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PLEKHA5在制備腫瘤診斷試劑中的應用.pdf

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PLEKHA5 制備 腫瘤 診斷 試劑 中的 應用
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摘要
申請專利號:

CN201510075919.1

申請日:

20150213

公開號:

CN104740649B

公開日:

20180316

當前法律狀態:

有效性:

有效

法律詳情:
IPC分類號: A61K48/00,A61K31/7088,C12Q1/6886,A61P35/00 主分類號: A61K48/00,A61K31/7088,C12Q1/6886,A61P35/00
申請人: 北京泱深生物信息技術有限公司
發明人: 楊承剛,邊洋,孫耀蘭,任靜
地址: 100080 北京市海淀區善緣街1號立方庭大廈3103室
優先權: CN201510075919A
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法律狀態
申請(專利)號:

CN201510075919.1

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法律狀態公告日:

法律狀態類型:

摘要

本發明涉及PLEKHA5在制備腫瘤診斷試劑中的應用,具體的本發明涉及PLEKHA5在制備骨肉瘤診斷試劑中的新用途。發明人基于高通量測序結果采用生物信息學方法分析進行基因篩選,挑選出候選基因PLEKHA5,進一步,通過分子細胞生物學實驗證實了PLEKHA5與骨肉瘤具有很好的相關性,可用于制備骨肉瘤輔助診療制劑,具有重要的臨床應用價值。

權利要求書

1.抑制PLEKHA5基因和/或蛋白表達的siRNA抑制劑在制備抗骨肉瘤制劑中的應用。2.根據權利要求1所述的應用,其特征在于,所述抑制PLEKHA5基因表達的siRNA序列選自下列序列中的一種和/或幾種:SEQIDNO.1、SEQIDNO.2、SEQIDNO.3、SEQIDNO.4、SEQIDNO.5、SEQIDNO.6。3.一種抗骨肉瘤制劑,其特征在于,所述的抗骨肉瘤制劑中含有抑制PLEKHA5基因表達的siRNA。4.PLEKHA5基因在制備骨肉瘤診療制劑中的應用。5.根據權利要求4所述的應用,其特征在于,所述的骨肉瘤的診療制劑用熒光定量PCR方法、基因芯片方法檢測骨肉瘤組織中PLEKHA5基因的表達。6.根據權利要求5所述的應用,其特征在于,所述的用熒光定量PCR方法檢測骨肉瘤中PLEKHA5基因的表達所用的診療制劑含有一對特異性擴增PLEKHA5基因的引物;所述的基因芯片包括與PLEKHA5基因的核酸序列雜交的探針。7.根據權利要求4所述的應用,其特征在于,所述的骨肉瘤的診療制劑用免疫方法檢測肺腺癌中PLEKHA5蛋白的表達。8.根據權利要求7所述的應用,其特征在于,所述免疫方法檢測骨肉瘤中PLEKHA5蛋白表達的為ELISA檢測試劑盒和/或膠體金檢測試劑盒。9.一種檢測骨肉瘤的熒光定量PCR試劑盒,其特征在于,所述試劑盒檢測基因PLEKHA5,采用特異的上游引物和下游引物,上游引物序列為SEQIDNO.9,下游引物序列為SEQIDNO.10。

說明書

技術領域

本發明涉及生物醫藥領域,PLEKHA5在制備腫瘤診斷試劑中的應用,具體的本發明涉及PLEKHA5在制備骨肉瘤診斷試劑中的新用途。

背景技術

PLEKHA5是PLEKHA((pleckstrin homology domain-containing protein family A)家族的一員,目前關于該基因的研究非常少。Kenichiro等(Identification and characterization of splicing variants of PLEKHA5(Plekha5)during brain development,Gene,Volume 492,Issue 1,15January 2012,270-275)對該基因進行研究后發現,其mRNA有兩種表達形式,較長的mRNA鏈(L-PLEKHA5)有32個外顯子,編碼1282個氨基酸,在腦組織中表達較高,而較短的(S-PLEKHA5)有26個外顯子,編碼1116個氨基酸,在機體的各個部位都有表達。這兩種形式的mRNA編碼的蛋白質均具有WW及PH結構域,主要位于細胞質中。在小鼠E13.5時PLEKHA5表達量最多,其中S-PLEKHA5占主要部分,隨后開始出現PLEKHA5總量下降,但是L-PLEKHA5的表達量卻逐漸增加,直到E17.5時,L-PLEKHA5的表達量達到最大,并一直維持在小鼠的整個成年期,提示PLEKHA5的表達量可能與小鼠的年齡呈依賴性關系。實驗還發現在這個轉變過程中PLEKHA5的PH結構域可以特異性的與PI3P,PI4P,PISP及PI(3,5)P2結合。這些均提示PLEKHA5可能通過與特異的磷酸肌醇連接完成從短鏈到長鏈轉變,這在大腦發育的過程中起著重要的作用。

骨肉瘤(Oseteosarcoma)是除漿細胞瘤外最常見的惡性骨原發性腫瘤,其組織學特點是在多數情況下腫瘤細胞產生骨樣或不成熟骨。骨肉瘤易于侵及生長迅速的干髓端,其典型的位置是在長管狀骨,股骨遠端及脛骨、朧骨的近端是最常見的發病部位,全部病人的50%-70%病變發生在膝關節周圍。骨肉瘤起病時無明顯的臨床癥狀,極易與外傷混淆,且惡性程度高早期即可能發生肺轉移,故其危害性大死亡率很高。臨床骨科工作者一直致力于對其防治的研究,希望尋找到骨肉瘤精確有效治療的靶點。

發明人對5例骨肉瘤病例樣本及3例正常對照進行高通量測序,結合生物信息學方法進行基因篩選,挑選出候選基因PLEKHA5。近來還有研究發現,在先天性攣縮綜合癥及神經肌肉疾病中,磷酸肌醇與PI(3、5)P2代謝異常被認為是導致該疾病的可能原因。PLEKHA5蛋白可能通過內吞作用與細胞膜上的PI(3,5)P2連接,從而激活細胞膜上的信號通路導致代謝異常。但是并沒有研究表明PLEKHA5與骨肉瘤之間的關系,進一步,本發明進行了分子細胞生物學方法證實了PLEKHA5與骨肉瘤的關系:PLEKHA5與骨肉瘤具有很好的相關性,骨肉瘤細胞的增殖及侵襲中具有重要的作用,可用于制備骨肉瘤輔助診療制劑,具有重要的臨床應用價值。

發明內容

本發明的目的在于提供PLEKHA5基因和/或蛋白抑制劑在制備抗骨肉瘤制劑中的應用。

為實現上述目的,本發明首先通過高通量測序結合生物信息學方法篩選到候選基因PLEKHA5,今兒通過分子細胞生物學方法驗證了PLEKHA5與骨肉瘤的關系:PLEKHA5與骨肉瘤具有很好的相關性,PLEKHA5在骨肉瘤細胞的增殖及侵襲中具有重要的作用,可用于制備骨肉瘤輔助診療制劑,具有重要的臨床應用價值。

進一步,所述抗骨肉瘤制劑是指可以抑制骨肉瘤細胞中PLEKHA5基因的表達的制劑。本領域人員熟知抑制基因的表達通常可以采用下述方法中的一種和/或幾種:通過激活目的基因的抑制基因、激活目的基因的抑制基因表達的蛋白、采用RNA干擾技術抑制目的基因表達、激活促進目的基因mRNA降解的microRNA、導入促進目的基因編碼蛋白降解的分子、抑制促進目的基因表達的因子及蛋白的表達。即通過激活PLEKHA5基因的抑制基因、激活抑制PLEKHA5基因表達的蛋白、導入抑制PLEKHA5基因表達的siRNA、激活促進PLEKHA5mRNA降解的microRNA、導入促進PLEKHA5蛋白降解的分子、抑制促進PLEKHA5基因表達的因子及蛋白的表達。

RNA干擾(RNAi)是指外源性和內源性雙鏈RNA在生物體內誘導同源靶基因的mRNA特異性降解,導致轉錄后基因沉默的現象,是一種使用小的雙鏈RNA高效、特異地阻斷體內某種特定基因的表達,促使mRNA降解,使細胞表現出特定基因缺失表型的技術。siRNA設計完成后可以采用直接合成法或者構建siRNA表達載體,制備好的siRNA可以通過磷酸鈣共沉淀法、電穿孔法、DEAE-葡聚糖和polybrene法、顯微注射或基因槍等機械法、陽離子脂質體試劑法等途徑轉染細胞。

進一步,所述抑制PLEKHA5基因表達的siRNA序列選自下列序列中的一種和/或幾種:SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6。優選siRNA序列為SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2。

本發明的目的在于提供一種抗骨肉瘤制劑,所述抗骨肉瘤制劑抑制骨肉瘤細胞中PLEKHA5基因的表達。進一步,所述的抗骨肉瘤制劑中含有抑制PLEKHA5基因表達的siRNA。

本發明的目的在于提供PLEKHA5基因在制備骨肉瘤診療制劑中的應用。

進一步,所述的骨肉瘤的診療制劑包括用熒光定量PCR方法、基因芯片方法檢測骨肉瘤組織中PLEKHA5基因的表達。

熒光定量PCR法是通過熒光染料或熒光標記的特異性的探針,對PCR產物進行標記跟蹤,實時在線監控反應過程,結合相應的軟件可以對產物進行分析,計算待測樣品模板的初始濃度。熒光定量PCR的出現,極大地簡化了定量檢測的過程,而且真正實現了絕對定量。多種檢測系統的出現,使實驗的選擇性更強。自動化操作提高了工作效率,反應快速、重復性好、靈敏度高、特異性強、結果清晰。

基因芯片又稱為DNA微陣列(DNA microarray),可分為三種主要類型:1)固定在聚合物基片(尼龍膜,硝酸纖維膜等)表面上的核酸探針或cDNA片段,通常用同位素標記的靶基因與其雜交,通過放射顯影技術進行檢測。2)用點樣法固定在玻璃板上的DNA探針陣列,通過與熒光標記的靶基因雜交進行檢測。3)在玻璃等硬質表面上直接合成的寡核苷酸探針陣列,與熒光標記的靶基因雜交進行檢測。基因芯片作為一種先進的、大規模、高通量檢測技術,應用于疾病的診斷,其優點有以下幾個方面:一是高度的靈敏性和準確性;二是快速簡便;三是可同時檢測多種疾病。

所述的用于熒光定量PCR方法檢測骨肉瘤中PLEKHA5基因的產品含有一對特異性擴增PLEKHA5基因的引物;所述的基因芯片包括與PLEKHA5基因的核酸序列雜交的探針。

進一步,所述的骨肉瘤的診療制劑包括用免疫方法檢測肺腺癌中PLEKHA5蛋白的表達。優選所述免疫檢測方法檢測骨肉瘤中PLEKHA5蛋白表達的為western blot和/或ELISA和/膠體金檢測方法。

酶聯免疫吸附實驗(ELISA)即將已知的抗原或抗體吸附在固相載體表面,使酶標記的抗原抗體反應在固相表面進行的技術。該技術可用于檢測大分子抗原和特異性抗體等,具有快速、靈敏、簡便、載體易于標準化等優點。ELISA檢測試劑盒根據檢測目的和操作步驟可分為間接法、雙抗夾心法、競爭法、雙位點一步法、捕獲法測IgM抗體、應用親和素和生物素的ELISA。ELISA檢測試劑盒中生色底物可選擇辣根過氧化物酶(HRP)或者堿性磷酸酶(AP)。

常用的免疫膠體金檢測技術:(1)免疫膠體金光鏡染色法細胞懸液涂片或組織切片,可用膠體金標記的抗體進行染色,也可在膠體金標記的基礎上,以銀顯影液增強標記,使被還原的銀原子沉積于已標記的金顆粒表面,可明顯增強膠體金標記的敏感性。(2)免疫膠體金電鏡染色法可用膠體金標記的抗體或抗抗體與負染病毒樣本或組織超薄切片結合,然后進行負染。可用于病毒形態的觀察和病毒檢測。(3)斑點免疫金滲濾法應用微孔濾膜作載體,先將抗原或抗體點于膜上,封閉后加待檢樣本,洗滌后用膠體金標記的抗體檢測相應的抗原或抗體。(4)膠體金免疫層析法將特異性的抗原或抗體以條帶狀固定在膜上,膠體金標記試劑(抗體或單克隆抗體)吸附在結合墊上,當待檢樣本加到試紙條一端的樣本墊上后,通過毛細作用向前移動,溶解結合墊上的膠體金標記試劑后相互反應,當移動至固定的抗原或抗體的區域時,待檢物與金標試劑的結合物又與之發生特異性結合而被截留,聚集在檢測帶上,可通過肉眼觀察到顯色結果。該法現已發展成為診斷試紙條,使用十分方便。

進一步,所述檢測PLEKHA5蛋白的ELISA法為使用ELISA檢測試劑盒。所述試劑盒中的抗體可采用市售的PLEKHA5單克隆抗體。進一步,所述的試劑盒包括:包被PLEKHA5單克隆抗體的固相載體,酶標二抗,酶的底物,蛋白標準品,陰性對照品,稀釋液,洗滌液,酶反應終止液等。

進一步,所述檢測PLEKHA5蛋白的膠體金法為使用檢測試劑盒,所述的抗體可采用市售的PLEKHA5單克隆抗體。進一步,所述的膠體金檢測試劑盒采用膠體金免疫層析技術或膠體金滲濾法。進一步,所述的膠體金檢測試劑盒硝酸纖維素膜上的檢測區(T)噴點有抗PLEKHA5單克隆抗體、質控區(C)噴點有免疫球蛋白IgG。

本發明的目的在于提供一種檢測骨肉瘤的熒光定量PCR試劑盒,其特征在于,所述試劑盒檢測基因PLEKHA5,采用特異的上游引物和下游引物,上游引物序列為SEQ ID NO.9,下游引物序列為SEQ ID NO.10。

進一步,該PCR試劑盒適合于目前存在市場上的所有類型熒光定量基因擴增儀,靈敏度高,定量快速準確、穩定性好,具有良好的應用前景。

進一步,上述熒光定量PCR試劑盒組分包括:特異性引物、內參引物、熒光定量PCR反應液。其中所述的特異性引物包括上游引物和下游引物,上游引物序列為SEQ ID NO.9,下游引物序列為SEQ ID NO.10。所述內參引物為β-actin內參引物,上游引物序列為SEQ ID NO.11,下游引物序列為SEQ ID NO.12。

所述的試劑盒還包含RNA抽提試劑。優選Reagent(invitrogen,貨號15596-018)進行樣本RNA提取。

本發明還檢測了本試劑盒靈敏性,結果顯示本試劑盒檢測范圍為106-102copies/μl,最小檢出濃度為100copies/μl。

本發明目的是提供了一種骨肉瘤檢測試劑盒,所述的檢測試劑盒檢測PLEKHA5蛋白。進一步的,所述的試劑盒還包括其他檢測試劑。

本發明目的是提供了一種檢測骨肉瘤的基因芯片,所述的基因芯片包括與PLEKHA5基因的核酸序列雜交的探針。

附圖說明

圖1 PLEKHA5基因在癌組織及正常組織中相對表達量圖

圖2 RNA干擾后各組PLEKHA5 mRNA表達水平

圖3 RNA干擾前后MG-63細胞增殖變化

具體實施方式

下面結合具體實施例,進一步闡述本發明,僅用于解釋本發明,而不能理解為對本發明的限制。本領域的普通技術人員可以理解:在不脫離本發明的原理和宗旨的情況下可以對這些實施例進行多種變化、修改、替換和變型,本發明的范圍由權利要求及其等同物限定。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法,通常按照常規條件或按照廠商所建議的條件實施檢測。

實施例1 高通量測序及分析

分別收集5例骨肉瘤病例樣本及3例正常對照組織,進行RNA提取,RNA提取后瓊脂糖凝膠電泳,從電泳結果可以初步判定提取的RNA樣品質量合格與否,是否可以用于進一步的轉錄組分析。進而通過NanoDrop1000分光光度計檢測RNA樣品的提取情況,RNA-seq測序的樣品要求:OD260/OD280為1.8-2.2。

測序平臺為Illumina公司的HiSeq 2500高通量測序平臺,進行高通量轉錄組深度測序,測序后我們運用Fast-QC(http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/)軟件對測序數據的質量進行整體評估,包括堿基的質量值分布,質量值的位置分布,GC含量,PCR duplication含量,kmer的frequency等。在差異基因表達分析時,根據得到的FPKM值,采用國際公認算法EBSeq進行差異篩選。其中,篩選時,LOG2FC>1或<-1,FDR<0.05。為了更好的理解差異表達基因的功能,我們對差異表達基因進行了Gene Onlogy和信號通路分析,并對差異表達基因進行功能注釋和蛋白質互相作用網絡分析,鑒于以上數據分析的結果,結合文獻我們篩選了差異表達基因PLEKHA5。

實施例2 骨肉瘤組織及正常組織PLEKHA5基因表達情況

一材料和方法

1、材料

收集65例骨肉瘤組織及25例正常組織,對其進行分組及編號。

2、方法

2.1 骨肉瘤組織及正常組織總RNA的提取

采用Reagent(invitrogen,貨號15596-018)進行樣本RNA提取,實驗操作按產品說明書進行,具體操作如下:

收集樣本后凍存于液氮,取出后把組織放入已預冷的研缽中進行研磨,待組織樣本成粉末狀后:

①加入Trizol,室溫保存5分鐘;

②加氯仿0.2ml,用力振蕩離心管,充分混勻,室溫下放置5分鐘-10分鐘;

③12000rpm高速離心15分鐘后吸取上層水相(吸70%)到另一新離心管管中,注意不要吸到兩層水相之間的蛋白物質。移入新管,加入等體積的-20℃預冷異丙醇,充分顛倒混勻,置于冰上10分鐘;

④12000rpm高速離15分鐘后小心棄掉上清液,按I ml/ml Trizol的比例加入75%DEPC乙醇洗漆沉淀(4℃保存),洗漆沉淀物,振蕩混合,4℃下12000rpm高速離心5分鐘;

⑤棄去乙醇液體,室溫下放置5分鐘以充分晾干沉淀,加入DEPC處理過的水溶解沉淀;

⑥用Nanodrop2000紫外分光光度計測量RNA純度及濃度,凍存于-70℃。RNA質量判定標準:RNA樣本的OD260/OD280值為1.7-2.2之間;總RNA電泳圖譜有清晰的28S、18S條帶;70℃水浴保溫1小時后的電泳圖譜與水浴保溫前的圖譜無明顯差異。

2.2 逆轉錄合成cDNA

采用III Reverse Transcriptase(invitrogen,貨號18080-044)進行cDNA反轉錄,實驗操作按產品說明書進行,具體操作如下:

使用逆轉錄試劑盒,用逆轉錄緩沖液對1μg總RNA進行逆反錄合成cDNA。采用25μl反應體系,每個樣品取1μg總RNA作為模板RNA,在PCR管中分別加入以下組分:

5×逆轉錄緩沖液5μl,10mmol/l dNTP 1.25μl,0.1mmol/l DTT 2.5μl,30μmmol/l OligodT 2μl,200U/μl MMLV 1.25μl,模板RNA 1μg,加入滅菌水至總體系25μl。42℃孵育1小時,72℃10分鐘,短暫離心。cDNA保存放-20℃冰箱備用。

2.3 Real-Time PCR

2.3.1 儀器及分析方法

用ABI 7500型熒光定量PCR儀,采用2-ΔΔCT法進行數據的相對定量分析。

2.3.2 引物設計

采用在線引物設計軟件,引物設計后由invitrogen公司合成。具體引物序列如下:

表1 引物序列

操作過程如下:

(一)反應體系:用PowerGreen PCR Master Mix(invitrogen,貨號4367659)進行擴增,實驗操作按產品說明書進行。擴增程序為:95°10min,(95℃15sec,60℃60sec)×45個循環。

表2 RealTime反應體系

組分 加入量 2×mix 10μl 上游引物(10uM) 0.5μl 下游引物(10uM) 0.5μl 模板 2μl 加入滅菌蒸餾水 至25μl

(二)引物篩選

將各樣本cDNA混合后,以此為模板進行5倍梯度稀釋,稀釋后樣品各取2μl作模板,分別用目的基因引物和內參基因引物進行擴增,同時在60-95℃進行融解曲線分析,根據擴增效率高和溶解曲線單峰原則進行引物篩選。

(三)樣品RealTimePCR檢測

將各樣品cDNA 10倍稀釋后取2μl作模板,分別用目的基因引物和內參基因引物進行擴增。同時在60-95℃進行溶解曲線分析。

二實驗結果

實時定量PCR擴增曲線拐點清楚,擴增曲線整體平行性好,表明各反應管的擴增效率相近,極限平而無上揚現在,曲線指數期斜率較大,說明擴增效率較高;樣本擴增產物溶解曲線都是單峰,說明擴增產物只有一條,為特異性擴增;根據qRT-PCR的相對定量公式:2-ΔCt×100%,比較PLEKHA5基因在骨肉瘤組織和正常組織中的表達水平。結果顯示(具體見圖1):qRT-PCR擴增結果穩定,其中PLEKHA5在癌組織中的表達水平高于正常組織,以上結果驗證了高通量轉錄組表達數據的整合分析PLEKHA5在骨肉瘤組織中高表達的結果。

實施例3 骨肉瘤細胞系MG-63的培養

一、材料

(一)標本來源

人骨肉瘤細胞系MG-63購自中科院上海細胞研究所。

(二)主要試劑

DMEM/HIGH Glucose(1×)(賽默飛世爾生物化學制品(北京)有限公司)

(三)主要溶液

1、細胞培養液

DMEM培養基+10%標準胎牛血清。

2、PBS(平衡鹽溶液)

在800ml蒸餾水中溶解8g NaCl,0.25g KCl,1.44g Na2HPO4和0.24g KH2PO4用HCl調節溶液的pH值至7.4,加水定容至1L,高壓滅菌,室溫保存。

3、0.25%胰蛋白酶消化液

0.25g胰蛋白酶加入100ml去離子水中,濾器過濾滅菌,分裝備用。

二、實驗方法

(一)細胞培養

1、細胞傳代

(1)將長滿細胞的培養瓶中原來的培養液棄去,加入0.25%胰蛋白酶液1ml,覆蓋細胞層,瓶口消毒,加蓋;

(2)倒置顯微鏡下觀察細胞變化,隨著時間的推移,原貼壁的細胞逐漸趨于圓形,細胞間質回縮,細胞間隙加大,在還未漂起時將胰酶棄去,加入5ml含10%胎牛血清的培養液終止消化;

(3)細胞計數:取上述細胞懸液0.5mI,適當稀釋后滴入血細胞計數板內,按白細胞計數法數四角四大格內細胞總數,計數時僅計數細胞核和細胞漿完整的細胞,成堆的細胞按一個細胞計算,將4大方格內的細胞總數按下列公式換算成每毫升細胞懸液中的細胞數:細胞總數/ml=4大格細胞總數/4×104×稀釋倍數;

(4)根據細胞計數結果,用DMEM完全培養液進一步稀釋為每毫升含3×105個細胞濃度,分裝于培養瓶中(8ml/每瓶),放置于37℃,5%CO2培養箱中培養。

2、細胞凍存

(1)消化細胞(方法同上),將細胞懸液收集至離心管中,1000rpm離心5min,棄上清液;

(2)沉淀加含保護液的培養液,計數,調整至5×106/ml左右,將懸液分至凍存管中,每管1ml;

(3)將凍存管口封嚴,否則復蘇時易出現爆裂,貼上標簽,寫明細胞種類,凍存日期;

(4)按下列順序降溫:室溫4℃(20分鐘),冰箱冷凍室(30分鐘)、低溫冰箱(-30℃,1小時),低溫冰箱(-70℃,過夜)、液氮。

3、細胞復蘇

(1)從液氮中取出凍存管,迅速置于37℃溫水中并不斷攪動。使凍存管中的凍存物在1分鐘之內融化,管消毒,入臺;

(2)打開凍存管,將細胞懸液吸到離心管中,1000rpm離心10分鐘,棄去上清液;

(3)沉淀加10ml培養液,吹打均勻,再離心10分鐘,棄上清液;

(4)加入新培養液適當稀釋,輕輕混勻,接種于培養瓶中培養。

實施例4 RNAi抑制PLEKHA5基因表達及其對人骨肉瘤MG-63細胞的影響

一、材料

(一)標本來源

人骨肉瘤細胞系MG-63購自中科院上海細胞研究所。

(二)主要試劑

LipofectamineTM2000 Transfection Reagent(Invitrogen),MTT(Solarbio),Transwell小室(Corning),Matrigel膠(BD)。

(三)siRNA構建與合成

依據在線設計軟件siDirect version 2.0(http://design.rnai.jp/),根據PLEKHA5基因在GenBank(NCBI Reference Sequence:NM_144920.3)中序列設計相應的siRNA。設計后送往合成公司合成。

二、實驗方法

(一)RNA干擾技術特異性抑制人骨肉瘤細胞PLEKHA5基因的表達

1、人骨肉瘤細胞MG-63的培養

方法步驟同實施例3。

2、siRNA的設計與合成

siRNA表達載體pSIREN-DNR含新霉素抗性基因和GFP綠色熒光標記,可以實時監測載體在細胞中的轉染效率。根據目的mRNA序列,設計3條RNA干擾靶序列及陰性對照(表3)。對于每條選定的siRNA靶序列,設計siRNA正義鏈和反義鏈,以loop(9nt)相連,稱為shRNA(shorthairpin RNA)。合成每條編碼shRNA的DNA模板的兩條單鏈,退火DNA單鏈得到shRNA的DNA雙鏈模板。模板鏈后面接有RNA PoIyIII聚合酶轉錄中止位點,同時兩端分別設計BamHI和HindIII酶切位點,可以克隆到siRNA載體多克隆位點的BamHI和HindIII酶切位點之間。siRNA空載體用BamHI和HindIII雙酶切后,1%瓊脂糖凝膠電泳,回收線性載體。把退火的DNA模板雙鏈連接到線性載體中。采用T4連接酶,插入片斷與載體的摩爾比約為3∶1。連接產物轉化DH5α大腸桿菌,在LB Amp培養基上涂板,37℃培養過夜。PCR鑒定;測序鑒定。柱抽提陽性克隆載體并定量。

表3 siRNA轉錄模板序列

3、細胞分組及轉染

(1)細胞分組

C組:空白對照組;C1組:轉染脂質體組;C2組:轉染非特異性的siRNA組;S1,S2,S3組:轉染特異性的siRNA組。

(2)轉染

按照LipofectamineTM2000 Transfection Reagent提供的步驟進行。

①轉染前24h,取對數生長期的細胞用胰酶消化并計數,用DMEM培養基調整細胞濃度為1×105/ml,取2ml接種于六孔板,放置于37℃,5%CO2培養箱中培養,在細胞達80%融合時用于轉染。在轉染前用不含血清的DMEM培養基培養3-4h。

②配制轉染液體:

A液:250ul無血清培養基稀釋4.0ugDNA,溫和混勻;

B液:250ul無血清培養基稀釋10ul Lipofectamine,溫和混勻,室溫放置5min;

③轉染:A液與B液混合在一起,室溫保溫20min,直接將復合物加入到每孔中,搖動培養板,輕輕混勻。在CO2培養箱中37℃保溫24-48h,6h后換液,加入含血清的培養基。

4、轉染效率的驗證

(1)熒光倒置顯微鏡下觀察細胞形態和轉染情況

轉染24h后,將培養板置于熒光倒置顯微鏡下觀察細胞形態及生長狀態,綠色熒光下觀察轉染情況。

(2)應用Real-time PCR方法檢測轉染前后PLEKHA5基因表達的變化

①標準曲線的構建:選取在50mI培養瓶中正常培養的骨肉瘤MG-63細胞1瓶,提取RNA,測定RNA濃度和純度,進行逆轉錄反應,將反應生成的DNA模板十倍稀釋,得到相當于104-100copies/ul的DNA模板,分別加入PLEKHA5引物和內參照actin引物,配制25ul反應體系,使用Real-time PCR擴增儀,進行PCR擴增反應。得到PLEKHA5和actin的標準曲線。

②Real-time PCR方法檢測轉染前后PLEKHA5基因表達的變化:提取各組細胞的RNA,測定RNA濃度和純度,進行逆轉錄反應,每組DNA模板同時進行PLEKHA5和actin的Real-time PCR反應,實驗重復三次。

③對PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳。

(二)RNAi抑制人骨肉瘤MG-63細胞PLEKHA5基因表達對其相關生物學行為的影響

1、MTT法測細胞增殖

活細胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性的MTT還原為難溶性的藍紫色結晶物并沉積在細胞中,而死細胞無此功能。二甲基亞砜(DMSO)能溶解細胞中的紫色結晶物,用紫外分光光度計在490nm處測定其吸光度,可間接反應活細胞數量。在一定細胞數范圍內,MTT結晶物形成的量與細胞數成正比。

實驗步驟:

(1)MTT溶液:稱取250mg MTT,放入小燒杯中,加入50mI PBS(0.01mol/L,pH7.4),在電磁力攪拌機上攪拌30min,用0.22um的微孔濾膜除菌,分裝,4℃保存,兩周內有效。

(2)細胞分組:實驗分為正常細胞組,陰性對照組和實驗組。正常細胞組為常規培養的MG-63;陰性對照組為非特異性siRNA轉染后48h;實驗組為特異性siRNA轉染后48h;每組設3個重復。

(3)接種細胞:用0.25%胰蛋白酶消化單層培養細胞,用含10%胎牛血清DMEM培養液配成單個細胞懸液,以每孔1了個細胞接種于96孔培養板中,每孔體積100ul。

(4)培養細胞:將培養板放入CO2孵箱,在37℃,5%CO2及飽和濕度條件下培養。

(5)呈色:培養后第0h、24h、48h、72h、96h,每孔加入MTT溶液(5mg/ml)20ul,37℃繼續孵育4h,終止培養,小心棄去孔內培養上清夜。吸去上清液,加入二甲基亞砜150ul,振蕩10min使結晶完全溶解。

(6)比色:選擇490nm波長,在紫外分光光度計上測定各孔吸光度。設與試驗孔平行不加細胞只加培養液的空白對照孔。重復3次,記錄結果,以時間為橫軸,吸光度(A490)為縱軸繪制細胞生長曲線。

2、體外侵襲實驗

(1)細胞準備

本實驗設置空白對照組,陰性對照組和實驗組。空白對照組為常規培養的MG-63;陰性對照組為非特異性siRNA轉染后48h;實驗組為特異性siRNA轉染后48h。將各組細胞用0.25%胰蛋白酶消化,終止消化后離心棄去培養液,用PBS洗3遍,重懸于含0.1%BSA的無血清培養基中。

(2)體外侵襲模型的構建與實驗步驟

Transwell小室是常用的Matrigel膠重建基底膜系統,是體外研究腫瘤細胞侵襲和轉移行為的有效方法。Matrigel是人工重構基底膜材料,主要成分為層黏連蛋白和W型膠原,是一種細胞外基質,4℃時是液體,在37℃會逐漸凝固成膠狀,不可逆。將Transwell小室放入24孔培養板中,小室內稱上室,培養板內稱下室。

①包被基底膜:將Transwell小室放入培養板中,上室內盛裝上層培養液,下室內盛裝下層培養液,上下層培養液以聚碳酸酯膜(8um孔徑)相隔。Matrigel 4℃過夜成液態,用50mg/L Matrigel 1∶8稀釋液包被Transwell小室底部膜的上室面,每個小室使用100ul,分3次涂在Transwell的聚碳酸酯膜上,第一次用50ul,第二、三次各加25ul,每次的間隔時間為10min,使膜上所有的微孔被人工基底膠覆蓋并在37℃孵育2h使其成凝膠狀,吸取膠層表面析出的水相,形成人工重組基底膜。取10ul纖維粘連蛋白(fibronectin,FN)稀釋液涂于小室的下表面,4℃風干。

②接種細胞:將各組細胞調整密度,取2×105/ml細胞200ul加入上室,下室加入作為化學趨化物的含10%FBS的DMEM培養基500ul。

③培養細胞:37℃,5%CO2條件下孵育20h。

④固定與染色:取出小室,棄去上室內培養基,用棉簽仔細擦凈膜上室面未

侵襲的細胞,下室面用甲醇固定10min后,0.1%結晶紫染色。用小刀沿邊緣切下,置于載玻片上,中性樹膠封片。

⑤觀察與計數:在倒置顯微鏡下隨機選取6個200×視野,計數穿膜細胞數目,取均值。實驗重復3次。

三、實驗結果

Real-time PCR檢測轉染效率。應用Real-time PCR方法構建PLEKHA5和actin的標準曲線,相關系數分別為0.9987,0.9979,線性關系良好,符合要求。用雙標準曲線的方法比較各組PLEKHA5基因的表達。空白對照組、脂質體轉染組、非特異性轉染組基因的表達基本相似,差異無統計學意義。SiRNA1,SiRNA2,SiRNA3均有抑制PLEKHA5基因表達的作用,PLEKHA5-siRNA2的作用更明顯,抑制效率達87%,而PLEKHA5-siRNA1和PLEKHA5-siRNA3的抑制作用分別為50%和28%,與空白對照組、脂質體轉染組、非特異性轉染組相比,差異有統計學意義,P<0.05(表4,圖2)。

表4 各組PLEKHA5 mRNA表達水平

組別 PLEKHA5/actin相對濃度比值(均數±標準差)

空白對照組 1.0 脂質體轉染組 1.0458±0.0772 非特異性轉染組 0.9952±0.0821 PLEKHA5-siRNA1組 0.5049±0.0158 PLEKHA5-siRNA2組 0.1295±0.0316 PLEKHA5-siRNA3組 0.7184±0.0225

細胞增殖抑制實驗(MTT)。陰性對照組為轉染非特異性siRNA,特異性siRNA轉染組轉染PLEKHA5-siRNA2。四甲基偶氮哇藍比色法(MTT)實驗顯示,在相同的初始條件下,各組細胞增殖速度相近,無統計學差異(P<0.05)。24h后,特異性siRNA轉染組(0.1599±0.0193)細胞增殖速度減慢,正常細胞組(0.2056±0.0208)、陰性對照組細胞(0.2013±0.0251)增殖速度相近,特異性siRNA轉染組細胞增殖速度減慢,差異有統計學意義(P<0.05)。隨著觀察時間延長,前兩組組間比較,增殖速度相似,差異無統計學意義(P>0.05);特異性siRNA轉染組與前兩組相比,增殖速度明顯減慢,有顯著性差異(P<0.05)。MTT實驗結果表明,特異性siRNA轉染組的細胞生長明顯受到抑制(表5、圖3)。

表5 RNA干擾前后MG-63細胞增殖變化

時間 正常細胞組 陰性對照組 實驗組 0h 0.1255±0.0223 0.1204±0.0320 0.1237±0.0154 24h 0.2056±0.0208 0.2013±0.0251 0.1680±0.0219 48h 0.3596±0.0311 0.3527±0.0198 0.2699±0.0138 72h 0.4482±0.0308 0.4451±0.0241 0.3425±0.0224 96h 0.5580±0.0402 0.5397±0.0336 0.4217±0.0173

體外侵襲實驗。細胞穿過Matrigel重建基底膜數目的多少反映了細胞侵襲能力的變化。通過計數實驗組與對照組細胞穿過人工基底膜的細胞數量并進行比較,可以發現RNA干擾PLEKHA5基因表達后腫瘤細胞的運動侵襲能力明顯下降,穿過人工基底膜的細胞數量明顯減少,空白對照組(33.54±1.85)、陰性對照組(33.18±2.74)及實驗組(20.77±1.83)侵襲細胞的相對數目差異有統計學意義(P<0.05)(表6)。

表6 RNA干擾PLEKHA5基因后Transwell值

組別 Transwell值 空白對照組 33.54±1.85 陰性對照組 33.18±2.74 實驗組 20.77±1.83

本發明采用高通量測序篩選出骨肉瘤致病相關基因PLEKHA5,結合分子細胞生物學實驗驗證,證實了PLEKHA5在骨肉瘤細胞的增殖及侵襲中具有重要的作用,抑制PLEKHA5基因的表達能夠降低骨肉瘤細胞的侵襲和增殖。本發明為骨肉瘤臨床診療提供了新的靶標,具有很好的臨床應用前景。

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本文標題:PLEKHA5在制備腫瘤診斷試劑中的應用.pdf
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