000,調整細胞濃度為1×107個/ml,于每只小鼠右腋皮下接種0.2ml,制成實體型荷瘤鼠模型。
(2)制備腫瘤疫苗:根據所述實施例1進行細胞培養;將培養的細胞分為4組,第一組不加藥,第二組加藥普魯卡因,第三組加藥MS-275,第四組普魯卡因和MS-275聯合加藥,具體加藥處理參照實施例2;將收集到的各組細胞培養上清液參照實施例3制備exosomes腫瘤疫苗。
(3)分組和治療:將小鼠30只隨機分為5組,每組各6只。空白對照組:荷瘤小鼠腹腔注射生理鹽水;exosomes對照組:腫瘤細胞接種當天,于小鼠腿根部皮下注射第一組制備的腫瘤疫苗(10μg/只);exosomes實驗組1:腫瘤細胞接種當天,于小鼠腿根部皮下注射第二組制備的腫瘤疫苗(10μg/只);exosomes實驗組2:腫瘤細胞接種當天,于小鼠腿根部皮下注射第三組制備的腫瘤疫苗(10μg/只);exosomes實驗組3:腫瘤細胞接種當天,于小鼠腿根部皮下注射第四組制備的腫瘤疫苗(10μg/只)。每間隔1天重復1次,共3次。所有小鼠在接種腫瘤后第15天處死,取瘤體,稱重、測腫瘤體積,計算瘤重抑制率、腫瘤體積抑制率。
(4)稱取腫瘤重量并計算腫瘤抑制率
小鼠處死后,分別取出腫瘤瘤體,剝離干凈后,以濾紙拭凈血污,電子天平稱取瘤重,計算抑瘤率:
抑瘤率(%)=(對照組腫瘤大小-治療組腫瘤大小)/對照組腫瘤大小×100%。
表2腫瘤疫苗對肝癌移植瘤的抑制作用
實驗分組腫瘤平均質量空白對照組2.78±0.29exosomes對照組1.76±0.16
exosomes實驗組11.32±0.14exosomes實驗組21.29±0.17exosomes實驗組30.97±0.13
采用exosomes腫瘤疫苗治療后肝癌移植瘤生長受到抑制,exosomes實驗組1、exosomes實驗組2、exosomes實驗組3瘤質量分別為(1.32±0.14)g、(1.29±0.17)g、(0.99±0.13)g,與空白對照組(2.78±0.29)g、exosomes對照組、(1.76±0.16)g比差異顯著(P<0.05),普魯卡因和MS-275聯合加藥制備的腫瘤疫苗抑制作用最強,瘤質量為(0.99±0.13)g,抑瘤率達65.11%。
本發明創造性提供了一種藥物組合物,使用該藥物組合物處理腫瘤細胞,處理后的腫瘤細胞分泌的exosomes能顯著改善原exosomes對淋巴細胞增殖功能的抑制作用。動物實驗表明,采用本發明藥物組合物處理制備的exosomes腫瘤疫苗治療效果顯著,具有重要的臨床應用價值。

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