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疫苗 組合
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摘要
申請專利號:

CN201210028610.3

申請日:

20030731

公開號:

CN102552895B

公開日:

20140723

當前法律狀態:

有效性:

失效

法律詳情:
IPC分類號: A61K39/095,A61P31/04 主分類號: A61K39/095,A61P31/04
申請人: 葛蘭素史密絲克萊恩生物有限公司
發明人: F·-X·J·貝爾泰,R·比曼斯,P·德諾埃,C·費龍,C·戈拉,J·普爾曼,V·魏南茨
地址: 比利時里克森薩特
優先權: 0218037.0,0218036.2,0218035.4,0218051.1,0220197.8,0220199.4,0225524.8,0225531.3,0230164.6,0230168.7,0230170.3,0305028.3
專利代理機構: 中國專利代理(香港)有限公司 代理人: 郭文潔
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法律狀態
申請(專利)號:

CN201210028610.3

授權公告號:

法律狀態公告日:

法律狀態類型:

摘要

本發明涉及用于治療和預防奈瑟氏球菌病的免疫原性組合物和疫苗。本發明的免疫原性組合物含有選自包括粘附素、自體轉運蛋白、毒素、鐵獲得蛋白和膜相關蛋白(優選整合外膜蛋白)在內的至少兩個不同種類抗原的抗原組合。這種抗原組合能以抗奈瑟氏球菌生活周期不同方面的免疫反應為目標,產生更有效的免疫反應。

權利要求書

1.2.3.4.5.6.7.8.9.10.11.12.13.14.15.16.17.

說明書

本申請是申請日為2004年2月19日,申請號為03818648.9的、發明名稱和本發明相同的發明專利申請的分案申請。

技術領域

本發明涉及奈瑟氏球菌(Neisserial)免疫原性組合物和疫苗,它們的制備方法以及這種組合物在藥物中的用途。更具體而言,它涉及包括抗原組合的疫苗組合物,正如在保護測定法或血清殺菌測定法中所測量的那樣,其具有可使本發明的疫苗引發令人驚訝的良好免疫反應的性質。

背景

細菌中的奈瑟氏球菌菌株是很多人類病變的病原體,因此需要研制出可抗這些病原體的有效疫苗。特別是,淋病奈瑟氏球菌(Neisseria?gonorrhoeae)和腦膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria?meningitidis)所引起的病變可通過接種疫苗而治療。

淋病奈瑟氏球菌是淋病的病原體,淋病是全世界所報道的最常見的性傳播疾病之一,據估計每年有六千兩百萬個病例發病(Gerbase等人,1998?Lancet?351;(Suppl?3)2-4)。淋病的臨床表現包括泌尿生殖道、咽喉或直腸粘膜炎癥以及新生兒眼睛感染。婦女淋球菌(gonococcal)感染上升可導致不孕、子宮外妊娠、慢性盆腔炎和輸卵管-卵巢膿腫形成。敗血癥、關節炎、心內膜炎和腦膜炎均與并發性淋病有關。

大量淋球菌菌株對抗生素產生耐藥性導致發病率以及與淋病有關的并發癥增加。用抗生素治療淋病的吸引人的替代方案是利用接種疫苗而預防淋病。目前還沒有抗淋病奈瑟氏球菌感染的疫苗。

腦膜炎奈瑟氏球菌是一種重要的病原體,特別是在兒童和年輕人中。敗血癥和腦膜炎是侵入性腦膜炎球菌病(IMD)的最嚴重威脅生命的形式。這種疾病由于其較高的發病率和死亡率已經成為全世界的健康問題。

根據莢膜多糖的抗原差異,已經鑒定出了13種腦膜炎奈瑟氏球菌血清組,最普遍的是A、B和C,它們導致全世界90%的該疾病。血清組B是歐洲、美國和拉丁美洲幾個國家中腦膜炎球菌病的最普遍原因。

已經研制出了基于血清組A、C、W和Y的莢膜多糖的疫苗,它們表現出可控制腦膜炎球菌病的暴發(Peltola等人,1985Pediatrics76;91-96)。然而,血清組B的免疫原性較差,且僅主要誘導I?gM同種型的短暫抗體反應(Ala’Aldeen?D和Cartwright?K?1996,J.Infect.33;153-157)。因此,目前還沒有能夠抗導致絕大多數溫帶國家中大多數該疾病的血清組B腦膜炎球菌的廣泛有效的疫苗。尤為嚴重的是血清型B疾病在歐洲、澳洲和美洲的發生率日益增加,主要是在5歲以下的兒童中。抗血清組B腦膜炎球菌的疫苗的研制提出了一個特有的困難,即由于多糖莢膜與人神經細胞粘著分子的免疫學相似性導致其免疫原性較差。將疫苗生產的方案集中于腦膜炎球菌外膜的表面外露結構,但卻被菌株之間這些抗原的顯著變異所阻礙。

進一步的研究采用由外膜小泡構成的疫苗,其包括很多構成細菌膜正常內含物的蛋白。這些的其中之一是抗腦膜炎奈瑟氏球菌血清組B和C的VA-MENGOC-Cuban疫苗(Rodriguez等人,1999Mem?Inst.Oswaldo?Cruz,Rio?de?Janeiro?94;433-440)。設計這種疫苗用來抗古巴的侵入性腦膜炎球菌病,這種病不能通過使用莢膜多糖AC疫苗進行的接種程序而被消除。流行的血清組是B和C,且VA-MENGOC-疫苗已經可以成功控制暴發,據估計該疫苗抗腦膜炎奈瑟氏球菌血清組B菌株的效能為83%(Sierra等人,1990In?Neisseria,Walter?Gruyter,Berlin,m.Atchman等人(eds)p?129-134,Sierra等人,1991,NIPH?Ann?14;195-210)。該疫苗可有效抗特異性暴發,然而所引發的免疫反應不能抗腦膜炎奈瑟氏球菌的其它菌株。

隨后在拉丁美洲,在由同源和異源血清組B腦膜炎球菌菌株引起的流行病過程中進行的功效研究已在年齡稍大的兒童和成人中表現出一些功效,但它的有效性在感染危險最大的、年齡較小的兒童中明顯偏低(Milagres等人,1994,Infect.Immun.62;4419-4424)。這種疫苗在具有多菌株地方病的國家,如UK效果怎樣還不肯定。對抗異源菌株的免疫原性的研究僅證實了有限的交叉反應性血清殺菌活性,特別是在嬰兒中(Tappero等人,1999,JAMA?281;1520-1527)。

第二種外膜小泡疫苗是在挪威,使用在斯堪的納維亞流行的那些普遍血清型B分離物研制的(Fredriksen等人,1991,NIPH?Ann,14;67-80)。該疫苗已在臨床試驗中進行了測試,并發現29個月后,它具有57%的保護功效(Bjune等人,1991,Lancet,338;1093-1096)。

然而,外膜小泡在疫苗中的使用與某些問題有關。例如,OMV包括有毒的脂多糖且它們可包括免疫顯性抗原,這些抗原或者是菌株特異性的,或者是可變表達的。已經描述過的幾個方法都可用于克服外膜小泡制品疫苗的一些問題。WO?01/09350描述了例如通過降低毒性并修飾外膜小泡上存在的抗原而解決某些問題的方法。

WO?01/52885描述了把外膜小泡與其它抗原組合在一起的可能性且包括了超過2,000種潛在的奈瑟氏球菌蛋白列表,從該列表可推測研制出對更寬血清型范圍都具有功效的疫苗。

目前所用的抗-腦膜炎球菌疫苗存在著多種問題。基于蛋白的外膜疫苗傾向于特異性且僅對少數菌株有效。多糖疫苗也是次最優的,這是因為它們傾向于引發較差且短暫的免疫反應,特別是對血清組B(Lepow等人1986;Peltola?1998,Pediatrics?76;91-96)。

奈瑟氏球菌感染提出了一個重要的保健問題,即對淋病奈瑟氏球菌而言,還沒有可用的疫苗,或對腦膜炎奈瑟氏球菌而言,僅有有限的抗異源菌株的功效和能力的疫苗。顯然需要研制抗奈瑟氏球菌感染更好的疫苗,它們能夠改善目前所用疫苗的功效并抗更大范圍的菌株。

附圖描述

圖1.-對由tbpA和hsf表達被上調的重組腦膜炎奈瑟氏球菌菌株制備的OMV中的TbpA和Hsf的檢測。通過用考馬斯亮藍染色的SDS-PAGE分析(4-20%梯度凝膠)分離OMV制品(10μg)。

圖2.-在大腸桿菌(E.coli)中產生的重組Hsf過客(passenger)結構域的檢測,10μg純化的Hsf過客蛋白(第2和3道)通過12%SDS-PAGE凝膠上分離,并與分子量標記(第1道)相比較。

圖3.-Hap過客純度的分析,這是通過(A)考馬斯染色,(B)銀染,(C)抗-His5蛋白質印跡和(D)抗-大腸桿菌檢測的。10μg純化抗原是在4-20%丙烯酰胺梯度凝膠上通過SDS-PAGE分離的。

圖4.-從腦膜炎奈瑟氏球菌菌株FAM20分離的FrpA和FrpC蛋白共有的序列相似性區。(A)腦膜炎奈瑟氏球菌菌株FAM20?RTX蛋白FrpA和FrpC的結構域組成。(B)從腦膜炎奈瑟氏球菌菌株H44/76獲得的FrpA/C擴增產物。

圖5.-重組Frp23(具有23個重復單位的FrpA/C保守區)抗原在大腸桿菌中的表達。用對照載體(pET24d)或重組構建體(分別為Frp3、Frp13和Frp23)轉化的大腸桿菌BL21DE3的非誘導(NI)和誘導(I)的總細胞提取物的SDS-PAGE分析。用考馬斯藍(A)將凝膠染色或將凝膠轉移到硝化纖維素上并用抗-His6小鼠血清進行免疫檢測。

圖6.-在大腸桿菌中表達的FHAB?2/3rd片段的優選DNA序列。

圖7.-來源于誘導大腸桿菌B121DE3提取物的重組FHAB?2/3rd的純化。(A)純化過程中的主要步驟。(B)對在純化過程不同步驟采樣的蛋白級分進行的SDS-PAGE分析。

圖8.-針對腦膜炎奈瑟氏球菌的FHAB?2/3rd、Hap、Hap過客結構域、Hsf和Hsf過客結構域抗原的抗-血清的粘附阻斷活性。

圖9.-表示Hsf、TbpA和NspA在來源于不同腦膜炎奈瑟氏球菌菌株的外膜小泡制品中的表達水平的考馬斯藍染色凝膠。第1道-分子量標記;第2道-從莢膜多糖被下調的菌株H44/76制備的外膜小泡;第3道-從莢膜多糖和PorA被下調的菌株H44/76制備的外膜小泡;第4道-從莢膜多糖和PorA被下調且NspA被上調的菌株H44/76制備的外膜小泡;第5道-從莢膜多糖和PorA被下調且Hsf被上調的菌株H44/76制備的外膜小泡;第6道-從莢膜多糖和PorA被下調且TbpA被上調的菌株H44/76制備的外膜小泡;第7道-從莢膜多糖和PorA被下調且TbpA和Hsf被上調的菌株H44/76制備的外膜小泡;第8道-從莢膜多糖和PorA被下調且TbpA和NspA被上調的菌株H44/76制備的外膜小泡。

詳述

本發明公開了奈瑟氏球菌抗原的特定組合,當它們組合在一起時,可使疫苗抗奈瑟氏球菌感染的功效令人驚訝地提高。

奈瑟氏球菌感染要經歷若干不同的階段。例如,腦膜炎球菌的生活周期包括鼻咽定居、粘膜附著、進入血流、在血液中增殖、誘導中毒性休克、穿過血/腦屏障并在腦脊液和/或腦脊膜中增殖。細菌表面上的不同分子參與感染周期的不同階段。通過使用有效量參與奈瑟氏球菌感染的不同過程特定抗原的組合產生免疫反應,可獲得具有令人吃驚的較高功效的奈瑟氏球菌疫苗。

具體而言,來源于不同種類的特定抗原的組合可引發針對感染多個階段的免疫反應,在這些不同種類的特定抗原中,有些參與附著到宿主細胞,有些參與鐵的獲得,有些是自體轉運蛋白而有些是毒素。抗原的這種組合可令人吃驚地提高(優選協同提高)疫苗抗奈瑟氏球菌感染的功效,其中以最佳方式通過免疫反應針對細菌的不止一個功能。

疫苗的功效可通過多種測定法評價。在動物模型中進行的保護測定法是本領域熟知的。此外,血清殺菌測定法(SBA)是最普遍認可的免疫學標記,以評價腦膜炎球菌疫苗的功效(Perkins等人,J?Infect?Dis.1998,177:683-691)。

抗原的某些組合(例如,某些自體轉運蛋白和某些鐵獲得蛋白的組合)可導致動物模型測定法中的保護提高和/或協同產生更高的SBA效價。不希望受到理論的束縛,抗原的這種協同組合可通過抗原組合所產生免疫反應的許多特性實現。抗原本身在奈瑟氏球菌細胞上通常是表面外露的,傾向于保守且未以最佳殺菌反應所需的充足量存在于表面細胞上,該最佳殺菌反應由單獨抗該抗原引起的抗體產生。將本發明抗原組合起來生產的制劑可導致殺菌抗體的有利組合,這些殺菌抗體與奈瑟氏球菌細胞的相互作用超出了臨界閾值。在這種臨界水平下,足量性質良好的抗體與細菌表面結合,從而通過補體有效殺死細菌并因此見到更高水平的殺菌作用。

因為血清殺菌測定法(SBA)可密切反映疫苗候選物的功效,因此通過抗原組合獲得的良好SBA效價可很好地表征包括該抗原組合的疫苗的保護功效。本發明涉及分離的或與另一抗原共同富含于混合物中的兩種抗原組合的用途。當組合在一起時,這種抗原組合有利地相互作用,且優選協同引發殺菌活性更高的免疫反應(正如在血清殺菌測定法或SBA中所測量的那樣),且優選高于由抗原單獨引發的加成反應,更優選高于由至少1.2、1.5、2、3、4、5、6、7、8、9個因子,最優選由至少10個因子引發的加成反應。

本發明的其它優點在于免疫原性組合物中來源于不同蛋白家族的本發明抗原組合可抗更大范圍的菌株。

本發明涉及包括很多(兩種或多種)蛋白的免疫原性組合物,所述蛋白選自至少兩個不同種類的蛋白,它們在奈瑟氏球菌中具有不同的功能。這種蛋白種類的例子是粘附素、自體轉運蛋白、毒素、整合外膜蛋白和Fe獲得蛋白。本發明的疫苗組合在抗同源奈瑟氏球菌菌株(衍生抗原的菌株)且還優選在抗異源奈瑟氏球菌菌株的疫苗功效方面顯示出令人吃驚的提高。

本發明提供免疫原性組合物,它包括至少或恰好兩種、三種、四種、五種、六種、七種、八種、九種或十種不同的抗原,這些抗原選自下列至少或恰好兩個、三個、四個或全部五個選自下述種類的抗原:

·至少一種奈瑟氏球菌粘附素;

·至少一種奈瑟氏球菌自體轉運蛋白;

·至少一種奈瑟氏球菌毒素;

·至少一種奈瑟氏球菌Fe獲得蛋白;

·至少一種奈瑟氏球菌膜相關蛋白(優選外膜蛋白,特別是整合外膜蛋白)。

優選,本發明提供包括至少或恰好兩種、三種、四種、五種、六種、七種、八種、九種或十種不同奈瑟氏球菌抗原的免疫原性組合物。最優選這些抗原選自下列的至少或恰好兩組、三組、四組或五組選自下述蛋白:

·選自FhaB、NspA、PilC、Hsf、Hap、MafA、MafB、Omp26、NMB0315、NMB?0995、NMB?1119和NadA的至少一種奈瑟氏球菌粘附素;

·選自Hsf、Hap、IgA蛋白酶、AspA和NadA的至少一種奈瑟氏球菌自體轉運蛋白;

·選自FrpA、FrpC、FrpA/C、VapD、NM-ADPRT、以及LPS免疫型L2和LPS免疫型L3之一或兩者的至少一種奈瑟氏球菌毒素;

·選自TbpA、TbpB、LbpA、LbpB、HpuA、HpuB、Lipo28(GNA2132)、Sibp、NMB0964、NMB0293、FbpA、Bcp、BfrA、BfrB和P2086(XthA)的至少一種奈瑟氏球菌Fe獲得蛋白;或

·選自PilQ、OMP85、FhaC、NspA、TbpA、LbpA、TspA、TspB、TdfH、PorB、MltA、HpuB、HimD、HisD、GNA1870、OstA、HlpA(GNA1946)、NMB?1124、NMB?1162、NMB?1220、NMB?1313、NMB?1953、HtrA和PldA的至少一種奈瑟氏球菌膜相關蛋白,優選外膜蛋白,優選整合外膜蛋白。

本發明的抗原都是分離的,即它們被人工改變。優選,它們被純化至某種程度,最優選超過40、50、60、70、80、90、95或99%純度(與本發明免疫原性組合物的其它組分組合前)。

優選本發明的免疫原性組合物包括至少一種奈瑟氏球菌粘附素和至少一種奈瑟氏球菌自體轉運蛋白且任選包括奈瑟氏球菌毒素、奈瑟氏球菌Fe獲得蛋白或奈瑟氏球菌膜相關蛋白(優選整合外膜蛋白)。優選所述抗原選自上述抗原。

優選本發明的免疫原性組合物包括至少一種奈瑟氏球菌粘附素和至少一種奈瑟氏球菌毒素且任選包括奈瑟氏球菌自體轉運蛋白、奈瑟氏球菌Fe獲得蛋白或奈瑟氏球菌膜相關蛋白(優選整合外膜蛋白)。優選所述抗原選自上述抗原。

優選本發明的免疫原性組合物包括至少一種奈瑟氏球菌粘附素和至少一種奈瑟氏球菌Fe獲得蛋白且任選包括奈瑟氏球菌毒素、奈瑟氏球菌自體轉運蛋白或奈瑟氏球菌膜相關蛋白(優選整合外膜蛋白)。優選所述抗原選自上述抗原。

優選本發明的免疫原性組合物包括至少一種奈瑟氏球菌粘附素和至少一種奈瑟氏球菌膜相關蛋白(優選整合外膜蛋白)且任選包括奈瑟氏球菌毒素、奈瑟氏球菌Fe獲得蛋白或奈瑟氏球菌自體轉運蛋白。優選所述抗原選自上述抗原。

優選本發明的免疫原性組合物包括至少一種奈瑟氏球菌自體轉運蛋白和至少一種奈瑟氏球菌毒素且任選包括奈瑟氏球菌粘附素、奈瑟氏球菌Fe獲得蛋白或奈瑟氏球菌膜相關蛋白(優選整合外膜蛋白)。優選所述抗原選自上述抗原。

優選本發明的免疫原性組合物包括至少一種奈瑟氏球菌自體轉運蛋白和至少一種奈瑟氏球菌Fe獲得蛋白且任選包括奈瑟氏球菌粘附素、奈瑟氏球菌毒素或奈瑟氏球菌膜相關蛋白(優選整合外膜蛋白)。優選所述抗原選自上述抗原。

優選本發明的免疫原性組合物包括至少一種奈瑟氏球菌自體轉運蛋白和至少一種奈瑟氏球菌膜相關蛋白(優選整合外膜蛋白)且任選包括奈瑟氏球菌粘附素、奈瑟氏球菌Fe獲得蛋白或奈瑟氏球菌毒素。優選所述抗原選自上述抗原。

優選本發明的免疫原性組合物包括至少一種奈瑟氏球菌毒素和至少一種奈瑟氏球菌Fe獲得蛋白且任選包括奈瑟氏球菌粘附素、奈瑟氏球菌自體轉運蛋白或奈瑟氏球菌膜相關蛋白(優選整合外膜蛋白)。優選所述抗原選自上述抗原。

優選本發明的免疫原性組合物包括至少一種奈瑟氏球菌毒素和至少一種奈瑟氏球菌膜相關蛋白(優選整合外膜蛋白)且任選包括奈瑟氏球菌粘附素、奈瑟氏球菌自體轉運蛋白或奈瑟氏球菌毒素。優選所述抗原選自上述抗原。

優選本發明的免疫原性組合物包括至少一種奈瑟氏球菌Fe獲得蛋白和至少一種奈瑟氏球菌膜相關蛋白(優選整合外膜蛋白)且任選包括奈瑟氏球菌粘附素、奈瑟氏球菌自體轉運蛋白或奈瑟氏球菌毒素。優選所述抗原選自上述抗原。

優選在本發明的免疫原性組合物中提供全部5組抗原。

當具體提到蛋白時,優選是天然、全長的蛋白及其天然變體(即,從奈瑟氏球菌,優選腦膜炎球菌菌株獲得的天然蛋白),它還可包括其抗原性片段(特別是在亞單位疫苗中)。這些是含有或包括從蛋白氨基酸序列上連續獲取的至少10個氨基酸,優選20個氨基酸,更優選30個氨基酸,更優選40個氨基酸或最優選50個氨基酸的片段(此處常常具體描述的)。此外,抗原性片段是指與抗奈瑟氏球菌全長蛋白產生的抗體或通過用奈瑟氏球菌感染哺乳動物宿主產生的抗體進行免疫反應的片段。抗原性片段還包括當以有效劑量施用時,可針對奈瑟氏球菌感染引發保護性免疫反應的片段,更優選它可防止腦膜炎奈瑟氏球菌和/或淋病奈瑟氏球菌感染,最優選它可防止腦膜炎奈瑟氏球菌血清組B感染。

本發明還包括本發明奈瑟氏球菌蛋白的重組融合蛋白,或其片段。這些可將不同的奈瑟氏球菌蛋白或其片段組合在同一多肽中。可選擇性地,本發明還包括奈瑟氏球菌蛋白或其片段的個體融合蛋白,即具有異源序列,如T-細胞表位或純化標記的供給者,例如:β-半乳糖苷酶、谷胱甘肽-S-轉移酶、綠色熒光蛋白(GFP)、附加表位如FLAG、myc標記、聚組氨酸、或病毒表面蛋白如流感病毒血細胞凝集素、破傷風類毒素、白喉類毒素、CRM197的融合蛋白。

本發明的抗原

NMB參照符號是指可從www.neisseria.org訪問的序列參照符號。

1.粘附素

粘附素包括FhaB(WO?98/02547)、NadA(J.Exp.Med(2002)195:1445;NMB?1994)、也可稱作NhhA的Hsf(NMB?0992)(WO?99/31132)、Hap(NMB1985)(WO?99/55873)、NspA(WO96/29412)、MafA(NMB?0652)和MafB(NMB?0643)(Annu?Rev?Cell?Dev?Biol.16;423-457(2000);Nature?Biotech?20;914-921(2002))、Omp26(NMB?0181)、NMB?0315、NMB?0995、NMB?1119和PilC(Mol.Microbiol.1997,23;879-892)。這些是參與奈瑟氏球菌與宿主細胞表面結合的蛋白。Hsf是粘附素的其中一個例子,同時也是自體轉運蛋白。因此本發明的免疫原性組合物可包括Hsf與其它自體轉運蛋白的組合,其中Hsf發揮其粘附素的作用。這些粘附素可來源于腦膜炎奈瑟氏球菌或淋病奈瑟氏球菌或其它奈瑟氏球菌菌株。本發明還包括來源于奈瑟氏球菌的其它粘附素。

FhaB

此抗原已在WO?98/02547SEQ?ID?NO:38(核苷酸3083-9025)中描述-還可參見NMB?0497。本發明人已經發現FhaB在誘導單獨的抗-粘附抗體方面特別有效,且特別是與本發明其它抗原組合時。雖然可使用全長FhaB,本發明人已經發現特定的C-末端截短物至少令人驚訝地有效且優選甚至在對交叉-菌株的作用方面更有效。已經有利地顯示出這種截短物更易克隆。本發明的FhaB截短物通常與FhaB分子的N-末端三分之二,優選位于1200-1600位置、更優選1300-1500位置、最優選1430-1440位置的新的C-末端相對應。具體的實施方案在1433或1436處具有C-末端。因此,本發明的這種FhaB截短物和包括這種截短物的疫苗是本發明的獨立方面而且是本發明組合免疫原性組合物的組分。N-末端還可被截短達10、20、30、40或50個氨基酸。

2.自體轉運蛋白

自體轉運蛋白通常由信號序列、過客結構域和用于附著外膜的錨定結構域組成。自體轉運蛋白的例子包括Hsf(WO?99/31132)(NMB0992)、HMW、Hia(van?Ulsen等人,Immunol.Med.Microbiol.200132;53-64)、Hap(NMB1985)(WO?99/55873;van?Ulsen等人,Immunol.Med.Microbiol.200132;53-64)、UspA、UspA2、NadA(NMB1994)(Comanducci等人,J.Exp.Med.2002?195;1445-1454)、AspA(Infection?and?Immunity?2002,70(8);4447-4461;NMB?1029)、Aida-1樣蛋白、SSh-2和Tsh。NadA(J.Exp.Med(2002)195:1445)是自體轉運蛋白的另一個例子,同時也是粘附素。本發明的免疫原性組合物因此包括NadA與粘附素的組合,其中NadA作為自體轉運蛋白發揮作用。這些蛋白可來源于腦膜炎奈瑟氏球菌或淋病奈瑟氏球菌或其它奈瑟氏球菌菌株。本發明還包括來源于奈瑟氏球菌的其它自體轉運蛋白。

Hsf

Hsf具有與自體轉運蛋白共用的結構。例如,來源于腦膜炎奈瑟氏球菌菌株H44/76的Hsf由氨基酸1-51組成的單一序列、表面外露且包括可變區(氨基酸52-106、121-124、191-210和230-234)的成熟蛋白(氨基酸52-479)氨基末端的頭區、頸區(氨基酸480-509)、疏水的α-螺旋區(氨基酸518-529)和其中4個跨膜鏈跨越外膜的錨定結構域(氨基酸539-591)。

雖然全長Hsf可用于本發明的免疫原性組合物中,但是各種Hsf截短物和缺失物也可有利地使用,這取決于疫苗的類型。

當Hsf用于亞單位疫苗中時,優選使用可溶性過客結構域的一部分;例如氨基酸52-479的完全結構域,最優選其保守部分,例如氨基酸134-479的特別有利的序列。Hsf的優選形式可被截短,以缺失在WO?01/55182中公開的蛋白可變區。優選的變體可包括在WO?01/55182中限定的1、2、3、4、或5個可變區的缺失。在N或C末端的任何一端或兩端,上述序列和下面描述的那些可被伸展或截短達1、3、5、7、10或15個氨基酸。

Hsf的優選片段因此包括Hsf的整個頭區,優選包含氨基酸52-473。Hsf的其它優選片段包括表面外露的頭區,它包括一個或多個下列氨基酸序列:52-62、76-93、116-134、147-157、157-175、199-211、230-252、252-270、284-306、328-338、362-391、408-418、430-440和469-479。

當Hsf存在于外膜小泡制品中時,它可被表達為全長蛋白或優選被表達為由氨基酸1-51和134-591的融合體組成的有利變體(產生氨基酸序列134-C末端的成熟外膜蛋白)。Hsf的優選形式可被截短,從而缺失WO?01/55182中公開的蛋白可變區。優選的變體可包括在WO01/55182中限定的1、2、3、4、或5個可變區的缺失。優選第一和第二個可變區缺失。優選的變體是使氨基酸序列52-237或54-237之間的殘基缺失,更優選使氨基酸52-133或55-133之間的殘基缺失。所述成熟蛋白可缺少信號肽。

Hap

對來源于腦膜炎奈瑟氏球菌的Hap-樣蛋白進行的計算機分析顯示出至少3個結構域。以來源于菌株H44/76的Hap-樣序列為例,包含氨基酸1-42的結構域1編碼自體轉運蛋白家族特征性的sec依賴性信號肽,包含氨基酸43-950的結構域2編碼很可能表面外露且易進入免疫系統的過客結構域,包含殘基951-C末端(1457)的結構域3被預測編碼可能裝配成桶-樣結構且被錨定在外膜中的β-鏈。因為結構域2可能是表面外露、良好保守的(在所有試驗菌株中超過80%)且可作為亞單位抗原在大腸桿菌中產生,因此它代表了目標疫苗候選物。因為結構域2和3很可能是表面外露且良好保守的(Pizza等人,(2000),Science?287:1816-1820),因此它們代表了目標疫苗候選物。結構域2被稱作過客結構域。

本發明的免疫原性組合物可包括全長Hap蛋白,優選被摻入到OMV制品中。本發明的免疫原性組合物還可包括Hap的過客結構域,在菌株H44/76中,其由氨基酸殘基43-950組成。Hap的這一片段可特別有利地用于本發明的亞單位組合物中。在N或C末端的任何一端或兩端,Hap過客結構域的上述序列可被伸展或截短達1、3、5、7、10、15、20、25、或30個氨基酸。

3.鐵獲得蛋白

鐵獲得蛋白包括TbpA(NMB?0461)(WO?92/03467,US5912336,WO93/06861和EP?586266)、TbpB(NMB?0460)(WO?93/06861和EP?586266)、LbpA(NMB?1540)(Med?Microbiol(1999)32:1117)、LbpB(NMB1541)(WO/99/09176)、HpuA(U73112.2)(Mol?Microbiol.1997,23;737-749)、HpuB(NC.003116.1)(Mol?Microbiol.1997,23;737-749)、也被稱作XthA的P2086(NMB?0399)(13th?International?Pathogenic?Neisseria?Conference?2002)、FbpA(NMB?0634)、FbpB、BfrA(NMB?1207)、BfrB(NMB?1206)、也被稱作GNA2132的Lipo28(NMB?2132)、Sibp(NMB1882)、HmbR、HemH、Bcp(NMB?0750)、Iron(III)ABC轉運蛋白-通透酶蛋白(Tettelin等人,Science?287;1809-1815?2000)、Iron(III)ABC轉運蛋白-周質(Tettelin等人,Science?287;1809-1815?2000)、TonB依賴性受體(NMB?0964和NMB?0293)(Tettelin等人,Science?287;1809-1815?2000)和轉鐵蛋白結合蛋白相關蛋白(Tettelin等人,Science?287;1809-1815?2000)。這些蛋白可來源于腦膜炎奈瑟氏球菌、淋病奈瑟氏球菌或其它奈瑟氏球菌菌株。本發明還包括來源于奈瑟氏球菌的其它鐵獲得蛋白。

TbpA

TbpA與TbpB相互作用在奈瑟氏球菌外膜上形成蛋白復合體,其結合轉鐵蛋白。在結構上,TbpA包括具有TonB箱的胞內N-末端結構域和活塞結構域,該活塞結構域為多個由短胞內環和較長的胞外環連接的跨膜β鏈。

已經區別了TbpB的兩個家族,它們分別具有較高的分子量和較低的分子量。TbpB的高和低分子量形式與TbpA的不同家族結合,可以同源性為基礎區別該不同家族。盡管它們的分子量相似,但還是將它們稱作高分子量和低分子量家族,這是因為它們與TbpB的高或低分子量形式結合(Rokbi等人,FEMS?Microbiol.Lett.100;51,1993)。術語TbpA(高)和TbpA(低)用于表示TbpA的這兩種形式,且與TbpB相似。本發明的免疫原性組合物可包括來源于腦膜炎奈瑟氏球菌血清組A、B、C、Y和W-135的TbpA和TbpB以及來源于包括淋病奈瑟氏球菌在內的其它細菌的鐵獲得蛋白。轉鐵蛋白結合蛋白TbpA和TbpB已經被分別稱作Tbp1和Tbp2(Cornelissen等人,Infection?and?Immunity?65;822,1997)。

TbpA包括若干不同的區。例如,就來源于腦膜炎奈瑟氏球菌菌株H44/76的TbpA而言,氨基末端的186個氨基酸形成內部球狀結構域,22個β鏈跨越膜,形成β桶結構。這些是由短胞內環和較大的胞外環連接的。胞外環2、3和5具有最高程度的序列變異性且環5是表面外露的。環5和4參與配體結合。

TbpA的優選片段包括TbpA的胞外環。使用來源于腦膜炎奈瑟氏球菌菌株H44/76的TbpA序列,這些環與環1的氨基酸200-202、環2的氨基酸226-303、環3的氨基酸348-395、環4的氨基酸438-471、環5的氨基酸512-576、環6的氨基酸609-625、環7的氨基酸661-671、環8的氨基酸707-723、環9的氨基酸769-790、環10的氨基酸814-844和環11的氨基酸872-903相對應。在序列對比后,在其它Tbp蛋白中的相應序列也可構成優選片段。最優選的片段可包括構成Tbp的環2、環3、環4或環5的氨基酸序列。

當本發明的免疫原性組合物包括TbpA時,它優選同時包括TbpA(高)和TbpA(低)。

雖然優選TbpA存在于OMV疫苗中,但它也可以是亞單位疫苗的一部分。例如,可被引入到本發明免疫原性組合物中的分離的鐵獲得蛋白也是本領域熟知的(WO00/25811)。它們可在細菌宿主中表達,使用洗滌劑提取(例如2%Elugent)并通過親和層析或使用本領域熟知的標準柱層析技術純化(Oakhill等人,Biochem?J.2002364;613-6)。

當TbpA存在于OMV疫苗中時,它的表達可通過此處討論的基因技術上調,或可優選通過親代菌株在下述鐵有限條件下生長而被上調。該方法還可導致可變鐵-調節蛋白,特別是FrpB的上調,其可變為免疫顯性的且它因此可按下面所述有利地下調這種蛋白(特別是FrpB)的表達(且優選使編碼這種蛋白的基因缺失),以確保本發明的免疫原性組合物引發抗存在于大范圍奈瑟氏球菌菌株中的抗原的免疫反應。它優選具有存在于免疫原性組合物中的TbpA(高)和TbpA(低),且優選這是通過將來源于表達TbpA可選擇形式的兩種菌株的OMV混合獲得的。

4.毒素

毒素包括FrpA(NMB?0585;NMB?1405)、FrpA/C(見下面的定義)、FrpC(NMB?1415;NMB?1405)(WO?92/01460)、NM-ADPRT(NMB?1343)(13thInternational?Pathogenic?Neisseria?Conference?2002?Masignani等人,p135)、VapD(NMB?1753)、脂多糖(LPS;也被稱作脂低聚糖或LOS)免疫型L2和LPS免疫型L3。FrpA和FrpC所含的區在這兩個蛋白之間是保守的且所述蛋白的優選片段是含有該保守片段的多肽,優選含有FrpA/C序列的氨基酸227-1004。這些抗原可來源于腦膜炎奈瑟氏球菌或淋病奈瑟氏球菌或其它奈瑟氏球菌菌株。本發明還包括來源于奈瑟氏球菌的其它毒素。

在可選擇性的實施方案中,毒素可包括參與毒性調節的抗原,例如在脂多糖合成中起作用的OstA。

FrpA和FrpC

腦膜炎奈瑟氏球菌編碼兩種RTX蛋白,它們被稱作FrpA和FrpC,是在鐵有限條件下分泌的(Thompson等人,(1993)J.Bacteriol.175:811-818;Thompson等人,(1993)Infect.Immun.61:2906-2911)。RTX(重復毒素)蛋白家族在靠近它們的C-末端處共有下列一致序列的一系列9個氨基酸重復單位:Leu?Xaa?Gly?Gly?Xaa?Gly(Asn/Asp)AspXaa(LXGGXGN/DDX)。大腸桿菌HlyA中的重復單位被認為是Ca2+結合的位點。正如在圖4中所描繪的,腦膜炎球菌FrpA和FrpC蛋白,正如在菌株FAM20中所表征的,在它們的中心和C-末端區共有廣泛的氨基酸相似性但在N-末端的相似性(如果有的話)非常有限。此外,由于9個氨基酸基序的重復(在FrpA中重復13次、在FrpC中重復43次),在FrpA和FrpC之間保守的區顯示出某些多態性。

本發明的免疫原性組合物可包括全長FrpA和/或FrpC或優選,含有在FrpA和FrpC之間保守的序列的片段。所述保守序列是由9個氨基酸的重復單位構成的。本發明的免疫原性組合物優選包括多于3個重復單位、多于10個重復單位、多于13個重復單位、多于20個重復單位或多于23個重復單位。

這種截短物具有較之全長分子更有利的性質且包含這種抗原并被摻入到本發明的免疫原性組合物中的疫苗形成本發明的獨立方面。

在FrpA和FrpC之間保守的序列被命名為FrpA/C,且當FrpA或FrpC形成本發明免疫原性組合物的組分時,可有利地使用FrpA/C。FrpA序列的氨基酸277-1004是優選的保守區。在N或C末端的任何一端或兩端,上述序列可被伸展或截短達1、3、5、7、10、15、20、25、或30個氨基酸。

LPS

LPS(脂多糖,也被稱作LOS-脂低聚糖)是奈瑟氏球菌外膜上的內毒素。已知LPS的多糖部分可誘導殺菌抗體。

LPS低聚糖部分內的異質性在不同的奈瑟氏球菌菌株之間產生結構和抗原多樣性(Griffiss等人,Inf.Immun.1987;55:1792-1800)。這已被用于將腦膜炎球菌菌株細分成12個免疫型(Scholtan等人,JMed?Microbiol?1994,41:236-243)。免疫型L3、L7和L9在免疫學方面是相同的且在結構上是相似的(或甚至是相同的)并因此已被命名為L3、7、9(或,為了本說明書的目的,統稱為“L3”)。腦膜炎球菌LPS?L3、7、9(L?3)、L2和L5可通過唾液酸化,或通過加入胞苷5′-一磷酸-N-乙酰基神經氨酸而被修飾。雖然L2、L4和L6LPS在免疫學方面是可區別的,但它們在結構上相似,且在此處提到L2時,L4或L6在本發明的范圍內可被任選替代。見M.P.Jenni?ngs等人,Microbiology?1999,145,3013-3021和Mol?Microbiol?2002,43:931-43,其中進一步舉例說明了LPS的結構和異質性。

當LPS,優選腦膜炎球菌LPS包括在本發明的疫苗中時,優選且有利地存在免疫型L2和L3之一或兩者。LPS優選存在于外膜小泡中(優選用低百分比的洗滌劑,更優選0-0.5%、0.02-0.4%、0.04-0.3%、0.06-0.2%、0.08-0.15%或0.1%,最優選脫氧膽酸鹽[DOC]提取小泡時),還可以是亞單位疫苗的一部分。LPS可使用熟知的過程,包括熱水-苯酚過程分離(Wesphal和Jann?Meth.Carbo.Chem.5;83-91?1965)。還可見Galanos等人,Eur?J?Biochem?9:245-249,和Wu等人,1987,Anal?Bio?Chem?160:281-289。LPS可簡單使用或與T-細胞表位的來源,如破傷風類毒素、白喉類毒素、CRM-197或OMV外膜蛋白綴合使用。使分離的LOS綴合的技術也是已知的(見,例如,EP?941738,其引入此處作為參考)。

當LOS(特別是本發明的LOS)存在于皰制劑中時,優選通過使LOS與也存在于皰制劑上的一種或多種外膜蛋白(例如,腦膜炎球菌中的PorA或PorB)綴合的方法使LOS原位綴合。

該方法可有利地提高皰制劑內LOS抗原的穩定性和/或免疫原性(提供T-細胞幫助)和/或抗原性-因此以其保護性最強的構象為非T-依賴性低聚糖免疫原提供T-細胞幫助-如在其天然環境中的、腦膜炎球菌外膜表面上的LOS。此外,LOS在皰內的綴合可導致LOS解毒(脂類A部分被穩定埋藏在外膜中,因此很少引起毒性)。因此,這里提到的從htrB-或msbB-突變體中分離皰,或通過向組合物中加入多粘菌素B的無毒肽功能性等價物的解毒方法(見WO?93/14115、WO?95/03327、Velucchi等人,(1997)J?Endotoxin?Res?4:1-12,和EP?976402,多粘菌素B的無毒肽功能性等價物的進一步描述-特別是(序列KTKCKFLKKC,其中2個半胱氨酸形成二硫鍵)肽SAEP?2的使用)可能并不是必需的(但其可被加入到組合中用于增加安全性)。因此,本發明人已經發現包括皰的組合物可形成用于治療或預防由衍生皰的生物所引起疾病的疫苗基礎,其中存在于皰中的LOS已以皰內模式與同時存在于皰中的外膜蛋白綴合,其中這種疫苗基本上是無毒的且能夠誘導抗其天然環境中的LOS的T-依賴性殺菌反應。

本發明因此進一步提供這種皰內LOS綴合的腦膜炎球菌皰制品。

這種皰制品是否可從正極討論的細菌(見WO?01/09350)中被分離出來,然后經過已知的綴合化學過程使LOS低聚糖部分上的基團(例如,NH2或COOH)與皰外膜蛋白上的基團(例如,NH2或COOH)綴合還在討論。可使用利用戊二醛、甲醛、或戊二醛/甲醛混合物的交聯技術,但優選使用選擇性更強的化學過程如EDAC或EDAC/NHS(J.V.Staros,R.W.Wright和D.M.Swingle.Enhancement?by?N-hydroxysuccinimide?of?water-soluble?carbodiimide-mediated?coupling?reactions.Analytical?chemistry?156:220-222(1986);和Bioconjugates?Techniques.Greg?T.Hermanson(1996)pp?173-176)。可使用的、能夠在LOS與蛋白分子之間生成共價鍵的其它綴合化學過程或處理在EP?941738中描述。

優選皰制品在沒有莢膜多糖存在的條件下綴合。所述皰可從不(按照下面所述天然地或經由突變)產生莢膜多糖的菌株中分離,或可從絕大多數且優選全部污染莢膜多糖中純化。以這種方式,皰內LOS綴合反應更加有效。

優選存在于皰中的超過10、20、30、40、50、60、70、80、90、或95%的LOS是交聯的/綴合的。

皰內綴合應優選整合下列方法的1、2或全部3個步驟:綴合pH應大于pH?7.0,優選大于或等于pH?7.5(最優選在pH?9下);在反應過程中應當維持1-5%、優選2-4%、最優選約3%蔗糖的條件;在綴合反應中應當將NaCl降到最低,優選0.1M、0.05M、0.01M、0.005M、0.001M、且最優選根本不存在。所有這些方法特征可確保在整個綴合過程中皰均保持穩定且保持在溶液中。

EDAC/NHS綴合方法是皰內綴合的優選方法。EDAC/NHS優于甲醛,甲醛可交聯至非常高的程度,由此不利地影響濾過率。EDAC與羧酸(如LOS中的KDO)反應,產生活性酯中間體。在有胺親核試劑(如外膜蛋白,如PorB中的賴氨酸)存在的條件下,酰胺鍵是用異脲副產物的釋放形成的。然而,EDAC-介導的反應的效能可通過Sul?fo-NHS酯中間體的形成而增加。Sulfo-NHS酯在水溶液中存在的時間比EDAC單獨與羧酸鹽反應形成的活性酯要長。因此,更高產率酰胺鍵的形成可使用這種兩階段方法實現。EDAC/NHS綴合在J.V.Staros,R.W.Wright和D.M.Swingle.Enhancement?by?N-hydroxysuccinimide?of?water-soluble?carbodiimide-mediated?coupling?reactions.Analytical?chemistry?156:220-222(1986);和Bioconjugates?Techniques.Greg?T.Hermanson(1996)pp?173-176中討論。優選在反應中使用0.01-5mg?EDAC/mg皰、更優選0.05-1mg?EDAC/mg皰。所用EDAC的量取決于存在于樣品中的LOS量,而其又依次取決于用于提取皰的脫氧膽酸鹽(DOC)%。在低%DOC(例如,0.1%)下,使用較大用量的EDAC(1mg/mg及以上),然而在高%DOC(例如0.5%)下,使用較小用量的EDAC(0.025-0.1mg/mg)以避免太多皰間交聯。

因此本發明的方法優選是用于產生皰內綴合LOS(優選腦膜炎球菌)的方法,該方法包括在有EDAC/NHS存在、pH?7.0-pH?9.0(優選約pH?7.5)、1-5%(優選約3%)蔗糖、且任選在基本上沒有NaCl(如上所述)的條件下使皰綴合,并分離反應混合物中綴合皰的步驟。

所述反應隨后使用抗-LOS(例如,抗-L2或抗-L3)mAb在反應混合物的蛋白質分離凝膠上進行,其顯示隨著反應時間的進行,皰中LOS的比例增大,LOS的分子量增加。

使用這種技術可回收的皰產率99%。

人們發現EDAC是一種極好的皰內交聯劑,這是因為它可使LOS與OMP充分交聯,用于提高LOS?T-依賴性免疫原性,但不會使它交聯至非常高的程度而導致如濾過率較差、聚集和皰間交聯的問題發生。所產生的皰的形態學與未綴合的皰相似(利用電子顯微鏡)。此外,上述方案可避免發生過度交聯(其可降低天然存在于皰表面上的保護性OMP,例如TbpA或Hsf的免疫原性)。

優選衍生皰的腦膜炎球菌是不能產生莢膜多糖的突變株(例如,下述突變株的其中一種,特別是siaD-)。還優選可有效抗腦膜炎球菌病的免疫原性組合物同時包含L2和L3皰,其中L2和L3LOS均與皰外膜蛋白綴合。此外,優選皰內綴合皰中的LOS結構與從lgtB-腦膜炎球菌菌株衍生的一致(如下所述)。最優選免疫原性組合物包括皰內綴合的皰:來源于不能產生莢膜多糖且是lgtB-的突變腦膜炎球菌菌株;包含來源于不能產生莢膜多糖的突變腦膜炎球菌菌株的L2和L3皰;包含來源于lgtB-突變腦膜炎球菌菌株的L2和L3皰;或最優選包含來源于不能產生莢膜多糖且是lgtB-的突變腦膜炎球菌菌株的L2和L3皰。

可用于本發明的一般L3腦膜炎球菌菌株是H44/76menB菌株。一般的L2菌株是B16B6menB菌株或39E腦膜炎球菌C型菌株。

如上所述,本發明的皰已通過綴合作用被解毒至一定程度,且無需進一步解毒,然而進一步的解毒方法可用于增加安全性,例如,使用來源于htrB-或msbB-腦膜炎球菌菌株的皰或向皰組合物中加入多粘菌素B的無毒肽功能性等價物[與脂類A具有較高親和性的分子](優選SEAP?2)(如上所述)。

在上述方法中,提供腦膜炎球菌泡及含有皰的免疫原性組合物,其具有重要的抗原LOS,該抗原基本上無毒,沒有自身免疫性問題,具有T-依賴性特征,存在于其天然環境中,且能夠誘導抗超過90%腦膜炎球菌菌株的殺菌抗體反應(在L2+L3組合物的情況下)。

優選皰內LOS綴合應整合下列方法的1、2、或全部3個步驟:綴合pH應大于pH?7.0,優選大于或等于pH?7.5(最優選在pH?9下);在反應過程中應當維持1-5%、優選2-4%、最優選約3%蔗糖的條件;在綴合反應中應當將NaCl降到最低,優選0.1M、0.05M、0.01M、0.005M、0.001M、且最優選根本不存在。所有這些方法特征可確保在整個綴合過程中皰保持穩定且保持于溶液中。

雖然可通過各種技術和化學過程使LOS與外膜蛋白在皰內綴合,但EDAC/NHS綴合方法是皰內綴合的優選方法。EDAC/NHS優于甲醛,甲醛可交聯至非常高的程度,由此對濾過率有不利的影響。EDAC與羧酸反應,產生活性酯中間體。在有胺親核試劑存在的條件下,酰胺鍵是用異脲副產物的釋放形成的。然而,EDAC-介導的反應的效能可通過Sulfo-NHS酯中間體的形成而增加。Sulfo-NHS酯在水溶液中存在的時間比EDAC單獨與羧酸鹽反應形成的活性酯要長。因此,更高產率酰胺鍵的形成可使用這種兩階段方法實現。EDAC/NHS綴合在J.V.Staros,R.W.Wright和D.M.Swingle.Enhancement?by?N-hydroxysuccinimide?of?water-soluble?carbodiimide-mediated?coupling?reactions.Analytical?chemistry?156:220-222(1986);和Bioconjugates?Techniques.Greg?T.Hermanson(1996)pp?173-176中討論。

因此本發明的方法優選是用于產生皰內綴合LOS(優選腦膜炎球菌)的方法,該方法包括在有EDAC/NHS存在、pH?7.0-pH?9.0(優選約pH?7.5)的pH、1-5%(優選約3%)蔗糖、且任選基本上沒有NaCl(如上所述)的條件下使皰綴合,以及從反應混合物中分離綴合皰的步驟。

所述反應隨后使用抗-LOS(例如,抗-L2或抗-L3)mAb在反應混合物的分離凝膠上進行,其顯示隨著反應時間的進行,皰中LOS的比例增大,LOS的分子量增加。

使用這種技術可回收的皰產率99%。

人們發現EDAC是一種極好的皰內交聯劑,這是因為它可使LOS與OMP充分交聯,用于提高LOS?T-依賴性免疫原性,但不會使它交聯至非常高的程度而導致如濾過率較差和皰間交聯的問題發生。此外,應當避免過度交聯,從而避免天然存在于皰表面上的保護性OMP,例如Tbp免疫原性的任何降低。

5.整合外膜蛋白

奈瑟氏球菌蛋白的其它種類也可以是包括在本發明奈瑟氏球菌疫苗中的候選物,且能夠以令人吃驚的有效方式與其它抗原組合。膜相關蛋白、特別是整合膜蛋白且最有利地是外膜蛋白,特別是整合外膜蛋白可用于本發明的組合物中。這種蛋白的例子是也被稱作Omp1A的Pld?A(NMB?0464)(WO00/15801),其是奈瑟氏球菌磷脂酶外膜蛋白。其它例子是TspA(NMB?0341)(Infect.Immun.1999,67;3533-3541)和TspB(T-細胞刺激蛋白)(WO?00/03003;NMB?1548、NMB?1628或NMB1747)。其它例子包括PilQ(NMB?1812)(WO99/61620)、也被稱作D15-的OMP85(NMB0182)(WO00/23593)、NspA(U52066)(WO96/29412)、FhaC(NMB?0496或NMB?1780)、PorB(NMB?2039)(Mol.Biol.Evol.12:363-370,1995)、HpuB(NC.003116.1)、TdfH(NMB1497)(Microbiology?2001,147;1277-1290)、OstA(NMB0280)、也被稱作GNA33和Lipo30的MltA(NMB0033)、HtrA(NMB?0532;WO99/55872)、HimD(NMB?1302)、HisD(NMB?1581)、GNA?1870(NMB?1870)、HlpA(NMB?1946)、NMB?1124、NMB?1162、NMB?1220、NMB?1313、NMB?1953、HtrA、TbpA(NMB?0461)(WO?92/03467)(還可見上面的鐵獲得蛋白)和LbpA(NMB?1541)。

OMP85

本發明的免疫原性組合物可包括全長OMP85,優選作為OMV制品的一部分。OMP85的片段也可用于本發明的免疫原性組合物中,特別是,優選將由氨基酸殘基1-475或50-475組成的OMP85表面外露結構域摻入到本發明免疫原性組合物的亞單位組分中。在N或C末端的任何一端或兩端,OMP85的表面外露結構域的上述序列可被伸展或截短達1、3、5、7、10、15、20、25、或30個氨基酸。優選刪除OMP85片段的信號序列。

OstA

OstA可在脂多糖的合成中發揮作用且可被認為是毒性調節劑。OstA可選擇性地包括在毒素類中,其中毒素種類被擴大至包括毒性調節劑以及毒素。

免疫原性組合物

免疫原性組合物是包括至少一種抗原的組合物,當給予宿主時,所述抗原能夠產生免疫反應。優選,這種免疫原性制品能夠產生抗奈瑟氏球菌,優選抗腦膜炎奈瑟氏球菌或淋病奈瑟氏球菌感染的保護性免疫反應。

本發明涉及包括至少兩種抗原的免疫原性組合物,其優選可引發協同殺菌、保護性或粘附阻斷反應的一種或多種。

本發明的SBA殺菌測定法

這種協同反應可通過由抗原組合引發的SBA來表征,抗原組合引發的SBA較之由每個抗原單獨引發的SBA要高至少50%、2倍、3倍、優選4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍且最優選10倍。優選SBA是相對于衍生抗原的同源性菌株測量的,且優選是相對于一組異源性菌株測量的。(見下面代表性小組,例如屬于A-4聚簇的BZ10(B:2b:P1.2);屬于ET-37復合體的B16B6(B:2a:P1.2);和H44/76(B:15:P1.7,16))。SBA是最普遍認可的免疫學標記,可評價腦膜炎球菌疫苗的功效(Perkins等人,J?Infect?Dis.1998,177:683-691)。令人滿意的SBA可通過任何已知方法測定。SBA可利用從動物模型或人類受試者獲得的血清進行(見實施例17-20)。

用人血清進行SBA的優選方法如下。在第一次接種前、第二次接種后2個月和第三次接種后1個月(1年中進行3次接種是一般的人類初次接種程序,例如在第0、2和4個月或第0、1、或6個月時給予)采集血液樣品。這種人類初次接種程序可對1歲以下的嬰兒進行(例如,與Hib接種同時進行),或也可給2-4歲的兒童或青少年接種以測試這種初次接種程序的SBA。如果適合,可在初次接種后6-12個月以及激發劑量后1個月再次采集血液樣品。

如果在(初次接種程序的)第三支疫苗給藥后一個月(在2-4歲兒童或青少年中,但優選在生命第一年的嬰兒中),抗衍生本發明抗原的腦膜炎球菌菌株的SBA(抗體稀釋度)效價(與接種前效價相比)增加4倍的受試者百分比超過30%、優選超過40%、更優選超過50%、最優選超過60%受試者,那么對于具有同源殺菌活性的抗原或皰制品而言,SBA是令人滿意的。

當然,如果它也可相對于衍生它的腦膜炎球菌菌株引發令人滿意的SBA的話,則具有異源殺菌活性的抗原或皰制品也可構成具有同源殺菌活性的皰制品。

如果在(初次接種程序的)第三支疫苗給藥后一個月(在2-4歲兒童或青少年中,但優選在生命第一年的嬰兒中),抗腦膜炎球菌3種異源菌株的SBA(抗體稀釋度)效價(與接種前效價相比)增加4倍的受試者百分比超過20%、優選超過30%、更優選超過35%、最優選超過40%受試者,那么對于具有異源殺菌活性的抗原或皰制品而言,SBA是令人滿意的。這種試驗是具有異源殺菌活性的抗原或皰制品是否可誘導抗各種腦膜炎球菌菌株的交叉殺菌抗體的良好表征。所述三種異源菌株應當優選具有彼此不同且優選與制備或衍生具有異源殺菌活性的抗原或皰制品的菌株不同的電泳型(ET)-復合體或多基因座序列分型(MLST)模式(見Maiden等人,PNAS?USA?1998,95:3140-5)。本領域技術人員應當能夠很容易地測定具有不同ET-復合體的三種菌株,其可反映在腦膜炎球菌之間,特別是腦膜炎球菌B型菌株之間觀察到的基因多樣性,這些菌株被認為是重要疾病負擔的原因和/或代表認可的MenB劇毒譜系(見Maiden等人,見上)。例如,可使用的三種菌株是下列:屬于A-4聚簇的BZ10(B:2b:P1.2);屬于ET-37復合體的B16B6(B:2a:P1.2);和屬于ET-5復合體的H44/76(B:15:P1.7,16),或屬于同一ET/聚簇的任何其它菌株。這種菌株可用于測試從例如屬于ET-S復合體的腦膜炎球菌菌株CU385(B:4:P1.15)制備或衍生的、具有異源殺菌活性的抗原或皰制品。可使用的其它樣品菌株來源于譜系3流行性克隆(例如,NZ124[B:4:P1.7,4])。另一ET-37菌株是NGP165(B:2a:P1.2)。

測量SBA活性的方法是本領域已知的。例如,可使用的方法在WO99/09176的實施例10C中描述。在一般情況中,所試驗的菌株培養物是在生長的對數期(優選在鐵缺失的條件中-通過向生長培養基中加入鐵螯合劑如EDDA)生長的。可將其懸浮在具有BSA的培養基(如具有0.3%BSA的Hanks培養基)中,以便獲得調至約20000CFU/ml的試驗細胞懸浮液。一系列反應混合物可通過將一系列2倍稀釋的試驗血清(優選在56℃熱滅活30分鐘)[例如,50μl/孔體積]和20000CFU/ml試驗的腦膜炎球菌菌株懸浮液(例如,25μl/孔體積)混合而制備。應培養(例如,37℃15分鐘)并振搖(例如,210rpm)反應小瓶。此外,終反應混合物[例如,100μl體積]還可包含補體源[如,25%終體積的預試幼兔血清],并按照上面所述培養[例如,37℃60分]。無菌的聚苯乙烯U-底96-孔微量滴定平板可用于該測定法。可使用多道移液器從每個孔中采集等分試樣[例如,10μl],滴在Mueller-Hinton瓊脂平板(優選含有1%Isovitalex和1%熱滅活的馬血清)上并培養(例如,在37℃、5%CO2中培養18小時)。優選,單獨的菌落高達80CFU/等分試樣。將下列三種試驗樣品用作對照:緩沖液+細菌+補體;緩沖液+細菌+滅活補體;血清+細菌+滅活補體。SBA效價可使用程序直接計算,該程序可對數據進行加工從而得到稀釋度的測量值,該測量值與通過回歸計算得到的50%細胞死亡相對應。

動物保護測定法

可選擇性地,協同反應可通過抗原組合在動物保護測定法中的功效而表征。例如,可使用實施例12或13中描述的測定法。優選,與單獨使用抗原,特別是抗原的次優劑量相比,通過抗原組合而得到保護的動物數量明顯增加。

用于防止淋病奈瑟氏球菌感染的成功疫苗可能需要不止一個下列要素:血清和/或粘膜抗體的產生以促進補體介導的淋球菌死亡,和/或通過白細胞如多形核白細胞提高吞噬作用并殺死微生物,和/或防止淋球菌附著于宿主組織;誘導細胞介導的免疫反應,它們也可參與保護。

本發明皰淋病疫苗制品功效的提高可通過分析誘導的血清和/或粘膜抗體免疫反應來評價,它們具有抗粘附和/或調理性和/或殺菌活性,如其他人所述(McChesney?D等人,Infect.Immun.36:1006,1982;Boslego?J等人:Efficacy?trial?of?a?purified?gonococcl?pilus?vaccine,in?Program?and?Abstracts?of?the?24th?Interscience?Conference?on?Antimicrobial?Agents?and?Chemotherapy,Washington,American?Society?for?Microbiology,1984;Siegel?M等人,J.Infect.Dis?145:300,1982;de?la?Pas,Microbiology,141(Pt4):913-20,1995)。

近來描述了由淋病奈瑟氏球菌所致的生殖器感染小鼠模型(Plante?M,J.Infect.Di?s.,182:848-55,2000)。本發明皰淋病疫苗功效的提高還可通過其防止或降低淋病奈瑟氏球菌在這種小鼠感染模型中定居的能力而評價。

粘附阻斷測定法

可選擇性地,協同反應可通過抗原組合在粘附阻斷測定法中的功效而表征。例如,可使用實施例11中描述的測定法。優選與使用抗單獨抗原產生的抗血清,特別是次優劑量的抗體相比,由抗抗原組合產生的抗血清誘導的阻斷程度顯著提高。

亞單位組合物

本發明的免疫原性組合物可以是一種亞單位組合物。亞單位組合物是在將組分混合形成抗原性組合物之前,其中組分已經被分離并純化到至少50%、優選至少60%、70%、80%、90%純度的組合物。

本發明的免疫原性亞單位組合物優選包括選自下列的至少2種抗原:FhaB、PilC、Hsf、Hap、NadA、OMP85、IgA蛋白酶、AspA、AspA的過客結構域、Hsf的過客結構域、Hap的過客結構域、FrpA、FrpC、TbpA、TbpB、LbpA、LbpB、HpuA、HpuB、TspA、TspB、PldA、PilQ、FhaC、NspA、和LPS免疫型L2和LPS免疫型L3之一或兩者。

亞單位組合物可以是水溶性蛋白的水溶液。它們可包含洗滌劑、優選非-離子、兩性離子或離子洗滌劑,以便使抗原的疏水部分溶解。它們可包含脂類,這樣就可形成脂質體結構,使抗原以跨越脂膜的結構呈遞。

外膜小泡制品

腦膜炎奈瑟氏球菌血清組B(menB)分泌足量的外膜皰從而使得能夠以工業規模制造它們。外膜小泡還可經由用洗滌劑提取細菌細胞的方法制備(見例如,EP?11243)。

本發明的免疫原性組合物還可包括具有至少兩種抗原的外膜小泡制品,所述抗原已被上調,或者被重組上調或通過其它方式被上調,包括在鐵-缺失條件下生長。在這種外膜小泡制品中被上調的抗原的例子包括:NspA、Hsf、Hap、OMP85、TbpA(高)、TbpA(低)、LbpA、TbpB、LbpB、PilQ、AspA、TdfH、PorB、HpuB、P2086、NM-ADPRT、MafA、MafB和PldA。這種制品還可任選包括LPS免疫型L2和LPS免疫型L3之一或兩者。

來源于奈瑟氏球菌菌株的皰制品的制備可通過本領域技術人員熟知的任何方法獲得。優選使用在EP?301992、US5,597,572、EP?11243或US4,271,147、Frederikson等人(NIPH?Annals[1991],14:67-80)、Zollinger等人,(J.Clin.Invest.[1979],63:836-848)、Saunders等人,(Infect.Immun.[1999],67:113-119)、Drabick等人(Vaccine[2000],18:160-172)或WO01/09350(實施例8)中公開的方法。通常,使用洗滌劑,優選脫氧膽酸鹽提取OMV,且核酸被任選酶促除去。純化是通過超速離心后,任選接著進行大小排阻層析實現的。如果包括本發明2種或多種不同的皰,則它們可在單一容器中組合形成本發明的多價制品(雖然制品也被認為是多價的,如果本發明的不同皰是處于單獨容器中的單獨組合物,但它們是在同一時間[由同一醫師]給予宿主的]。OMV制品通常是通過0.2μm濾器過濾而滅菌的,且優選貯存在蔗糖溶液(例如3%)中,該蔗糖溶液已知可使皰制品溶解。

蛋白在外膜小泡制品內的上調可通過將基因的附加拷貝插入到衍生OMV制品的奈瑟氏球菌菌株中而獲得。可選擇性地,可將衍生OMV制品的奈瑟氏球菌菌株中的基因啟動子交換成較強的啟動子。這種技術在WO01/09350中描述。與從未修飾的腦膜炎奈瑟氏球菌(例如菌株H44/76)衍生的OMV中存在的蛋白水平相比,蛋白的上調將導致OMV中存在的蛋白水平更高。優選所述水平要高1.5、2、3、4、5、7、10或20倍。

當LPS是OMV中的附加抗原時,使用低濃度提取洗滌劑(例如,脫氧膽酸鹽或DOC)的方案可優選用于OMV制備方法中,以便保持高水平的結合LPS而特別除去有毒的結合較差的LPS。所用DOC的濃度優選0-0.5%DOC、0.02-0.4%DOC、0.04-0.3%DOC,更優選0.06%-0.2%DOC或0.08-0.15%DOC,最優選約或準確的0.1%DOC。

“強的啟動子序列”是指增加編碼目標抗原的基因轉錄的調節控制元件。

“上調表達”是指相對于未修飾(即天然存在的)皰而言,可提高目標抗原表達的任何方式。應當了解‘上調’的量取決于特定的目標抗原,但不會超出破壞皰的膜完整性的量。抗原的上調是指較之未修飾的皰高至少10%的表達。優選高至少50%。更優選高至少100%(2倍)。最優選高3、4、5、7、10、20倍。可選擇性地或附加地,上調表達是指就代謝或營養變化而言表達是非-條件性的,特別是在TbpA、TbpB、LbpA和LbpB的情況下。優選當從在鐵有限條件中生長的細菌中衍生皰時,評價表達水平(例如在有鐵螯合劑存在的條件下)。

又為了清楚的目的,術語‘將細菌菌株進行改造以產生較少所述抗原’或下調是指相對于未修飾的(即天然存在的皰)而言,優選通過缺失使目標抗原表達(或功能性基因產物的表達)降低的任何方式,這樣表達較之未修飾的皰要低至少10%。優選低至少50%且最優選完全缺乏。如果下調蛋白是酶或功能性蛋白,則下調可通過引入一次或多次突變而獲得,導致酶或功能活性降低10%、20%、50%、80%或優選100%。

調節奈瑟氏球菌蛋白表達所需的改造步驟可以以本領域技術人員已知的各種方式進行。例如,可插入序列(例如,啟動子或開放閱讀框),并通過轉座子插入技術破壞啟動子/基因。例如,上調基因的表達時,可經由轉座子將強啟動子插入到基因起始密碼子的直到2kb上游(更優選200-600bp上游,最優選約400bp上游)。還可利用點突變或缺失(特別是對基因的下調表達而言)。

然而,這種方法可能相當不穩定或不確定,且因此優選改造步驟是經由同源重組事件進行。優選,該事件發生在細菌染色體上至少30個核苷酸的序列(誘重組區)和在菌株內轉化的載體上至少30個核苷酸的序列(第二誘重組區)之間。優選該區是40-1000個核苷酸,更優選100-800個核苷酸,最優選500個核苷酸。這些誘重組區應當足夠相似,這樣它們就能夠在十分嚴格的條件下彼此雜交。

用于進行此處所述基因修飾事件的方法(如通過重組事件將基因上調或下調并將其它基因序列引入到奈瑟氏球菌基因組中)在WO01/09350中描述。可在奈瑟氏球菌中被整合的一般強啟動子是porA、porB、lgtF、Opa、p110、lst、和hpuAB。PorA和PorB是優選的組成型強啟動子。已經確定了PorB啟動子活性包含在與PorB起始密碼子上游的核苷酸1-250相對應的片段中。

通過在鐵有限培養基中生長而上調抗原的表達

本發明外膜小泡制品中某些抗原的上調優選通過分離在鐵有限條件下生長的奈瑟氏球菌親代菌株中的外膜小泡而實現。培養基中低濃度的鐵將導致參與鐵獲得的蛋白表達增加,包括TbpA、TbpB、LbpA、LbpB、HpuA、HpuB和P2086。這些蛋白的表達由此被上調而無需重組修飾所涉及的基因,例如通過插入較強的啟動子或插入基因的附加拷貝。本發明還包括通過在鐵有限培養基中生長而上調鐵獲得蛋白,其中所述基因也已被重組修飾。

鐵有限是通過向培養基中加入鐵螯合劑而實現的。適宜的鐵螯合劑包括2,2-雙吡啶,EDDHA(乙二胺-二(o-羥基苯乙酸)和Desferal(甲磺酸去鐵胺,Sigma)。Desferal是優選的鐵螯合劑且以10-100μM、優選25-75μM、更優選50-70μM、最優選60μM的濃度加入到培養基中。培養基的鐵內含物主要來源于酵母提取物和大豆胨組分,且存在的用量可根據批次而變化。因此,在不同批的培養基中,不同濃度的Desferal對于獲得鐵獲得蛋白的上調是最佳的。本領域技術人員應當能夠很容易地測定最佳濃度。在基礎條件下,應向培養基中加入充足的鐵螯合劑,從而上調所需鐵-調節蛋白的表達,但也不能過量而不利地影響細菌的生長。

優選將通過在鐵有限條件下生長的鐵獲得蛋白的上調與其它抗原的重組上調組合,從而獲得本發明的外膜小泡。

可變和非-保護性免疫顯性抗原的下調/除去

在細菌菌株中,很多表面抗原都是可變的且因此只能抗一組有限的緊密相關的菌株。本發明一方面涉及本發明的外膜小泡,其中其它蛋白的表達減少,或優選編碼可變表面蛋白的基因缺失。這種缺失導致產生皰的細菌菌株當以疫苗形式給藥時,抗各種菌株交叉反應性的潛能更強,這是由于保守蛋白(留存在外膜上)對接種者的免疫系統施加了更強的影響。可在本發明皰免疫原性組合物中被下調的奈瑟氏球菌中這種可變抗原的例子包括PorA、PorB、Opa。

可被下調或切斷的其它類型基因是在體內可被細菌很容易地接通(表達)或切斷的基因。因為由這種基因編碼的外膜蛋白并不總是存在于細菌上,因此這種蛋白在皰制品中的存在還可由于上述原因而對疫苗有效性有害。下調或缺失的優選例子是奈瑟氏球菌Opc蛋白。由含Opc的皰疫苗誘導的抗-Opc免疫性僅具有有限的保護能力,這是因為感染生物很容易變為Opc。

例如,這些可變或非-保護基因的表達可被下調,或最終被切斷。如此則具有將免疫系統集中于更好抗原上的優點,所述抗原僅少量存在于皰外表面上。下調還指表面外露的,上述外膜蛋白的可變免疫顯性環可被改變或缺失,從而產生免疫顯性較低的外膜蛋白。

下調表達的方法在WO01/09350中公開。在本發明的皰免疫原性組合物中被下調的優選蛋白組合包括PorA與OpA、PorA與OpC、OpA與OpC、PorA與OpA與OpC。

已知有4種不同的Opa基因存在于腦膜炎球菌基因組(Aho等人,1991Mol.Microbiol.5:1429-37)中,因此當提到Opa的表達被下調時,它是指優選存在于腦膜炎球菌中的1、2、3或(優選)全部4種基因都被下調。這種下調通常可按照WO01/09350所述基因工程進行或通過查找很容易發現的、天然的、穩定的腦膜炎球菌菌株而進行,它們自Opa基因座的表達較低或沒有。這種菌株可使用Poolman等人(1985J.Med.Micro.19:203-209)描述的技術發現,其中Opa-細胞具有與表達Opa的細胞不同的表型,這可通過在平板上或顯微鏡下觀察細胞外觀而見到。一旦找到,在進行發酵以使Opa缺失后,通過在細胞內含物上進行蛋白質印跡而顯示出該菌株是穩定的Opa-。

當外膜小泡中某些抗原的上調是通過在鐵有限條件下生長而實現的時,可變蛋白FrpB(Microbiology?142;3269-3274,(1996);J.Bacteriol.181;2895-2901(1999))也可被上調。本發明人已經發現,按照WO01/09350所述通過下調全部蛋白的表達或通過使FrpB可變區缺失而在這些環境下下調FrpB表達是有利的。如此可確保由免疫原性組合物引發的免疫反應針對存在于大范圍菌株中的抗原。在本發明的皰免疫原性組合物中,FrpB的下調優選與PorA和OpA、PorA和OpC、OpA和OpC、PorA和OpA和OpC的下調組合。

在本發明可選擇性的實施方案中,外膜小泡中的FrpB被下調,所述外膜小泡是從不是在鐵有限條件下生長的奈瑟氏球菌菌株制備的。

LPS解毒

本發明免疫原性組合物中的皰可經由WO01/09350公開的LPS解毒方法解毒。本發明LPS解毒的具體方法包括使WO01/09350中公開的htrB和/或msbB酶被下調/缺失。奈瑟氏球菌的msbB和htrB基因還分別被稱作lpxL1和lpxL2(WO00/26384)且這些基因的缺失突變是通過失去一個仲酰基鏈的msbB-突變LOS和失去兩個仲酰基鏈的htrB-突變LOS而從表型方面表征的。WO?93/14155和WO?95/03327描述了可用于本發明組合物中的多粘菌素B的無毒肽功能性等價物。

這種方法優選與皰提取方法組合,皰提取方法包括使用低水平的DOC、優選0-0.3%DOC、更優選0.05%-0.2%DOC、最優選約或準確的0.1%DOC。

LPS解毒的其它方法包括如上所述向皰制品中加入多粘菌素B的無毒肽功能性等價物(優選SAEP?2)。

交叉反應性多糖

將細菌外膜皰從有莢膜的革蘭氏陰性菌中分離出來常常導致莢膜多糖的共-純化。在某些情況下,這種“污染”材料可顯示有用,這是因為多糖可提高由其它皰組分產生的免疫反應。然而在其它情況下,污染性多糖材料在細菌皰制品中的存在可證明對皰在疫苗中的應用有害。例如,已經顯示出至少在腦膜炎奈瑟氏球菌的情況下,血清組B莢膜多糖不會帶來保護免疫性且很容易在人類中誘導不利的自身免疫反應。因此,可將本發明的外膜小泡從細菌菌株中分離出來用于皰的生產,其已被改造成沒有莢膜多糖。這樣一來皰即適用于人類。這種皰制品的特別優選的例子是來源于沒有莢膜多糖的腦膜炎奈瑟氏球菌血清組B的皰制品。

這可通過使用修飾的皰產生菌株實現,其中莢膜生物合成和/或輸出所需的基因已損壞。編碼莢膜多糖生物合成或輸出的基因的滅活可通過(優選使用上述同源重組技術)使控制區、編碼區或兩者突變(點突變、缺失或插入),或通過降低這種基因酶功能的任何其它方式而實現。此外,莢膜生物合成基因的滅活還可通過反義過量表達或轉座子誘變而實現。優選方法是使多糖生物合成及輸出所需的腦膜炎奈瑟氏球菌Lps基因的一部分或全部缺失。就該目的而言,置換質粒pMF121(在Frosh等人,1990,Mol.Microbiol.4:1215-1218中所述)可用于傳遞使cpsCAD(+galE)基因聚簇缺失的突變。

已經對抗L3或L2LPS所產生抗體的安全性產生了疑問,這是由于與存在于人鞘糖脂中的乳-N-neotetraose低聚糖基團(Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glcβ1-)相似的結構的存在。盡管已經有很多人安全接種了脫氧膽酸鹽提取的含有殘余量L3LPS的小泡疫苗(G.Bjune等人,Lancet(1991),338,1093-1096;GVG.Sierra等人,NIPH?ann(1991),14,195-210),LOS糖末端部分的缺失可有利地防止與存在于人組織表面的結構的任何交叉反應。在優選實施方案中,lgtB基因的滅活產生中間體LPS結構,其中缺少末端半乳糖殘基和唾液酸(突變留下L2和L3LOS中的4GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glcβ1-結構)。這種中間體可在L3和L2LPS菌株中獲得。LPS的可選擇性且不太優選的(短的)版本可通過關閉lgtE基因獲得。LPS的其它選擇性且不太優選的版本可通過關閉lgtA基因獲得。如果選擇這種lgtA-突變,優選還可關閉lgtC表達從而防止形成非免疫原性L1免疫型。

LgtB-突變體是最優選的,這是因為本發明人已經發現這是用于解決安全性問題同時仍然保留可誘導殺菌抗體反應的LPS保護性低聚糖表位的最佳截短。

因此,還包含L2或L3制品(純化的或在分離的皰中)的本發明免疫原性組合物或腦膜炎球菌皰制品通常有利地來源于奈瑟氏球菌菌株(優選腦膜炎球菌),它們已被基因工程改造成永久性下調來源于lgtB、lgtA或lgtE基因的功能性基因產物的表達,優選通過切斷基因,最優選通過使基因啟動子和/或開放閱讀框的全部或一部分缺失。

當本發明上述免疫原性組合物來源于腦膜炎球菌B菌株時,還優選除去莢膜多糖(其還包含人-樣糖結構)。雖然可將很多基因切斷以實現此目的,但本發明人有利地顯示優選已將皰產生菌株進行基因工程改造以永久下調siaD基因的功能性基因產物的表達(即,下調α-2-8聚唾液酸轉移酶的活性),優選通過切斷基因,最優選通過使基因啟動子和/或開放閱讀框的全部或一部分缺失。這種滅活在WO?01/09350中描述。siaD(也被稱作synD)突變是多種突變中最有利的,可除去莢膜多糖的人-相似表位,這是因為突變中僅有一種對LOS保護性表位的生物合成沒有作用,因此在最終使用LOS作為保護性抗原的方法中是有利的,且對細菌生長的作用最小。因此本發明的優選方面是上述皰免疫原性制品,其來源于lgtE-siaD-、lgtA-siaD-或優選lgtB-siaD-腦膜炎球菌B突變株。所述菌株本身是本發明的另一方面。

雖然由于上述原因siaD-突變是優選的,但也可使用切斷腦膜炎球菌B莢膜多糖合成的其它突變。因此,可將皰產生菌株進行基因工程改造以永久下調來源于下列一種或多種基因的功能性基因產物的表達:ctrA、ctrB、ctrC、ctrD、synA(相當于synX和siaA)、synB(相當于siaB)或synC(相當于siaC)基因,優選通過切斷基因,最優選通過使基因啟動子和/或開放閱讀框的全部或一部分缺失。lgtE-突變可與這些突變的一種或多種組合。優選lgtB-突變與這些突變的一種或多種組合。因此本發明另一方面是上述皰免疫原性制品,其來源于腦膜炎球菌B的這種組合突變株。所述菌株本身是本發明的另一方面。

含有各種lgt基因,包括lgtB和lgtE的奈瑟氏球菌基因座及其序列是本領域已知的(見M.P.Jennings等人,Microbiology?1999,145,3013-3021和其中引證的參考文獻,以及J.Exp.Med.180:2181-2190[1994])。

當把全長(未-截短的)LOS用于終產品中時,希望LOS沒有被唾液酸化(因為這種LOS可產生抗絕大多數危險的、侵入性腦膜炎球菌B菌株的免疫反應,所述菌株也未被唾液酸化)。在這種情況下,使用具有缺失synA(相當于synX和siaA)、synB(相當于siaB)或synC(相當于siaC)基因的莢膜陰性菌株是有利的,這是因為這種突變也可導致menB?LOS不能被唾液酸化。

在皰制品中,特別是在用低濃度DOC提取的制品中,可使用LPS作為本發明免疫原性組合物中的抗原。然而,可有利地將lgtE、lgtA(特別是與lgtC組合)、或優選lgtB基因/基因產物的酶功能下調/缺失/滅活,以便除去人樣乳-N-neotetraose結構。包含用于生物合成LPS低聚糖結構的lgt基因的奈瑟氏球菌基因座(及其序列)是本領域已知的(Jennings等人,Microbiology?1999?145:3013-3021和其中引證的參考文獻,以及J.Exp.Med.180:2181-2190[1994])。優選lgtB(或功能性基因產物)被下調/缺失,這是因為它可留下完整的LPS保護性表位。

在本發明的腦膜炎奈瑟氏球菌血清組B皰制品中,siaD和lgtB的下調/缺失是優選的,(雖然,在腦膜炎球菌B皰產生菌株中也可使用lgtB-與ctrA-、ctrB-、ctrC-、ctrD-、synA-(相當于synX-和siaA-)、synB-(相當于siaB-)或synC-(相當于siaC-)中任何一個的組合),得到具有最佳安全性和LPS保護性表位保留的皰制品。

本發明的另一方面是上述皰免疫原性制品,其來源于腦膜炎球菌B的這種組合突變株。所述菌株本身是本發明的另一方面。

本發明的免疫原性組合物可包括至少1、2、3、4或5種不同的外膜小泡制品。當包括兩種或多種OMV制品時,本發明至少一個抗原在各OMV中被上調。這種OMV制品可來源于相同種類和血清組的奈瑟氏球菌菌株或優選來源于不同種類、血清組、血清型、亞血清型或免疫型的奈瑟氏球菌菌株。例如,免疫原性組合物可包括一種或多種外膜小泡制品,其含有免疫型L2的LPS和含有免疫型L3的LPS的一種或多種外膜小泡制品。L2或L3OMV制品優選來源于穩定的菌株,其在LPS低聚糖合成基因座具有最小的相變異性。

與亞單位組合物組合的外膜小泡

本發明的免疫原性組合物還可包括亞單位組合物和外膜小泡。有若干抗原由于它們的溶解性而特別適于包括在亞單位組合物中。這種蛋白的例子包括:FhaB、NspA、Hsf的過客結構域、Hap的過客結構域、AspA的過客結構域、AspA、OMP85、FrpA、FrpC、TbpB、LbpB、PilQ。外膜小泡制品具有選自下列的至少一種不同抗原,其在外膜小泡中已被重組上調:NspA、Hsf、Hap、OMP85、TbpA(高)、TbpA(低)、LbpA、TbpB、LbpB、NadA、TspA、TspB、PilC、PilQ、TdfH、PorB、HpuB、P2086、NM-ADPRT、MafA、MafB和PldA;且任選包括LPS免疫型L2和LPS免疫型L3之一或兩者。

本發明具體的免疫原性組合物

在下列具體組合中,當抗原組合存在于泡中時,這種抗原組合應如上所述被上調。

本發明特別優選的實施方案包括自體轉運蛋白和鐵獲得蛋白,更優選Hsf和TbpA(高)和/或TbpA(低)。這種免疫原性組合物可優選進一步包括OMP?85、FrpA、FrpC、LbpA、LbpB、Lipo28、Sibp、NMB0964、NMB0293、TspA、NadA、TspB、PilQ、FhaC、NspA、PldA、HimD、HisD、GNA1870、OspA、HlpA、FhaB、PilC、Omp26、NMB0315、NMB0995、NMB1119、TdfH、PorB、HpuB、P2086、NM-ADPRT、VapD和Hap中的至少一種。所有上述免疫原性組合物還可包括LPS免疫型L2和LPS免疫型L3之一或兩者。

本發明的另一優選實施方案包括Hsf和選自下列的至少一種其它抗原:FrpA、FrpC、NM-ADPRT、VapD、LbpB、LbpA、TbpB、TbpA、P2086、HpuA、HpuB、Lipo28、Sibp、Hap、AspA、IgA蛋白酶、OMP85、NspA、PilQ、HimD、HisD、GNA1870、OspA、HlpA、FhaC、NadA、PldA、TspA、TspB、TdfH、PorB和FhaB。所有上述免疫原性組合物還可包括LPS免疫型L2和LPS免疫型L3之一或兩者。優選組合包括Hsf和OMP85(任選與Hap、FrpA或LbpB的一個或多個);Hsf和Hap(任選與FrpA、LbpB或OMP85的一個或多個);Hsf和FrpA(任選與Hap、LbpB或OMP85的一個或多個);Hsf和LbpB(任選與Hap、OMP85或FrpA的一個或多個)。由于Hsf既是粘附素又是自體轉運蛋白,因此特別優選的組合包括Hsf、OMP85、TbpA、LPS免疫型L2和/或L3,優選在多價皰制品中,其具有所提供的所有5組抗原的成員。優選TbpA(低)和TbpA(高)均存在。

本發明的另一免疫原性組合物包括FhaB和選自下列的至少一種其它抗原:FrpA、FrpC、NM-ADPRT、VapD、LbpB、LbpA、TbpB、HpuA、HpuB、P2086、Lipo28、Sibp、NMB0964、NMB0293、TdfH、PorB、PldA、Hap、IgA蛋白酶、AspA、PilQ、HimD、HisD、GNA1870、OspA、HlpA、OMP85、NspA、PilC、Omp26、NMB0315、NMB0995、NMB?1119、NadA、PldA、TbpA、Hsf、TspA和TspB、以及LPS免疫型L2和LPS免疫型L3之一或兩者。優選組合包括FhaB和Hsf(任選與OMP85、LbpB、Hap或FrpA的一個或多個);FhaB和OMP85(任選與LbpB、Hap或FrpA的一個或多個);FhaB和LbpB(任選與Hap或FrpA的一個或多個);FhaB和Hap(任選與FrpA)。優選組合包括FhaB、LbpB、Hsf(作為OMP)和FrpA,其具有所提供的全部5組抗原的成員。

本發明的另一免疫原性組合物包括NspA和選自下列的至少一種其它抗原:FrpA、FrpC、NM-ADPRT、VapD、LbpB、LbpA、TbpB、TbpA、HpuA、HpuB、P2086、Lipo28、Sibp、NMB0964、NMB0293、Hap、OMP85、PilQ、AspA、IgA蛋白酶、NadA、PldA、Hsf、Hap、TspA、TspB、TdfH、PorB、和LPS免疫型L2和LPS免疫型L3之一或兩者。優選組合包括NspA和Hsf(任選與OMP85、Hap、LbpA或TbpA的一個或多個);NspA和OMP85(任選與Hap、LbpA或TbpA的一個或多個);Ns?pA和Hap(任選與LbpA或TbpA的一個或多個);Ns?pA和LbpA(任選與TbpA)。特別優選的組合包括NspA、Hsf、TbpA、LPS免疫型L2和/或L3,優選在多價皰制品中,其具有所提供的全部5組抗原的成員。優選TbpA(低)和TbpA(高)均存在。

本發明沒有要求保護具有WO?00/25811中所公開的抗原的個別組合的免疫原性組合物。優選,如果它們的抗原內含物僅由轉鐵蛋白結合蛋白和NspA組成(或在皰疫苗中,上調的或富聚的抗原內含物僅由轉鐵蛋白結合蛋白和NspA組成),則這類免疫原性組合物或疫苗不包括在本發明內,然而可包括由NspA以及TbpA(高)和TbpA(低)組成或包括NspA以及TbpA(高)和TbpA(低)的特定抗原(或上調的抗原)組合。任選地,沒有要求保護包括轉鐵蛋白結合蛋白和NspA的組合(亞單位)或上調(皰)的組合物或疫苗。

本發明另一免疫原性組合物包括NadA和選自下列的至少一種其它抗原:FrpA、FrpC、NM-ADPRT、VapD、LbpB、LbpA、TbpB、TbpA、P2086、Lipo28、Sibp、NMB0964、NMB0293、Hap、OMP85、NspA、PilQ、HimD、HisD、GNA1870、OspA、HlpA、HpuA、HpuB、AspA、IgA蛋白酶、PldA、Hsf、TspA、TspB、TdfH、PorB、以及LPS免疫型L2和LPS免疫型L3之一或兩者。

本發明另一免疫原性組合物包括TbpA(低)和選自下列的至少一種抗原:FrpA、FrpC、NM-ADPRT、VapD、LbpB、LbpA、TbpB、IgA蛋白酶、NspA、HpuA、HpuB、Hap、OMP85、NspA(當與TbpA(高)組合時)、PilQ、HimD、HisD、GNA1870、OspA、HlpA、PilC、Omp26、NMB0315、NMB0995、NMB1119、MafA、MafB、AspA、NadA、PldA、Hsf、TspA、TspB、TdfH、PorB和haB、以及LPS免疫型L2和LPS免疫型L3之一或兩者。優選組合包括TbpA(低)和Hsf和LbpA;TbpA(低)和OMP85(任選與LbpA和Hap之一或兩者);TbpA(低)和LbpA和Hap。

本發明另一免疫原性組合物包括TbpA(高)和選自下列的至少一種其它抗原:FrpA、FrpC、NM-ADPRT、VapD、LbpB、LbpA、TbpB、Hap、OMP85、NspA(當與TbpA(低)組合)、PilC、Omp26、NMB0315、NMB0995、NMB?1119、PilQ、HimD、HisD、GNA1870、OspA、HlpA、MafA、MafB、AspA、IgA蛋白酶、PldA、FhaB、NadA、PldA、Hsf、TspA、TspB、TdfH、PorB和FhaB、以及LPS免疫型L2和LPS免疫型L3之一或兩者。優選組合包括TbpA(高)和Hsf和LbpA;TbpA(高)和OMP85(任選與LbpA和Hap之一或兩者);TbpA(高)和LbpA和Hap。

本發明另一免疫原性組合物包括LbpA和選自下列的至少一個其它抗原:FrpA、FrpC、NM-ADPRT、VapD、LbpB、TbpB、Hap、OMP85、NspA、PilC、Omp26、NMB0315、NMB0995、NMB?1119、NadA、PldA、TbpA、Hsf、TspA、TspB、MafA、MafB、IgA蛋白酶、AspA、FhaB、PilQ、HimD、Hi?sD、GNA1870、OspA、HlpA、TdfH、PorB和FhaB以及LPS免疫型L2和LPS免疫型L3之一或兩者。優選組合包括LbpA和Hsf(任選與Hap)。

本發明另一免疫原性組合物包括LbpB和選自下列的至少一個其它抗原:FrpA、FrpC、NM-ADPRT、VapD、LbpA、TbpB、Hap、OMP85、NspA、PilC、Omp26、NMB0315、NMB0995、NMB?1119、NadA、PldA、TbpA、Hsf、TspA、TspB、MafA、MafB、IgA蛋白酶、AspA、FhaB、PilQ、HimD、HisD、GNA1870、OspA、HlpA、TdfH、PorB和FhaB、以及LPS免疫型L2和LPS免疫型L3之一或兩者。優選組合包括LbpB和Hsf(任選與OMP85、Hap或FrpA的一個或多個);LbpB和OMP85(任選與Hap或FrpA的一個或多個);LbpB和Hap(任選與FrpA)。

本發明另一免疫原性組合物包括OMP85和選自下列的至少一個其它抗原:FrpA、FrpC、NM-ADPRT、VapD、LbpB、LbpA、TbpB、TbpA、HpuA、HpuB、P2086、Lipo28、Sibp、NMB0964、NMB0293、Hap、IgA蛋白酶、As?pA、Hsf、Ns?pA、PilC、Omp26、NMB0315、NMB0995、NMB1119、MafA、MafB、NadA、PldA、Hsf、TspA、TspB、PilQ、TdfH、PorB和FhaB、以及LPS免疫型L2和LPS免疫型L3之一或兩者。優選組合包括OMP85和Hsf(任選與LbpA或NspA的一個或多個);OMP85和LbpA(任選與Hap和NspA的一個或多個);OMP85和Hap(任選與NspA)。

本發明另一免疫原性組合物包括Hap和選自下列的至少一個其它抗原:FrpA、FrpC、NM-ADPRT、VapD、LbpB、LbpA、TbpB、TbpA、HpuA、HpuB、P2086、Lipo28、Sibp、NMB0964、NMB0293、PilQ、HimD、HisD、GNA1870、OspA、HlpA、NspA、IgA蛋白酶、AspA、OMP85、NspA、PilC、Omp26、NMB0315、NMB0995、NMB1119、MafA、MafB、NadA、PldA、Hsf、TspA、TspB、TdfH、PorB和FhaB、以及LPS免疫型L2和LPS免疫型L3之一或兩者。

本發明另一免疫原性組合物包括FrpA和選自下列的至少一個其它抗原:LbpB、LbpA、TbpA、TbpB、HpuA、HpuB、P2086、Lipo28、Sibp、NMB0964、NMB0293、PilQ、HimD、HisD、GNA1870、OspA、HlpA、TspA、TspB、Hap、IgA蛋白酶、AspA、NadA、FhaB、PilQ、HimD、HisD、GNA1870、OspA、HlpA、OMP85、NspA、PilC、Omp26、NMB0315、NMB0995、NMB1119、MafA、MafB、PldA、Hsf、TspA、TspB、TdfH、PorB和FhaB、以及LPS免疫型L2和LPS免疫型L3之一或兩者。

本發明另一免疫原性組合物包括FrpC和選自下列的至少一個其它抗原:LbpB、LbpA、TbpA、TbpB、HpuA、HpuB、P2086、Lipo28、Sibp、NMB0964、NMB0293、PilQ、HimD、HisD、GNA1870、OspA、HlpA、TspA、TspB、Hap、IgA蛋白酶、AspA、NadA、FhaB、OMP85、NspA、PilC、Omp26、NMB0315、NMB0995、NMB?1119、MafA、MafB、PldA、Hsf、TspA、TspB、TdfH、PorB和FhaB、以及LPS免疫型L2和LPS免疫型L3之一或兩者。

本發明另一免疫原性組合物包括LPS免疫型L2和LPS免疫型L3之一或兩者以及選自下列的至少一個其它抗原:LbpB、LbpA、TbpA、TbpB、HpuA、HpuB、P2086、Lipo28、Sibp、NMB0964、NMB0293、PilQ、HimD、HisD、GNA1870、OspA、HlpA、TspA、TspB、Hap、IgA蛋白酶、AspA、NadA、FhaB、OMP85、Ns?pA、PilC、Omp26、NMB0315、NMB0995、NMB1119、MafA、MafB、PldA、Hsf、TspA、TspB、TdfH、PorB和FhaB。

本發明免疫原性組合物中的優選抗原組合包括如下組合,該組合包含鐵獲得蛋白、自體轉運蛋白和FhaB;鐵獲得蛋白、自體轉運蛋白和PilC;鐵獲得蛋白、自體轉運蛋白和NadA;鐵獲得蛋白、自體轉運蛋白和FrpA;鐵獲得蛋白、自體轉運蛋白和PilQ;鐵獲得蛋白、自體轉運蛋白和TspA;鐵獲得蛋白、自體轉運蛋白和TspB;鐵獲得蛋白、自體轉運蛋白和NspA;鐵獲得蛋白、自體轉運蛋白和FrpC;更優選包含鐵獲得蛋白、自體轉運蛋白和Hap;鐵獲得蛋白、自體轉運蛋白和FrpA/C;鐵獲得蛋白、自體轉運蛋白和LbpB;鐵獲得蛋白、自體轉運蛋白和OMP85(D15)。最優選,摻入OMP85(D15)作為外膜小泡制品的一部分。

包含LPS的本發明免疫原性組合物優選具有與T-輔助細胞表位來源,優選蛋白綴合的LPS,且就OMV中的LPS而言,優選外膜蛋白。特別優選的實施方案包括已經與OMP在外膜小泡制品中(如上所述)原位(優選皰內)綴合的LPS。

本發明的免疫原性組合物可包括來源于腦膜炎奈瑟氏球菌血清組A、B、C、Y、W-135或淋病奈瑟氏球菌的抗原(蛋白、LPS和多糖)。

優選本發明的免疫原性組合物或疫苗不由WO?00/71725第3頁第18行-第52頁第2行表中所列的SEQ?ID的特定組合和/或WO?00/71725中實施例1-11描述的任何單個組合組成和/或含有這些組合。

優選,本發明不要求保護WO01/52885中公開的個別組合。

其它組合

本發明的免疫原性組合物還可包括細菌莢膜多糖或低聚糖。莢膜多糖或低聚糖可來源于下列一種或多種:腦膜炎奈瑟氏球菌血清組A、C、Y、和/或W-135、流感嗜血桿菌b(Haemophilus?influenzae?b)、肺炎鏈球菌(Streptococcus?pneumoniae)、A組鏈球菌、B組鏈球菌、金黃色葡萄球菌(Staphylococca?saureus)和表皮葡萄球菌(Stapylocoaus?epidermidis)。

本發明另一方面是含有本發明抗原性組合物和其它抗原的疫苗組合物,其可有利地用于抗某些疾病狀況,包括與病毒或革蘭氏陽性菌有關的那些。

在其中一個優選組合中,本發明的抗原性組合物是用下列腦膜炎球菌莢膜多糖或低聚糖的1、2、3或優選全部4種配制的,其可以是簡單的或與蛋白載體:A、C、Y或W-135綴合的。優選本發明的免疫原性組合物是用A和C;或C;或C和Y配制的。這種含有源自腦膜炎奈瑟氏球菌,優選血清組B的蛋白的疫苗可被有利地用作通用的腦膜炎球菌疫苗。

在另一優選實施方案中,本發明的抗原性組合物,優選用簡單或綴合的腦膜炎球菌莢膜多糖或低聚糖A、C、Y或W-135的1、2、3或全部4種配制(如上所述)的,是用綴合的流感嗜血桿菌b莢膜多糖或低聚糖,和/或一種或多種簡單或綴合的肺炎球菌莢膜多糖或低聚糖配制的。任選地,所述疫苗還可包括一種或多種蛋白抗原,它們可保護宿主免受肺炎鏈球菌感染。這種疫苗可被有利地用作通用腦膜炎疫苗。

在又一優選實施方案中,本發明的免疫原性組合物是用來源于腦膜炎奈瑟氏球菌、流感嗜血桿菌b、肺炎鏈球菌、A組鏈球菌、B組鏈球菌、金黃色膿葡萄球菌或表皮葡萄球菌中一種或多種的莢膜多糖或低聚糖配制的。肺炎球菌的莢膜多糖抗原優選選自血清型1、2、3、4、5、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F和33F(最優選選自1、3、4、5、6B、7F、9V、14、18C、19F和23F)。進一步優選的實施方案包括流感嗜血桿菌的PRP莢膜多糖。進一步優選實施方案包括金黃色葡萄球菌的5型、8型或336莢膜多糖。進一步優選實施方案包括表皮葡萄球菌的I型、II型或III型莢膜多糖。進一步優選實施方案包括B組鏈球菌的Ia型、Ic型、II型或III型莢膜多糖。進一步優選實施方案包括A組鏈球菌的莢膜多糖,優選還包括至少一種M蛋白且更優選多種類型的M蛋白。

本發明這種莢膜多糖可與載體蛋白如破傷風類毒素、破傷風類毒素片段C、白喉類毒素、CRM197、肺炎球菌溶血素、蛋白D(US6342224)非-綴合或綴合。所述多糖綴合物可通過任何已知的偶聯技術制備。例如,可經由硫醚鍵使多糖偶聯。這種綴合方法依靠用1-氰基-4-二甲氨基四氟硼酸吡啶(CDAP)活化多糖而形成氰酸酯。活化多糖可因此與載體蛋白上的氨基直接偶聯或經由間隔基團偶聯。優選,使用包括形成硫醚鍵的雜絡合化學過程使氰酸酯與己二胺偶聯,使氨基-衍生的多糖與載體蛋白偶聯。這種綴合物在PCT公開申請WO93/15760Uniformed?Services?University中描述。

綴合物還可通過如US?4365170(Jennings)和US4673574(Anderson)中描述的直接還原胺化方法制備。其它方法在EP-0-161-188、EP-208375和EP-0-477508中描述。其它方法包括通過碳二亞胺縮合使己二酸酰肼(ADH)衍生的溴化氰活化的多糖與蛋白載體偶聯(Chu?C.等人,Infect.Immunity,1983?245?256)。當包括低聚糖時,優選使它們綴合在一起。

優選的肺炎球菌蛋白抗原是在肺炎球菌外表面上暴露的那些肺炎球菌蛋白(在肺炎球菌至少部分生活周期內能夠由宿主免疫系統識別),或是由肺炎球菌分泌或釋放的蛋白。最優選,所述蛋白是毒素、粘附素、2-組分信號轉導蛋白、或肺炎鏈球菌的脂蛋白,或其片段。特別優選的蛋白包括,但不限于:肺炎球菌溶血素(優選通過化學處理或突變解毒)[Mi?tchell等人,Nucleic?Acids?Res.1990年7月11日:18(13):4010“Comparison?of?pneumolysin?genes?and?proteins?from?Streptococcus?pneumoniae?types?1?and?2.”,Mitchell等人,Biochim?Biophys?Acta?1989年1月23日;1007(1):67-72,“Expression?of?the?pneumolys?in?gene?in?Escherichia?coli:rapid?purification?and?biological?properties.”,WO?96/05859(A.Cyanamid)、WO?90/06951(Paton等人)、WO?99/03884(NAVA)];PspA及其跨膜缺失變體(US?5804193-Briles等人);PspC及其跨膜缺失變體(WO?97/09994-Briles等人);PsaA及其跨膜缺失變體(Berry和Paton,Infect?Immun?1996年12月;64(12):5255-62,“Sequence?heterogeneity?of?PsaA,a?37-kilodalton?putative?adhesin?essential?for?virulence?of?Streptococcuspneumoniae”);肺炎球菌膽堿結合蛋白及其跨膜缺失變體;CbpA及其跨膜缺失變體(WO97/41151、WO?99/51266);甘油醛-3-磷酸-脫氫酶(Infect.Immun.1996?64:3544);HSP70(WO?96/40928);PcpA(Sanchez-Beato等人,FEMS?Microbiol?Lett?1998,164:207-14);M樣蛋白(EP?0837130)和粘附素18627(EP?0834568)。進一步優選的肺炎球菌蛋白抗原是WO98/18931中公開的那些,特別是WO98/18930和PCT/US99/30390中選擇的那些。

本發明的免疫原性組合物/疫苗還可任選包括由其它革蘭氏陰性菌,例如粘膜炎莫拉氏菌(Moraxella?catarrhalis)或流感嗜血桿菌制備的外膜小泡制品。

粘膜炎莫拉氏菌皰制品

本發明的免疫原性組合物還可包括來源于粘膜炎莫拉氏菌的OMV制品。如WO01/09350所述,基因工程改造的OMV制品可來源于粘膜炎莫拉氏菌。優選將下列基因(編碼保護性抗原)的一種或多種上調:OMP106(WO97/41731和WO96/34960)、HasR(PCT/EP99/03824)、PilQ(PCT/EP99/03823)、OMP85(PCT/EP00/01468)、lipo06(GB9917977.2)、lipo10(GB?9918208.1)、lipo11(GB?9918302.2)、lipo18(GB?9918038.2)、P6(PCT/EP99/03038)、ompCD、CopB(Helminen?ME等人,(1993)Infect.Immun.61:2003-2010)、D15(PCT/EP99/03822)、OmplAl(PCT/EP99/06781)、Hly3(PCT/EP99/03257)、LbpA和LbpB(WO?98/55606)、TbpA和TbpB(WO97/13785和WO?97/32980)、OmpE、UspAl和UspA2(WO?93/03761)、和Omp21。作為可被異源引入到其他革蘭氏陰性菌中的基因,它們也是優選的。

優選將下列基因的一個或多個下調:CopB、OMP106、OmpBl、TbpA、TbpB、LbpA、和LbpB。

優選將下列基因的一個或多個下調:htrB、msbB和lpxK。

優選將下列基因的一個或多個上調:pmrA、pmrB、pmrE、和pmrF。

流感嗜血桿菌皰制品

本發明的免疫原性組合物還可包括來源于流感嗜血桿菌的OMV制品。如WO01/09350所述,基因工程改造的OMV制品可來源于流感嗜血桿菌。優選將下列基因(編碼保護性抗原)的一個或多個上調:D15(WO94/12641)、P6(EP?281673)、TbpA(WO96/40929、WO95/13370)、TbpB(WO96/40929;WO95/13370)、P2、P5(WO?94/26304)、OMP26(WO97/01638)、HMW1、HMW2、HMW3、HMW4、Hia、Hsf、Hap、Hin47、和Hif(該操縱子中的所有基因均應被上調以將菌毛蛋白上調)。作為可被異源引入到其他革蘭氏陰性菌中的基因,它們也是優選的。

優選將下列基因的一個或多個下調:P2、P5、Hif、IgA1-蛋白酶、HgpA、HgpB、HMW1、HMW2、Hxu、htrB、msbB和lpxK。

優選將下列基因的一個或多個上調:pmrA、pmrB、pmrE、和pmrF。

本發明的免疫原性組合物/疫苗還可任選包括抗白喉、破傷風和百日咳鮑特氏菌(Bordetella?pertussis)感染中一種或多種的抗原。百日咳鮑特氏菌組分可被殺死,無論是全細胞百日咳鮑特氏菌(Pw)還是無細胞的百日咳鮑特氏菌(Pa),其包含來源于PT、FHA和69kDapertactin的至少一種抗原(優選2或所有3種)。通常,提供抗白喉和破傷風保護的抗原是白喉類毒素和破傷風類毒素。類毒素是化學滅活的毒素或通過引入點突變而滅活的毒素。

免疫原性組合物/疫苗還可任選地包括一種或多種保護宿主免受非-分型(non-typeable)流感嗜血桿菌、RSV感染的抗原和/或一種或多種可保護宿主免受流感病毒感染的抗原。這種疫苗可有利地用作通用中耳炎疫苗。

優選的非分型流感嗜血桿菌蛋白抗原包括絲束蛋白(US?5766608)和含有來自絲束蛋白的肽的融合蛋白(例如,LB1融合蛋白)(US5843464-Ohio?State?Research?Foundation)、OMP26、P6、蛋白D、TbpA、TbpB、Hia、Hmw1、Hmw2、Hap、和D15。

優選的流感病毒抗原包括完整的、活的或滅活的病毒、脫落流感病毒,其在卵或MDCK細胞中生長,或非洲綠猴腎細胞株系細胞或完整的流感病毒體(如R.Gluck,Vaccine,1992,10,915-920所述)或其純化或重組蛋白,如HA、NP、NA、或M蛋白、或其組合。

優選的RSV(呼吸道合胞病毒)抗原包括F糖蛋白、G糖蛋白、HN蛋白、M蛋白或其衍生物。

本發明的免疫原性組合物可包括粘膜炎莫拉氏菌蛋白,包括TbpA(WO97/13785;WO99/52947)、TbpB(WO97/13785;WO99/52947;Mathers等人,FEMS?Immunol?Med?Microbiol?1997?19;231-236;Myers等人Infect?Immun?1998?66;4183-4192)、LbpA、LbpB(Du等人,Infect?Immun?1998?66;3656-3665)、UspA1、UspA2(Aebi等人,Infect?Immun.1997?65;4367-4377)、OMP106(US6214981)、Ton-B依賴性受體(WO00/78968)、CopB(Sethi等人,Infect.Immun.199765;3666-3671)、和HasR受體(WO00/78968);流感嗜血桿菌的蛋白包括HMW(St?Geme等人,Infect?Immun1998?66;364-368)、Hia(St?Geme等人,J.Bacteriol.2000?182;6005-6013)、Tbp1(WO96/40929;WO95/13370)、Tbp2(WO96/40929;WO95/13370;Gray-Owen等人,Infect?Immun?1995?63;1201-1210)、LbpA、LbpB(Schryvers等人,1989,29:121-130)、HasR、Ton?B-依賴性受體(Fleishmann等人,Science?1995?269;496-512)、血紅蛋白-結合蛋白、HhuA(Cope等人,Infect?Immun?200068;4092-4101)、HgpA(Maciver等人,Infect?Immun?199664;3703-3712)、HgbA、HgbB和HgbC(Jin等人,Infect?Immun?199664;3134-3141)、HxuA(Cope等人,Mol?Microbiol?199413;863-873)、HxuC(Cope等人,Infect?Immun?200169;2353-2363);來源于腦膜炎奈瑟氏球菌的蛋白,包括Tbp1、Tbp2、FbpA、FbpB、BfrA、BfrB(Tettelin等人,Science?2000287;1809-1815)、LbpA、LbpB和HmbR。

疫苗制劑

本發明的優選實施方案是還可含有藥學上可接受賦形劑或載體的本發明免疫原性組合物的疫苗制劑。

來源于上述任何一種修飾菌株的外膜小泡制品的制備可通過本領域技術人員熟知的任何一種方法實現。優選使用EP?301992、US5,597,572、EP?11243或US?4,271,147中公開的方法。更優選使用WO01/09350中描述的方法。

疫苗制品通常在疫苗設計中描述(“The?subunit?and?adjuvant?approach”(eds?Powell?M.F.&?Newman?M.J.)(1995)Plenum?Press?New?York)。

本發明的疫苗制劑中可向本發明的抗原性組合物施加佐劑。適宜的佐劑包括鋁鹽如氫氧化鋁凝膠(明礬)或磷酸鋁,但還可以是鈣鹽(特別是碳酸鈣)、鐵鹽或鋅鹽,或可以是酰化酪氨酸或酰化糖,陽離子或陰離子衍生的多糖或聚磷腈的不溶性懸浮液。

可使用的適宜Th1佐劑系統包括單磷酰基脂類A,特別是3-脫-O-酰化單磷酰基脂類A和單磷酰基脂類A、優選3-脫-O-酰化單磷酰基脂類A(3D-MPL)與鋁鹽(優選磷酸鋁)的組合。增強的系統包括單磷酰基脂類A和皂苷衍生物的組合,特別是WO?94/00153中公開的QS21與3D-MPL的組合,或如WO?96/33739中公開的反應原性較低的組合物,其中用膽固醇猝滅QS21。WO?95/17210中描述了特別有效的、包含QS213D-MPL和生育酚的水包油乳液的佐劑,且其是優選的制劑。

所述疫苗可包括皂苷,更優選QS21。它還可包括水包油乳液和生育酚。含有寡核苷酸的未甲基化的CpG(WO?96/02555)是TH1反應的優選誘導劑,且適用于本發明。

本發明的疫苗制品可用于保護或治療易感染的哺乳動物,其中經由全身或粘膜途徑給予所述疫苗。這些給藥可包括經由肌內、腹膜內、皮內或皮下途徑注射;或經由粘膜給予口腔/消化、呼吸、泌尿生殖道。因此本發明其中一個方面是使人類宿主免疫而抗革蘭氏陰性菌感染所引起的疾病的方法,該方法包括給予所述宿主免疫保護劑量的本發明OMV制品。

選擇每個疫苗劑型中的抗原量,其可誘導免疫保護反應且沒有一般疫苗的明顯的副作用。這種量可根據所用的特定免疫原以及如何提供而變化。通常預期每個劑型包含1-100μg蛋白抗原或OMV制品,優選5-50μg,且最一般5-25μg。

特定疫苗的最佳用量可通過標準研究確定,該標準研究包括觀察受試者中的適宜免疫反應。初次接種后,受試者可接受一次或若干次適當間隔的加強免疫。

本發明的疫苗優選是免疫保護性且無毒的,并適于兒童和青少年使用。

給兒科使用時,它是指小于4歲的兒童。

免疫保護性是指令人滿意地滿足上述SBA和/或動物保護模型和/或粘附阻斷測定法。

無毒是指通過熟知的LAL和熱原性測定法測量,疫苗中的內毒素活性水平不大于令人滿意的水平。

本發明的多核苷酸

“多核苷酸”通常是指任何多核糖核苷酸或多脫氧核糖核苷酸,其可以是未修飾的RNA或DNA或修飾的RNA或DNA。“多核苷酸”包括但不限于單鏈和雙鏈的DNA,單鏈和雙鏈區混合的DNA,單鏈和雙鏈的RNA,單鏈和雙鏈區混合的RNA,包含單鏈或,更通常雙鏈或單鏈與雙鏈區混合的DNA和RNA的雜交分子。此外“多核苷酸”是指包含RNA或DNA或同時包含RNA與DNA的三鏈區。術語多核苷酸還包括含有一個或多個修飾堿基的DNA或RNA,和具有由于穩定性或其它原因而被修飾的主鏈的DNA或RNA。“修飾”堿基包括,例如,三苯甲基化的堿基和特殊堿基如肌苷。已經對DNA和RNA進行了各種修飾;因此,“多核苷酸”包括一般天然存在的多核苷酸的化學、酶或代謝修飾形式,以及病毒和細胞特征性的DNA和RNA的化學形式。“多核苷酸”還包括相對較短的多核苷酸,通常被稱作寡核苷酸。

本發明另一方面涉及免疫/疫苗制劑,其包含一種或多種多核苷酸。這種技術是本領域已知的,見,例如Wolff等人,Science(1990)247:1465-8。

這種疫苗包含編碼與上述本發明蛋白組合相對應的多種蛋白的一種或多種多核苷酸。

來源于這種多核苷酸的蛋白的表達將受到真核啟動子的控制,該啟動子能夠驅動在哺乳動物細胞內表達。此外所述多核苷酸可包含編碼其它抗原的序列。可驅動表達的真核啟動子的例子包括來源于病毒的病毒啟動子,包括腺病毒啟動子、逆轉錄病毒啟動子。可選擇性地,哺乳動物啟動子可用于驅動表達。

本發明其它方面

本發明另一方面包括用于治療或預防奈瑟氏球菌病的方法,包括在宿主需要時,給予其保護劑量(或有效量)的本發明疫苗。腦膜炎奈瑟氏球菌血清組A、B、C、Y或W135和/或淋病奈瑟氏球菌感染可被有利地預防或治療。

本發明還包括本發明疫苗在制備用于治療或預防奈瑟氏球菌感染的藥物中的用途。此外奈瑟氏球菌感染包括由腦膜炎奈瑟氏球菌血清組A、B、C、Y、W-135和/或淋病奈瑟氏球菌引起的感染。

本發明另一方面是可衍生本發明外膜小泡(如上所述,具有本發明重組上調的至少兩種蛋白)的基因工程改造的奈瑟氏球菌菌株。這種奈瑟氏球菌菌株可以是腦膜炎奈瑟氏球菌或淋病奈瑟氏球菌。

所述菌株還可被改造(如上所述)以下調其它奈瑟氏球菌蛋白的表達,包括LgtB、LgtE、SiaD、OpC、OpA、PorA、FrpB、msbB和HtrB中1、2、3、4、5、6、7或8個的表達。用于下調的優選組合包括至少LgtB和SiaD的下調(優選缺失)、至少PorA和OpC的下調、至少PorA和OpA的下調以及至少PorA、OpA和OpC的下調。

本發明另一方面是制備本發明免疫原性組合物或疫苗的方法。這些方法包括將至少兩種來源于奈瑟氏球菌的分離抗原或蛋白混合在一起的步驟,其可以以來源于本發明奈瑟氏球菌菌株的皰形式存在,從而制備本發明的免疫原性組合物,另一制備本發明疫苗的方法包括將本發明的免疫原性組合物與藥學上可接受的載體組合的步驟。

也包括在本發明中的制備本發明免疫原性組合物的方法包括分離奈瑟氏球菌培養物中的外膜小泡的步驟。這種方法可包括將至少兩種外膜小泡制品混合的又一步驟,優選其中至少一種外膜小泡制品包含免疫型L2的LPS且至少一種外膜小泡制品包含免疫型L3的LPS。本發明還包括這種方法,其中所述外膜小泡制品是通過用0-0.5%濃度的DOC提取而分離的。0.3%-0.5%濃度的DOC用于將LPS含量減到最小。在OMV制品中,其中LPS作為抗原是保守的,0-0.3%、優選0.05%-0.2%、最優選約0.1%濃度的DOC用于提取。

血影細胞或被殺死的全細胞疫苗

本發明人預期對皰制品和疫苗的上述改進可很容易地擴展至血影細胞或被殺死的全細胞制品和疫苗(具有相同的優點)。可從其制備皰制品的本發明修飾的革蘭氏陰性菌菌株還可用于制備血影細胞和被殺死的全細胞制品。從革蘭氏陰性菌菌株制備血影制品(具有完整外膜的空細胞)是本領域熟知的(見例如WO?92/01791)。殺死全細胞以制備用于疫苗中的滅活細胞制品的方法也是熟知的。術語‘皰[或OMV]制品’和‘皰[或OMV]疫苗’以及本文獻所描述的方法因此,因本發明目的起見,可分別應用于本發明的術語‘血影制品’和‘血影疫苗’和‘被殺死的全細胞制品’和‘被殺死的全細胞疫苗’。

抗體和被動免疫

本發明另一方面是制備用于預防或治療奈瑟氏球菌感染的免疫球蛋白的方法,包括用本發明疫苗使受體免疫并分離受體中免疫球蛋白的步驟。通過該方法制備的免疫球蛋白是本方面的另一方面。包含本發明免疫球蛋白以及藥學上可接受載體的藥物組合物是本發明的另一方面,其可制備用于治療或預防奈瑟氏球菌病的藥物。用于治療或預防奈瑟氏球菌感染的方法是本發明的另一方面,該方法包括給予患者有效量的本發明的藥物制品。

用于多克隆抗體產生的接種物通常是通過將抗原性組合物分散在適于人類使用的生理學耐受的稀釋劑,如生理鹽水或其它佐劑中,從而形成含水組合物而制備的。將免疫刺激量的接種物給予哺乳動物,然后使接種的哺乳動物維持一段時間,這段時間足以使抗原性組合物誘導保護性抗體。

可通過熟知的技術,如親和層析分離抗體至所需的程度(Harlow和Lane?Antibodies;a?laboratory?manual?1988)。

抗體可包括來源于通常使用的各種動物,例如,山羊、靈長類動物、驢、豬、馬、豚鼠、大鼠或人的抗血清制品。給所述動物抽血并回收血清。

按照本發明生產的免疫球蛋白可包括完整的抗體、抗體片段或亞片段。抗體可以是任何種類,例如IgG、IgM、IgA、IgD或IgE的完整免疫球蛋白,嵌合抗體或對本發明兩種或多種抗原具有雙重特異性的雜交抗體。它們還可以是片段,例如F(ab′)2、Fab’、Fab、Fv等,包括雜交片段。免疫球蛋白還包括天然的、合成的或基因工程改造的蛋白,它們可通過與特異性抗原結合形成復合體而像抗體一樣發揮作用。

可將本發明的疫苗給予受體,然后受體作為免疫球蛋白的來源發揮作用,該免疫球蛋白是在應答特異性疫苗的攻擊時產生的。然后經由常規的血漿分離方法從如此治療過的受試者所捐獻的血漿中獲得超免疫球蛋白。將所述超免疫球蛋白給予另一受試者,從而產生抗或治療奈瑟氏球菌感染的抗性。本發明的超免疫球蛋白特別用于治療或預防兒童、無免疫應答個體或在需要治療對而個體在應答接種免疫時沒時間產生抗體的奈瑟氏球菌病。本發明另一方面是一種藥物組合物,它包含對本發明免疫原性組合物至少兩種組分具有反應性的兩種或多種單克隆抗體(或其片段;優選人或人源化的),該藥物組合物可用于治療或預防革蘭氏陰性菌,優選奈瑟氏球菌,更優選腦膜炎奈瑟氏球菌或淋病奈瑟氏球菌,最優選腦膜炎奈瑟氏球菌血清組B所引起的感染。

這種藥物組合物包括單克隆抗體,它們可以是任何種類,例如IgG、IgM、IgA、IgD或IgE的完整免疫球蛋白,嵌合抗體或對本發明兩種或多種抗原具有特異性的雜交抗體。它們還可以是片段,例如F(ab′)2、Fab′、Fab、Fv等,包括雜交片段。

制備單克隆抗體的方法是本領域熟知的,且包括脾細胞與骨髓瘤細胞的融合體(Kohler和Milstein?1975?Nature?256;495;Antibodies-a?laboratory?manual?Harlow?and?Lane?1988)。可選擇性地,單克隆Fv片段可通過篩選適宜的噬菌體展示庫而獲得(Vaughan?TJ等人,1998Nature?Biotechnology?16;535)。利用已知方法,單克隆抗體可以是人源化的或部分人源化的。

本專利說明書中引證的所有參考文獻或專利申請均引入此處作為參考。

本發明人指出此處每個例子中的術語“包括(comprising)”、“包括(comprise)”和“包括(comprises)”可分別任選用“由的組成(consisting?of)”、“由的組成(consist?of)”和“由的組成(consists?of)”替代。

本發明的工業應用方法

除非另有詳細描述,下面的實施例是使用本領域那些技術人員熟知且常規的標準技術進行的。實施例僅是舉例說明,而不是對本發明的限制。

實施例1:構建用于外膜小泡制品中的腦膜炎奈瑟氏球菌血清組B的方法

WO01/09350提供用于制備外膜小泡并處理衍生外膜小泡的細菌菌株的詳細方法。當外膜小泡保留有脂蛋白如TbpB或脂多糖時,優選使用低水平或不使用脫氧膽酸鹽的分離方法。

實施例2:Hsf蛋白抗原在缺少功能性cps基因但表達PorA的重 組腦膜炎奈瑟氏球菌血清組B菌株中的上調

如WO01/09350實施例中所述,在某些國家,PorA在外膜小泡中的存在可能是有利的,且可增強重組改良泡的疫苗功效。在下列實施例中,我們使用修飾的pCMK(+)載體上調Hsf蛋白抗原在缺少功能性cps基因但表達PorA的菌株中的表達。原始的pCMK(+)載體包括在表達laclq的大腸桿菌宿主中被抑制,但在腦膜炎奈瑟氏球菌中是轉錄活性的嵌合porA/lacO啟動子。在修飾的pCMK(+)中,天然的porA啟動子用于驅動hsf基因的轉錄。編碼Hsf的基因是使用下表中提供的HSF01-NdeI和HSF?02-NheI寡核苷酸引物進行PCR擴增的。由于HSF01-NdeI引物的序列,所表達Hsf蛋白的5’末端包括兩個甲硫氨酸殘基。PCR擴增所用的條件是由供應商描述的那些(HiFi?DNA聚合酶,Boehringer?Mannheim,GmbH)。熱循環如下:25次(94℃1分鐘,48℃1分鐘,72℃3分鐘)和1次(72℃10分鐘,4℃直到回收)。隨后在pCMK(+)送遞載體相應限制位點中克隆相應的擴增子。在該重組質粒中,即所設計的pCMK(+)-Hsf中,我們通過重組PCR策略使存在于嵌合porA/lacO啟動子中的lacO缺失。pCMK(+)-Hsf質粒被用作模板以使下列2個單獨的DNA片段PCR擴增:

-片段1包括porA?5’誘重組區,卡那霉素抗性基因和porA啟動子。所用的寡核苷酸引物RP1(SacII)和RP2在下表中提供。RP1引物與緊在lac操縱子上游的序列同源。

-片段2包括來源于porA基因的Shine-Dalgarno序列、hsf基因和porA?3’重組區。所用的寡核苷酸引物RP3和RP4(ApaI)在下表中提供。RP3引物與緊在lac操縱子下游的序列同源。片段1的3’末端和片段2的5’末端具有48個堿基重疊。將各500ng?PCR(1和2)用于使用引物RP1和RP4進行的終PCR反應。將所得的終擴增子亞克隆到用SacII和ApaI限制酶切的pSL1180載體中。使用QIAGEN?maxiprep試劑盒大規模純化修飾質粒pCMK(+)-Hsf,并將2μg該材料用于轉化缺少功能性cps基因的腦膜炎奈瑟氏球菌血清組B菌株。為了維持porA的表達,通過PCR和蛋白質印跡篩選方法的組合來選擇單一交換產生的整合。將通過porA-特異性PCR和蛋白質印跡被證實為陽性的卡那霉素抗性克隆在-70℃以甘油原液貯存用于進一步的研究。將細菌(相當于約5.108個細菌)重懸浮于50μl?PAGE-SDS緩沖液中,冷凍(-20℃)/沸騰(100℃)3次,然后通過PAGE-SDS電泳在12.5%凝膠上分離。Hsf的表達是在來源于NmB[Cps-,PorA+]或NmB[Cps-,PorA+,Hsf+]的全細胞細菌溶菌產物(WCBL)中檢測的。考馬斯染色可檢測出Hsf表達的顯著增加(相當于內源性Hsf水平)。該結果證實修飾pCMK(+)-Hsf載體是功能性的且可成功用于上調外膜蛋白的表達,不會消除主要PorA外膜蛋白抗原的產生。

這項工作中使用的寡核苷酸

實施例3:利用啟動子置換上調腦膜炎奈瑟氏球菌血清組B的tbpA 基因

實驗的目的是用較強的porA啟動子置換tbpA基因的內源性啟動子區,以上調TbpA抗原的產生。就該目的而言,啟動子置換質粒是用大腸桿菌克隆方法構建的。位于tbpA編碼區列上游的DNA區(731bp)是在腦膜炎奈瑟氏球菌菌株ATCC?13090的私立Incyte?PathoSeq數據庫中發現的。該DNA包含編碼TbpB抗原的序列。所述基因是在操縱子中組織的。TbpB基因將缺失并被CmR/porA啟動子彈夾置換。就該目的而言,與t?bpB基因的509bp?5’側翼區、2139bp的tbpB編碼序列、87bp的基因間序列以及tbpA編碼序列的前483個核苷酸相對應的3218bp的DNA片段是用含有吸收序列和NheI及HindIII限制位點(下劃線)的寡核苷酸BAD16(5’-GGC?CTA?GCT?AGC?CGT?CTG?AAG?CGA?TTA?GAG?TTTCAA?AAT?TTA?TTC-3’)和BAD17(5’-GGC?CAA?GCT?TCA?GAC?GGC?GTT?CGACCG?AGT?TTG?AGC?CTT?TGC-3′’)從腦膜炎奈瑟氏球菌血清組B基因組DNA擴增的。用High?Pure?Kit(Boerhinger?Mannheim,德國)純化該PCR片段并將其直接克隆到pGemT載體(Promega,美國)中。使該質粒進行循環PCR誘變(Jones和Winistofer(1992))以便(i)插入適宜的限制位點,使CmR/PorA啟動子盒克隆和(ii)使209bp的tbpB?5’側翼序列和tbpB編碼序列缺失。循環PCR是用含有適宜限制位點XmaI、BglII和XhoI(下劃線)的BAD?18(5’-TCC?CCC?GGG?AAG?ATC?TGG?ACG?AAA?AATCTC?AAG?AAA?CCG-3’)和BAD?19(5’-GGA?AGA?TCT?CCG?CTC?GAG?CAA?ATTTAC?AAA?AGG?AAG?CCG?ATA?TGC?AAC?AGC?AAC?ATT?TGT?TCC?G-3’)寡核苷酸進行的。CmR/PorA啟動子彈夾是使用含有適宜限制位點XmaI、SpeI、BglII和XhoI(下劃線)的引物BAD21(5’-GGA?AGA?TCT?CCG?CTC?GAGACA?TCG?GGC?AAA?CAC?CCG-3’)和BAD20(5’-TCC?CCC?GGG?AGA?TCT?CACTAG?TAT?TAC?CCT?GTT?ATC?CC-3’),按照先前所述從pUC?D15/Omp85質粒擴增的。將該PCR片段克隆到循環PCR質粒中。該質粒用于轉化腦膜炎奈瑟氏球菌血清組B[cps-]和[cps-porA-]菌株。通過在tbpA上游區中進行雙重交換進行整合可將porA啟動子直接插入到tbpA?ATG的上游。

實施例4:兩種抗原:TbpA和Hsf的表達被上調的腦膜炎奈瑟氏 球菌血清組B菌株的構建

實驗目的是同時上調TbpA和Hsf在同一腦膜炎奈瑟氏球菌血清組B菌株中的表達。TbpA的產生是通過用較強的porA啟動子置換其內源性啟動子區而被上調的(啟動子置換)。在本文中,位于tbpA上游的tbpB基因缺失,且TbpB蛋白不再存在于外膜中。Hsf的表達是通過在porA基因座插入相應基因的第二個拷貝(同源重組)而被上調的(基因送遞)。兩種菌株已經在WO01/09350獨立專利中描述。兩種策略中所用的選擇標記(CmR或KanR)可使兩種整合到同一染色體中。

通過Qiagen?Genomic尖端500-G方案從重組Nm.Bcps-/TbpA+/PorA+菌株提取總基因組DNA。用DraIII限制酶限制酶切10μg?DNA,并用于通過經典轉化方案轉化腦膜炎奈瑟氏球菌血清組B。用于轉化的細胞是重組NmB?cps-/Hsf+/PorA+(通過1次交換到porA基因座中而進行的同源重組)或重組NmB?cps-/Hsf+/PorA-(通過2次交換到porA基因座中而進行的等位基因交換/同源重組)。將它們平板接種在含200μtg/ml卡那霉素的GC瓊脂上過夜,在GC液體培養基10mMMgCl2中被稀釋到DO650=0.1,并在用力攪拌的條件下與10μg?DraIII限制酶切的基因組DNA于37℃溫育6小時。在含有200μg/ml卡那霉素和5μg/ml氯霉素的GC培養基上選擇由于雙重交換事件(PCR篩選)產生的重組腦膜炎奈瑟氏球菌,并分析TbpA和Hsf在OMV制品中的表達。如圖1所示,與從對照NmB?cps-菌株制備的OMV相比,從TbpA/Hsf重組NmB菌株制備的OMV中的TbpA和Hsf產生顯著增加。各蛋白在雙重重組體中的過量表達水平可與在相應的單一重組體中獲得的表達水平相比較。TbpA和Hsf的過量表達水平是在PorA+和PorA-菌株中比較的(沒有給出數據)。這些數據共同證實了:(i)TbpA和Hsf在腦膜炎奈瑟氏球菌中的表達可共同且相伴地被上調,且(ii)可獲得富含TbpA和Hsf的重組泡并用于免疫。

實施例5:兩種抗原:TbpA和NspA的表達被上調的腦膜炎奈瑟氏 球菌血清組B菌株的構建

實驗目的是同時上調TbpA和NspA在同一腦膜炎奈瑟氏球菌血清組B菌株中的表達。TbpA的產生是通過用較強的porA啟動子置換其內源性啟動子區而被上調的(啟動子置換)。NspA的表達是通過在porA基因座插入相應基因的第二個拷貝(同源重組)而被上調的(基因送遞)。兩種菌株已經在獨立專利WO01/09350描述。兩種策略中所用的選擇標記(CmR或KanR)可使兩種整合到同一染色體中。

通過Qiagen?Genomic尖端500-G方案從重組NmBcps-/TbpA+/PorA+菌株提取總基因組DNA。用AatII限制酶限制酶切10μg?DNA,并用于通過經典轉化方案轉化腦膜炎奈瑟氏球菌血清組B。用于轉化的細胞是重組NmB?cps-/NspA+/PorA+。將它們平板接種在含200μg/ml卡那霉素的GC瓊脂上過夜,在GC液體培養基10mM?MgCl2中被稀釋到DO650=0.1,并在用力攪拌的條件下與10μg?AatII限制酶切的基因組DNA于37℃溫育6小時。在含有200μg/ml卡那霉素和5μg/ml氯霉素的GC培養基上選擇由于雙重交換事件(PCR篩選)產生的重組腦膜炎奈瑟氏球菌,并分析TbpA和NspA在OMV制品中的表達。與從對照NmB?cps-菌株制備的OMV相比,從TbpA/NspA重組NmB菌株制備的OMV中的TbpA和NspA產生顯著增加。各蛋白在雙重重組體中的過量表達水平可與在相應的單一重組體中獲得的表達水平相比較。這些數據共同證實了:(i)TbpA和NspA在腦膜炎奈瑟氏球菌中的表達可共同且相伴地被上調,且(ii)可獲得富含TbpA和NspA的重組皰并用于免疫。

實施例6:兩種抗原:NspA和D15/Omp85的表達被上調的腦膜炎 奈瑟氏球菌血清組B菌株的構建

實驗的是同時上調NspA和D15/Omp85在同一腦膜炎奈瑟氏球菌血清組B菌株中的表達。D15/Omp85的產生是通過用較強的porA啟動子置換其內源性啟動子區而被上調的(啟動子置換)。NspA的表達是通過在porA基因座插入相應基因的第二個拷貝(同源重組)而被上調的(基因送遞)。兩種菌株已經在獨立專利WO01/09350中描述。兩種策略中所用的選擇標記(CmR或KanR)可使兩種整合組合到同一染色體中。

通過Qiagen?Genomic尖端500-G方案從重組NmB?cps-/D15-Omp85/PorA+菌株提取總基因組DNA。用AatII限制酶限制酶切10μgDNA,并用于通過經典轉化方案轉化腦膜炎奈瑟氏球菌血清組B。用于轉化的細胞是重組NmB?cps-/NspA+/PorA-。將它們平板接種在含200μg/ml卡那霉素的GC瓊脂上過夜,在GC液體培養基,10mMMgCl2中被稀釋到DO650=0.1,并在用力攪拌的條件下與10μg?AatII限制酶切的基因組DNA于37℃溫育6小時。在含有200μg/ml卡那霉素和5μg/ml氯霉素的GC培養基上選擇由于雙重交換事件(PCR篩選)產生的重組腦膜炎奈瑟氏球菌,并分析NspA和D15/Omp85在OMV制品中的表達。與從對照NmB?cps-菌株制備的OMV相比,從NspA/D15-Omp85重組NmB菌株制備的OMV中的NspA和D15/Omp85產生顯著增加。各蛋白在雙重重組體中的過量表達水平可與在相應的單一重組體中獲得的表達水平相比較。這些數據共同證實了:(i)NspA和Omp85在腦膜炎奈瑟氏球菌中的表達可共同且相伴地被上調,且(ii)可獲得富含NspA和Omp85的重組泡并用于免疫。

實施例7:重組Hsf形式在大腸桿菌中的產生和純化

對來源于腦膜炎奈瑟氏球菌的Hsf-樣蛋白進行的計算機分析揭示了至少4個結構域。將來源于菌株H44/76的Hsf序列作為參考,包含氨基酸1-51的結構域1編碼自體轉運蛋白家族特征性的sec-依賴性信號肽,包含氨基酸52-473的結構域2編碼很可能是表面外露的且易進入免疫系統的過客結構域,包含氨基酸474-534的結構域3編碼蛋白低聚所需的推定卷曲螺旋結構域及絞鏈(頸部)區,包含殘基535-C末端的結構域4被預測編碼可能裝配成桶-樣結構且被錨定在外膜中的B-鏈(Henderson等人,(1998),Trends?Microbiol.6:370-378;Hoiczyk等人,(2000),EMBO?22:5989-5999)。因為結構域2和3很可能是表面外露的,且很好保守的(在所測試的所有菌株中超過80%;如Pizza等人,(2000),Science?287:1816-1820所述),它們代表了目標疫苗候選物。就該目的而言,結構域2(被稱作Hsf過客結構域)和結構域2+3(被稱作Hsf頸部區+卷曲螺旋結構域)在大腸桿菌中表達并被純化。編碼氨基酸52-473(Hsf過客)和52-534(Hsf?n+cc)的DNA片段是用加入末端Rca?I(正向引物)和XhoI(反向引物)限制位點的寡核苷酸進行PCR擴增的。純化的擴增子是用RcaI/XhoI在供應商建議的條件下消化的;且隨后被克隆到pET24d(Novagen?Inc.,Madi?sonWI)大腸桿菌表達載體的NcoI(與rcaI相容)/XhoI位點中。選擇重組質粒并用于制備純化重組質粒。進行表達研究時,將這些載體(pET-Hsfpas和pET-Hsf?ncc)引入到大腸桿菌菌株B121DE3(Novagen)中,其中,T7聚合酶的基因受到異丙基-β-D硫代半乳糖苷(IPTG)-可調節的lac啟動子的控制。Novablue(DE3)[pET-24b/BASB029]大腸桿菌重組菌株的液體培養物(700ml)是在37℃攪拌下生長的,直到600nm的光密度(OD600)達到0.6。在該時間點,加入IPTG至1mM終濃度,使培養物再生長4小時。然后10,000rpm離心該培養物,將沉淀在-20℃冷凍至少10小時。融化后,在細胞溶解之前,22℃下,利用Rannie破裂器通過兩種途徑將沉淀(680ml培養物)重懸浮于pH7.0的20mM磷酸鹽緩沖液中30分鐘。4℃下,15,000rpm(Beckman?J2-HS離心機,JA-20轉子)離心溶解的細胞30分鐘使其成為沉淀。將上清液上樣到在pH8.0的20mM?Tris-HCl緩沖液中平衡的Q-瓊脂糖快速流動柱(Pharmacia)上。流過后,用5倍柱體積的pH8.0的20mM?Tris-HCl緩沖液洗滌柱子。利用溶于pH8.0的20mM?Tris-HCl緩沖液中的250mM?NaCl溶液洗脫柱上的重組蛋白。收集抗原陽性級分,并相對于pH7.0的20mM磷酸鹽緩沖液透析過夜。然后將0.5M?NaCl和20mM咪唑加入到透析樣品中。然后將樣品應用在Ni-NTA瓊脂糖柱(Qiagen)上,該柱是在含500mMNaC?l和pH7.0的20mM咪唑的20mM磷酸鹽緩沖液中平衡的。流過后,用5倍柱體積含500mM?NaCl和20mM咪唑的pH7.0的20mM磷酸鹽緩沖液洗滌柱子。用溶于pH7.0的20mM磷酸鹽緩沖液中的100mM咪唑溶液洗脫污染物。用溶于pH7.0的20mM磷酸鹽緩沖液中的250mM咪唑溶液洗脫重組蛋白。收集抗原陽性級別并相對于含150mM?NaCl的pH6.8的10mM磷酸鹽緩沖液透析。如圖2所示,從柱上洗脫富聚的(據估計在CBB染色的SDS-PAGE中的純度高于90%)Hsf-樣過客蛋白,它們遷移到約47kDa(估計的相對分子量)處。該多肽對5-組氨酸基序產生的小鼠單克隆抗體是反應性的。這些數據共同表明Hsf過客及Hsf?ncc基因可以以重組形式在大腸桿菌中表達并純化。

實施例8:重組Hap過客在大腸桿菌中的產生和純化

對來源于腦膜炎奈瑟氏球菌的Hap-樣蛋白進行的計算機分析揭示了至少3個結構域。將來源于菌株H44/76的Hap-樣序列作為參考,包含氨基酸1-42的結構域1編碼自體轉運蛋白家族特征性的sec-依賴性信號肽,包含氨基酸43-950的結構域2編碼很可能是表面外露的且易進入免疫系統的過客結構域,包含氨基酸951-C末端(1457)的結構域3被預測編碼可能裝配成桶-樣結構且被錨定在外膜中的β-鏈。因為結構域2很可能是表面外露的,且很好保守的(在所測試的所有菌株中超過80%)并可能作為亞單位抗原在大腸桿菌中產生,所以它代表了目標疫苗候選物。因為結構域2和3很可能是表面外露的,且很好保守的(在所測試的所有菌株中超過80%;如Pizza等人,(2000),Science287:1816-1820所述),所以它們代表了目標疫苗候選物。就該目的而言,結構域2(被稱作Hap過客結構域)在大腸桿菌中表達并被純化。編碼氨基酸43-950(Hap過客)的DNA片段是用加入末端NcoI(正向引物)和XhoI(反向引物)限制位點的寡核苷酸進行PCR擴增的。純化的擴增子是用NcoI/XhoI在供應商建議的條件下消化的;且隨后被克隆到pET24d(Novagen?Inc.,Madi?son?WI)大腸桿菌表達載體的NcoI/XhoI位點中。選擇重組質粒并大規模純化。進行表達研究時,將這些載體(pET-Hap?pass)引入到大腸桿菌菌株B121DE3(Novagen)中,其中,T7聚合酶的基因受到異丙基-β-D硫代半乳糖苷(IPTG)-可調節的lac啟動子的控制。

在發酵罐中培養大腸桿菌BL21[pET-Hap?pass]:將主接種物的等分試樣級分(100μl)在FEC013AA平板(大豆胨A320g/L、酵母提取物5g/L、NaCl?5g/L、瓊脂18g/L、蒸餾水加到1L)上擴散,并在37℃下生長20小時。收獲菌苔并重懸浮于含0.9%NaCl的無菌水中。該溶液用于以批量模式在20L發酵罐中的FEC011AC培養基(大豆胨24g/L、酵母提取物48g/L、MgSO4/7H2O?0.5g/L、K2HPO42g/L、NaH2PO4/2H2O0.45g/L、甘油(87%)40g和蒸餾水加到1L)上接種。維持溫度(30℃)、pH(6.8,NaOH?25%/H3PO425%)、壓力(500mbar)恒定,以20L/分換氣。在這些條件中,通過調整攪拌速度(100-1000rpm)將溶解的氧壓維持在20%。生長8小時后加入誘導物(IPTG、1mM)(OD=27.8)。6小時(OD=49.2)和16H30(OD=48.6)后收集樣品(6L),離心收獲生物量,并在-20℃貯存相應的顆粒狀物。

Hap過客的純化:

HAP過客是以批量模式自發酵罐純化的。開發了純化流程(見下面)。

細胞破裂后,在離心沉淀中回收到大量Hap過客。用8M尿素進行溶解。盡管有N-末端His-尾部,IMAC作為第一步是無效的,但第一步后仍在SP-XL陽離子交換器上進行。在該SP-瓊脂糖-XL上,在線性NaCl(0-250mM)梯度的中點定量洗脫蛋白。IMAC是用Cu++-上樣的螯合瓊脂糖FF進行的,如同FHAb。該時間,與FHAb相反,IMAC顯示重要的純化因子。在SDS-PAGE上,IMAC之后HAP2/3似乎是純的。然而在0-200mM咪唑梯度下,HAP2/3的峰非常寬,因此我們試圖通過咪唑步驟(10mM-100mM)洗脫;然而就純度而言,梯度模式似乎更有效。作為最后一步,我們試驗了通過凝膠滲透作用進行尿素-精氨酸緩沖液交換,然而在這種情況下,蛋白有兩個洗脫峰。這兩個峰在SDS-PAGE上顯示出可比較的分布;因此假設是由于HAP過客的部分重折疊。然后我們進行最后一步的經典透析用于緩沖液交換。SDS-PAGE分析顯示終材料的良好純度(見圖3)。HAP過客純度是通過WB抗-his進一步證實的。它由抗-大腸桿菌識別。分子量為96.1KD。

實施例9:重組FrpA/C形式在大腸桿菌中的產生和純化

腦膜炎奈瑟氏球菌編碼兩種RTX蛋白,它們被稱作FrpA和FrpC,是在鐵有限條件下分泌的(Thompson等人,(1993)J.Bacteriol.175:811-818;Thompson等人,(1993)Infect.Immun..61:2906-2911)。RTX(重復毒素)蛋白家族在靠近它們的C-末端處共有具有如下一致序列的一系列9個氨基酸的重復:Leu?Xaa?Gly?Gly?XaaGly(Asn/Asp)AspXaa.(LXGGXGN/DDX)。大腸桿菌HlyA中的重復單位被認為是Ca2+結合位點。如圖4所示,在菌株FAM20中表征的腦膜炎球菌FrpA和FrpC蛋白在它們的中心和C-末端區共有廣泛的氨基酸相似性,但N-末端的氨基酸相似性非常有限(如果有的話)。此外,在FrpA和FrpC之間保守的區顯示出某些多態性,這是由于9氨基酸基序的重復(在FrpA中13次,在FrpC中43次)。為了評價FrpA和Fr?pC的疫苗潛能,我們在大腸桿菌中重組生產了在FrpA和FrpC之間保守的蛋白區。就該目的而言,包括氨基酸277-1007的DNA片段(關于腦膜炎奈瑟氏球菌FAM20肽序列)是用正向引物

FrpA-19(5’-CTCGAGACCATGGGCAAA?TATCATGTCTACGACCCCCTCGC-3’)和反向引物FrpA-18(3’-GTGCATAGTGTCAGAGTTTTTGTCGACGTCGTAATTATAGACC-3’)從腦膜炎奈瑟氏球菌血清組B?H44/76基因組進行PCR擴增的。獲得分別為約1530bp(3個重復單位)、約2130bp(13個重復單位)和2732bp(23個重復單位)的3個擴增子并用NcoI和SalI限制性內切酶消化。然后將這些片段插入到pET24d的NcoI/XhoI(與SalI相容)位點中,并選擇重組質粒(分別為pET-Frp3、pET-Frp13和pET-Frp23)用于轉化大腸桿菌BL21DE3細胞。如圖5所示,所有這3個構建體均可在誘導后產生重組FrpA/C保守結構域。此外,增加重復單位的數量可增加重組蛋白的溶解性,這是通過細胞分級分離分析測定的(沒有給出數據)。

包含23個九肽LXGGXGN/DDX重復的FrpA/C保守結構域(總計911 aa)的純化:培養3.5升大腸桿菌B121DE3[pET-Frp23]并在OD達到0.6時,通過加入2mM?IPTG而誘導4小時。離心收獲細胞并將相應的沉淀壓碎,離心澄清,并將相應的上清液上樣在Ni2+-離子金屬親和柱上(Ni-NTA-瓊脂糖,Qiagen?GmBh)。咪唑用于洗脫,且最終通過相對于pH6.8的10mM磷酸鈉、150mM?NaCl進行廣泛透析而被除去。

實施例10:重組FHA形式在大腸桿菌中的產生和純化

截短的FhaB自腦膜炎奈瑟氏球菌克隆

基因組DNA是用QIAGEN基因組DNA提取試劑盒(Q?iagen?Gmbh)從腦膜炎奈瑟氏球菌血清組B菌株H44/76的1010個細胞中提取的。然后使該材料(1μg)經過聚合酶鏈反應DNA擴增,其中使用下列FhaB基因的特異性引物:JKP:5’AAT?GGA?ATA?CAT?ATG?AAT?AAA?GGT?TTA?CAT?CGCATT?ATC3’和57JKP?5’CCA?ACT?AGT?GTT?TTT?CGC?TAC?TTG?GAG?CTG?T3’。得到編碼所述蛋白前1433個N-末端氨基酸的約4200bp的DNA片段,用NdeI/SpeI限制性內切酶消化并使用標準分子生物學技術(Molecular?Cloning,a?Laboratory?Manual,Second?Edition,Eds:Sambrook,Fritsch?&?Maniatis,Cold?Spring?Harbor?press?1989)插入到pMG?MCS的相應位點中(pMG衍生物,Proc?Natl?Acad?Sci?USA1985年1月;82(1):88-92)。克隆FhaB片段的DNA序列是用Big?DyeCycle測序試劑盒(Perkin-Elmer)和ABI?373A/PRISM?DNA測序儀測定的(見圖1)。然后使重組pMG-FhaB質粒(1μg)經歷聚合酶鏈反應DNA擴增,其中使用FhaB特異性引物(XJKP035’AATGGAATACATATGAATAAAGGTTTACATCGCATTATCTTTAG3’和XJKP57025’GGGGCCACTCGAGGTTTTTCGCTACTTGGAGCTGTTTCAG?ATAGG?3’)。獲得4214bp的DNA片段,利用NdeI/XhoI限制性內切酶消化并使用標準分子生物學技術(Molecular?Cloning,a?Laboratory?Manual,Second?Edition,Eds:Sambrook,Fritsch&Maniatis,Cold?Spring?Harbor?press?1989)插入到pET-24b克隆/表達載體(Novagen)的相應位點中。含有截短FhaB(pET24b/FhaB2/3)的重組pET-24b的證實性測序是使用Big?Dyes試劑盒(Applied?biosystems)進行的并在由供應商描述的條件下,在ABI?373/A?DNA測序儀上進行分析。所得核苷酸序列在圖6中給出。

重組截短的FhaB蛋白在大腸杠桿菌中的表達和純化

pET24b/FhaB2/3克隆/表達載體的構建在上面描述。該載體攜帶從與6個組氨酸殘基片段融合的菌株H44/76中分離出來的截短FhaB基因(在重組產品的C-末端),其受到強噬菌體T7基因10啟動子的控制。進行表達研究時,該載體被引入到大腸桿菌菌株Novablue(DE3)(Novagen)中,其中,T7聚合酶的基因受到異丙基-β-D硫代半乳糖苷(IPTG)-可調節的lac啟動子的控制。Novablue(DE3)[pET24b/FhaB2/3]大腸桿菌重組菌株的液體培養物(100ml)在37℃攪拌下生長,直到600nm(OD600)的光密度達到0.6。在該時間點,加入IPTG到1mM終濃度,并使培養物再生長4小時。然后10,000rpm離心培養物并將沉淀在-20℃冷凍至少10小時。融化后,25℃下將沉淀重懸浮于緩沖液A(6M鹽酸胍、0.1M?NaH2PO4、0.01M?Tris,pH?8.0)中30分鐘,3次通過針,并離心澄清(20000rpm,15分鐘)。然后以1ml/分鐘的流速將樣品上樣到Ni2+-上樣的Hitrap柱(Pharmacia?Biotech)上。流過之后,用40ml緩沖液B(8M尿素、0.1MNaH2PO4、0.01M?Tris,pH?8.0)、40ml緩沖液C(8M尿素、0.1M?NaH2PO4、0.01M?Tris,pH?6.3)連續洗滌柱子。然后用30ml含有500mM咪唑的緩沖液D(8M尿素、0.1M?NaH2PO4、0.01M?Tris,pH?6.3)將柱上的重組蛋白FhaB2/3/His6洗脫下來,并收集3ml-大小的級分。如圖7所示,從柱上洗脫下遷移到大約154kDa(估計的相對分子量)處的高度富聚的FhaB-2/3/His6蛋白。該多肽對5-組氨酸基序的小鼠單克隆抗體是反應性的。這些數據共同表明FhaB2/3可以以重組形式在大腸桿菌中表達并純化。

用重組FhaB2/3/His給小鼠免疫

將在大腸桿菌中表達的部分純化的重組FhaB2/3/His6蛋白在第0、14和29天三次注射到Balb/C小鼠中(10只動物/組)。用大約5μg抗原以兩種不同制劑通過皮下途徑給動物注射:或者吸附在100μgAlPO4上或在SBAS2乳液中配制(每個劑量的SB62乳液含5μgMPL和5μgQS21)。此外,還在實驗中加入由僅用SBAS2乳液免疫的小鼠組成的陰性對照組。在第29天(II后15天)和第35(III后6天)給小鼠采血以檢測特異性抗-FhaB抗體。通過對純化重組FhaB2/3/His進行ELISA而測量混合血清(10只小鼠/組)的特異性抗-FhaB抗體。

實施例11:抗FHA、Hap和Hsf抗原產生的小鼠和兔血清的粘附阻 斷活性

與腦膜炎球菌FHAB-樣、Hsf-樣和Hap-樣同源的蛋白先前已被描述為重要的毒性決定因素并介導百日咳鮑特氏菌(FHA)和流感嗜血桿菌(Hap和Hsf)的細菌粘附。已知與上皮和內皮細胞的粘附對于腦膜炎球菌的鼻咽定居和穿透血腦屏障而言至關重要。因此,阻礙腦膜炎球菌粘附提供了一種很有價值的方法,以控制腦膜炎球菌定居和感染。在這里我們測試了針對腦膜炎球菌FHAB2/3rd、Hap-樣和Hsf-樣抗原的抗-血清是否能夠阻礙腦膜炎奈瑟氏球菌與內皮細胞的粘附。使用下列實驗過程:

HUVEC粘附的抑制:本研究中所用的腦膜炎球菌試驗菌株是菌株NmA8013的無莢膜、無菌毛的Opa-和Ope-衍生物。37℃下,將腦膜炎球菌細胞(NmA8013衍生物的2.10E5集落形成單位(CFU))在由40μlRPMI、50μl胎牛血清和50μl血清組成的培養基中培養30分鐘以測試粘附阻斷性。然后將該混合物放在含人臍帶靜脈內皮細胞(HUVEC)匯合單層的孔中,其中的培養基之前已被除去。在37℃、5%CO2下培養細菌和HUVEC細胞4小時。然后用新鮮的RPMI血清洗滌細胞單層3次,隨后刮平板。然后連續稀釋并將細胞溶解產物接種在GC平板上,測定與HUVEC相關的CFU。37℃培養平板48小時,以回收并使細胞相關腦膜炎球菌生長。

小鼠和兔血清的抗重組FHAB2/3 rd 、Hap和hsf抗原的粘附-阻斷活 性:抗-FHA?2/3、抗-Hsf全長(WO99/58683中所述)和抗-Hap全長(WO99/55873)抗體,以及針對相應的Hsf和Hap過客結構域的抗-血清可阻礙腦膜炎球菌與內皮HUVEC細胞粘附。圖8舉例說明與單獨的佐劑相比,由在AlPO4中配制的FHA?2/3誘導的特異性抗體能夠抑制腦膜炎奈瑟氏球菌B與HUVEC細胞粘附。與單獨的SBAS2佐劑相比(沒有抗原,4組),抗-FHA?2/3abs(SBAS2制劑)仍然是有效的,但效力低于AlPO4。單獨的SBAS2佐劑(沒有抗原)不能誘導可阻礙粘附的抗體。與4組相比,抗-Hap抗體(1組)可能具有輕微的抑制作用。在5組中,當試驗抗-FHA?2/3、抗-Hsf和抗-Hap抗體的混合物時,粘附的抑制強于單獨的抗-FHA?2/3,表明抗-Hap和抗-Hsf抗體產生了協同作用。在第二組抑制實驗(圖2)中,與陰性對照相比(3和4組),針對抗OMV過量表達Hsf(作為候選蛋白)的特異性兔抗血清能夠部分抑制腦膜炎奈瑟氏球菌B固定在內皮細胞上。該兔抗血清已被證實包含非常高的特異性抗-Hsf抗體效價。針對rec?Hsf(Hsf過客和Hsf全長)的抗體也能夠抑制細菌在HUVEC細胞上的粘附。用小鼠血清(5-6組)和用兔血清(激光擴展(laserextend))(7-8組)都是這樣的。在該第二個實驗中,證實了已經在第一個實驗中測試的特異性抗-rec?FHA?2/3抗體(1組)具有非常高的抑制作用。這些結果表明這些特異性抗原(Hap、FHA2/3和Hsf),無論分離的還是組合的,都是目標疫苗抗原。

實施例12:在小鼠攻擊模型中重組OMV的保護作用

在Balb/C小鼠中評價在致命攻擊后若干重組OMV的保護作用。這種活性免疫模型包括在通過皮下途徑進行一系列免疫后,將來源于若干菌株的腦膜炎球菌(懸浮于缺鐵TSB培養基中)腹膜內注射到成年Balb/C或OF1小鼠(6-8周大)中。用作外部鐵來源的鐵葡聚糖似乎是維持菌血癥所必需的且導致感染動物死亡。雖然該小鼠IP模型已經顯示出可有效評價毒力、免疫保護和鐵在感染中的作用,但它們不會進入在人類菌血癥和腦膜炎之前發生的咽運階段。該模型已經用于篩選過量表達Ns?pA、TbpA、或Hsf的若干OMV候選物。在下列實驗中,在第0、14和28天,通過皮下途徑用3(PV00N049)-5μg(PV00N035和PV00N043實驗)過量表達Hsf、NspA或TbpA的rec?OMV給Balb/C(近交)或OF1(遠交)小鼠免疫接種3次OMV是在Al(OH)3(100μg?Al(OH)3/動物)(PV00N035和PV00N043)或在AlPO4(100μg?AlPO4/動物)上配制的。然后在第28天(II后14天)和第35天(III后7天)給所述動物采血,用于特異性Ab評價。第35天,在攻擊前1小時,腹膜內注射10mg鐵葡聚糖。用H44/76(B:15:P1.7,16)或CU-385(B:4:P1.19,15)菌株攻擊,約1.10e7CFU/動物(見準確攻擊劑量結果的表)。使用CU-385菌株進行的異源菌株較之使用同源菌株更為嚴格。記錄第1-5天的死亡率。之后的表1舉例說明與較小擴展(lesser?extend)中OMV?porA(-)以及OMV?porA(+)相比,使用OMV?TbpA(+)(1/10和3/5的porA(-)與9/10和3/5的porA(+))、OMV?NspA(+)(4/10和4/5)和OMVHsf(+)(3/10、2/10和3/5)觀察到了更好的保護。這是我們在這三個實驗中共同得到的觀察結果。這些數據支持了在皰表面表達的TbpA、Hsf和NspA抗原對未來menB疫苗是重要的。

表1:重組外膜小泡小鼠模型中的保護活性.該表概括了在3個實驗過程中獲得的結果(PV00N35、PV00N043和PV00N049)

OMVs(皰)

NT:沒有測試

實施例13:在小鼠攻擊模型中重組亞單位抗原的保護作用

進行致死攻擊后,在Balb/C小鼠中評價若干重組純化蛋白的保護作用。這種活性免疫模型包括在通過皮下途徑進行一系列免疫后,將來源于若干菌株的腦膜炎球菌(懸浮于缺鐵的TSB培養基中)腹膜內注射到成年Balb/C或OF1小鼠(6-8周大)中。

用作外部鐵來源的鐵葡聚糖似乎是維持菌血癥所必需的且導致感染動物死亡。雖然該小鼠IP模型已經顯示出可有效評價毒力、免疫保護和鐵在感染中的作用,但它們不會進入在人類菌血癥和腦膜炎前發生的咽運階段。該模型已經用于篩選若干menB亞單位疫苗候選物,如重組FrpC、TbpA、FHA2/3和Hap分子。

在該實驗中,在第0、14和28天,通過皮下途徑,在有10μgMPL(每只動物)存在時,用在AlPO4(100μg)上配制的5μg(PV00N050實驗)這些蛋白給OF1(遠交)小鼠免疫接種3次。

然后在第28天(II后14天)和第35天(III后7天)給所述動物采血,用于特異性Ab評價,同時在第35天攻擊它們。攻擊那天,在攻擊前1小時,腹膜內注射10mg鐵葡聚糖。用CU-385(B:4:P1.19,15)菌株進行攻擊,在這種情況下其是異源的,事實上,除了TbpA序列來自B16B6菌株(B:2a:P1.2)之外,所述抗原序列均來自H44/76(B:15:P1.7,16)。

表2所列結果表明在該模型中,FrpC、TbpA、FHAB2/3rd、Hap誘導顯著保護:攻擊之后,5只小鼠中有2-4只存活,而只使用佐劑僅僅1/5存活。除了一組之外,在所有組中,特異性抗體的效價均較高(特異性抗-TbpA效價適中)。所有這些數據支持了以亞單位抗原、分離或組合形式提供的FrpC、FrpA、FrpA/C保守結構域、TbpA、FHAB2/3rd、Hap可用于研制menB疫苗。

表2:重組外膜小泡的小鼠模型中的保護活性.該表概括了在其中一個實驗過程中獲得的結果(PV00N050)。

亞單位抗原

實施例14:表示疫苗抗原組合的協同作用的方法

在檢測疫苗候選物這種組合的協同作用方面,可單獨或組合測試所得到的不同重組OMV(OMVs?porA(+)rmp-LbpB、OMVsporA(-)TbpA(+)Hsf(+)、OMVs?porA(-)TbpA(+)、OMVsporA(-)NspA(+)、OMVs?porA(-)Hsf(+)、OMVs?porA(-)TbpA(+)NspA(+))以從統計學上確定最佳組合。這項工作還可用亞單位抗原的組合、以及亞單位抗原+重組OMV的組合進行。給32組5只OF1小鼠/組注射并測試小鼠模型中的血清殺菌和調理活性,主動和被動保護(如果需要使用次優量的各抗原)。如果組合免疫后所產生的保護水平高于各抗原的總和,則表示抗原組合的協同作用。

實施例15:外膜小泡考馬斯藍染色的SDS-PAGE的Hsf和TbpA含 量分析

將15μg溶于外膜小泡制品中的蛋白在含有β-巰基乙醇的樣品緩沖液中稀釋,其中Hsf或TbpA或Hsf與TbpA兩個被上調,并在95℃下加熱10分鐘。然后使樣品通過SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝膠(Novex4-20%Tris-甘氨酸1.5mm2Dwell?SDS?Page),并在考馬斯藍中染色1小時,并通過若干次脫色洗滌而脫色。結果在圖9中表示,其表明在來源于腦膜炎奈瑟氏球菌的外膜小泡制品中,Hsf和TbpA水平明顯更高,其中它們的表達水平已得到提高。

實施例16:Hsf和/或TbpA被上調的OMV的免疫原性

在第0、21和28天,通過肌內途徑用OMV給20只小鼠的組免疫3次。每次接種包括5μg(蛋白含量)在含MPL的AlPO4上配制的OMV。所述OMV來源于腦膜炎奈瑟氏球菌菌株H44/76,其被改造成莢膜多糖和PorA被下調。比較其中的Hsf、TbpA、Hsf和TbpA兩個被上調或均未被上調的OMV。在第41天,采集血液樣品,通過ELISA或血清殺菌測定法進行分析。

檢測抗Hsf抗體的ELISA

4℃下,用100μl?1μg/ml溶于PBS中的特異性抗原覆蓋96孔微量平板(Nunc,Maxi?sorb)過夜。用150mM?NaCl?0.05%Tween?20洗滌后,在室溫振播下,用100μl?1%的PBS-BSA使平板飽和30分鐘。在每個步驟之間(室溫下振搖進行30分鐘,并使用0.2%PBS-BSA作為稀釋緩沖液),通過用NaCl-Tween?20洗滌除去過量試劑。向每個微量孔中加入100μl稀釋的血清樣品。結合抗體是由生物素化的抗-小鼠Ig(Prosan)(1/2000)識別的。抗原-抗體復合體是通過與鏈霉抗生物素-生物素化的過氧化物酶綴合物(Amersham)(1/4000)溫育而顯示的。鄰苯二胺/H2O2(4mg/10ml檸檬酸鹽緩沖液0.1M?pH4.5+5μl?H2O2)用于顯示測定。通過加入50μl?1N?HCl而終止反應前,在黑暗中室溫溫育平板15分鐘。閱讀490nm處的吸光度。

上表所示結果表明抗Hsf的較高和相等的抗體效價是通過用其中Hsf或Hsf和TbpA兩個均被上調的OMV免疫而提高的。事實上,在用單獨的佐劑或其中Hsf或TbpA均未被上調或只有TbpA被上調的OMV接種后產生的血清中沒有檢測到抗Hsf的抗體。

實施例17:抗Hsf和/或TbpA被上調的OMV產生的抗血清的血清 殺菌活性

在使用同源菌株H44/76或異源菌株Cu385的測定法中比較用OMV接種的小鼠抗血清的血清殺菌活性,其中OMV中的Hsf、TbpA、Hsf和TbpA兩個被上調或未被上調。血清殺菌測定法已經顯示出與保護作用的良好關聯且因此是候選組合物在引發保護性免疫反應方面有效程度的良好指征。

在37℃+5%CO2下,在MH+1%Polyvitex+1%馬血清培養皿上過夜培養腦膜炎奈瑟氏球菌血清組B野生型菌株(H44/76菌株=B:15?P1.7,16L3,7,9和CU385菌株=B:4?P1.19,15L?3,7,9)。37℃振搖下,在補充了50μM?Desferal(鐵螯合劑)的液體TSB培養基中將它們傳代培養3小時,以在470nm處達到約0.5的光密度。

56℃下,將混合或單獨的血清滅活40分鐘。在0.3%HBSS-BSA中1/100稀釋血清樣品,然后在50μl體積的圓底微量平板中連續稀釋2倍(稀釋8次)。

將適宜OD的細菌在0.3%HBSS-BSA中稀釋,得到1.310e4CFU/ml。將37.5μl該稀釋液加入到血清稀釋液中,并在37℃振搖下培養微量平板15分鐘。然后,將12.5μl兔補體加入到各孔中。37℃振搖培養1小時后,將微量平板放在冰上停止殺死。

使用傾斜方法,將每孔20μl涂在MH+1%Polyvitex+1%馬血清培養皿中,37℃+CO2培養過夜。計算CFU和殺死的百分比。血清殺菌效價是達到≥50%殺死的最后稀釋度。

與上表所示那些相似的結果是在兩個其它相似的實驗中獲得的。

對同源菌株和異源的殺菌效價(GMT)顯著增加是在用其中Hsf和TbpA被上調的OMV接種后見到的。通過比較,在用Hsf或TbpA上調的OMV接種的小鼠上測量的殺菌GMT與使用對照OMV接種小鼠獲得的那些相似。

雙重上調的益處還可很清楚地在產生顯著水平殺菌抗體的小鼠百分比方面觀察到(效價大于1/100),特別是使用異源菌株的實驗。

實施例18:混合抗-Hsf和抗-TbpA血清對殺菌活性的作用

在第0、21和28天,通過肌內途徑用OMV給20只小鼠的組免疫3次。每次接種包括5μg(蛋白含量)在含MPL的AlPO4上配制的OMV。所述OMV來源于腦膜炎奈瑟氏球菌菌株H44/76,其被改造成莢膜多糖和PorA被下調。用其中沒有蛋白上調的對照OMV給其中一組小鼠免疫。在第二組中,Hsf表達被上調,在第三組中,TbpA表達被上調,在第四組中,Hsf和TbpA的表達均被上調。

混合血清,即或者使用同組小鼠的血清或混合從其中Hsf單獨或TbpA單獨被上調的組中分離的血清。測量各組混合血清的血清殺菌活性,結果在下表提供。

上表中的結果表明將抗-Hsf和抗-TbpA抗血清混合在一起可導致較之任何一種抗血清單獨獲得的更高的血清殺菌活性。協同作用似乎是由于抗Hsf和TbpA抗體的同時存在而獲得的。

實施例19:截短的Hsf蛋白可與TbpA協同組合

一系列截短的Hsf構建體是用標準分子生物學方法制備的。這些包括編碼包含Hsf信號序列的氨基酸1-54和Hsf氨基酸134-592的構建體(TrlHsf)。第二個截短的Hsf包括Hsf信號序列的氨基酸1-53,接著是Hsf的氨基酸238-592(Tr2Hsf)。將這兩個截短的Hsf構建體和全長Hs?f引入到腦膜炎奈瑟氏球菌B菌株MC58?siaD-、Opc-、PorA中-這樣它們的表達將被上調,且外膜小泡是用上述方法生產的。

外膜小泡制品吸附在Al(OH)3上,并在第0、21和28天注射到小鼠中。在第42天,給小鼠采血并制備血清。將所述血清與從用上調的TbpA?OMV免疫的小鼠的血清混合,并按照上面所述進行血清殺菌測定。

結果

上表所示結果表明第一次截短(TrlHsf)可引發免疫反應,其能夠與抗TbpA的抗血清組合產生較之使用全長Hsf更高的血清殺菌活性。然而,截短的程度十分重要,且在Tr2中產生的截短物與全長Hsf相比,具有有害作用。相對于所用的兩種菌株,均可見到TrlHsf的殺菌活性提高。

實施例20:抗TbpA、Hsf和第三種腦膜炎球菌蛋白抗體的血清殺 菌活性

將上述其中PorA和莢膜多糖被下調的腦膜炎奈瑟氏球菌菌株H66/76用作使用上述方漢上調TbpA和Hsf、LbpB、D15、PilQ或NspA的背景菌株。外膜小泡是從上述各菌株制備的。重組FHAb、FrpC、FrpA/C和Hap是用此前所述技術和本領域已知的技術制備的(如PCT/EP99/02766、WO92/01460和WO98/02547中所述)。

外膜小泡制品和重組蛋白吸附到Al(OH)3上,并在第0、21和28天注射到小鼠中。第42天,給小鼠采血并制備血清。將抗TbpA和Hsf上調的OMV的血清和來源于用含上調的LbpB、D15、PilQ或NspA或重組FHAb、FrpC、FrpA/C或Hap的OMV接種的小鼠血清混合,并按照上面所述進行血清殺菌測定。

結果

結果在下表中給出。在使用同源H44/76菌株的測定法中,除了FrpC之外,加入抗第三腦膜炎球菌抗原的抗體不會產生較之使用單獨的抗TbpA和Hsf抗體所產生的更高的血清殺菌效價。

然而,抗第三種抗原抗體的加入在使用異源菌株的血清殺菌測定法中是有利的。抗D15(OMP85)、Hap、FrpA/C和LbpB的抗體可特別有效地增加抗CU385菌株的血清殺菌效價。

實施例21:外膜小泡中的FrpB?KO對它們在同源和異源菌株中引 發殺菌免疫反應的能力的作用

按照WO01/09350所述,使用0.1%DOC提取,將H44/76腦膜炎奈瑟氏球菌的兩種菌株用于制備外膜小泡制品,這樣LOS含量大約為20%。菌株B1733是siaD(-)、PorA(-),具有Trl?Hsf(實施例19)的上調且lgtB被敲除。菌株B1820?B1733是siaD(-)、PorA(-),具有Trl?Hsf的上調,且lgtB被敲除,FrpB也被敲除。兩種菌株都是在補充了60μM?Desferal的培養基中培養的,這樣就可使鐵調節的蛋白如LbpA/B和TbpA/B被上調。

皰制品吸附在Al(OH)3上,并在第0和21天,將5μg肌內注射到30只小鼠的組中。在第28天采集血液樣品。

按照實施例17所述,在3種L3菌株(同源野生型菌株H44/76和兩種異源L3菌株;NZ124和M97250687)上進行血清殺菌測定法。

結果

GMT表示SBA中的血清幾何平均效價。

SC表示小鼠血清轉變數(SBA效價>1/100)。

所述結果清楚地表明FrpB?KO(B?1820)皰較之FrpB(+)皰(B1733)可誘導更好的異源交叉-殺菌反應。在菌株M97250687和NZ124中,SBA效價更高且血清轉變小鼠的比例更高。當FrpB缺失時,同源性菌株的結果不是很好。這些數據表明FrpB驅動免疫反應,但因為該外膜蛋白是高度可變的,因此抗該蛋白的抗體僅能誘導殺死同源菌株。

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