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測量淚液樣品中淚液成分的方法.pdf

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測量 淚液 樣品 成分 方法
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摘要
申請專利號:

CN201680038138.8

申請日:

20160502

公開號:

CN107735026A

公開日:

20180223

當前法律狀態:

有效性:

審查中

法律詳情:
IPC分類號: A61B5/1455 主分類號: A61B5/1455
申請人: 黛爾格諾斯蒂爾有限公司
發明人: A·薩默,O·法克托爾,E·埃拉特
地址: 以色列特拉維夫市
優先權: 62/156,093,62/156,079,62/156,072,62/156,087,62/278,814,62/278,805
專利代理機構: 北京市聯德律師事務所 代理人: 黃大正
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法律狀態
申請(專利)號:

CN201680038138.8

授權公告號:

法律狀態公告日:

法律狀態類型:

摘要

本發明提供了一種方法,其中該方法將受試者分類為患有干眼癥,該方法由以下組成:a.獲得人口統計數據,其由受試者的年齡和性別組成;b.從患者獲得淚液樣品,并確定人血清白蛋白的水平;c.由確定的人血清白蛋白的水平,為確定的人血清白蛋白的量分配分數;以及d.由分配的分數,根據以下等式計算截止概率分數:其中如果所計算的截止概率分數是50%至60%,則受試者具有干眼癥。

權利要求書

1.一種方法,其中所述方法將受試者分類為患有干眼癥,所述方法由以下組成:a.獲得人口統計數據,其由所述受試者的年齡和性別組成;b.從患者獲得淚液樣品,并確定人血清白蛋白的水平;c.由所確定的人血清白蛋白的水平,為確定的人血清白蛋白的量分配分數;以及d.由所分配的分數,根據以下等式計算截止概率分數:其中如果所計算的截止概率分數是50%至60%,則所述受試者具有干眼癥。2.根據權利要求1所述的方法,其中所述方法具有50%的截止概率分數,并且77%的時間正確地將受試者分類為具有干眼癥,并且30%的時間正確地將受試者分類為健康的。3.根據權利要求1所述的方法,其中所述方法具有60%的截止概率分數,并且68%的時間正確地將受試者分類為具有干眼癥,并且63%的時間正確地將受試者分類為健康的。4.根據權利要求1所述的方法,其中使用裝置執行確定所述淚液樣品中的人血清白蛋白的水平的步驟,所述裝置包括:a.測試條,其配置為從所述患者接收淚液樣品;以及b.包含對人血清白蛋白特異的試劑的試劑墊,所述試劑墊在與所述淚液樣品接觸時進行反應,所述反應配置為產生顏色,其中所述顏色的強度與所述淚液樣品中的人血清白蛋白的量成比例,并且其中所述測試條配置為將所述淚液樣品遞送到所述試劑墊。5.一種方法,其中所述方法將受試者分類為患有干眼癥,所述方法由以下組成:a.獲得人口統計數據,其由所述受試者的年齡和性別組成;b.從患者獲得淚液樣品,并確定人血清白蛋白、乳鐵蛋白和溶菌酶的水平;c.由所確定的人血清白蛋白、乳鐵蛋白和溶菌酶的水平,為確定的人血清白蛋白、乳鐵蛋白和溶菌酶的量分配分數;以及d.由所分配的分數,根據以下等式計算截止概率分數:其中如果所計算的截止概率分數是50%至60%,則所述受試者具有干眼癥。6.根據權利要求5所述的方法,其中所述方法具有50%的截止概率分數,并88%的時間正確地將受試者分類為具有干眼癥,并且76%的時間正確地將受試者分類為健康的。7.如權利要求5所述的方法,其中所述方法具有55%的截止概率分數,并84%的時間正確地將受試者分類為具有干眼癥,并且80%的時間正確地將受試者分類為健康的。8.根據權利要求5所述的方法,其中所述方法具有60%的截止概率分數,并81%的時間正確地將受試者分類為具有干眼癥,并且86%的時間正確地將受試者分類為健康的。9.根據權利要求5所述的方法,其中使用裝置執行確定選自由人血清白蛋白、乳鐵蛋白和溶菌酶組成的群組的至少一種淚液成分的水平的步驟,所述裝置包括:a.測試條,其配置為從所述患者接收淚液樣品;以及b.多個試劑墊,其中第一單個試劑墊包含對人血清白蛋白特異的試劑,第二試劑墊包含對溶菌酶特異的試劑,并且第三試劑墊包含對乳鐵蛋白特異的試劑,其中所述第一試劑墊、所述第二試劑墊和所述第三試劑墊中的所述試劑在與所述淚液樣品接觸時進行反應,所述反應配置為產生顏色,其中所述顏色的強度與所述淚液樣品中的所述人血清白蛋白、溶菌酶和乳鐵蛋白的量成比例,并且其中所述測試條配置為將所述淚液樣品遞送到所述多個試劑墊。

說明書

相關申請的交叉引用

本申請要求2015年5月1日提交的美國臨時專利申請序列號62/156,072、2015年5月1日提交的美國臨時專利申請序列號62/156,079、2015年5月1日提交的美國臨時專利申請序列號62/156,087、2015年5月1日提交的美國臨時專利申請序列號62/156,093、2016年1月14日提交的美國臨時專利申請序列號62/278,805以及2016年1月14日提交的美國臨時專利申請序列號62/278,814的優先權,其全部內容通過引用整體并入本文。

技術領域

本發明總體涉及診斷方法和裝置,并且更具體地涉及用于診斷干眼綜合癥的方法和裝置。

背景技術

干眼綜合癥是由淚液缺乏引起的淚膜障礙,其導致瞼間眼表面不適和損傷。淚液是覆蓋角膜上皮和結膜上皮的表面上皮細胞的細胞外液。淚膜的功能包括潤滑眼睛表面和眼瞼,優化前段的折射功能,并提供一種從眼表面去除環境污染物的手段。

正常淚膜由三層組成:由瞼板中的瞼板腺產生的外部脂質層(約0.1μm厚)、由主淚腺和副淚腺產生的中心水性層(約7-10μm厚)以及結膜中杯狀細胞產生的內粘蛋白層(約0.2-1.0μm厚)。4-8淚液組成列表包括水、電解質、脂質和蛋白質(例如脂質運載蛋白(lipocalin,脂籠蛋白)、乳鐵蛋白、粘蛋白和溶菌酶)以及各種免疫球蛋白、生長因子和細胞因子。當淚液的質量或數量受到這些組分的不平衡或分解而受到損害時,會嚴重影響眼睛并導致或加劇干眼綜合癥。

發明內容

在一個實施例中,本發明提供了一種方法,其中該方法將受試者分類為患有干眼癥,該方法由以下組成:

a.獲得人口統計數據,其由受試者的年齡和性別組成;

b.從患者獲得淚液樣品,并確定人血清白蛋白的水平;

c.由確定的人血清白蛋白的水平,為確定的人血清白蛋白的量分配分數(score);以及

d.由分配的分數,根據以下等式計算截止概率分數(cutoff probability score):

其中如果所計算的截止概率分數是50%至60%,則受試者具有干眼癥。

在一個實施例中,該方法具有50%的截止概率分數,并且77%的時間正確地將受試者分類為具有干眼癥,并且30%的時間正確地將受試者分類為健康的。

在一個實施例中,該方法具有60%的截止概率分數,并且68%的時間正確地將受試者分類為具有干眼癥,并且63%的時間正確地將受試者分類為健康的。

在一個實施例中,確定人血清白蛋白的水平使用免疫化學反應進行,所述免疫化學反應配置為產生顏色,其中顏色的強度與淚液樣品中人血清白蛋白的量成比例,并且其中根據顏色的強度來分配分數。

在一個實施例中,本發明提供了一種用于確定人血清白蛋白水平的裝置,所述裝置包括:

a.測試條,其配置為從患者接收淚液樣品;以及

b.包含對人血清白蛋白特異的試劑的試劑墊,所述試劑在與淚液樣品接觸時進行反應,所述反應配置為產生顏色,其中顏色的強度與淚液樣品中的人血清白蛋白的量成比例,并且其中測試條配置為將淚液樣品遞送到試劑墊(pad)。

在一個實施例中,本發明提供了一種方法,其中該方法將受試者分類為患有干眼癥,該方法由以下組成:

a.獲得人口統計數據,其由受試者的年齡和性別組成;

b.從患者獲得淚液樣品,并確定人血清白蛋白、乳鐵蛋白和溶菌酶的水平;

c.由確定的人血清白蛋白、乳鐵蛋白和溶菌酶水平,為確定的人血清白蛋白、乳鐵蛋白和溶菌酶量分配分數;以及

d.由分配的分數,根據以下等式計算截止概率分數:

其中如果所計算的截止概率分數是50%至60%,則受試者具有干眼癥。

在一個實施例中,該方法具有50%的截止概率分數,并且88%的時間正確地將受試者分類為具有干眼癥,并且76%的時間正確地將受試者分類為健康的。

在一個實施例中,該方法具有55%的截止概率分數,并且84%的時間正確地將受試者分類為具有干眼癥,并且80%的時間正確地將受試者分類為健康的。

在一個實施例中,該方法具有60%的截止概率分數,并且81%的時間正確地將受試者分類為具有干眼癥,并且86%的時間正確地將受試者分類為健康的。

在一個實施例中,本發明提供了一種用于確定選自由人血清白蛋白、乳鐵蛋白和溶菌酶組成的群組的至少一種淚液成分的水平的裝置,所述裝置包括:

a.測試條,其配置為從患者接收淚液樣品;以及

b.多個試劑墊,其中第一單個試劑墊包含對人血清白蛋白特異的試劑,第二試劑墊包含對溶菌酶特異的試劑,以及第三試劑墊包含對乳鐵蛋白特異的試劑,其中在第一試劑墊、第二試劑墊和第三試劑墊中的試劑在與淚液樣品接觸后進行反應,所述反應配置為產生顏色,其中顏色的強度與淚液樣品中的人血清白蛋白、溶菌酶和乳鐵蛋白的量成比例,并且其中測試條配置為將淚液樣品遞送到所述多個試劑墊。

附圖說明

圖1顯示了使用根據本發明的一些實施例的乳鐵蛋白測定獲得的測試線強度的相關性。

圖2顯示了使用根據本發明的一些實施例的乳鐵蛋白測定獲得的測試線強度與分析物濃度的相關性。

圖3顯示了使用根據本發明的一些實施例的人血清白蛋白測定獲得的測試線強度與分析物濃度的相關性。

圖4顯示了使用根據本發明的一些實施例的溶菌酶測定獲得的測試線強度與分析物濃度的相關性。

圖5顯示了使用根據本發明的一些實施例的粘蛋白測定獲得的測試線強度與分析物濃度的相關性。

圖6顯示了根據本發明一些實施例的裝置。

具體實施方式

為了清楚說明本公開而非限制,將本發明的具體說明分成描述或闡明本發明的某些特征、實施例或應用的以下子部分。

在整個說明書和權利要求中,除非上下文另外明確指出,否則以下術語采用本文明確關聯的意思。雖然可能,但是在文中使用的短語“在一個實施例中”和“在一些實施例中”不一定指相同的實施例。此外,雖然可能,但是在文中使用的短語“在另一個實施例中”和“在一些其它實施例中”不一定指不同的實施例。因此,如下所述,在不脫離本發明的范圍或精神下,可以將本發明的各種實施例輕易地組合。

另外,如本文所使用的,術語“或”是包含性的“或”作用詞(operater),并且等同于術語“和/或”,除非上下文另有明確指出。術語“基于”不是排他性的,并且允許基于未描述的附加因素,除非上下文另有明確指出。另外,在整個說明書中,“一(a)”、“一(an)”和“所述(the)”的意思包括復數指代。“在……中”的意思包括“在……中(in)”和“在……上(on)”。

如本文所用,術語“干眼病”是指由淚液缺乏引起的淚膜障礙,其導致瞼間眼表面不適和損傷。在本發明方法的一些實施例中,干眼病可以由環境條件惡化、生活方式選擇或藥物引起,但不限于此。

如本文所用,當用于描述本文公開的本發明的實施例的一些方法中收集的淚液時,術語“有效體積”是指足以在經受特定化學或物理測試時提供確定結果的體積。因此,“有效體積”將取決于正在進行的特定測試。

如本文所用,術語“溶菌酶”是指由淚腺的腺泡合成和分泌的蛋白質。正常淚液中存在的溶菌酶量為0.6-2.6mg/ml,其通過降解淚膜中細菌的細胞壁組分而充當抗菌劑。

如本文所用,術語“輕度干眼癥”是指由患者和/或醫學專業人員(例如但不限于醫生、護士等)診斷的、不需要治療的疾病的暫時性癥狀或體征。對于被認為是中等程度的干眼癥,患者必須經歷對簡單治療措施(例如,但不限于將眼藥水施用于干眼)有反應的體征或癥狀。

如本文所用,術語“半定量強度測量”是指從測定獲得的結果,其中測定包括固定的運行時間和由醫學專業人員使用的配置為接收包含至少一種淚液成分(例如溶菌酶)的淚液的測試條,并且其中醫學專業人員將測試條(即,淚液分析條)的線強度與包含含有多個線強度的線強度板(例如,如圖1和2中所示)(文中稱為“標度板”)的對照印刷圖片進行比較以確定試紙條的強度結果是否指示受試者患有干眼病。這種半定量強度測量可以用于與其它測試(例如Schirmer測試、TFBUT、OSDI、角膜染色或其任何組合)進行比較和相關。在一些實施例中,標度板是多個顏色線強度的印刷圖片。

如本文所用,術語“淚液”是指覆蓋角膜和結膜上皮的表面上皮細胞的細胞外液,其中淚膜代表眼表面的最后一道防線。淚膜的主要功能是潤滑表面和眼瞼、優化前段的折射功能和提供一種從眼表面去除環境污染物的手段。正常淚膜由三層組成:由瞼板中瞼板腺產生的外部脂質層(約0.1μm厚),由主和副淚腺產生的中心水層(約7-10μm厚)以及結膜中杯狀細胞產生的內粘蛋白層(約0.2-1.0μm厚)。

如本文所用,術語“淚液組分”是指淚液中的分子,并且包括但不限于水、電解質、抗微生物分子、免疫球蛋白、粘蛋白、脂質、生長因子或其任何組合。當淚液的質量或數量由這些組分中的任一種的不平衡或分解而受到損害時,結果可能是導致或加劇干眼綜合癥。

在本發明的方法的一些實施例中,以下是本文使用的術語的列表和所述術語的隨附縮寫:

在一些實施例中,本發明提供了一種方法,其中該方法將受試者分類為患有干眼癥,所述方法由以下組成:

a.獲得人口統計數據,其由受試者的年齡和性別組成;

b.從患者獲得淚液樣品,并確定選自由人血清白蛋白、乳鐵蛋白、溶菌酶和粘蛋白組成的群組的至少一種淚液成分的水平;

c.由確定的量,為至少一種淚液成分的水平分配分數;以及

d.由至少一種淚液成分的分數,計算截止概率分數,

其中如果所計算的截止概率分數是50%至60%,則受試者具有干眼癥。

在一些實施例中,確定至少一種淚液成分的水平使用免疫化學反應進行,所述免疫化學反應配置為產生顏色,其中顏色的強度與淚液樣品中至少一種淚液成分的量成比例,并且其中根據顏色的強度來分配分數。

在一些實施例中,分數選自由0.25、0.5、0.75、1.0、1.25、1.5、1.75和2.0組成的群組。

在一些實施例中,本發明提供了一種方法,其中該方法將受試者分類為患有干眼癥,所述方法由以下組成:

a.獲得人口統計數據,其由受試者的年齡和性別組成;

b.從患者獲得淚液樣品,并確定人血清白蛋白的水平;

c.由確定的人血清白蛋白水平,為確定的人血清白蛋白量分配分數;以及

d.由分配的分數,根據以下等式計算截止概率分數:

其中如果所計算的截止概率分數是50%至60%,則受試者具有干眼癥。

在一些實施例中,該方法具有50%的截止概率分數,并且77%的時間正確地將受試者分類為具有干眼癥,并且30%的時間正確地將受試者分類為健康的。

在一些實施例中,該方法具有60%的截止概率分數,并且68%的時間正確地將受試者分類為具有干眼癥,并且30%的時間正確地將受試者分類為健康的。

在一些實施例中,確定人血清白蛋白的水平使用免疫化學反應進行,所述免疫化學反應配置為產生顏色,其中顏色的強度與淚液樣品中人血清白蛋白的量成比例,并且其中根據顏色的強度來分配分數。

在一些實施例中,分數選自由0.25、0.5、0.75、1.0、1.25、1.5、1.75和2.0組成的群組。

在一些實施例中,本發明提供了一種方法,其中該方法將受試者分類為患有干眼癥,所述方法由以下組成:

a.獲得人口統計數據,其由受試者的年齡和性別組成;

b.從患者獲得淚液樣品,并確定人血清白蛋白、乳鐵蛋白和溶菌酶的水平;

c.由確定的人血清白蛋白、乳鐵蛋白和溶菌酶的水平,為確定的人血清白蛋白、乳鐵蛋白和溶菌酶的量分配分數;以及

d.由分配的分數,根據以下等式計算截止概率分數:

其中如果所計算的截止概率分數是50%至60%,則受試者具有干眼癥。

在一些實施例中,該方法具有50%的截止概率分數,并且88%的時間正確地將受試者分類為具有干眼癥,并且76%的時間正確地將受試者分類為健康的。

在一些實施例中,該方法具有55%的截止概率分數,并且84%的時間正確地將受試者分類為具有干眼癥,并且80%的時間正確地將受試者分類為健康的。

在一些實施例中,該方法具有60%的截止概率分數,并且81%的時間正確地將受試者分類為具有干眼癥,并且86%的時間正確地將受試者分類為健康的。

在一些實施例中,分數選自由0.25、0.5、0.75、1.0、1.25、1.5、1.75和2.0組成的群組。

在一些實施例中,淚液樣品的體積是1至25微升。在一些實施例中,淚液樣品的體積是1微升。在一些實施例中,淚液樣品的體積是2微升。在一些實施例中,淚液樣品的體積是4微升。在一些實施例中,淚液樣品的體積是6微升。在一些實施例中,淚液樣品的體積是8微升。在一些實施例中,淚液樣品的體積是10微升。在一些實施例中,淚液樣品的體積是12微升。在一些實施例中,淚液樣品的體積是14微升。在一些實施例中,淚液樣品的體積是16微升。在一些實施例中,淚液樣品的體積是18微升。在一些實施例中,淚液樣品的體積是20微升。在一些實施例中,淚液樣品的體積是21微升。在一些實施例中,淚液樣品的體積是22微升。在一些實施例中,淚液樣品的體積是23微升。在一些實施例中,淚液樣品的體積是24微升。在一些實施例中,淚液樣品的體積是25微升。

根據本發明的一些實施例的淚液樣品中成分的測量

在一些實施例中,本發明是一種用于定量淚液樣品中至少一種淚液成分的量的方法,所述淚液成分選自由溶菌酶、乳鐵蛋白、粘蛋白、人血清白蛋白及其任何組合組成的群組。在一些實施例中,該方法是一種多分析測試。

在一些實施例中,本發明是一種用于定量淚液樣品中人血清白蛋白的量的方法。

在一些實施例中,本發明是一種用于定量淚液樣品中人血清白蛋白和乳鐵蛋白的量的方法。

在一些實施例中,本發明是一種用于定量淚液樣品中人血清白蛋白、乳鐵蛋白和溶菌酶的量的方法。

根據本發明的一些實施例的淚液樣品中人血清白蛋白(HSA)的測量:在一些實施例中,本發明是一種用于定量淚液樣品中人血清白蛋白(HSA)的量的方法,其包括:從受試者收集含有一定量HSA的淚液樣品,其中淚液樣品的HSA量用于通過以下來產生HSA的半定量強度測量:從受試者收集含有一定量HSA的淚液樣品;使來自受試者的含有一定量HSA的淚液樣品與淚液分析條接觸,其中淚液分析條含有0.4μg的至少一種抗HSA抗體(例如單克隆抗HSA克隆M12619HS3,Fitzgerald Industries International,30Sudbury Road,Suite1A North Acton,MA 01720USA),其以0.4μg/ml抗體與526nm下OD1膠體的比例與膠體金綴合,其中一定量的至少一種抗HSA抗體(例如單克隆抗HSA克隆M12619HS1,Fitzgerald Industries International,30Sudbury Road,Suite 1A North Acton,MA 01720USA),以1mg/ml的濃度分配在硝基纖維素紙上,以在淚液分析條上孵育(incubate)來自受試者的一定量的HSA,從而產生HSA的線強度;以及利用HSA的線強度來確定HSA的半定量強度量度;其中HSA的半定量強度測量選自由0.25、0.5、0.75、1.0、1.25、1.5、1.75和2.0組成的群組。

圖3說明使用根據本發明一些實施例的人血清白蛋白測定獲得的測試線強度與分析物濃度的相關性。在一些實施例中,降低的測試線強度與用于干眼癥的現有測試(例如,Schirmer測試、角膜染色、OSDI等)相關。

參考圖3,在一些實施例中,在根據本發明的一些實施例的測試分析中觀察到,0.1的強度與0μg/ml的人血清白蛋白的濃度相關。在一些實施例中,在根據本發明的一些實施例的測試分析中觀察到,0.25的強度與0.1μg/ml的人血清白蛋白濃度相關。在一些實施例中,在根據本發明的一些實施例的測試分析中觀察到,0.5的強度與0.5μg/ml的人血清白蛋白濃度相關。在一些實施例中,在根據本發明的一些實施例的測試分析中觀察到,0.75的強度與0.75μg/ml的人血清白蛋白濃度相關。在一些實施例中,在根據本發明的一些實施例的測試分析中觀察到,1.0的強度與1μg/ml的人血清白蛋白濃度相關。在一些實施例中,在根據本發明的一些實施例的測試分析中觀察到,1.25的強度與1.1μg/ml的人血清白蛋白濃度相關。在一些實施例中,在根據本發明的一些實施例的測試分析中觀察到,1.5的強度與1.2μg/ml的人血清白蛋白濃度相關。在一些實施例中,在根據本發明的一些實施例的測試分析中觀察到,1.75的強度與6μg/ml的人血清白蛋白濃度相關。在一些實施例中,在根據本發明的一些實施例的測試分析中觀察到,2.0的強度與10μg/ml的人血清白蛋白濃度相關。

在一些實施例中,測試線的相關性表明根據本發明的一些實施例的測試分析中較低量的人血清白蛋白(比如,例如,0至0.1μg/ml)與通過選自由Schirmer測試、角膜染色測試、ODSI和TFBUT組成的群組中的至少一種測試檢測到較低結果相關。

在一些實施例中,測試線的相關性表明根據本發明的一些實施例的測試分析中較低量的人血清白蛋白(比如,例如,0至0.1μg/ml)與通過選自由Schirmer測試、角膜染色測試、ODSI和TFBUT組成的群組中的至少一種測試檢測到更高結果相關。

根據本發明的一些實施例的淚液樣品中的乳鐵蛋白的測量:在一些實施例中,本發明提供了一種用于定量淚液樣品中乳鐵蛋白的量的方法,所述方法包括:從受試者收集含有一定量的乳鐵蛋白的淚液樣品,其中淚液樣品的乳鐵蛋白的量用以產生乳鐵蛋白的半定量強度測量,其方法是:從受試者收集含有一定量乳鐵蛋白的淚液樣品;使來自受試者的含有一定量乳鐵蛋白的淚液樣品與淚液分析條接觸,其中淚液分析條結合至與生物素結合的一定量的豌豆凝集素(PSA)和一定量的小扁豆凝集素(LCA)(其中至少PSA與淚液分析條的硝基纖維素結合),其中一定量的與生物素結合的PSA以每1光學密度(OD)/ml的與抗生蛋白鏈菌素(streptavidin)結合的膠體金對2.5μg/ml至10μg/ml與生物素結合的PSA的比率與膠體金綴合,將來自受試者的一定量的乳鐵蛋白在淚液分析條上孵育,以產生乳鐵蛋白的線強度;并利用乳鐵蛋白的線強度以測定乳鐵蛋白的半定量強度測量;其中乳鐵蛋白的半定量強度測量選自由0.25、0.5、0.75、1.0、1.25、1.5、1.75和2.0組成的群組。

在一些實施例中,比率是每1OD/ml的與抗生蛋白鏈菌素結合的膠體金對2.5μg/ml與生物素結合的PSA。在一些實施例中,比率是每1OD/ml的與抗生蛋白鏈菌素結合的膠體金對3μg/ml與生物素結合的PSA。在一些實施例中,比率是每1OD/ml的與抗生蛋白鏈菌素結合的膠體金對3.5μg/ml與生物素結合的PSA。在一些實施例中,比率是每1OD/ml的與抗生蛋白鏈菌素結合的膠體金對4μg/ml與生物素結合的PSA。在一些實施例中,比率是每1OD/ml的與抗生蛋白鏈菌素結合的膠體金對4.5μg/ml與生物素結合的PSA。在一些實施例中,比率是每1OD/ml的與抗生蛋白鏈菌素結合的膠體金對5μg/ml與生物素結合的PSA。在一些實施例中,比率是每1OD/ml的與抗生蛋白鏈菌素結合的膠體金對5.5μg/ml與生物素結合的PSA。在一些實施例中,比率是每1OD/ml的與抗生蛋白鏈菌素結合的膠體金對6μg/ml與生物素結合的PSA。在一些實施例中,比率是每1OD/ml的與抗生蛋白鏈菌素結合的膠體金對6.5μg/ml與生物素結合的PSA。在一些實施例中,比率是每1OD/ml的與抗生蛋白鏈菌素結合的膠體金對7μg/ml與生物素結合的PSA。在一些實施例中,比率是每1OD/ml的與抗生蛋白鏈菌素結合的膠體金對7.5μg/ml與生物素結合的PSA。在一些實施例中,比率是每1OD/ml的與抗生蛋白鏈菌素結合的膠體金對8μg/ml與生物素結合的PSA。在一些實施例中,比率是每1OD/ml的與抗生蛋白鏈菌素結合的膠體金對8.5μg/ml與生物素結合的PSA。在一些實施例中,比率是每1OD/ml的與抗生蛋白鏈菌素結合的膠體金對9μg/ml與生物素結合的PSA。在一些實施例中,比率是每1OD/ml的與抗生蛋白鏈菌素結合的膠體金對9.5μg/ml與生物素結合的PSA。在一些實施例中,比率是每1OD/ml的與抗生蛋白鏈菌素結合的膠體金對10μg/ml與生物素結合的PSA。

圖2說明使用根據本發明的一些實施例的乳鐵蛋白測定獲得的測試線強度與分析物濃度的相關性。在一些實施例中,降低的測試線強度與用于干眼癥的現有測試(例如,Schirmer測試、角膜染色、OSDI等)相關。

參照圖2,在一些實施例中,在根據本發明的一些實施例的測試分析中觀察到,0.1的強度與1μg/ml的乳鐵蛋白濃度相關。在一些實施例中,在根據本發明的一些實施例的測試分析中觀察到,0.25的強度與4μg/ml的乳鐵蛋白濃度相關。在一些實施例中,在根據本發明的一些實施例的測試分析中觀察到,0.5的強度與12.5μg/ml的乳鐵蛋白濃度相關。在一些實施例中,在根據本發明的一些實施例的測試分析中觀察到,0.75的強度與25μg/ml的乳鐵蛋白濃度相關。在一些實施例中,在根據本發明的一些實施例的測試分析中觀察到,1.0的強度與50μg/ml的乳鐵蛋白濃度相關。在一些實施例中,在根據本發明的一些實施例的測試分析中觀察到,1.25的強度與75μg/ml的乳鐵蛋白濃度相關。在一些實施例中,在根據本發明的一些實施例的測試分析中觀察到,1.5的強度與100μg/ml的乳鐵蛋白濃度相關。在一些實施例中,在根據本發明的一些實施例的測試分析中觀察到,1.75的強度與150μg/ml的乳鐵蛋白濃度相關。在一些實施例中,在根據本發明的一些實施例的測試分析中觀察到,2.0的強度與200μg/ml的乳鐵蛋白濃度相關。

在一些實施例中,測試線的相關性表明根據本發明的一些實施例的測試分析中較低量的乳鐵蛋白(比如,例如1至4μg/ml)與通過選自由Schirmer測試、角膜染色測試、ODSI和TFBUT組成的群組中的至少一種測試所檢測到的較低結果相關。

在一些實施例中,測試線的相關性表明根據本發明的一些實施例的測試分析中較低量的乳鐵蛋白(比如,例如1至4μg/ml)與通過選自由Schirmer測試、角膜染色測試、ODSI和TFBUT組成的群組中的至少一種測試所檢測到的較高結果相關。

根據本發明的一些實施例的淚液樣品中溶菌酶的測量:在一些實施例中,本發明是一種用于定量淚液樣品中溶菌酶的量的方法,其包括:從受試者收集含有一定量的溶菌酶的淚液樣品,其中淚液樣品中溶菌酶的量用于通過以下產生溶菌酶的半定量強度量度:利用稀釋緩沖液稀釋淚液樣品;使來自受試者的含有一定量的溶菌酶的稀釋的淚液樣品與淚液分析條接觸,其中淚液分析條含有一定量的第一抗體(比如,例如,但不限于綿羊或兔抗溶菌酶抗體)和一定量的第二抗體(比如,例如,但不限于兔抗溶菌酶抗體),其中該量的第一抗體以每1光學密度(OD)/ml的膠體金對2.5μg/ml至10μg/ml的比率與膠體綴合,并且將1.5mg/ml第二抗體作為捕獲線(capture line)包埋在淚液分析條上,將來自受試者的一定量的溶菌酶在淚液分析條上孵育得到溶菌酶的線強度;并利用溶菌酶的線強度確定溶菌酶的半定量強度量度;其中溶菌酶的半定量強度量度選自由0.25、0.5、0.75、1.0、1.25、1.5、1.75和2.0組成的群組。

在一些實施例中,比率是每1OD/ml的與抗生蛋白鏈菌素結合的膠體金對2.5μg/ml第一抗體。在一些實施例中,比率是每1OD/ml的與抗生蛋白鏈菌素結合的膠體金對3μg/ml第一抗體。在一些實施例中,比率是每1OD/ml的與抗生蛋白鏈菌素結合的膠體金對3.5μg/ml第一抗體。在一些實施例中,比率是每1OD/ml的與抗生蛋白鏈菌素結合的膠體金對4μg/ml第一抗體。在一些實施例中,比率是每1OD/ml的與抗生蛋白鏈菌素結合的膠體金對4.5μg/ml第一抗體。在一些實施例中,比率是每1OD/ml的與抗生蛋白鏈菌素結合的膠體金對5μg/ml第一抗體。在一些實施例中,比率是每1OD/ml的與抗生蛋白鏈菌素結合的膠體金對5.5μg/ml第一抗體。在一些實施例中,比率是每1OD/ml的與抗生蛋白鏈菌素結合的膠體金對6μg/ml第一抗體。在一些實施例中,比率是每1OD/ml的與抗生蛋白鏈菌素結合的膠體金對6.5μg/ml第一抗體。在一些實施例中,比率是每1OD/ml的與抗生蛋白鏈菌素結合的膠體金對7μg/ml第一抗體。在一些實施例中,比率是每1OD/ml的與抗生蛋白鏈菌素結合的膠體金對7.5μg/ml第一抗體。在一些實施例中,比率是每1OD/ml的與抗生蛋白鏈菌素結合的膠體金對8μg/ml第一抗體。在一些實施例中,比率是每1OD/ml的與抗生蛋白鏈菌素結合的膠體金對8.5μg/ml第一抗體。在一些實施例中,比率是每1OD/ml的與抗生蛋白鏈菌素結合的膠體金對9μg/ml第一抗體。在一些實施例中,比率是每1OD/ml的與抗生蛋白鏈菌素結合的膠體金對9.5μg/ml第一抗體。在一些實施例中,比率是每1OD/ml的與抗生蛋白鏈菌素結合的膠體金對10μg/ml第一抗體。

圖4說明使用根據本發明的一些實施例的溶菌酶測定獲得的測試線強度與分析物濃度的相關性。在一些實施例中,降低的測試線強度與用于干眼癥的現有測試(例如,Schirmer測試、角膜染色、OSDI等)相關。

參考圖4,在一些實施例中,在根據本發明的一些實施例的測試分析中觀察到,0.1的強度與0μg/ml的溶菌酶濃度相關。在一些實施例中,在根據本發明的一些實施例的測試分析中觀察到,0.25的強度與1μg/ml的溶菌酶濃度相關。在一些實施例中,在根據本發明的一些實施例的測試分析中觀察到,0.5的強度與3μg/ml的溶菌酶濃度相關。在一些實施例中,在根據本發明的一些實施例的測試分析中觀察到,0.75的強度與12μg/ml的溶菌酶濃度相關。在一些實施例中,在根據本發明的一些實施例的測試分析中觀察到,1.0的強度與25μg/ml的溶菌酶濃度相關。在一些實施例中,在根據本發明的一些實施例的測試分析中觀察到,1.25的強度與40μg/ml的溶菌酶濃度相關。在一些實施例中,在根據本發明的一些實施例的測試分析中觀察到,1.5的強度與70μg/ml的溶菌酶濃度相關。在一些實施例中,在根據本發明的一些實施例的測試分析中觀察到,1.75的強度與100μg/ml的溶菌酶濃度相關。在一些實施例中,在根據本發明的一些實施例的測試分析中觀察到,2.0的強度與150μg/ml的溶菌酶濃度相關。

在一些實施例中,測試線的相關性表明根據本發明的一些實施例的測試分析中較低量的溶菌酶(比如,例如0至1μg/ml)與通過選自由Schirmer測試、角膜染色測試、ODSI和TFBUT組成的群組中的至少一種測試所檢測到的較低結果相關。

在一些實施例中,測試線的相關性表明根據本發明的一些實施例的測試分析中較低量的溶菌酶(比如,例如0至1μg/ml)與通過選自由Schirmer測試、角膜染色測試、ODSI和TFBUT組成的群組中的至少一種測試所檢測到的較高結果相關。

根據本發明的一些實施例的淚液樣品中粘蛋白的測量:在一些實施例中,本發明是一種用于定量淚液樣品中粘蛋白的量的方法,其包括:從受試者收集含有一定量的粘蛋白的淚液樣品,以及其中淚液樣品中粘蛋白的量用于通過以下來產生粘蛋白的半定量強度量度:從受試者收集含有一定量粘蛋白的淚液樣品;使來自受試者的含有一定量粘蛋白的淚液樣品與淚液分析條接觸,其中淚液分析條與一定量的與生物素結合的木菠蘿凝集素及一定量的麥胚凝集素(WGA)結合,其中一定量的與生物素結合的木菠蘿凝集素以每1光學密度(OD)/ml的膠態金對2.5μg/ml至10μg/ml的比率與膠體金綴合,將來自受試者的一定量的粘蛋白在淚液分析條上孵育,從而得到粘蛋白線強度;并利用粘蛋白線強度確定粘蛋白的半定量強度量度;其中粘蛋白的半定量強度量度選自由0.25、0.5、0.75、1.0、1.25、1.5、1.75和2.0組成的群組。

在一些實施例中,比率是每1OD/ml的與抗生蛋白鏈菌素結合的膠體金對2.5μg/ml與生物素結合的木菠蘿凝集素。在一些實施例中,比率是每1OD/ml的與抗生蛋白鏈菌素結合的膠體金對3μg/ml與生物素結合的木菠蘿凝集素。在一些實施例中,比率是每1OD/ml的與抗生蛋白鏈菌素結合的膠體金對3.5μg/ml與生物素結合的木菠蘿凝集素。在一些實施例中,比率是每1OD/ml的與抗生蛋白鏈菌素結合的膠體金對4μg/ml與生物素結合的木菠蘿凝集素。在一些實施例中,比率是每1OD/ml的與抗生蛋白鏈菌素結合的膠體金對4.5μg/ml與生物素結合的木菠蘿凝集素。在一些實施例中,比率是每1OD/ml的與抗生蛋白鏈菌素結合的膠體金對5μg/ml與生物素結合的木菠蘿凝集素。在一些實施例中,比率是每1OD/ml的與抗生蛋白鏈菌素結合的膠體金對5.5μg/ml與生物素結合的木菠蘿凝集素。在一些實施例中,比率是每1OD/ml的與抗生蛋白鏈菌素結合的膠體金對6μg/ml與生物素結合的木菠蘿凝集素。在一些實施例中,比率是每1OD/ml的與抗生蛋白鏈菌素結合的膠體金對6.5μg/ml與生物素結合的木菠蘿凝集素。在一些實施例中,比率是每1OD/ml的與抗生蛋白鏈菌素結合的膠體金對7μg/ml與生物素結合的木菠蘿凝集素。在一些實施例中,比率是每1OD/ml的與抗生蛋白鏈菌素結合的膠體金對7.5μg/ml與生物素結合的木菠蘿凝集素。在一些實施例中,比率是每1OD/ml的與抗生蛋白鏈菌素結合的膠體金對8μg/ml與生物素結合的木菠蘿凝集素。在一些實施例中,比率是每1OD/ml的與抗生蛋白鏈菌素結合的膠體金對8.5μg/ml與生物素結合的木菠蘿凝集素。在一些實施例中,比率是每1OD/ml的與抗生蛋白鏈菌素結合的膠體金對9μg/ml與生物素結合的木菠蘿凝集素。在一些實施例中,比率是每1OD/ml的與抗生蛋白鏈菌素結合的膠體金對9.5μg/ml與生物素結合的木菠蘿凝集素。在一些實施例中,比率是每1OD/ml的與抗生蛋白鏈菌素結合的膠體金對10μg/ml與生物素結合的木菠蘿凝集素。

圖5說明使用根據本發明的一些實施例的粘蛋白測定獲得的測試線強度與分析物濃度的相關性。在一些實施例中,降低的測試線強度與用于干眼癥的現有測試(例如,Schirmer測試、角膜染色、OSDI等)相關。

參照圖5,在一些實施例中,在根據本發明的一些實施例的測試分析中觀察到,0.1的強度與0μg/ml的粘蛋白濃度相關。在一些實施例中,在根據本發明的一些實施例的測試分析中觀察到,0.25的強度與0.1μg/ml的粘蛋白濃度相關。在一些實施例中,在根據本發明的一些實施例的測試分析中觀察到,0.5的強度與0.5μg/ml的粘蛋白濃度相關。在一些實施例中,在根據本發明的一些實施例的測試分析中觀察到,0.75的強度與1μg/ml的粘蛋白濃度相關。在一些實施例中,在根據本發明的一些實施例的測試分析中觀察到,1.0的強度與3μg/ml的粘蛋白濃度相關。在一些實施例中,在根據本發明的一些實施例的測試分析中觀察到,1.25的強度與6μg/ml的粘蛋白濃度相關。在一些實施例中,在根據本發明的一些實施例的測試分析中觀察到,1.5的強度與12μg/ml的粘蛋白濃度相關。在一些實施例中,在根據本發明的一些實施例的測試分析中觀察到,1.75的強度與25μg/ml的粘蛋白濃度相關。在一些實施例中,在根據本發明的一些實施例的測試分析中觀察到,2.0的強度與50μg/ml的粘蛋白濃度相關。

在一些實施例中,測試線的相關性表明根據本發明的一些實施例的測試分析中較低量的粘蛋白(比如,例如0至1μg/ml)與通過選自由Schirmer測試、角膜染色測試、ODSI和TFBUT組成的群組中的至少一種測試所檢測到的較低結果相關。

在一些實施例中,測試線的相關性表明根據本發明的一些實施例的測試分析中較低量的粘蛋白(比如,例如0至1μg/ml)與通過選自由Schirmer測試、角膜染色測試、ODSI和TFBUT組成的群組中的至少一種測試所檢測到的較高結果相關。

根據本發明的一些實施例的裝置

在一些實施例中,本發明提供了一種用于確定選自由人血清白蛋白、乳鐵蛋白、溶菌酶和粘蛋白組成的群組中的至少一種淚液成分的水平的裝置,所述裝置包括:

a.測試條,其配置為從患者接收淚液樣品;以及

b.包含對人血清白蛋白特異的試劑的試劑墊,所述試劑在與淚液樣品接觸時進行反應,所述反應配置為產生顏色,其中顏色的強度與淚液樣品中的人血清白蛋白的量成比例,并且其中測試條配置為將淚液樣品遞送到試劑墊。

在一些實施例中,本發明提供了一種用于確定選自由人血清白蛋白、乳鐵蛋白和溶菌酶組成的群組中的至少一種淚液成分的水平的裝置,所述裝置包括:

a.測試條,其配置為從患者接收淚液樣品;以及

b.多個試劑墊,其中第一單個試劑墊包含對人血清白蛋白特異的試劑,第二試劑墊包含對溶菌酶特異的試劑,以及第三試劑墊包含對乳鐵蛋白特異的試劑,其中在第一試劑墊、第二試劑墊和第三試劑墊中的試劑在與淚液樣品接觸后進行反應,所述反應配置為產生顏色,其中顏色的強度與淚液樣品中存在的人血清白蛋白、溶菌酶和乳鐵蛋白的量成比例,并且其中測試條配置為將淚液樣品遞送到所述多個試劑墊。

在一些實施例中,配置為產生顏色的反應是免疫化學反應。在一些實施例中,配置為產生顏色的反應是結合反應。

圖6顯示了根據本發明的一些實施例的裝置的非限制性示例性實施例。該裝置包括一個或多個包含化學或生物試劑的墊,所述試劑與淚液接觸后,與測試的分析物發生免疫化學識別,并將復合物遷移至限定的區域。因此,觀察到彩色線。診斷可以在預定義的時間后進行,例如,完成免疫化學反應后。該診斷基于將觀察到的裝置反應區上的線的顏色強度與顏色線強度的參考印刷圖像進行比較。顏色線強度的印刷圖像,其中每個顏色強度代表用于診斷DES的一個或多個特征。這樣的特征可以是但不限于(a)至少一種物質的濃度,其濃度已知與DES相關(非限制性實例包括溶菌酶),至少一種預定義蛋白質水平和電解質(如鈉、鉀等)的濃度、(b)同滲容摩、(c)粘度和表面張力,和(d)pH。

在本發明的方法的一些實施例中,該裝置也可以用于收集其量足以進行基于淚水的相關特征的醫學診斷的淚液。在一些實施例中,裝置因此可以提供定性的、定量的(例如但不限于使用條狀讀取器)、半定量和多因素診斷。在一些實施例中,該裝置因此可以提供半定量診斷。

在一些實施例中,本發明的方法包括提供兩種凝集素,例如豌豆凝集素(“PSA”)和小扁豆凝集素(“LCA”)[均由Medicago AB制造,Medicago AB在:Da nmark Berga 13,SE-755 98烏普薩拉,瑞典,或由VECTOR LABORATORIES,INC制造:30Ingold Road,Burlingame,CA 94010,USA],其中PSA與金顆粒綴合。在一些實施例中,生物素與PSA結合,產生生物素-PSA,并且生物素-PSA與抗生蛋白鏈菌素-金綴合物結合。在一些實施例中,將凝集素放置在測試條上。在一些實施例中,至少一種凝集素與金顆粒綴合(“免疫金標記的”)。在一些實施例中,金顆粒是膠體金顆粒。在一些實施例中,膠體金顆粒可以在20-125nm范圍內。在一些實施例中,膠體金顆粒可以在50-125nm范圍內。在一些實施例中,膠體金顆粒可以在100-125nm范圍內。在一些實施例中,膠體金顆粒可以在20-100nm范圍內。在一些實施例中,膠體金顆粒可以在20-50nm范圍內。在一些實施例中,膠體金顆粒可以在20-40nm范圍內。在一些實施例中,膠體金顆粒可以在20-60nm范圍內。在一些實施例中,膠體金顆粒可以在40-60nm范圍內。在一些實施例中,膠體金顆粒可以在50-100nm范圍內。

在一些實施例中,本發明的方法包括提供溶菌酶抗體(抗溶菌酶),其中抗溶菌酶是綴合的。在一些實施例中,將抗溶菌酶抗體置于測試條上。在一些實施例中,抗溶菌酶抗體得自綿羊(即,綿羊抗溶菌酶和/或兔抗溶菌酶;其中綿羊抗溶菌酶可由Seramun GmbH[Spreenhagener Str.Heidesee 115754,德國]提供,或者是由Nordic MUbio[Rangeerweg 5A 6114BC Susteren The Netherlands]提供的兔抗溶菌酶)。在一些實施例中,抗溶菌酶抗體與金顆粒綴合(“免疫金標記的”)。在一些實施例中,抗綿羊抗體與金顆粒綴合(4μg抗體與1ml OD 1的40nm金顆粒綴合)。在一些實施例中,金顆粒是膠體金顆粒。在一些實施例中,膠體金顆粒可以在20-125nm范圍內。在一些實施例中,膠體金顆粒可以在50-125nm范圍內。在一些實施例中,膠體金顆粒可以在100-125nm范圍內。在一些實施例中,膠體金顆粒可以在20-100nm范圍內。在一些實施例中,膠體金顆粒可以在20-50nm范圍內。在一些實施例中,膠體金顆粒可以在50-100nm范圍內。在一些實施例中,膠體金顆粒可以在20-60nm范圍內。在一些實施例中,膠體金顆粒可以在40-60nm范圍內。在一些實施例中,膠體金顆粒可以在20-40nm范圍內。

在一些實施例中,本發明的方法包括提供兩種凝集素,例如豌豆凝集素(“PSA”)和小扁豆凝集素(“LCA”),其中PSA與金顆粒綴合。在一些實施例中,生物素與PSA結合,產生生物素-PSA,并且生物素-PSA與抗生蛋白鏈菌素-金綴合物結合。在一些實施例中,將凝集素放置在測試條上。在一些實施例中,至少一種凝集素與金顆粒綴合(“免疫金標記的”)。在一些實施例中,金顆粒是膠體金顆粒。在一些實施例中,膠體金顆粒可以在20-125nm范圍內。在一些實施例中,膠體金顆粒可以在50-125nm范圍內。在一些實施例中,膠體金顆粒可以在100-125nm范圍內。在一些實施例中,膠體金顆粒可以在20-100nm范圍內。在一些實施例中,膠體金顆粒可以在20-50nm范圍內。在一些實施例中,膠體金顆粒可以在20-60nm范圍內。在一些實施例中,膠體金顆粒可以在20-40nm范圍內。在一些實施例中,膠體金顆粒可以在40-60nm范圍內。在一些實施例中,膠體金顆粒可以在50-100nm范圍內。

在一些實施例中,測試條包括硝基纖維素(例如,但不限于,來自Advanced Microdevices PVT的Whatman FF120或CNPH-N-SS60)。

在一些實施例中,測試條包含游離的[即未綴合的]綿羊抗溶菌酶抗體,其中這些游離抗體可以驗證測試敏感度。

在一些實施例中,本發明的方法包括比較步驟,其中溶菌酶的半定量強度量度與Schirmer方法的結果相關。根據Schirmer方法,使用紙條測量在五分鐘內產生的淚液量。將該條放置在下眼瞼的中間和外側三分之一的接合處,在眼球與眼瞼之間。測試在環境光線下進行。指示患者在測試過程期間向前看并正常眨眼。采用在5分鐘內潤濕超過10mm的紙張來表明眼睛產生正常量的淚液。Schirmer方法的特異性(即,測試識別正常個人的能力)通常在90%左右。Schirmer測試以整個DED疑似群體的20%的比率提供了對DED疑似個人的真正識別。Schirmer測試在潤濕小于5mm時提供真陽性結果,而當潤濕水平在10mm以上時提供真陰性結果,并且當潤濕水平在5mm與10mm之間時可提供假陽性結果。當濕潤水平在5mm與10mm之間時,患者疑似患有DES,但結果不能被認為是結論性的。

在一些實施例中,本發明的方法包括比較步驟,其中乳鐵蛋白的半定量強度量度與Schirmer方法的結果相關。根據Schirmer方法,使用紙條測量在五分鐘內產生的淚液量。將該條放置在下眼瞼的中間和外側三分之一的接合處,在眼球與眼瞼之間。測試在環境光線下進行。指示患者在測試過程期間向前看并正常眨眼。采用在5分鐘內潤濕超過10mm的紙張來表明眼睛產生正常量的淚液。Schirmer方法的特異性(即,測試識別正常個人的能力)通常在90%左右。Schirmer測試以整個DED疑似群體的20%的比率提供了對DED疑似個人的真正識別。Schirmer測試在潤濕小于5mm時提供真陽性結果,而當潤濕水平在10mm以上時提供真陰性結果,并且當潤濕水平在5mm與10mm之間時可提供假陽性結果。當濕潤水平在5mm與10mm之間時,患者疑似患有DES,但結果不能被認為是結論性的。

在一些實施例中,本發明的方法包括比較步驟,其中粘蛋白的半定量強度量度與Schirmer方法的結果相關。根據Schirmer方法,使用紙條測量在五分鐘內產生的淚液量。將該條放置在下眼瞼的中間和外側三分之一的接合處,在眼球與眼瞼之間。測試在環境光線下進行。指示患者在測試過程期間向前看并正常眨眼。采用在5分鐘內潤濕超過10mm的紙張來表明眼睛產生正常量的淚液。Schirmer方法的特異性(即,測試識別陰性結果的能力)通常在90%左右。Schirmer測試以整個DED疑似群體的20%的比率提供了對DED疑似個人的真正識別。Schirmer測試在潤濕小于5mm時提供真陽性結果,而當潤濕水平在10mm以上時提供真陰性結果,并且當潤濕水平在5mm與10mm之間時可提供假陽性結果。當濕潤水平在5mm與10mm之間時,患者疑似患有DES,但結果不能被認為是結論性的。

現在參考以下實例,其與以上描述一起以非限制的方式說明本發明的一些實施例。

實例

實例1:根據本發明的一些實施例的淚液樣品中乳鐵蛋白的測量

在健康受試者和符合輕度至中度干眼癥的一個或多個標準的受試者中檢查了主要淚液成分的水平。以下實驗說明了用于干眼癥評估的基準測試與淚液成分的定量量度之間的比較。用于定量測量至少一種淚液成分的測試的實例是角膜染色、Schirmer測試、TFBUT和包括OSDI問卷和Ora-CalibraTM眼部不適分數的提供的癥狀評估。OSDI是一個12個問題的評估,其已經成為干眼癥狀的標準。用于不適的Ora-CalibraTM評估也通過允許患者回答問題來提供對癥狀的量度,其中與OSDI相比,問題的數量減少。使用毛細管收集淚液樣品,然后分析淚液成分。測得的淚液成分是乳鐵蛋白。

淚液成分測定和測量方法

使用快速測試條(淚液分析條)和試劑以利用半定量技術測量乳鐵蛋白水平;其中對于每種類型的測定,半定量技術遵循固定的運行時間,使用HP掃描儀型號Scanjet 200掃描該條。使用功能變亮/變暗優化掃描圖:加亮-(-)50;陰影-(-)69;中色調-(-)50;γ-1.7,然后記錄信號強度(如圖2所示)。與一系列對照線的強度相比,使用強度測試線的半定量估計來進行淚液成分的確定。

實驗設計

受試者群體:用于研究的受試者包括符合下表中列出的納入和排除標準的18歲以上的任何人。研究群體包括兩組受試者(組A,如表1所示,組B,如表2所示),每組的數量大致相等(每組約100個受試者):

表1:A組-健康的眼睛

表2:B組-疑似干眼癥

本發明方法的一個示例性實施例是由約200名受試者組成的前瞻性單中心單次訪問平行組數據和淚液收集研究。有一次定期的研究訪問,篩選受試者;將那些符合資格標準的人招募到這項研究中。

淚液樣品收集:收集淚液樣品的程序如下:

1.將裂隙燈設置為低強度光束。

2.將眼睛的下眼瞼縮回,并將玻璃毛細管置于接觸淚液表面的顳側。

3.接觸淚液表面并允許收集6-25微升淚液。

4.一旦收集到足夠的體積(例如,但不限于6-25微升),將玻璃毛細管的內容物取出并倒入小瓶中。如果淚液體積低于6微升,則將另一個樣品從另一只眼睛取出倒入另一個干凈的小瓶中。

5.小瓶上標有贊助商提供的指定受試者標簽。

6.將小瓶儲存在2℃-8℃的溫度下。在進一步分析乳鐵蛋白的水平前,將淚液樣品轉移到贊助商實驗室進行自收集起長達48小時的初始制備。

7.使用小體積的移液管在取樣后的48小時內測量淚液體積。將兩個樣品體積的磷酸鹽緩沖鹽水(PBS X 1)加入收集的樣品中,然后短旋渦(20秒)進行混合。將稀釋的樣品放回到2℃-8℃的溫度下用以儲存。

乳鐵蛋白測定:該測定允許使用側流免疫層析測定、用乳鐵蛋白(即,一種糖蛋白)的糖基團的特異性檢測直接檢測人淚液中的乳鐵蛋白。首先,將20μl以1:2000稀釋的淚液樣品置于樣品墊上。然后,將額外的40μl洗滌溶液置于樣品墊上以使淚液樣品遷移并潤濕綴合物墊。綴合物墊包含通過生物素抗生物素蛋白相互作用綴合至與金顆粒綴合的抗生蛋白鏈菌素(其由Arista Biologicals Inc.1101Hamilton Street,Allentown,PA 18101制造)的第一凝集素(例如豌豆凝集素(“PSA”))。綴合的凝集素結合來自淚液樣品中的乳鐵蛋白,并通過硝基纖維素膜向芯(wick)遷移。當金綴合物/乳鐵蛋白復合物到達測試區時,金綴合物/乳鐵蛋白結合至固定于膜表面(即測試線)的第二凝集素(例如,小扁豆凝集素(“LCA”))。結合至測試線的金綴合物/乳鐵蛋白的積累形成粉紅色的可視線。然后過量的復合物遷移到含有結合抗生蛋白鏈菌素金綴合物的生物素BSA的第二區域。形成第二線(對照線)。對照線表示測試有效性。剩余量的綴合物和淚液樣品從硝基纖維素膜遷移到芯墊中。

如下制備測試條:將1mg/ml(0.75-1.5mg/ml)LCA浸漬到硝基纖維素的層析膜上(例如,Whatman硝基纖維素膜,FF120,但也可以是mdi C PH-N-5560膜)。將LCA浸漬到呈1mm寬線條形狀的測試條上。LCA溶液額外地包含以下:(1)緩沖液,例如pH 7.4的磷酸鹽緩沖鹽水或pH值6.5-9.0的Tris、HEPES、Borax或MES緩沖液;(2)2%海藻糖或蔗糖,濃度為1%-4%;(3)1-4%乙醇(例如,但不限于1%、2%、3%、4%乙醇)。將LCA浸漬的硝基纖維素在50℃下干燥10分鐘以使蛋白質與硝基纖維素結合。LCA與硝基纖維素的結合也可以在37-60℃下進行5至24小時,其中較高的溫度將允許較短的孵育時間。通過以例如但不限于11:1、22:1或33:1的比率將生物素與PSA綴合使生物素與PSA結合。生物素-PSA以5μg/ml生物素-PSA(但可以在1μg/ml至7μg/ml濃度范圍內)和OD0.5/ml-OD2.0/ml,例如但不限于OD1/ml金-抗生蛋白鏈菌素的比率與抗生蛋白鏈菌素-金綴合物結合。反應復合物也可以包括洗滌試劑,其從硝基纖維素膜上清除過量的金綴合物。洗滌試劑可以包含以下:(1)pH 7.4的PBS x 1(可以在pH 7.0-9.0范圍內);(2)1%不含脂肪酸的牛血清白蛋白(0.5%-3.0%);(3)0.1%吐溫20(可以在0.05%-2.0%范圍內);(4)0.05%十二烷基硫酸鈉(可以在0.01%-1%范圍內),或其任何組合。關于圖1,當以50μg/ml測量乳鐵蛋白時,形成1的線強度(即,顯示線強度與乳鐵蛋白濃度之間的等效性)。

淚膜破裂時間測試:TFBUT的步驟包括:

1.醫學專業人員向每只眼睛的下結膜穹窿中滴入5μL 2%無防腐劑熒光素鈉溶液。為了將熒光素與淚膜充分混合,指示受試者眨眼數次。為了獲得最大的熒光,在評估TFBUT前,醫學專業人員在滴注后等待約30秒。

2.在裂隙燈的幫助下,醫學專業人員監測淚膜的完整性,注意從打開眼睛時形成膠束所需的時間。用秒表以秒為單位測量TFBUT,依次對右眼和左眼用數字圖像記錄系統測量。使用Wratten#12黃色過濾器來提高TFBUT評分的能力。

3.對于每只眼睛,取兩個測量值并取平均值,除非這兩個測量值相差大于2秒并且每個少于10秒,在這種情況下,取第三個測量值,并將三個測量值中最接近的兩次取平均值。

角膜熒光素染色:用于角膜熒光素的步驟包括:

1.為了獲得最大的熒光,醫學專業人員在滴注后等待約3-5分鐘,然后評估熒光素染色。使用Wratten#12黃色過濾器來增強熒光素染色分級的能力。

2.分級并記錄瞼間組織,使用5點等級(例如,具有代表一度強度等級的線強度的掃描條/板圖)對結膜和角膜上皮細胞進行染色。輕輕抬起上眼瞼,將整個角膜表面分級。對于結膜,當受試者向鼻觀察時,進行顳區域分級;通過向顳觀察進行經鼻分級。

3.使用Ora CalibraTM角膜和結膜染色分級對結膜和角膜染色進行分級并記錄。

未麻醉的Schirmer測試:按照以下步驟進行Schirmer淚液測試:

1.使用無菌的淚液Flo Schirmer測試條(例如,購自RoseEnterprises,但不限于此),條的彎曲與條的凹槽一致。

2.指示受試者注視。

3.將Schirmer測試條置于每只眼睛的下顳臉邊緣,使測試條緊密貼合。指示受試者閉上眼睛。

4.5分鐘后,取出Schirmer條。記錄每只眼睛的潤濕區域的長度(mm)。

Ora CalibraTM眼部不適分級:在一個示例性實施例中,根據以下等級,由受試者主觀上分級眼部不適分數,分別對每只眼睛進行評分。所用的等級如下所示,范圍是0-4:

0=沒有不適

1=間歇性意識

2=持續意識

3=間歇性不適

4=持續不適

Ora CalibraTM眼部不適&4-癥狀問卷:受試者對以下每種癥狀的嚴重程度評分,關于眼睛感覺如何,總體來說-總體眼部不適、灼燒、干燥、沙礫感和刺痛,根據以下6-點(0-5)等級,其中0=無,5=最大。

對于研究方案依從性,遵循保護受試者的眼部安全性的專業護理標準。符合入選標準的受試者提供人口統計信息,醫療和眼部病史以及人工淚液使用(如果適用)。臨床工作人員確認受試者在研究前一小時內沒有使用人工淚液,然后指導受試者通過以下步驟:

1.受試者完成問卷和Ora CalibraTM眼部不適&4-癥狀問卷。

2.受試者和工作人員檢查了來源文件,以基于當前藥物和病史確認受試者符合所有的納入/排除標準。

3.臨床工作人員使用毛細血管從受試者右眼收集6-25微升淚液。工作人員用受試者篩選號標記收集小瓶,并將毛細管內容物倒入小瓶中。

4.在從右眼收集的淚液體積低于6微升的情況下,從左眼抽取樣品,將毛細管內容物倒入另一個標有相同受試者篩選號的干凈小瓶中。

5.臨床工作人員對收集眼進行淚膜破裂時間測試。

6.臨床工作人員進行角膜熒光染色,并檢查收集眼的眼表面。

7.如果從右眼收集6或更多微升,但是受試者右眼不符合淚膜破裂時間或熒光素染色納入標準,則對左眼重復步驟3-6。

8.臨床工作人員對收集眼進行未麻醉的Schirmer測試。

9.臨床工作人員審查結果,基于根據項目3-8收集的數據確定患者是否符合所有納入/排除標準。

10.符合所有標準的患者被分配一個受試者研究號,并根據對健康或疑似干眼癥患者的診斷對標簽進行分類。

11.如果適用,記錄不良事件。

使用以下參數處理和測試樣品:

1.使用微量移液管測量收集的淚液體積。添加兩倍測量體積的磷酸鹽緩沖鹽水(PBS),最終稀釋度為1:3。

2.利用PBS將稀釋的淚液進一步連續稀釋至以下稀釋度:1:50、1:100和1:200。

3.將兩微升的稀釋樣品與18微升金綴合物混合物在微管中混合。將相關測試條蘸入混合物中4分鐘。

4.將額外的25微升洗滌溶液加入管中,以從反應區中清除過量的染料。

5.顯色6分鐘后,用薄紙將測試條輕輕吸干,并用臺式掃描儀掃描。

6.根據圖2所示的強度等級,對測試強度進行量化。

能力分析:表3給出了所選樣品量的能力。

表3

使用精確二項式方法估計能力,其中考慮了兩個協同的主要療效指標(靈敏度和特異性),并且其中“N”表示僅正值(或僅負值)情況的數目。因此,整個樣品量加倍。

表4說明了“精確度”參數,其被定義為置信區間(CI)的一半長度。CI是群體參數的區間估計。CI是觀察到的區間(即從觀察結果計算出),原則上樣品間不同,如果重復實驗,通常包括感興趣的參數。

表4

結果與分析

研究的主要結果是用于干眼癥的基準測試(例如TFBUT、角膜染色、Schirmer測試和OSDI問卷)與淚膜成分(例如乳鐵蛋白)的測試結果的比較。

分析中包括從符合入選標準的患者眼睛獲得的所有收集的樣品。這項研究的目標是開發一個評估工具以比較用于干眼癥的基準測試和測試淚膜化合物乳鐵蛋白的試劑盒。數據分布從最低值到最高值,并與其它參數進行比較,以確定正和負相關性。圖2說明了測試線強度與分析物濃度的相關性。在一些實施例中,降低的測試線強度與用于干眼癥的測試(例如,Schirmer測試、角膜染色、OSDI等)相關。

在一些實施例中,測試線的相關性表明根據本發明的一些實施例的測試分析中的乳鐵蛋白的較低量(比如,例如1至4μg/ml)與通過選自由Schirmer測試、角膜染色測試、ODSI和TFBUT組成的群組中的至少一種測試所檢測的較高結果相關。

在這個初步研究中的樣品量(總共198只眼睛,每組99只)不是基于任何能力分析,而是基于足以構建用于區分健康淚液和疑似干眼癥淚液并利用不同測試參數評估基準測試的模型的眼睛數量的近似值。

不良事件(AE)包括在淚液收集過程和眼表面評估步驟中報告的任何事件。該臨床研究涉及TFBUT、角膜染色和用于成分分析的眼淚收集。在這些測試中,參與者可能已經感覺到異物感。在淚液收集期間,可能出現由于運動而與眼睛直接接觸的情況,導致角膜磨損或眼睛發紅。任何這樣的事件被記錄和如下分級:

輕微:通常是短暫的體征或癥狀,不需要特殊治療,一般不會干擾正常的活動。

中度:可能通過簡單的治療措施改善的體征或癥狀;可能會干擾正常的活動。

嚴重:強烈或虛弱的體征或癥狀,干擾正常的活動。恢復通常借助于治療措施。

總共198個受試者完成研究,包括126個女性和72個男性。下表5中列出了根據入選標準A或B的受試者分類。符合入選標準的那些人在本研究中不匹配年齡或性別。

表5

男性 女性 平均年齡 A組健康的 41 59 45.5 B組疑似DE 31 67 58.6

在每個研究組中招募的受試者符合健康或疑似干眼癥的入選標準。唯一顯示出兩組間顯著差異的人口統計標準是年齡;初步分析顯示兩組之間的任何淚液度量(metric)無顯著差異。另外,兩組都顯示了基準測試參數的一系列值。根據這一觀察,將所有受試者合并到單個組中,并使用群體四分位數進行分析,假設抽樣群體代表了干眼癥嚴重程度的連續區。使用這個概念,對每個基準測試的測量結果進行排名,并將4個四分位數中每一個的平均值與淚液診斷的測量值進行比較。

四分位數分析:用于TFBUT、劣質染色和Schirmer測試的四分位數分析總結在表6中。這種方法的重點在于極值,四分位數1和4,因為這些代表了每個度量具有最大差異的那些患者。在所有三個測量中,Q1是具有正常患者預期值的四分位數,而Q4是具有干眼癥有關值的四分位數。例如,Q1中的那些具有12.80秒的平均TFBUT,因此將被認為是正常的,而Q4中的那些具有2.34秒的平均TFBUT,這與中度干眼病的診斷一致。當比較每個TFBUT定義的四分位數中測試參數的平均值時,出現了破裂時間度量與淚液成分動力學之間的關聯。Q1與Q4之間TFBUT的減少伴隨著乳鐵蛋白的增加。劣質染色從Q1增加到Q4,并且這種增加與乳鐵蛋白的增加顯著相關。由Schirmer分數定義的四分位數顯示出顯著的負相關性:平均Schirmer分數從Q1下降到Q4的同時,乳鐵蛋白值增加,并顯示了Q1與Q4之間的顯著差異。這種負相關性是由于Schirmer分數的性質,其中較高值(Q1)表明健康的淚液產生。

表6顯示了用于TFBUT、劣質染色和Schirmer測試的四分位數分析。T檢驗值在顯著的情況下(小于0.05)用粗體突出顯示。

表6

第二輪四分位數分析使用相同的方法來確定由淚液成分值定義的四分位數是否顯示與干眼癥的體征和癥狀的其他度量的類似相關性。這些數據顯示在表7中。表7.乳鐵蛋白的四分位數分析。T檢驗值在顯著的情況下(<0.05)用粗體突出顯示。

表7

與淚腺蛋白乳鐵蛋白相關的四分位數顯示出對于角膜染色測量的顯著差異,其中劣質和整個角膜染色顯示與蛋白質水平從Q1增加到Q4的正相關性。

討論

目前的研究說明最初招募用于分析的兩個受試者群體的異質性。盡管其納入基于癥狀學、TFBUT和角膜染色的差異標準,但是在淚液成分分析中沒有識別到兩個群體之間的顯著差異。

在一些實施例中,本發明的方法提供了一種用于測量干眼癥的方法,包括淚液成分分析。在一些實施例中,本發明的方法提供了一種用于測量干眼癥的方法,包括淚液成分分析,并將淚液成分分析與諸如但不限于Schirmer測試、TFBUT等的測試進行比較,以便獲得信息來治療被診斷為干眼病的患者。

四分位數分析顯示了傳統度量與作為淚液成分的一部分的測試參數之間的關系。一個例外是TFBUT,其只表現出與任何測量的淚液成分的適度相關性。相比之下,角膜染色的措施(例如劣質染色,表6)與測試參數的變化密切相關。這與蒸發性干眼癥的診斷一致,其中淚液的含水量降低將導致所有淚液成分的濃度明顯增加。或者,淚液成分濃度的增加可能歸因于眼表面窘迫的炎癥反應,其引起嚴重到粘液淚液分泌物的比率的改變。此外,更大量的乳鐵蛋白與更大染色和更低Schirmer分數相關;此外,乳鐵蛋白顯示出與較低的TFBUT的顯著相關性。

在一些實施例中,本發明的方法包括使用至少一個診斷測試。在一些實施例中,在進行健康和干眼病受試者的淚液成分的這種比較中,獲得乘法效應。在一些實施例中,使用試劑盒來提供嚴重患者與健康受試者之間的評估。

實例2:根據本發明的一些實施例的淚液樣品中溶菌酶的測量

在健康受試者和符合輕度至中度干眼癥的一個或多個標準的受試者中檢查了主要淚液成分的水平。以下實驗說明了用于干眼癥評估的基準測試與淚液成分的定量測量之間的比較。用于定量測量至少一種淚液成分的測試的實例是角膜染色、Schirmer測試、TFBUT、以及包括OSDI問卷和Ora-CalibraTM眼部不適分數的提供的癥狀評估。OSDI是一個12個問題的評估,其已經成為干眼癥狀的標準。用于不適的Ora-CalibraTM評估也通過允許患者回答問題來提供對癥狀的測量,其中與OSDI相比,問題的數量減少。使用毛細管收集淚液樣品,然后分析淚液成分。測量的淚液成分是溶菌酶。

淚液成分測定和測量方法

使用快速測試條(淚液分析條)和試劑以利用半定量技術測量乳鐵蛋白水平;其中對于每種類型的測定,半定量技術遵循固定的運行時間,使用HP掃描儀型號Scanjet 200掃描條帶。使用功能變亮/變暗優化掃描圖:加亮-(-)50;陰影-(-)69;中色調-(-)50;γ-1.7,然后記錄信號強度(如圖4所示)。與一系列對照線的強度相比,使用強度測試線的半定量估計來進行淚液成分的測定。

實驗設計

受試者群體:用于研究的受試者包括符合下表中列出的納入和排除標準的18歲以上的任何人。研究群體包括兩組受試者(組A,如以上實例1中表1所示,組B,如以上實例1中表2所示),每組的數量大致相等(每組約100個受試者):

本發明方法的一個示例性實施例是由約200名受試者組成的前瞻性單中心單次訪問平行組數據和淚液收集研究。有一次定期的研究訪問,篩選受試者;將那些符合資格標準的人招募到這項研究中。

淚液樣品收集:淚液樣品收集的步驟根據以上實例1中所述的方法。

溶菌酶測定:測定允許使用識別酶的特異性抗體直接檢測人淚液中的溶菌酶。測試條采用半定量側流免疫層析技術。將淚液樣品用磷酸鹽鹽水緩沖液1:200稀釋(即進一步至淚液的1:3初始稀釋度),將10μl 1:200稀釋的樣品置于樣品墊上。額外的40μl洗滌溶液允許淚液樣品遷移,潤濕綴合物墊。與金顆粒綴合的特異性綿羊多克隆抗體結合溶菌酶。與溶菌酶結合的綴合抗體流過硝基纖維素膜。當金綴合物/溶菌酶復合物到達測試區時,其與固定在膜表面的二級綿羊抗溶菌酶抗體反應。硝基纖維素上的第二區域被浸漬(例如,用山羊抗綿羊抗體)并配置為結合綿羊抗溶菌酶-金綴合物。形成第二條線并被稱為對照線。對照線表示測試有效性。值得注意的是,兩種抗溶菌酶抗體(即,綿羊抗溶菌酶或兔抗溶菌酶)可以識別酶上的不同表位。

在一個示例性實施例中,將1.5mg/ml(0.75-2.5mg/ml)綿羊抗溶菌酶浸漬到具有高蛋白結合能力的硝基纖維素的層析膜上(例如,但不限于,mdi C PH-N-5560)。通過例如但不限于肉眼觀察浸漬,呈1mm寬的線。抗體溶液包含以下:a.緩沖液,例如pH 7.4的磷酸鹽緩沖鹽水或pH值6.5至9.0的Tris、HEPES、Borax或MES緩沖液;b.2%海藻糖(也可以是蔗糖),也可以在1%至4%糖范圍內;C.2%乙醇,也可以在1%至4%范圍內。

將抗體浸漬的硝基纖維素在50℃下干燥10分鐘以使蛋白質固定在硝基纖維素上。在一個實施例中,通過溫度調節,結合可以在60℃至37℃之間進行5至24小時(例如,在較高溫度下更快的結合)。

在一個示例性實施例中,綿羊抗溶菌酶以528nm下每OD1/ml膠體金4μg蛋白質的比率與金顆粒(例如20nm、40nm、60nm或100nm)綴合。綴合在pH7與pH9之間的pH條件下進行,例如pH8。

金綴合物的有效濃度范圍可以是OD 0.5/ml至OD 2/ml。將30μg/ml游離綿羊抗溶菌酶(也可使用兔抗溶菌酶)加入綴合物溶液中以調節測試靈敏度。如圖4所示,目測估計(即半定量測量)線強度。當溶菌酶濃度為25μg/ml時,形成1的線強度(顯示例如線強度與溶菌酶濃度之間的等效性)。反應混合物也包括洗滌試劑(WR),其提供化學環境以及從硝基纖維素膜上清除金殘留物。WR包含以下:(a)PBS X 1pH 7.4(可以在7至9范圍內),(b)1%牛血清白蛋白(BSA)可以在0.5至3%范圍內且不含脂肪酸),(c)0.05%至2%吐溫20,例如,但不限于0.1%吐溫20,(d)0.05%N-月桂酰肌氨酸和0.4%PEG以減少與硝基纖維素膜的非特異性結合,其中N-月桂酰肌氨酸的濃度為0.01-1%。

淚膜破裂時間測試:根據上述實例1中所述的方法進行該步驟。

角膜熒光素染色:根據上述實例1中所述的方法進行該步驟。

未麻醉的Schirmer測試:根據上述實例1中所述的方法進行該步驟。

Ora CalibraTM眼部不適分級:根據上述實例1中所述的方法進行該步驟。

Ora CalibraTM眼部不適&4-癥狀問卷:根據上述實例1中所述的方法進行問卷。

對于研究方案依從性,遵循保護受試者的眼部安全性的專業護理標準。符合入選標準的受試者提供人口統計信息,醫療和眼部病史以及人工淚液使用(如果適用)。臨床工作人員確認受試者在研究前一小時內沒有使用人工淚液,然后指導受試者通過以下步驟:

1.受試者完成問卷和Ora CalibraTM眼部不適&4-癥狀問卷。

2.受試者和工作人員檢查了來源文件,以基于當前藥物和病史確認受試者符合所有的納入/排除標準。

3.臨床工作人員使用毛細血管從受試者右眼收集6-25微升淚液。工作人員用受試者篩選號標記收集小瓶,并將毛細管內容物倒入小瓶中。

4.在從右眼收集的淚液體積低于6微升的情況下,從左眼抽取樣品,將毛細管內容物倒入另一個標有相同受試者篩選號的干凈小瓶中。

5.臨床工作人員對收集眼進行淚膜破裂時間測試。

6.臨床工作人員進行角膜熒光染色,并檢查收集眼的眼表面。

7.如果從右眼收集6或更多微升,但是受試者右眼不符合淚膜破裂時間或熒光素染色納入標準,則對左眼重復步驟3-6。

8.臨床工作人員對收集眼進行未麻醉的Schirmer測試。

9.臨床工作人員審查結果,根據項目3-8收集的數據確定患者是否符合所有納入/排除標準。

10.符合所有標準的患者被分配一個受試者研究號,并根據對健康或疑似干眼癥患者的診斷對標簽進行分類。

11.如果適用,記錄不良事件。

使用以下參數處理和測試樣品:

1.使用微量移液管測量收集的淚液體積。添加兩倍測量體積的磷酸鹽緩沖鹽水(PBS),最終稀釋度為1:3。

2.利用PBS將稀釋的淚液進一步連續稀釋至以下稀釋度:1:50、1:100和1:200。

3.將兩微升的稀釋樣品與18微升金綴合物混合物在微管中混合。將相關測試條蘸入混合物中4分鐘。

4.將額外的25微升洗滌溶液加入管中,以從反應區中清除過量的染料。

5.顯色6分鐘后,用薄紙將測試條輕輕吸干,并用臺式掃描儀掃描。

6.根據圖4所示的強度等級,對測試強度進行量化。

能力分析:表8給出了所選樣品量的能力。

表8

使用精確二項式方法估計能力,其中考慮了兩個協同的主要療效指標(endpoint)(靈敏度和特異性),并且其中“N”表示僅正值(或僅負值)情況的數目。因此,整個樣品量加倍。

表9說明了“精確度”參數,其被定義為置信區間(CI)的一半長度。CI是群體參數的區間估計。CI是觀察到的區間(即從觀察結果計算出),原則上樣品間不同,如果重復實驗,通常包括感興趣的參數。

表9

結果與分析

研究的主要結果是用于干眼癥的基準測試(例如TFBUT、角膜染色、Schirmer測試和OSDI問卷)與淚膜成分(例如溶菌酶)的測試結果的比較。

分析中包括從符合入選標準的患者眼睛獲得的所有收集的樣品。這項研究的目標是開發一個評估工具以比較用于干眼癥的基準測試和測試淚膜化合物溶菌酶的試劑盒。數據分布從最低值到最高值,并與其它參數進行比較,以確定正和負相關性。圖4說明了測試線強度與分析物濃度的相關性。在一些實施例中,降低的測試線強度與用于干眼癥的測試(例如,Schirmer測試、角膜染色、OSDI等)相關。

在一些實施例中,測試線的相關性表明根據本發明的一些實施例的測試分析中的較低量(比如,例如0至1μg/ml)的溶菌酶與通過選自由Schirmer測試、角膜染色測試、ODSI和TFBUT組成的群組中的至少一種測試所檢測的較低結果相關。

在這個初步研究中的樣品量(總共198只眼睛,每組99只)不是基于任何能力分析,而是基于足以構建模型用于區分健康淚液和疑似干眼癥淚液并利用不同測試參數評估基準測試的模型的眼睛數量的近似值。

不良事件(AE)包括在淚液收集過程和眼表面評估步驟中報告的任何事件。該臨床研究涉及TFBUT、角膜染色和用于成分分析的眼淚收集。在這些測試中,參與者可能已經感覺到異物感。在淚液收集期間,可能出現由于運動而與眼睛直接接觸的情況,導致角膜磨損或眼睛發紅。任何這樣的事件被記錄和如下分級:

輕微:通常是短暫的體征或癥狀,不需要特殊治療,一般不會干擾正常的活動。

中度:可能通過簡單的治療措施改善的體征或癥狀;可能會干擾正常的活動。

嚴重:強烈或虛弱的體征或癥狀,干擾正常的活動。恢復通常借助于治療措施。

總共198個受試者完成研究,包括126個女性和72個男性。下表10中列出了根據入選標準A或B的受試者分類。符合入選標準的那些人在本研究中不匹配年齡或性別。

表10

男性 女性 平均年齡 A組健康的 41 59 45.5 B組疑似DE 31 67 58.6

在每個研究組中招募的受試者符合健康或疑似干眼癥的入選標準。唯一顯示出兩組間顯著差異的人口統計標準是年齡;初步分析顯示兩組之間的任何淚液度量無顯著差異。另外,兩組都顯示了基準測試參數的一系列值。根據這一觀察,將所有受試者合并到單個組中,并使用群體四分位數進行分析,假設抽樣群體代表了干眼癥嚴重程度的連續區。使用這個概念,對每個基準測試的測量結果進行排名,并將4個四分位數中每一個的平均值與淚液診斷的測量結果進行比較。

四分位數分析:用于TFBUT、劣質染色和Schirmer測試的四分位數分析總結在表11中。這種方法的重點在于極值,四分位數1和4,因為這些代表了每個度量具有最大差異的那些患者。在所有三個測量中,Q1是具有正常患者預期值的四分位數,Q4是具有干眼癥有關值的四分位數。例如,Q1中的那些具有12.80秒的平均TFBUT,因此將被認為是正常的,而Q4中的那些具有2.34秒的平均TFBUT,這與中度干眼病的診斷一致。當比較每個TFBUT定義的四分位數中測試參數的平均值時,出現了破裂時間度量與淚液成分動力學之間的關聯。Q1與Q4之間TFBUT的減少伴隨著溶菌酶的減少。劣質染色從Q1增加到Q4,并且這種增加與溶菌酶的增加顯著相關。由Schirmer分數定義的四分位數顯示出顯著的負相關性:平均Schirmer分數從Q1下降到Q4的同時,溶菌酶值增加,并顯示了Q1與Q4之間的顯著差異。這種負相關性是由于Schirmer分數的性質,其中較高值(Q1)表明健康的淚液產生。

表11顯示了用于TFBUT、劣質染色和Schirmer測試的四分位數分析。T檢驗值在顯著的(<0.05)情況下用粗體突出顯示。

表11

第二輪四分位數分析使用相同的方法來確定由淚液成分值定義的四分位數是否顯示與干眼癥的體征和癥狀的其它度量的類似相關性。這些數據顯示在表12中。

表12.溶菌酶的四分位數分析。T檢驗值在顯著的(<0.05)的情況下用粗體突出顯示。

表12

溶菌酶四分位數顯示出對于角膜染色測量的顯著差異,其中劣質和整個角膜染色顯示與蛋白質水平從Q1增加到Q4的正相關性。

討論

目前的研究說明最初招募用于分析的兩個受試者群體的異質性。盡管其納入基于癥狀學、TFBUT的差異標準,但是在淚液成分分析中沒有識別到兩個群體之間的顯著差異。觀察到角膜染色和Schirmer測試的顯著差異。

在一些實施例中,本發明的方法提供了用于測量干眼癥的方法,包括淚液成分分析。在一些實施例中,本發明的方法提供了用于測量干眼癥的方法,包括淚液成分分析,并將淚液成分分析與諸如但不限于Schirmer測試、TFBUT等的測試進行比較,以便獲得信息來治療被診斷為干眼病的患者。

四分位數分析顯示了傳統度量與作為淚液成分的一部分的測試參數之間的關系。一個例外是TFBUT,其只表現出與任何測得的淚液成分的適度相關性。相比之下,角膜染色量度(例如劣質染色,表11)與測試參數的變化密切相關。這與蒸發性干眼癥的診斷一致,其中淚液的含水量降低將導致所有淚液成分的濃度明顯增加。或者,淚液成分濃度的增加可能歸因于眼表面窘迫的炎癥反應,其引起嚴重到粘液淚液分泌物的比率的改變。此外,溶菌酶與更大染色和更低Schirmer分數相關;此外,溶菌酶沒有顯示出與TFBUT的顯著相關性。

在一些實施例中,本發明的方法包括使用至少一個診斷測試。在一些實施例中,在進行健康和干眼病受試者的淚液成分的這種比較中,獲得乘法效應。在一些實施例中,使用試劑盒來提供嚴重患者與健康受試者之間的評估。

實例3:根據本發明的一些實施例的淚液樣品中溶菌酶的測量

在健康受試者和符合輕度至中度干眼癥的一個或多個標準的受試者中檢查了主要淚液成分的水平。以下實驗說明了用于干眼癥評估的基準測試與淚液成分的定量測量之間的比較。用于定量測量至少一種淚液成分的測試的實例是角膜染色、Schirmer測試、TFBUT、以及包括OSDI問卷和Ora-Calibra TM眼部不適分數的提供的癥狀評估。OSDI是一個12個問題的評估,其已經成為干眼癥狀學的標準。用于不適的Ora-Calibra評估也通過允許患者回答問題來提供對癥狀的測量,其中與OSDI相比,問題的數量減少。使用毛細管收集淚液樣品,然后分析淚液成分。測得的淚液成分是粘蛋白。

淚液成分測定和測量方法

使用快速測試條(淚液分析條)和試劑以利用半定量技術測量乳鐵蛋白水平;其中對于每種類型的測定,半定量技術遵循固定的運行時間,使用HP掃描儀型號Scanjet 200掃描條帶。使用功能變亮/變暗優化掃描圖:加亮-(-)50;陰影-(-)69;中色調-(-)50;γ-1.7,然后記錄信號強度(如圖5所示)。與一系列對照線的強度相比,使用強度測試線的半定量估計來進行淚液成分的測定。

實驗設計

受試者群體:用于研究的受試者包括符合下表中列出的納入和排除標準的18歲以上的任何人。研究群體包括兩組受試者(組A,如以上實例1中表1所示,組B,如以上實例1中表2所示),每組的數量大致相等(每組約100個受試者):

本發明方法的一個示例性實施例是由約200名受試者組成的前瞻性單中心單次訪問平行組數據和淚液收集研究。有一次定期的研究訪問,篩選受試者;將那些符合資格標準的人招募到這項研究中。

淚液樣品收集:淚液樣品收集的步驟根據以上實例1中所述的方法。

粘蛋白測定:該測定允許使用側流免疫層析測定通過檢測粘蛋白(一種糖蛋白,即包含至少一個糖部分)的糖基團來檢測人淚液中的粘蛋白。首先,將稀釋的淚液樣品置于樣品墊上。然后,將額外數滴洗滌溶液置于樣品墊上以使淚液樣品遷移并潤濕綴合物墊。綴合物墊包含通過生物素-抗生物素蛋白(Avidin)相互作用而被綴合至金顆粒的第一凝集素(例如木菠蘿素(Jacalin))。綴合的凝集素結合淚液樣品中的粘蛋白,并通過硝基纖維素膜向芯遷移。當金綴合物/粘蛋白復合物到達測試區時,金綴合物/粘蛋白與固定于膜表面(即測試線處)的第二凝集素(例如,麥胚凝集素(“WCA”))反應。結合至測試線的金綴合物/粘蛋白的積累形成粉紅色的可視線。然后過量的復合物遷移到含有生物素BSA的第二區域,并結合抗生蛋白鏈菌素金綴合物,形成第二線(對照線)。對照線表明測試有效性。剩余量的綴合物和淚液樣品從硝基纖維素膜遷移到芯墊中。

如下制備測試條:將1mg/ml(0.75-1.5mg/ml)WGA浸漬到硝基纖維素的層析膜上(例如,Whatman紙,FF120)。浸漬呈1mm寬線條形狀。凝集素溶液額外地包含以下:(1)緩沖液,例如pH 7.4的磷酸鹽緩沖鹽水或pH值6.5-9.0的Tris、HEPES、Borax或MES緩沖液;(2)2%海藻糖或蔗糖,濃度為1%-4%;(3)1-4%乙醇(例如,但不限于1%、2%、3%、4%乙醇)。將WGA浸漬的硝基纖維素在50℃下干燥10分鐘以使蛋白質與硝基纖維素結合。WGA與硝基纖維素的結合也可以在37-60℃下進行5至24小時,其中較高的溫度將允許較短的孵育時間。通過以例如但不限于11:1、22:1或33:1的比率將生物素與木菠蘿素綴合使生物素與木菠蘿素結合。生物素-木菠蘿素以5μg/ml生物素-木菠蘿素和OD0.5/ml-OD2.0/ml,例如但不限于OD1/ml金-抗生蛋白鏈菌素的比率與抗生蛋白鏈菌素-金綴合物結合。反應復合物也可以包括洗滌試劑,其從硝基纖維素膜上清除過量的金綴合物。洗滌試劑可以包含以下:(1)pH 7.4的PBS x 1(可以在pH 7.0-9.0范圍內);(2)1%不含脂肪酸的牛血清白蛋白(0.5%-3.0%);(3)0.1%吐溫20(可以在0.05%-2.0%范圍內);或其任何組合。此外,可將0.05%的十二烷基硫酸鈉以0.01%至1.0%的濃度加入洗滌試劑中。關于圖5,當粘蛋白被測量為12μg/ml時,形成1的線強度。

淚膜破裂時間測試:根據上述實例1中所述的方法進行該步驟。

角膜熒光素染色:根據上述實例1中所述的方法進行該步驟。

未麻醉的Schirmer測試:根據上述實例1中所述的方法進行該步驟。

Ora CalibraTM眼部不適分級:根據上述實例1中所述的方法進行該步驟。

Ora CalibraTM眼部不適&4-癥狀問卷:根據上述實例1中所述的方法進行問卷。

對于研究方案依從性,遵循保護受試者的眼部安全性的專業護理標準。符合入選標準的受試者提供人口統計信息,醫療和眼部病史以及人工淚液使用(如果適用)。臨床工作人員確認受試者在研究前一小時內沒有使用人工淚液,然后指導受試者通過以下步驟:

1.受試者完成問卷和Ora CalibraTM眼部不適&4-癥狀問卷。

2.受試者和工作人員檢查了來源文件,以基于當前藥物和病史確認受試者符合所有的納入/排除標準。

3.臨床工作人員使用毛細血管從受試者右眼收集6-25微升淚液。工作人員用受試者篩選號標記收集小瓶,并將毛細管內容物倒入小瓶中。

4.在從右眼收集的淚液體積低于6微升的情況下,從左眼抽取樣品,將毛細管內容物倒入另一個標有相同受試者篩選號的干凈小瓶中。

5.臨床工作人員對收集眼進行淚膜破裂時間測試。

6.臨床工作人員進行角膜熒光染色,并檢查收集眼的眼表面。

7.如果從右眼收集6或更多微升,但是受試者右眼不符合淚膜破裂時間或熒光素染色納入標準,則對左眼重復步驟3-6。

8.臨床工作人員對收集眼進行未麻醉的Schirmer測試。

9.臨床工作人員審查結果,根據項目3-8收集的數據確定患者是否符合所有納入/排除標準。

10.符合所有標準的患者被分配一個受試者研究號,并根據對健康或疑似干眼癥患者的診斷對標簽進行分類。

11.如果適用,記錄不良事件。

使用以下參數處理和測試樣品:

1.使用微量移液管測量收集的淚液體積。添加兩倍測量體積的磷酸鹽緩沖鹽水(PBS),最終稀釋度為1:3。

2.利用PBS將稀釋的淚液進一步連續稀釋至以下稀釋度:1:50、1:100和1:200。

3.將兩微升的稀釋樣品與18微升金綴合物混合物在微管中混合。將相關測試條蘸入混合物中4分鐘。

4.將額外的25微升洗滌溶液加入管中,以從反應區中清除過量的染料。

5.顯色6分鐘后,用薄紙將測試條輕輕吸干,并用臺式掃描儀掃描。

6.根據圖5所示的強度等級,對測試強度進行量化。

能力分析:表13給出了所選樣品量的能力。

表13

使用精確二項式方法估計能力,其中考慮了兩個協同的主要療效指標(靈敏度和特異性),并且其中“N”表示僅正值(或僅負值)情況的數目。因此,整個樣本量加倍。

表14說明了“精確度”參數,其被定義為置信區間(CI)的一半長度。CI是群體參數的區間估計。CI是觀察到的區間(即從觀察結果計算出),原則上樣品間不同,如果重復實驗,通常包括感興趣的參數。

表14

結果與分析

研究的主要結果是用于干眼癥的基準測試(例如TFBUT、角膜染色、Schirmer測試和OSDI問卷)與淚膜成分(例如粘蛋白)的測試結果的比較。

分析中包括從符合入選標準的患者眼睛獲得的所有收集的樣品。這項研究的目標是開發一個評估工具以比較用于干眼癥的基準測試和測試淚膜化合物粘蛋白的試劑盒。數據分布從最低值到最高值,并與其它參數進行比較,以確定正和負相關性。圖5說明了測試線強度與分析物濃度的相關性。在一些實施例中,降低的測試線強度與用于干眼癥的測試(例如,Schirmer測試、角膜染色、OSDI等)相關。

在一些實施例中,測試線的相關性表明根據本發明的一些實施例的測試分析中的較低量(比如,例如0至1μg/ml)的粘蛋白與通過選自由Schirmer測試、角膜染色測試、ODSI和TFBUT組成的群組中的至少一種測試所檢測的較低結果相關。

在這個初步研究中的樣本量(總共198只眼睛,每組99只)不是基于任何能力分析,而是基于足以構建模型用于區分健康淚液和疑似干眼癥淚液并利用不同測試參數評估基準測試的模型的眼睛數量的近似值。

不良事件(AE)包括在淚液收集過程和眼表面評估步驟中報告的任何事件。該臨床研究涉及TFBUT、角膜染色和用于成分分析的眼淚收集。在這些測試中,參與者可能已經感覺到異物感。在淚液收集期間,可能出現由于運動而與眼睛直接接觸的情況,導致角膜磨損或眼睛發紅。任何這樣的事件被記錄和如下分級:

輕微:通常是短暫的體征或癥狀,不需要特殊治療,一般不會干擾正常的活動。

中度:可能通過簡單的治療措施改善的體征或癥狀;可能會干擾正常的活動。

嚴重:強烈或虛弱的體征或癥狀,干擾正常的活動。恢復通常借助于治療措施。

總共198個受試者完成研究,包括126個女性和72個男性。下表15中列出了根據入選標準A或B的受試者分類。符合入選標準的那些人在本研究中不匹配年齡或性別。

表15

男性 女性 平均年齡 A組健康的 41 59 45.5 B組疑似DE 31 67 58.6

在每個研究組中招募的受試者符合健康或疑似干眼癥的入選標準。唯一顯示出兩組間顯著差異的人口統計標準是年齡;初步分析顯示兩組之間的任何淚液度量無顯著差異。另外,兩組都顯示了基準測試參數的一系列值。根據這一觀察,將所有受試者合并到單個組中,并使用群體四分位數進行分析,假設抽樣群體代表了干眼癥嚴重程度的連續區。使用這個概念,對每個基準測試的測量結果進行排名,并將4個四分位數中每一個的平均值與淚液診斷的測量結果進行比較。

四分位數分析:用于TFBUT、劣質染色和Schirmer測試的四分位數分析總結在表16中。這種方法的重點在于極值,四分位數1和4,因為這些代表了每個度量具有最大差異的那些患者。在所有三個測量中,Q1是具有正常患者預期值的四分位數,Q4是具有干眼癥有關值的四分位數。例如,Q1中的那些具有12.80秒的平均TFBUT,因此將被認為是正常的,而Q4中的那些具有2.34秒的平均TFBUT,這與中度干眼病的診斷一致。當比較每個TFBUT定義的四分位數中和/或角膜染色的測試參數的平均值時,出現了破裂時間度量與淚液成分動力學之間的關聯。Q1與Q4之間TFBUT的減少伴隨著粘蛋白的減少。由Schirmer分數定義的四分位數顯示出負相關性,例如,當平均Schirmer評分從Q1降低至Q4時,粘蛋白的量增加。粘蛋白定義的四分位數顯示出與角膜染色分數的顯著相關性,并且也表現出與癥狀分數OSDI和Ora Calibra眼部不適分數的相關性。增加的粘蛋白值與更大的癥狀分數、更強的角膜染色分數和降低的Schirmer分數相關。

表16顯示了用于TFBUT、劣質染色和Schirmer測試的四分位數分析。T檢驗值在顯著的(<0.05)情況下用粗體突出顯示。

表16

第二輪四分位數分析使用相同的方法來確定由淚液成分值定義的四分位數是否顯示與干眼癥的體征和癥狀的其它度量的類似相關性。這些數據顯示在表17中。

表17.粘蛋白的四分位數分析。T檢驗值在顯著的(<0.05)情況下用粗體突出顯示。

表17

與淚腺蛋白粘蛋白有關的四分位數顯示出對于角膜染色測量的顯著差異,其中劣質和整個角膜染色以及Schimer測試顯示與蛋白質水平從Q1增加到Q4的正相關性。

討論

目前的研究說明最初招募用于分析的兩個受試者群體的異質性。盡管其納入基于癥狀學、TFBUT和劣質角膜染色的差異標準,但是在淚液成分分析中沒有識別到兩個群體之間的統計學上的顯著差異。

在一些實施例中,本發明的方法提供了用于測量干眼癥的方法,包括淚液成分分析。在一些實施例中,本發明的方法提供了用于測量干眼癥的方法,包括淚液成分分析,并將淚液成分分析與諸如但不限于Schirmer測試、TFBUT等的測試進行比較,以便獲得信息來治療被診斷為干眼病的患者。

四分位數分析顯示了傳統度量與作為淚液成分的一部分的測試參數之間的關系。一個例外是TFBUT,其只表現出與任何測得的淚液成分的適度相關性。相比之下,角膜染色的量度(例如劣質染色,表16)與測試參數的變化密切相關。這與蒸發性干眼癥的診斷一致,其中淚液的含水量降低將導致所有淚液成分的濃度明顯增加。或者,淚液成分濃度的增加可能歸因于眼表面窘迫的炎癥反應,其引起嚴重到粘液淚液分泌物的比率的改變。

在一些實施例中,本發明的方法包括使用至少一個診斷測試。在一些實施例中,在進行健康和干眼病受試者的淚液成分的這種比較中,獲得乘法效應。在一些實施例中,使用試劑盒來提供嚴重患者與健康受試者之間的評估。

實例4:根據本發明的一些實施例的淚液樣品中多種成分的測量

開發用于DES的更可靠診斷的一種方法是健康受試者和DES受試者中的主要淚液成分的比較檢查。測量多種淚液組成的目的是確定哪些量度或量度的組合可能顯示與DES的已建立的量度的可靠的相關性,因此代表新的診斷模式的基礎。在對健康和DES患者的淚液成分進行這種比較時,觀察到組合的測定可能提供潛在的乘法診斷效果。

在本實例中概述的研究中,受試者接受常用的基準測試,包括角膜染色、Schirmer測試、TFBUT和使用OSDI問卷的癥狀評估。這些基準測試用來根據在用于其它干眼綜合征診斷產品的在先FDA監管批準程序中使用的已建立的評分矩陣來分級每個受試者疾病的嚴重程度。從每個受試者收集的淚液樣品使用針對5種淚液成分的測定進行分析,目的是區分健康受試者的淚液與具有干眼綜合癥的受試者的淚液。對淚液樣品進行溶菌酶、乳鐵蛋白、基質金屬蛋白酶9、白蛋白和粘蛋白的定量分析,每個按照0.1至2的順序尺度(ordinal scale)進行評分,增量為0.25。測定結果由兩個獨立讀取器讀取作為內部對照;在98%以上的情況下,讀取器之間的差異是不顯著的。

本實例中概述的這項研究的目的是基于用于其它干眼綜合癥產品的在先FDA監管批準程序中的FDA定義,評估所開發測定在健康受試者以及干眼癥受試者的淚液中的有效性(見以下的納入和排除標準)。

這是一個前瞻性單中心單次訪問平行組數據和淚液收集研究。有一次定期的研究訪問,篩選受試者,如果他們符合資格標準則被招募到這項研究中。源文件作為所收集研究數據的CRF。在這項研究中沒有測試制品。

在開始本方案指定的任何程序(包括篩選程序)前,從受試者獲得書面知情同意。原始簽署的知情同意保留所有受試者的受試者記錄。對于研究方案依從性,遵循保護受試者的眼部安全性的專業護理標準。

研究群體的選擇

將研究群體分成兩組:

A組:眼睛健康的受試者(對照;約30名受試者)

B組:干眼綜合癥受試者(1-4等級;約40名受試者)。

納入和排除標準

納入:為了有資格納入,受試者是:

1.至少30歲,可以是任何種族和性別;

2.能夠閱讀、簽名和注明IRB批準的知情同意的日期。此外,知情同意必須由同意該課題的個人簽字并注明日期;

3.同意允許從雙眼收集淚液樣本;

4.愿意遵守研究程序和訪問日程;

5.符合陰性對照、1級、2級或3-4級的適用嚴重等級標準;

排除:如果以下情況,則排除受試者:

1.受試者對局部麻醉劑或熒光素染料過敏;

2.受試者在過去3個月內具有眼部損傷、創傷或眼部手術史;

3.受試者已知具有淚道系統的阻塞;

4.受試者目前進行過例如青光眼、變態反應或結膜炎的慢性眼睛綜合癥的藥物治療;

5.受試者患有一個病癥,主要研究者認為這會干擾最佳的研究參與,或者會給受試者帶來特殊的風險;

6.受試者在過去7天內戴過隱形眼鏡;

7.受試者在招募30天內使用調查研究藥物或研究裝置;

8.受試者曾做過角膜屈光手術,包括RK、LASIK或PRK手術;

9.受試者目前患有活躍性眼內炎癥或眼內炎癥史,例如,葡萄膜炎。

10.受試者在過去30天內使用口服多西環素、皮質類固醇或免疫調節劑;

11.受試者在過去30天內接受了局部眼用皮質類固醇、局部眼用非甾體(NSAID)治療或局部眼用環孢菌素;

12.受試者是懷孕或哺乳的女性;

13.受試者在淚液收集前14天內曾使用過任何局部眼科藥物,不包括人工淚液;或者

14.受試者在淚液收集24小時內使用過任何人工淚液。

研究程序

嚴重性分級方案:用于限定對照和干眼癥受試者的分級方法基于以下分類方案:

表18-干眼分級

研究目標招募:按受試者等級的招募如下:

陰性對照:約30個受試者

1級:約5個受試者

2級:約5個受試者

3-4級:約30個受試者。

訪問和檢查:訪問1(基線和淚液收集):

1.獲得人口統計信息、醫療和眼科病史以及人工淚液使用(如果適用)。

2.指示受試者完成問卷和Ora CalibraTM眼部不適&4-癥狀問卷。

3.進行視敏度。

4.進行裂隙燈檢查。

5.對雙眼進行瞼板腺評估。

6.使用毛細管從受試者右眼收集6-25微升淚液。

7.對收集眼進行淚膜破裂時間測試。

8.對收集眼進行角膜熒光素染色并檢查眼表面。

9.對收集眼進行未麻醉的Schirmer測試。

10.分配受試者研究號,根據診斷等級在標簽上記錄。

11.如適用,記錄任何不利事件。

訪問2程序:如果受試者的訪問1淚液不能被分析(例如體積不足),則要求受試者返回進行第二次訪問以收集淚液。

1.進行視敏度。

2.進行裂隙燈檢查。

3.使用毛細管從受試者的合格眼收集6-25微升淚液。

分析和安全變量

淚液測量:分析淚液中溶菌酶、乳鐵蛋白、基質金屬蛋白酶9、白蛋白和粘蛋白的總量度,在邏輯回歸中作為按0.1至2的可視線強度等級分級的解釋性變量,增量為0.25,以確定與1-4級干眼癥受試者或健康受試者的關聯。

淚液成分以單變量方式分析以與干眼癥相關聯。使用正向選擇(forward selection)程序,其中將最初的解釋性變量放置在模型中后,將額外的主效應項(在雙側α=0.10的單變量分析中是顯著的)放置在模型中以及相應的雙向交互項和其它主效應項已與模型中,添加項并保持在雙側α=0.05下。如果交互項符合要添加的標準,則還添加主效應項。

干眼癥評估:如上所述對受試者篩查干眼綜合癥的體征和癥狀。表19招募的受試者人口統計

結果

總共74位受試者完成研究,包括5位分別分類為1級或2級干眼癥,34位受試者具有3級或4級以及30位健康對照。表5-2總結了人口統計。干眼綜合癥患者更可能是女性(3/4級受試者為34/44,對照為15/30),而且更可能年齡較大。

初始篩選的結果:淚液成分分析結果顯示,在對每一種的單變量Wald卡方分析中,僅白蛋白顯示出與總干眼癥分數(P=0.0370)的顯著(P小于0.05)相關性。

淚液分析結果建模:總共74名受試者,44名1-4級干眼癥和30名健康受試者被包括在預測模型的開發中。作為該過程的第一步,建立了基于白蛋白測量的預測算法。只使用白蛋白的模型是:

表20:模型0-僅白蛋白

使用這些項,給定淚液白蛋白分數的干眼癥(1-4級)受試者的概率計算如下:

在計算這個概率后,基于概率將受試者分配到一個組(干眼癥或健康的)。使用50%的截止概率,該模型在34/44=77.4%的時間正確地將干眼癥受試者分類為患有干眼癥,并且在9/30=30.0%的時間正確地將健康受試者分類為健康的。

在將截止概率增加至60%后,模型在30/44=68.2%的時間正確地將干眼癥受試者分類為患有干眼癥,并且在19/30=63.3%的時間正確地將健康受試者分類為健康的。

在組合模型中,將所有變量與每個雙向交互一起輸入模型中;實施反向選擇程序用以去除在雙側α=0.10下不顯著的項。如果交互項符合要添加的標準,則還要求主效應項。由于西班牙裔/拉丁裔受試者數量小,所以模型擬合存在問題,包括模型種族。因此,去除種族及其所有雙向交互。

所得模型產生白蛋白、乳鐵蛋白、年齡、性別和白蛋白*乳鐵蛋白作為顯著的解釋性變量,并且具有以下最大似然估計以估計身為3/4級干眼癥受試者的受試者的對數發生比:

表21:模型1-白蛋白乳鐵蛋白+人口統計

基于該模型,用下列表達式計算給定白蛋白、乳鐵蛋白、年齡和性別分數的干眼癥(GI-4)受試者的概率:

在計算這個概率后,然后基于該概率將受試者分配到一個組(干眼癥或健康的)。使用50%的截止概率,該模型在39/44=88.6%的時間正確地將干眼癥受試者分類為患有干眼癥,并且在23/30=76.7%的時間正確地將健康受試者分類為健康的。

在將截止概率增加至55%后,模型在37/44=84.1%的時間正確地將干眼癥受試者分類為患有干眼癥,并且在24/30=80.0%的時間正確地將健康受試者分類為健康的。

進一步將截止概率增加到60%,模型在36/44=81.8%的時間正確地將干眼癥受試者分類為患有干眼癥,并且在26/30=86.7%的時間正確地將健康受試者分類為健康的。

該模型的結果證明選擇55%或60%的截止概率產生大于或等于80%的靈敏度和特異性。

將溶菌酶單獨添加到模型1中沒有產生模型的靈敏度或特異性的任何差異。相比之下,添加交互項溶菌酶*白蛋白和溶菌酶*乳鐵蛋白確實因交互項產生了額外的預測能力,所以構建了組合所有這些項的第二個模型。

表22:模型2-白蛋白/溶菌酶/乳鐵蛋白/人口統計

使用50%的截止概率,該模型在40/44=90.9%的時間正確地將干眼癥受試者分類為患有干眼癥,并且在23/30=76.7%的時間正確地將健康受試者分類為健康的。

在將截止概率增加至55%后,模型在38/44=86.4%的時間正確地將干眼癥受試者分類為患有干眼癥,并且在26/30=86.7%的時間正確地將健康受試者分類為健康的。

進一步將截止概率增加到60%,模型在36/44=81.8%的時間正確地將干眼癥受試者分類為患有干眼癥,并且在27/30=90.0%的時間正確地將健康受試者分類為健康的。

添加溶菌酶以及溶菌酶*白蛋白和溶菌酶*乳鐵蛋白交互在每個截止概率下略微提高了靈敏度和特異性。

在研究過程中沒有報道出不良事件或安全問題。

討論和總結論

本實例中概述的研究的目的是評估本發明的方法在健康受試者以及具有干眼綜合癥的受試者的淚液中的有效性。首先,使用標準化的分級系統來定義和區分健康受試者群體與具有不同等級的干眼綜合癥的那些群體。這個評分方案是由四個確定的基準測試組成,用于評估干眼癥的體征和癥狀。這個定義先前用于美國監管臨床試驗和稱為的診所(in-office)干眼癥篩選測試的FDA批準過程,這是一種基于淚液MMP9水平檢測的測試。

也對使用標準化系統分級的研究受試者測定基于其提供干眼嚴重性的客觀測量的潛力而選擇的小組淚液成分。將觀察到的線強度和受試者人口統計數據用于構建預測性統計模型,作為判斷哪種開發的測定可以提供最佳診斷能力的手段。

所開發測定的結果表明白蛋白是預測模型所基于的最佳被測物(assay),因為它顯示識別DES受試者的最高有效性。然而,額外測定的納入提供了甚至更高靈敏度和特異性的機會。為此,并且因為我們知道DES是一個多因素綜合癥的這個事實,所以我們進行了所有的測定,然后將它們結合到一個模型中來問這個問題,給以每個受試者的淚液成分分數,靈敏度和特異性可以是這些成分在其診斷DES的能力方面上的組合。

測試靈敏度表示正確識別為具有DES的受試者的數目,而特異性表示正確識別為健康對照的受試者的數目。這些值可以組合在陽性預測值(PPV)中,這是衡量那些確定為DES患者具有干眼癥的受試者的哪個部分。理想的測試將具有高靈敏度和高特異性。表23顯示了基于不同測定結果的不同模型的靈敏度和特異性的比較。

就目前而言,在市場上有兩個主要的DES診斷商業測試,都涉及患者群體的異質性并且依靠單一參數進行中繼,并試圖診斷多因素疾病-(診斷使用點為炎癥標記物MMP914提供了陽性或陰性測定)和系統,其提供了在302至328mOsm范圍內的淚液滲透壓的數值輸出,其范圍包括正常和超高滲透壓值。裝置和滲透壓系統提供被設計用于設置門診訪問的客觀的診斷測試;兩者在贊助的臨床試驗中表現良好。

表23:模型比較

來自模型2(表7-1)的靈敏度和特異性值與包括滲透壓系統或的商業診斷(表24)是一致的。這個結果支持了模型2組合測定作為干眼癥診斷的潛在用途。特別值得注意的是,研究的評分方案使用了這一研究中使用的同一組用于干眼癥的診斷標準14,這是比較不同測試性能的主要變量。

研究結果還顯示,模型2能夠以優于明確的現有測試,特別是在臨床醫生辦公室的環境下通常進行的測試的靈敏度和特異性診斷干眼癥:Schirmer測試、TFBUT、癥狀問卷(如ODSI)或角膜染色。

表24:其它干眼癥測試的特征

雖然在一些測試中,和裝置都表現出良好的靈敏度和特異性,但在這兩種情況下都存在關于它們作為診斷方法(diagnostic)的整體可靠性的爭論,這主要是因為這兩個測試涉及患者群體的異質性并且依靠單一參數來試圖診斷多因素疾病。例如,最近的幾項研究得出結論:基于滲透壓測量與干眼癥的其它體征或癥狀之間沒有相關性。同樣,雖然的初步評估以高敏感度和特異性將其分級,但最近的研究發現與MMP9檢測裝置和其它干眼癥測試的結果幾乎沒有相關性。這種差異可能歸因于樣品收集方法的差異。

系統和目前的研究都從眼睛的側面輕輕地收集淚液。相比之下,采樣涉及下眼臉的相對侵入性的摩擦。直接比較使用兩種收集方法的MMP9水平對于解決MMP9結果差異的基礎是必要的。

對于來自該研究的模型的進一步測試,使用模型2測試來自包括疑似健康和DES患者(根據不同納入標準招募)的DiagnosTear第一臨床測試的數據集(dataset);結果如表25所示。

表25:第一臨床測試結果的測試模型

作為本研究中開發的模型的測試,測試更大的群體或其它干眼癥分級方案是有價值的。例如,包含結膜染色組分的分級方案已用于淚液蛋白質組學的最新研究。此外,用于研究的樣本量也可能由于受試者群體的年齡和性別差異而引起偏差,但這是未來測試中可以解決的問題。

炎癥是干眼癥的病因學中已知的因素,并且暴露于促炎信號的組織響應于血管滲透性增加和來自局部脈管系統的滲出性流體損失。這種滲出物可以隨著電解質濃度增加(即滲透壓增加)和白蛋白濃度升高而影響淚膜組合物。因此,本研究中使用的標志物允許綜合測量干眼癥表型的幾個后遺癥。

使用白蛋白作為診斷信息(diagnostic)具有堅實的科學依據。白蛋白從擴張的結膜血管擴散到淚膜中,在眼睛閉合和創傷期間其濃度增加。因此,淚液的白蛋白水平可被認為是眼表面完整性的標記。此外,任何炎癥事件中的標志性響應之一是血管滲透性的增加,并且隨著增加,期望循環血漿(其中白蛋白濃度在3%至5%范圍內)中可溶性組分從血管系統流出進入淚膜的流量增加是合理的。這項測試(和其它研究)的結果證實,淚膜白蛋白的顯著變化與干眼癥確實有關。

目前還沒有報道證明白蛋白在淚液中的任何清楚的生理學作用。雖然如此,但是眼部炎癥的臨床前研究使Shimura等(2003)認為淚膜中的白蛋白可能代表在流淚減少或杯狀細胞損失后對可溶性粘蛋白減少的代償性響應。研究顯示白蛋白似乎減少大鼠上皮細胞的細胞凋亡,表明血清衍生蛋白對眼部炎癥反應有積極的作用。他們還建議,淚液白蛋白是眼表面完整性的一個特定標記,這一觀點得到了DiagnosTear第一臨床研究結果的支持——其中觀察到白蛋白與角膜染色之間的顯著的正相關。

來自單獨的白蛋白(模型0)的結果比使用多次測定的結果穩健性差,但是可以受益于僅測量單一淚液成分的簡單性,其中過程或測定干擾問題的可能性被最小化。相反,根據染色和其它傳統的干眼癥測試,在OSDI調查中分數低的無癥狀但符合干眼癥標準的受試者中檢測多重測定模型的診斷能力也是值得的。這些受試者由于其不適程度低而特別容易造成眼表面損傷。

已經確定了溶菌酶和乳鐵蛋白在干眼癥中的潛在作用有一段時間,因為它們是已知的淚腺產物和淚膜的健康水相的兩種主要組分。這些蛋白質的水平代表了淚腺產生的量度,因此淚膜中其濃度的任何改變都意味著淚腺功能障礙。淚液中的其它標記物包括炎性產物,例如MMP9;這樣的淚液標記物反映炎癥細胞的局部的淚管周圍浸潤。

就我們所知,我們首次證明,起源于眼中不同位置的蛋白質水平的組合具有診斷DES的顯著能力。將這兩種淚液成分中的一種或多種的變化與白蛋白組合的測試將對眼表面挑戰(challenge)采樣兩種不同的生理反應,因此可以提供更穩健的診斷輸出。

研究結果證實多測定方法可能提供用于識別和治療干眼綜合癥的最佳診斷工具。

在健康受試者和符合輕度至中度干眼癥的一個或多個標準的受試者中檢查了主要淚液成分的水平。以下實驗說明了用于干眼癥評估的基準測試與淚液成分的定量測量之間的比較。用于定量測量至少一種淚液成分的測試的實例是角膜染色、Schirmer測試、TFBUT、和包括OSDI問卷和Ora-CalibraTM眼部不適分數的提供的癥狀評估。OSDI是一個12個問題的評估,其已經成為干眼癥狀的標準。用于不適的Ora-CalibraTM評估也通過允許患者回答問題來提供對癥狀的量度,其中與OSDI相比,問題的數量減少。使用毛細管收集淚液樣品,然后分析淚液成分。測得的淚液成分是粘蛋白。

本文引用的公開在此通過引用整體并入。雖然以上通過參考實例和優選實施例已經說明了本發明的多個方面,但是應該理解,本發明的范圍不是由上述說明限定的,而是由在專利法原則下適當解釋的以下權利要求限定的。

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