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一種化合物在制備抑制HIV體內擴散藥物的應用.pdf

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一種 化合物 制備 抑制 HIV 體內 擴散 藥物 應用
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摘要
申請專利號:

CN201711107507.7

申請日:

20171110

公開號:

CN107737130A

公開日:

20180227

當前法律狀態:

有效性:

審查中

法律詳情:
IPC分類號: A61K31/7012,A61P31/18 主分類號: A61K31/7012,A61P31/18
申請人: 廈門諾康得生物科技有限公司
發明人: 閆旭,李柱,韓緒春,王先武,郭崗,黃國鋒,吳進
地址: 361008 福建省廈門市思明區環島東路1811號B1901之三
優先權: CN201711107507A
專利代理機構: 廈門加減專利代理事務所(普通合伙) 代理人: 李強
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法律狀態
申請(專利)號:

CN201711107507.7

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法律狀態公告日:

法律狀態類型:

摘要

本發明涉及生物醫療技術領域,特別涉及一種化合物在制備抑制HIV體內擴散藥物的應用。對于本發明涉及的針對CD169靶點的化合物在制備抑制HIV體內擴散藥物中的應用屬于首次公開,該化合物對CD169+巨噬細胞具有很強的靶向作用,可以通過競爭性的與巨噬細胞表面的CD169相結合從而有效阻斷HIV利用CD169粘性蛋白來結合巨噬細胞,抑制病毒在體內的擴散,具有良好的開發應用前景,制成的藥物對抑制和治療AIDS有著積極的意義。

權利要求書

1.一種化合物在制備抑制HIV體內擴散藥物的應用,其中所述化合物的化學式為:2.如權利要求1所述的化合物在制備抑制HIV體內擴散藥物的應用,其特征在于:所述藥物為液態藥物。3.如權利要求1所述的化合物在制備抑制HIV體內擴散藥物的應用,其特征在于:所述藥物為藥片藥物。4.如權利要求1所述的化合物在制備抑制HIV體內擴散藥物的應用,其特征在于:所述藥物為膠囊藥物。5.如權利要求1所述的化合物在制備抑制HIV體內擴散藥物的應用,其特征在于:所述藥物為散劑藥物。

說明書

技術領域

本發明涉及生物醫療技術領域,特別涉及一種化合物在制備抑制HIV體內擴散藥物的應用。

背景技術

CD169又稱唾液酸黏附素,是唾液酸結合性免疫球蛋白樣凝集素家族的一員,表達于特定的巨噬細胞亞群表面。CD169+巨噬細胞通過該受體與其他細胞表面的配體識別并結合,完成細胞間的“交流”,在抗原遞呈、調節淋巴細胞增殖、誘導炎癥反應和免疫耐受中發揮重要作用。CD169+巨噬細胞存在于正常人的脾臟、淋巴結、骨髓、肝臟、結腸、肺、神經系統中,而在外周血中很少表達。但在疾病狀態下,如自身免疫性疾病,可在病變組織、淋巴結及外周血中檢測到其數量的明顯變化。在艾滋病病毒體內傳播過程中,CD169+巨噬細胞發揮著重要作用。

艾滋病病毒(HIV)是一種感染人類免疫系統細胞的慢病毒(lentivirus),屬逆轉錄病毒的一種。HIV感染并殺死免疫系統細胞,包括T細胞和巨噬細胞。這會破壞免疫系統,使病人容易感染上常見的細菌、病毒和其他在擁有健康免疫系統的人們體內不會導致問題的病原體,從而致使各種疾病在人體內蔓延,最終導致AIDS(Acquired Immune Deficiency Syndrome)。由于HIV的變異極其迅速,難以生產特異性疫苗,至今無有效治療方法,對人類健康造成極大威脅。

為了攻克艾滋病,大量的研究工作被投入進去。迄今為止治療HIV的研究都聚焦于清除T細胞(免疫系統中一種非常重要的免疫細胞)中的病毒。但是有研究發現HIV病毒會持續存在于感染HIV病毒的巨噬細胞中,使巨噬細胞為艾滋病病毒的卷土重來和擴散提供庇護。對于艾滋病毒(HIV)的擴散,HIV是通過其表面的唾液酸與CD169相結合從而進入巨噬細胞,捕獲病毒顆粒的巨噬細胞向一種罕見類型的B細胞開放,隨后病毒顆粒就會將自身吸附于這些B細胞的尾部,并且被拖入淋巴結內部,在一至兩天內這些B細胞就會同組織建立穩定的聯系,從而促進病毒的完全傳遞。

如何防止HIV病毒持續存在于感染HIV病毒的巨噬細胞中,使巨噬細胞為艾滋病病毒的卷土重來和擴散提供庇護是現有技術一直無法有效解決的難題。

發明內容

為解決以上背景技術中提到的如何防止HIV病毒持續存在于感染HIV病毒的巨噬細胞中,使巨噬細胞為艾滋病病毒的卷土重來和擴散提供庇護的問題,本發明提供一種化合物在制備抑制HIV體內擴散藥物的應用,其中所述化合物的化學式為:

進一步地,所述藥物為液態藥物。

進一步地,所述藥物為藥片藥物。

進一步地,所述藥物為膠囊藥物。

進一步地,所述藥物為散劑藥物。

以上化合物為針對CD169靶點的化合物,記為M1,本發明在通過對M1的藥性評估中意外發現,M1對CD169+巨噬細胞具有很強的靶向作用,可以通過競爭性地與巨噬細胞表面的CD169相結合從而有效阻斷HIV利用CD169粘性蛋白來結合巨噬細胞,從而抑制病毒在體內的擴散,制成的藥物具有良好的開發應用前景,對抑制和治療AIDS有著積極的意義。

對于本發明涉及的化合物M1在制備抑制HIV體內擴散藥物中的應用屬于首次公開;其對于抑制HIV體內擴散起到了意想不到,不存在由其他化合物給出任何啟示的可能,具備突出的實質性特點,同時用于抑制HIV在體內擴散顯然具有顯著的進步。

附圖說明

為了更清楚地說明本發明實施例或現有技術中的技術方案,下面將對實施例或現有技術描述中所需要使用的附圖作一簡單地介紹,顯而易見地,下面描述中的附圖是本發明的一些實施例,對于本領域普通技術人員來講,在不付出創造性勞動性的前提下,還可以根據這些附圖獲得其他的附圖。

圖1為對注射不含M1和含M1的溶液藥物后C57BL/6小鼠腘窩淋巴結處捕獲的HIV Gag-GFP的比較分析圖;

圖2為對正常小鼠C57BL/6和基因敲除小鼠Siglec1-/-腘窩淋巴結處捕獲的HIV Gag-GFP的比較分析圖;

圖3為免疫系統人源化BLT小鼠在不含M1和含M1時脾臟中捕獲的HIVGag-GFP的比較分析圖。

具體實施方式

為使本發明實施例的目的、技術方案和優點更加清楚,下面將結合本發明實施例中的附圖,對本發明實施例中的技術方案進行清楚、完整地描述,顯然,所描述的實施例是本發明一部分實施例,而不是全部的實施例。基于本發明中的實施例,本領域普通技術人員在沒有做出創造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例,都屬于本發明保護的范圍。

本發明提供一種能夠針對CD169靶點的化合物,該化合物其化學式為:

針對以上化合物的制備方法,包括以下步驟:

1、制備TCC-COOH

1)、在0℃下,將6-氯-8-氟苯并二氫吡喃-4-酮1(5g,24.9mmol)溶解于15mL二甲基甲酰胺(N,N-Dimethylformamide,簡稱DMF)中,并逐滴加入磷酰氯(2.3mL,24.9mmol),得到混合物M51;

2)、將S410得到的混合物M51在0℃下攪拌30分鐘后加熱至80℃,保溫1.5小時后冷卻至室溫,得到混合物M52;

3)、將S420得到的混合物M52冷卻至室溫后,加入1N NaOAc溶液淬滅后,加入二氯甲烷(2×25mL)進行萃取,將萃取后的有機層進行真空濃縮,得到4,6-二氯-8-氟-2H-色烯-3-甲醛,不經進一步純化即可進行下一步驟;

4)、在0℃下,于100ml圓底燒瓶中,將得到的4,6-二氯-8-氟-2H-色烯-3-甲醛(6.1g,24.9mmol)溶解在30mL乙醇溶液中,逐滴加入的巰基乙酸乙酯(2.73mL,24.9mmol)與乙醇鈉(21wt%,在乙醇中,18.7mL,49.8mmol)于溶液中,得到混合物M53;

5)將S440得到的混合物M53升溫至室溫并攪拌過夜后,進行過濾,得到沉淀物后,用水洗滌并收集沉淀物;

6)將S450得到的沉淀物加入四氫呋喃(Tetrahydrofuran,簡稱THF)和1N NaOH溶液中,并在50℃下攪拌24小時,得到混合物M54;

7)將S460得到的混合物M54冷卻至室溫,用CH2Cl2(2×50mL)洗滌,并加入1N HCl酸化,將所得固體產物過濾,用水洗滌并干燥,即得到TCC-COOH。

其中,TCC-COOH的化學結構式為:

該制備方法中,合成TCC-COOH的化學反應式為:

2、制備TosSia methyl ester

1)、將唾液酸(15.0g,50mmol)、1ml三氟乙酸和300ml無水甲醇混合后在室溫下攪拌至澄清,得到混合物M41;其中,該處表述的唾液酸的化學結構式如下所示:

2)、將得到的混合物M41采用蒸發的方式除去溶劑,得到唾液酸甲酯,為白色固體,無需進一步純化;

3)、將得到的固體唾液酸甲酯和P2O5在真空干燥過夜,得到混合物M42;

4)、在得到的混合物M42與無水吡啶共蒸發兩次以除去痕量水分,得到混合物M43;

5)、將得到的混合物M43溶于200ml無水吡啶中后,冷卻至0℃,并加入對甲苯磺酰氯(10.0g,53mmol),得到混合物M44;

6)、將得到的混合物M44加熱至室溫并攪拌過夜后,通過減壓加熱除去溶劑;

7)、將上一步除去溶劑后的殘余物通過柱層析(EtOAc:MeOH=20:1)純化,得到白色固體(18.0g,38mmol),即為TosSiamethylester,制得的TosSiamethyl ester化學式如下所示:

3、制備N3Sia methyl ester

1)、將8.0g疊氮化鈉和TosSiamethyl ester(14.0g,30mmol)加入150ml二甲基甲酰胺(DMF)中得到混合物M31;

2)、將S210中得到的混合物M31加熱至80℃過夜后,除去溶劑;

3)、將S220去除溶劑后的殘余物通過柱層析(EtOAc:MeOH=20:1)純化,得到固體即為N3Sia methyl ester,其化學結構式如下所示:

4、制備TCCSia methyl ester

1)、將N3Sia methyl ester(3.0g,8.6mmol)、300mgPd/C(鈀碳)催化劑和100ml無水甲醇混合,得到混合物M21;

2)、在S110得到的混合物M21中加入乙酰氯,調節pH為1~2,得到混合物M22;

3)、將S120得到的混合物M22置于H2中攪拌,并通過薄層色譜監測(TCL監測)至反應完全,約12小時,得到混合物M23;

4)、將S130得到的混合物M23通過過濾以除去Pd/C催化劑,并采用蒸發的方式去除溶劑,得到殘留混合物M24;

5)、將S140中得到的殘留混合物M24、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽(EDC·HCl)(2.0g,10.3mmol)、1-羥基苯并三唑(HOBT)(1.4g,10.3mmol)、三乙胺(3.6ml,25.8mmol)、TCC-COOH(2.0g,8.6mmol)和150ml二甲基甲酰胺(DMF)混合,并在黑暗中攪拌48小時,得到混合物M25;

6)、將S150中得到的混合物M25蒸發除去溶劑,并將去除溶劑后的殘余物通過柱層析(CH2Cl2:MeOH=10:1)進行純化,得到固體(2.6g,4.8mmol)即為TCCSia methyl ester,其化學結構式如下所示:

5、制備針對CD169靶點的化合物(TCC-Neu5Ac)

1)、將TCCSia methyl ester(536mg,1mmol)、5ml甲醇和5ml 2M NaOH溶液混合,并在室溫下攪拌20min得到混合物M11;

2)、在混合物M11中,加入2M HCl水溶液,調節混合物M11的pH為7,得到混合物M12;

3)、將混合物M12溶劑的溶劑完全去除,將去除溶劑后的殘余物通過柱層析進行純化,所述柱層析中采用的CH2Cl2:MeOH=2:1,制得淺黃色固體(287mg,0.55mmol)即為針對CD169靶點的化合物。

更具體地,本發明提供的針對CD169靶點的化合物的化學式合成路線如下所示:

將針對CD169靶點的化合物按照以下實施例步驟配制不同濃度的藥物:

實施例1:配制濃度為10mM的M1藥物儲備液

步驟a、采用分析天平準確稱取130.2mg M1于干凈的燒杯中,用少量新鮮無菌的PBS(0.01M,pH 7.4)溶解。將玻璃棒一端靠在25mL容量瓶頸內壁上(注意不要讓玻璃棒其它部位觸及容量瓶口,防止液體流到容量瓶外壁上),把溶液轉入容量瓶中,接著用少量PBS多次洗滌燒杯,并把洗滌溶液全部轉移到容量瓶里。

步驟b、向容量瓶中補充PBS至離標線1cm左右時,改用滴管小心滴加,最后使液體的彎月面與標線正好相切。

步驟c、蓋緊瓶塞,用倒轉和搖動的方法使瓶內的液體混合均勻,即得到濃度為10mM的M1藥物儲備液;配置好后置于4℃冰箱中避光保存。

實施例2:配制濃度為50μM的M1藥物儲備液

取實施例1制備的10mM的M1藥物儲備液50μL,加入9.95mL PBS稀釋即得到濃度為50μM的M1藥物儲備液。

實施例3:配制濃度為100μM的M1藥物儲備液

取實施例1制備的10mM的M1儲備液100μL,加入9.9mL PBS稀釋即得到濃度為100μM的M1藥物儲備液。

實施例4:配制濃度為200μM的M1藥物儲備液

取實施例1制備的10mM的M1儲備液200μL,加入9.8mL PBS稀釋即得到濃度為100μM的M1藥物儲備液。

根據具體需要可以將M1的藥物儲備液制成液態藥液、藥片藥物、膠囊藥物或散劑藥物。

通過以下實驗證明M1的藥物抑制HIV在體內擴散的作用。

研究中設計不同的小鼠模型進行了驗證,驗證方法如下。

對于正常小鼠C57BL/6或者基因敲除小鼠Siglec1-/-,先通過尾靜脈注射M1溶液給藥10ml,30分鐘后,對熒光標記的HIV Gag-GFP病毒顆粒使用含15%蔗糖的PBS溶液進行濃縮,濃縮后的溶液含有約200000個感染單位,注射25μL濃縮液至正常小鼠C57BL/6或者基因敲除小鼠Siglec1-/-的足底,一段時間后分離出小鼠的腘窩淋巴結,經膠原酶TL(0.2mg/mL,Roche)和DNA酶I(20μg/mL,Roche)在37℃孵育30分鐘,之后將組織通過70μm的細胞過濾器,添加10%的FCS使蛋白酶失活,然后用4%的多聚甲醛固定樣品,接著進行流式分析,對腘窩淋巴結處捕獲的HIV進行定量分析。

其中,如圖1所示,對注射不含M1(圖中對應空白組)和含M1(圖中對應加藥組)的溶液藥物后C57BL/6小鼠腘窩淋巴結處捕獲的HIV Gag-GFP進行比較分析;采用正常C57BL/6小鼠對M1是否能抑制HIV傳播進行了探究,因為HIV在體內的傳播主要依靠各免疫器官,并將其作為巢穴繁殖,所以研究中對小鼠采用足下注射病毒懸液后,分離出腘窩淋巴結并對其中的HIV進行定量,從圖1可以看出提前注射M1可有效減少HIV在腘窩淋巴結處的含量。

如圖2所示,對正常小鼠C57BL/6(圖中對應正常小鼠)和基因敲除小鼠Siglec1-/-(圖中對應基因敲除小鼠)腘窩淋巴結處捕獲的HIV Gag-GFP進行比較分析;HIV在血液中的傳播必須依靠免疫細胞作為載體,為了研究其依賴的細胞類型,研究中利用基因敲除小鼠Siglec1-/-對比正常小鼠進行了探究,從圖2結果發現基因敲除小鼠Siglec1-/-腘窩淋巴結處的HIV含量要明顯低于正常小鼠,考慮到基因敲除小鼠Siglec1-/-不能表達CD169,可以證明CD169對于HIV病毒在體內的傳播和在淋巴結處的聚集具有重要作用,HIV潛伏在CD169+巨噬細胞中隨血液循環傳播。

如圖3所示,免疫系統人源化BLT小鼠在不含M1(圖中對應空白組)和含M1(圖中對應加藥組)時脾臟中捕獲的HIV Gag-GFP進行比較分析;為了進一步證明M1能有效抑制HIV在小鼠體內的傳播,研究采用免疫系統人源化BLT小鼠模型對M1阻止HIV病毒感染遠端免疫器官—脾臟進行了探究,圖3的結果顯示與空白對照組相比,注射M1給藥后可以有效減少HIV在脾臟中的積累。脾臟作為主要的免疫器官,也是免疫細胞的主要聚集地之一,是血細胞儲備和更新的應急儲備庫,也是易受HIV病毒攻擊的主要器官之一,相對足部來說,脾臟距離較遠,HIV病毒必須通過較長距離的血液循環才能聚集在此處,而實驗結果表明,M1可有效抑制HIV在遠端免疫器官—脾臟中的聚集。

通過以上實驗和證據表明HIV病毒能通過CD169+巨噬細胞在體內傳播,而M1通過競爭性的與CD169相結合可以有效的抑制這一途徑。通過抑制HIV病毒在體內的擴散,可以起到治療和預防艾滋病的作用。

最后應說明的是:以上各實施例僅用以說明本發明的技術方案,而非對其限制;盡管參照前述各實施例對本發明進行了詳細的說明,本領域的普通技術人員應當理解:其依然可以對前述各實施例所記載的技術方案進行修改,或者對其中部分或者全部技術特征進行等同替換;而這些修改或者替換,并不使相應技術方案的本質脫離本發明各實施例技術方案的范圍。

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