• / 10
  • 下載費用:30 金幣  

水稻基腐病菌抗生素ZEAMINES在植物病害防治中的應用.pdf

關 鍵 詞:
水稻 病菌 抗生素 ZEAMINES 植物病害 防治 中的 應用
  專利查詢網所有資源均是用戶自行上傳分享,僅供網友學習交流,未經上傳用戶書面授權,請勿作他用。
摘要
申請專利號:

CN201410487673.4

申請日:

20140922

公開號:

CN104322563A

公開日:

20150204

當前法律狀態:

有效性:

有效

法律詳情:
IPC分類號: A01N63/02,A01P3/00 主分類號: A01N63/02,A01P3/00
申請人: 華南農業大學
發明人: 張煉輝,廖立勝,陳少華,賀飛,周佳暖,王惠杉
地址: 510642 廣東省廣州市天河區五山路483號
優先權: CN201410487673A
專利代理機構: 廣州粵高專利商標代理有限公司 代理人: 林麗明
PDF完整版下載: PDF下載
法律狀態
申請(專利)號:

CN201410487673.4

授權公告號:

法律狀態公告日:

法律狀態類型:

摘要

本發明公開了水稻基腐病菌Dickeyazeae產生的抗生素物質zeamines的新用途,具體為用于防治真菌性植物病害。通過室內生物測定和盆栽試驗,本發明發現水稻基腐病菌Dickeyazeae產生的抗生素zeamines對霜疫霉屬(PeronophythoraChen)、炭疽菌屬(ColletotrichumCorda)、梨孢屬(Pyricularia)、葡萄孢屬(Botrytissp.)、絲核菌屬(Rhizoctonia)、鐮胞菌屬(Fusarium)等屬的常見植物病害具有良好的防治作用。本發明對zeamines用于防治植物病害的新用途提出了新的思路,為微生物代替化學合成殺菌劑提供了新的開發資源,對解決植物病原菌對藥劑日益突出的抗性問題具有重要的意義。

權利要求書

1.水稻基腐病菌產生的抗生素zeamines?在防治真菌性植物病害方面的應用。2.根據權利要求1所述的應用,其特征在于,所述zeamines是從水稻基腐病病原菌的培養發酵液中分離提取的抑菌活性成分。3.根據權利要求1或2所述的應用,其特征在于,所述zeamines的制備方法是先將培養發酵、離心收集發酵液,提取得到抑菌活性提取物;提取物經分離、提純和結構鑒定得到zeamines。4.根據權利要求1所述的應用,其特征在于,所述真菌性植物病害包括霜疫霉屬、炭疽菌屬、梨孢屬、葡萄孢屬、絲核菌屬、鐮胞菌屬植物病害。5.根據權利要求1所述的應用,其特征在于,所述zeamines以8?μg/mL濃度應用于防治荔枝霜疫霉病。

說明書

技術領域

本發明涉及生物防治技術領域,具體涉及水稻基腐病菌抗生素zeamines在植物病害防治中的應用,特別是水稻基腐病菌抗生素zeamines作為殺真菌劑在植物病害方面的應用。

背景技術

生物防治這一門科學的產生是從利用天敵防治有害生物開始。19世紀80年代,美國加州從澳大利亞引進澳洲瓢蟲控制吹綿蚧取得了極大的成功,轟動國際昆蟲學領域,傳統生物防治科學的新紀元由此誕生。經過100多年來的發展,生物防治已在理論上和方法上成為具有較完整的基礎理論體系和方法學的學科。1987年,美國國家科學院將生物防治的定義擴大為:利用自然的或經過改造的生物、基因或基因產物來減少有害生物的作用,使其有利于有益生物如作物、樹木、動物和益蟲及微生物。

?近年來,伴隨著生物學、植物病理學等學科的快速發展,農藥中殺菌劑的研究已進入了一個新興的時代。高毒、高殘留、高抗藥性的化學農藥逐漸淡出歷史舞臺,取而代之的是更安全、低殘留、低抗藥性的生物源農藥。生物農藥(?Biopesticides?)?是利用生物活體或者其代謝產物對有害生物進行防治的一類制劑,?是生物防治的物質基礎和重要手段。微生物農藥是生物源農藥的重要代表,具有開發利用途徑多,不易產生抗性等特點。例如我國20世紀70年代研究生產的井岡霉素,具有高效、長效、安全、價廉等特點,幾十年來一直是控制水稻紋枯病的首選農藥品種。此外還具有下列優點:種類繁多,研發的選擇余地大;對環境安全,無公害,無殘留;專一性強,活性高,生產成本低,發酵工藝簡單;對非靶標生物安全。其中,細菌類生物農藥劑的研究趨于活躍,主要用于防治植物土傳病害,在全國的應用面積已超過億畝。細菌類?100多種生物農藥中蘇云金桿菌(Bacillus?thuringiersis,?B.t.?)是目前世界上用途最廣,應用最成功的生物殺蟲劑,占生防制劑總量90%以上。細菌中還有許多含抗菌物質。如在芽孢桿菌產生的抗菌肽中,多數抗細菌,少數抗真菌。Wakayama等從蠟狀芽孢桿菌(?B.?cereus?)中純化出一種抗真菌環狀多肽Mycocerin,其抑菌譜廣,活力強,能同時對絲狀真菌和酵母起作用,且耐熱性和穩定性好。近年來多肽類抗生素的研究日益受到重視,研究的進一步發展可通過基因定點突變技術對其分子結構進行修飾,以提高其活性。

水稻基腐病菌(Dickeya?Zeae)菌體單生,短桿狀,兩端鈍圓,大小為0.7?μm×1.4-1.75?μm,周生多根鞭毛。革蘭氏染色反應呈陰性,不形成芽胞和莢膜。劉瓊光等(2008,2009)發現D.?zeae能產生抗生素,相反,侵染雙子葉植物的D.?chrysanthemi則不產生抑制水稻種子發芽的抗生素。進一步突變實驗結果表明,D.?zeae產生的抗生素對抑制水稻種子發芽至關重要,并引起水稻秧苗致萎;而侵染雙子葉植物的D.?chrysanthemi則不產生抑制水稻種子發芽的抗生素。這些初步實驗結果表明,D.?zeae的致病機理和D.?chrysanthemi不同,抗生素是D.?zeae侵染單子葉植物的重要致病因子。近期研究表明水稻基腐病菌代謝產生的抗生素zeamines對多種革蘭氏陰性和革蘭氏陽性菌,包括多種植物病原細菌和動物病原細菌都有高強度的抑制作用(Wu等,2010)。實驗表明Zeamines抗生素是一種非常有潛力、有價值的新型抗生素藥物,需要深入的研究與開發。

????關于zeamines的殺真菌活性還未見報道。應用zeamines在植物病害的防治也還未見報道,尤其是對農業產品采后病害的防治方面更未見報道。

?研究zeamines對植物病真菌的抑菌活性,將zeamines應用到植物病害的防治上,對解決病原物對藥劑日益突出的抗性問題具有重要的意義。而具體研究zeamines在農業果實產品采后病害的防治應用,具有巨大的經濟效益前景。目前還沒有見到相關報道。

發明內容

本發明的目的在于提供zeamines的一個新用途。

???本發明的目的通過以下技術方案來予以實現:

提供zeamine?在防治真菌性植物病害方面的應用。

所述的zeamines是從水稻基腐病菌Dickeya?zeae?發酵培養液中提取物中的活性成分。

所述zeamines的制備方法是通過離心收集水稻基腐病菌D.?zeae發酵培養液上清,利用5M的NaOH將發酵液的pH值上調成10,再利用旋轉蒸發儀將pH為10的發酵液上清濃縮為原體積的1/10。利用三倍體積的有機溶劑(正丁醇:乙酸乙酯=2:1)萃取二次。再使用蒸發儀將有機溶劑蒸干后,使用乙醇將其溶解,過凝膠柱吸附,使用甲醇洗脫。將含有抑菌活性的甲醇溶液蒸干濃縮之后,在利用高效液相色譜(HPLC)進一步純化、分析、收集活性物質。結構鑒定確認活性成分為zeamines。

?將zeamines配置成一定濃度的供試藥液,采用菌絲生長速率法、孢子囊萌發法、離體組織(葉片、果實等)對霜疫霉屬(Peronophythora?Chen)、炭疽菌屬(Colletotrichum?Corda)、梨孢屬(Pyricularia)、葡萄孢屬(Botrytis?sp.)、絲核菌屬(Rhizoctonia)、鐮胞菌屬(Fusarium)等屬的常見植物病害進行了室內毒力測定并進行了溫室盆栽試驗。試驗結果表明,zeamines對供試病原菌具有良好的抑菌效果,可以開發其在防治植物病害中的新用途。

?作為一個優選方案,本發明提供了所述zeamines以8?μg/mL濃度應用于防治荔枝霜疫霉病。

本發明的有益效果是:

本發明突破以往zeamines只是對一些細菌的抑制效果的簡單測試,對zeamines的應用提出了新思路,并確定了水稻基腐病菌發酵液提取活性成分zeamines用于防治真菌性植物病害的技術方案。為微生物源代替化學合成殺菌劑提供了新的開發資源,對解決病原菌對藥劑日益突出的抗性問題具有重要的意義。

附圖說明

????圖1為zeamines對荔枝霜疫霉屬(Peronophythoralichi)病菌菌絲的抑制作用;其中圖A表示為培養基中加入10%甲醇對照;圖B表示為培養基含有終濃度為0.5μg/mL?的zeamines;圖C表示為培養基含有終濃度為1μg/mL?的zeamines;圖D表示為培養基含有終濃度為2μg/mL?的zeamines;圖E表示為培養基含有終濃度為4μg/mL?的zeamines;圖F表示為培養基含有終濃度為8μg/mL?的zeamines。

圖2為zeamines對荔枝霜疫霉屬(Peronophythoralichi)病菌孢子囊的抑制作用;其中,圖A表示為培養基中加入10%甲醇對照;圖B表示為培養基含有終濃度為0.5μg/mL?的zeamines;圖C表示為培養基含有終濃度為1μg/mL?的zeamines;圖D表示為培養基含有終濃度為2μg/mL?的zeamines;圖E表示為培養基含有終濃度為4μg/mL?的zeamines;圖F表示為培養基含有終濃度為8μg/mL?的zeamines。

????圖3為zeamines對香蕉枯萎病的盆栽防治效果;A表示沒有用zeamines處理植株,并接種病菌;B表示表示用10μg/mL?的zeamines處理植株,并接種病菌;C表示表示用20μg/mL?的zeamines處理植株,并接種病菌;D表示表示用10μg/mL?的zeamines處理植株,并接種病菌;E表示表示用40μg/mL?的zeamines處理植株,并接種病菌。

具體實施方式

????下面結合說明書附圖和具體實施例來進一步詳細說明本發明,但實施例并不能限定本發明的保護范圍。

實施例1??zeamines的制備

????將OD600=1.0的D.?zeae種子液接入產毒培養基(LS培養基),25oC、180rpm培養36個小時后,通過離心收集水稻基腐病菌D.?zeae發酵培養液上清。所得發酵液用2L錐形瓶密封遮光保存待下一步提取用。

本發明采用的是常規的化合物分離提取的方法對發酵液中抑菌活性物質的分離與提取。利用5M的NaOH將發酵液的pH值上調成10,再利用旋轉蒸發儀將pH為10的發酵液上清濃縮為原體積的1/10。利用三倍體積的有機溶劑(正丁醇:乙酸乙酯=2:1)萃取二次。再使用蒸發儀將有機溶劑蒸干后,使用乙醇將其溶解,過凝膠柱吸附,使用甲醇洗脫。將含有抑菌活性的甲醇溶液蒸干濃縮之后,在利用高效液相色譜(HPLC)進一步純化、分析、收集活性物質。結構鑒定確認活性成分為zeamines。

實施例2??zeamines對霜疫霉屬(Peronophythora?Chen)病菌的抑制作用。

用10%的甲醇作為溶劑溶解提取物,然后再與CDA(胡蘿卜培養基)培養基配置成帶zeamines培養基,以菌絲生長速率法測定不同濃度提取物對荔枝霜疫霉菌絲生長的抑制作用。具體操作是:

采用菌絲生長速率法:用10%甲醇作為溶劑將zeamines配置成一定濃度的供試藥劑,準確加入一定量的zeamines溶液到50oC融化的CDA培養基中,使培養基中zeamines的終濃度分別為0.5μg/mL、1μg/mL、2μg/mL、4μg/mL、8μg/mL,每個濃度倒3重復的培養平板。以相同體積的10%甲醇作為對照。供試病菌荔枝霜疫霉菌在直徑為9cm的培養基平板上培養5天后,在菌落邊緣菌絲生長旺盛處用滅菌的4mm的打孔器鉆取菌餅,分別接種于每個培養皿的中央,有菌絲的一面向上。25oC培養箱數天后,觀察并記錄實驗結果。實驗結果見圖1,圖1結果表明,zeamines對荔枝霜疫霉病菌菌絲生長的抑制效果明顯高于對照組,在2μg/mL;4μg/mL;8μg/mL的zeamines濃度下抑制率達到99.2%、99.7%、100%,顯示出很強的抑菌作用。

實施例3:zeamines對霜疫霉屬(Peronophythora?Chen)病菌的抑制作用。

采用載玻片測定(方中達,1998),將在CDA培養基上培養6天的荔枝霜疫霉菌用無菌水洗下孢子囊,配置孢子囊溶液,調整孢子囊濃度為每個視野(10×10倍)約40~60個孢子囊。向孢子囊懸浮液中加不同量的zeamines溶液,是其終濃度分別為0.5μg/mL、1μg/mL、2μg/mL、4μg/mL、8μg/mL。取50μL孢子懸浮液滴在凹玻片上,再將凹玻片置于已放一張濾紙的9cm培養皿內,并在濾紙上滴加少量無菌水以保濕,蓋上培養皿,置于28oC黑暗培養6個小時后,在光學顯微鏡下觀察孢子囊萌發情況。實驗結果如圖2所示,實驗結果表明:處理6個小時,光學顯微鏡下觀察,隨著處理濃度的升高,孢子囊萌發率相應降低,抑制率依次為98.7%、86.4%、67.9%、7.5%、2.3%、0%,顯示出很強的抑菌作用。

實施例4:Zeamines對鐮胞菌屬(Fusarium)病菌的溫室盆栽試驗

香蕉枯萎病菌(Fusarium?oxysporium)孢子懸浮液的制備:將在PDA培養基上培養7天后,用4mm的打孔器鉆取菌餅,將帶病原菌菌絲的菌餅接入YPD培養基中,在28℃恒溫箱中培養15d,用無菌水配成1×106?CFU/mL孢子懸浮液。

盆栽試驗在塑料大棚中進行。每個塑料盆缽裝滿(塘泥和基質土)混合營養土1kg。當香蕉組培苗長出?4~5片真葉時,先取出營養缽中的組培苗,用針刺傷根尖,再將根浸沒于1×106CFU/mL的孢子懸浮液中,30min后移栽于盆缽中。并將剩余的病原菌孢子懸浮液澆入栽有香蕉幼苗的土壤中,接種后置于室溫、自然光照條件下培養,常規的水肥管理。

接種病原菌10d后的香蕉苗分別灌注三個(40μg/mL、20μg/mL、10μg/mL)濃度的供試藥劑,蒸餾水作為對照,每株灌注藥劑100mL,每個處理3個重復,每個重復5株。施藥后45天,對照組的香蕉苗出現枯死或假莖開裂,調查蕉苗病情指數。病情分級標準:?

1級:(0)假莖基部無褐色;

2級:(+)假莖基部變褐程度只有針鼻兒大小;

3級:(++)假莖基部變褐程度小于假莖直徑的1/2;

4級:(+++)假莖基部變褐程度大于1/2;

發病率(%)=發病蕉苗數/總接種蕉苗×100%

實驗結果見表1、圖3所示:

表1?zeamines對香蕉枯萎病的盆栽防治效果

濃度(μg/mL) 病情指數(%) 發病率(%) 對照(不含zeamines接病菌) 52.4 87.34 10 25.1 65.51 20 27.3 35.12 40 7.3 9.29 對照(不含zeamines不接病菌) 3.1 7.53

實驗結果表明:zeamines對香蕉枯萎病有較好的防治效果,防治效果隨著濃度的升高而提高。供試濃度為10μg/mL、20μg/mL、40μg/mL,處理45天香蕉苗的發病率65.51%、35.12%、9.29%。

實施例5:Zeamines對6種病原菌的最低抑菌濃度的測定

采用固體瓊脂稀釋法測量zeamines對6種真菌的最低抑菌濃度。根據Lass-Florl的方法將zeamines的甲醇溶液10倍依次稀釋,并添加到CDA或PDA培養基中。將6種不同的病原真菌分別在CDA或PDA培養基上培養6天,取菌落邊緣菌絲生長旺盛的菌餅,并接種于含有不同濃度zeamines?的LB培養基平板上,每個濃度3個重復,25oC培養10天,觀察并測量結果。結果如表2?所示:

表2?zeamines?對6種病原真菌的最低抑菌濃度

????實驗結果顯示:Zeamines對6種植物病原真菌都有明顯的抑制作用,最低抑菌濃度都較低水平,其中對荔枝霜疫霉的抑制顯示出最為顯著的效果;平均7.84μg/mL的zeamines就能抑制其菌絲生長;對立枯絲核菌的抑制效果也非常明顯,平均在15.69μg/mL的濃度就能限制其菌絲的生長。此外,對其余4種病原真菌也表現出良好的抑菌效果。說明zeamines對植物病原真菌具有廣譜的殺菌作用。

關于本文
本文標題:水稻基腐病菌抗生素ZEAMINES在植物病害防治中的應用.pdf
鏈接地址:http://www.rgyfuv.icu/p-6730704.html
關于我們 - 網站聲明 - 網站地圖 - 資源地圖 - 友情鏈接 - 網站客服 - 聯系我們

[email protected] 2017-2018 zhuanlichaxun.net網站版權所有
經營許可證編號:粵ICP備17046363號-1 
 


收起
展開
山东11选5中奖结果走势图