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微生物 組合
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摘要
申請專利號:

CN201080050567.X

申請日:

20100910

公開號:

CN102630141B

公開日:

20150923

當前法律狀態:

有效性:

有效

法律詳情:
IPC分類號: A01N65/00,A01N35/04,A01N65/08,A01N65/06,A01P15/00,A01N27/00,A01N31/04,A01N31/06,A01N31/08,A01N35/02,A01N35/06,A01N43/22,A01N49/00 主分類號: A01N65/00,A01N35/04,A01N65/08,A01N65/06,A01P15/00,A01N27/00,A01N31/04,A01N31/06,A01N31/08,A01N35/02,A01N35/06,A01N43/22,A01N49/00
申請人: 薩里大學
發明人: 弗朗西斯庫斯·安東尼厄斯·安娜·瑪麗亞·德萊,米娜卡蘭塔爾·扎德
地址: 英國吉爾福德
優先權: 0915879.1
專利代理機構: 北京三高永信知識產權代理有限責任公司 代理人: 何文彬
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法律狀態
申請(專利)號:

CN201080050567.X

授權公告號:

法律狀態公告日:

法律狀態類型:

摘要

本發明提供了包含萜類化合物和抗微生物劑的抗微生物組合物,以及所述組合物在不同應用中的用途,包括防止、對抗或治療微生物感染,或防止微生物生長或定居。

權利要求書

1.一種抗微生物組合物,包含二萜類化合物或三萜類化合物或其鹽,以及抗微生物劑,所述抗微生物劑干擾細胞膜完整性或蛋白質合成;其中,所述三萜類化合物選自烏索酸、石竹素、樺木酸、模繞酮酸和羽扇豆醇;所述二萜類化合物選自脫氫松香酸、松香酸、海松酸、異貝殼杉烯酸、ent-3-β-羥基異貝殼杉烯酸、塞爾維克酸(salvic?acid)、桃拓酮、18-乙酸基-順式-海州常山-3,13-Z-二烯-15-酸、松香醇、脫氫松香基胍、花柏酸、鐵銹醇、異海松酸、7-氧代-脫氫松香酸、7-羥基-脫氫松香酸和13-羥基-羅漢松-8,11,13-三烯-18酸。2.根據權利要求1所述的組合物,其中,所述二萜類化合物或三萜類化合物和/或抗微生物劑來自硬木或軟木。3.根據權利要求1或2所述的組合物,其中,所述二萜類化合物或三萜類化合物和/或抗微生物劑來自冬青樹、橡樹、山毛櫸、白蠟樹、楓樹、白楊樹、柳樹,或栗樹。4.根據權利要求3所述的組合物,其中,所述栗樹為甜栗。5.根據權利要求1或2所述的組合物,其中,所述二萜類化合物或三萜類化合物和/或抗微生物劑來自松樹、云杉、雪松、冷杉、落葉松、花旗松、鐵杉、柏樹、紅杉或紫杉。6.根據權利要求1所述的組合物,其中,所述抗微生物劑包含香精油。7.根據權利要求6所述的組合物,其中,所述香精油是百里香油、丁香油、茶樹精油、大茴香子油、菖蒲油、樟腦油、柏木油、肉桂油、香茅油、檸檬油、檸檬草油、梨莓油、肉豆蔻油、玫瑰草油、薄荷油、迷迭香油、羅勒油、香根草油、黑胡椒油、姜油、沒藥油、牛至油、月桂葉油、香葉油、橙油、蒔蘿油或冬青油。8.根據權利要求1所述的組合物,其中,所述抗微生物劑是香草醛,或其鹽。9.根據權利要求1所述的組合物,其中,所述抗微生物劑是1,2-二苯乙烯,或其鹽。10.根據權利要求1所述的組合物,其中,所述抗微生物劑是松柏醛或其鹽。11.根據權利要求1所述的組合物,其中,所述抗微生物劑是脫氫姜油酮或其鹽。12.根據權利要求1所述的組合物,其中,所述抗微生物劑用分子式XII表示:其中,R、R、R、R、R和R各自選自H、OH、C-C的烷基或亞烷基、C-C的烷氧基、C-C的飽和或不飽和醛、C-C的酯或酮、C-C的羧基以及C-C的烷基取代的苯基。13.根據權利要求12所述的組合物,其中,R是OH、C-C的烷基或烷氧基、C-C的醛或C-C的烷基取代的苯基;R是H、C-C的烷基或烷氧基,或C-C的酯;R是H或C-C的烷基;R是H、C-C的烷基或亞烷基、C-C的烷氧基、C-C飽和或不飽和的醛,或C-C的酮;R是H或C-C的烷基;以及R是H或C-C的烷基。14.根據權利要求12所述的組合物,其中,R是OH、C的烷氧基、C的醛或C-C的烷基取代的苯基。15.根據權利要求12所述的組合物,其中,R是H、C-C的烷基、或C-C烷氧基,或C-C的酯。16.根據權利要求12所述的組合物,其中,R是H或C-C的烷基。17.根據權利要求12所述的組合物,其中,R是H、C-C的烷基或亞烷基、C-C的烷氧基、C-C的飽和或不飽和的醛,或C-C的酮。18.根據權利要求12所述的組合物,其中,R是H或C-C的烷基。19.根據權利要求12所述的組合物,其中,R是H或C-C的烷基。20.二萜類化合物或者三萜類化合物或其鹽增加抗微生物劑的抗微生物活性的用途,所述抗微生物劑干擾細胞膜完整性或蛋白質合成;其中,所述三萜類化合物選自烏索酸、石竹素、樺木酸、模繞酮酸和羽扇豆醇;所述二萜類化合物選自脫氫松香酸、松香酸、海松酸、異貝殼杉烯酸、ent-3-β-羥基異貝殼杉烯酸、塞爾維克酸、桃拓酮、18-乙酸基-順式-海州常山-3,13-Z-二烯-15-酸、松香醇、脫氫松香基胍、花柏酸、鐵銹醇、異海松酸、7-氧代-脫氫松香酸、7-羥基-脫氫松香酸和13-羥基-羅漢松-8,11,13-三烯-18酸。21.二萜類化合物或者三萜類化合物或其鹽增加用分子式XII表示的抗微生物劑的抗微生物活性的用途:其中,R、R、R、R、R和R如權利要求12-19中任意一項所限定;所述三萜類化合物選自烏索酸、石竹素、樺木酸、模繞酮酸和羽扇豆醇;所述二萜類化合物選自脫氫松香酸、松香酸、海松酸、異貝殼杉烯酸、ent-3-β-羥基異貝殼杉烯酸、塞爾維克酸、桃拓酮、18-乙酸基-順式-海州常山-3,13-Z-二烯-15-酸、松香醇、脫氫松香基胍、花柏酸、鐵銹醇、異海松酸、7-氧代-脫氫松香酸、7-羥基-脫氫松香酸和13-羥基-羅漢松-8,11,13-三烯-18酸。22.根據權利要求20或21所述的用途,其中,所述抗微生物劑的抗微生物活性增加至少8倍。23.根據權利要求22所述的用途,其中,所述二萜類化合物或三萜類化合物和抗微生物劑如權利要求1-19中任一項中所限定。24.一種包含根據權利要求1-19中任一項所述的抗微生物組合物的液體劑型。25.一種包含根據權利要求1-19中任一項所述的抗微生物組合物的動物墊料。26.一種包含根據權利要求1-19中任一項所述的抗微生物組合物的覆蓋物。27.一種防止或抑制微生物定居于物體的方法,其包含用根據權利要求1-19中任一項所述的抗微生物組合物接觸或涂覆所述物體的表面。28.一種包含根據權利要求1-19中任一項所述的抗微生物組合物的物體。29.一種根據權利要求28所述的物體,其中所述物體是醫療器械。30.根據權利要求29所述的物體,其中,所述醫療器械是醫用導管、支架、創傷敷料、繃帶、避孕器、外科用植入物、隱型眼鏡或石膏。31.根據權利要求29所述的物體,其中,所述醫療器械是替代的關節。32.一種包含根據權利要求1-19中任一項所述的抗微生物組合物的紡織品或聚合物。33.一種包含根據權利要求32所述的紡織品或聚合物的衣著類商品。34.一種包含根據權利要求32所述的紡織品或聚合物的鞋或其鞋墊。35.一種包含根據權利要求1-19中任一項所述的抗微生物組合物的包裝材料。36.一種根據權利要求35所述的包裝材料,其中,所述包裝材料用于包裝食品或食品原料。37.根據權利要求1-19中任一項所述的抗微生物組合物的用途,其用于防止或抑制食品的微生物感染的方法中,該方法包含用權利要求1-19中任一項所述的抗微生物組合物接觸或涂覆食品的表面。38.一種包含根據權利要求1-19中任一項所述的抗微生物組合物的容器。39.一種根據權利要求38所述的容器,其中,所述容器能夠容納食品,或為廢物容器。

說明書

本發明涉及抗微生物組合物。特別地,本發明涉及包含萜類化合物和抗微生物劑的抗微生物組合物,以及所述組合物在不同應用中的用途,包括防止、對抗或治療微生物感染,或防止微生物生長或定居的應用。所述抗微生物組合物的具體應用包括用于動物墊料產業,例如禽舍,用于普通抗微生物產品,例如抗菌劑和消毒劑,用于食品工業,例如包裝材料,以及用于產品的直接處理,用于土壤、覆蓋物或植物材料以防止植物病原體的擴散,還能用于各種醫療方面的應用。

禽舍中墊料材料內的微生物活性導致雞糞便中的尿酸轉變成氨。這對飼養密度高的禽舍是一個特有的問題,禽舍中廢棄物的高濃度的銨使其變成堿性,這導致銨轉變為氨氣,高濃度的氨氣對禽類有毒害,當其排入大氣時,成為酸雨的重要促成因素。因此,動物房的氨排放受到密切關注,新法案迫使農戶遵守嚴格的排放法規(IPPC,國際植物保護公約)。實際上,實施國際植物保護公約意味著擁有40,000多只禽類的農戶必須:(1)使氨的排放最小化,(2)減少由禽舍散發的臭味,以及(3)制定適當的糞便管理計劃。

在富含銨的墊料上飼養的家禽會遭受足、胸的“腐蝕性燒傷”以及足墊皮膚炎(FPD)之苦,這就降低了最終的食品的質量。防止銨造成的“腐蝕性燒傷”不僅能改善動物的健康安樂,也會因動物生長得更好,以及更高質量的動物產品而減少農戶的損失。因此有必要使禽舍中的微生物活性最小化。

目前,減少微生物活性以防止動物墊料中的微生物將尿酸轉變成氨和銨通過保持盡可能低的墊料含水量來實現。據稱在這方面有效的報道是使用吸濕的墊料材料。然而,實際上,很難保持墊料的低濕度水平,因為禽類飼養密度通常較高,并且冷凝和液體濺出會導致墊料越來越濕。潮濕會助長微生物活性,其導致雞糞便中存在的尿酸形成銨。

當pH值升至高于7時,銨轉變成氨,在pH值高于8時氨濃度明顯增高。為了防止墊料材料產生腐蝕性,一旦尿酸轉變成氨,可以添加酸式鹽,例如明礬(KAl(SO4)2.12H2O)或硫酸氫鈉以保持低pH值。然而,這些化合物并不持久,且對農戶而言價格昂貴。而且所產生的廢物內的大量的鋁會因重金屬濃度升高而產生廢物處理問題。因此,上述“酸化物質”并不常用,禽舍中氨的形成仍舊普遍。

經飼養用于食肉或產蛋的動物,例如雞的另一個問題是食品中攜帶病原體的風險。據估計超市銷售的75-95%的冷凍雞肉感染有彎曲桿菌,10%的感染有沙門氏菌。對于從事育種和產崽的農戶而言,在動物房中檢測到沙門氏菌則意味著整個崽群需要銷毀,這造成農戶嚴重的經濟損失。一般認為,這些細菌從動物房,尤其是墊料中進入動物體。據信,上述問題的原因在于動物墊料為這些細菌提供了適宜的基底,包括高溫(25-35℃)、高濕度水平、糞便中高濃度的營養物以及處于適合所述細菌生長范圍的pH值。因此,迫切需要減少動物墊料中的微生物活性,以防止病原體生長。

壞死梭桿菌和黑色素類桿菌是足跟(蹄皮炎)的病原體,其病癥為綿羊、山羊和牛腳趾間區域感染,造成蹄腐爛。該病非常痛苦,且具接觸傳染性。接觸時能殺滅所述細菌的動物墊料會顯著降低所述細菌對偶蹄類動物造成的傷害。

市面上有眾多合成抗菌劑和消毒劑,其特征可描述為基于醇類、醛類、氧化劑、酚類或季銨的化合物。通常這些物質可以有效殺滅微生物,但存在如下問題:(1)細菌對醛類產生抗性;(2)氧化劑和酚類腐蝕性極強;(3)有機物質使醛類失活;(4)醇類不持久;(5)上述物質大多數對人類具有毒性或刺激性:或者(6)對環境有負面影響。

由于上述問題的存在,對“天然”和更“綠色”的抗微生物劑,例如香精油以及其他具有抗微生物性能的天然產品,例如香草醛有極大的需求。常見的香精油的例子包括百里香酚(來自百里香的天然酚類產品),含有茶樹精油的產品,以及包含其他來自丁香(丁香酚)、桉樹、松樹等的香精油的產品。然而,香精油和其他植物來源的抗微生物產品的抗微生物性通常較弱,因此,為了發揮效力,需要使用高濃度而致使上述產品有強烈的氣味,這樣不僅昂貴,而且令使用者感到非常不悅。因此,本領域存在提高已知抗微生物劑活性的需求。

發明人現證實,萜類化合物及其衍生物顯著改善已知抗微生物劑的抗微生物性能。

因此,根據本發明第一方面,提供了抗微生物組合物,所述組合物包含萜類化合物或其衍生物,以及抗微生物劑,所述抗微生物劑干擾細胞膜完整性或蛋白質合成。

第二方面,提供萜類化合物或其衍生物用于增加抗微生物劑的抗微生物活性的用途,所述抗微生物劑干擾細胞膜完整性或蛋白質合成。

發明人研究了輕微加熱的木屑變得具有抗微生物活性的機制,并驚訝地發現,包含萜類化合物脫氫松香酸和抗微生物劑香草醛的所述木屑的提取物能夠強烈殺菌。然而,如實施例1所描述,最令人驚訝的是,他們發現,包含上述兩種物質的提取物表現出比僅含香草醛,即不與萜類化合物組合時高出1000倍的抗微生物活性。如實施例3所示,該效應并不僅限于二萜類化合物,例如松香酸、脫氫松香酸和海松酸,還擴大至許多三萜類化合物,例如烏索酸、石竹素以及白樺脂醇。通常抗微生物物質以純品形式使用,因而發明人相信,他們第一個發現任何萜類化合物,例如脫氫松香酸,都具有驚人的提高天然或合成抗微生物劑,例如香草醛的抗微生物活性的性能。

術語“增加抗微生物劑的抗微生物活性”可以意味著,當萜類化合物存在時,所述抗微生物劑呈現出比不存在萜類化合物時更高的抗微生物活性。活性的出人意料的增加可能是協同效應的結果,其中兩種物質以互補的方式干擾微生物細胞膜完整性或蛋白質合成。因此,所述抗微生物劑能夠干擾微生物的細胞膜的完整性或其蛋白質合成(例如RNA合成),而所述萜類化合物會使所述抗微生物劑更容易進入細胞,或增強其功能。

所述抗微生物劑的抗微生物活性可以增加至少1倍,至少2倍,至少3倍,至少5倍,至少8倍,或至少10倍。抗微生物活性可以增加至少20倍,至少50倍,至少100倍,200倍,300倍,500倍,700倍,或1000倍。抗微生物活性甚至可以增加至少1200倍,至少1500倍,1700倍,或至少2000倍或更多。所述抗微生物活性的增加可以用例如在實施例中描述的那些檢測法來確定。

發明人測試了多種加熱后的植物材料,發現經加熱的來自不同硬木和軟木,例如松木和蔥木的包含萜類化合物和抗微生物劑的木屑呈現出令人驚訝的抗微生物性能。因此,所述萜類化合物和/或抗微生物劑可以來自植物,例如硬木或軟木。作為所述萜類化合物和/或抗微生物劑來源的適合的硬木種屬的例子包括冬青樹(冬青屬,Ilex?genus)、橡樹(櫟屬,Quercus?genus)、山毛櫸(山毛櫸屬,Fagus?genus)、白蠟樹(白蠟樹屬,Fraxinus?genus)、楓樹(槭屬,Acer?genus)、白楊樹(楊屬,Populus?genus)、柳樹(柳屬,Salix?genus),以及栗樹(栗屬,Castanea?genus),例如甜栗(歐洲板栗,Castanea?sativa)。

作為所述萜類化合物和/或抗微生物劑來源的適合的軟木種屬包括針葉樹或松樹。適合的軟木種屬的例子包括松樹(松屬,Pinus?genus)、云杉(云杉屬,Picea?genus)、雪松(雪松屬,Cedrus?genus)、冷杉(冷杉屬,Abies?genus)、落葉松(落葉松屬,Larix?genus)、花旗松(黃衫屬,Pseudotsuga?genus)、鐵杉(毒參屬,Conium?genus)、柏樹(柏科Cupressaceae?family)、紅杉(北美紅杉屬,Sequoia?genus)和紫杉(紅豆杉屬,Taxus?genus)。發明人發現源自松樹,尤其是歐洲赤松的材料表現出令人驚訝的抗微生物活性,由此為本發明的組合物提供了有用的來源。因此,所述萜類化合物和/或抗微生物劑可以源自松科,優選為松屬,例如silvestrus松(Pinus?silvestrus)或negrus松(Pinus?negrus)。諸如松香和歧化松香等來自木材的材料也是本發明所用萜類化合物的優良來源。

作為所述萜類化合物和/或抗微生物劑來源的植物材料可以先加熱,例如暴露于至少50℃或至少115℃的溫度。所述植物材料可以暴露于低于200℃或低于150℃的溫度。所述植物材料可以暴露于介于75℃和175℃或介于100℃和160℃的溫度。所述植物材料可以暴露于所述處理溫度至少30分鐘,至少1小時,至少5小時,至少24小時,至少36小時,至少48小時或至少72小時。發明人發現,經所述熱處理結果會產生本發明的抗微生物組合物。

用于第一方面的組合物中,或用于第二方面的用途中的萜類化合物由異戊二烯單元,即2-甲基-1,3-丁二烯或CH2=C(CH3)CH=CH2組成。異戊二烯單元可以由通式(I)表示:

萜類化合物具有親水部分(通常為羧酸)以及疏水部分(通常為多環結構)。所述萜類化合物可以是樹脂酸,樹脂酸可以作為保護劑或木材防腐劑,它由樹木的樹脂導管周邊的薄壁組織上皮細胞產生。

萜類化合物可依據異戊二烯單元的數量進行分類。因此,所述萜類化合物可以是二萜類或三萜類化合物。二萜類化合物含有四個異戊二烯單元,三萜類化合物含有六個異戊二烯單元。可用于第一或第二方面的適宜的三萜類化合物可以選自三萜類化合物烏索酸、石竹素、樺木酸、模繞酮酸和羽扇豆醇。三萜類化合物在實施例3中描述。

二萜類化合物,其包括樹脂酸和氧化樹脂酸,具有由取代的十氫萘骨架和包含一個氫鍵供體基團的親水區域組成的疏水部分。二萜類化合物在實施例1和2中描述。適宜的二萜類化合物可選自二萜類化合物脫氫松香酸、松香酸、海松酸、貝殼杉烯酸、ent-3-β-羥基貝殼杉烯酸、salvic酸(salvic?acid)、桃拓酮、18-乙酸基-順式-海州常山-3,13-Z-二烯-15-酸(18-acetoxy-cis-cleroda-3,13-Z-dien-15-oic?acid)、松香醇(7,13-松香二烯-18-醇,7,13-abietadien-18-ol)、脫氫樅酸基胍(dehydroabieticylguanidines)、花柏酸、鐵銹醇、異海松酸、7-氧代-脫氫松香酸、7-羥基-脫氫松香酸和13-羥基-羅漢松-8,11,13-三烯-18酸(13-hydroxy-podocarpa-8,11,13-trien-18-oic?acid)。

松香酸可以由通式(II)表示:

相應地,第一方面的組合物中的或第二方面用途中的所述萜類化合物可以是松香酸,或其衍生物。

發明人相信,他們最先生產出了包含松香酸和抗微生物劑的消毒或抗菌組合物。因此,第一方面的所述組合物可以是抗菌劑或消毒劑。抗菌劑可以是任何抗微生物的物質,其用于活組織或皮膚,以減少或防止微生物感染或膿毒癥。因此所述抗菌劑中的有效成分最好具有足夠的特異性和濃度,其可用于皮膚或組織,而不會產生毒性作用或刺激,但能殺滅微生物。消毒劑可以是任何抗微生物的物質,其殺滅在無生命物體或其表面上的微生物。

可依照本發明使用的適宜的松香酸,可包括新松香酸、棕櫚酸、左旋海松酸、脫氫松香酸,或其衍生物。

優選地,所述萜類化合物是脫氫松香酸(DHAA),或其衍生物。脫氫松香酸以及適合的衍生物可以由通式(III)、(IV)或(V)表示:

其中,R是CO2H,CO2Me,CH2OH或CHO;R2是CO2H,CO2Me或CH2OH;R3是CO2H,CO2Me或CH2OH。

萜類化合物可以通過不同的方式修飾,例如脫水、鹵化、氧化或甲基化以形成一系列具有上述性能的衍生物。因此,適合的萜類化合物衍生物可以包括脫水、氧化、甲基化或鹵化形式的萜類化合物。例如,松香酸可脫水形成海松酸。另外,脫氫松香酸可鹵化形成12,14-二氯脫氫松香酸。

所述萜類化合物或其衍生物可用堿,例如氫氧化鈉處理,以形成相應的鹽(例如DHAA氫氧化物)。所述鹽易溶于水形成溶液,其可用于表面,例如通過噴灑或浸入溶液自身。

依照本發明使用的所述抗微生物劑能干擾微生物細胞膜的完整性,該過程發生的機制被認為因物質不同而各異,但一般認為,所述抗微生物劑中的親脂部分能與微生物細胞膜的磷脂成分發生反應,從而改變位于細胞膜上的鈣離子通道和鉀離子通道的活性。另外,所述抗微生物劑可以通過其生化性能和分子形狀與細胞膜相互作用,從而影響膜酶、膜載體分子和膜受體的活性。上述任一種或全部的機制能干擾微生物細胞膜的完整性,導致細胞死亡。

許多香精油,例如那些自植物提取的,呈現出不同的抗微生物活性。因此,在本發明的一個實施方案中,用于第一或第二方面的所述抗微生物劑可包含香精油。可用的適合的香精油包括百里香油(活性成分:百里香酚)、丁香油(活性成分:丁香酚)、茶樹精油(活性成分:松油烯-4-醇)、大茴香子油、菖蒲油、樟腦油、柏木油、肉桂油、香茅油、檸檬油、檸檬草油、梨莓油、肉豆蔻油、玫瑰草油、薄荷油、迷迭香油、羅勒油、香根草油、黑胡椒油、姜油、沒藥油、牛至油、月桂葉油、香葉油、橙油、蒔蘿油或冬青油。

因此,所述抗微生物劑可包含百里香酚,或其衍生物。百里香酚的化學分子式和結構式在此提供。

據信,香精油以上述方式與微生物細胞膜整體相互作用,即油中的親脂部分與細胞膜的脂質部分發生反應,改變細胞膜中離子通道的活性。另外,香精油據信通過其生化性能和分子形狀與細胞膜相互作用。香精油通常包含生物活性化合物的混合物,但被認為對其抗微生物活性起作用的主成分是酚類。在香精油中發現的酚類化合物的例子記載于表1。

表1:香精油中發現的抗微生物酚類化合物的例子

因此,依照本發明使用的所述抗微生物劑可擴大至使用表1所列任何一種酚類化合物。

香精油中同樣也被認為具有抗微生物活性的其他生物活性化合物包括鄰甲酚、間甲酚、對甲酚、香芹酚、甲氧甲酚、異丁子香酚、對苯二酚、愈創木酚、水楊酸甲酯、反式-茴香醚、甲基丁子香酚、甲基胡椒酚、對甲氧基苯丙酮、苯甲醛、茴香醛和枯茗醛。因此,本發明所述抗微生物劑也可包括上述化合物中的任何一種。

如實施例中所描述,發明人證實,當與萜類化合物脫氫松香酸組合時,香草醛的抗微生物活性出人意料地增強。因此,所述抗微生物劑可以是香草醛或其衍生物。需要注意的是,香草醛(又名甲基香蘭素或4-羥基-3-甲氧基苯甲醛)是具有C8H8O3分子式的有機化合物,由分子式VI表示:

相應地,在一個實施方案中,本發明第一方面的組合物包含脫氫松香酸或其衍生物,以及香草醛或其衍生物。在第二方面用途的一個實施方案中,脫氫松香酸或其衍生物用于提高香草醛或其衍生物的抗微生物特性。

香草醛的常見衍生物是香草酸,其由分子式VII表示:

另一種適合的香草醛衍生物可包括乙基香草醛。

如圖2所示,發明人證實,1,2-二苯乙烯的抗微生物活性也能被萜類化合物,例如脫氫松香酸令人驚訝地增強。因此,在另一實施方案中,所述抗微生物劑可以是1,2-二苯乙烯,或其衍生物。1,2-二苯乙烯存在兩種可能的同分異構體,順式和反式同分異構體,其由分子式VIII和IX表示:

如實施例12中所述,發明人證實,松柏醛的抗微生物活性也能被萜類化合物,例如脫氫松香酸令人驚訝地增強。因此,在另一實施方案中,所述抗微生物劑可以是松柏醛或其衍生物,其由分子式X表示:

如實施例8中所述,發明人證實,脫氫姜油酮的抗微生物活性也能被萜類化合物,例如脫氫松香酸令人驚訝地增強。因此,在另一實施方案中,所述抗微生物劑可以是脫氫姜油酮或其衍生物,其由分子式XI表示:

因此,在另一實施方案中,本發明第一方面的組合物可以包含脫氫松香酸或其衍生物,香草醛或其衍生物,和/或1,2-二苯乙烯和/或松柏醛和/或脫氫姜油酮,或其衍生物。

另外,在另一實施方案中,第二方面的用途可以包含脫氫松香酸和/或1,2-二苯乙烯和/或松柏醛和/或脫氫姜油酮,或其衍生物用于提高香草醛或其衍生物的抗微生物特性。

在另一實施方案中,所述抗微生物劑可以是蛋白質性質的,優選包含至少一種多肽。因此,當被試驗者食用后,所述抗微生物劑可以被蛋白酶消化。例如,所述抗微生物劑可以是乳酸鏈球菌肽,其為具有34個氨基酸的多環肽抗微生物化合物。當被試驗者食用后,乳酸鏈球菌肽被體內存在的蛋白酶快速失活。如實施例5中所述,發明人證實,脫氫松香酸水溶性差,且證實,令人驚訝的是,包含脫氫松香酸和香草醛的材料的水提取物對微生物細胞并無毒性。相反,抗微生物活性保留在處理過的材料中。因此,將脫氫松香酸與蛋白性質的抗微生物劑例如乳酸鏈球菌肽組合將制得非常安全的產品,因為不僅脫氫松香酸不易溶解,而且還有變性蛋白,該產品不會對試驗者具有任何毒性作用。

除了之前提到的可依照本發明用作抗微生物劑的“天然產品”,還有許多也能破壞微生物細胞膜的化學制品,其造成微生物的死亡,因此也可依照本發明用作抗微生物劑。這些化合物可分為醇類、醛類、氧化劑、酚類或季銨化合物。通常,這些化合物用于清潔表面,并以水溶液形式提供(例如氯)。因此,這些化合物與萜類化合物例如脫氫松香酸組合以增強其抗微生物活性可使得這些化合物更加有效,即便被稀釋時。所述抗微生物劑可以是或不是抗生素。所述抗微生物劑可以是或不是重金屬,例如鋅。

發明人還發現,除了萜類化合物之外,其他具有極性、酸性基團或部分以及剛性疏水部分的分子,也可用于增強抗微生物劑例如香草醛的抗微生物活性。

因此,根據本發明的第三方面,提供了具有極性部分和剛性疏水部分的化合物用于增強香精油或香草醛,或其衍生物抗微生物活性的用途。

所述極性部分可包含羥基,例如羧酸部分。所述疏水部分可包含至少一個芳香環,優選多個芳香環。所述化合物可以是類異黃酮植物抗毒素(例如菜豆蛋白)、大豆抗毒素或紫檀堿。所述香精油可以是前述中的任一個,或其活性成分。需要注意的是,第三方面的用途可用于本發明以下任一方面中所述的任何應用中。

發明人仔細研究了于此描述的可依照本發明使用的每種抗微生物劑的化學結構,發現它們均可用相同的化學分子式表示。

因此,所述抗微生物劑可用分子式XII表示:

其中,R1、R2、R3、R4、R5和R6各自選自H、OH、C1-C4的烷基或亞烷基、C1-C4的烷氧基、C1-C4的飽和或不飽和醛、C2-C4的酯或酮、C1-C4的羧基以及C1-C3的烷基取代的苯基。

R1可以是OH、C1-C4的烷基或烷氧基、C1-C4的醛或C1-C2的烷基取代的苯基。R1可以是OH、C1的烷氧基、C1的醛或C1-C2的烷基取代的苯基。

R2可以是H、C1-C4的烷基或烷氧基,或C2-C4的酯。R2可以是H、C1-C3的烷基、C1-C3的烷氧基,或C2-C3的酯。

R3可以是H或C1-C4的烷基。R3可以是H或C1-C3的烷基。

R4可以是H、C1-C4的烷基或亞烷基、C1-C4的烷氧基、C1-C4的的飽和或不飽和醛,或C2-C4的酮。R4可以是H、C1-C3的烷基或亞烷基、C1-C2的烷氧基、C1-C2的飽和或不飽和醛,或C2-C3的酮。

R5可以是H或C1-C4的烷基。R5可以是H或C1-C2的烷基。

R6可以是H或C1-C4的烷基。R6可以是H或C1-C2的烷基。

R1、R2、R3、R4、R5和R6可以如下表所限定。

需要注意的是,有許多氧化的香精油或其衍生物的組分具有上述通式XII,但其并未在列表中逐一提及。

第四方面中,提供了包含萜類化合物或其衍生物,以及由分子式XII表示的抗微生物劑的抗微生物組合物。

其中,R1、R2、R3、R4、R5和R6各自選自H、OH、C1-C4的烷基或亞烷基、C1-C4的烷氧基、C1-C4的飽和或不飽和醛、C2-C4的酯或酮、C1-C4的羧基以及C1-C3的烷基取代的苯基。

第五方面中,提供了萜類化合物或其衍生物用于增強由分子式XII表示的抗微生物劑的抗微生物活性的用途。

其中,R1、R2、R3、R4、R5和R6各自選自H、OH、C1-C4的烷基或亞烷基、C1-C4的烷氧基、C1-C4的飽和或不飽和醛、C2-C4的酯或酮、C1-C4的羧基以及C1-C3的烷基取代的苯基。

依照本發明的所述抗微生物組合物可用于防止、對抗或治療任何微生物感染,其為細菌或真菌感染。可用第一或第四方面的抗微生物組合物治療或防止的細菌感染可以是革蘭氏陽性或革蘭氏陰性細菌感染。可用所述組合物對抗的革蘭氏陽性細菌的例子包括厚壁菌(Firmicutes)門中的細菌,其包括芽孢桿菌屬(Bacillus?spp.)、梭狀桿菌屬(Clostridium?spp.)、分枝桿菌屬(Mycobacterium?spp.)、葡萄球菌屬(Staphylococcus?spp.)、鏈球菌屬(Streptococcus?spp.)和腸球菌屬(Enterococcus?spp.)。例如,所述革蘭氏陽性細菌可以是金黃色葡萄球菌(S.aureus)。可用所述組合物對抗的革蘭氏陰性細菌的例子包括腸桿菌科(Enterobaceriaceae),例如沙門氏菌屬(Salmonella?spp.)(例如腸道沙門氏菌(Salmonella?enterica)、腸炎沙門菌(S.enteritidis)或鼠傷寒沙門菌(S.typhimurium)),以及腸桿菌屬(Escherichia?spp.)(例如大腸桿菌(E.coli)))。彎曲菌屬(Campylobacter?spp.)和假單胞菌屬(Pseudomonas?spp.)是可用本發明的組合物治療的革蘭氏陰性細菌的其他例子。

可用所述組合物對抗的感染人或動物的真菌感染的例子主要是皮膚病。例如,可對抗的真菌可以是絲狀真菌,例如青霉屬(Penicillium?spp.)或曲霉屬(Aspergillus?spp.)。感染皮膚的真菌病的例子有花斑癬(致病病原為正圓瓶形酵母(Pityrossporum?orbiculare))、金錢癬、足癬(致病病原為小孢霉屬(Microsporum)、毛癬菌屬(Trichophyton)和表皮癬菌屬(Epidermophyton)的真菌)以及例如鵝口瘡(致病病原為白假絲酵母(Candida?albicans))的酵母感染。造成皮膚成片剝落(頭皮屑)的頭皮真菌感染也能用本發明的組合物治療。除了感染哺乳動物的真菌感染之外,本發明的組合物可用于對抗植物或植物產品的真菌感染。特別令人感興趣的是那些即便在植物本身已死亡時,也能在植物殘體上存活或產生孢子的真菌。能在死亡的植物材料上存活,并造成嚴重損失的真菌病的例子包括疫霉屬(Phytophthora)、腐霉菌(Pythium)、核盤菌屬(Sclerotinia)、輪枝孢屬(Verticillium)、文圖拉屬(Ventura)、葡萄孢屬(Botrytis)和鐮刀菌屬(Fusarium)的真菌。一個極具破壞性的疾病的例子是櫟樹猝死病菌,即櫟樹猝死病的致病病原Phytophthora?ramorum。該病感染杜鵑花屬種,并對橡樹(櫟屬)具有毀滅性的作用。本發明的組合物也可用于對抗例如釀酒酵母(S.cerevisiae)的酵母感染。

已知可用本發明組合物對抗的多種不同的微生物,發明人認為,第一和第四方面的組合物可通過增強已知抗微生物劑的活性,應用于多種不同的抗微生物用途(臨床或其他方面的),例如在工業的、家用的、醫療保健、包裝和工程方面的應用,其中微生物活性或甚至其存在是個問題。優選地,所述組合物以可溶的形式(即溶于乙醇或丙酮),或通過使其轉變成可溶于水的鹽來應用。然而,當不是鹽的形式時,一旦溶劑揮發,所述組合物自身以水不溶的形式存在,即吸收、整合或覆蓋到支持表面或材料上。

因此,本發明第六方面中提供了包含第一或第四方面的所述抗微生物組合物的液體劑型。

對哺乳動物具有低毒性,味道或氣味良好或完全無味,并具有優良且廣泛的抗微生物性能的天然化合物可應用在很多方面。例如,它們可用于為動物墊料和動物床消毒,或為例如用于制備食物的器具表面消毒。組合物也可用于抗菌洗手液和肥皂、去屑洗發露、皮膚霜和漱口水。

有利地,使用萜類化合物改善干擾細胞膜完整性的抗微生物劑活性,例如香草醛或香精油,導致現有天然產品活性顯著增強,即使在原始活性成分處于低濃度(即非常稀)的情況下。因此,第一或第四方面的組合物在其沒有氣味或味道的低濃度的情況下是有效的。另外,重要的是,本發明的組合物對人或哺乳動物是無害的,因為所述化合物天然地普遍存在于周圍環境中,因此當處理過的產品通過常規廢物處理渠道處理時,對環境的影響沒有顯著的增加。在一個實施方案中,所述抗微生物組合物可用于處理動物墊料,因為其抗微生物性能,防止了沙門氏菌、彎曲桿菌、分枝桿菌和大腸桿菌的生長,已知這些菌均為與動物墊料相關的主要動物病原體。對各種參與將尿酸和尿素轉變成氨的微生物的抑制可防止動物墊料產生腐蝕性,并防止氨釋放入大氣中。

因此,第七方面中提供了包含依照第一或第四方面所述的抗微生物組合物的動物墊料。

為了有效減少第五方面的動物墊料中氨的形成以及病原體數量,用第一方面所述的組合物對木屑或其他吸附劑,例如紙、珍珠巖或其他多孔材料進行處理。所述組合物最好是包含脫氫松香酸或其衍生物與香草醛。所述組合物可包含作為溶劑的乙醇或丙酮。因此,墊料原料可通過直接噴灑,或通過浸入溶液,或將溶液與墊料原料混合來處理,然后令溶劑揮發。可選地,所述組合物先通過成鹽而具有水溶性,使其可與水和其他極性溶質配合。

有利地,第七方面所述的墊料減少了異味,并增進了動物的健康安適。所述動物墊料可用于動物飼養產業,例如用于家禽,例如雛雞、火雞、鴨、雞或鵝,也可用于豬、牛、羊、馬以及其他動物的墊料。可選地,所述動物墊料可用于寵物產業,例如作為兔子、豚鼠、倉鼠、沙鼠、大鼠、小鼠或籠中鳥的墊料。第七方面的墊料也可用于在動物實驗室試驗中的動物,例如小鼠、大鼠或兔子(例如基因敲除小鼠/裸鼠)。所述墊料也可用于動物園中飼養動物的墊料/窩。所述墊料也可用于運輸活動物的動物墊料,或用于產卵母雞的動物墊料/窩,因為已知腸炎沙門氏菌感染健康母雞的卵巢,并在蛋殼形成前感染雞蛋。

第一或第四方面的組合物也可用于園藝和造林,以防止因真菌或細菌感染引起的植物病所造成的農作物損失。因此,所述組合物可用作覆蓋物,即土壤表面的保護性覆蓋,以防止土壤滋生的病原體感染植物、果實或蔬菜。可選地,所述組合物可直接用于植物殘體,以防止定居于這些材料的病原體擴散。

因此,第八方面中提供了包含依照第一或第四方面的所述抗微生物組合物的覆蓋物。

所述覆蓋物可用來使微生物感染引起的農作物損失最小化或防止該損失。例如,50%的草莓和20-40%的葡萄因諸如葡萄孢屬的真菌感染受損,蘋果70%的經濟價值因蘋果黑星病受損。據信上述農作物損失可通過使用所述覆蓋物而避免。

發明人還認為,第一或第四方面的所述組合物能用于防止或抑制微生物定居于物體自身。

因此,第九方面中提供了防止或抑制微生物定居于物體本身的方法,其包含用第一或第四方面的所述組合物接觸或涂覆所述物體的表面。

醫院“超級細菌”是醫療系統的主要問題之一,抗微生物產品是克服該問題的有效解決方法。本發明的組合物已顯示出能有效防止革蘭氏陰性細菌,例如金黃色葡萄球菌(Staphylococcus?aureus)和艱難梭菌(Clostridium?difficile)的生長。該技術也能用于天然(即羊毛、棉花、亞麻、黃麻等)的纖維和例如由尼龍和聚酯制成的人造纖維,其可用于制造病號服,以及床上用品。其他應用包括處理醫療設備、家具、電器和電子產品,以及窗框。

第十方面中提供了包含依照第一或第四方面的所述抗微生物組合物的物體。

所述物體可涂有所述組合物。優選地,一經涂覆,所述組合物便處于不溶的形式。優選地,用于第九方面所述方法或第十方面所述物體的組合物的用量足以有效殺滅或防止微生物生長。需要注意的是,本發明的組合物對涂覆需要無菌的表面或物體特別有用,并且如上述討論,所述組合物具有持久抗微生物的優勢。本發明組合物可用于涂覆生物或醫療場所或環境中所用的任何物體或設備,對這些物體或設備而言,長期防止可導致病人感染的微生物感染或污染非常重要。

所述物體可以是醫療器械。可用本發明的組合物涂覆的醫療器械的例子包括醫用導管、支架、創傷敷料、繃帶、避孕器、外科用移植物和替代關節、隱型眼鏡等。本發明的組合物對涂覆生物材料和物體,以及由此制備的器械特別有用。生物材料的微生物污染/定居是特別棘手的問題,因為微生物可用上述材料作為生長基質。生物材料(例如膠原和其他生物聚合物)可用于涂覆人工關節表面。或者,某些移植物可基本上包含含有本發明的消毒劑的上述生物材料。

開發繃帶、創傷敷料和石膏時,產生針對致病原的有效屏障是一個重要的考慮因素。因此,盡管產生針對病原生物體的屏障,用本發明的組合物處理上述產品可以允許氣體交換。相似地,被單和枕套能用所述組合物處理,使其具有抗微生物活性。

本發明的組合物可用于涂覆處于要求無菌的環境中的任何表面,例如在醫療環境中的任何表面。所述組合物可用于保持醫院病房清潔,因此幾乎醫院的任何部分均可用本發明的組合物涂覆。所述組合物可用于防止手術室中的醫療設備(例如手術臺),以及手術室墻壁和地板的表面感染,因此,這些表面可涂以本發明的組合物。發明人相信,此處描述的組合物將對總體改善無菌性和潔凈性非常有用。

本發明的組合物也可用于保護多種不同易于受微生物感染的家用產品。所述產品可涂以所述組合物,而且該產品可為各種不同類型的產品,例如制備食物的表面,廚房案板或地毯。地毯通常由羊毛、尼龍、聚酯和聚丙烯纖維制成,其可簡單地涂以本發明組合物。然而,需要注意的是,潛在的應用可能更廣。上述依照本發明的組合物可應用的物體和表面的名單尚不詳盡。因此,所述組合物可用于任何易于受微生物感染或污染的表面,例如廚房和浴室表面及產品,例如馬桶座或馬桶自身。

發明人認為,本發明的組合物可用于制造抗微生物材料,例如由聚合物、紡織品或纖維織物制成的鞋墊,所述聚合物、紡織品或纖維織物可用于制造墊料,也可用于服裝和時裝行業。因此,第十一方面中提供了包含依照第一或第四方面的所述抗微生物組合物的聚合物或紡織品。

所述紡織品和聚合物可用于例如醫院和手術室所用的寢具,例如枕套、床單,以及被套。所述紡織品或聚合物可用于制造衣物,例如易于受微生物感染的衣物,例如內衣或鞋墊。

因此,第十二方面中提供了包含依照第十一方面的所述紡織品或聚合物的衣著類商品。

所述衣著類商品可以是內衣或鞋墊。所述衣著類商品可以是鞋類。

因此,第十三方面中提供了包含依照第十一方面的所述紡織品或聚合物的鞋類或其鞋墊。

本發明的抗微生物組合物也可用于國防的應用。士兵,尤其是戰爭中的士兵,由于不能經常清洗而受困于衛生問題,因而易于受微生物感染。因此,第十二方面的衣著類商品可為制服,優選為軍裝。

本發明的其他應用包括食品包裝。水果收獲后,因真菌和細菌感染導致的農作物損失很普遍,估計收獲后損失至少與收獲前損失相當。因此,迫切需要能用于食品包裝行業的抗微生物材料。

因此,第十四方面中提供了包含依照第一或第四方面的所述抗微生物組合物的包裝材料。

優選地,所述包裝材料用于包裝易腐爛的產品,即任何壽命有限的產品或具有微生物感染風險的產品。優選地,所述包裝材料用于包裝食品或食品原料。所述包裝材料可防止易腐爛或剛收獲的食物產品的損失,例如易受腐敗菌,例如真菌和細菌感染的水果和蔬菜。為了防止由上述腐敗菌造成的損失,所述包裝材料可用第一或第四方面的組合物涂覆或噴灑,或浸入所述組合物中。

可用所述包裝材料包裝的所述食品可以是水果(例如油桃、桃子、蘋果或梨)或蔬菜、肉、面包或餅干等。水果此處用作高度易感收獲后疾病的農產品的例子,然而其他農產品,例如西紅柿、胡蘿卜、生菜等,能受益于本發明組合物的保護。

第十五方面中提供了第一或第四方面的所述抗微生物組合物的下述用途,即在防止或抑制食品的微生物感染的方法中的使用,該方法包含用第一或第四方面的所述抗微生物組合物接觸或涂覆食品的表面。

所述食品可以是水果、蔬菜、肉或奶制品。香精油經常用于水果包裝,因為由于其揮發性而產生抑制食品腐敗微生物的氣氛。一旦食品開封,香精油揮發,而不會在食物產品上有任何殘留。發明人因此設想,使用第一或第四方面的所述組合物,其中萜類化合物與香精油組合,用于處理食品,諸如水果。萜類化合物與干擾細胞膜完整性的抗微生物劑組合使用,例如與香精油組合,產生更大的抗微生物效應。當水果開封時,所述香精油揮發,不會有香精油殘留,而剩余分子本身并無害。因此,所述處理對食用所述水果的人無害。

舉例來講,脫氫松香酸與天然抗微生物劑一起的應用是用于食品,例如水果的表面。因為僅是水果表面被處理,即使每單位表面面積濃度較高,每單位重量或體積的濃度會較低,取決于水果的大小。而且,水果的攝入將導致所述組合物在消化道內因食物與唾液和消化液的混合而進一步稀釋。眾所周知,脫氫松香酸和其他萜類化合物難溶于水,因此可以設想,當其被攝入時,甚至與影響細胞膜完整性的物質共用時,其效果甚微。

另外,實施例5中,發明人檢測了加熱的松樹木屑(其包含脫氫松香酸和多種抗微生物產品,包括香草醛)的水提取物的抗微生物性能。每種提取物對沙門氏菌效果甚微,然而經提取后的木屑本身保留了極高的抗微生物活性。這清楚地表明,脫氫松香酸難溶于水,因此當被攝入時,不太可能造成任何毒性效應。為了使所述組合物更安全,優選將萜類化合物與可在胃中快速降解的抗微生物劑組合,例如蛋白性質的化合物,例如乳酸鏈球菌肽。

發明人還設想用第一或第四方面的所述組合物處理或涂覆盛器或容器。

因此,第十六方面中提供了包含依照第一或第四方面的所述抗微生物組合物的容器。

所述容器可容納食品,即食品容器。所述容器可容納任何易腐敗、損耗或受微生物感染的食品材料,例如新鮮食品或產品。例如,所述食品可包括水果或蔬菜。第一或第四方面的所述組合物也可用于處理容納廢料的盛器,或作為廢料容器的添加劑。因此,所述容器可容納廢料,即廢物容器。所述容器可用于存儲任何可能降解的廢料,例如食余殘渣。可降解垃圾,例如有機廚房垃圾處理不當時會招引蒼蠅,并產生異味。因此,經所述組合物處理的所述廢物容器可以是家用或商用垃圾箱,其導致蒼蠅或異味的減少或消除。

總而言之,本發明的組合物包含與抗微生物劑組合的萜類化合物,該抗微生物劑干擾微生物細胞膜的完整性或蛋白質合成,例如RNA合成。需要注意的是,大多數合成的抗微生物劑(例如苯酚、乙醇、氯化的化合物等)高度可溶,因此,通過接觸,對人細胞有毒害。香精油趨于更加疏水,但僅有溫和的抗微生物活性。然而,如實施例5中所述,脫氫松香酸難溶于水,因此其效果僅限于經處理的特定表面。因為其用于上述的任何應用中,例如用于動物墊料、醫院和家用表面及鞋墊時,不會導致所述物質轉移至與經處理物體接觸的人,因而優勢明顯。因此,經處理的物體具有抗微生物活性,但對動物和人無毒害。另外,萜類化合物例如脫氫松香酸與溫和的抗微生物天然產品(例如香精油)的組合,允許這些通常價格昂貴,且具強烈的味道和氣味的產品,可以在大大降低的濃度下使用而保持高效力。

另一方面提供了包含萜類化合物或其衍生物,以及干擾細胞膜完整性的抗微生物劑的抗微生物組合物。

另一方面提供了萜類化合物或其衍生物增強抗微生物劑的抗微生物活性的用途,所述抗微生物劑干擾細胞膜完整性。

此處描述的所有特征(包括任何附隨的權利要求、摘要和附圖),和/或由此公開的任何方法或程序中的所有步驟,可與任何上述方面以任何方式組合,除了至少一些上述特征和/或步驟相互排斥的組合之外。

為了更好的了解本發明,并展示本發明的實施方案如何實施,以下附圖和實施例可作為參考。

圖1顯示使用本發明一個實施例中包含香草醛和脫氫松香酸的組合物抗金黃色葡萄球菌(革蘭氏陽性細菌)的抑制實驗;

圖2顯示使用包含1,2-二苯乙烯和脫氫松香酸的組合物抗金黃色葡萄球菌的抑制實驗;

圖3顯示使用包含香草醛和脫氫松香酸的組合物抗腸炎沙門菌(革蘭氏陰性細菌)的抑制實驗;

圖4顯示使用包含香草醛和脫氫松香酸的組合物抗鼠傷寒沙門菌(革蘭氏陰性細菌)的抑制實驗;

圖5顯示使用包含香草醛和脫氫松香酸的組合物抗大腸桿菌(革蘭氏陰性細菌)的抑制實驗;圖6顯示使用包含香草醛和脫氫松香酸的組合物抗青霉屬(絲狀真菌)的抑制實驗;

圖7顯示使用包含香草醛和脫氫松香酸的組合物抗曲霉屬(絲狀真菌)的抑制實驗;以及

圖8顯示使用包含香草醛和脫氫松香酸的組合物抗釀酒酵母(酵母)的抑制實驗;

實施例

發明人研究了輕微加熱的松樹木屑產生抗微生物活性的機制。如下述實施例所述,他們觀察到,萜類化合物,脫氫松香酸能顯著提高香草醛和其他天然抗微生物劑,例如香精油的抗微生物活性。

實施例1脫氫松香酸對香草醛抗微生物活性的協同效應

本實施例的目的在于確定脫氫松香酸增強香草醛的抗微生物活性的程度。

方法

用乙醇和水(80/20體積比)由20mmol的香草醛制備按2倍稀釋的系列,產生20mmol–0.00975mmol的各種濃度。另制備20mmol的脫氫松香酸的乙醇和水的溶液。

為了比較脫氫松香酸對香草醛抗微生物效果的影響,10μl每種濃度的香草醛稀釋液,連同10μl的20mmol脫氫松香酸,滴至三塊10mg的珍珠巖上,使每克珍珠巖具有與在該溶液中相同的濃度。一套對照處理不加脫氫松香酸,另一套對照處理僅加20mmol脫氫松香酸,第三套對照處理僅加10μl以80/20配比的乙醇和水,不加香草醛或脫氫松香酸。乙醇一經揮發,所有重復樣品接受10μl包含每毫升約5x106菌落形成單位(cfu)的腸道沙門氏菌懸液,每塊珍珠巖顆粒上的細菌載量約為5x104。將每塊珍珠巖顆粒在微量離心管中于25℃溫育24小時,最終分散在1ml0.25強度的林格氏液中。從每份懸液中取6滴20μl的液滴置于木糖-賴氨酸-脫氧膽鹽(XLD)瓊脂培養基上,每滴約含1000個細菌細胞。

結果

結果見表2。

表2-香草醛以及香草醛和脫氫松香酸組合物對腸道沙門氏菌存活的影響(n=3)

結論

表2所示結果表明:

(1)濃度為20mmol或低于20mmol的香草醛單獨對沙門氏菌無抑制效果;

(2)當與脫氫松香酸組合時,濃度為0.019mmol的香草醛仍具有顯著抑制效果。這表明脫氫松香酸使香草醛的抗微生物活性至少增強1000-2000倍;以及

(3)濃度為20mmol的脫氫松香酸無顯著的抗微生物活性。

實施例2有機酸對香草醛的抗微生物活性影響

本實施例目的在于評估脫氫松香酸對香草醛的協同效應是否特異性地與脫氫松香酸有關,或者能否解釋為酸的pH效應。

方法

用乙醇和水(80/20體積比)由20mmol的香草醛制備按2倍稀釋的系列,產生20mmol–0.078mmol的各種濃度。另制備20mmol的檸檬酸水溶液。

為了評估檸檬酸是否具有與脫氫松香酸相同的效果(如實施例1所述),10μl的每種香草醛稀釋溶液滴至三塊10mg的珍珠巖上,使每克珍珠具有與在該溶液中相同的濃度。隨后,10μl的20mmol檸檬酸滴至每塊珍珠巖顆粒。一套對照處理不加檸檬酸,另一套對照處理僅加10μl以80/20配比的乙醇和水,不加香草醛或檸檬酸。乙醇一經揮發,所有重復樣品接受10μl包含每毫升約5x106cfu的沙門氏菌懸液,每塊珍珠巖顆粒上的細菌載量約為5x104。

將每塊珍珠巖顆粒在微量離心管中于25℃溫育24小時,最終分散在1ml0.25強度的林格氏液中。從每份懸液中取6滴20μl的液滴置于XLD瓊脂培養基上,每滴約含1000個細菌細胞。

結果

結果見表3。

表3-香草醛和檸檬酸的組合對腸道沙門氏菌存活的影響(n=3)

結論

表3所示結果表明:

(1)檸檬酸非常輕微地增加香草醛的效果(最大2倍);以及

(2)脫氫松香酸對香草醛活性的影響并非由于pH效應。

實施例3香草醛與各種不同的三萜類化合物組合的抗微生物活性

實施例3的目的在于確定同樣也具有親水和疏水部分的三萜類化合物,是否具有和二萜類化合物脫氫松香酸相似的與香草醛相關的活性。

方法

用乙醇和水(80/20體積比)由20mmol的香草醛制備按10倍稀釋的系列,產生20mmol–0.02mmol的各種濃度。另制備20mmol的烏索酸、石竹素以及白樺脂醇的乙醇溶液。

為了確定烏索酸、石竹素以及白樺脂醇、脫氫松香酸對香草醛抗微生物效果的影響,10μl的每種香草醛稀釋溶液,連同10μl的20mmol的每種三萜類化合物,滴至三塊10mg的珍珠巖上,使每克珍珠巖具有與在該溶液中相同的濃度。一套對照處理不加三萜類化合物,另一套僅加20mmol脫氫松香酸。乙醇一經揮發,所有重復樣品接受10μl包含每毫升約5x106cfu的腸道沙門氏菌懸液,每塊珍珠巖顆粒上的細菌載量約為5x104。將每塊珍珠巖顆粒在微量離心管中于25℃溫育24小時,最終分散在1ml0.25強度的林格氏液中。從每份懸液中取6滴20μl的液滴置于XLD瓊脂培養基上,每滴約含1000個細菌細胞。

結果

結果見表4。

表4:香草醛與三種三萜類化合物(烏索酸(a)、石竹素(b)以及白樺脂醇(c))的組合物 對腸道沙門氏菌存活的影響(n=3)

(a)烏索酸

(b)石竹素

(c)白樺脂醇

結論

表4所示結果表明:

(1)所有測試的三萜類化合物均增強香草醛活性;

(2)所述三種三萜類化合物在增強抗微生物活性的效果方面沒有顯著區別,以及

(3)三萜類化合物與香草醛結合的協同效應比所觀察到的脫氫松香酸與香草醛組合使用的協同效應弱。最有可能的原因是三萜類化合物極難溶,即便近距離接觸時,也可能無法被微生物細胞吸取足夠的量以發揮顯著的效果。

實施例4來自不同樹種的加熱和不加熱木屑的抗微生物效果

實施例4的目的在于確定來自一系列有代表性的軟木種和硬木種的加熱和不加熱木屑的抗微生物效果。

方法

本實驗選取不同軟木(松樹、云杉、雪松)和不同硬木(山毛櫸、樺木、白蠟木、甜栗、紅橡木)的主干木料的木屑,每種木屑分置于六個爐中。其中三個爐于140℃加熱72小時,其他三個爐于20℃干燥,每種處理給出三個重復樣品。隨后,取自每種處理的1g木屑置于通用瓶中,每瓶接種1ml腸道沙門氏菌的乳濁液(每毫升約108cfu)。接種后的木屑于25℃溫育20小時,隨后,由所述木屑制備10倍稀釋的系列(未稀釋-10-8),取0.1ml的每種稀釋液置于XLD瓊脂培養基上鋪板。25℃溫育36小時后,對沙門氏菌菌落進行計數。

結果 結果見表5。

表5:選自軟木和硬木的加熱和不加熱的木屑上的腸道沙門氏菌的復壯(log?cfu/克木頭±SE) (n=3)。每個重復樣品接種約10 8 ?cfu的菌。

*不同的字母代表不同處理之間的顯著性差異。

結論

從表5所示數據可得出以下結論:

(1)不加熱的木屑其抗微生物性能有小的但顯著的差別。云杉、樺木和紅橡木抗微生物活性最差,因為其每種木材使得細菌菌落復壯數目最大。在加熱處理前,柏樹和桉樹的抗微生物活性最強,因為這兩種木材導致較少的細菌菌落生長;

(2)加熱導致所有被測木種的抗微生物活性顯著增強;

(3)加熱導致桉樹的抗微生物活性增強3倍,云杉的抗微生物活性增強1000倍,松樹、柏樹、白蠟木、山毛櫸、橡木和樺木均完全抑制菌落復壯;以及

(4)除了香草醛之外,松樹和雪松中必定還含有其他抗微生物物質。

實施例5毒性測試

本實施例的目的在于說明脫氫松香酸和香草醛(或任何其他來源于木材的抗微生物物質)的組合物被人食用時是安全的。

物質的潛在危害取決于其潛在毒性和其與靶細胞的接觸。因此,搞清潛在的毒性物質將其遞呈至人類細胞的潛在通路對確定潛在危害(風險)至關重要。如果能證實所述物質(或物質的毒性組合物)不可能與人類靶細胞接觸,則所述物質可認定為安全的。對于脫氫松香酸和香草醛(或任何其他天然抗微生物劑)而言,當涂覆了所述產品的食物被攝入時,有至少四種機制能防止其與人細胞接觸,即:

1)所述組合物的攝入將導致所述化合物被充分稀釋而無效;

2)消化系統的細胞由一層粘液保護,使消化系統的細胞免于接觸所述組合物;

3)一種(或兩種)化合物被消化系統失活。這可能是酶活性的結果;以及

4)所述化合物在胃液中的溶解性不足以對消化系統的細胞產生影響。

只有第4種可能性可在不使用喂食研究時進行測試。

方法

本實驗中,加熱和不加熱的松樹木屑用作測試材料。之前的研究表明,加熱的松樹木屑具有高度抗微生物活性。該效應據信至少部分歸因于脫氫松香酸對一些在輕微持久加熱期間所形成的溫和的抗微生物物質的協同效應(參見實施例1和3)。如果這些物質保持與松樹木屑結合而且不能用水提取,可以設想它們無法溶于消化系統,也不會導致任何的接觸。沙門氏菌用作測試微生物,因為已經證實,沙門氏菌細胞對松香酸和香草醛的組合物敏感(參見實施例1)。

水提取

按如下浸泡規定,通過添加5ml無菌水至2g木屑(三個重復樣品),使取自每組處理和未處理的松樹木屑的6g材料浸泡于水中:

·室溫浸泡24小時

·90℃水浴浸泡24小時

為了評估提取物是否具有抗微生物活性,進行如下步驟:

1、將1ml提取物傾倒于1g撕碎(高壓滅菌)的濾紙(12個樣品)上;

2、用0.25強度的林格氏液作為對照(3個樣品);

3、樣品于50℃干燥過夜(或直至干燥);

4、制備于0.25強度的林格氏液中的沙門氏菌乳懸液,每個樣品添加1ml該乳懸液;

5、30℃溫育過夜;

6、每個樣品經系列稀釋(10-1–10-6)后鋪板(15x6=90塊板);

7、溫育并清點計數板;以及

8、與對照和不加熱木屑的提取物比較抑制效果。

為了評估提取后的木屑的抗微生物活性,進行如下程序:

1、將提取后的木屑于50℃干燥過夜(或直至干燥);

2、用2g切碎的濾紙作為對照(3個樣品);

3、每2g木屑和每2g濾紙添加2ml沙門氏菌懸液;

4、30℃溫育24小時;

5、每個樣品經系列稀釋(10-1–10-6)后鋪板;

6、溫育并清點計數板;以及

7、與對照(濾紙)和不加熱木屑比較抑制效果。

醇提取

從處理和未處理的每批次中取6g材料,通過添加5ml甲醇至2g木屑(三個重復樣品),浸泡24小時:

為了評估提取物是否具有抗微生物活性,進行如下步驟:

1、將1ml提取物傾倒于1g撕碎(高壓滅菌)的濾紙(6個樣品);

2、用0.25強度的林格氏液作為對照(3個樣品);

3、將3個1g的樣品用甲醇浸泡(為保證醇類殘留不會抑制微生物生長);

4、樣品于50℃干燥過夜(或直至干燥);

5、制備0.25強度的林格氏液的沙門氏菌乳狀懸液,每個樣品中添加1ml該乳懸液;

6、30℃溫育過夜;

7、每個樣品經系列稀釋(10-1–10-6)后鋪板(12x6=72塊板);

8、溫育并清點計數板;以及

9、與對照和不加熱木屑比較抑制效果。

為了評估提取后的木屑的抗微生物活性,進行如下程序:

1、將提取后的木屑于50℃干燥過夜(或直至干燥);

2、用2g撕碎的濾紙作為對照(3個樣品);

3、每2g木屑和濾紙添加2ml沙門氏菌懸液;

4、30℃溫育24小時;

5、每個樣品經系列稀釋(10-1–10-6)后鋪板(9x6=54個板);

6、溫育并清點計數板;以及

7、與對照(濾紙)和不加熱木屑比較抑制效果。

結果

結果見表6和7。

表6-經加熱和不加熱的松樹木屑的提取物處理的濾紙上接種的沙門氏菌的復壯(log?cfu?g -1 ± SE)。提取物經在冷水(冷水提取)、90℃水(熱水提取)或甲醇(醇提取)中浸泡2g木屑而 獲得。對照未經處理,但加入與經處理的濾紙同樣數量的沙門氏菌(n=3)。

*不同的字母代表不同處理之間的顯著性差異。

表7-事先經提取過的加熱和不加熱松樹木屑上接種的沙門氏菌的復壯(log?cfu?g -1 ±SE),所述提 取為在冷水(冷水提取)、90℃水(熱水提取)或甲醇(醇類提取)中浸泡2g木屑。對照由 接受與松樹木屑同樣數量的沙門氏菌的濾紙組成(n=3)。

*不同的字母代表不同處理之間的顯著性差異。

結論

從表6和7中可得出以下結論:

(1)加熱的松樹木屑的冷水和熱水提取物對沙門氏菌均無毒效;

(2)經冷水或熱水提取后,松樹木屑仍保留對微生物毒效;

(3)加熱的松樹木屑的醇提取物對沙門氏菌有毒效;

(4)醇提取去除了部分與加熱松樹木屑相關的毒性;

(5)脫氫松香酸與加熱的松樹木屑中的其他抗微生物物質組合時,其在水中的可溶性不足以對細菌細胞造成顯著毒性;

(6)可以預料,經脫氫松香酸與諸如香草醛的天然抗微生物劑共同處理的食物被攝入后,不會造成顯著的與人類細胞的接觸。

實施例6本發明組合物的應用

發明人已將其驚人的發現,即當諸如香草醛的已知抗微生物劑與萜類化合物組合時,其抗微生物活性能顯著改善,用于各種不同的應用。

(1)動物墊料

他們制備了包含脫氫松香酸與香草醛的組合物的液體制劑,并將其噴灑至一些在禽舍中使用的現有類型的動物墊料。發明人發現,所述墊料受彎曲桿菌和沙門氏菌感染的程度降低,并且在所述墊料上飼養的雞未呈現任何細菌感染的跡象。

(2)覆蓋物

發明人還制造了一些覆蓋物,其已浸入包含脫氫松香酸與香草醛的液體制劑中保持過夜,以致足量的制劑被吸收。然后將所述覆蓋物覆蓋在一塊土地上,并進行測試以確認其能防止土壤滋生的病原體感染植物、水果或蔬菜。發明人興奮地發現,與使用普通覆蓋物的對照相比,所述經處理的覆蓋物使生長在該覆蓋物內的草莓免受微生物感染。

(3)醫療器械

發明人然后測試了能否賦予醫療器械表面以抗微生物活性,并用創傷敷料(即繃帶)作為模型,將繃帶浸入制劑,放置過夜,使其吸收活性劑量。他們發現,令其驚訝的是,所述繃帶防止了自繃帶下傷口散發出的微生物的擴散。

(4)紡織品或聚合物

所述制劑然后被用于棉花和羊毛,并用其制造衣著類商品。也可以制鞋,且發明人發現,各種情況下,微生物感染均被防止。當用于鞋類時,也使產生的異味減到最小。

(5)食品包裝材料

發明人還用所述液體制劑噴灑食品包裝產品,例如紙板模。易腐爛的食材例如水果和蔬菜儲存在包裝材料中,發明人發現,所述食品原料并不像儲存在傳統包裝材料中的對照食品一樣腐爛得那么快。

總結

發明人證實,具有極性、熱解的基團以及剛性疏水部分的分子能增加干擾微生物細胞膜的溫和抗微生物物質的抗微生物活性。萜類化合物,例如脫氫松香酸,能使抗微生物劑香草醛的抗微生物活性增強1000-2000倍。發明人還證實,脫氫松香酸難溶于水,因此,包含脫氫松香酸和香草醛的材料的水提取物對微生物細胞無毒性。相反,抗微生物活性保留在處理過的材料中。因此,攝入經諸如脫氫松香酸的萜類化合物與諸如香草醛的天然抗微生物劑共同處理的食物不會導致顯著的與人類細胞的接觸。

實施例7利用珍珠巖的生物檢測,分析純化的脫氫松香酸(DHAA)對市售香草醛抗腸炎沙 門氏菌的抗微生物效果的協同效應

如之前的實施例所述,使用脫氫松香酸和/或已從加熱木屑分離得到的香草醛獲得了重要的結果。用“珍珠巖生物檢測”取代傳統的液體培養基稀釋分析的實驗使香草醛(自加熱的木材分離)的抗微生物功效提高了2000倍。存在爭議的是,將所述組合物干燥于珍珠巖上,并基于珍珠巖重量計算濃度時,可能會使結果出現偏差。

因此,本實驗使用分離自歧化松香的純脫氫松香酸和購自Sigma-Aldrich的純香草醛,評估珍珠巖生物檢測是否使結果出現偏差。

制備儲液:用丙酮制備20mM的香草醛儲液,并進一步通過2倍系列稀釋,得到濃度范圍為20-0.078mM的系列稀釋液。并用丙酮制備20mM的脫氫松香酸儲液。

生物檢測:用含有10mg細珍珠巖的1.5ml微量離心管進行測試。10μl每種濃度的香草醛分別裝入4個微量離心管,每種濃度得到4個重復樣品。其中兩個管各添加10μl脫氫松香酸。將這些離心管置于層流柜3小時,使丙酮揮發。接下來,每管添加1μl過夜培養的腸炎沙門氏菌。溫育過程中為保持珍珠巖的濕潤,每管分別裝入10μl無菌反滲水。僅添加脫氫松香酸的兩個管和僅添加反滲水的兩個管作為對照。

管子溫育過夜,并將每管內含物于營養瓊脂上鋪板,通過細菌計數確定細菌存活量。

結果

表8-脫氫松香酸對香草醛抗腸炎沙門氏菌的抗微生物活性的影響(CFU/管)

脫氫松香酸:TMTC(多得難以計數)

反滲水對照:TMTC

結論

本實驗中,脫氫松香酸使香草醛增效約8倍。因此,珍珠巖生物監測明確提供了關于抗微生物劑活性的有效結果,并證實了用于測試的兩種純化合物之間的協同效應。發明人還認為,當化合物分離自加熱的木屑時,可能存在某些能進一步有助于脫氫松香酸和香草醛的協同活性的未知因子。

實施例8確定脫氫姜油酮和松柏醛與香草醛和脫氫松香酸混合物組合時,抗腸炎沙門氏菌的 最低抑菌濃度(MICs)

之前提到,純脫氫松香酸和純香草醛的組合在二者之間產生了抗微生物協同作用(即8倍),盡管不及香草醛和分離自加熱的松樹木屑的脫氫松香酸組合的協同程度(即2000倍)。如果僅其中一種成分來自加熱的松木,而另一種成分為市售的純品形式,也能獲得相似強度的抗微生物功效。有趣的是,由此方式獲得的抗微生物功效導致混合物為橙色,表明某未知的橙黃色污染物可能與增強香草醛和脫氫松香酸的協同效應相關。松柏醛被認為是可能的候選分子,其之前分離自加熱的松樹木屑。

相似的是,如果香草醛不是立即使用,而是儲存在丙酮中,脫氫松香酸與香草醛組合的抗微生物功效大大恢復。眾所周知,香草醛與丙酮反應形成酮,即脫氫姜油酮。因此據猜測,脫氫姜油酮也可能參與脫氫松香酸與香草醛產生的抗微生物功效。

材料與方法:

純香草醛獲自Sigma-Aldrich。脫氫姜油酮通過將香草醛與丙酮縮合制得。純脫氫松香酸分離自歧化松香。

制備20mM的香草醛儲液,用于制備不同的終濃度的溶液。0.1,1,5,10mM的脫氫姜油酮和20mM的脫氫松香酸儲液通過將所述化合物溶于丙酮制得。儲液儲存于5℃的冰箱中。

體外生物檢測:香草醛與潛在協同分子組合的最低抑菌濃度(MIC)通過微量肉湯稀釋法確定。使用96孔微量滴定板,以無菌營養肉湯稀釋而制得8個2倍稀釋的香草醛系列,從而獲得20mM到0.078mM的香草醛的2倍稀釋系列。制備4個不同濃度(10mM,5mM,1mM以及0.1mM)的脫氫姜油酮(DHZ),并通過添加100μl的每種儲液至各孔,與不同濃度的香草醛混合。在一個分開的實驗中,脫氫姜酮被松柏醛替代。對照孔加入100μl丙酮。每種處理重復4次。所述微量滴定板置于層流柜中8小時,使丙酮揮發。為了確定各孔的抗微生物活性,微量滴定板接種5μl于25℃過夜培養、包含108cfu/ml腸炎沙門氏菌的細菌細胞培養液。接種后,所述微量滴定板于25℃溫育24小時。為了確定所述處理是否具有殺菌性,從每孔各取0.01ml點在營養瓊脂上。接種后的營養瓊脂板溫育24-48小時,沒有細菌滋生或僅有少數菌落的點被標記為“殺菌的”。為了確定抑菌的效果,在各孔中添加四唑鹽溶液以確定代謝活性。25℃溫育過夜后顏色不變的定義為抑菌的效果,而進行代謝的(無效)顯示為紅色至紫色。

結果

表9-不同濃度的松柏醛和香草醛組合對腸炎沙門氏菌生長的影響。除對照(-DHAA)外,所 有處理均包含20mM脫氫松香酸。(n=4)

BS:抑菌;BC:殺菌;G:生長

表10-不同濃度的脫氫姜油酮和香草醛組合對腸炎沙門氏菌生長的影響。除對照(-DHAA) 外,所有處理均包含20mM脫氫松香酸。(n=4)

BS:抑菌;BC:殺菌;G:生長

結論

松柏醛是與香草醛和脫氫松香酸組合的有效的抗微生物劑,顯示出對腸炎沙門氏菌強的抗微生物功效。脫氫姜油酮是溫和的抗微生物劑,其與香草醛和脫氫松香酸組合,顯示出對腸炎沙門氏菌強的抗微生物功效。上述結果表明,香草醛和脫氫姜油酮的濃度相加大于5mM(與脫氫松香酸組合)是抑菌所需的。

實施例9脫氫松香酸在松柏醛和香草醛的抗微生物活性中的作用

在之前的實驗中,脫氫松香酸添加至香草醛和松柏醛的組合物中。為了確定脫氫松香酸是否必需,設計單獨的實驗以量化其在上述三種物質的抗微生物功效中的作用。

材料與方法

香草醛和松柏醛獲自Sigma-Aldrich。利用柱層析法由歧化松香分離出脫氫松香酸。

用去離子水制備20mM香草醛儲液。用丙酮制備5mM和10mM松柏醛以及20mM脫氫松香酸儲液。所有儲液均儲存于5℃。

體外生物檢測:不同處理的最低抑菌濃度通過微量肉湯稀釋法確定。使用96孔微量滴定板,以無菌水稀釋20mM儲液制得4倍稀釋的香草醛系列,獲得濃度介于20mM到0.0002mM之間的香草醛。制備5mM和10mM的2個濃度的松柏醛,并通過添加100μl每種儲液至每個孔,與不同濃度的香草醛混合。對照孔添加100μl丙酮。一半的孔添加脫氫松香酸至終濃度為20mM,另一半的孔不加。每種處理重復4次。所述微量滴定板置于層流柜中8小時,使溶劑揮發。隨后,每孔接種5μl于25℃過夜培養、包含108cfu/ml腸炎沙門氏菌的懸液。接種后,所述微量滴定板于25℃溫育24小時。為了確定所述處理是否具有殺菌性,從每孔各取0.01ml點在營養瓊脂上,將所述瓊脂板溫育24-48小時,沒有細菌滋生或僅有少數菌落的點被標記為“殺菌的”。如果可能,對菌落進行計數以獲得更準確的定量數據。為了確定抑菌的效果,在每個孔中添加50μl四唑鹽溶液以確定代謝活性。25℃溫育過夜后顏色不變的定義為抑菌的效果,而進行代謝的(無效)顯示為紅色至紫色。

結果

表11-有和無20mM脫氫松香酸(DHAA)時,香草醛與松柏醛(CFA)組合的抗微生物功效。 針對腸炎沙門氏菌檢測處理的效果。(n=4)

BS:抑菌;BC:殺菌;G:生長

表12-由菌落計數得到的5mM松柏醛與濃度為20-0.00029mM的香草醛的組合(下面的4個單 元格)以及與香草醛/脫氫松香酸的組合(上面的4個單元格)的96孔的板圖

結論

脫氫松香酸對松柏醛和香草醛組合的活性呈現協同效應。低濃度(至少0.0003mM)香草醛的存在是5mM松柏醛具有殺菌效果所需的(如果含有20mM脫氫松香酸)。

實施例10脫氫姜油酮對香草醛和脫氫松香酸(DHAA)混合物抗腸炎沙門氏菌效果的影響 之前推測,脫氫姜油酮(由香草醛形成)可能是加熱的木屑抗微生物活性的決定因子。在香草醛和脫氫姜油酮二者與脫氫松香酸組合使用的實驗中,暗示上述兩分子的抗微生物活性是加和性的。在此,發明人研究了是否確實如此,或是否存在取決于上述兩分子比率的協同效應。

材料與方法

香草醛獲自Sigma-Aldrich。脫氫姜油酮由香草醛與丙酮縮合制備如下:0.5g香草醛添加至2ml丙酮中,于螺旋蓋瓶中搖動溶解香草醛。香草醛溶解后,添加1ml10%(w/v)NaOH溶液。混合物于室溫儲存24小時。隨后,添加10ml3M的HCL,混合物經劇烈搖動,形成黃色的脫氫姜油酮晶體。通過布氏漏斗過濾上述獲得的脫氫姜油酮懸液,接著用水沖洗所述晶體,從而分離獲得純化的脫氫姜油酮。經空氣干燥后,用NMR對分離得到的脫氫姜油酮進行結構確認。

制備香草醛-脫氫姜油酮溶液

用5ml丙酮制備包含比例為100:0,75:25,50:50,25:75,0:100(w/w)的香草醛和脫氫姜油酮的丙酮溶液。未稀釋的脫氫姜油酮和香草醛相加濃度為10mM。抗微生物測試前,在每種比例溶液中添加30.4mg脫氫松香酸,使得每種處理中脫氫松香酸濃度為20mM。對照處理僅由脫氫松香酸和溶劑組成。儲液于5℃冰箱中儲存48小時。

分析方法

香草醛和脫氫姜油酮組合溶液的抑菌活性通過微量肉湯稀釋法確定。以9.6mL營養肉湯充滿96孔板。為了確定樣品的MIC(最低抑菌濃度),用所述肉湯制備幾個稀釋濃度(0,1:2,1:4,1:8,1:16,1:32,1:64,1:128)的樣品。做好系列稀釋后,將板置于層流柜中5小時,使溶劑揮發。

隨后,每孔接種5μl于25℃過夜培養的、包含108cfu/ml腸炎沙門氏菌的懸液。接種后,所述板于25℃溫育24小時。為了確定所述處理是否具有殺菌性,從每孔各取0.01ml點在營養瓊脂上,將所述瓊脂板溫育24-48小時,沒有細菌滋生或僅有少數菌落的點被標記為“殺菌的”。如果可能,對菌落進行計數以獲得更準確的定量數據。為了確定抑菌的效果,在每孔中添加50μl四唑鹽溶液以確定代謝活性。25℃溫育過夜后顏色不變的定義為抑菌的效果,而進行代謝的(無效)顯示為紅色至紫色。

表13-20mM脫氫松香酸(DHAA)存在時,香草醛與脫氫姜油酮組合的抗微生物功效。針對 腸炎沙門氏菌檢測處理的效果。(n=4)

BS:抑菌;BC:殺菌;G:生長

結論

脫氫姜油酮與香草醛的組合效應并非加和性,而是取決于兩種分子之間的比例。當任一分子與另一分子處于1:3的比例時,效果最佳。脫氫姜油酮與香草醛自身具有相似的抗微生物活性,但當以1:3的比例組合時,達到比單獨使用或以50:50的比例大4到8倍的出人意料的效果。

實施例11pH值對脫氫松香酸溶解性的影響,以及儲液的儲存條件對香草醛和脫氫松香酸 組合物抗腸炎沙門氏菌抗微生物的活性的影響

之前提到,脫氫松香酸和香草醛在高pH值(>9)的組合使所述組合效果變差。據猜測,這可能歸因于脫氫松香酸在堿性條件下的低溶解性(導致脫氫松香酸不再溶解)。迄今為止所述的大多數實驗都是在pH值為7時進行,其產生良好的活性,但不如直接由加熱木屑的提取的提取物效果好。加熱木屑的pH值約為4,然而,如此低的pH值可能影響細菌生長,細菌通常更喜歡中性pH值。為了在檢測pH的影響時確保脫氫松香酸是溶解的,使用了兩種溶解所述化合物的方法。在一種方法中,將所述化合物溶于pH值為4的磷酸緩沖液,在另一種方法中,使用pH值為7的DMSO。

對如下處理方式進行檢測:

·香草醛儲液,實驗開始前48小時制備;溶液保存于5℃的冰箱;

·脫氫松香酸(DHAA)儲液,實驗開始前48小時制備;溶液保存于5℃的冰箱;

·香草醛/脫氫松香酸組合物儲液,實驗開始前48小時制備;溶液保存于5℃的冰箱;

·香草醛儲液,實驗開始前48小時制備并于室溫(20℃)保存;

·脫氫松香酸儲液,實驗開始前48小時制備并于室溫(20℃)保存;以及

·香草醛/脫氫松香酸組合物儲液,實驗開始前48小時制備并于室溫(20℃)保存。

材料與方法

香草醛獲自Sigma-Aldrich,脫氫松香酸分離自歧化松香。

在緩沖液配制的pH值為4的肉湯中檢測的儲液:以丙酮制備兩批20mM的香草醛儲液和兩批香草醛/脫氫松香酸(10mM/20mM)儲液。每種儲液中的一批于冰箱中保存,另一批于室溫保存。

在緩沖液配制的pH值為7的肉湯中檢測的儲液:以DMSO制備兩批20mM的香草醛儲液和兩批香草醛/脫氫松香酸(10mM/20mM)儲液。每種儲液中的一批于冰箱中保存,另一批于室溫保存。

生物檢測:通過微量肉湯稀釋法進行檢測。香草醛和香草醛/脫氫松香酸儲液經2倍系列稀釋,進一步稀釋至濃度介于10mM和0.625mM之間。100μL每種濃度的溶液添加至含有100μL營養肉湯的96孔板的每個孔中。每種濃度設3個重復樣品。所述微量滴定板置于層流柜中使溶劑揮發。

隨后,每個孔接種5μl于25℃過夜培養的、包含108cfu/ml腸炎沙門氏菌的懸液。接種后,所述微量滴定板于25℃溫育24小時。為了確定所述處理是否具有殺菌性,從每孔各取0.01ml點在營養瓊脂上,將所述瓊脂板溫育24-48小時,沒有細菌滋生或僅有少數菌落的點被標記為“殺菌的”。如果可能,對菌落進行計數以獲得更準確的定量數據。為了確定抑菌效果,在每個孔中添加50μl四唑鹽溶液以確定代謝活性。25℃溫育過夜后顏色不變的定義為抑菌效果,而進行代謝的(無效)顯示為紅色至紫色。

表14-pH值,以及香草醛和脫氫松香酸可能的相互作用對腸炎沙門氏菌生長的影響。脫氫松香 酸在實驗開始添加(單獨)或在實驗開始前先與香草醛作用48小時后添加(組合)(n=3)

BC:殺菌;BS:抑菌;G:生長

結論脫氫松香酸在pH值為4和7時均增強香草醛的抗微生物活性(pH值本身對沙門氏菌的生存影響甚微)。使脫氫松香酸與香草醛相互作用48小時增強了這兩種分子的抗微生物活性。

實施例12脫氫松香酸與松柏醛、百里香酚和1,2-二苯乙烯的協同效應

在之前的實驗中,抗微生物化合物連同香草醛一起檢測使得很難確定脫氫松香酸只是增強香草醛的活性,或者還增強其他天然抗微生物分子,例如百里香酚、松柏醛和1,2-二苯乙烯的活性。在第一個測試中,對這些化合物進行了抗革蘭氏陰性菌腸炎沙門氏菌的測試,在第二個測試中,對同樣的化合物進行了抗革蘭氏陽性菌金黃色葡萄球菌的測試。

材料與方法

百里香酚、反式-1,2-二苯乙烯和松柏醛獲自Sigma-Aldrich,脫氫松香酸分離自歧化松香。

生物檢測:通過微量肉湯稀釋法進行檢測。脫氫松香酸(20mM)或者與松柏醛、百里香酚組合或者與(反式)1,2-二苯乙烯組合,于25℃溫育48小時。對照溶液由不含脫氫松香酸的松柏醛、百里香酚和二苯乙烯組成。另制備僅含丙酮的溶劑對照。為了進行測試,溶液按2倍稀釋系列進行稀釋,制備濃度介于10-0.156mM之間的活性成分。每種濃度以脫氫松香酸修正,使得脫氫松香酸終濃度為20mM。100μL每種濃度的溶液添加至含有100μL營養肉湯的96孔板的每個孔。每種濃度設3個重復樣品。所述96孔板置于層流柜中使溶劑揮發。

隨后,每個孔接種5μl于25℃過夜培養的、包含108cfu/ml腸炎沙門氏菌的懸液。在第二個測試中使用金黃色葡萄球菌。接種后,所述96孔板于25℃溫育24小時。為了確定所述處理是否具有殺菌性,從每孔各取0.01ml點在營養瓊脂上,將所述瓊脂板溫育24-48小時,沒有細菌滋生或僅有少數菌落的點被標記為“殺菌的”。如果可能,對菌落進行計數以獲得更準確的定量數據。為了確定抑菌的效果,在每個孔中添加50μl四唑鹽溶液以確定代謝活性。25℃溫育過夜后顏色不變的定義為抑菌效果,而進行代謝的(無效)顯示為紅色至紫色。

結果

表15-脫氫松香酸對松柏醛、百里香酚或1,2-二苯乙烯抗腸炎沙門氏菌的協同效應。含有脫氫 松香酸的處理包含20mM脫氫松香酸。(n=3)

BC:殺菌,BS:抑菌,G:生長

結果

脫氫松香酸對松柏醛有強烈的協同活性,使松柏醛抗腸炎沙門氏菌的效力提高約16倍。脫氫松香酸使百里香酚抗腸炎沙門氏菌的效力約為原來的兩倍。

實施例13脫氫松香酸與香草醛組合物抗多種不同的微生物的抗微生物活性

利用在薄層層析(TLC)紙上的抑菌圈實驗,發明人檢測了多種不同的化合物對微生物(革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌、絲狀真菌以及酵母)的抗微生物活性。

材料與方法

準備兩種測試溶液,即:(1)香草醛與脫氫松香酸組合,以及(2)1,2-二苯乙烯與脫氫松香酸組合。針對幾種不同的微生物檢測所述溶液的活性如下。

將一滴測試溶液置于薄層層析板上。使溶劑揮發,將測試微生物的肉湯懸液(革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌)均勻地涂于薄層層析板上。所述板溫育過夜。為了顯示微生物活性,向薄層層析板噴灑四唑鹽溶液。微生物活性以紅色至紫色顯示。

為了證實所述溶液抗絲狀真菌的效力,接種后的薄層層析板溫育至真菌開始生成孢子。為了證實抗酵母的效力,溫育后,將薄層層析板在營養瓊脂板上按壓,所述瓊脂板溫育直至酵母菌落清楚可見。

結果

圖1-8顯示了所述測試溶液對受測微生物生長的影響。

參見圖1,顯示了香草醛和脫氫松香酸組合物對金黃色葡萄球菌的活性。與對照中細菌生長旺盛相比,使用上述測試溶液的板上抑菌圈清晰可見。圖2顯示了1,2-二苯乙烯與脫氫松香酸組合物與1,2-二本乙烯自身,以及對照相比,其抗金黃色葡萄球菌的抗微生物活性明顯地更強。圖3顯示了香草醛和脫氫松香酸組合物具有抗腸炎沙門菌的抗微生物活性,而這兩種化合物獨自均無效。圖4顯示了香草醛和脫氫松香酸組合物具有抗鼠傷寒沙門菌的抗微生物活性。

圖5顯示了香草醛和脫氫松香酸組合物具有抗大腸桿菌的抗微生物活性。圖6顯示了香草醛和脫氫松香酸組合物具有抗絲狀真菌青霉屬的抗微生物活性。圖7顯示了香草醛和脫氫松香酸組合物具有抗曲霉屬的抗微生物活性。最后,圖8顯示了香草醛和脫氫松香酸組合物具有抗釀酒酵母的抗微生物活性。香草醛獨自在5mM有效,但與脫氫松香酸組合時,僅0.078mM的香草醛便有效。

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