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茶黃素?3,3’?雙沒食子酸酯在制備治療抗炎藥物中的應用.pdf

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黃素 雙沒食子酸酯 制備 治療 抗炎藥 中的 應用
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摘要
申請專利號:

CN201710827356.6

申請日:

20170914

公開號:

CN107714691A

公開日:

20180223

當前法律狀態:

有效性:

審查中

法律詳情:
IPC分類號: A61K31/353,A61P29/00,A61P11/00 主分類號: A61K31/353,A61P29/00,A61P11/00
申請人: 廣州暨南生物醫藥研究開發基地有限公司
發明人: 王一飛,袁曉,吳燕婷
地址: 510632 廣東省廣州市黃埔大道西601號暨南大學生命科學技術學院5樓南翼
優先權: CN201710827356A
專利代理機構: 廣州勝沃園專利代理有限公司 代理人: 徐翔
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法律狀態
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CN201710827356.6

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法律狀態類型:

摘要

本發明屬于生物醫藥技術領域,具體涉及茶黃素?3,3’?雙沒食子酸酯在制備治療抗炎藥物中的應用。本發明使用兩種炎癥細胞模型首次證明了小分子單體化合物TF?3的抗炎活性;本發明構建小鼠急性肺損傷炎癥模型首次證明了TF?3在體內抑制肺損傷炎癥的預防和治療的應用。實驗結果證明:TF?3能夠有效抑制炎癥因子TNF?α,IL?1β和IL?6基因的表達,并且能夠抑制急性肺損傷小鼠血清中炎癥細胞因子的產生,能夠防止炎癥細胞的浸潤,治療肺損傷。本發明中小分子單體化合物茶黃素?3,3’?雙沒食子酸酯體具有低毒性、抗炎效果顯著的活性,克服了現有抗炎藥物毒性大、易產生耐藥性等缺陷和問題。

權利要求書

1.茶黃素-3,3’-雙沒食子酸酯在制備治療抗炎藥物中的應用。2.根據權利要求1所述的應用,其特征在于,所述茶黃素-3,3’-雙沒食子酸酯在制備治療急性肺損傷炎癥藥物的應用。3.根據權利要求1所述的應用,其特征在于,所述茶黃素-3,3’-雙沒食子酸酯與藥學上可接受的載體混合,用于制備治療抗炎藥物中的應用。4.根據權利要求3所述的應用,其特征在于,所述茶黃素-3,3’-雙沒食子用藥濃度為酸酯5~100μM。

說明書

技術領域

本發明屬于生物醫藥技術領域,具體涉及茶黃素-3,3’-雙沒食子酸酯在制備治療抗炎藥物中的應用。

背景技術

炎癥是機體在多種外來病原微生物或者壓力應激條件下產生的一種防御反應。過度的炎癥反應是許多疾病的發病基礎,與多種疾病的發生和發展有著密切聯系。全世界每年有數以百萬計的炎癥患者承受著病痛的折磨,因此,開發低毒、有效的抗炎藥物是炎癥患者越來越迫切的需求。

茶黃素-3,3’-雙沒食子酸酯(theaflavin-3,3’-digallate,TF3)是一類具有苯并卓酚酮結構的物質,通過兒茶素苯并環化作用而形成;其分子式為C43H32O20,分子量為868.70,CAS NO.33377-72-9,結構式如下所示:

TF-3具有抗氧化、抗腫瘤、抗菌、抗病毒、具有預防心血管疾病,抗糖尿病,調節血脂,除臭等作用。截至目前為止,已有很多有關紅茶提取物的藥理作用的研究,但大部分研究都集中于茶黃素混合物而非單體,TF-3單體作用機制研究的報道較少。茶黃素-3,3’-雙沒食子酸酯在制備治療抗炎藥物中的應用,至今尚無報道。

發明內容

本發明提供了茶黃素-3,3’-雙沒食子酸酯在制備治療抗炎藥物中的應用。

本發明提供了所述茶黃素-3,3’-雙沒食子酸酯在制備治療急性肺損傷炎癥藥物的應用。

進一步地,所述茶黃素-3,3’-雙沒食子酸酯與藥學上可接受的載體混合,用于制備治療抗炎藥物中的應用。

進一步地,所述茶黃素-3,3’-雙沒食子用藥濃度為酸酯5~100μM。

本發明使用兩種炎癥細胞模型首次證明了小分子單體化合物TF-3的抗炎活性;本發明構建小鼠急性肺損傷炎癥模型首次證明了TF-3在體內抑制肺損傷炎癥的預防和治療的應用。實驗結果證明:TF-3對RAW 264.7、U937、LO-2三種細胞的IC50均大于200μM,說明TF-3對細胞毒性低;TF-3能夠有效抑制炎癥細胞內炎癥因子TNF-α,IL-1β和IL-6基因的表達;在急性肺損傷小鼠中,TF-3能夠抑制急性肺損傷小鼠血清中炎癥細胞因子的產生,能夠有效抑制急性肺損傷小鼠肺組織中炎癥基因TNF-α,IL-1β和IL-6的表達;能夠防止炎癥細胞的浸潤肺組織,從而能夠有效治療肺損傷。本發明中小分子單體化合物茶黃素-3,3’-雙沒食子酸酯體具有低毒性、抗炎效果顯著的活性,克服了現有抗炎藥物毒性大、易產生耐藥性等缺陷和問題。

附圖說明

圖1:TF-3對U937、RAW264.7和LO-2細胞存活率的影響;

圖2:TF-3對LPS誘導的TNF-α,IL-1β和IL-6mRNA水平的影響;

圖3:TF-3對小鼠體重的影響;

圖4:TF-3對急性肺損傷小鼠肺水腫的影響;

圖5:TF-3對急性肺損傷小鼠血清中TNF-α、IL-1β和IL-6因子的影響;

圖6:TF-3對急性肺損傷小鼠肺組織中TNF-αmRNA表達的影響;

圖7:TF-3對急性肺損傷小鼠肺組織中IL-1βmRNA表達的影響;

圖8:TF-3對急性肺損傷小鼠肺組織中IL-6mRNA表達的影響;

圖9:不同急性肺損傷小鼠肺組織炎癥評分柱狀圖。

具體實施方式

下面將結合實施例進一步的詳細說明本發明。需要指出的是,以下說明僅僅是對本發明要求保護的技術方案的舉例說明,并非對這些技術方案的任何限制。本發明的保護范圍以所附權利要求書記載的內容為準。

人急性早幼粒白血病細胞(U937),小鼠單核巨噬細胞(RAW 264.7),人正常肝細胞(LO-2)均購自上海中國科學院細胞庫,培養于37℃,5%CO2的二氧化碳恒溫培養箱中。其中U937細胞使用含10%南美血清(美國GIBCO公司)和100U雙抗(青霉素和鏈霉素,購自上海華壹生物科技有限公司)的1640培養基(美國GIBCO公司)培養,LO-2細胞使用含10%南美血清加100U雙抗(青霉素和鏈霉素)的DMEM培養基(美國GIBCO公司)培養,RAW264.7細胞使用含10%澳洲胎牛血清(美國GIBCO公司)加100U雙抗(青霉素和鏈霉素)的DMEM培養基培養。

四甲基偶氮唑鹽(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT,購自美國Sigma-Alarich公司)溶液:使用分析天平稱取0.10g MTT粉末,溶于20mL的PBS緩沖液中,使用0.22μm的濾膜濾過除菌,分裝于干凈的小青瓶中,用錫箔紙包住小青皮外壁,于4℃冰箱中避光保存。

實施例1 MTT法檢測TF-3對細胞的毒性

所述利用MTT法檢測TF-3對細胞的毒性的具體步驟為:

(1)RAW 264.7、U937、LO-2細胞鋪板:將100μL處于對數生長期的RAW264.7、U937、LO-2細胞均勻鋪在96孔板中,然后放入37℃、5%CO2恒溫培養箱中培養至細胞密度達80~90%,吸棄培養基,用PBS緩沖液清洗一遍細胞,吸棄PBS溶液。

(2)藥物梯度稀釋:用不含血清的DMEM培養基將藥物母液稀釋成不同濃度的藥物工作液,濃度依次為200、100、50、25、12.5、6.25、3.125μM。

(3)加藥處理:每孔加入100μLTF-3稀釋液,每個藥物濃度均設置3個復孔,同時設置空白對照組、正常細胞對照組和溶劑對照組。將加藥后的96孔板放入37℃、5%CO2恒溫培養箱中,分別培養24h、48h后檢測。

(4)加入MTT:96孔板中每孔加入10μL 5mg/mL的MTT溶液,于37℃、5%CO2恒溫培養箱中繼續培養。4h后吸棄MTT溶液,每孔加入100μLDMSO溶液,用錫箔紙包住培養板,于水平搖床上避光低速振搖15min,使藍紫色甲瓚結晶充分溶解。

(5)檢測:設定酶標儀的檢測波長為570nm,背景參考波長為630nm測定OD值。

(6)計算細胞存活率:細胞存活率=加藥組OD值/正常細胞對照組OD值;以細胞存活率數值為縱坐標,藥物濃度為橫坐標,作曲線圖,線性回歸求算出藥物的最大無毒濃度與藥物的半數毒性濃度(IC50),結果如圖1所示。

由圖1可知,TF-3對這三種細胞的IC50均大于200μM,說明TF-3對細胞毒性低。

實施例2建立本發明所述藥物的應用模型

(一)RAW 264.7細胞炎癥反應模型

(1)將細胞懸液稀釋為2×105cells/mL的密度,以每孔1mL加入無菌的12孔板中,輕輕搖勻,確保細胞均勻貼壁。

(2)使用無血清DMEM培養基將1mg/mL LPS母液稀釋成終濃度為100ng/mL的工作液。

(3)培養過夜后,觀察細胞狀態和融合度,狀態良好且密度達到80~90%時,吸棄培養基,設置不加LPS的正常細胞對照組,加入無血清培養基,其余孔加入含有100ng/ml LPS和不同濃度藥物的無血清DMEM培養基,放入細胞培養箱中繼續培養。

(4)6h后提取細胞總RNA,并逆轉錄成cDNA后利用Real Time PCR方法檢測GAPDH、TNF-α、IL-1β和IL-6mRNA的表達情況,以判斷RAW 264.7細胞炎癥反應模型是否建立成功。

(二)U937細胞炎癥反應模型

(1)使用無血清培養基將100μg/mL丙二醇甲醚醋酸酯(phenylmethanesμLfonyl fluoride,PMA)母液稀釋成終濃度為20ng/mL的工作液。

(2)將細胞懸液稀釋為1×106cells/mL的密度,以每孔1mL加入無菌的6孔板中,再加入1mL含20ng/mLPMA的培養基,輕輕搖勻后放入培養箱中繼續培養。

(3)48h后,吸棄培養基,設置不加LPS的正常細胞對照組,加入無血清培養基,其余孔加入含有100ng/mL LPS和不同濃度藥物的無血清1640培養基,放入細胞培養箱中繼續培養。

(4)24h后提取細胞總RNA,并逆轉錄成cDNA后利用Real Time PCR方法檢測GAPDH、TNF-α、IL-1β和IL-6mRNA的表達情況,以判斷U937細胞炎癥反應模型是否建立成功。

實施例3炎癥基因表達水平檢測

(一)提取細胞的總RNA

(1)前期準備:穿好實驗服,戴好口罩和手套;預冷高速冷凍離心機10min,使其溫度降為4℃;準備好不含RNA酶的1000μL、200μL、10μL的槍頭;準備好氯仿、異丙醇和配好的75%乙醇。

(2)裂解細胞:用PBS溶液清洗3遍藥物處理后的細胞,吸棄PBS溶液,立即加入1mLTrizol試劑,室溫放置5min后使用1mL移液器反復劇烈吹打,使細胞裂解充分,將細胞裂解液移入不含RNA酶的1.5mL的EP管中。

(3)相分離:加入200μL氯仿,在渦旋振蕩儀上振蕩或者劇烈顛倒混勻,室溫下靜置5min。4℃,12000g離心15min。

(4)RNA沉淀:小心吸取300~500μL上清(不要吸到白色沉淀)至另一個干凈的無RNA酶的EP管中,加入與上清體積比為1:1的異丙醇,反復顛倒混勻,室溫下靜置10min。4℃,12000g離心10min。

(5)洗滌:吸棄上清,加入之前配好的冷的75%乙醇,輕輕搖振,12000g,4℃離心5min。

(6)干燥:離心后,吸棄上清,并將EP管倒置在干凈的紙巾上,空氣干燥5min。

(7)溶解:根據提取得到的RNA量(EP管底小白點的大小),加入適量的DEPC水溶解RNA,立即測濃度,進行后續的反轉錄實驗,或是保存在-80℃超低溫冰箱中備用。

(二)反轉錄反應

(1)實驗前準備:穿好實驗服,戴好口罩和手套;準備好無RNase的1000μL、200μL、10μL的槍頭和Takara PrimeScriptTM RTMaster Mix(Perfect Real Time)(Cat.#RR036A)試劑盒。

(2)按照說明書中的反應體系和條件進行逆轉錄反應,反應后的溶液可直接用于下一步的Real Time PCR實驗,或在-80℃超低溫冰箱中保存。反應體系如下:

反應條件為:37℃15min,85℃5s,12℃

(3)Real Time PCR

利用軟件Primer Premier 5.0設計Real time PCR檢測引物,引物序列如下:

表1熒光定量PCR引物

Table 1 Primers for Real Time PCR

反應體系如下表2所示:

表2 Real Time PCR反應體系

SsoFastEvaGreenSuperMix 5μL 10μMForwardprimer 0.5μL 10μMReverseprimer 0.5μL cDNA模板 2μL DEPC水 2μL

反應條件為:(1)95℃30s;(2)55℃5s;(3)58℃5s;(4)go to(2)40個循環;(5)65℃to 95℃Increment 0.5℃5s(6)結束。

實施例4 TF-3對脂多糖誘導的炎癥因子mRNA表達水平的影響

按實施例2方法分別建立RAW 264.7細胞炎癥反應模型和U937細胞炎癥反應模型,其中TF-3給藥濃度分別為6.25μM、12.5μM、25.0μM和50μM;然后按實施例3方法進行炎癥因子mRNA表達水平驗證,實驗結果如圖2所示。

由圖2可知,不管是共處理還是預處理,TF-3對LPS誘導的U937和RAW264.7炎癥細胞模型中TNF-α、IL-1β和IL-6mRNA的表達具有顯著的抑制作用。

實施例5 TF-3對LPS誘導小鼠肺水腫的影響

將C57BL/6小鼠隨機分為5組,即正常組、模型組、地塞米松+LPS組、20mg/kg TF-3+LPS組,40mg/kgTF-3+LPS組,每組6只。給藥組分別按20,40mg/kg體重腹腔注射給藥,地塞米松組腹腔注射5mg/kg地塞米松,正常組和模型組分別注射100μL的生理鹽水。給藥1h后,在乙醚輕度麻醉下(在通風廚中操作),用LPS滴鼻刺激小鼠,每鼠按100μg/25g體重滴濃度為10mg/mL的LPS,正常組以等體積生理鹽水滴鼻。LPS滴鼻6h后,用5%的戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉小鼠,采血后取出左肺,PBS清洗1次,用濾紙吸干表面水分,稱重獲得“濕”重。然后放于80℃恒溫箱中,48h后稱重獲得“干”重,計算濕干重(W/D)比率,衡量肺臟水腫情況。

小鼠的飲食情況和體重的變化關系著實驗結果的準確性,在進行正式實驗前,我們進行了藥物的急性毒性實驗,以確定實驗中TF-3濃度,實驗過程中沒有小鼠死亡。由圖3可以看出,加藥后的0~48h,正常組小鼠體重有輕微上升,LPS組及LPS+20、40mg/kg TF-3組小鼠的體重有輕微下降,20、40mg/kg TF-3組小鼠體重沒有特別明顯的變化。

結果如圖4所示,與正常組比較,LPS組小鼠肺損傷程度明顯比正常組小鼠嚴重(p#<0.05),而地塞米松組和40mg/kg TF-3組小鼠肺損傷程度明顯比LPS組小鼠輕微(p*<0.05)。

實施例6 TF-3對LPS誘導的急性肺損傷小鼠血清中炎癥細胞因子影響

(一)血清的收集:戊巴比妥鈉麻醉小鼠后,用一次性真空采血管采血,在室溫自然凝固10~20min,4000rpm/min離心20min后仔細收集上清。置-80℃超低溫冰箱中保存備用。

(二)檢測:檢測之前取出試劑盒中的試劑,置于室溫下回溫。檢測步驟如下:

(1)準備好所有需要的試劑及工作濃度標準品;

(2)將不需要的板條拆卸下來,放回裝有干燥劑的鋁箔袋,重新封好封口;

(3)加入300μL 1×洗液靜置浸泡30s。棄掉洗液之后,在吸水紙上將微孔板拍干;注意:洗板完成之后,請立即使用微孔板,不要讓微孔板干燥;

(4)復孔加入100μL 2倍倍比稀釋的標準品。空白孔復孔加入100μL標準品稀釋液,樣本孔加入80μL 1×檢測緩沖液和20μL樣本;

(5)每孔加入50μL稀釋的檢測抗體,加樣全過程在15min內完成;

(6)封板膜封板后300rpm/min振蕩,室溫下孵育1.5h;

(7)棄掉液體,每孔加入300μL洗液洗板,洗滌6次。每次洗板,在吸水紙上拍干,徹底移除殘留液體;

(8)每孔加入100μL稀釋的辣根過氧化物酶標記的鏈霉親和素;

(9)新的封板膜封板后300rpm/min振蕩,室溫下孵育30min;

(10)按照步驟(7)洗滌;

(11)每孔加入100μL顯色底物TMB,避光,室溫孵育5~30min;

(12)每孔加入100μL終止液,充分混勻;

(13)在15min之內,使用酶標儀進行雙波長檢測,測定450nm最大吸收波長和570nm或630nm參考波長下的OD值。校準后的OD值為450nm的測定值減去570nm或630nm的測定值。僅使用450nm測定會導致OD值偏高,并且準確度降低;

(14)酶標儀讀數后導出數據,通過繪制標準曲線圖計算相應細胞因子的濃度。計算標準品和樣本的平均OD值,然后減去零濃度標準品的OD值。以標準品濃度為橫坐標,OD值為縱坐標,用計算機軟件進行回歸擬合生成標準曲線。回歸分析確定最佳擬合曲線。通過對濃度值和OD值取對數擬合,可以對標準曲線進行線性化。

結果如圖5顯示,LPS組小鼠血清中三種炎癥細胞因子與對照組比較均顯著上升(p##<0.01),而地塞米松組和20、40mg/kg TF-3組小鼠血清中炎癥細胞因子TNF-α、IL-6的含量顯著低于LPS組(p**<0.01或p***<0.001),但TF-3組小鼠血清中炎癥細胞因子IL-1β的含量顯著與LPS組比較,沒有顯著性差異。

實施例7 TF-3對LPS誘導的急性肺損傷小鼠肺組織中炎癥基因影響

取小鼠1/4右肺,用手術剪剪碎后加入1mLTrizol試劑置于冰上,用電動組織勻漿器研磨2min,12000g 4℃離心5min,取上清于另一個EP管中,提取組織RNA,操作按照實施例2進行,檢測肺組織中炎癥基因的表達情況。

實驗各組小鼠肺組織中TNF-α、IL-1β和IL-6mRNA表達情況如圖6~8所示,LPS組小鼠肺組織中三種炎癥基因的表達與對照組比較均顯著上調(p###<0.001),而地塞米松組和40mg/kg TF-3組小鼠肺組織中TNF-α、IL-1β和IL-6的表達顯著低于LPS組(p***<0.001),20mg/kg TF-3組小鼠肺組織中TNF-α和IL-6的表達顯著低于LPS組,但IL-1βmRNA的表達與LPS組比較,沒有顯著性差異(p**<0.01)。由此可知,TF-3能夠有效抑制急性肺損傷小鼠肺組織中炎癥基因的表達。

實施例8 TF-3對LPS誘導的急性肺損傷小鼠肺組織病理學變化的影響

(一)肺組織病理學觀察

(1)取材:小鼠麻醉后,放血,取小鼠右肺的一半;

(2)固定:將一半右肺固定在4%多聚甲醛中4~8h,流水沖洗4h;

(3)脫水:為了減少組織強度收縮,脫水過程應從低度酒精開始,一般經70%、80%、90%、95%、100%等濃度酒精各6~12h;

(4)透明:經二甲苯使組織塊透明為止,便于石蠟的浸入和包埋;

(5)浸蠟:透明后的組織塊放入融化的石蠟中(56~60℃),經過2~3h,使石蠟充分浸入組織塊內部;

(6)包埋:為了使組織能切成薄片,將融化的石蠟倒入包埋框中,再將浸蠟后的組織塊放入包埋框中,待石蠟冷卻后變成固體;

(7)切片與貼片:蠟塊經過一定的修理后,固定在載物臺上,然后安裝在切片機上進行切片,厚度為3μm。將切片貼在涂有蛋白甘油的載玻片上,晾干;

(8)HE染色

①二甲苯浸泡10min,以除去石蠟;

②各級酒精100%、95%、90%、80%、70%梯度洗滌3~5min,以除去二甲苯;

③純水洗5min,以洗去酒精;

④蘇木素染液染色5~10min,洗去玻片上多余的染液;

⑤0.5%~1%鹽酸酒精(70%酒精配制)分色片刻。鏡檢控制,直至細胞核及核內染色質清晰為止;然后用自來水沖洗1min;

⑥0.1%~0.5%伊紅染液染色5min(若著色困難,可在每100mL染液中加入1~2滴冰醋酸,使易著色且不易脫色),然后用純水洗30s;

⑦依次經70%、85%、95%、100%酒精脫水,各級為2~5min,在95%以下濃度的酒精中伊紅易脫色,應適當縮短時間;

⑧加入二甲苯I和二甲苯II透明,各3min;

⑨封片:擦去切片周圍多余的二甲苯,迅速滴加適量中性樹膠,再加蓋玻片封固即可。

(二)組織炎癥評分的標準

肺損傷的炎癥評分是以肺組織學變化特征進行評估,包括(1)肺泡充血、出血,(2)間質水腫,(3)中性粒細胞浸潤,(4)肺泡壁的厚度。炎癥評分標準:不出現癥狀記為0分,出現輕微癥狀記為1分,出現嚴重癥狀記為2分,總分為8分。

結果如圖9所示,按照炎癥評分標準進行評分比較得出,LPS組小鼠肺組織炎癥評分顯著高于正常組(p##<0.01),地塞米松組和20、40mg/kg TF-3組小鼠肺組織炎癥評分顯著低于LPS組(p*<0.05或p**<0.01)。并且通過細胞組織觀察,正常組小鼠肺組織支氣管上皮細胞結構正常,肺泡壁及肺泡腔結構正常,未見明顯的炎性細胞浸潤。與正常組比較,LPS組小鼠肺臟組織破壞較嚴重,肺泡壁明顯增厚,肺泡腔容積減少,出現大量炎性細胞浸潤并伴有肺充血等現象。而地塞米松組和20、40mg/kg TF-3組小鼠肺臟組織學變化都有所緩解。由此可知,TF-3能夠有效抑制炎性細胞的浸潤,從而能夠有效治療肺損傷。

以上僅是本發明的優選實施方式,應當指出的是,上述優選的實施方式不應視為對本發明的限制,本發明的保護范圍應當以權利要求所限定的范圍為準。對于本技術領域的普通技術人員來說,在不脫離本發明的精神和范圍內,還可以做出若干改進和潤飾,這些改進和潤飾也應視為本發明的保護范圍。

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