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一種自靶向抗癌納米粒子及其制備方法.pdf

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一種 靶向 抗癌 納米 粒子 及其 制備 方法
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摘要
申請專利號:

CN201710861026.9

申請日:

20170921

公開號:

CN107596384A

公開日:

20180119

當前法律狀態:

有效性:

審查中

法律詳情:
IPC分類號: A61K47/69,A61K47/52,A61K47/54,A61K47/58,A61K31/517,A61P35/00 主分類號: A61K47/69,A61K47/52,A61K47/54,A61K47/58,A61K31/517,A61P35/00
申請人: 南開大學
發明人: 袁直,張亞慧
地址: 300000 天津市南開區衛津路94號
優先權: CN201710861026A
專利代理機構: 北京高沃律師事務所 代理人: 劉奇
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法律狀態
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CN201710861026.9

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法律狀態公告日:

法律狀態類型:

摘要

本發明提供了一種自靶向抗癌納米粒子,由表面羧酸化的金屬氧化物與活性部分通過酰胺鍵連接構成,所述活性部分為鍵連有雷替曲塞的乙酰化超支化聚乙烯亞胺;所述活性部分的質量含量為10~30%;所述乙酰化超支化聚乙烯亞胺與雷替曲塞通過酰胺鍵連接,所述乙酰化超支化聚乙烯亞胺與雷替曲塞的摩爾比為1:1~8。本發明利用多價相互作用,設計了上述自靶向抗癌納米粒子,該自靶向抗癌納米粒子上搭載了多個雷替曲塞,形成多價體系,通過該多價體系與受體的強結合力實現對癌細胞的高選擇性,同時利用雷替曲塞自身的毒性,特異性殺死癌細胞。

權利要求書

1.一種自靶向抗癌納米粒子,由表面羧酸化的金屬氧化物與活性部分通過酰胺鍵連接構成,所述活性部分為鍵合有雷替曲塞的乙酰化超支化聚乙烯亞胺;所述活性部分的質量含量為10~30%;所述乙酰化超支化聚乙烯亞胺與雷替曲塞通過酰胺鍵連接,所述乙酰化超支化聚乙烯亞胺與雷替曲塞的摩爾比為1:1~8。2.如權利要求1所述的自靶向抗癌納米粒子,其特征在于,所述表面羧酸化的金屬氧化物為表面包覆有檸檬酸的FeO納米粒子。3.如權利要求1或2所述的自靶向抗癌納米粒子,其特征在于,所述自靶向抗癌納米粒子的平均粒徑為100~200nm。4.一種權利要求1~3任一項所述的自靶向抗癌納米粒子的制備方法,包括如下步驟:(1)將雷替曲塞、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽、N-羥基琥珀酰亞胺和極性有機溶劑混合,對雷替曲塞進行活化;將所述活化所得活化液與超支化聚乙烯亞胺混合,進行第一酰胺化反應,得到鍵連有雷替曲塞的超支化聚乙烯亞胺;(2)將表面羧酸化的金屬氧化物、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽、N-羥基琥珀酰亞胺和水混合,對所述表面羧酸化的金屬氧化物進行活化,得到表面羧酸化的金屬氧化物活化液;(3)將所述步驟(2)得到的表面羧酸化的金屬氧化物活化液與所述步驟(1)得到的鍵連有雷替曲塞的超支化聚乙烯亞胺混合,進行第二酰胺化反應,得到自靶向抗癌納米粒子前驅體;(4)將所述步驟(3)得到的自靶向抗癌納米粒子前驅體與三乙胺和水混合,得到堿性前驅體溶液;向所述堿性前驅體溶液中加入乙酸酐,進行乙酰化反應,得到自靶向抗癌納米粒子;所述步驟(1)和步驟(2)之間沒有時間順序的限定。5.如權利要求4所述的制備方法,其特征在于,所述步驟(1)中雷替曲塞與超支化聚乙烯亞胺的摩爾比為0.5~10:1。6.如權利要求4所述的制備方法,其特征在于,所述步驟(2)中表面羧酸化的金屬氧化物與鍵連有雷替曲塞的超支化聚乙烯亞胺的質量比為2~5:1。7.如權利要求4~6任一項所述的制備方法,其特征在于,所述第一酰胺化反應和第二酰胺化反應的反應溫度獨立地為15~35℃,所述第一酰胺化反應和第二酰胺化反應的反應時間獨立地為20~30h。8.如權利要求4所述的制備方法,其特征在于,所述步驟(4)中自靶向抗癌納米粒子前驅體與三乙胺的質量比為1:20~30。9.如權利要求4所述的制備方法,其特征在于,所述步驟(4)中自靶向抗癌納米粒子前驅體與乙酸酐的質量比為1:20~30。10.如權利要求4或9所述的制備方法,其特征在于,所述乙酰化反應的反應溫度為15~35℃,所述乙酰化反應的反應時間為10~15h。

說明書

技術領域

本發明涉及醫藥技術領域,尤其涉及一種自靶向抗癌納米粒子及其制備方法。

背景技術

雷替曲塞(Raltitrexed)簡稱RTX,是由英國澤內卡公司研制的新型抗癌藥物,其化學名稱為N-{5-{N-{(3,4-二氫-2-甲基-4-氧-6-喹唑啉基)-甲基}-N-甲氨基}-2-噻吩基}-L-谷氨酸。雷替曲塞于1996年在英國上市,已成為晚期結腸癌和直腸癌治療的一線藥物。此外,國內外Ⅰ、Ⅱ期臨床試驗均已評估雷替曲塞單藥或聯合用藥在治療胃癌、胰腺癌、食管癌、惡性間皮瘤、頭頸部惡性腫瘤和乳腺癌等腫瘤中的效果,結果表明雷替曲塞對于其他腫瘤也具有良好的治療前景。

雷替曲塞具有和腫瘤靶向配體葉酸相似的結構,因此可以和在上皮腫瘤譜系高表達的葉酸受體結合,具有一定的靶向作用。雷替曲塞經葉酸受體介導進入細胞后,在葉酰聚谷氨酸合成酶作用下轉化為多聚谷氨酸鹽,作用于胸腺苷合成酶(TS)靶點的葉酸結合部位,這些多聚谷氨酸鹽比雷替曲塞具有更強的抑制胸腺苷合成酶作用,其半衰期可達198h,從而抑制細胞內葉酸代謝,導致細胞死亡。由于雷替曲塞具有上述對葉酸受體的靶向性和對細胞內葉酸代謝抑制的雙重作用,使其成為一種具有一定自靶向功能的抗癌藥物。

但是,雷替曲塞作為一種小分子藥物通常采用直接注射的方式使用,由于裸藥雷替曲塞的靶向性較弱,不能有效地靶向到達腫瘤部位實現針對性的治療,副作用較大。CN1969854A將雷替曲塞包裹于腸溶性包衣中,得到一種緩釋制劑,通過口服的方式進入人體,實現了結腸定位,降低了藥物的全身性副作用。但具有特異溶解性的包衣會使藥物局限于治療某一種癌癥,而不具有廣泛適用性,限制了雷替曲噻的治療范圍。

發明內容

本發明的目的在于提供一種自靶向抗癌納米粒子及其制備方法。本發明所提供的自靶向抗癌納米粒子對癌細胞具有較強的靶向性,能夠特異性殺死癌細胞,且對癌癥細胞具有廣泛適用性。

本發明提供了一種自靶向抗癌納米粒子,由表面羧酸化的金屬氧化物與活性部分通過酰胺鍵連接構成,所述活性部分為鍵合有雷替曲塞的乙酰化超支化聚乙烯亞胺;所述活性部分的質量含量為10~30%;所述乙酰化超支化聚乙烯亞胺與雷替曲塞通過酰胺鍵連接,所述乙酰化超支化聚乙烯亞胺與雷替曲塞的摩爾比為1:1~8。

優選的,所述表面羧酸化的金屬氧化物為表面包覆有檸檬酸的Fe3O4納米粒子。

優選的,所述自靶向抗癌納米粒子的平均粒徑為100~200nm。

本發明還提供了上述自靶向抗癌納米粒子的制備方法,包括如下步驟:

(1)將雷替曲塞、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽、N-羥基琥珀酰亞胺和極性有機溶劑混合,對雷替曲塞進行活化;將所述活化所得活化液與超支化聚乙烯亞胺混合,進行第一酰胺化反應,得到鍵連有雷替曲塞的超支化聚乙烯亞胺;

(2)將表面羧酸化的金屬氧化物、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽、N-羥基琥珀酰亞胺和水混合,對所述表面羧酸化的金屬氧化物進行活化,得到表面羧酸化的金屬氧化物活化液;

(3)將所述步驟(2)得到的表面羧酸化的金屬氧化物活化液與所述步驟(1)得到的鍵連有雷替曲塞的超支化聚乙烯亞胺混合,進行第二酰胺化反應,得到自靶向抗癌納米粒子前驅體;

(4)將所述步驟(3)得到的自靶向抗癌納米粒子前驅體與三乙胺和水混合,得到堿性前驅體溶液;向所述堿性前驅體溶液中加入乙酸酐,進行乙酰化反應,得到自靶向抗癌納米粒子;

所述步驟(1)和步驟(2)之間沒有時間順序的限定。

優選的,所述步驟(1)中雷替曲塞與超支化聚乙烯亞胺的摩爾比為0.5~10:1。

優選的,所述步驟(2)中表面羧酸化的金屬氧化物與鍵連有雷替曲塞的超支化聚乙烯亞胺的質量比為2~5:1。

優選的,所述第一酰胺化反應和第二酰胺化反應的反應溫度獨立地為15~35℃,所述第一酰胺化反應和第二酰胺化反應的反應時間獨立地為20~30h。

優選的,所述步驟(4)中自靶向抗癌納米粒子前驅體與三乙胺的質量比為1:20~30。

優選的,所述步驟(4)中自靶向抗癌納米粒子前驅體與乙酸酐的質量比為1:20~30。

優選的,所述乙酰化反應的反應溫度為15~35℃,所述乙酰化反應的反應時間為10~15h。

本發明提供了一種自靶向抗癌納米粒子,由表面羧酸化的金屬氧化物與活性部分通過酰胺鍵連接構成,所述活性部分為鍵合有雷替曲塞的乙酰化超支化聚乙烯亞胺;所述活性部分的質量含量為10~30%;所述乙酰化超支化聚乙烯亞胺與雷替曲塞通過酰胺鍵連接,所述乙酰化超支化聚乙烯亞胺與雷替曲塞的摩爾比為1:1~8。本發明利用多價相互作用,設計了上述自靶向抗癌納米粒子,該自靶向抗癌納米粒子上搭載了多個雷替曲塞,形成多價體系,通過該多價體系與受體的強結合力實現對癌細胞的高選擇性,同時利用雷替曲塞自身的毒性,特異性殺死癌細胞;并且由于該自靶向抗癌納米粒子不需要包裹具有特異溶解性的包衣,使其對癌癥細胞具有廣泛適用性。

實驗結果表明,葉酸受體陽性細胞對本發明所提供的自靶向抗癌納米粒子的攝取量遠遠大于葉酸受體陰性細胞,說明本發明所提供的自靶向抗癌納米粒子具有優異的葉酸過表達癌細胞靶向能力,能夠選擇性進入癌細胞。

并且,本發明提供的自靶向抗癌納米粒子結構中具有酰胺鍵,具有一定的穩定性,在蛋白酶K的作用下,能夠緩慢降解,釋放出雷替曲塞。實驗結果表明,隨釋放時間的延長,雷替曲塞的累積釋放量逐步增多,釋放時間為20h時,雷替曲塞的累積釋放量達到約70%,之后趨于穩定不再釋放,說明本發明所提供的自靶向抗癌納米粒子為一種緩釋型藥物。

此外,由于本發明所提供的自靶向抗癌納米粒子為多價體系,其對葉酸受體陽性細胞的殺傷性更強,能夠實現選擇性殺傷葉酸過表達的癌細胞。實驗結果表明,本發明所提供的自靶向抗癌納米粒子對于葉酸受體陽性細胞的殺傷性強于葉酸受體陰性細胞,且隨著用藥量的增加,對上述兩種細胞的殺傷性差別越大。

附圖說明

圖1為本發明自靶向抗癌納米粒子的結構示意圖;

圖2為實施例1步驟(1)所得表面羧酸化的Fe3O4的紅外光譜圖;

圖3為實施例1步驟(2)所得鍵連有雷替曲塞的超支化聚乙烯亞胺及其絡合物的紫外光譜圖;

圖4為實施例1所得自靶向抗癌納米粒子的粒徑分布圖;

圖5為實施例1所得自靶向抗癌納米粒子的XRD圖;

圖6為實施例1步驟(1)、(3)和(4)所得產物的電勢測試結果;

圖7為實施例1所得自靶向抗癌納米粒子的釋放曲線;

圖8為實施例1所得自靶向抗癌納米粒子對KB和A549的毒性測試結果;

圖9為裸藥雷替曲塞對KB和A549的毒性測試結果;

圖10為實施例1所得自靶向抗癌納米粒子對癌細胞選擇性的測試結果。

具體實施方式

本發明提供了一種自靶向抗癌納米粒子,由表面羧酸化的金屬氧化物與活性部分通過酰胺鍵連接構成,所述活性部分為鍵合有雷替曲塞的乙酰化超支化聚乙烯亞胺;所述活性部分的質量含量為10~30%;所述乙酰化超支化聚乙烯亞胺與雷替曲塞通過酰胺鍵連接,所述乙酰化超支化聚乙烯亞胺與雷替曲塞的摩爾比為1:1~8。

在本發明中,所述自靶向抗癌納米粒子中活性部分的質量含量優選為14~20%。

在本發明中,所述自靶向抗癌納米粒子中乙酰化超支化聚乙烯亞胺與雷替曲塞的摩爾比優選為1:3~5。

在本發明中,所述表面羧酸化的金屬氧化物的粒徑優選為納米級別,更優選為50~80nm。在本發明中,所述表面羧酸化的金屬氧化物優選為表面包覆有檸檬酸的Fe3O4納米粒子;所述檸檬酸與Fe3O4納米粒子的質量比優選為1:4~5。

在本發明中,所述自靶向抗癌納米粒子的平均粒徑優選為100~200nm,更優選為120~180nm,最優選為140~160nm。

圖1為本發明所提供的自靶向抗癌納米粒子的結構示意圖,如圖所示,圖1左側為所述自靶向抗癌納米粒子的簡化圖,黑色粒子為表面羧酸化的金屬氧化物,箭頭表示活性部分,所述活性部分簡稱為PEI-Ac-RTX4,黑色粒子表面分布多個箭頭表示表面羧酸化的金屬氧化物與多個活性部分通過酰胺鍵鍵連;圖1右側為所述活性部分的結構示意圖,如圖所示,所述活性部分為鍵連有雷替曲塞的乙酰化超支化聚乙烯亞胺,圖中所示雷替曲塞的數目僅為示意數目,在本發明中,所述乙酰化超支化聚乙烯亞胺與雷替曲塞的摩爾比為1:1~8,所述雷替曲塞上的羧基與乙酰化超支化聚乙烯亞胺上的氨基形成酰胺鍵;如圖1右側圖所示,所述活性部分結構示意圖的左端為酰胺鍵,該鍵為表面羧酸化的金屬氧化物與活性部分的連接鍵,由表面羧酸化的金屬氧化物的表面羧基與所述活性部分中的乙酰化超支化聚乙烯亞胺的氨基發生酰胺化反應形成。

本發明還提供了上述技術方案所述的自靶向抗癌納米粒子的制備方法,包括如下步驟:

(1)將雷替曲塞、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽、N-羥基琥珀酰亞胺和極性有機溶劑混合,對雷替曲塞進行活化;將所述活化所得活化液與超支化聚乙烯亞胺混合,進行第一酰胺化反應,得到鍵連有雷替曲塞的超支化聚乙烯亞胺;

(2)將表面羧酸化的金屬氧化物、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽、N-羥基琥珀酰亞胺和水混合,對所述表面羧酸化的金屬氧化物進行活化,得到表面羧酸化的金屬氧化物活化液;

(3)將所述步驟(2)得到的表面羧酸化的金屬氧化物活化液與所述步驟(1)得到的鍵連有雷替曲塞的超支化聚乙烯亞胺混合,進行第二酰胺化反應,得到自靶向抗癌納米粒子前驅體;

(4)將所述步驟(3)得到的自靶向抗癌納米粒子前驅體與三乙胺和水混合,得到堿性前驅體溶液;向所述堿性前驅體溶液中加入乙酸酐,進行乙酰化反應,得到自靶向抗癌納米粒子;

所述步驟(1)和步驟(2)之間沒有時間順序的限定。

本發明將雷替曲塞、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽、N-羥基琥珀酰亞胺和極性有機溶劑混合后,對雷替曲塞進行活化。本發明在對雷替曲塞進行活化的過程中,1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽的碳二亞胺鍵與雷替曲塞上的羧基耦合形成O-乙酰基脲結構,該結構具有較高的活性,容易與氨基反應形成酰胺鍵。

在本發明中,所述雷替曲塞與1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽、N-羥基琥珀酰亞胺的質量比優選為1:3~7:1.5~4,更優選為1:4~6:2~3.5,最優選為1:5:2.5。

在本發明中,所述極性有機溶劑優選為二甲基亞砜、N,N-二甲基甲酰胺或二氯甲烷,更優選為二甲基亞砜。

在本發明中,所述雷替曲塞的質量與所述極性有機溶劑的體積之比優選為1g:30~70mL,更優選為1g:40~60mL,最優選為1g:50mL。

本發明對活化雷替曲塞的活化溫度沒有特殊限定,在本發明實施例中優選采用室溫;所述活化的活化時間優選為20~50min,更優選為30~40min;所述活化優選在攪拌狀態下進行;所述攪拌的轉速優選為400~800r/min,更優選為500~700r/min,最優選為600r/min。

完成對雷替曲塞的活化后,本發明將所述活化得到的活化液與超支化聚乙烯亞胺混合,進行第一酰胺化反應,得到鍵連有雷替曲塞的超支化聚乙烯亞胺。

在本發明中,所述雷替曲塞與超支化聚乙烯亞胺的摩爾比優選為0.5~10:1,更優選為1~7:1,最優選為2~3:1。

在本發明中,所述超支化聚乙烯亞胺的分子量優選為1500~2000g/mol。本發明對所述超支化聚乙烯亞胺的氨基含量、支化程度沒有特殊限定,采用市售的常規超支化聚乙烯亞胺即可;在本發明實施例中,所述超支化聚乙烯亞胺優選為AlfaAesar公司的貨號LOT:W30B061型號超支化聚乙烯亞胺。在本發明中,所述超支化聚乙烯亞胺可以以單質的形式混合,也可以配制成水溶液再混合;在本發明實施例中,優選采用15~25mg/mL的超支化聚乙烯亞胺水溶液。

在本發明中,所述第一酰胺化反應的反應溫度優選為15~35℃,更優選為20~30℃;所述第一酰胺化反應的反應時間優選為20~30h,更優選為24~27h。在本發明中,所述第一酰胺化反應中雷替曲塞上的羧基與超支化聚乙烯亞胺上的氨基發生酰胺化反應,生成酰胺鍵。

完成所述第一酰胺化反應后,本發明優選將所述第一酰胺化反應所得混合溶液進行透析,得到鍵連有雷替曲塞的超支化聚乙烯亞胺水分散液。在本發明中,通過透析可將反應體系中未反應的物質和小分子雜質去除。

本發明優選將裝有第一酰胺化反應所得混合溶液的透析袋置于水中進行透析;所述水優選為去離子水;所述混合溶液與透析用水的體積比優選為1:1000~2000;所述透析的時間優選為20~30h,更優選為24~26h;所述透析過程中優選每隔1~3h換一次水,更優選每隔2h換一次水;所述透析優選采用截留分子量為1900~3000g/mol的透析袋,更優選為截留分子量為2000~2500g/mol的透析袋;本發明對所述透析袋的材質沒有特殊限定,可以采用本領域技術人員所熟知的材質。

得到鍵連有雷替曲塞的超支化聚乙烯亞胺水分散液后,本發明優選將所述鍵連有雷體曲塞的超支化聚乙烯亞胺水分散液進行干燥,得到鍵連有雷替曲塞的超支化聚乙烯亞胺;本發明對所述干燥的方式沒有特殊限定,能夠將水分去除即可。在本發明實施例中優選將所述鍵連有雷替曲塞的超支化聚乙烯亞胺水分散液直接用于第二酰胺化反應。

本發明將表面羧酸化的金屬氧化物、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽、N-羥基琥珀酰亞胺和水混合,對所述表面羧酸化的金屬氧化物進行活化,得到表面羧酸化的金屬氧化物活化液。在本發明中,所述活化可將表面羧酸化的金屬氧化物表面的羧基活化,以利于第二酰胺化反應的進行。

在本發明中,所述表面羧酸化的金屬氧化物的粒徑優選為50~80nm,更優選為60~70nm。

本發明對所述表面羧酸化的金屬氧化物的來源沒有特殊限定,采用市售產品或采用本領域技術人員所熟知的制備方法自制均可。

本發明對所述表面羧酸化的金屬氧化物的種類沒有特殊限定,采用本領域技術人員在制備藥物時常用的表面羧酸化的金屬氧化物即可。在本發明實施例中,所述表面羧酸化的金屬氧化物優選為表面包覆有檸檬酸的Fe3O4納米粒子。在本發明中,所述表面包覆有檸檬酸的Fe3O4納米粒子的粒徑優選為50~80nm。

本發明對所述表面包覆有檸檬酸的Fe3O4納米粒子的來源沒有特殊的限定,采用本領域技術人員熟知的制備方法制備即可。在本發明實施例中,所述表面包覆有檸檬酸的Fe3O4納米粒子的制備優選包括以下步驟:

(1)將水溶性鐵鹽、水溶性亞鐵鹽、檸檬酸和水混合,得到鐵鹽和亞鐵鹽的酸性混合溶液;

(2)在惰性氣體的保護下,將氨水滴加至所述鐵鹽和亞鐵鹽的酸性混合溶液中,進行沉淀反應,得到表面包覆有檸檬酸的Fe3O4納米粒子。

本發明優選將水溶性鐵鹽、水溶性亞鐵鹽、檸檬酸和水混合,得到鐵鹽和亞鐵鹽的酸性混合溶液。本發明對水溶性鐵鹽、水溶性亞鐵鹽、檸檬酸和水的混合順序沒有特殊限定,可以采用任意混合順序。

在本發明中,所述水溶性鐵鹽中的Fe3+與水溶性亞鐵鹽中的Fe2+的摩爾比優選為2.5~3:1,更優選為2.6~2.7:1。在本發明中,所述水溶性鐵鹽優選為氯化鐵、硝酸鐵和硫酸鐵中的一種或兩種以上的混合物。在本發明中,所述水溶性亞鐵鹽優選為氯化亞鐵、硝酸亞鐵和硫酸亞鐵中的一種或兩種以上的混合物。

在本發明中,所述水溶性鐵鹽中的Fe3+與檸檬酸的摩爾比優選為9~10:1,更優選為9.4~9.6:1。本發明實施例中優選采用檸檬酸的水溶液與鐵鹽和亞鐵鹽的混合水溶液混合;所述檸檬酸的水溶液的濃度優選為0.01~0.1wt.%;所述鐵鹽和亞鐵鹽的混合水溶液中,鐵鹽的濃度優選為0.25~0.4wt.%。

得到鐵鹽和亞鐵鹽的酸性混合溶液后,本發明優選在惰性氣體的保護下,將氨水滴加至所述鐵鹽和亞鐵鹽的酸性混合溶液中,進行沉淀反應,得到表面包覆有檸檬酸的Fe3O4納米粒子。

本發明對所述惰性氣體的種類沒有特殊限定,采用本領域技術人員所常用的惰性氣體即可,如氮氣、氬氣。在本發明實施例中,所述惰性氣體優選為氮氣。

在本發明中,所述氨水的濃度優選為4~7wt.%,更優選為5~6wt.%;所述氨水的滴加速度為1~3mL/min,優選為2~2.6mL/min。

在本發明中,所述沉淀反應的溫度優選為80~90℃;所述沉淀反應的時間優選為20~40min,更優選為25~30min;所述沉淀反應的時間優選從氨水滴加結束時計起。

本發明優選先對反應體系進行氮氣保護,然后將所述鐵鹽和亞鐵鹽的混合溶液加熱至沉淀反應所需的溫度,再滴加氨水。本發明對所述加熱的速率沒有特殊限定,采用本領域技術人員所常用的加熱速率即可。在本發明實施例中,所述加熱的速率優選為2~5℃/min。

完成沉淀反應后,本發明優選將所述沉淀反應得到的混合溶液冷卻室溫;所述冷卻優選自然冷卻。

冷卻完成后,本發明優選將所述冷卻的產物進行離心,得到上清液。在本發明中,通過離心將體系中顆粒較大的產物去除;所得上清液中表面包覆有檸檬酸的Fe3O4的粒徑優選為50~80nm。

在本發明中,所述離心的轉速優選為9000~10000rpm,更優選為9500~9700rpm;所述離心的時間優選為20~40min,更優選為25~35min。

本發明優選采用傾倒的方式將離心所得體系中的上清液取出。

得到上清液后,本發明優選將所述上清液進行透析,得到表面包覆有檸檬酸的Fe3O4水分散液。在本發明中,通過透析將體系中未反應的原料及雜質小分子去除。

本發明優選將裝有所述上清液的透析袋置于水中進行透析;所述水優選為去離子水;所述上清液與透析用水的體積比優選為1:1000~2000;所述透析的時間優選為20~30h,更優選為24~26h;所述透析過程中優選每隔1~3h換一次水,更優選每隔2h換一次水;所述透析優選采用截留分子量為1000~3500g/mol的透析袋;本發明對所述透析袋的材質沒有特殊限定,可以采用本領域技術人員所熟知的材質。

得到表面包覆有檸檬酸的Fe3O4水分散液后,本發明優選將所述表面包覆有檸檬酸的Fe3O4水分散液干燥,得到表面包覆有檸檬酸的Fe3O4;本發明對所述干燥的方式沒有特殊限定,能夠將水分去除即可。在本發明實施例中,優選將經透析后所得的表面包覆有檸檬酸的Fe3O4水分散液直接用于第二酰胺化反應。

在本發明中,所述表面羧酸化的金屬氧化物與1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽、N-羥基琥珀酰亞胺的質量比優選為1:3~7:2~4,更優選為1:4~6:2~3.5,最優選為1:5:3。

在本發明中,所述表面羧酸化的金屬氧化物與水的質量之比優選為0.004~0.006:1,更優選為0.0045~0.005:1。

本發明對活化表面羧酸化的金屬氧化物的活化溫度沒有特殊限定,在本發明實施例中優選采用室溫。在本發明中,對所述表面羧酸化的金屬氧化物進行活化的活化時間優選為20~50min,更優選為30~40min;所述活化優選在攪拌狀態下進行,所述攪拌的轉速優選為400~800r/min,更優選為500~700r/min,最優選為600r/min。

得到鍵連有雷替曲塞的超支化聚乙烯亞胺和表面羧酸化的金屬氧化物活化液后,本發明將所述活化所述表面羧酸化的金屬氧化物活化液與所述鍵連有雷替曲塞的超支化聚乙烯亞胺混合,進行第二酰胺化反應,得到自靶向抗癌納米粒子前驅體。在本發明中,所述第二酰胺化反應為表面羧酸化的金屬氧化物表面的羧基與鍵連有雷替曲塞的超支化聚乙烯亞胺上的氨基進行酰胺化反應,生成酰胺鍵。

在本發明中,所述表面羧酸化的金屬氧化物與鍵連有雷替曲塞的超支化聚乙烯亞胺的質量比優選為2~5:1。在本發明中,鍵連有雷替曲塞的超支化聚乙烯亞胺的添加量較大,使得表面羧酸化的金屬氧化物在第二酰胺化反應過程中均參與反應,經后續離心后均可沉淀。

在本發明中,所述第二酰胺化反應的反應溫度優選為15~35℃,更優選為20~25℃;所述第二酰胺化反應的反應時間優選為20~30h,更優選為24~26h。

完成第二酰胺化反應后,本發明優選將第二酰胺化反應所得混合溶液進行離心,得到自靶向抗癌納米粒子前驅體。在本發明中,所述第二酰胺化反應所得混合溶液經離心后產生沉淀,將上清液棄去,所得沉淀即為所述自靶向抗癌納米粒子前驅體。

在本發明中,對第二酰胺化反應所得混合溶液的進行離心的轉速優選為8000~10000rpm,更優選為9000~9500rpm;所述離心的時間優選為5~10min,更優選為6~8min。

得到自靶向抗癌納米粒子前驅體后,本發明將所述自靶向抗癌納米粒子前驅體、三乙胺和水混合,得到堿性前驅體溶液,然后向所述堿性前驅體溶液中加入乙酸酐,進行乙酰化反應,得到自靶向抗癌納米粒子。在本發明中,所述自靶向抗癌納米粒子前驅體中含有游離氨基,經乙酰化反應后,可將游離氨基乙酰化,進而減小自靶向抗癌納米粒子對人體的副作用。

本發明優選將自靶向抗癌納米粒子前驅體分散于去離子水中,再與三乙胺混合,室溫攪拌20~40min,然后向所得堿性前驅體溶液中加入乙酸酐,進行乙酰化反應。

在本發明中,所述自靶向抗癌納米粒子前驅體與三乙胺的質量比優選為1:20~30,更優選為1:22~25;所述三乙胺作為堿性催化劑,可以使自靶向抗癌納米粒子前驅體中的氨基轉化成親核性更強的親核基團,來進攻乙酸酐上的碳正離子,使得乙酰化反應更容易發生。

在本發明中,所述攪拌的轉速優選為500~700rpm。

在本發明中,所自靶向抗癌納米粒子前驅體與乙酸酐的質量比優選為1:20~30,更優選為1:22~25;所述乙酸酐的添加量相對于游離氨基的數目遠遠過量,可將自靶向抗癌納米粒子前驅體中的游離氨基全部乙酰化。本發明優選采用滴加的方式加入乙酸酐;所述滴加的速度優選為0.006~0.015mL/min。

在本發明中,所述乙酰化反應的反應溫度優選為15~35℃,更優選為20~25℃;所述乙酰化反應的反應時間為10~15h,更優選為12~14h。

完成乙酰化反應后,本發明優選將乙酰化所得混合溶液進行離心,得到自靶向抗癌納米粒子;通過離心,所述自靶向抗癌納米粒子沉淀于下層,未反應的小分子物質分散于上清液中,棄去上清液,所得沉淀即為自靶向抗癌納米粒子。

在本發明中,離心乙酰化所得混合溶液的離心速率優選為8000~10000rpm,更優選為8500~9500rpm;所述離心的時間優選為5~10min。

本發明優選將所述自靶向抗癌納米粒子保存于超純水中;所述自靶向抗癌納米粒子的保存濃度優選為0.5~1wt.%。本發明優選將所述自靶向抗癌納米粒子超聲分散于超純水中進行保存;所述超聲的頻率優選為4~6W;所述超聲的時間優選為1~5min,更優選為2~4min。

下面將結合本發明中的實施例,對本發明中的技術方案進行清楚、完整地描述。顯然,所描述的實施例僅僅是本發明一部分實施例,而不是全部的實施例。基于本發明中的實施例,本領域普通技術人員在沒有做出創造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例,都屬于本發明保護的范圍。

實施例1

(1)在氮氣保護下,向5mL三氯化鐵濃度為0.31g/mL、氯化亞鐵濃度為0.09g/mL的鐵鹽和亞鐵鹽的混合溶液中加入20mL檸檬酸水溶液,所述檸檬酸水溶液的濃度為0.01g/mL;維持氮氣保護狀態,將所得混合溶液升溫至85℃,向所述混合溶液中滴加26mL濃度為5.8wt.%的氨水,所述滴加的速度為2.6mL/min;完成所述滴加后,維持溫度和氮氣保護狀態不變,恒溫反應30min;反應完成后,自然冷卻至室溫,將所得混合溶液在9500rpm的轉速下離心30min,取上清液;將所述上清液置于截留分子量為3500g/mol的透析袋中,放入2L去離子水中透析24h,每隔6h換一次水,得到濃度為4.9mg/mL的表面羧酸化的Fe3O4水分散液;通過動態光散射法測定表面羧酸化的Fe3O4的粒徑,得其平均粒徑為60nm;

(2)將10mg雷替曲塞、50mg 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽、25mgN-羥基琥珀酰亞胺和5mL二甲基亞砜混合,在600rpm的轉速下室溫攪拌30min;將所得混合溶液與0.85mL濃度為20mg/mL的超支化聚乙烯亞胺水溶液混合,在25℃攪拌進行第一酰胺化反應,所述第一酰胺化反應的時間為24h,所述攪拌的轉速為600rpm;第一酰胺化反應完成后,將所得混合溶液置于截留分子量為2000g/mol的透析袋中,置于2L去離子水中透析24h,每隔2h換一次水,得到濃度為0.8392mg/mL的鍵連有雷替曲塞的超支化聚乙烯亞胺水分散液;

(3)將1mL步驟(1)所述的表面羧酸化的Fe3O4水分散液、30mg 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽、15mg N-羥基琥珀酰亞胺混合,在600rpm轉速下室溫攪拌30min;將所得混合溶液與1.2mL步驟(2)所述的鍵連有雷替曲塞的超支化聚乙烯亞胺水分散液混合,在25℃下攪拌進行第二酰胺化反應,所述第二酰胺化反應的時間為24h,所述攪拌的轉速為600rpm;第二酰胺化反應完成后,將所得混合溶液在9000rpm的轉速下離心7min,棄去上清液,所得沉淀為自靶向抗癌納米粒子前驅體;

(4)將步驟(3)所得自靶向抗癌納米粒子前驅體超聲分散于1mL去離子水中,所述超聲的強度為5W,所述超聲的時間為2min;將所得自靶向抗癌納米粒子前驅體分散液與0.02mL三乙胺混合,在25℃攪拌30min,所述攪拌的轉速為600rpm;然后維持攪拌狀態和體系溫度不變,向所得混合溶液中滴加0.015mL乙酸酐,所述滴加的速度為0.008mL/min,滴加結束后,在25℃進行乙酰化反應,所述乙酰化反應的反應時間為12h;將所述乙酰化反應所得混合溶液在9000rpm離心7min,所得沉淀為自靶向抗癌納米粒子,經干燥后得其質量為5.7322mg;得到自靶向抗癌納米粒子后,將自靶向抗癌納米粒子分散于1mL的超純水中,得到自靶向抗癌納米粒子水分散液,以此狀態進行保存。

自靶向抗癌納米粒子中的活性部分的質量含量采用如下公式計算:

經計算,本實施例所得自靶向抗癌納米粒子中的活性部分的質量含量為14.5%。

取步驟(1)所得表面羧酸化的Fe3O4水分散液,經冷凍干燥,得到表面羧酸化的Fe3O4粉體,測得其紅外光譜,如圖2所示,譜圖中634cm-1和464cm-1處為Fe-O的伸縮振動吸收峰,1379cm-1為COO的對稱伸縮振動峰,3322cm-1為OH的伸縮振動峰和1063cm-1處為C-H的彎曲振動峰,說明得到的Fe3O4樣品表面包覆有檸檬酸;檸檬酸的羧酸根在水中帶負電,因而能夠阻止Fe3O4納米粒子發生團聚,提高其在水溶液中的單分散性;同時,檸檬酸使Fe3O4粒子表面帶有羧基以利于進一步修飾。

使用紫外光譜測定鍵連有雷替曲塞的超支化聚乙烯亞胺的價態和濃度,具體測試方法如下:

1、測定一系列不同濃度的超支化聚乙烯亞胺和Cu2+絡合物在265nm處的吸光度,以超支化聚乙烯亞胺的濃度(單位為μg/mL)為x1,所對應的吸光度為y1,得到標準曲線A,y1=0.0187x1+0.0046,相關性系數R2=0.998;

2、測定一系列不同濃度雷替曲塞(RTX)水溶液在351nm處的吸光度,以RTX濃度(單位為mg/mL)為x2,所對應的吸光度為y2,得到標準曲線B,y2=26.869x2+0.0157,相關性系數R2=0.996;

3、取200μL步驟(2)所得鍵連有雷替曲塞的超支化聚乙烯亞胺水分散液,加入1mL硫酸銅溶液(2mg/mL)使得超支化聚乙烯亞胺和Cu2+發生絡合,然后用水稀釋6倍,測試所得溶液在265nm的紫外吸光度A1;另取200μL步驟(2)所得鍵連有雷替曲塞的超支化聚乙烯亞胺水分散液加入1mL去離子水,然后用水稀釋6倍,測試所得溶液在351nm處的吸光度A2,在265nm處的吸光度A3;

測試結果如圖3所示,鍵連有雷替曲塞的超支化聚乙烯亞胺簡寫為PEI-RTX4,其與Cu2+的絡合物簡寫為絡合,其中A1=2.153,A2=1.881,A3=0.881,將A2帶入標準曲線B,可得原溶液中RTX的濃度為0.4165mg/mL,將A1-A3的數值帶入標準曲線A,可得原溶液中PEI濃度為0.4227mg/mL,已知PEI分子量為1800g/mol,RTX分子量為458.49g/mol,計算可得PEI和RTX的摩爾比為1:4。

采用動態光散射法測定所得自靶向抗癌納米粒子的粒徑分布,如圖4所示,本實施例所得自靶向抗癌納米粒子的粒徑范圍為60~300nm,平均粒徑為148nm,落在了可在腫瘤組織產生高通透和滯留效應的納米粒子的粒徑范圍內,說明本實施例所得自靶向抗癌納米粒子能夠通過腫瘤組織,并具有滯留效應。

對本實施例所得產物進行XRD測試,結果如圖5所示,圖中出現了2θ角為30.1°、35.5°、43.3°、53.5°、56.9°和62.6°處的衍射峰,其分別對應著磁性納米粒子中Fe3O4面心立方晶格中(220)、(311)、(400)、(422)、(511)、(440)的晶面,對比標準圖譜JCPDS(65-3107)表明所制備的磁性粒子屬于立方晶系的Fe3O4納米晶體。

對本實施例步驟(1)、(3)和(4)所得產物的電勢進行測試,如圖6所示,其中[email protected]表示表面羧酸化的Fe3O4,[email protected]表示自靶向抗癌納米粒子前驅體,[email protected]表示自靶向抗癌納米粒子,由圖6可知,[email protected][email protected]電勢提高了大約20mV,而[email protected]的zeta電位又比[email protected]降低了5mV左右。

實施例2

(1)在氮氣保護下,向5mL三氯化鐵濃度為0.31g/mL、氯化亞鐵濃度為0.09g/mL的鐵鹽和亞鐵鹽的混合溶液中加入20mL檸檬酸水溶液,所述檸檬酸水溶液的濃度為0.01g/mL;維持氮氣保護狀態,將所得混合溶液升溫至85℃,向所述混合溶液中滴加26mL濃度為5.8wt.%的氨水,所述滴加的速度為2.6mL/min;完成所述滴加后,維持溫度和氮氣保護狀態不變,恒溫反應30min;反應完成后,自然冷卻至室溫,將所得混合溶液在9500rpm的轉速下離心30min,取上清液;將所述上清液置于截留分子量為3500g/mol的透析袋中,放入2L去離子水中透析24h,每隔6h換一次水,得到濃度為4.9mg/mL的表面羧酸化的Fe3O4水分散液;通過動態光散射法測定表面羧酸化的Fe3O4的粒徑,得其平均粒徑為60nm;

(2)將10mg雷替曲塞、50mg 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽、25mgN-羥基琥珀酰亞胺和5mL二甲基亞砜混合,在600rpm的轉速下室溫攪拌30min;將所得混合溶液與2.5mL濃度為20mg/mL的超支化聚乙烯亞胺水溶液混合,在30℃攪拌進行第一酰胺化反應,所述第一酰胺化反應的時間為20h,所述攪拌的轉速為600rpm;第一酰胺化反應完成后,將所得混合溶液置于截留分子量為2000g/mol的透析袋中,置于2L去離子水中透析24h,每隔2h換一次水,得到濃度為0.40571mg/mL的鍵連有雷替曲塞的超支化聚乙烯亞胺水分散液;

(3)將1mL步驟(1)所述的表面羧酸化的Fe3O4水分散液、30mg 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽、15mg N-羥基琥珀酰亞胺混合,在600rpm轉速下室溫攪拌30min;將所得混合溶液與5mL步驟(2)所述的鍵連有雷替曲塞的超支化聚乙烯亞胺水分散液混合,在20℃下攪拌進行第二酰胺化反應,所述第二酰胺化反應的時間為24h,所述攪拌的轉速為600rpm;第二酰胺化反應完成后,將所得混合溶液在9000rpm的轉速下離心7min,棄去上清液,所得沉淀為自靶向抗癌納米粒子前驅體;

(4)將步驟(3)所得自靶向抗癌納米粒子前驅體超聲分散于1mL去離子水中,所述超聲的強度為5W,所述超聲的時間為2min;將所得自靶向抗癌納米粒子前驅體分散液與0.02mL三乙胺混合,在30℃攪拌30min,所述攪拌的轉速為600rpm;然后維持攪拌狀態和體系溫度不變,向所得混合溶液中滴加0.015mL乙酸酐,所述滴加的速度為0.008mL/min,滴加結束后,在30℃進行乙酰化反應,所述乙酰化反應的反應時間為12h;將所述乙酰化反應所得混合溶液在9000rpm離心5min,所得沉淀為自靶向抗癌納米粒子,經干燥后得其質量為6.9634mg;得到自靶向抗癌納米粒子后,將自靶向抗癌納米粒子分散于1mL的超純水中,得到自靶向抗癌納米粒子水分散液,以此狀態進行保存。

經計算,本實施例所得自靶向抗癌納米粒子中的活性部分的質量含量為29.6%。

采用實施例1所述的方法測試步驟(2)所得鍵連有雷替曲塞的超支化聚乙烯亞胺中的超支化聚乙烯亞胺與雷替曲塞的摩爾比,結果為1:1。

采用動態光散射法測定所得自靶向抗癌納米粒子的粒徑分布,本實施例所得自靶向抗癌納米粒子的粒徑范圍為75~200nm,平均粒徑為150nm,落在了可在腫瘤組織產生高通透和滯留效應的納米粒子的粒徑范圍內,說明本實施例所得自靶向抗癌納米粒子能夠通過腫瘤組織,并具有滯留效應。

對本實施例所得產物進行XRD測試,結果同實施例1。

實施例3

(1)在氮氣保護下,向5mL三氯化鐵濃度為0.31g/mL、氯化亞鐵濃度為0.09g/mL的鐵鹽和亞鐵鹽的混合溶液中加入20mL檸檬酸水溶液,所述檸檬酸水溶液的濃度為0.01g/mL;維持氮氣保護狀態,將所得混合溶液升溫至85℃,向所述混合溶液中滴加26mL濃度為5.8wt.%的氨水,所述滴加的速度為2.6mL/min;完成所述滴加后,維持溫度和氮氣保護狀態不變,恒溫反應30min;反應完成后,自然冷卻至室溫,將所得混合溶液在9500rpm的轉速下離心30min,取上清液;將所述上清液置于截留分子量為3500g/mol的透析袋中,放入2L去離子水中透析24h,每隔6h換一次水,得到濃度為4.9mg/mL的表面羧酸化的Fe3O4水分散液;通過動態光散射法測定表面羧酸化的Fe3O4的粒徑,得其平均粒徑為60nm;

(2)將25mg雷替曲塞、50mg 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽、25mg N-羥基琥珀酰亞胺和12mL二甲基亞砜混合,在600rpm的轉速下室溫攪拌30min;將所得混合溶液與0.6mL濃度為20mg/mL的超支化聚乙烯亞胺水溶液混合,在20℃攪拌進行第一酰胺化反應,所述第一酰胺化反應的時間為24h,所述攪拌的轉速為600rpm;第一酰胺化反應完成后,將所得混合溶液置于截留分子量為2000g/mol的透析袋中,置于2L去離子水中透析24h,每隔2h換一次水,得到濃度為1.230mg/mL的鍵連有雷替曲塞的超支化聚乙烯亞胺水分散液;

(3)將1mL步驟(1)所述的表面羧酸化的Fe3O4水分散液、30mg 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽、15mg N-羥基琥珀酰亞胺混合,在600rpm轉速下室溫攪拌30min;將所得混合溶液與1mL步驟(2)所述的鍵連有雷替曲塞的超支化聚乙烯亞胺水分散液混合,在20℃下攪拌進行第二酰胺化反應,所述第二酰胺化反應的時間為24h,所述攪拌的轉速為600rpm;第二酰胺化反應完成后,將所得混合溶液在9000rpm的轉速下離心7min,棄去上清液,所得沉淀為自靶向抗癌納米粒子前驅體;

(4)將步驟(3)所得自靶向抗癌納米粒子前驅體超聲分散于1mL去離子水中,所述超聲的強度為5W,所述超聲的時間為2min;將所得自靶向抗癌納米粒子前驅體分散液與0.02mL三乙胺混合,在25℃攪拌30min,所述攪拌的轉速為600rpm;然后維持攪拌狀態和體系溫度不變,向所得混合溶液中滴加0.015mL乙酸酐,所述滴加的速度為0.008mL/min,滴加結束后,在25℃進行乙酰化反應,所述乙酰化反應的反應時間為12h;將所述乙酰化反應所得混合溶液在9000rpm離心5min,所得沉淀為自靶向抗癌納米粒子,經干燥后得其質量為5.5307mg;得到自靶向抗癌納米粒子后,將自靶向抗癌納米粒子分散于1mL的超純水中,得到自靶向抗癌納米粒子水分散液,以此狀態進行保存。

經計算,本實施例所得自靶向抗癌納米粒子中的活性部分的質量含量為11.4%。

采用實施例1所述的方法測試步驟(2)所得鍵連有雷替曲塞的超支化聚乙烯亞胺中的超支化聚乙烯亞胺與雷替曲塞的摩爾比,結果為1:8。

采用動態光散射法測定所得自靶向抗癌納米粒子的粒徑分布,本實施例所得自靶向抗癌納米粒子的粒徑范圍為75~300nm,平均粒徑為160nm,落在了可在腫瘤組織產生高通透和滯留效應的納米粒子的粒徑范圍內,說明本實施例所得自靶向抗癌納米粒子能夠通過腫瘤組織,并具有滯留效應。

對本實施例所得產物進行XRD測試,結果同實施例1。

應用例1

將1mL本發明實施例1所得自靶向抗癌納米粒子水分散液(7.6mg/mL)、400ulTris-HCl(即三(羥甲基)氨基甲烷鹽酸鹽)緩沖液(濃度為0.05mol/L)、200uL蛋白酶K溶液(2mg/mL)混合,將所得混合溶液置于截留分子量為3500g/mol的透析袋中,將透析袋置于20mLpH值為7.4的磷酸緩沖溶液中。每隔一定時間取出釋放液1mL,用紫外可見光譜測定釋放液中RTX濃度,得到藥物釋放曲線,如圖7所示,可以看出該釋放曲線在20h之前藥物釋放濃度逐步增強,20h后RTX釋放量達到RTX總量的70%左右,然后基本趨于穩定不再釋放,可以得出該自靶向抗癌納米粒子屬于緩釋型。

采用上述方法測試本發明實施例2~4所得的自靶向抗癌納米粒子的釋放性能,所得結果與實施例1所得的自靶向抗癌納米粒子類似。

應用例2

以KB細胞(葉酸受體陽性細胞)和A549細胞(葉酸受體陰性細胞)為模型細胞評價本發明實施例1所得的自靶向抗癌納米粒子對葉酸受體陽性細胞和葉酸受體陰性細胞的毒性。

采用RPMI.1640培養基在相同條件下培養KB細胞和A549細胞,培養基含有10wt.%胎牛血清、1wt.%雙抗(青霉素和鏈霉素的混合水溶液,青霉素的濃度為60μg/ml,鏈霉素的濃度為60μg/ml),培養箱溫度為37℃,培養箱內二氧化碳的體積濃度為5%;取對數期生長良好的KB細胞和A549細胞,以每孔1萬細胞的數量種植于96孔板中,24h后顯微鏡觀察細胞貼壁良好;依次向孔中加入用培養基稀釋過的雷替曲塞濃度為1.25、2.5、5、10、15μg/mL的自靶向抗癌納米粒子和裸藥雷替曲塞120μL;培養24h后,吸走培養基,各加入120μL濃度為5mg/mL的噻唑藍水溶液,繼續培養4h后,吸走噻唑藍溶液,各加入120μL二甲基亞砜,15min后,用酶標儀測定各孔的吸光度,計算細胞存活率,結果如圖8和圖9所示。

圖8為本發明所提供自靶向抗癌納米粒子對KB和A549的毒性測試結果,由圖8可知,本發明所提供自靶向抗癌納米粒子對于KB和A549的殺傷性有顯著區別,對KB的殺傷性明顯優于對A549,且隨著雷替曲塞濃度的增大,殺傷性的差別越大,說明本發明所提供的自靶向抗癌納米粒子對于葉酸受體陽性細胞具有更強的毒性。

圖9為裸藥雷替曲塞對KB和A549的毒性測試結果,由圖9可知,裸藥雷替曲塞對于KB和A549的殺傷性類似,隨著濃度的增大,裸藥雷替曲塞對兩者的殺傷性表現出了一定差別,但該差別小于本發明所提供的自靶向抗癌納米粒子對兩種細胞的殺傷性差別。由此說明,本發明所提供的自靶向抗癌納米粒子對葉酸受體陽性細胞的毒性強于裸藥雷替曲塞。

采用上述方法測試本發明實施例2~4所得的自靶向抗癌納米粒子對葉酸受體陽性細胞和葉酸受體陰性細胞的毒性,結果與實施例1相同。

應用例3

對癌細胞選擇性的測試:

采用應用例2所述的培養細胞的方法培養KB和A549細胞;取對數期生長良好的KB和A549,以每孔10萬細胞的數量種植于6孔板中,培養24h后,使用顯微鏡觀察細胞貼壁良好,然后加入用培養基稀釋過的RTX濃度為15μg/mL的自靶向抗癌納米粒子液體1mL;繼續培養4h后,加入200μL胰酶,室溫消化3min后細胞開始剝離孔板底部,再加入800μL培養基用移液槍吹打沖洗孔板底部使細胞懸浮,將細胞懸浮液加入15mL離心管,在1000rpm轉速下離心5min,棄去上清液,得到底部細胞;將所得細胞分散于1mL磷酸緩沖鹽溶液(pH值為7.4)中,加入200μL濃鹽酸,在20000Hz超聲5min,使得細胞破裂,自靶向抗癌納米粒子釋放出。用等離子體發射光譜儀(ICP)測定鐵濃度,得到兩種細胞對自靶向抗癌納米粒子的攝取量,該攝取量以鐵的含量表示,如圖10所示。

由圖10可知,A549和KB對自靶向抗癌納米粒子的攝取量有顯著差別,KB對自靶向抗癌納米粒子的攝取量是A549對自靶向抗癌納米粒子攝取量的2倍,說明本發明所提供的自靶向抗癌納米粒子其具有優越的葉酸過表達癌細胞靶向能力,能夠選擇性地進入癌細胞。

采用上述方法測試本發明實施例2~4所得的自靶向抗癌納米粒子對癌細胞的選擇性,結果與實施例1相同。

以上所述僅是本發明的優選實施方式,應當指出,對于本技術領域的普通技術人員來說,在不脫離本發明原理的前提下,還可以做出若干改進和潤飾,這些改進和潤飾也應視為本發明的保護范圍。

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本文標題:一種自靶向抗癌納米粒子及其制備方法.pdf
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