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一種豬支原體肺炎滅活疫苗的生產方法.pdf

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種豬 支原體 肺炎 疫苗 生產 方法
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摘要
申請專利號:

CN201510249922.0

申請日:

20150515

公開號:

CN104940918B

公開日:

20180316

當前法律狀態:

有效性:

有效

法律詳情:
IPC分類號: A61K39/02,A61P31/04 主分類號: A61K39/02,A61P31/04
申請人: 北京中海生物科技有限公司,吉林和元生物工程有限公司
發明人: 孫曄,吳金,馮忠澤,沈青春,李秋菊,魏晶晶,李聰研,孫亞波,宋瀟婷,史文艷
地址: 100081 北京市海淀區中關村南大街8號
優先權: CN201510249922A
專利代理機構: 北京君智知識產權代理事務所(普通合伙) 代理人: 鄭明
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法律狀態
申請(專利)號:

CN201510249922.0

授權公告號:

法律狀態公告日:

法律狀態類型:

摘要

本發明涉及一種豬支原體肺炎滅活疫苗的生產方法。本發明是在成功分離到一株免疫原性良好的豬肺炎支原體(Mycoplasma?hyopneumoniae?Mhp)S株作為生產菌株,通過使用高效的培養基,研究出適宜的培養方法、滅活工藝和適宜的免疫佐劑,制造出豬肺炎支原體滅活疫苗,本發明生產出的滅活疫苗具用于免疫豬后獲得良好的免疫保護效力。

權利要求書

1.一種豬支原體滅活疫苗,其特征在于該滅活疫苗含有滅活的豬支原體(Mycoplasmahyopneumoniae,Mhp)S株和獸醫生物制品允許使用的佐劑;該豬肺炎支原體S株已于2014年12月1日送交北京市朝陽區北辰西路1號院3號中國科學院微生物研究所中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏,保藏號為CGMCCNo.10095。2.如權利要求1所述一種豬支原體滅活疫苗的生產方法,其特征在于該滅活疫苗的生產為:(1)疫苗制造用抗原的制備:將二級種子按1:20接種Lps-5培養基,在37℃培養3~6日,當pH值達到6.9左右,收獲培養物,再按1:50比例以同樣的方法傳代培養,直到收獲菌液制造疫苗;(2)滅活:培養后菌液經β-丙內酯置滅活處理,加入硫柳汞作為防腐劑;(3)配苗:將滅活后菌液與油佐劑按(V/V)1:1的比例混合,使用低剪切力乳化制備水成包油包水(W/O/W)雙相疫苗。3.如權利要求1所述一種豬支原體滅活疫苗的生產方法,其特征在于該滅活疫苗的生產為:將滅活后菌液與水佐劑按(V/V)1:1的比例混合,攪拌均勻后制備水劑滅活疫苗。

說明書

技術領域

本發明涉及豬的一種傳染病預防用滅活疫苗,本專利屬于獸用生物制品技術領域。

背景技術

豬支原體肺炎(Mycoplasma pneumoniae of swine,MPS),又稱豬地方流行性肺炎(Enzootic pneumoniae of Swine,EPS),俗稱豬喘氣病,是由豬肺炎支原體(Mycoplasma hyopneumoniae)引起的一種慢性接觸性呼吸道傳染病,主要癥狀為表現為咳嗽和氣喘,生長遲緩,飼料轉化率低。該病具有發病率高,死亡率低,廣泛分布于世界各地,是造成全球養豬經濟損失最重要的疾病之一。

豬肺炎支原體具有典型支原體的全部形態特征,無細胞壁菌體呈多種形態,在電鏡下可以見到球狀、環狀、絲狀及點狀的菌體形態。在固體培養基上10~14日可見到菌落,多為圓形,邊緣通常不整齊,半透明,少數中央有乳頭狀突起,大小在100~300μm之間。豬肺炎支原體是當前最難培養的支原體種類之一,其對培養基營養成分和培養條件要求非常苛刻,在普通培養基上難以生長。要從發病豬體內或病變組織分離豬肺炎支原體是件極其困難的事,初次分離生長非常緩慢,通常需要10~30日的培養,才能引起培養物顏色發生變化,而且培養物滴度很低,需經過持續馴化后才能達到較高的活菌滴度,培養時間可縮短為3~4日。

患病豬是該病最主要傳染源,病豬和健康豬混群飼養,常引起本病的傳播。各種年齡的豬均可感染本病,但幼齡仔豬易感性比成年豬高,而且發病癥狀也更加明顯,由此引起的經濟損失也較為嚴重。在老疫區,患病母豬往往是主要傳染源,并將病原體傳染給仔豬,造成該病在豬群中長期的存在。豬支原體肺炎的傳播途徑主要是直接接觸傳播和空氣傳播兩種形式,當患病豬與健康豬直接接觸,或同圈飼養的病豬咳嗽時將病原體通過呼吸道排出體外,健康豬吸入病原體而感染。Goodwin等1966年證明從患有喘氣病的豬鼻腔分泌物中成功分離出豬肺炎支原體(Goodwin RF,Whittlestone P:Enzootic pneumonia of pigs:growth and behaviour of the causal mycoplasma in liquid media.Br J Exp Pathol 1966,47(5):518-524.)。

豬肺炎支原體可單獨引起豬發病,也可與其他病原體引起混合感染,包括支原體(如豬鼻支原體)、細菌(如豬副嗜血桿菌、胸膜肺炎放線桿菌及敗血波氏桿菌、巴氏桿菌等)、病毒(如豬藍耳病病毒、豬瘟等),甚至包括肺絲蟲等寄生蟲,在實際生產中,絕大部分表現出典型豬喘氣病的病豬都是混合感染。

對發病豬進行剖檢,可發現其主要病變發生在肺臟,通常出現在尖葉、心葉、中間葉和膈葉的前緣部分,可見到暗紅色的肉樣病變,與正常肺組織界限清晰。肺部病變部位的病理變化是結締組織增生硬化,與相鄰正常肺組織齊平或下陷。切割時切面濕潤、平滑致密,類似于鮮嫩的肌肉,氣管和支氣管中常伴有卡它性分泌物,肺門淋巴結和隔淋巴結常明顯腫大。

該病的防治主要通過疫苗免疫,藥物治療可緩解或減輕疾病癥狀,降低發病率,但不能根除病原體,也不能阻止再感染,停藥后往往會很快復發,極大地影響養殖的成本。當前豬支原體肺炎疫苗主要包括弱毒活疫苗和滅活疫苗兩種。

截至當前,豬支原體肺炎的防治工作仍是世界上養豬業面臨的一個難題。疫苗免疫是所有預防控制手段中最有效的途徑,我國針對豬支原體肺炎疫苗的研究開始于上世紀60年代,直到90年代中國獸醫藥品監察所成功馴化出了一株免疫原性良好的豬肺炎支原體弱毒疫苗,并研制乳兔組織活疫苗和雞胚活疫苗,本世紀初江蘇農科院研制出了豬支原體肺炎活疫苗(168株),但以上活疫苗都采用胸腔注射免疫,操作上不易被用戶接受,影響其推廣使用。近年來,中國獸醫藥品監察所又研制出采用鼻腔噴射免疫的豬支原體肺炎活疫苗(RM48株)。我國在活疫苗上研制上處于領先地位,但在滅活疫苗的研制上則起步較晚。

發明內容

本發明的目的是為將成功分離到一株免疫原性良好的豬肺炎支原體野毒株的基礎上,通過使用高效的培養基,研究出適宜的培養方法、滅活工藝和適宜的免疫佐劑,制造免疫保護效力良好的豬肺炎支原體滅活疫苗的方法。

本發明的實施方案:

1.一種豬支原體滅活疫苗,其特征在于該滅活疫苗含有滅活的S株豬支原體(Mycoplasma hyopneumoniae)和獸醫生物制品允許使用的佐劑;該豬肺炎支原體S株已于2014年12月1日送交北京市朝陽區北辰西路1號院3號中國科學院微生物研究所中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏,保藏號為CGMCC No.10095。

2.如權利要求1所述一種豬支原體滅活疫苗的生產方法,其特征在于該滅活疫苗的生產為:

(1)疫苗制造用抗原的制備:將二級種子按1:20接種Lps-5培養基,在37℃培養3~6日,當pH值達到6.9左右,收獲培養物,再按1:50比例以同樣的方法傳代培養,直到收獲菌液制造疫苗;

(2)滅活:培養后菌液經β-丙內酯置滅活處理,加入硫柳汞作為防腐劑;

(3)配苗:

油劑苗 將滅活后菌液與油佐劑(法國賽比克公司)按(V/V)1:1的比例混合,使用低剪切力乳化制備水成包油包水(W/O/W)雙相疫苗。

水劑苗 將滅活后菌液與水佐劑(法國賽比克公司),按1:1的比例,攪拌均勻后制備成水劑滅活疫苗。

具體實施方式

本品系用豬肺炎支原體S株接種Lps-5培養基,收獲培養物,加入適量的佐劑,乳化后制成。用于預防豬支原體肺炎(俗稱豬喘氣病)。

1 菌種

(1)制造本品用的菌種為豬肺炎支原體(Mycoplasma hyopneumoniae)S株,由北京中海生物科技有限公司分離、鑒定;該豬肺炎支原體,S株,已于2014年12月1日送交北京市朝陽區北辰西路1號院3號中國科學院微生物研究所中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏,保藏號CGMCC No.10095。效力檢驗用菌種為豬肺炎支原體JN株,由中國獸醫藥品監察所提供。

(2)豬肺炎支原體(Mycoplasma hyopneumoniae)S株生產用菌種標準

l)形態特性 菌體形態為環狀、球狀、絲狀、桿狀和點狀多形態微生物,無細胞壁,革蘭氏染色陰性。

2)培養特性 在Lps-5液體培養基中,置37℃下培養5~10日,培養基pH值下降0.5以上,呈現輕度混濁;在固體培養基上,置含CO2潮濕環境下37℃培養7~10日,低倍顯微鏡下可見支原體菌落。該菌株的菌落為灰白色支原體的菌落形態,大多數菌落邊緣整齊,有少數菌落邊緣不整齊,多數菌落中間沒有“臍”狀特征。

3)血清學特性 用代謝抑制試驗鑒定。將豬肺炎支原體S株菌液用Lps培養基稀釋至104或105顏色變化單位/mL(CCU/mL)后,加入等量含10%的抗豬肺炎支原體陽性兔血清(中國獸醫藥品監察所提供)(瓊脂擴散反應效價≥1:16)的Lps-5培養基,同時設不加陽性血清的豬肺炎支原體培養物對照管,置37℃培養15日,觀察培養基顏色變化。對照管pH值下降0.5以上,含陽性血清的試管培養基顏色不發生變化或pH值下降低于0.5為合格。豬肺炎支原體陽性血清能特異地抑制豬肺炎支原體對培養基中葡萄糖的代謝。

4)免疫原性 使用豬肺炎支原體S株菌種,按照本規程制備疫苗,使用7~14日齡健康子豬5頭,頸部肌肉注射疫苗0.5mL,14日后再次肌肉注射0.5mL。首次免疫后21日,連同對照組5頭豬一同使用豬肺炎支原體JN株肺組織毒進行氣管內攻毒,5mL/頭(含肺組織量0.01g)。觀察28日后剖檢,取豬肺臟按照附件3豬肺病變指數和保護率計算方法,病變指數減少率應不低于60%。

5)純粹 按現行《中國獸藥典》(中國獸藥典委員會編,全稱《中華人民共和國獸藥典》三部,二〇一〇年版,中國農業出版社,本發明以下稱《中國獸藥典》)附錄進行檢驗,應純粹。

6)基礎種子代數 1~3代。

7)保存 弱毒凍干菌種–20℃以下保存,有效期為72個月。

(2)檢驗用強毒菌株標準

1)PCR檢測 用豬肺炎支原體16s RNA的特異序列為目的片段設計引物進行擴增,豬肺炎支原體JN株肺組織毒應呈現特異性陽性反應(見附注4)。

2)毒力 將豬肺炎支原體JN株肺組織毒(含病變肺組織0.1g)用PBS(pH值7.2)1:50倍稀釋,經氣管途徑感染30~50日齡健康敏感豬5頭,5mL/頭,觀察28日,試驗豬肺臟病變平均分達到1.0以上為合格。

3)菌種保存 強毒凍干菌種JN株–20℃以下保存,有效期72個月。

2.疫苗制造及半成品檢驗

(1)生產用菌種的制備

1)一級種子的繁殖 將凍干基礎菌種開啟后,使用Lps-5培養基溶解后,以1:10的比例接種Lps-5培養基,置37℃下培養3~10日,當培養物pH值達到6.8~7.0,收獲菌液并進行純粹檢驗,標明收獲日期,菌種代次。檢驗符合規定后即可作為一級種子。

2)二級種子的繁殖 將一級種子化凍后,以1:10~20的比例接種Lps-5培養基,置37℃下培養3~7日,當培養物pH值達到6.8~7.0,收獲菌液并進行純粹檢驗,標明收獲日期,菌種代次,置–15~–40℃凍存2個月或2~8℃保存3日內使用。檢驗符合規定后即可作為二級種子。

3)菌種保存 一級種子置–60~–80℃凍存,不超過6個月;二級種子置–15~–40℃凍存不超過2個月或2~8℃保存不超過5日。

4)菌種繼代 從基礎種子到制苗用菌液的傳代代次不超過5代。

(2)培養基 Lps-5培養基(見附注6)。

(3)疫苗制造用抗原的制備

將二級種子按1:20接種Lps-5培養基,在37℃培養3~6日,當pH值達到6.9左右,收獲培養物,再按1:50比例以同樣的方法傳代培養,直到收獲菌液制造疫苗。取樣進行半成品檢驗,其余部分置2~8℃,菌液冷卻后即可進行滅活處理。

(4)滅活

將半成品菌液,加入1:4000的比例加入β-丙內酯置2~8℃滅活24h后,置37±1℃溫室2h水解,加入0.001%的硫柳汞作為防腐劑,置2~8℃冷庫保存。

(5)半成品檢驗

1)純粹檢驗 按《中國獸藥典》附錄進行檢驗,應純粹。

2)活菌計數 取滅活前的半成品菌液,以Lps-5培養基按照附件5,置37℃下培養14日,檢測培養物中支原體的活菌含量,凍干前半成品的活菌數應不低于2×108CCU50/mL。

3)滅活檢驗 取1mL滅活后的菌液接種到20mL的Lps-5培養基,置37±1℃培養5日后,分別取0.2mL接種到3支裝有1.8mL培養基的小管,置37±1℃繼續培養10日,兩次接種的培養基顏色均未變黃,則滅活完全。

(6)配苗及分裝

油劑苗的配制 將滅活后菌液與油佐劑分別預熱到31±1℃后,按1:1的比例,使用低剪切力乳化5~10min,一步法制備水包油包水(W/O/W)雙相滅活疫苗。

水劑苗的配制 將滅活后菌液與水佐劑,按1:1的比例,攪拌3~5min,制備成水劑滅活疫苗。

(7)分裝 對配制好的疫苗半成品按照規定頭份定量分裝。

3 成品檢驗

(1)性狀

1)油劑苗

外觀 乳白色乳液。

劑型 水包油包水(W/O/W)型。

穩定性 吸取疫苗10mL置一次性離心管中,以3000r/min離心15min,底部析出的水相不超過0.5mL。

黏度 按現行《中國獸藥典》附錄進行,應不超過200mPa.s。

2)水劑苗

外觀 黃色或橙色均與懸液。

(2)無菌檢驗 按現行《中國獸藥典》附錄進行檢驗,應純粹。

(3)裝量檢查 按現行《中國獸藥典》附錄進行檢驗,應符合規定。

(4)安全檢驗 用7~14日齡健康敏感豬5頭,雙倍免疫劑量免疫后的總分均不大于4判為安全,評價方法見附件3。

(5)效力檢驗(兩種方法仍選其一)

1)用家兔檢驗 使用1.2~1.5kg清潔級新西蘭試驗兔共10只,其中5只作為對照組,5只各前腿部肌肉注射0.2mL,2周后后腿各肌肉注射0.2mL。免疫后14日檢測豬肺炎支原體IHA抗體效價。對照組應全部陰性,免疫組試驗兔應至少4只陽性(即IHA抗體不低于1/20)。IHA抗體測定方法見附注7。

2)用豬檢驗 用7~14日齡健康易感仔豬10頭,其中5頭作為對照豬,對另5頭各肌肉注射疫苗1mL,14日后再次肌肉注射1mL。首免后30日,連同對照組5頭豬一同使用豬肺炎支原體JN株肺組織毒進行氣管內攻毒,5mL/頭(含肺組織量0.1g)。觀察28日后剖檢,取豬肺臟按照附件2豬支原體肺炎病變指數評分標準進行評分和計算,病變指數減少率應不低于60%。

(6)汞類防腐劑殘留量測定按照現行《中國獸藥典》附錄進行測定,應符合規定。

4 作用與用途 用于預防豬支原體肺炎(豬喘氣病),免疫期為6個月。

5 用法與用量 7~35日齡仔豬肌肉注射1mL/頭,14日后相同劑量加強免疫一次。

6 注意事項

6.1 疫苗2~8℃保存,嚴禁凍結,避免高溫和日光直射。

6.2 疫苗開啟應一次用完。

6.3 本疫苗只用于健康豬,并每頭豬更換一次注射針頭。

6.4 屠宰前1個月內不應免疫本疫苗。

7 貯藏與有效期 2~8℃保存,有效期為18個月。

8 規格10mL/瓶、20mL/瓶、50mL/瓶、100mL/瓶、250mL/瓶。

本發明涉及的微生物資源信息

豬肺炎支原體(Mycoplasma hyopneumoniae)S株,該菌株已于2014年12月1日送交北京市朝陽區北辰西路1號院3號中國科學院微生物研究所中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏,保藏號CGMCC No.10095。效力檢驗用菌種為豬肺炎支原體(Mycoplasma hyopneumoniae)JN株,由中國獸醫藥品監察所提供。

本發明的積極意義

本發明涉及一種豬支原體肺炎滅活疫苗的生產方法。本發明是在成功分離到一株免疫原性良好的豬肺炎支原體(Mycoplasma hyopneumoniae)S株作為生產菌株,通過使用高效的培養基,研究出適宜的培養方法、滅活工藝和適宜的免疫佐劑,制造出豬肺炎支原體滅活疫苗,本發明生產出的滅活疫苗具用于免疫豬后獲得良好的免疫保護效力。

附圖說明

圖1豬支原體肺炎的肺臟病變圖顏色深的部分即為豬支原體肺炎的典型肉樣病變區。

圖2血清樣品檢測劑稀釋圖

圖3血凝反應結果判定圖

實施例

本實施例僅為對本發明作進一步說明,不對本發明的技術方案構成限定。

實施例1

——疫苗制造及半成品檢驗

(1)生產用菌種的制備

1)一級種子的繁殖 將凍干基礎菌種開啟后,使用Lps-5培養基溶解后,以1:10的比例接種Lps-5培養基,置37℃下培養3~10日,當培養物pH值達到6.8~7.0,收獲菌液并進行純粹檢驗,標明收獲日期,菌種代次。檢驗符合規定后即可作為一級種子。

2)二級種子的繁殖 將一級種子化凍后,以1:10~20的比例接種Lps-5培養基,置37℃下培養3~7日,當培養物pH值達到6.8~7.0,收獲菌液并進行純粹檢驗,標明收獲日期,菌種代次,置–15~–40℃凍存2個月或2~8℃保存3日內使用。檢驗符合規定后即可作為二級種子。

3)菌種保存 一級種子置–60~–80℃凍存,不超過6個月;二級種子置–15~–40℃凍存不超過2個月或2~8℃保存不超過5日。

4)菌種繼代 從基礎種子到制苗用菌液的傳代代次不超過5代。

(2)培養基 Lps-5培養基(見附注6)。

(3)疫苗制造用抗原的制備

將二級種子按1:20接種Lps-5培養基,在37℃培養3~6日,當pH值達到6.9左右,收獲培養物,再按1:50比例以同樣的方法傳代培養,直到收獲菌液制造疫苗。取樣進行半成品檢驗,其余部分置2~8℃,菌液冷卻后即可進行滅活處理。

(4)滅活

將半成品菌液,加入1:4000的比例加入β-丙內酯置2~8℃滅活24h后,置37±1℃溫室2h水解,加入0.001%的硫柳汞作為防腐劑,置2~8℃冷庫保存。

(5)半成品檢驗

1)純粹檢驗 按現行《中國獸藥典》附錄進行檢驗,為純粹。

2)活菌計數 取滅活前的半成品菌液,以Lps-5培養基按照附件5,置37℃下培養14日,檢測培養物中支原體的活菌含量,凍干前半成品的活菌數應不低于2×108CCU50/mL。

3)滅活檢驗 取1mL滅活后的菌液接種到20mL的Lps-5培養基,置37±1℃培養5日后,分別取0.2mL接種到3支裝有1.8mL培養基的小管,置37±1℃繼續培養10日,兩次接種的培養基顏色均未變黃,滅活完全。

實施例2

------豬支原體肺炎滅活疫苗(S株,油佐劑)的制備與檢驗

1.配苗及分裝

將實施例1制備成滅活后的豬肺炎支原體S株菌液與油佐劑(法國賽比克公司)分別預熱到31±1℃后,按1:1的比例,使用低剪切力乳化5~10min,一步法制備水包油包水(W/O/W)雙相疫苗。

分裝 對乳化好的疫苗半成品按照規定頭份定量分裝。

2.成品檢驗

(1)性狀

均為乳白色乳液;吸取疫苗10mL置一次性離心管中,以3000r/min離心15min,底部均無水相析出;按現行《中國獸藥典》附錄進行黏度測定,結果分別為45mPa.s、53mPa.s和46mPa.s。3批性狀檢驗結果均符合規定。

(2)無菌檢驗 按現行《中國獸藥典》附錄進行檢驗,3批疫苗均無細菌生長,結果符合規定。

(3)裝量檢查 按現行《中國獸藥典》附錄進行檢驗,3批疫苗均符合規定。

(4)疫苗安全檢驗

1)小鼠安全檢驗

3批疫苗分別腹腔注射15~22g Balb/C小鼠8只,觀察10日,小鼠均健活;

2)仔豬安全檢驗

超劑量肌肉注射仔豬,觀察7日,首次免疫后4~5日仔豬體溫略有升高,持續1~3日后均恢復正常,仔豬均健活,除注射部位出現輕微紅腫,無其他副反應。

(5)效力檢驗(兩種方法仍選其一)

1)用家兔檢驗 使用1.2~1.5kg清潔級新西蘭試驗兔共10只,其中5只作為對照組,5只各前腿部肌肉注射0.2mL,2周后后腿各肌肉注射0.2mL。免疫后14日檢測豬肺炎支原體IHA抗體效價。對照組應全部陰性,免疫組試驗兔應至少4只陽性(即IHA抗體不低于1/20)。結果見表1。

表1 豬支原體肺炎滅活疫苗(S株,油佐劑)家兔免疫后抗體IHA效價測定結果

2)用豬檢驗 用7~14日齡健康易感仔豬10頭,其中5頭作為對照豬,對另5頭各肌肉注射疫苗1mL,14日后再次肌肉注射1mL。首免后30日,連同對照組5頭豬一同使用豬肺炎支原體JN株肺組織毒進行氣管內攻毒,5mL/頭(含肺組織量0.1g)。觀察28日后剖檢,取豬肺臟按照附件豬支原體肺炎病變指數評分標準進行評分和計算,病變指數減少率應不低于60%。結果表明保護率均符合標準要求。

表2 豬支原體肺炎滅活疫苗(S株,油佐劑)效力檢驗結果

(6)汞類防腐劑殘留量測定3批疫苗的測定結果均符合標準要求。

實施例3

------豬支原體肺炎滅活疫苗(S株,水佐劑)的制備與檢驗

1.配苗及分裝

將將實施例1制備成滅活后的豬肺炎支原體S株菌液與水佐劑(法國賽比克公司)按1:1的比例,混合攪拌3~5min,制備成水佐劑滅活疫苗。

分裝 對配制好的疫苗半成品按照規定頭份定量分裝。

2.成品檢驗

2.成品檢驗

(1)性狀 3批疫苗均為橙色懸液,結果均符合規定。

(2)無菌檢驗 按現行《中國獸藥典》附錄進行檢驗,3批疫苗均無細菌生長,結果符合規定。

(3)裝量檢查 按現行《中國獸藥典》附錄進行檢驗,3批疫苗均符合規定。

(4)疫苗安全檢驗

1)小鼠安全檢驗

3 批疫苗分別腹腔注射15~22g Balb/C小鼠8只,觀察10日,小鼠均健活;

2)仔豬安全檢驗

超劑量肌肉注射仔豬,觀察7日,首次免疫后4~5日仔豬體溫略有升高,持續1~3日后均恢復正常,仔豬均健活,除注射部位出現輕微紅腫,無其他副反應。

(5)效力檢驗

1)用家兔檢驗使用1.2~1.5kg清潔級新西蘭試驗兔共10只,其中5只作為對照組,5只各前腿部肌肉注射0.2mL,2周后后腿各肌肉注射0.2mL。免疫后14日檢測豬肺炎支原體IHA抗體效價。對照組應全部陰性,免疫組試驗兔應至少4只陽性。結果見表3。

表3 豬支原體肺炎滅活疫苗(S株,水佐劑)家兔免疫后抗體IHA效價測定結果

2)用豬檢驗 用7~14日齡健康易感仔豬10頭,其中5頭作為對照豬,對另5頭各肌肉注射疫苗1mL,14日后再次肌肉注射1mL。首免后30日,連同對照組5頭豬一同使用豬肺炎支原體JN株肺組織毒進行氣管內攻毒,5mL/頭(含肺組織量0.1g)。觀察28日后剖檢,取豬肺臟按照附件豬支原體肺炎病變指數評分標準進行評分和計算,病變指數減少率應不低于60%。結果見表4。

表4 豬支原體肺炎滅活疫苗(S株)效力檢驗結果

(6)汞類防腐劑殘留量測定3批疫苗的測定結果均符合標準要求。

附件: 1.健康敏感豬標準

2.豬肺病變指數和保護率計算方法

3.疫苗安檢豬臨床發病判定標準

4.豬肺炎支原體PCR檢測

5.CCU50測定方法

6.Lps-5培養基配制

7.間接血凝(IH)試驗方法

附件1 健康敏感豬標準

1.1 來源要求 母豬未免疫過豬支原體肺炎疫苗,豬場無豬喘氣病發病史。

1.2 健康狀況 仔豬飲食正常,精神狀態和發育良好,體溫、呼吸、糞便正常,無任何與疾病有關的臨床癥狀。

1.3 試驗豬的檢測

1.3.1 豬肺炎支原體抗體檢測

使用市售的豬肺炎支原體抗體檢測試劑盒進行檢測,檢驗用豬血清應為豬肺炎支原體抗體陰性。

1.3.2 豬繁殖與呼吸綜合癥的病原檢測

使用市售的豬繁殖與呼吸綜合癥(PRRSV)RT-PCR檢測試劑盒檢測,結果應為陰性。

1.3.2 豬偽狂犬的病原檢測

使用市售的豬偽狂犬(PRV)PCR檢測試劑盒檢測,結果應為陰性。

附件2 豬肺病變指數和保護率計算方法

2.1 試驗用豬 7~14日齡健康敏感豬10頭。

2.2 試驗攻毒 將豬肺炎支原體強毒JN株肺組織毒l:50稀釋后,連同對照組經氣管內注射攻毒,5mL/頭,觀察25日后撲殺,觀察、記錄肺臟病變情況。

2.3 病變指數的計算

本標準參照了國外常用的5.5分法評分標準,左、右尖葉出現100%病變各記1分,左、右心葉出現100%病變各記1分,左、右膈葉(與心葉相鄰的三角形區域)出現100%病變各記0.5分,中間葉出現100%病變各記0.5分,病變總分為5.5分。根據肺臟出現病變的輕重程度加減分值。同一個肺葉的正反兩面病變面積不一致時,取平均面積。如圖1中感染豬支原體肺炎的豬肺臟評分,左尖葉病變40%,計0.4分;右尖葉病變100%,計1.0分;左心葉病變100%,計1.0分;右心葉病變100%,計1.0分;左膈葉病變100%,計0.5分,右膈葉病變100%,計0.5分;中間葉病變40%,計0.2分,則病變總分=左尖葉+右尖葉左心葉+右心葉++左膈葉+右膈葉+中間葉=0.4+1.0+1.0+1.0+0.5+0.5+0.2=4.7(見附圖1)。

2.4 保護率的計算

保護率計算公式如下:

附件3 疫苗安檢豬臨床發病判定標準

根據檢驗豬如下臨床癥狀進行判斷:呼吸困難、俯臥、嘔吐、死亡和直腸溫度等。發病豬臨床癥狀評判標準見下表1。

表1 豬支原體肺炎發病豬臨床癥狀評判標準

豬安檢試驗中,每頭試驗豬癥狀全部累計,兩次免疫單獨計算不累加。兩次免疫后的總分均不大于4判為安全;任何一次免疫后總分大于4判為安全檢驗不符合規定,按照現行《中國獸藥典》獸用生物制品通則的要求進行重檢。

附件4 豬肺炎支原體PCR檢測

4.1 引物序列 上游引物為5’-GAGCCTTCAAGCTTCACCAAGA-3’(序列1),下游引物為5’-TGTGTTAGTGACTTTTGCCACC-3’(序列2)。

4.2 模板制備 用滅菌PBS(pH值7.2)稀釋將待檢組織勻漿液(或培養物)稀釋20倍后,沸水浴10分鐘后,12000g離心10分鐘,取上清作為PCR檢測用模板。同時設置陰陽性對照。

4.3 反應條件 反應體系為:總體系20μl,其中模板DNA 1μl,10×buffer 2μl,dNTP(2.5mmol/L)2μl,上下游引物(25mmol/L)各1μl,去離子水12.5μl,Taq酶0.5μl,PCR反應條件為:95℃預變性5分鐘;95℃變性40秒、60℃退火40秒、72℃延伸60秒,共35個循環;72℃延伸5min。

4.4 結果判定 陽性對照出現649bp電泳條帶,陰性對照無擴增條帶,試驗結果有效。出現約為649bp擴增條帶的樣品為豬肺炎支原體陽性。

附件5 CCU50測定方法

先將豬肺炎支原體培養物使用Lps-5培養基(液體)進行10倍比稀釋至10-9,分別從10-6、10-7、10-8、10-9管中各取0.2mL加入到裝有1.8mL培養基的小管中,每個稀釋度設6個重復,共計24支小管,置37℃靜置培養。2周后進行結果判定,統計各個稀釋度培養基變色(pH變化值≥5)的小管數量,按照Reed和Muench法計算半數變色單位(CCU50)。

三次對S株F3代培養物進行CCU50測定的結果

參照《中國獸藥典》(2010版,三部)附錄7的病毒半數致死量、感染量測定法,計算CCU50方法如下:

log CCU50=高于50%變色的稀釋度的對數+距離比例×稀釋系數的對數;

以上表為例,高于50%變色的稀釋度為-8,

log CCU50=-8+0.75×(-1)=-8.75;

即CCU50=10-7.75/0.2mL,將其轉換成每毫升含CCU50數2.5×108CCU50/mL。該方法相比CCU的測定結果表示更加精確,可重復性更好。

附件6.Lps-5培養基配制

6.1 Lps-5培養基基礎液的配制:PPLO粉、葡萄糖、水解乳蛋白(Difco)、10%MEM、25%酵母浸出液、青霉素、酚紅0.002%等溶于50mL蒸餾水中,使用2mol/L NaOH調pH值至7.8~7.9,補加去離子水至總體積800mL,使用0.2μm濾器過濾除菌,分裝。2~8℃保存備用。

6.2 Lps-5培養基的配制,培養基基礎液800mL,分別加入100mL豬血清和馬血清。1mol/L NaOH調pH值至7.5~7.6,分裝,按現行《中國獸藥典》附錄進行無菌檢驗,應無菌生長,2~8℃保存不超過4個月。

6.3 Lps-5固體培養基制備

將7.1中除了10%MEM和青霉素外,其余成分中再加入1.5%的瓊脂,115℃高壓滅菌30min后,冷卻到50~60℃,分別無菌加入預熱過的MEM、青霉素和血清。

附件7 間接血凝(IH)試驗方法

7.1 檢測前的準備

將抗原溶解液全部加入到豬喘氣病間接血凝抗原中溶解搖勻,置2~8℃保存,并請在2周內使用完。待檢血清(每頭份血清量應大于0.1mL)56℃水浴滅活30分鐘(滅活可減少非特異性反應)。將一次性血凝板用蒸餾水沖洗一遍,拍干即可。

7.2 加稀釋液

取一次性醫用血凝板一塊橫放,從第6~7列孔間用記號筆垂直劃線將血凝板一分為二(每塊血凝板可檢測14個樣品,若只檢測少量樣品,請注意不要污染其它各排樣孔),在第1列和第7列孔中加入40μL稀釋液,其它各孔加入25μL稀釋液。如圖1所示。

7.3 稀釋待檢血清

在第1列的8個孔中分別加入1~8號豬血清各10μL;第7列的1~6個孔中分別加入9~14號豬血清各10μL;第7列的第7和8個孔分別加入陽性和陰性對照血清各10μL。陰性血清只稀釋到第4孔,第5、6孔作為空白對照。

每排第1孔,用移液器吹打5~6次混勻后從該孔中取出25μL移入第2孔,混勻后取出25μL移入第3孔……直至第6孔混勻后取出25μL丟棄。此時第1排1~6孔血清的稀釋度(稀釋倍數)依次為1:5、1:10、1:20、1:40、1:80、1:160。其它血清樣和對照血清也采用同樣的稀釋方法。如附圖2所示。

注意!取每一份血清時,都必須更換槍頭;每次稀釋都應更換槍頭一次。

7.4 加間接血凝抗原

將間接血凝抗原充分搖勻至底部無血球沉淀,在被檢血清各孔、陰性和陽性對照及空白對照各孔中分別加入間接血凝抗原25μL。

7.5 振蕩混勻

將血凝板置于微量振蕩器上振蕩30秒鐘左右(如無振蕩器,可輕輕振搖直至各孔紅血球混合均勻為止),裝入密封袋中,室溫靜置1.5~2小時后判定結果。

7.6 判定標準

將血凝板小心靜置于白色背景上,觀察檢測結果。

陰性對照血清和空白對照各孔,應均無凝集(血球全部沉入孔底形成邊緣整齊的小圓點),或僅出現“+”凝集(血球大部分沉于孔底,邊緣僅有少量血球)。

陽性血清對照效價應≥1:40,即至少在第1~4孔應出現“++”以上的凝集。

在對照孔均合格的前提下,再觀察待檢血清各孔,以呈現“++”凝集的最大稀釋倍數為該份血清的抗體效價。血凝反應強度表示如下:(參考附圖3)

++++ 血球在孔底形成較厚凝集層,向底部集中,卷邊或鋸齒狀邊。

+++ 血球在孔底形成均勻凝集,面積較大。

++ 血球在孔底中心形成少量血球或空心圓點,大部分血球凝集于孔底周圍。

+ 血球在孔底中心形成圓點,周圍均勻凝集。

- 血球在孔底中心形成較粗圓點,周圍無凝集或少量凝集。

當樣品血清抗體效價>1:10,即第2孔以上出現“++”的凝集,判為陽性;

當樣品血清抗體效價<1:5,即第1孔出現“++”以下的凝集,判為陰性。介于二者之間為可疑。

例如待檢血清第1~2孔出現“+++”的凝集,第3孔出現“++”的凝集,第4孔為“+”,即血清抗體效價為1:20,大于1:10,即為豬喘氣病抗體陽性。

7.7 注意事項與說明

7.7.1 對照用陰、陽性血清請勿多次凍融。

7.7.2 豬肺炎支原體血凝抗原稀釋后,2~8℃保存期間會自然沉積于瓶底,使用前振搖均勻即可使用。

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