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一種小麥成熟胚培養及再生的方法.pdf

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一種 小麥 成熟 培養 再生 方法
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摘要
申請專利號:

CN201110196692.8

申請日:

20110714

公開號:

CN102283123A

公開日:

20111221

當前法律狀態:

有效性:

失效

法律詳情:
IPC分類號: A01H4/00 主分類號: A01H4/00
申請人: 江蘇省農業科學院
發明人: 蔣蘇,馬鴻翔,張旭,余桂紅,孫曉波,魏芳
地址: 210014 江蘇省南京市玄武區鐘靈街50號
優先權: CN201110196692A
專利代理機構: 南京經緯專利商標代理有限公司 代理人: 孫忠浩
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法律狀態
申請(專利)號:

CN201110196692.8

授權公告號:

法律狀態公告日:

法律狀態類型:

摘要

本發明涉及一種小麥成熟胚培養及再生的方法,其再生培養基以MS基本培養基為基礎,再生培養基中麥芽糖為40g/L,MES為1.95g/L,KT為5mg/L,NAA為0.1mg/L,pH=5.8;具體方法為:挑選成熟飽滿的小麥種子,用70%酒精浸泡5min,0.1%HgCl2滅菌20min,至少用無菌水沖洗4次,再用無菌水中浸泡19~24h;再將種子的成熟胚去掉胚芽胚根后縱切,接入誘導培養基中,23~25℃暗培養,10~14天繼代一次,共誘導培養20~28天,獲得小麥成熟胚愈傷組織;然后轉入上述配制好的再生培養基中,23~25℃光照培養,25~30天,誘導小麥成熟胚愈傷組織分化,形成再生植株苗。

權利要求書

1.一種小麥成熟胚培養及再生的方法,其特征在于,再生培養基以MS基本培養基為基礎,添加麥芽糖,MES,KT,NAA,再生培養基中麥芽糖的濃度為40g/L,MES濃度為1.95g/L,KT為5mg/L,NAA為0.1mg/L,pH=5.8;小麥成熟胚培養及再生的具體方法為:a)挑選成熟飽滿的小麥種子,用70%酒精浸泡5min,0.1%HgCl滅菌20min,至少用無菌水沖洗4次后,再用無菌水浸泡19~24h,剝取種子的成熟胚;b)將浸泡后種子的成熟胚去掉胚芽胚根后縱切,接入誘導培養基中,23~25℃暗培養,10~14天繼代一次,共誘導培養20~28天,獲得小麥成熟胚愈傷組織;c)將小麥成熟胚愈傷組織轉入上述配制好的再生培養基中,23~25℃光照培養,25~30天,誘導小麥成熟胚愈傷組織分化,形成再生植株苗。2.根據權利要求1所述的一種小麥成熟胚培養及再生的方法,其特征在于,所述的誘導培養基使用MS基本培養基的大量元素、微量元素和鐵鹽,與B5基本培養基的維生素成分進行復合,再添加麥芽糖,MgCl,水解酪蛋白,谷氨酰胺,MES,其中,麥芽糖的濃度為40g/L,MgCl的濃度為0.75g/L,水解酪蛋白的濃度為500mg/L,谷氨酰胺濃度為300mg/L,所述培養基中MES濃度為1.95g/L,pH=5.8。3.根據權利要求1所述的一種小麥成熟胚培養及再生的方法,其特征在于,所述的23~25℃光照培養是指:在培育期期內,以環境溫度23~25℃,光照和黑暗每12h相間交替,光照強度2000lux。4.根據權利要求1或2所述的一種小麥成熟胚培養及再生的方法,其特征在于,小麥成熟胚愈傷組織誘導率至少為98%,小麥成熟胚愈傷組織分化率為23~50%。5.根據權利要求3所述的一種小麥成熟胚培養及再生的方法,其特征在于,將分化出的再生植株苗接入1/2MS培養基中,按照傳統方法進行壯苗培養。

說明書

技術領域

本發明涉及一種適合小麥成熟胚愈傷組織誘導及再生的方法。

背景技術

小麥組織培養為小麥無性系變異、胚挽救、外源基因的轉化等工作提供了必要的基礎,而高頻再生則是小麥組織培養的關鍵。

目前小麥組織培養獲得成功的外植體有根、幼穗、幼胚、花藥、成熟胚等。在這之中,幼胚培養的再生效率最高,而成熟胚培養再生最為困難。然而,幼胚的取材受季節、時間以及單株之間不同生理狀態的限制極大,在自然條件下無法全年持續供應,利用溫室栽培技術進行整年持續種植則對條件要求嚴格且耗資巨大。成熟胚作為外植體源具有易儲藏、取材方便、一次收獲可大量持續穩定供應等特點,且具有成本低、個體間生理狀態一致、方便實用等諸多優點,因此成為目前研究者進行突破的熱點。

小麥成熟胚培養及再生的體系主要受基因型限制極大,不同的體系對不同的基因型培養效果差異較大。植物愈傷組織的分化是依賴于細胞分裂素和生長素的比值,該比值高則利于芽的分化,該比值低則利于根的分化。通常小麥成熟胚愈傷組織分化率的平均水平約為23%【M,Turet?M,Altinok?S?et?al.Efficient?callus?induction?and?plant?regeneration?from?mature?embryo?culture?of?winter?wheat(Triticum?aestivum?L.)genotypes.Plant?Cell?Rep,1998,18(3~4):P.331~335】,如何提高小麥成熟胚愈傷組織分化效率一直是人們關注的焦點。

小麥成熟胚培養及再生離不開誘導培養基和再生培養基。小麥成熟胚愈傷組織分化率取決于再生培養基,而再生培養基一般是以MS基本培養基為基礎,添加適量的激素,所述的激素一般包括細胞分裂素(如:ZT,KT等)和生長素(如:2,4-D,IAA,NAA等),據報道,現有的再生培養基中,細胞分裂素的添加量一般為0.1~2mg/L,生長素的添加量一般為0.1~1mg/L。例如:激素濃度配比中采用ZT比IAA為2.0mg/L比0.5mg/L【陳俊男,高潤紅,鄧志英,田紀春.小麥成熟胚組織培養體系優化及優良轉化受體基因型的篩選.山東農業科學.2010,11:P.1-5】、或采用KT比2,4-D為0.1mg/L比0.5mg/L【畢瑞明,王洪剛.小麥成熟胚的組織培養.中國農學通報.2007,23卷,2期:P.53-57】或采用1.0~1.5mg/L比0.2~0.5mg/L【劉香利,劉縉,郭藹光,趙惠賢.小麥不同外植體離體培養與再生研究.麥類作物學報.2008,28(4):P.568-572;劉芳、周翠紅、李麗雅,侯文卓,王強,郭藹光,劉香利.不同遺傳背景小麥成熟胚再生體系的初步研究.麥類作物學報.2010,30(1):P.39-42】、或采用KT比NAA為0.6mg/L比0.4mg/L【曹新有,李春蓮,余玲,任慧莉,陳耀鋒.小麥成熟胚愈傷組織誘導及分化研究.西北植物學報.2006,26(11):P.2276-2280;李根英,黃承彥,隋新霞,何中虎,孫其信,夏先春.小麥不同外植體的組織培養效果研究.麥類作物學報.2006,26(1):P.21-25】,也有人提出單獨使用KT0.5~2.0mg/L【貴夢園,魏琦超,何男男,歐行奇,趙俊杰,張勝利,周巖.不同基因型小麥成熟胚愈傷組織的誘導與分化.湖北農業科學.2009(9),48(9):P.2049-2051】等。

在本領域,有人認為再生培養基中如果KT濃度過高易導致愈傷組織褐化死亡【曹新有,李春蓮,余玲,任慧莉,陳耀鋒.小麥成熟胚愈傷組織誘導及分化研究.西北植物學報.2006,26(11):P.2276-2280】,因此較少有人在分化過程中使用超常規高濃度KT【唐宗祥,張懷瓊,張懷渝,晏本菊,任正隆.2,4-D、KT對小麥成熟胚愈傷組織形成、分化的影響.四川農業大學學報.2004,22卷,3期:P.203-205】。

發明內容

本發明的目的在于,針對目前小麥成熟胚愈傷組織分化率的平均水平較低的實際問題,提供一種新的小麥成熟胚培養及再生的方法。

本發明的目的是這樣實現的:一種小麥成熟胚培養及再生的方法,其特征在于,再生培養基以MS基本培養基為基礎,添加麥芽糖,MES,KT,NAA,再生培養基中麥芽糖的濃度為40g/L,MES濃度為1.95g/L,KT為5mg/L,NAA為0.1mg/L,pH=5.8;小麥成熟胚培養及再生的具體方法為:

a)挑選成熟飽滿的小麥種子,用70%酒精浸泡5min,0.1%?HgCl2滅菌20min,至少用無菌水沖洗4次后,再用無菌水中浸泡19~24h,獲得種子的成熟胚;

b)將種子的成熟胚去掉胚芽胚根后縱切,接入誘導培養基中,23~25℃暗培養,10~14天繼代一次,共誘導培養20~28天,獲得小麥成熟胚愈傷組織;

c)將小麥成熟胚愈傷組織轉入上述配制好的再生培養基中,23~25℃光照培養,25~30天,誘導小麥成熟胚愈傷組織分化,形成再生植株苗。

在本發明中,所述的誘導培養基使用MS基本培養基的大量元素、微量元素和鐵鹽,與B5基本培養基的維生素成分進行復合,再添加麥芽糖,MgCl2,水解酪蛋白,谷氨酰胺,MES,其中,麥芽糖的濃度為40g/L,MgCl2的濃度為0.75g/L,水解酪蛋白的濃度為500mg/L,谷氨酰胺濃度為300mg/L,所述培養基中MES濃度為1.95g/L,pH=5.8。

在本發明中,所述的23~25℃光照培養是指:在培育期期內,以環境溫度23~25℃,光照和黑暗每12h相間交替,光照強度2000lux。

在本發明中,小麥成熟胚愈傷組織誘導率至少為98%,小麥成熟胚愈傷組織分化率為23~50%。

在本發明中,將分化出的再生植株苗接入1/2MS培養基中,按照傳統方法進行壯苗培養。

本發明的優點在于,由于再生培養基中采用細胞分裂素KT和生長素NAA并克服傳統觀念,提高了細胞分裂素KT的濃度,以及細胞分裂素KT與生長素NAA的比值,較大幅度的提高了小麥成熟胚愈傷組織分化率;同時KT價格較低,與ZT相比,可以降低培養基的成本;由于誘導培養基和再生培養基中的碳源均為麥芽糖,與砂糖或蔗糖相比,可以始終保持較高的滲透壓,提高小麥成熟胚愈傷組織的分化率。

具體實施方式

實施例1

1)誘導培養基

誘導培養基為含有MS基本培養基的大量元素、微量元素、鐵鹽,以及B5基本培養基的維生素,添加麥芽糖40g/L、氯化鎂0.75g/L、水解酪蛋白500mg/L、谷氨酰胺300mg/L、MES?1.95g/L的固體培養基,pH=5.8。

配制后用121℃高壓濕熱滅菌20min。

2)再生培養基(簡稱KT?5.0NAA?0.1再生培養基)

再生培養基為含有MS基本培養基、麥芽糖40g/L、MES?1.95g/L、KT?5mg/L、NAA?0.1mg/L的固體培養基,pH=5.8。

配制后用121℃高壓濕熱滅菌20min。

3)對照用再生培養基(簡稱KT?5.0再生培養基)

對照用再生培養基為含有MS基本培養基、麥芽糖40g/L、MES?1.95g/L、KT5mg/L,pH=5.8。

配制后用121℃高壓濕熱滅菌20min。

實施例2

小麥品種“花培1號”。

挑選成熟飽滿的“花培1號”小麥種子,用70%酒精浸泡5min,0.1%?HgCl2滅菌20min,無菌水沖洗4次后,無菌水中浸泡19h,獲得種子的成熟胚。

將小麥種子成熟胚去掉胚芽胚根后縱切接入上述配制好的誘導培養基(實施例1提供,下同)中,23℃暗培養,10天繼代一次,共誘導培養20天,獲得小麥愈傷組織。

將小麥愈傷組織分別轉入KT?5.0?NAA?0.1再生培養基和KT?5.0再生培養基(均由實施例1提供,下同),誘導再生苗的分化。培養期為30天,在培養期內,以環境溫度23~25℃,光照和黑暗每12h相間交替,光照強度2000lux,小麥成熟胚愈傷組織分化為再生植株苗。

花培1號的愈傷組織誘導率為100%,采用KT?5.0?NAA?0.1再生培養基的小麥成熟胚愈傷組織分化率平均為47.8±1.6%;采用KT?5.0再生培養基的小麥成熟胚愈傷組織分化率平均為15±3.5%,前者是后者的3倍。

經過方差分析,每個品種在兩種不同激素配比的培養基上的分化率在P=0.05水平上差異顯著。

實施例3

小麥品種“寧麥13”

挑選成熟飽滿的“寧麥13”小麥種子,用70%酒精浸泡5min,0.1%?HgCl2滅菌20min,無菌水沖洗5次后,無菌水中浸泡24h,獲得種子的成熟胚。

將小麥種子成熟胚去掉胚芽胚根后縱切接入上述配制好的誘導培養基中,25℃暗培養,14天繼代一次,共誘導培養28天,獲得小麥愈傷組織。

將小麥愈傷組織分別轉入KT?5.0?NAA?0.1再生培養基和KT?5.0再生培養基,誘導再生苗的分化。培養期為28天,在培養期內,以環境溫度23~25℃,光照和黑暗每12h相間交替誘導,光照強度2000lux,小麥成熟胚愈傷組織分化為再生植株苗。

寧麥13的愈傷組織誘導率為100%,采用KT?5.0?NAA?0.1再生培養基的小麥成熟胚愈傷組織分化率平均為23.3±3.8%;采用KT?5.0再生培養基的小麥成熟胚愈傷組織分化率平均為7.5±1.6%,前者是后者的3倍。

經過方差分析,每個品種在兩種不同激素配比的培養基上的分化率在P=0.05水平上差異顯著。

實施例4

小麥品種“揚麥158”

挑選成熟飽滿的“揚麥158”小麥種子,用70%酒精浸泡5min,0.1%?HgCl2滅菌20min,無菌水沖洗5次后,無菌水中浸泡22h,獲得種子的成熟胚。

將小麥種子成熟胚去掉胚芽胚根后縱切接入上述配制好的誘導培養基中,25℃暗培養,12天繼代一次,共誘導培養24天,獲得小麥愈傷組織。

將小麥愈傷組織分別轉入KT?5.0?NAA?0.1再生培養基和KT?5.0再生培養基,誘導再生苗的分化。培養期為28天,在培養期內,以環境溫度23~25℃,光照和黑暗每12h相間交替,光照強度2000lux,小麥成熟胚愈傷組織分化為再生植株苗。

揚麥158的愈傷組織誘導率平均為100%,采用KT?5.0?NAA?0.1再生培養基的小麥成熟胚愈傷組織分化率平均為25.0±2.9%;采用KT?5.0再生培養基的小麥成熟胚愈傷組織分化率平均為8.3±2.9%,前者是后者的3倍。

經過方差分析,每個品種在兩種不同激素配比的培養基上的分化率在P=0.05水平上差異顯著。

以上各實施例不是對本發明的限制,具體實施時,對小麥成熟胚進行誘導愈傷組織培養時,可以采用傳統的誘導培養基,對各實施例中獲得的再生植株苗還應該接入1/2MS培養基中,按照傳統方法進行壯苗培養。

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