• / 58
  • 下載費用:30 金幣  

控制水稻穗大小基因、其突變體及應用.pdf

摘要
申請專利號:

CN201210030466.7

申請日:

2012.02.10

公開號:

CN103243107B

公開日:

2015.01.21

當前法律狀態:

授權

有效性:

有權

法律詳情: 授權|||實質審查的生效IPC(主分類):C12N 15/29申請日:20120210|||公開
IPC分類號: C12N15/29; C12N15/63; C12N5/10; C07K14/415; A01H5/00 主分類號: C12N15/29
申請人: 中國科學院遺傳與發育生物學研究所
發明人: 傅向東; 劉正斌; 劉學英; 吳昆
地址: 100101 北京市朝陽區北辰西路1號院2號
優先權:
專利代理機構: 中科專利商標代理有限責任公司 11021 代理人: 王旭
PDF完整版下載: PDF下載
法律狀態
申請(專利)號:

CN201210030466.7

授權公告號:

103243107B||||||

法律狀態公告日:

2015.01.21|||2013.09.11|||2013.08.14

法律狀態類型:

授權|||實質審查的生效|||公開

摘要

本發明涉及控制水稻穗大小基因SSP1(Small?and?Sheathed?Panicle?1)及其突變基因ssp1,以及它們在調控植物株高、葉夾角和穗大小等方面的作用機理,其中來源于控制水稻穗大小基因突變體ssp1基因的序列SEQ?IDNO:3。本發明還涉及控制水稻穗大小基因突變體ssp1基因在大麥、小麥、玉米、高粱、大豆、棉花、油菜、或擬南芥等植物中的同源基因,它們統稱為控制穗大小基因。本發明還涉及SSP1基因和突變體ssp1基因在控制植物株高、提高耐倒伏能力、減小葉夾角提高光合效率、改變赤霉素響應抑制穗發芽等育種方面的應用。

權利要求書

權利要求書
1.   控制水稻穗大小基因突變體ssp1基因,其編碼的氨基酸序列為SEQ ID NO:4。

2.   根據權利要求1所述的控制水稻穗大小基因突變體ssp1基因,其核苷酸序列為SEQ ID NO:3。

3.   一種重組載體,其包含權利要求2所述的控制水稻穗大小基因突變體ssp1基因。

4.   一種轉基因植物細胞,其轉化了權利要求3所述的重組載體。

5.   根據權利要求4所述的轉基因植物細胞,其為下列植物的細胞:水稻、小麥、大麥、玉米、高粱、大豆、油菜、棉花、或擬南芥。

6.   根據權利要求5所述的轉基因植物細胞,其為水稻細胞。

7.   控制水稻穗大小基因突變體ssp1基因的應用,其用于培育具有植株半矮化提高抗倒伏能力、減小葉夾角提高光合效率、改變赤霉素響應抑制種子穗發芽的優點的農作物。

8.   一種培育植株矮化耐倒伏、改良農作物穗型和提高葉片光合效率的農作物的方法,其包括通過轉基因技術在所述農作物中組織特異性啟動子過量表達控制水稻穗大小基因SSP1基因或其突變體ssp1基因的步驟。

9.   根據權利要求8所述的方法,其中所述農作物包括水稻、小麥、大麥、玉米、高粱、大豆、油菜、棉花、或擬南芥。

10.   控制水稻穗大小基因突變體ssp1基因在小麥、大麥、玉米、高粱、大豆、棉花、油菜、或擬南芥等植物中的同源基因,它們統稱為控制穗大小基因,其cDNA序列為:
小麥TaSSP1?like1(Rht?A1a):SEQ ID NO:5;
大麥HvSSP1?like:SEQ ID NO:7;
玉米ZmSSP1?like:SEQ ID NO:9;
高粱SbSSP1?like:SEQ ID NO:11;
大豆GmSSP1?like:SEQ ID NO:13;
棉花GhSSP1?like1:SEQ ID NO:15;
棉花GhSSP1?like2:SEQ ID NO:17;
油菜BnSSP1?like1:SEQ ID NO:19;
油菜BrSSP1?like2:SEQ ID NO:21;
擬南芥AtSSP1?like1:SEQ ID NO:23;
擬南芥AtSSP1?like2:SEQ ID NO:25。

說明書

說明書控制水稻穗大小基因、其突變體及應用
技術領域
本發明涉及控制水稻穗大小基因SSP1(Small and Sheathed Panicle 1)和突變體ssp1基因,以及它們在調控植物株高、葉夾角和穗型等方面的作用機理。本發明還涉及控制水稻穗大小基因SSP1和突變體ssp1基因在降低株高提高抗倒能力、減小葉夾角提高光合效率、改變赤霉素響應抑制種子穗發芽等育種方面的應用。
背景技術
“農以種為先”,提高產量一直是作物遺傳育種研究的主要目標。水稻株型由株高、分蘗數目、分蘗角度葉片夾角以及穗型等構成,也是影響水稻產量的重要因素之一。上世紀60年代以株型改良為特征的矮化育種使得小麥和水稻的產量大幅度提高,而水稻“綠色革命”就是利用了半矮稈sd1基因。SD1編碼赤霉素(Gibberellin,GA)合成基因,其突變使得水稻體內有活性的赤霉素含量下降,導致株高降低,提高植株抗倒伏能力,進而提高產量。目前研究表明,赤霉素促進植物生長發育是通過降解DELLA蛋白而實現的。在植物體內,GA首先與赤霉素受體GID1蛋白結合,活化的GA?GID1能與DELLA蛋白相結合,促進GID1?GA?DELLA復合體與GID2(F?Box)蛋白結合,被泛素化后的DELLA蛋白經由26S蛋白酶解途徑降解,解除了DELLA蛋白的阻遏作用來促進植物生長的(Jiang and Fu,2007)。
小麥的“綠色革命”基因是赤霉素信號途徑的關鍵元件??DELLA蛋白。目前在黃淮海平原大部分小麥新品種單產可達500公斤/畝,部分品種具有超過600公斤/畝產量的潛力。但在全國范圍的大面積生產中,小麥的平均單產遠低于350公斤/畝。據統計近30年來,小麥產量提高速度緩慢,平均年增長僅為0.7%左右。而根據預測,到2020年,我國小麥單產平均年增加2%以上才能基本滿足需求。因此,要實現小麥自給,必須進一步提高小麥產量潛力,培育出高產、穩產的小麥新品種。同樣,水稻的產量自上世紀60年代水稻“綠色革命”即矮化育種使得中國水稻單產比原有高稈品種提高20?30%。70年代成功采用以雜種優勢利用為手段的雜交稻育種,使水稻單產在矮稈品種的基礎上再增產20%左右,實現水稻產量上的飛躍,為解決我國13億人口的吃飯問題做出了巨大貢獻。
然而,目前水稻生產中所應用的矮桿基因都是sd1,來源相當狹窄。矮稈基因利用單一化以及矮稈基因遺傳隱性化,導致了水稻品種遺傳背景單一和狹窄,影響了水稻品種特別是雜交水稻組合的產量潛力進一步挖掘和提高。所以發掘和利用新型矮稈基因十分重要。
發明內容
本發明涉及控制水稻穗大小基因SSP1基因和突變體ssp1基因,以及它們在調控植物株高、葉夾角和穗型等方面的作用及其作用機制。本發明還涉及控制水稻穗大小基因SSP1和突變體ssp1在植株半矮化提高抗倒能力、減小葉夾角提高光合效率、改變赤霉素響應抑制種子穗發芽等育種方面的應用。
本發明人在中國水稻所收集的水稻資源材料中發現其中一個材料具有植株矮化、包穗等表型,通過遺傳雜交,確定這個性狀是受一個顯性基因控制的。進一步遺傳回交,構建了近等基因系,對近等基因系的比較分析發現,該基因除了控制株高外(降低株高對農作物抗倒伏,利于農作物密植增產),還控制水稻的劍葉和葉夾角的大小,劍葉變短、葉夾角也變小的性狀對提高作物光合效率很重要,控制水稻的穗部性狀(包穗且穗也變小)。根據穗部的突出表型,本發明人將這個突變體命名為水稻穗型突變體ssp1(Small and Sheathed Panicle 1)。
ssp1穗部性狀不是農業直接應用的優良性狀,但是它的株型和葉型性狀對農業生產非常有利:1),降低株高,可提高農作物的抗倒伏能力;2),株型緊湊,可密植;3),葉片深綠色,本身光合效率較高;4),葉夾角變小,可提高群體光合效率;5),改變赤霉素應答反應,可用于抑制種子穗發芽遺傳改良。本發明人的研究工作正是針對上述五個優良性狀開展的。
產量是由復雜數量性狀位點QTL(Quantitative Trait Loci)和環境互作所控制,并最終通過調節單位面積的穗粒數和粒重來影響產量。穗型(包括穗長、枝梗數、穗粒數、籽粒大小和結實率等)是影響水稻產量的重要因素之一,而株高和葉片夾角對提高水稻種植密度、提高光能轉換效率和耐肥抗倒性以及提高產量非常重要。水稻穗型突變體ssp1表現為植株半矮化和葉片直立等特征,屬典型的nl類矮化類型。
為了弄清該突變體矮化株型的遺傳控制基礎,我們利用圖位克隆的方法,克隆了SSP1基因(Small and Sheathed Panicle 1)。該基因編碼一個GRAS蛋白,它與水稻SLR1蛋白(水稻中的DELLA蛋白)C端氨基酸序列有較高的相似性。突變的ssp1是由2個氨基酸置換突變造成的(參見SEQ ID NO:4)。
SSP1基因幾乎在水稻不同發育階段的各個器官和組織部位都有表達,尤其在穗部和穗下節的居間分生組織中表達量最高。轉基因水稻植株中SSP1?GFP融合蛋白定位于細胞核中。赤霉素誘導糊粉層細胞α?淀粉酶活性實驗表明突變的ssp1蛋白能抑制赤霉素應答反應,表明ssp1參與GA信號傳導過程,是赤霉素信號傳導中的一個關鍵元件。
進一步的酵母雙雜交實驗結果顯示,突變的ssp1和野生的SSP1蛋白均不能與赤霉素受體GID1蛋白相互作用,這說明ssp1/SSP1是一個參與赤霉素信號途徑但不依賴于GID1功能的新的負調控因子。ssp1和SSP1蛋白也不能與參與DELLA蛋白降解的F?Box蛋白(GID2)和U?Box蛋白互作,說明ssp1/SSP1蛋白穩定性的調控機制與DELLA蛋白SLR1的降解途徑不同。另外,比較氨基酸序列發現,SSP1蛋白與另外一個參與油菜素內酯(BR)的調控因子DLT相似性較高。當利用外源油菜素內酯BR處理ssp1突變體時,ssp1突變體的第二葉鞘長度和葉夾角能夠恢復到野生型對照植株接近的水平。在ssp1突變體背景下,DLT表達量被明顯上調,而另外一個油菜素內酯信號途徑的關鍵基因BU1表達量略有下調。這表明SSP1基因也參與調控油菜素內酯的應答反應。以上實驗結果說明,SSP1可能既參與赤霉素信號傳導,又參與油菜素內酯信號傳導,是兩激素互作的一個關鍵調控元件。
具體地,本發明包括下述方面:
1.鑒定了水稻穗型突變體ssp1的表型。水稻ssp1突變體表現為包穗(抽穗不完全)、葉片直立,是一個赤霉素不敏感的半矮稈突變體。遺傳分析表明,植株矮化(抽穗不完全)是受一對顯性基因控制的。樹脂切片實驗結果表明,ssp1突變體倒一節莖稈的細胞數目和細胞伸長都受到明顯抑制,表明ssp1抑制莖稈的細胞分裂和細胞伸長;同時,ssp1突變體葉夾角明顯變小,外源施加油菜素內酯能使葉夾角表型恢復到野生型水平,這說明,SSP1基因參與油菜素內酯的應答反應。
2.克隆了SSP1基因。ssp1突變體分別與南京6號(NJ6,一種秈稻)和中花11號(ZH11,一種粳稻)雜交,構建了SSP1基因的粗(精細)定位群體。通過圖位克隆方法,獲得了SSP1候選基因。SSP1基因編碼一個GRAS蛋白,其C端與水稻DELLA蛋白SLR1具有較高的序列保守性。獲得候選基因后,通過以下實驗對該候選基因進行了互補驗證:a.遺傳互補實驗:構建自身啟動子+ssp1 cDNA+3’UTR的載體(pSSP1:ssp1?3’UTR)并通過農桿菌介導轉化到日本晴(一種粳稻)中,轉基因植株表現為ssp1突變體的表型,具體為:株高變矮、倒一節明顯縮短、葉夾角變小和對外源赤霉素處理不敏感;b.過量表達實驗:構建過表達載體p35S:ssp1,并通過農桿菌介導轉化到日本晴中。表型分析發現,過量表達ssp1的轉基因水稻表現更為明顯的矮化,且矮化程度與該基因表達水平呈正相關。通過以上實驗確定了該候選基因是目的基因。
3.獲得了近等基因系NIL?ssp1和NIL?SSP1。構建粳稻(日本晴)和秈稻(南京6號)兩個不同遺傳背景的近等基因系:NIL?ssp1和NIL?SSP1。遺傳分析表明,ssp1基因在秈稻和粳稻中均表現為顯性遺傳。
4.SSP1/ssp1基因表達分析。利用RT?PCR方法分析了SSP1基因在各個發育階段和不同組織器官中的表達情況,包括:花、葉、鞘、葉枕、根、穗下莖節(從下到上0?3cm(居間分生組織區),3?8cm(伸長區),8cm以上(成熟區))等組織。結果表明,SSP1基因幾乎在水稻不同發育階段的各個器官組織部位都有表達,尤其在穗部和穗下節的居間分生組織中表達量最高。同SSP1野生型相比,ssp1基因表達模式和表達量均沒有明顯的變化。
5.SSP1?GFP融合蛋白的亞細胞定位分析。構建了p35S:HA?SSP1?GFP載體,轉化日本晴,利用共聚焦顯微鏡觀察轉基因植株根部的熒光信號。實驗結果表明,SSP1?GFP融合蛋白定位于細胞核中。另外,GA處理并沒有觀察到細胞核中SSP1?GFP或ssp1?GFP融合蛋白量的變化,表明SSP1?GFP融合蛋白穩定性不受GA影響。
6.SSP1參與赤霉素信號途經,但不依賴于赤霉素信號傳導途徑中GID1和DELLA蛋白的功能。在ssp1突變體種子糊粉層細胞中,GA不能誘導淀粉酶活性;其第二葉鞘的生長也不受GA影響。這些結果表明,SSP1參與GA信號傳導過程,是赤霉素信號途徑中的一個關鍵負調控因子。雖然,從氨基酸序列比較來看,SSP1蛋白與SLR1蛋白具有較高的同源性,但酵母雙雜交結果顯示,SSP1和ssp1蛋白都不能與赤霉素受體GID1蛋白互作。這些研究表明SSP1在GA信號傳導途徑中起作用,卻是一個不依賴于GID1功能的調控因子。同時,SSP1/ssp1蛋白也不能與參與SLR1蛋白降解的U?BOX和F?BOX(GID2)蛋白互作,表明SSP1/ssp1蛋白穩定性(蛋白降解途徑)的調控機制與SLR1不同。ssp1突變體中SLR1蛋白水平沒有明顯改變,而且GA處理也能導致SLR1蛋白的降解,但ssp1突變體矮化表型并沒有改變。這些實驗也表明,ssp1基因并不依賴于(或影響)DELLA蛋白的功能。
7.過量表達SSP1基因也能導致植株矮化、葉夾角變小和包穗等性狀。構建過表達載體p35S:ssp1/SSP1,將其轉化水稻日本晴。轉基因水稻表型分析證實,過量表達SSP1也能導致類似ssp1突變體的表型,包括株高、葉夾角和包穗等性狀。在基因表達水平相同時,過量表達ssp1有更強的矮化表型。
8.SSP1基因參與油菜素內酯(BR)的應答反應。在ssp1突變體背景下,參與油菜素內酯信號途徑的調控因子,如:DLT、BU1等基因的表達量都發生了變化。DLT基因表達量得到較為明顯的上調,而BU1的表達量略有下調。當外源油菜素內酯BR處理ssp1突變體后,ssp1突變體第二葉鞘長度和葉夾角表型等能恢復到野生型表型。這些實驗表明,SSP1基因也參與了調控油菜素內酯應答反應。SSP1既參與了赤霉素信號傳導,又參與了油菜素內酯信號傳導,是兩大激素互作的一個關鍵調控元件。
另外,本發明人在進一步的研究中發現,控制水稻穗大小基因SSP1基因在農作物中非常保守,通過Blast發現控制水稻穗大小基因突變體ssp1基因在小麥、大麥、玉米、高粱、大豆、棉花、油菜、或擬南芥等植物中的同源基因,可以將它們統稱為控制穗大小基因,這些基因的名稱以及它們的cDNA序列編號可參見表1。根據本發明對控制水稻穗大小基因SSP1及其突變體ssp1基因的研究結果,可以推測這些同源基因也具有與控制水稻穗大小基因SSP1及其突變體ssp1基因相似的功能。
表1:控制水稻穗大小基因突變體ssp1基因在其它植物中的同源基因
  名稱  cDNA序列編號  小麥TaSSP1?like1(Rht?A1a)  SEQ ID NO:5  大麥HvSSP1?like  SEQ ID NO:7  玉米ZmSSP1?like  SEQ ID NO:9  高粱SbSSP1?like  SEQ ID NO:11  大豆GmSSP1?like  SEQ ID NO:13  棉花GhSSP1?like1  SEQ ID NO:15  棉花GhSSP1?like2  SEQ ID NO:17  油菜BnSSP1?like1  SEQ ID NO:19  油菜BrSSP1?like2  SEQ ID NO:21  擬南芥AtSSP1?like1  SEQ ID NO:23  擬南芥AtSSP1?like2  SEQ ID NO:25
因此,本發明提供下述:
1.控制水稻穗大小基因的突變體ssp1基因,其編碼的氨基酸序列為SEQ ID NO:4。
2.根據第1項所述的控制水稻穗大小基因的突變體ssp1基因,其核苷酸序列為SEQ ID NO:3。
3.一種重組載體,其包含第2項所述的控制水稻穗大小基因的突變體ssp1基因。
4.一種轉基因植物細胞,其轉化了第3項所述的重組載體。
5.根據第4項所述的轉基因植物細胞,其為下列植物的細胞:水稻、小麥、大麥、玉米、高粱、大豆、油菜、棉花、或擬南芥。
6.根據第5項所述的轉基因植物細胞,其為水稻細胞。
7.控制水稻穗大小基因的突變體ssp1基因的應用,其用于培育具有植株半矮化提高抗倒伏能力、減小葉夾角提高光合效率、改變赤霉素響應抑制種子穗發芽的優點的農作物。
8.一種培育植株矮化耐倒伏、改良農作物穗型和提高葉片光合效率的農作物的方法,其包括通過轉基因技術在所述農作物中組織特異性啟動子過量表達控制水稻穗大小基因SSP1基因或其突變體ssp1基因的步驟。
9.根據第8項所述的方法,其中所述農作物包括水稻、小麥、大麥、玉米、高粱、大豆、油菜、棉花、或擬南芥。
10.控制水稻穗大小基因突變體ssp1基因在小麥、大麥、玉米、高粱、大豆、棉花、油菜、或擬南芥等植物中的同源基因,它們統稱為控制穗大小基因,它們的名稱和cDNA序列參見表1。
附圖說明
從下面結合附圖的詳細描述中,本發明的上述特征和優點將更明顯,其中:
圖1ssp1是小穗突變體(圖1A),ssp1穗子變小(圖1,B、C)。統計發現,突變體的每穗粒數(圖1D),一次枝梗數目(圖1E),二次枝梗數目(圖1F)都明顯少于野生型對照(NP?SSP1);
圖2ssp1是nl類型半矮稈突變體。A:倒五節;B:倒四節;C:倒三節;D:倒二節;E:倒一節;F:每節占株高的百分比;
圖3近等基因系的樹脂切片,A圖:NIL?SSP1莖稈橫切面,B圖:NIL?ssp1莖稈橫切面,C圖:NIL?SSP1莖稈縱切面,D圖:NIL?ssp1莖稈縱切面;
圖4SSP1基因的圖位克隆,箭頭表示ssp1的突變位點;
圖5SSP1與ssp1蛋白的氨基酸序列比對,箭頭表示突變位點;
圖6遺傳互補實驗,A:株高比較,B:劍葉夾角比較,C:穗子大小比較,D:每穗穗粒數比較,E:一級枝梗數目比較,F:二級枝梗數目比較,其中A、B和C圖中由左至右依次為野生型對照和遺傳互補轉基因植株;
圖7p35S:ssp1轉基因植株表現出比ssp1突變體更強的表型,A:株高比較,B:劍葉夾角比較,C:穗子大小比較,D:每穗穗粒數比較,E:一級枝梗數目比較,F:二級枝梗數目比較,其中A、B和C圖中由左至右依次為野生型對照和過量表達ssp1轉基因植株;
圖8過量表達ssp1抑制穗的形成,由左至右依次為4個獨立的轉基因植株;
圖9過表達SSP1的轉基因植株表現出與ssp1相似的表型。A:株高比較,B:劍葉夾角比較,C:穗子大小比較,D:每穗穗粒數比較,E:一級枝梗數目比較,F:二級枝梗數目比較,其中A、B和C圖中由左至右依次為野生型對照和過量表達SSP1的轉基因植株;
圖10敲除SSP1的日本晴表型上沒有變化。A:株高比較,B:每穗穗粒數比較,C:一級枝梗數目比較,D:二級枝梗數目比較;圖中由左至右依次為野生型對照和下調SSP1基因表達的轉基因植株;
圖11SSP1基因在水稻中的表達譜;
圖12SSP1?GFP融合蛋白的亞細胞定位分析;
圖13GA誘導α?淀粉酶的活性依賴于SSP1;
圖14酵母雙雜交實驗。A:SSP1蛋白與GID1蛋白相互作用分析,B:SSP1蛋白與GID2蛋白相互作用分析,C:SSP1蛋白與U?Box蛋白相互作用分析;
圖15葉片夾角比較分析,A:劍葉夾角比較,B:第二葉片夾角比較,C:劍葉夾角比較統計,D:第二葉片夾角比較統計,其中A和B圖中由左至右依次為近等基因系NIL?SSP1和NIL?ssp1;
圖16水稻SSP1系統進化樹分析;
圖17不同BRs濃度下第二葉鞘的長度變化的比較;
圖18SSP1影響BRs調控因子DLT、BU1達量;
圖19SSP1/ssp1基因在雙子葉植物擬南芥中過量表達。
序列表描述:
SEQ ID NO:1控制水稻穗大小基因SSP1基因全長cDNA序列(野生型);
SEQ ID NO:2控制水稻穗大小基因SSP1蛋白序列(野生型);
SEQ ID NO:3控制水稻穗大小基因的突變體ssp1基因全長cDNA序列(突變型);
SEQ ID NO:4控制水稻穗大小基因的突變體ssp1蛋白序列(突變型);
SEQ ID NO:5?6小麥TaSSP1?like1(Rht?A1a)cDNA序列及氨基酸序列;
SEQ ID NO:7?8大麥HvSSP1?like cDNA序列及氨基酸序列;
SEQ ID NO:9?10玉米ZmSSP1?like cDNA序列及氨基酸序列;
SEQ ID NO:11?12高粱SbSSP1?like cDNA序列及氨基酸序列;
SEQ ID NO:13?14大豆GmSSP1?like cDNA序列及氨基酸序列;
SEQ ID NO:15?16棉花GhSSP1?like1cDNA序列及氨基酸序列;
SEQ ID NO:17?18棉花GhSSP1?like2cDNA序列及氨基酸序列;
SEQ ID NO:19?20油菜BnSSP1?like1cDNA序列及氨基酸序列;
SEQ ID NO:21?22油菜BrSSP1?like2(也稱:BrRGA2)cDNA序列及氨基酸序列;
SEQ ID NO:23?24擬南芥AtSSP1?like1(GAI,AT1G14920)cDNA序列及氨基酸序列;
SEQ ID NO:25?26擬南芥AtSSP1?like2(RGA,AT2G01570)cDNA序列及氨基酸序列。
具體實施方式
以下通過實施例來進一步闡明本發明。但是應該理解,所述實施例只是舉例說明的目的,并不意欲限制本發明的范圍和精神。
實施例1:突變體ssp1的表型分析
通過遺傳雜交,構建并獲得了日本晴(粳稻)和南京6號(秈稻)背景的近等基因系:NP?SSP1和NIL?ssp1。如圖1所示,南京6號遺傳背景下的NIL?ssp1植株表現為半矮化、葉夾角變小、葉片深綠色、穗型改變等表型。
NIL?ssp1水稻穗變小(圖1,B、C)、抽穗不完全(圖1B)。統計發現,NIL?ssp1的每穗粒數(圖1D)、一次枝梗數(圖1E)、二次枝梗數(圖1F)都明顯少于NIL?SSP1。尤其,NIL?ssp1水稻二次枝梗數目減少更為顯著,說明穗粒數的減少主要是由二次枝梗數目減少引起的。另外,NIL?ssp1水稻植株半矮化,葉夾角直立(圖1A,圖2)。對其各節間長度占整個株高的百分比進行統計分析發現,其矮化主要是由于倒一節顯著縮短引起的,屬于nl矮化類型(圖2)。
實施例2:ssp1基因抑制細胞分裂和細胞伸長
選取近等基因系的倒一節莖稈相同部位的組織進行固定,觀察橫向和縱向組織切片發現,NIL?ssp1的倒一節莖稈(圖3A)中維管束數目明顯少于NP?SSP1(圖3B),說明NIL?ssp1的細胞分裂受到抑制;同時,NIL?ssp1的倒一節莖稈中縱向細胞數目和大小(圖3D)明顯小于NP?SSP1(圖3C),說明NIL?ssp1中細胞分裂和細胞伸長均明顯受到抑制。
實施例3:圖位克隆SSP1基因
利用ssp1與南京6號雜交所獲得的F1和F2后代進行遺傳分析,統計數據和卡方檢驗發現其性狀分離比符合3:1,說明該性狀由一個顯性單基因控制。
利用ssp1與南京6號雜交所構建的定位群體F2代單株表型分離,將SSP1粗定位于1號染色體長臂上Marker 337和Marker481之間。然后,利用ssp1與中花11雜交所構建的的F2代單株表型分離,將其精細定位在BAC AP002910上109kb的區域內(圖4)。該區域含15個ORF,其中11個有預測蛋白產物。進一步測序發現,其中一個基因存在兩個點突變:C端1360bp處的G?C,導致Gly?Arg,1366bp處的A?C,導致Asn?His。該基因只有一個外顯子,編碼一個GARS蛋白(圖5)。
實施例4:SSP1與水稻DELLA蛋白有較高的序列保守性
SSP1基因編碼一個GRAS蛋白,與水稻SLR1蛋白序列比對缺少了N端的DELLA、TVHYNP、polyS/T/V區,但是C末端多了47個氨基酸,其他區域非常保守,故該基因又被命名為SLR1?Like1(SLRL1)。突變發生在C端(圖5,箭頭所示)。NCBI blast所有物種的GRAS蛋白,發現玉米ZmSCL1存在與SSP1蛋白C端相類似的保守序列。說明該基因在禾本科作物中也非常保守。
實施例5:遺傳互補驗證
將含水稻SSP1基因自身啟動子(2214bp)、突變ssp1的全長cDNA(SEQ ID NO:3)和3’?UTR的2215bp的DNA片段克隆到pCAMBIA1300載體(購自CAMBIA,Canberra,Australia),獲得pSSP1:ssp1?3’UTR載體并將其轉化日本晴。與野生型相比,轉基因日本晴植株株高和穗部性狀有明顯變化,類似于突變體ssp1的表型:植株半矮化、葉片直立、包穗等性狀。如圖6所示。
實施例6:過表達ssp1植株表現出突變體ssp1的強化表型
構建過表達載體p35S:ssp1,將其轉化水稻日本晴,結果發現轉基因植株無論穗型還是株型都有著比ssp1突變體本身更強的表型(圖7)。并且,轉基因植株的株高和穗型表型與ssp1基因表達量正相關,隨著ssp1基因表達量升高,轉基因植株矮化越明顯,葉夾角和穗越小(結果未顯示);當ssp1基因表達非常高時,轉基因植株嚴重矮化,穗發育受到嚴重抑制,甚至不能生長(圖8)。
實施例7:過表達SSP1的轉基因植株表現出類似于ssp1突變體的表型
構建過表達載體p35S:SSP1,將其轉化水稻日本晴。過量表達SSP1基因的轉基因植株也產生類似于ssp1突變體的表型:植株半矮化、葉夾角變小、葉片長度變短、葉色變深和包穗等(圖9)。另外,過量表達SSP1轉基因植株表型(包括株高、葉夾角和包穗等性狀)與SSP1基因表達量呈正相關。但與過量表達ssp1基因的轉基因植株表型相比,在相同表達水平下,過量表達ssp1有更強的表型變化。
實施例8:下調SSP1基因的表達水平并不明顯改變日本晴表型
轉p35S:SSP1?RNAi載體的轉基因日本晴株系與野生型在表型上無明顯差別(圖10A),統計結果也顯示,株高、葉夾角變化不明顯;每穗穗粒數(圖10B)和一次枝梗數目(圖10C)略大于野生型,但差別不顯著;二次枝梗數目(圖10D)與野生型接近。
實施例9:SSP1基因表達模式分析
以根、葉片、葉鞘、10cm長穗、莖稈倒一節的居間分生組織(0?3cm)、伸長區(3?8cm)和成熟區(8cm以上)等組織部位為材料,用RT?PCR分析SSP1的表達模式發現,SSP1基因幾乎在水稻不同發育階段的各個組織中都有表達,尤其在穗部和莖稈倒一節的居間分生組織中表達量最高(圖11)。突變體ssp1與野生型SSP1基因表達模式和表達水平基本一致(圖11)。
實施例10:SSP1是核定位蛋白
構建載體p35S:HA?SSP1?GFP轉化日本晴,激光共聚焦熒光顯微鏡下觀察轉基因植株中的熒光信號,發現SSP1?GFP融合蛋白定位于細胞核內(圖12)。這與預測SSP1的氨基酸序列(圖8)中含有核定位信號相符。另外,GFP蛋白能增強SSP1功能,所得到的二十多個獨立的轉基因株系都表現為極端矮化,類似于高表達ssp1的表型。由于N端融合GFP往往能夠增加融合蛋白的穩定性,這也暗示ssp1突變可能增強了SSP1蛋白的穩定性。
實施例11:SSP1是GA信號傳導途徑的負調控因子
ssp1突變體表現為赤霉素不敏感的矮化表型。在野生型水稻種子的糊粉層細胞中,GA能誘導α?淀粉酶的活性,表現為GA依賴型。而ssp1突變體糊粉層細胞中,其α?淀粉酶活性不能被GA誘導(圖13)。這些實驗說明SSP1是GA信號傳遞途徑中的負調控因子,ssp1基因可以用于改變赤霉素反應。這個結果可用于主要農作物(例如,小麥、水稻和大麥等)抑制種子穗發芽遺傳改良。
實施例12:SSP1蛋白參與赤霉素信號傳遞但其功能并不依賴GID1?GA?SLR1調控模塊
構建pGADT7:SSP1、pGADT7:NSLR1?SSP1(N端融合SLR1蛋白的DELLA結構域、THVYNP以及polyS/T/V結構域)載體,分別與構建的pGBKT7?GID1、pGBKT7?UBOX、pGBKT7?GID2(購自CLONTECHLaboratories,Inc.)進行酵母雙雜交實驗,酵母菌株使用AH109(購自CLONTECH Laboratories,Inc.)。研究結果表明,SSP1蛋白以及在其N端融合SLR1蛋白的N端(含DELLA結構域、THVYNP以及polyS/T/V結構域)后均不與GID1互作(圖14A);同時它也不與F?BOX蛋白(GID2)(圖14B)和U?BOX蛋白(圖14C)互作,說明SSP1雖然同SLR1一樣是GA途徑的負調控因子,但與SLR1不同,SSP1的功能不依賴于GID1,也不是通過SCFGID2介導的26S蛋白酶途徑降解的。
結合實施例11和12,說明SSP1是一個新的不依賴于GID1和DELLA蛋白功能的GA信號途徑負調控因子。
實施例13:SSP1基因參與油菜素內酯(BR)信號傳遞途徑
首先,ssp1突變體具有油菜素內酯(BR)典型的表型,如:葉色明顯加深,葉夾角無論是劍葉(圖15A、15C)還是第二葉(圖15B、15D)均明顯變小。ssp1突變體的葉夾角約為10度,而野生型葉夾角約為45度(圖15C、15D)。
其次,水稻種子去殼、滅菌,37℃催芽24小時,挑選萌發基本一致的種子播到含不同濃度(10?9、10?8、10?7、10?6M)BR的1%GM培養基上。然后置于30℃持續光照,兩周后測量第二葉鞘的長度。結果如圖17所示,隨著BR濃度的增加,突變體第二葉鞘的長度變長,在BR濃度達到10?6M時,其長度已接近野生型水平。這非常類似于BR缺失突變體對BR的反應。
再次,在ssp1背景下,BR信號途徑中的調控因子DLT、BU1基因的表達水平也發生了變化,DLT(圖18)的表達量明顯上調,而BU1(圖18)的表達量略有下調。這說明,SSP1與上述基因位于同一通路,參與BR的信號傳導與調控。
實施例14:ssp1和SSP1基因在單、雙子葉植物(擬南芥)中功能保守
我們將水稻SSP1基因的過表達載體p35S:SSP1和p35S:ssp1異源轉入雙子葉植物擬南芥野生型(Columbia)。轉基因株系株高顯著降低,開花時間推遲,而且ssp1過表達植株葉片卷曲(圖19)。這些實驗說明,水稻SSP1基因在擬南芥中也能抑制植物生長發育,其功能在單、雙子葉植物間是保守的。這種功能的保守性,意味著SSP1基因或ssp1基因可以用于在大豆、油菜、棉花等雙子葉植物上進行株型改良。
水稻ssp1基因和SSP1基因轉化水稻和擬南芥都能導致植物半矮化表型和提高植株的耐倒伏性。過量表達ssp1基因和SSP1基因的轉基因水稻和擬南芥植株的葉片變為深綠色。利用光合儀L1?6400(LI?COR Inc.,Lincolin,NE.USA),在的光強1500μmol photous m?2sec?1下,測定CO2的凈吸收量(μmol m?2sec?1),結果表明,轉基因的水稻葉片的光和效率比對照提高18.5%。同時,本發明人發現,轉基因水稻葉片夾角變小。根據本發明人的實驗結果,ssp1基因和SSP1基因的轉基因水稻葉角變小、半矮化表型和高光效的特性說明,ssp1基因和SSP1基因可以用來降低水稻、小麥等農作物的株高并增強抗倒伏性,改良農作物穗型和提高葉片光合效率,提高農作物的種植密度和增加群體光合效率,進而提高產量。例如,可以通過轉基因組織特異性過量表達ssp1基因或SSP1基因,實現提高作物光合效率、半矮化育種等目標。
另外,本發明人還通過構建南京6背景下的近等基因系(NIL?SSP1、NIL?ssp1),分析了ssp1在南京6(秈稻)背景下的表型,結果發現ssp1在秈稻背景下具有與日本晴(粳稻)背景下同樣的表型,而且株高降低更為明顯。
應該理解,盡管參考其示例性的實施方案,已經對本發明進行具體地顯示和描述,但是本領域的普通技術人員應該理解,在不背離由后附的權利要求所定義的本發明的精神和范圍的條件下,可以在其中進行各種形式和細節的變化,可以進行各種實施方案的任意組合。
參考文獻:
Jiang,C.,and Fu,X.(2007).GA action:turning on de?DELLA repressing signaling.Curr Opin Plant Biol.10(5),461?465.
H.Itoh,et al..(2005).Overexpression of a GRAS protein lacking the DELLA domain confers altered gibberellin responses in rice.The Plant Journal.44,669?679.Gurdev S.Khush,.(2001).Green revolution:the way forward.Nature Reviews Genetics.2,815?822.
Tomoaki Sakamoto,et al.,.(2003).Genetic manipulation of gibberellin metabolism in transgenic rice.Nature Biotechnology.21,909?913.
Tong,H.,Jin,Y.,Liu,W.,Li,F.,Fang,J.,Yin,Y.,Qian,Q.,Zhu,L.,and Chu,C.(2009).DWARF AND LOW?TILLERING,a new member of the GRAS family,plays positive roles in brassinosteroid signaling in rice.Plant J.58,803?816.
Shimada,A.,Ueguchi?Tanaka,M.,Sakamoto,T.,Fujioka,S.,Takatsuto,S.,Yoshida,S.,Sazuka,T.,Ashikari,M.,Matsuoka,M.(2006).The rice SPINDLY gene functions as a negative regulator of gibberellin signaling by controlling the suppressive function of the DELL A protein,SLR1,and modulating brassinosteroid synthesis.Plant J.48,390?402.
Wang,L.,Xu,Y.,Zhang,C.,Ma,Q.,Joo,S.,Kim,S.,Xu,Z.,Chong,K.(2008).OsLIC,a Novel CCCH?Type Zinc Finger Protein with Transcription Activation,Mediates Rice Architecture via Brassinosteroids Signaling.PLoS ONE.3(10):e3521..
Zhang,L.,Bai,M,Wu,J.,Zhu,J.,Wang,H.,Zhang,Z.,Wang,W.,Sun,Y.,Zhao,J.,Sun,X.,Yang,H.,Xu,Y.,Kim,S.,Fujioka,S.,Lin,W.,Chong,K.,Lu,T.,and Wang,Z.(2009).Antagonistic HLH/bHLH Transcription Factors Mediate Brassinosteroid Regulation of Cell Elongation and Plant Development in Rice and Arabidopsis.Plant Cell.21,3767?3780.
Yongzhong Xing and Qifa Zhang.(2010).Molecular Basis of Plant Architecture.Annu.Rev.Plant Biol.59:253?279.

關 鍵 詞:
控制 水稻 大小 基因 突變體 應用
  專利查詢網所有資源均是用戶自行上傳分享,僅供網友學習交流,未經上傳用戶書面授權,請勿作他用。
關于本文
本文標題:控制水稻穗大小基因、其突變體及應用.pdf
鏈接地址:http://www.rgyfuv.icu/p-6420565.html
關于我們 - 網站聲明 - 網站地圖 - 資源地圖 - 友情鏈接 - 網站客服客服 - 聯系我們

[email protected] 2017-2018 zhuanlichaxun.net網站版權所有
經營許可證編號:粵ICP備17046363號-1 
 


收起
展開
山东11选5中奖结果走势图