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一種用于治療癌癥的藥物組合物.pdf

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一種 用于 治療 癌癥 藥物 組合
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摘要
申請專利號:

CN201510612018.1

申請日:

20150923

公開號:

CN105125576B

公開日:

20180316

當前法律狀態:

有效性:

有效

法律詳情:
IPC分類號: A61K33/24,A61K9/14,A61K47/54,A61K47/26,A61P35/00,A61P35/04,A61K31/337 主分類號: A61K33/24,A61K9/14,A61K47/54,A61K47/26,A61P35/00,A61P35/04,A61K31/337
申請人: 廣東省第二人民醫院
發明人: 向國安,張錦前
地址: 510317 廣東省廣州市海珠區新港中路466號大院
優先權: CN201510612018A
專利代理機構: 北京市廣友專利事務所有限責任公司 代理人: 滕勝利
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法律狀態
申請(專利)號:

CN201510612018.1

授權公告號:

法律狀態公告日:

法律狀態類型:

摘要

本發明提供了一種二氧化鈦納米粒子(TiO2),及包含所述二氧化鈦納米粒子的用于非光動力療法、非光熱和非聲動力療法的藥物組合物,所述二氧化鈦納米粒子可通過調節細胞內滲透壓,上調通道蛋白αENaC,使細胞線粒體膜電位發生去極化,誘導線粒體孔蛋白VDAC1上調,造成Cyt?c和ATP的流失,進一步激活caspase?3,可顯著促進腫瘤細胞的凋亡、抑制腫瘤細胞的生長和增殖,使其細胞周期出現S期阻滯,而對正常細胞系的生物學功能無明顯影響。本發明進一步提供了一種包含所述二氧化鈦納米粒子的抑制腫瘤的材料,以及所述二氧化鈦納米粒子及其藥物組合物在治療和預防癌癥中的應用。

權利要求書

1.一種用于治療癌癥的藥物組合物,其特征在于包含二氧化鈦納米粒子,并且所述的藥物組合物并非是用于癌癥的光動力療法、光熱和聲動力療法的藥物組合物,所述二氧化鈦納米粒子為15納米的顆粒大小的二氧化鈦納米粒子,所述的藥物組合物還包含紫杉醇,還可以包含至少一個針對癌細胞或腫瘤組織中的生物部分的靶向部分,所述的靶向部分為唾液酸,其專一性地與僅存在在腫瘤組織或肝癌細胞中的分子標志物唾液酸受體結合。2.根據權利要求1所述的藥物組合物,其特征在于所述的癌癥為肝癌。

說明書

技術領域

本發明屬于生物治療學領域,更具體的說,是屬于癌癥治療領域。特別地,本發明涉及一種包含納米材料二氧化鈦納米粒子的用于非光動力療法、非光熱和非聲動力療法的藥物組合物、包含二氧化鈦納米粒子的抑制腫瘤的材料以及利用所述二氧化鈦納米粒子和所述藥物組合物來治療和預防癌癥,尤其是肝癌的方法。

背景技術

2012年全球新增1400萬癌癥患者,兩成以上在中國。2012年全球共新增癌癥病例1400萬,820萬人死亡,新增病例近一半在亞洲。2015年2月3日,世界衛生組織(WHO)發布了《全球癌癥報告2014》,這是6年來首篇概述全球癌癥情況的報告。據WHO預測,全球癌癥病例將呈現迅猛增長態勢,到2035年將達到2400萬人。相比世衛組織的報告數據,中國自己的數據形勢更為嚴峻。在全國腫瘤登記中心發布的《2013中國腫瘤登記年報》中顯示:我國年新發癌癥病例數309萬例,250萬人死亡,分別占全球總量的21.9%和26.8%。中國龐大人口基數,令中國癌癥新增病例和死亡人數均居世界首位,每分鐘有6人被診斷為惡性腫瘤。惡性腫瘤嚴重影響國民健康,其發病與各種環境和遺傳因素相關,其中肝細胞肝癌(Hepatocellular carcinorma,HCC)是我國常見的消化道惡性腫瘤。據世界衛生組織統計數據顯示,目前全球每年肝癌新發病例63萬例,死亡人數約60萬。在我國每年超過30萬新發患者,是死亡率居第二位的癌癥“殺手”,常見于中年男性。因惡性度高、進展快,確診時大多已屬中晚期,治療難度大、死亡率高,診斷后未治療患者中位生存期僅為6個月,5年生存率小于5%。

肝癌的發病機制不清,可能與如下多種因素有關:病毒性肝炎與肝硬化、黃曲霉毒素、其他化學致癌物、寄生蟲等。近年來,隨著分子生物學技術的不斷進步,對HCC發病機制的研究愈發深入。其發病機制可能與如下幾方面相關:①抑癌基因,如WWOX基因、Parkin基因、RB基因等;②癌基因,如陷阱受體3、垂體瘤轉化基因1;③生長因子,如HGF、TGF、血小板源生長因子;④病毒相關基因,如HBV及HCV的主要功能蛋白編碼基因。我國肝癌主要致病因素是慢性乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)感染,HBV一方面通過與免疫分子相互作用影響機體免疫系統;另一方面通過其編碼蛋白影響細胞增殖和腫瘤的發生,其預后差的根本原因是HBV相關肝癌的發病機制至今未能明確、且缺乏有效的治療方法。明確肝癌尤其是HBV相關肝癌的發病機制一直是傳染病防治研究中的關鍵領域之一,而有效治療肝癌的藥物更是國內外多年研究探求的目標。

臨床實踐中只有約15%的肝癌患者適宜手術,且術后易復發;而放療、化療、瘤內無水酒精注射等僅能限制腫瘤發展,無法逆轉病情;肝移植術后長期應用免疫抑制劑使患者極易復發,在發展中國家由于供體來源及費用問題仍難以推廣;新型多靶點靶向治療藥物索拉非尼,其研究對象主要為歐美白種人,在人種及致病因素之間與我國都存在明顯差異,更為關鍵的是價格昂貴,即使在國外也難以負擔,在我國更無法成為晚期肝癌患者的常規治療方法。目前應用的多種藥物以及多種給藥方案,總體評價療效并不理想,其復發率高,5年生存期極低,缺乏有效的治療方法。肝癌是我國當前和今后相當長時期內危害人民健康的重要因素,揭示其發病機制、研發有效的藥物是國民經濟和社會發展中迫切需要解決的關鍵科技問題。因此,治療肝癌藥物的研究也變得極為重要和迫切。

然而用化學療法藥物治療癌癥存在一些重大的不足,包括:i)藥物對于正常組織和腫瘤組織的非特異性毒性;ii)向靶細胞遞送藥物的無效率;以及iii)藥物不合適的釋放。

二氧化鈦作為一種重要的無機材料,被應用于各個領域。傳統上,二氧化鈦被廣泛應用于涂料、陶瓷、化妝品等領域。而作為一種活性材料,納米結構的二氧化鈦則被廣泛應用于傳感器、電致變色顯示、氣相催化劑、燃料電池、鋰離子電池、光伏、光電化學電池及光催化等領域。與其他無機材料相比,二氧化鈦具有幾個優點:地球存儲量大、低毒性、化學和熱力學穩定性及抗光腐蝕性。而納米二氧化鈦具有良好的紫外線吸收性能、小尺寸效應、表面效應、量子尺寸效應及宏觀量子隧道效應等,導致納米微粒的熱、磁、光、敏感特性和表面穩定性等性能不同于常規粒子,可用于疾病的光動力學、光熱及聲動力學治療,但并沒有發現納米二氧化鈦作為常規藥物組合物用于治療癌癥,尤其是肝癌。

發明內容

本發明是基于申請人發現二氧化鈦納米粒子可調節細胞內滲透壓,上調通道蛋白αENaC,使細胞線粒體膜電位發生去極化,誘導呼吸鏈關鍵蛋白ACSS1表達水平下調,線粒體相關蛋白SirT3和VDAC1的表達水平上調,造成Cyt-c和ATP的流失,并進一步激活caspase-3,可顯著促進腫瘤細胞的凋亡、抑制腫瘤細胞的生長和增殖,使其細胞周期出現S期阻滯,而對正常細胞系的生物學功能無明顯影響。由此發現二氧化鈦納米粒子可以用于癌癥,尤其是肝癌的生物治療。

因此本發明的一個方面提供了一種包含所述二氧化鈦納米粒子的藥物組合物,優選所述二氧化鈦納米粒子為10-15納米的顆粒大小的二氧化鈦納米粒子。

所述藥物組合物可用于治療和預防以腫瘤生長、轉移和血管生成為特征的人體或動物體疾病,尤其是癌癥,能夠促進癌細胞的凋亡。優選所述治療和預防方法不是光動力療法、光熱和聲動力療法。

原則上,本發明所述的二氧化鈦納米粒子或包含二氧化鈦納米粒子的藥物組合物可治療任何類型的癌癥,并避免與藥物抗性腫瘤相關的問題。例如本發明所述的二氧化鈦納米粒子或包含二氧化鈦納米粒子的藥物組合物可用于治療肺癌、肝癌、腎癌、膀胱癌、宮頸癌、乳腺癌、頭頸癌、腦癌、卵巢癌、前列腺癌、腸癌、胃癌、結腸癌、直腸癌、子宮癌、胰腺癌、眼癌、骨髓癌、淋巴系統癌或甲狀腺癌等癌癥。優選用于治療肝癌。

當用于治療或預防上述癌癥時,二氧化鈦納米粒子和/或其藥物組合物可單獨給藥或應用,也可與其它藥物活性劑聯合用藥。因此本發明所述的藥物組合物除二氧化鈦納米粒子外還任選地可包含一種或多種其他對癌癥有效的活性成分。優選其他對癌癥有效的活性成分為具有細胞毒性作用的可用于化療的化合物,更優選其他對癌癥有效的活性成分為紫杉醇。

本發明所述的藥物組合物還可以包含至少一個靶向部分,所述靶向部分為對通常僅存在于癌細胞或腫瘤組織中的生物部分例如分子標志或結構(例如,基因、蛋白質)具有優先的結合親和力的分子。優選所述靶向部分為唾液酸,其專一性地與僅存在于腫瘤組織或癌細胞表面的分子標志物唾液酸受體結合,使本發明的藥物組合物能夠特異性地靶向腫瘤組織或肝癌細胞。更優選所述唾液酸與二氧化鈦納米粒子通過共價鍵綴合。

本發明的另一個方面提供了一種抑制腫瘤的材料,所述材料包含二氧化鈦納米粒子,優選包含10-15納米顆粒大小的二氧化鈦納米粒子。

本發明的再一個方面提供了二氧化鈦納米粒子在制備治療癌癥的藥物組合物中的應用,優選所述的藥物組合物并非用于癌癥的光動力療法、光熱和聲動力療法的藥物組合物,更加優選所述的二氧化鈦納米粒子的顆粒大小為10-15納米。

進一步地,本發明還提供了二氧化鈦納米粒子及包含所述二氧化鈦納米粒子的藥物組合物在治療和預防癌癥以及促進癌細胞凋亡中的應用。優選所述治療和預防方法不是光動力療法、光熱和聲動力療法,更加優選所述的二氧化鈦納米粒子的顆粒大小為10-15納米。

進一步地,本發明還提供了二氧化鈦納米粒子在制備治療或預防癌癥或促進癌細胞凋亡的藥物組合物中的應用。優選所述的藥物組合物并非用于癌癥的光動力療法、光熱和聲動力療法的藥物組合物,更加優選所述的二氧化鈦納米粒子的顆粒大小為10-15納米。

本發明的藥物組合物除有效的活性成分外還包含一種或多種藥學可接受的成分或載體的藥物組合物。合適的藥學可接受的成分和載體是本領域技術人員熟知的,例如,鹽水溶液、等滲溶液、稀釋劑、賦形劑、佐劑、填充劑、緩沖液、防腐劑、抗氧化劑、潤滑劑、穩定劑、增溶劑、表面活性劑(例如,潤濕劑)、掩蔽劑、著色劑、調味劑和甜味劑。在標準藥學教科書中可找到合適的載體、稀釋劑、賦形劑等。

本發明提供通過給藥患者治療有效量的化合物和/或其藥物組合物來治療或預防的方法。所述患者可以是動物,更優選是哺乳動物,更優選是人。

通常,治療癌癥或癌癥的治療包括經口服(例如通過吞咽)或更優選腸胃外對受治療者施用。優選腸胃外施用包括,但不限于皮下、皮內、肌肉內、靜脈內、動脈內、心內、鞘內、脊柱內、囊內、包膜下、眼眶內、腹腔內、氣管內、角質層下、關節內、蛛網膜下和胸骨內注射。給藥可為系統或局部的。各種遞送系統(例如包囊化在脂質體、微粒、微膠囊、膠囊等中)也可用于給藥化合物和/或其藥物組合物。給藥的優選模式由實施者來判斷,并部分有賴于給藥位點的情況。在大多數情況下,給藥將導致所述化合物和/或其藥物組合物釋放到血液中。

藥物組合物可以是液體、溶液或懸浮液(例如,水溶液或非水溶液)、乳液(例如,水包油型、油包水型)、酏劑、糖漿、藥糖劑、片劑(例如,包衣片)、顆粒、粉末、糖錠、錠劑、膠囊(例如硬質和軟質明膠膠囊)、丸劑、安瓿、大藥丸、酊劑、凝膠、糊劑或油的形式。

通常,藥物組合物會包含治療有效量的本發明的二氧化鈦納米粒子。本領域技術人員將理解二氧化鈦納米粒子或包含二氧化鈦納米粒子的藥物組合物的適當劑量可因患者而異。測定最佳劑量將通常包括針對任何風險或有害副作用平衡療效水平。所選擇的劑量水平將取決于多種因素,包括施用途徑、施用時間、二氧化鈦納米粒子的排泄速率、治療的持續時間、組合使用的其他化合物和/或材料、病癥的嚴重度和患者的物種、性別、年齡、重量、病癥、綜合健康狀況和之前的醫療史。盡管通常會選擇在作用部位達到實現期望作用的局部濃度的劑量,但劑量和施用途徑將最終依據醫師或臨床醫生的判斷。

通常,本發明的用于治療癌癥的治療或方法包括對受治療者施用治療有效量的本發明所述的二氧化鈦納米粒子或包含二氧化鈦納米粒子的藥物組合物,優選所述的二氧化鈦納米粒子的顆粒大小為10-15納米。

可以在整個治療過程中以一種劑量連續或間歇地(例如,在以合適間隔的分次劑量)進行施用。確定最有效的施用方式和劑量的方法是本領域技術人員熟知的,且隨用于療法的制劑、療法的目的、被治療的靶組織或細胞和被治療的受治療者而變化。并可以供治療醫師或臨床醫生選擇不同的劑量水平和模式進行單次或多次施用。

為了幫助理解本說明書和權利要求書,提供了如下定義:

術語“患者”或“受治療者”可互換使用,是指哺乳動物如人和非人靈長類動物,以及實驗動物如兔,大鼠和小鼠,及其它動物。

“癌癥”或者“腫瘤”是同義術語,是指特征在于細胞不受控制的異常增殖、病變細胞的局部傳播或者通過血液和淋巴系統播散至機體其它部分(即轉移)的能力以及許多特征性結構和/或分子學特征的任一種疾病。“癌癥”或者“腫瘤”細胞是指具有特異性結構性質、缺少分化并且能浸潤和轉移的細胞。癌癥例如是肺癌、肝癌、腎癌、膀胱癌、宮頸癌、乳腺癌、頭頸癌、腦癌、卵巢癌、前列腺癌、腸癌、胃癌、結腸癌、直腸癌、子宮癌、胰腺癌、眼癌、骨髓癌、淋巴系統癌或甲狀腺癌等癌癥。優選用于治療肝癌。

本文所用術語“治療癌癥”是指阻止、減輕、改善、停止、遏制、減緩或者逆轉腫瘤進展,或者降低哺乳動物中的腫瘤發育和增加凋亡率,或者在腫瘤細胞中誘導凋亡。

“治療有效量”,是指當施用給病人用于疾病的治療時,足夠實施對這種疾病的治療的化合物的量。“治療有效量”將根據化合物、疾病和其嚴重性,以及被治療的病人的年齡、體重等變化。

為了使本發明的目的、技術方案和優點更加清楚明白,以下結合附圖及實施例,對本發明進行進一步詳細說明。應當理解,在此描述的特定實施方式僅通過舉例的方式來解釋本發明,在閱讀了本發明的上述內容之后,本領域技術人員可對本發明做出各種不背離本發明的精神和范圍的修改,這些等價形式同樣落于本發明所要求保護的范圍。

附圖說明

圖1是二氧化鈦納米粒子(TiO2)對HepG2細胞生長的抑制。其中圖1A的細胞計數結果顯示TiO2對L02細胞的生長狀態無明顯影響,圖1B的細胞計數結果顯示TiO2明顯抑制HepG2細胞的生長,且抑制結果呈一定的濃度依耐性,并且不同濃度之間的抑制差異有統計學意義(*P<0.05,**P<0.01)。

圖2是二氧化鈦納米粒子(TiO2)對HepG2細胞增殖的抑制。細胞與TiO2共培養12h、24h、48h后于3個時間點分別檢測細胞增殖情況。其中圖2A的結果顯示,對于L02細胞,在12h、24h、48h三個時間點,與對照組相比,四個濃度實驗組的細胞增殖能力雖稍有抑制,但均無統計學差異。圖2B的結果顯示,對于HepG2細胞,四個濃度實驗組的細胞增殖能力均明顯下降,并且有明顯的的濃度依賴性,與對照組相比,培養12h時0D值無統計學差異,24h時0D值明顯降低,48h時降低更明顯,差異有統計學意義(*P<0.05,*P<0.01)。

圖3是二氧化鈦納米粒子(TiO2)對HepG2細胞周期S期的抑制。與TiO2共培養48h后,應用7-AAD染色流式細胞術檢測對TiO2對L02和HepG2細胞周期G1、S、G2期的變化。圖3A的結果顯示,TiO2對L02細胞的G1、S、G2期無明顯影響。圖3B的結果顯示,在HepG2細胞中,隨著濃度的增加,細胞周期G1期的比例增加,與對照組比較,差異具有統計學意義(*P<0.05)。而S期的比例隨著濃度的增加比例明顯降低,與對照組比較,差異具有統計學意義(*P<0.01)。G2期細胞比例無明顯變化。

圖4是二氧化鈦納米粒子(TiO2)誘導HepG2細胞的凋亡。與TiO2共培養48h后收集細胞應用Annexin V/7-AAD雙染色法流式細胞術檢測TiO2對L02和HepG2細胞凋亡的影響。圖4A和圖4B的結果顯示,48h后L02細胞未出現明顯的凋亡。圖4C和圖4D的結果顯示,在HepG2細胞中,隨著濃度的增加,細胞凋亡率增加,與對照組比較,差異具有統計學意義(*P<0.05,**P<0.01)。

圖5是二氧化鈦納米粒子(TiO2)誘導凋亡相關蛋白caspase-3,線粒體相關蛋白SirT3、VDAC1、ACSS1和膜通道蛋白αENaC的表達結果。細胞與不同濃度的TiO2-NPS共培養48h后通過Western Blot分析細胞中caspase-3、αENaC、SirT3、ACSS1、VDAC1的表達。圖5A的結果顯示在L02細胞中,caspase-3、αENaC、SirT3、ACSS1以及VDAC1的表達量與對照組比較,沒有明顯變化。圖5B的結果顯示在HepG2細胞中,caspase-3、αENaC、SirT3以及VDAC1的表達明顯上調,ACSS1的表達明顯下調,均具有濃度依賴性。提示TiO2通過線粒體途徑誘導HepG2細胞的凋亡,并且所述凋亡可能與αENaC有關。

圖6是二氧化鈦納米粒子(TiO2)對caspase3/7活性的影響。圖6A的結果顯示TiO2對L02細胞中caspase 3/7的活性無明顯影響。圖6B的結果顯示TiO2可誘導HepG2細胞中caspase 3/7活性的顯著增加,差異具有統計學意義(*P<0.05,**P<0.01)。這些發現進一步證明,TiO2能夠降低HepG2細胞活力,促進細胞凋亡,使caspase 3/7活性增加。

圖7是二氧化鈦納米粒子(TiO2-NPS)使HepG2細胞膜電位去極化的結果。通過JC-10檢測試劑盒檢測L02和HepG2細胞膜電位的變化,圖7A的結果顯示,與TiO2共培養48h后,L02細胞線粒體膜電位無明顯變化。圖7B的結果顯示,在HepG2細胞中,線粒體膜電位出現逐漸去極化趨勢,呈濃度依賴性,差異有統計學意義(*P<0.05,**P<0.01)。

圖8是二氧化鈦納米粒子(TiO2)使HepG2細胞ADP/ATP比例升高的結果。通過ADP/ATP檢測試劑盒檢測細胞內ADP/ATP比例的變化,圖8A的結果顯示,與TiO2共培養48h后,L02細胞內ADP/ATP比例無明顯變化。圖8B的結果顯示,在HepG2細胞中,ADP/ATP比例逐漸升高,呈濃度和時間依賴性,差異有統計學意義(*P<0.05,**P<0.01)。

圖9是二氧化鈦納米粒子(TiO2)-Taxol(紫杉醇)聯合抑制HepG2細胞生長的結果。圖9A的結果顯示,在與NPS(唾液酸)、TiO2和TiO2-NPS共培養48h的實驗組中,TiO2-NPS對HepG2細胞生長的抑制作用更為顯著(*P<0.05)。圖9B的結果顯示,在與TiO2、Taxol以及TiO2-Taxol共培養48h的實驗組中,TiO2-Taxol對HepG2細胞生長的抑制作用相比單獨使用TiO2或Taxol對HepG2細胞生長的抑制作用更為顯著(*P<0.05,**P<0.01)。單獨使用Taxol的抑制率為17.8%;單獨使用TiO2-NPS的抑制率為24.9%;而TiO2-Taxol兩者聯用的抑制率則達到58.7%。由此可見TiO2與Taxol兩者的聯合使用對于HepG2細胞生長產生了協同抑制的效果。

圖10是TiO2-NPS-Taxol和TiO2–Taxol抑制HepG2細胞生長的結果。圖10的結果顯示,在與TiO2-NPS-Taxol和TiO2–Taxol共培養48h的實驗組中,5ug/ml TiO2-NPS-Taxol對HepG2細胞生長就能夠達到比10ug/ml TiO2–Taxol更好的抑制效果,10ug/ml TiO2-NPS-Taxol的抑制作用更為顯著(*P<0.05)。

圖11是TiO2-NPS-Taxol毒性實驗結果。上述結果顯示,14d內觀察動物正常,無死亡現象。

圖12是TiO2-NPS-Taxol體內抑制裸鼠荷瘤實驗結果。上述結果顯示,TiO2-NPS-Taxol可以顯著抑制肝癌細胞HepG2誘導的荷瘤裸鼠體內腫瘤的生長。

具體實施方式

實施例1.載有不同濃度的TiO2-NPS培養板的制備

二氧化鈦納米粒子通過本領域常規方式制備,稱取5.0mg二氧化鈦納米粒子(TiO2)粉末(所使用的納米粒子顆粒大小為10納米和15納米兩種)溶于100ml 75%酒精溶液中,終濃度為50.0ug/ml。充分混勻,然后分裝保存。根據前期預實驗結果,采用如下4個濃度進行實驗組分組實驗:2.5ug/ml、5.0ug/ml、7.5ug/ml、10.0ug/ml;分別根據培養板孔徑所加培養液的體積,加入相應量的TiO2-NPS混懸液,6孔板分別加入100μl、200μl、300μl、400μl,96孔板分別加入5μl、10μl、15μl、20μl;然后用75%酒精將分組液體補齊使液體體積一致,對照組加等量的75%酒精溶液。使懸液均勻平鋪于孔底面。將實驗孔板置于電熱恒溫干燥箱,恒定于60℃,待酒精徹底蒸發后取出置于超凈工作臺內,于紫外線燈照射2h,備用。

實施例2.細胞培養、傳代及分板

人類正常肝細胞系L02,人肝癌細胞株HepG2。均來自首都醫科大學傳染病研究所凍存。

2.1.細胞復蘇

取出液氮凍存的細胞迅速放于37℃水浴箱中水浴,使其快速融化。將凍存管內的細胞迅速加入含2ml DMEM液體培養基(已加入10%胎牛血清,下同)的離心管中,800rpm,離心3min,棄去上清。向離心管中加入2ml DMEM液體培養基使細胞重懸,將混勻的細胞移至加有3ml DMEM液體培養基的培養瓶中,輕輕水平十字搖晃培養瓶,使細胞分布均勻,室溫下置于超凈臺內靜置數分鐘,使細胞沉淀,顯微鏡下觀察。將細胞置于37℃,5%CO2孵箱中培養(將培養瓶口擰松)。24小時后細胞換液,去除漂浮的死亡細胞。

2.2.細胞傳代

小心棄去DMEM液體培養基,1×PBS緩沖液將細胞洗滌2次。0.25%胰酶(含0.02%EDTA)1ml消化融合度達80%至90%的細胞,顯微鏡下觀察。待細胞間隙清晰可見時,迅速加入2ml DMEM液體培養基終止消化,然后將細胞轉移至離心管中。1000rpm,離心5min,棄上清。加入2ml DMEM液體培養基,將細胞吹勻,重懸。將混勻的細胞分裝至加有DMEM液體培養基的培養瓶中,37℃,5%CO2孵箱中培養。或進行分板,用于后續的細胞實驗。

2.3.細胞分板

消化收集處于對數生長期的細胞。1000rpm,離心5min,棄上清。加入2ml DMEM液體培養基,將細胞吹勻,重懸。吸取混勻細胞液10μl,采用記數板記數。

計數方法如下:細胞數(個/ml)=(記數板4個大方格細胞總數/4)×104。用DMEM液體培養基將細胞終濃度稀釋至1×105個/ml,然后加入到制備好的TiO2-NPS培養板中。

六孔板每孔中加入2ml稀釋好的細胞液,“十字法”搖勻,置于37℃,5%CO2孵箱中培養。96孔板每孔中加入100μl稀釋好的細胞液,“十字法”搖勻,置于37℃,5%CO2孵箱中培養。

實施例3.細胞計數法檢測TiO2對L02和HepG2細胞生長情況的影響

分別使用顆粒大小為10納米和15納米兩種TiO2與6孔板中細胞(進行實驗)共同培養48h后消化收集細胞于5ml離心管中。1000rpm,離心5min,棄上清。加入2ml DMEM液體培養基,將細胞吹勻,重懸。吸取混勻細胞液10μl,采用記數板記數,記下各組細胞數目。

結果分析:細胞計數結果顯示,TiO2對L02細胞的生長狀態無明顯影響(如圖1A所示),對HepG2細胞的生長明顯抑制(如圖1B所示),呈一定的濃度依賴性,并且不同濃度之間的抑制差異有統計學意義(*P<0.05,**P<0.01)。圖中1中所示為10納米顆粒大小的TiO2的實驗結果,15納米顆粒大小的TiO2-NPS實驗結果與10納米顆粒大小的相同,在此沒有給出具體圖譜。

實施例4.CCK-8法檢測TiO2-NPS對L02和HepG2細胞增殖的影響

在經10納米顆粒大小TiO2制備好的96孔板中接種細胞懸液(100μl/孔)。將培養板放在培養箱中培養(在37℃,5%CO2的條件下)。分別取12、24、48h 3個時間點進行檢測,在培養相應時間后向每孔加入10μl的CCK-8溶液,然后在培養箱內孵育1小時。用酶標儀測定樣本在450nm處的吸光度值(OD值)。

結果分析:我們采用CCK-8細胞增殖與活性檢測試劑盒來分析TiO2對L02和HepG2細胞凋亡的影響。細胞計數結果顯示,在L02細胞中,在12h、24h、48h三個時間點,與對照組相比,四個濃度實驗組的細胞增殖能力稍有抑制,但均無統計學差異(如圖2A所示)。在HepG2細胞中,四個濃度實驗組的細胞增殖能力均明顯下降,有明顯的的濃度依賴性,與對照組相比,培養12h時0D值無統計學差異,24h時0D值明顯降低,48h時降低更明顯,差異有統計學意義(*P<0.05,*P<0.01)(如圖2B所示)

實施例5.7-AAD染色流式細胞術檢測對TiO2對L02和HepG2細胞周期時相的影響

細胞與10納米顆粒大小TiO2在6孔板中共培養48h后消化收集細胞于5ml流式管中。用冷的PBS洗滌2次。加入300μl PBS重懸后,緩慢加入800μl冰冷的無水乙醇進行固定,4℃過夜。固定好的細胞800rpm,離心3min,然后加入500μl PBS洗滌2次。細胞重懸后加入100μl PBS,然后加入5μl 7-AAD,室溫染色15min。上機檢測。

結果分析:與TiO2共培養48h后,應用7-AAD染色流式細胞術檢測對TiO2對L02和HepG2細胞周期G1、S、G2期的變化。結果顯示,TiO2對L02細胞的G1、S、G2期無明顯影響(如圖3A所示)。但在HepG2細胞中,隨著濃度的增加,細胞周期G1期的比例增加,與對照組比較,差異具有統計學意義(*P<0.05)。而S期的比例隨著濃度的增加比例明顯降低,與對照組比較,差異具有統計學意義(*P<0.01)。G2期細胞比例無明顯變化(如圖3B所示)。

實施例6.Annexin V/7-AAD雙染色法流式細胞術檢測TiO2對L02和HepG2細胞凋亡的影響

在6孔板中細胞與10納米顆粒大小TiO2共同培養48h后消化收集細胞于5ml流式管中。用冷的PBS洗滌2次。然后用1×Binding Buffer緩沖液重懸。細胞800rpm離心3分鐘后,在流式管中加入100μl 1×Annexin V Binding Buffer。加入5μl的Annexin V-FITC和5μl7-AAD進行雙染,輕輕混勻,室溫避光處放置15分鐘。1小時內使用流式細胞儀測定結果。

結果分析:與TiO2共培養48h后收集細胞應用Annexin V/7-AAD雙染色法流式細胞術檢測TiO2對L02和HepG2細胞凋亡的影響。結果顯示,48h后L02細胞細胞未出現明顯凋亡(如圖4A、4B所示)。在HepG2細胞中,隨著濃度的增加,細胞凋亡率增加(如圖4C、4D所示),與對照組比較,差異具有統計學意義(*P<0.05,**P<0.01)。

實施例7.Western Blot檢測TiO2對L02和HepG2細胞凋亡相關蛋白caspase-3,膜蛋白αENaC,線粒體相關蛋白SirT3、VDAC1、ACSS1表達的影響

7.1.總蛋白提取

細胞培養、傳代及分板的方法與實施例2相同。棄去細胞培養基,加入1ml 1×PBS液,洗去細胞碎片,棄液。0.25%胰酶消化收集細胞,離心,1200rpm,5min,棄上清。1ml 1×PBS液,吹勻細胞,移至1.5ml EP管中,低溫高速離心,4℃,12 000rpm,15min,徹底棄除上清(可選用移液器吸取)。每管中加細胞裂解液30至50μl(已按100:1比例已加入PMSF),混勻。冰上放置30min至60min,充分裂解。低溫高速離心,4℃,12 000rpm,15min,吸取上清液。測蛋白濃度,于-80℃冰箱保存。

7.2.蛋白濃度測定

配置工作液:根據標準品和樣品數量,將BCA試劑盒中的A試劑與B試劑按體積比50:1進行配置。充分混勻,現配現用。

標準品的稀釋:按照表1所示進行標準品稀釋。將稀釋好的標準品加入20μl至96孔板的標準品孔中。

加20μl的蛋白稀釋液(2μl蛋白+18μl ddH2O)到96孔板的樣品孔中。每個孔加入200μl的BCA工作液,37℃避光放置30min。冷卻到室溫,用酶標儀測定,設置波長為562nm。

表1.標準品的稀釋

7.3.蛋白變性

蛋白中加入裂解液體積1/3的4×SDS Buffer,混勻,使其終濃度為1×SDS。99℃,500rpm,震蕩10min后冰浴5min,冷卻至室溫后,分裝,-80℃保存。

7.4.配制濃縮膠及分離膠

按照表1所示進行濃縮膠及分離膠的配制。

表2 10%Gel SDS-PAGE分離膠(5ml)及5%SDS-PAGE濃縮膠(2ml)配制方法

7.5.配置電泳緩沖液及轉膜緩沖液

按照表3所示進行電泳緩沖液及轉膜緩沖液的配制。

表3電泳緩沖液及轉膜緩沖液配制方法

7.6.蛋白電泳

將電泳緩沖液倒入電泳儀中,依電極方向放置配制好的膠板。分別對應對照組、四個濃度實驗組加樣,每孔加樣100μg,另加預染蛋白分子量Marker 5μl對照。

電泳條件:上層膠90V,20min;下層膠120V,60至90min。注意目的條帶不要跑出膠外。

7.7.轉膜

根據預染蛋白分子量Marker切膠,剪裁大小合適的濾紙及PVDF膜。提前將PVDF膜在無水甲醇中浸泡10min,ddH2O浸泡5min,轉膜緩沖液浸泡15min;同時將濾紙浸泡于轉膜緩沖液中。轉膜槽中倒入轉膜緩沖液,放置冰盒中預冷。將夾板放入盛有轉膜緩沖液的培養皿中,負極(黑板)向下,由下向上分別放置:濾紙、膠、PVDF膜、濾紙,兩端夾蓋海棉,趕出氣泡,按電極方向安裝至轉膜槽中。

轉膜條件:GAPDH(36kDA)16W,30min;目的條帶根據分子量大小采用不同的功率和轉膜時間。

7.8膜封閉及抗體孵育

用TBST緩沖液浸泡洗膜,再用5%脫脂奶粉溶液封閉,室溫,置搖床上2h。同時將膠用考馬斯藍染色,置搖床上2h。孵育一抗,4℃過夜。TBST緩沖液浸泡洗膜,搖床,每次10min,共3次。孵育二抗,置于搖床上室溫孵育1h(羊抗鼠多克隆抗體IgG以1:5000稀釋,羊抗兔多克隆抗體IgG以1:5000稀釋)。TBST緩沖液洗膜,置于搖床上,每次10min,共3次。

7.9化學發光顯影

將反應液A、B以1:1比例混勻,反復沖洗PVDF膜。用PE膜包裹覆蓋,放于fusion solo成像儀中,進行掃描。圖片用Bio1D軟件分析測定目的條帶的光密度值。

結果分析:為了進一步研究TiO2誘導HepG2細胞發生凋亡的分子作用機制,將細胞與不同濃度的TiO2共培養48h后通過western Blot分析細胞caspase-3、αENaC、SirT3、ACSS1、VDAC1的表達。結果顯示,在L02細胞中,caspase-3、αENaC、SirT3、ACSS1以及VDAC1的表達量與對照組比較沒有明顯變化(如圖5A所示)。在HepG2細胞中,caspase-3、αENaC、SirT3以及VDAC1的表達明顯上調,ACSS1的表達明顯下調,均具有濃度依賴性(如圖5B所示)。提示TiO2通過線粒體途徑誘導HepG2細胞的凋亡,并且所述凋亡可能與αENaC有關。

實施例8.Caspase3/7活性實驗檢測TiO2對L02和HepG2細胞凋亡的影響

在96孔板中細胞與10納米顆粒大小TiO2共同培養24h和48h后,每孔加入100ul Caspase 3/7活性檢測試劑后,用酶標儀直接檢測其在440-460nm處的熒光值。

結果分析:與TiO2共培養48h后收集細胞應用Caspase3/7活性實驗檢測TiO2對L02和HepG2細胞凋亡的影響。結果顯示,48h后L02細胞未出現明顯凋亡(如圖6A所示)。在HepG2細胞中,隨著作用時間及濃度的增加,細胞凋亡率增加(如圖6B所示),與對照組比較,差異具有統計學意義(*P<0.05,**P<0.01)。

實施例9.JC-10檢測試劑盒檢測TiO2對L02和HepG2細胞線粒體膜電位的影響

細胞與10納米顆粒大小TiO2置于6孔板中共培養48h后收集細胞于5ml流式管中。PBS洗滌2次。將200×JC-10抗體(A液)用緩沖液(B液)稀釋成1×JC-10染色液備用。細胞洗滌后每管加入500μl JC-10染色液進行染色。避光孵育40分鐘后上機檢測,FL1通道為綠色熒光信號,FL2通道為紅色熒光信號。計算各組FL1/FL2的熒光強度比值。

結果分析:通過JC-10檢測試劑盒檢測L02和HepG2細胞膜電位的變化。結果顯示,與TiO2共培養48h后,L02細胞線粒體膜電位無明顯變化(如圖7A所示)。在HepG2細胞中,線粒體膜電位出現逐漸去極化趨勢,呈濃度依賴性,差異有統計學意義(*P<0.05,**P<0.01)(如圖7B所示)。提示TiO2使HepG2細胞線粒體相關蛋白SirT3、VDAC1的表達明顯上調,可能跟線粒體內滲透壓改變誘導細胞膜電位發生變化有關。

實施例10.ADP/ATP檢測試劑盒檢測TiO2對L02和HepG2細胞內ADP/ATP比值的影響

按表4所示組分配制檢測反應液。

表4ADP/ATP檢測反應體系

Table 3-8.Detection system of ADP/ATP

細胞與10納米顆粒大小TiO2置于96孔板中共培養48h。將反應液按100μl/孔加入到與細胞培養孔相對應的新的白色96孔培養板中。上機讀數,記為:數據A。

移除細胞培養板中的培養液,PBS洗滌2次。向每孔中加入50μl核苷酸釋放液(Nucleotide ReleAsing Buffer),室溫輕輕晃動5分鐘。轉移至預先加有反應液的96孔板的對應的孔中,2分鐘后上機讀數,記為:數據B。

將ADP轉化酶(ADP Converting Enzyme)與220μl核苷酸釋放液輕輕混勻后,將混合液取出部分稀釋10倍備用。為了提高準確性,此時再次上機讀數,記為:數據C。

向培養板每孔中加入稀釋好的ADP轉化酶混合液10μl,2分鐘后上機讀數,記為:數據D。

計算ADP/ATP=(數據A–數據B)/(數據C–數據D)。

結果分析:通過ADP/ATP檢測試劑盒檢測細胞內ADP/ATP比例的變化,結果顯示,與TiO2共培養48h后,L02細胞內ADP/ATP比例無明顯變化(如圖8A所示)。在HepG2細胞中,ADP/ATP比例逐漸升高,呈濃度和時間依賴性,差異有統計學意義(*P<0.05,**P<0.01)(如圖8B所示)。提示TiO2使HepG2細胞線粒體相關蛋白ACSS1的表達明顯下調,可能在TiO2進入細胞線粒體后導致呼吸鏈受抑制,從而導致ATP生成障礙,造成ADP在線粒體內堆積。同時TiO2使HepG2細胞線粒體膜電位去極化,有可能會使ATP進一步流失。

實施例11.二氧化鈦納米粒子(TiO2)-Taxol(紫杉醇)對HepG2細胞生長的抑制作用

用p25強堿處理二氧化鈦納米粒子(TiO2),然后與唾液酸(NPS)一起加熱攪拌,使二氧化鈦納米粒子(TiO2)表面連接上唾液酸,經紅外光譜及拉曼光譜檢測特異峰值后確定。

將6孔板中細胞分別與濃度均為10ug/ml的NPS(唾液酸)、10納米顆粒大小TiO2、TiO2-NPS(其中TiO2為10納米顆粒大小)共同培養48h后消化收集細胞于5ml離心管中。以及將6孔板中的細胞分別與濃度均為10ug/ml的10納米顆粒大小的TiO2、Taxol以及TiO2-Taxol(其中TiO2為10納米顆粒大小)共同培養48h后消化收集細胞于5ml離心管中。1000rpm,離心5min,棄上清。加入2ml DMEM液體培養基,將細胞吹勻,重懸。吸取混勻細胞液10μl,采用記數板記數,記下各組細胞數目。

結果分析:實驗結果顯示,在與NPS(唾液酸)、TiO2和TiO2-NPS共培養48h的實驗組中,相同使用濃度下,NPS對HepG2細胞生長無抑制作用,而TiO2和TiO2-NPS對HepG2細胞生長具有明顯的抑制作用,其中TiO2-NPS對HepG2細胞生長的抑制作用更為顯著,說明在TiO2-NPS中NPS對于HepG2細胞具有一定的靶向作用,使得相同濃度的TiO2-NPS較TiO2的抑制效果更好(*P<0.05)(如圖9A所示)。在與TiO2、Taxol以及TiO2-Taxol共培養48h的實驗組中,TiO2-Taxol對HepG2細胞生長的抑制作用相比單獨使用TiO2或Taxol對HepG2細胞生長的抑制作用更為顯著(*P<0.05,**P<0.01)(如圖9B所示)。單獨使用Taxol的抑制率為17.8%;單獨使用TiO2的抑制率為24.9%;而TiO2-Taxol兩者聯用的抑制率則達到58.7%。由此可見TiO2與Taxol兩者的聯合使用對于HepG2細胞生長產生了協同抑制的效果,這是在進行試驗之前無法預料到的結果。

實施例12.TiO2-NPS-Taxol和TiO2–Taxol對HepG2細胞生長的抑制作用。

用p25強堿處理二氧化鈦納米粒子(TiO2)以及實施例11中所制備的TiO2-NPS,然后與Taxol一起加熱攪拌,使之表面連接上Taxol,經紅外光譜及拉曼光譜檢測特異峰值后確定。

將6孔板中細胞分別與TiO2-NPS-Taxol(5ug/ml,10ug/ml)和TiO2–Taxol(10ug/ml)共培養48h,其中TiO2的顆粒大小均為10納米,共同培養48h后消化收集細胞于5ml離心管中。1000rpm,離心5min,棄上清。加入2ml DMEM液體培養基,將細胞吹勻,重懸。吸取混勻細胞液10μl,采用記數板記數,記下各組細胞數目。

結果分析:實驗結果顯示,在實驗組中,5ug/ml TiO2-NPS-Taxol對HepG2細胞生長就能夠達到比10ug/ml TiO2–Taxol更好的抑制效果,10ug/ml TiO2-NPS-Taxol的抑制作用更為顯著(*P<0.05)。說明在TiO2-NPS-Taxol中NPS對于HepG2細胞具有一定的靶向作用,因此降低TiO2-NPS-Taxol的使用量仍然能夠達到較TiO2–Taxol更為顯著的抑制效果(如圖10所示)。

實施例13TiO2-NPS-Taxol的毒性實驗。

TiO2-NPS-Taxol的制備方法參見實施例12。購買16只健康ICR小鼠,雌雄各半,由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供,動物生產許可證號SCXK(京)2012-0001。動物適應3天環境,自由飲水飲食,室溫(23+/-1)℃,濕度(60+/-10)%。隨后給予尾靜脈注射TiO2-NPS-Taxol(其中TiO2的顆粒大小均為10納米)。動物分為4組,每組4只(雌雄各半)。尾靜脈注射TiO2-NPS-Taxol溶液,濃度分別為10mg/kg;1mg/kg;100ug/kg;10ug/kg。

結果提示,14d內觀察動物的行為變化,所有動物于14天內生存狀態正常,無死亡現象(如下列表格所示)。

實施例14 TiO2-NPS-Taxol體內抑制裸鼠荷瘤實驗。

TiO2-NPS-Taxol的制備方法參見實施例12。

購買24只健康BalB/C nu/nu裸鼠,雄性,五周齡,由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供,動物生產許可證號SCXK(京)2012-0001。動物適應3天環境,自由飲水飲食,室溫(23+/-1)℃,濕度(60+/-10)%。取對數期生長肝癌細胞HepG2胰酶消化得單細胞懸液。按5X107個/只細胞量進行裸鼠腋下皮下注射荷瘤。動物分為3組:對照組,尾靜脈注射給藥組與皮下注射給藥組;每組8只。腫瘤長出后,注射TiO2-NPS-Taxol溶液(其中TiO2的顆粒大小均為10納米),濃度為10mg/kg。每三天記錄腫瘤體積,共給藥四次。第四次給藥24h后,動物處死,稱取腫瘤重量,計算腫瘤系數。(腫瘤系數=腫瘤重量/體重X1000)

結果提示,二氧化鈦納米粒子TiO2-NPS-Taxol可以顯著抑制肝癌細胞HepG2誘導的荷瘤裸鼠體內的腫瘤生長(如圖11所示)。

除上述10納米顆粒大小的TiO2納米粒子的實驗外,申請人還做了顆粒為15納米的TiO2納米粒子的實驗,實驗結果顯示,15納米顆粒大小與10納米顆粒大小的TiO2納米粒子實驗結果完全相同,也能夠抑制HepG2細胞的增殖,減少HepG2細胞周期的S期比例,誘導HepG2細胞的凋亡,在HepG2細胞中,誘導caspase-3、αENaC、SirT3以及VDAC1的表達,抑制ACSS1的表達,誘導HepG2細胞中caspase 3/7活性的顯著增加,使HepG2細胞線粒體膜電位出現去極化趨勢,提高ADP/ATP比例,與紫杉醇聯合使用有協同作用,在體內能抑制肝癌細胞HepG2誘導的實體瘤,且對小鼠無明顯毒性。

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