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一種生產白術脫毒苗的方法.pdf

摘要
申請專利號:

CN201410041675.0

申請日:

2014.01.28

公開號:

CN103749309B

公開日:

2015.01.14

當前法律狀態:

有效性:

法律詳情: 授權|||實質審查的生效IPC(主分類):A01H 4/00申請日:20140128|||公開
IPC分類號: A01H4/00 主分類號: A01H4/00
申請人: 貴州師范大學
發明人: 薛興華; 龔寧; 田靜; 乙引; 趙霰霖; 洪鯤
地址: 550001 貴州省貴陽市寶山北路116號
優先權:
專利代理機構: 貴陽東圣專利商標事務有限公司 52002 代理人: 蘭艷文
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法律狀態
申請(專利)號:

CN201410041675.0

授權公告號:

103749309B||||||

法律狀態公告日:

2015.01.14|||2014.06.04|||2014.04.30

法律狀態類型:

授權|||實質審查的生效|||公開

摘要

一種生產白術脫毒苗的方法,包括1.白術種子的預處理及其胚的無菌萌發:將白術胚接種于初代培養基中:1/2MS+蔗糖20g/L+瓊脂粉6g/L;2.增殖培養:增殖培養基為:MS+1.0mg/L6-BA+0.2mg/LNAA+30g/L蔗糖+瓊脂粉6g/L;3.病毒檢測:將含病毒的白術苗舍去,不含病毒的白術苗繼續增殖培養;4.生根培養:將培養到4cm左右的白術組培無根苗直立插入到生根培養基中:1/2MS+1.0mg/LNAA+20g/L蔗糖+6g/L瓊脂粉;5.煉苗移栽。本發明通過單因素試驗,獲得了白術的初代培養基配方和生根培養基配方,通過正交設計獲得白術組培苗增殖培養基配方,最重要的是本發明利用種胚部分不含病毒的事實通過胚培養獲得白術脫毒苗。

權利要求書

權利要求書
1.   一種生產白術脫毒苗的方法,其特征在于:包括以下操作流程:

1.  白術種子的預處理及其胚的無菌萌發:購買的白術種子的處理方式為:蒸餾水浸泡12h,然后在超凈工作臺上用75%酒精浸泡60s,無菌水沖洗2-3次,再置于10%次氯酸鈉溶液中10min,期間攪拌,無菌水沖洗5-6次,傾盡無菌水待用;使用經過高壓滅菌的槍狀鑷和醫用鑷子將消過毒的白術種子置于無菌皿中去皮剖開,并拔取種胚部分,將白術胚接種于初代培養基中:1/2MS+蔗糖20g/L+瓊脂粉6g/L,培養于光照12h/天,光強2000lx,溫度21±2℃的培養室中;接種一周后,觀察到種胚開始萌發;

2.  增殖培養:培養40-60天待苗長到2-3cm左右,在超凈工作臺上將苗從培養瓶中取出,置于無菌皿中,修剪后轉接到增殖培養基中:MS+1.0mg/L6-BA+0.2mg/LNAA+30g/L蔗糖+瓊脂粉6g/L,培養于光照12h/天,光強2000lx,溫度21±2℃的培養室中;40d后,統計得平均增殖倍率達到3.5;

3.  病毒檢測:將增殖苗從培養瓶移出,剪取0.2g莖葉進行病毒檢測,采用ELISA檢測法,步驟如下:
1)將待檢樣品加入盛有通用緩沖液GEB的研缽充分研磨,然后用移液槍移取100μL于聚苯乙烯板的反應孔中,同時做陽性、陰性及空白對照孔,4℃過夜;次日,棄去孔內溶液,用磷酸鹽吐溫緩沖液PBST潤洗3次,每次3min;
2)加封閉液脫脂奶粉ECM,每個反應孔200μL,置于37℃孵育1h;1h后,用PBST緩沖液潤洗3次,每次3min;
3)加新鮮稀釋的抗體,在每個反應孔中加100μL,置于37℃孵育2h;2h后,用PBST緩沖液潤洗7-8次,每次3min;
4)于各反應孔中加入新鮮稀釋的酶標抗體100μL,置于25℃孵育2h;2h后,用PBST緩沖液潤洗7-8次,每次3min;
5)于各反應孔中加入堿性磷酸酯酶PNP底物溶液100μL,置于37℃進行暗培養,過夜;
6)結果檢測:在酶標儀上,于405nm處,以空白對照孔調零后測各個反應孔的OD值,若大于陰性對照OD值的2倍,則為陽性;
ELISA檢測結果顯示,90%的胚培養苗不含病毒,將含病毒的白術苗舍去,不含病毒的白術苗繼續增殖培養;

4.  生根培養:在超凈工作臺上,將培養到4cm左右的白術組培無根苗直立插入到生根培養基中:1/2MS+1.0mg/LNAA+20g/L蔗糖+6g/L瓊脂粉,培養于光照12h/天,光強2000lx,溫度21±2℃的培養室中;一個月后,組培苗平均生根數可高達8條/株;

5.  煉苗移栽:當白術組培苗根長≥1cm時,將培養瓶從組培室移出,置于煉苗室常溫閉瓶煉苗4d,旋松蓋子2d,半開蓋子2d,全開蓋2d;煉苗完成后,將白術苗從培養瓶移出,放入清水盆中,小心洗去根部瓊脂,然后撈出,移栽于盛有松針土的花盆中,澆透水,每天早晚清水噴灑葉面保濕,一周后減少噴水次數;一個月后,統計成活率可以達到92%以上。

說明書

說明書一種生產白術脫毒苗的方法
技術領域
本發明屬于植物脫毒與組織培養快繁技術領域,具體說涉及一種生產白術脫毒苗的技術方法。
背景技術
白術(Atractylodes macrocephala Koidz),多年生菊科(Asteraceae)蒼術屬草本植物,是中醫“參、術、苓、甘”四大名貴藥材之一,其干燥根莖,具有健脾益氣、燥濕利水、止汗安胎之效,為常用的補益類中藥,俗有 “十方九術”之說。由于白術應用廣,市場需求量大,白術在全國各地均有推廣種植。
然而在白術的栽培中常受到病蟲害危害,特別是在高溫高濕的天氣,有時整片死亡甚至絕收,造成無法挽回的經濟損失。白術的病害有細菌病害、真菌病害和病毒病害。病毒病害的防治與細菌和真菌病害完全不同,沒有防治的特效藥劑, 通常采用脫毒的方法來達到防治目的。因此白術脫毒苗的生產是最大限度降低病毒病害的有效措施。
  病毒在植株體內的積累很大程度上影響植株的品質和產量,對植株的生產和利用造成極大的危害。
常規的莖尖脫毒,為最廣泛的脫毒手段之一,除操作繁瑣外,還存在脫毒率與成活率相矛盾的問題,即若想得到較高的脫毒率需要將莖尖周圍的幼葉等組織剝除,僅留生長錐部分進行培養,但這樣的材料成活率很低,有時甚至為零,若想提高成活率則需要用較大的莖尖進行培養,這又會使脫毒率不理想。
近年來,雖然有文獻對白術的組培快繁技術進行了研究,但都屬于常規的組培,對于如何生產白術脫毒苗的研究還未見報道。
發明內容
本發明的目的在于解決白術病毒病的危害,提供一種白術脫病毒組培苗的生產方法,建立白術組培脫毒的技術體系。本發明基于白術種胚部分不含病毒的檢測結果,將種胚分離出來進行培養,以獲得脫病毒苗,提高白術種苗品質。
本發明的目的及解決其主要技術問題是采用以下技術方案來實現的:一種生產白術脫毒苗的方法,包括以下操作流程:
1.白術種子的預處理及其胚的無菌萌發:購買的白術種子的處理方式為:蒸餾水浸泡12h,然后在超凈工作臺上用75%酒精浸泡60s,無菌水沖洗2-3次,再置于10%次氯酸鈉溶液中10min,期間攪拌,無菌水沖洗5-6次,傾盡無菌水待用;使用經過高壓滅菌的槍狀鑷和醫用鑷子將消過毒的白術種子置于無菌皿中去皮剖開,并拔取種胚部分,將白術胚接種于初代培養基中:1/2MS+蔗糖20g/L+瓊脂粉6g/L,培養于光照12h/天,光強2000lx,溫度21±2℃的培養室中;接種一周后,觀察到種胚開始萌發;
2.增殖培養:培養40-60天待苗長到2-3cm左右,在超凈工作臺上將苗從培養瓶中取出,置于無菌皿中,修剪后轉接到增殖培養基中:MS+1.0mg/L6-BA+0.2mg/LNAA+30g/L蔗糖+瓊脂粉6g/L,培養于光照12h/天,光強2000lx,溫度21±2℃的培養室中;40d后,統計得平均增殖倍率達到3.5;
3.病毒檢測:將增殖苗從培養瓶移出,剪取0.2g莖葉進行病毒檢測,采用ELISA檢測法,步驟如下:
1)將待檢樣品加入盛有通用緩沖液GEB的研缽充分研磨,然后用移液槍移取100μL于聚苯乙烯板的反應孔中,同時做陽性、陰性及空白對照孔,4℃過夜;次日,棄去孔內溶液,用磷酸鹽吐溫緩沖液PBST潤洗3次,每次3min;
2)加封閉液脫脂奶粉ECM,每個反應孔200μL,置于37℃孵育1h;1h后,用PBST緩沖液潤洗3次,每次3min;
3)加新鮮稀釋的抗體,在每個反應孔中加100μL,置于37℃孵育2h;2h后,用PBST緩沖液潤洗7-8次,每次3min;
4)于各反應孔中加入新鮮稀釋的酶標抗體100μL,置于25℃孵育2h;2h后,用PBST緩沖液潤洗7-8次,每次3min;
5)于各反應孔中加入堿性磷酸酯酶PNP底物溶液100μL,置于37℃進行暗培養,過夜;
6)結果檢測:在酶標儀上,于405nm處,以空白對照孔調零后測各個反應孔的OD值,若大于陰性對照OD值的2倍,則為陽性;
ELISA檢測結果顯示,90%的胚培養苗不含病毒,將含病毒的白術苗舍去,不含病毒的白術苗繼續增殖培養;
4.生根培養:在超凈工作臺上,將培養到4cm左右的白術組培無根苗直立插入到生根培養基中:1/2MS+1.0mg/LNAA+20g/L蔗糖+6g/L瓊脂粉,培養于光照12h/天,光強2000lx,溫度21±2℃的培養室中;一個月后,組培苗平均生根數可高達8條/株;
5.煉苗移栽:當白術組培苗根長≥1cm時,將培養瓶從組培室移出,置于煉苗室常溫閉瓶煉苗4d,旋松蓋子2d,半開蓋子2d,全開蓋2d;煉苗完成后,將白術苗從培養瓶移出,放入清水盆中,小心洗去根部瓊脂,然后撈出,移栽于盛有松針土的花盆中,澆透水,每天早晚清水噴灑葉面保濕,一周后減少噴水次數;一個月后,統計成活率可以達到92%以上。
 
本發明與現有技術相比具有明顯的優點和有益效果。由以上技術
方案可知,本發明通過單因素試驗,獲得了白術的初代培養基配方和生根培養基配方,通過正交設計獲得白術組培苗增殖培養基配方,最重要的是本發明利用種胚部分不含病毒的事實通過胚培養獲得白術脫毒苗,胚培養避免了莖尖脫毒存在的問題,不僅操作簡便,而且成活率和脫毒率均較高,簡化了脫毒過程,建立了胚培養獲得白術脫毒苗的技術體系,為解決白術的病毒危害問題奠定了基礎。
具體實施方式
以下結合較佳實施例,對依據本發明提出的一種生產白術脫毒苗的方法具體實施方式、特征及其功效,詳細說明如后。
一種生產白術脫毒苗的方法,包括以下操作流程:
1.白術種子的預處理及其胚的無菌萌發:購買的白術種子的處理方式為:蒸餾水浸泡12h,然后在超凈工作臺上用75%酒精浸泡60s,無菌水沖洗2-3次,再置于10%次氯酸鈉溶液中10min,期間攪拌,無菌水沖洗5-6次,傾盡無菌水待用;使用經過高壓滅菌的槍狀鑷和醫用鑷子將消過毒的白術種子置于無菌皿中去皮剖開,并拔取種胚部分,將白術胚接種于初代培養基中:1/2MS+蔗糖20g/L+瓊脂粉6g/L,培養于光照12h/天,光強2000lx,溫度21±2℃的培養室中;接種一周后,觀察到種胚開始萌發;
2.增殖培養:培養40-60天待苗長到2-3cm左右,在超凈工作臺上將苗從培養瓶中取出,置于無菌皿中,修剪后轉接到增殖培養基中:MS+1.0mg/L6-BA+0.2mg/LNAA+30g/L蔗糖+瓊脂粉6g/L,培養于光照12h/天,光強2000lx,溫度21±2℃的培養室中;40d后,統計得平均增殖倍率達到3.5;
3.病毒檢測:將增殖苗從培養瓶移出,剪取0.2g莖葉進行病毒檢測,采用ELISA檢測法,步驟如下:
1)將待檢樣品加入盛有通用緩沖液GEB的研缽充分研磨,然后用移液槍移取100μL于聚苯乙烯板的反應孔中,同時做陽性、陰性及空白對照孔,4℃過夜;次日,棄去孔內溶液,用磷酸鹽吐溫緩沖液PBST潤洗3次,每次3min;
2)加封閉液脫脂奶粉ECM,每個反應孔200μL,置于37℃孵育1h;1h后,用PBST緩沖液潤洗3次,每次3min;
3)加新鮮稀釋的抗體,在每個反應孔中加100μL,置于37℃孵育2h;2h后,用PBST緩沖液潤洗7-8次,每次3min;
4)于各反應孔中加入新鮮稀釋的酶標抗體100μL,置于25℃孵育2h;2h后,用PBST緩沖液潤洗7-8次,每次3min;
5)于各反應孔中加入堿性磷酸酯酶PNP底物溶液100μL,置于37℃進行暗培養,過夜;
6)結果檢測:在酶標儀上,于405nm處,以空白對照孔調零后測各個反應孔的OD值,若大于陰性對照OD值的2倍,則為陽性;
ELISA檢測結果顯示,90%的胚培養苗不含病毒,將含病毒的白術苗舍去,不含病毒的白術苗繼續增殖培養;
4.生根培養:在超凈工作臺上,將培養到4cm左右的白術組培無根苗直立插入到生根培養基中:1/2MS+1.0mg/LNAA+20g/L蔗糖+6g/L瓊脂粉,培養于光照12h/天,光強2000lx,溫度21±2℃的培養室中;一個月后,組培苗平均生根數可高達8條/株;
5.煉苗移栽:當白術組培苗根長≥1cm時,將培養瓶從組培室移出,置于煉苗室常溫閉瓶煉苗4d,旋松蓋子2d,半開蓋子2d,全開蓋2d;煉苗完成后,將白術苗從培養瓶移出,放入清水盆中,小心洗去根部瓊脂,然后撈出,移栽于盛有松針土的花盆中,澆透水,每天早晚清水噴灑葉面保濕,一周后減少噴水次數;一個月后,統計成活率可以達到92%以上。
 本發明是通過單因素試驗,獲得白術的初代培養基配方和生根培養基配方,通過正交設計獲得白術組培苗增殖培養基配方,最重要的是本發明利用種胚部分不含病毒的檢測結果,通過胚培養獲得白術脫毒苗,簡化脫毒過程,具體地:
其中:白術種子及其各部位的病毒檢測,采用ELISA檢測法,步驟如下:
將購買的白術種子用蒸餾水浸泡12h后,使用槍狀鑷和醫用鑷子將每個種子的種皮、子葉和胚分離開來,對種子、種皮、子葉和胚進行3次重復的ELISA檢測。
1)將待檢樣品加入盛有GEB(通用緩沖液)的研缽充分研磨,然后用移液槍移取100μL于聚苯乙烯板的反應孔中,同時做陽性、陰性及空白對照孔,4℃過夜。次日,棄去孔內溶液,用PBST(磷酸鹽吐溫緩沖液)潤洗3次,每次3min。
2)加封閉液ECM(脫脂奶粉),每個反應孔200μL,置于37℃孵育1h。1h后,用PBST緩沖液潤洗3次,每次3min。
3)加新鮮稀釋的抗體,在每個反應孔中加100μL,置于37℃孵育2h。2h后,用PBST緩沖液潤洗7-8次,每次3min。
4)于各反應孔中加入新鮮稀釋的酶標抗體100μL,置于25℃孵育2h。2h后,用PBST緩沖液潤洗7-8次,每次3min。
5)于各反應孔中加入臨時配制的PNP(堿性磷酸酯酶)底物溶液100μL,置于37℃進行暗培養,過夜。
6)結果檢測:在酶標儀上,于405nm處,以空白對照孔調零后測各個反應孔的OD值,若大于陰性對照OD值的2倍,則為陽性。
種子及各部位的ELISA檢測結果見表1。從表1可知,河北安國張步鄉村和浙江磐安產地的種子及子葉部位均檢出含有病毒PVX(馬鈴薯X病毒)、ORSV(齒蘭環斑病毒)和CYMV(劍蘭花葉病毒),河南焦作種子及子葉部位檢出含有病毒PVX、ORSV,不含CYMV;三個產地的種皮和胚部分均未檢出含有病毒PVX、ORSV和CYMV。因此,在本發明中,采用胚培養獲取白術脫毒苗。
 

其中:白術種子處理和胚的無菌萌發,除種子預處理和初代培養基不同外,其余處理方式相同。
購買的白術種子的預處理方式有6種,見表2。
           

然后在超凈工作臺用75%酒精浸泡60s,無菌水沖洗2-3次,再置于10%次氯酸鈉溶液中10min,期間攪拌,無菌水沖洗5-6次,傾盡無菌水待用。使用經過高壓滅菌的槍狀鑷和醫用鑷子將消過毒的白術種子置于無菌皿中去皮剖開,并拔取種胚部分,將白術的胚接種于表3所述的初代培養基中,培養于光照12h/天,光強2000lx,溫度21±2℃的組培室中。一個月后,統計各種處理的成活率,統計分析結果見表4.


從表4可知,成活率A組>C4組和E2組>B組>其他處理組,整體比較可以看出,病毒唑的加入一定程度上抑制了種胚的萌發,但加入量和抑制作用沒有正相關性。
白術胚培養苗經擴繁后,采用ELISA進行病毒檢測。于超凈工作臺上將苗從培養瓶移出,剪取0.2g莖葉進行病毒檢測,步驟如下:
1)將待檢樣品加入盛有GEB(通用緩沖液)的研缽充分研磨,然后用移液槍移取100μL于聚苯乙烯板的反應孔中,同時做陽性、陰性及空白對照孔,4℃過夜。次日,棄去孔內溶液,用PBST(磷酸鹽吐溫緩沖液)潤洗3次,每次3min。
2)加封閉液ECM(脫脂奶粉),每個反應孔200μL,置于37℃孵育1h。1h后,用PBST緩沖液潤洗3次,每次3min。
3)加新鮮稀釋的抗體,在每個反應孔中加100μL,置于37℃孵育2h。2h后,用PBST緩沖液潤洗7-8次,每次3min。
4)于各反應孔中加入新鮮稀釋的酶標抗體100μL,置于25℃孵育2h。2h后,用PBST緩沖液潤洗7-8次,每次3min。
5)于各反應孔中加入臨時配制的PNP(堿性磷酸酯酶)底物溶液100μL,置于37℃進行暗培養,過夜。
6)結果檢測:在酶標儀上,于405nm處,以空白對照孔調零后測各個反應孔的OD值,若大于陰性對照OD值的2倍,則為陽性。
白術胚培養苗的ELISA病毒檢測結果見表5。從表5可知,處理組A檢出率最高,處理組B、C、D和E均起到了一定的脫毒效果,即胚培養與病毒抑制劑的處理均起到了脫毒的效果,但是不同病毒的脫除率不同。對PVX來講,D組處理的脫除率較好,B組次之,C組和E組較差;而對ORSV和CYMV來講,B、C、E組處理的脫除率較好,D組較差。從簡便、節約、環保的角度綜合考慮,處理B(即通過用蒸餾水浸泡種子后,將胚接種于不含病毒唑的初代培養基)即可得到較高的脫毒率,此處理對PVX的脫除率可達90%,對ORSV和CYMV的脫除率高達100%。又處理B成活率較其他處理(除C4和E2外)的高,因此,本發明選擇處理B為適宜處理方式。
 

其中:增殖培養基的篩選:
通過正交試驗設計獲得白術苗增殖培養基配方,選擇6-BA、NAA、KT三個因素,分別設定三個濃度水平(見表6),采用L9(34)正交表(見表7)進行正交試驗以獲取白術組培苗增殖的適宜培養基配方。基本培養基均為MS,各組均添加30g/L蔗糖和6g/L瓊脂粉,pH值為5.8。
 


白術增殖的正交試驗共有9組處理,各處理除增殖培養基不同外,其余處理方式都相同,如下:
白術種子的預處理及其胚的無菌萌發:購買的白術種子的處理方式為:蒸餾水浸泡12h。然后在超凈工作臺上用75%酒精浸泡60s,無菌水沖洗2-3次,再置于10%次氯酸鈉溶液中10min,期間攪拌,無菌水沖洗5-6次,傾盡無菌水待用。使用經過高壓滅菌的槍狀鑷和醫用鑷子將消過毒的白術種子置于無菌皿中去皮剖開,并拔取種胚部分,將白術胚接種于初代培養基(1/2MS+蔗糖20g/L+瓊脂粉6g/L)中,培養于光照12h/天,光強2000lx,溫度21±2℃的組培室中。
增殖培養:在超凈工作臺上將苗從培養瓶取出,修剪后轉接到表7所述的增殖培養基中,培養于光照12h/天,光強2000lx,溫度21±2℃的組培室中。
接種40天后,統計增殖數并計算增殖倍率,對試驗結果進行極差分析。白術苗增殖正交試驗結果及分析見表8,結果表明白術苗增殖培養基的最佳配方為MS+1.0mg/L6-BA+0.2mg/LNAA+30g/L蔗糖+瓊脂粉6g/L。
 

其中:白術生根試驗共有6組處理,各處理除生根培養基不同外,其余處理方式都相同,如下:
種子的預處理及其胚的無菌萌發:購買的白術種子的處理方式,為:蒸餾水浸泡12h。然后在超凈工作臺用75%酒精浸泡60s,無菌水沖洗2-3次,再置于10%次氯酸鈉溶液中10min,期間攪拌,無菌水沖洗5-6次,傾盡無菌水待用。使用經過高壓滅菌的槍狀鑷和醫用鑷子將消過毒的白術種子置于無菌皿中去皮剖開,并拔取種胚部分,將白術胚接種于初代培養基(1/2MS+蔗糖20g/L+瓊脂粉6g/L)中,培養于光照12h/天,光強2000lx,溫度21±2℃的組培室中。
增殖培養:培養50天后,在超凈工作臺上將苗從培養瓶取出,修剪后轉接到增殖培養基(MS+1.0mg/L6-BA+0.2mg/LNAA+30g/L蔗糖+瓊脂粉6g/L)中,培養于光照12h/天,光強2000lx,溫度21±2℃的組培室中。
生根培養:在超凈工作臺上,將培養到4cm左右的白術組培無根苗直立插入到表9所述的生根培養基中,培養于光照12h/天,光強2000lx,溫度21±2℃的組培室中。一個月后,統計白術組培苗的平均生根情況并進行分析,白術組培苗生根試驗所用的培養基配方及生根結果見表9。
 

由表9可知,處理2生根率遠遠高于其它處理組,為8.21,選擇處理2即1/2MS+0.5mg/LNAA+20g/L蔗糖+6g/L瓊脂粉為白術組培苗生根的適宜培養基配方。處理2生根苗煉苗移栽,30d后統計成活率可以達到92%以上。
 
本發明基于白術種胚部分不含病毒的檢測結果,利用胚培養生產脫毒苗,簡化了實驗過程,且經ELISA病毒檢測,胚培養苗的脫毒率達90%以上,將檢測結果含病毒的株系棄去,不含病毒的用于增殖培養,可生產出100%脫毒的組培苗。
本發明建立了白術脫毒培養的技術體系,為大規模生產無病毒種苗,促進白術產業健康發展奠定了基礎。
 
以上所述,僅是本發明的較佳實施例而已,并非對本發明作任何形式上的限制,任何未脫離本發明技術方案內容,依據本發明的技術實質對以上實施例所作的任何簡單修改、等同變化與修飾,均仍屬于本發明技術方案的范圍內。

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一種 生產 白術 脫毒 方法
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