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一種抗HIV中藥的有效部位及其制備方法.pdf

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一種 HIV 中藥 有效 部位 及其 制備 方法
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摘要
申請專利號:

CN201410166156.7

申請日:

20140423

公開號:

CN103948631A

公開日:

20140730

當前法律狀態:

有效性:

有效

法律詳情:
IPC分類號: A61K35/56,A61P31/18 主分類號: A61K35/56,A61P31/18
申請人: 南方醫科大學
發明人: 劉利紅,徐小英,李琳,張萱萱
地址: 510515 廣東省廣州市白云區沙太南路1023號
優先權: CN201410166156A
專利代理機構: 廣州嘉權專利商標事務所有限公司 代理人: 鄭瑩
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法律狀態
申請(專利)號:

CN201410166156.7

授權公告號:

法律狀態公告日:

法律狀態類型:

摘要

本發明公開了一種抗HIV中藥的有效部位及其制備方法。本發明的制備方法包括如下步驟:(1)稱取地龍適量,加入無水乙醇,超聲提取,濾液減壓除去乙醇;(2)加入石油醚,超聲溶解后抽濾,濾液中加入水萃取,取上相,減壓除去石油醚;(3)將上述提取物上硅膠柱,以石油醚-乙酸乙酯混合液梯度洗脫,收集石油醚-乙酸乙酯比例為20:3的洗脫液,減壓除去石油醚-乙酸乙酯,得抗HIV的中藥有效部位。本發明制備得到的抗HIV有效部位的CC50值為146.93±4.43μg/ml,CC50值比其抗R5病毒感染活性的IC50值大得多,表明其可在較大濃度范圍內對病毒感染產生抑制作用,而不對細胞造成較大的毒性。

權利要求書

1.一種抗HIV中藥有效部位的制備方法,包括如下步驟:(1)稱取地龍適量,加入無水乙醇,超聲提取,抽濾,濾液留用,重復該步驟2~3次,合并濾液,減壓除去乙醇;(2)在上述提取物中加入石油醚,超聲溶解,靜置后抽濾,在濾液中加入水萃取,取上相,重復2~3次,減壓除去石油醚;(3)將上述提取物上硅膠柱,以石油醚-乙酸乙酯混合液梯度洗脫,收集石油醚-乙酸乙酯比例為20:3的洗脫液,減壓除去石油醚-乙酸乙酯,得抗HIV的中藥有效部位。2.根據權利要求1所述的制備方法,其特征在于,步驟(1)無水乙醇的用量為地龍重量的2~4倍。3.根據權利要求1所述的制備方法,其特征在于,步驟(1)超聲提取的條件為:25~30℃,200~300?W?超聲提取0.5~2h。4.根據權利要求1所述的制備方法,其特征在于,步驟(2)在濾液中加入等量的水萃取。5.一種抗HIV中藥有效部分,其特征在于,其是由權利要求1~4任一項的方法制備得到。

說明書

技術領域

本發明涉及中藥技術領域,具體涉及一種抗HIV中藥有效部位的制備方法。

背景技術

艾滋病即獲得性免疫缺陷綜合癥(acquired??immunodeficiency??syndrome,?AIDS),是由人類免疫缺陷病毒(human?immunodeficiency?virus,?HIV)??感染引起的一種嚴重傳染性疾病。自美國?1981?年診斷出首例艾滋病病人以來,艾滋病病毒在全球范圍內的傳播速度驚人,已有?200?余個國家和地區受到艾滋病的嚴重威脅。艾滋病在全球的迅速蔓延,引起了世界衛生組織和各國的高度重視,投入了巨大的人力和財力用于抗HIV新藥及疫苗的研發。目前已上市的抗HIV的藥物,根據不同的作用機制可分為?6?大類:核苷類逆轉錄酶抑制劑(nucleoside?analog??reverse??transcriptase??inhibitors,??NR-TIs)、非核苷類逆轉錄酶抑制劑(non-?nucleoside?analog?reverse?transcriptase?inhibitors,?NNRT?Is)、蛋白酶抑制劑(protease?inhibitors,?PIs)、融合抑制劑(fusion?inhibitors,?FIs)、進入抑制劑(entry?Inhibitors,?EIs)?和整合酶抑制劑(integrase?inhibitors,?IIs)。然而,現存的藥物存在著抗耐藥性差和毒副作用大等弊端,所以繼續開發高效低毒且具有抗耐藥性的艾滋病藥物是當前新藥研發領域具有挑戰性的重大課題。

在當前藥物存在弊端和抗艾滋病新藥研發緩慢的形勢下,人們開始關注傳統醫學,尋找天然抗HIV?藥物的研究正在蓬勃展開。到目前為止,已從天然藥物中分離得到了生物堿類、黃酮類、香豆素類、木脂素類、萜類等具有抗HIV?活性的化學成分,這些天然成分具有專屬性強、毒副反應少、方便有效等優點。因此,從藥用植物與海洋生物等天然藥物中尋找抗HIV?活性成分的研究受到越來越多的重視,現已成為抗HIV?藥物研究的新趨勢(崔祥龍,等,天然藥物中抗HIV?活性成分研究進展【J】.現代生物醫學進展,2010,10(15):2989)。

發明內容

本發明的目的在于提供一種一種抗HIV中藥有效部位的制備方法。

本發明所采取的技術方案是:

一種抗HIV中藥有效部位的制備方法,包括如下步驟:

(1)稱取地龍適量,加入無水乙醇,超聲提取,抽濾,濾液留用,重復該步驟2~3次,合并濾液,減壓除去乙醇;

(2)在上述提取物中加入石油醚,超聲溶解,靜置后抽濾,在濾液中加入水萃取,取上相,重復2~3次,減壓除去石油醚;

(3)將上述提取物上硅膠柱,以石油醚-乙酸乙酯混合液梯度洗脫,收集石油醚-乙酸乙酯比例為20:3的洗脫液,減壓除去石油醚-乙酸乙酯,得抗HIV的中藥有效部位。

作為優選的,步驟(1)無水乙醇的用量為地龍重量的2~4倍。

作為優選的,步驟(1)超聲提取的條件為:25~30℃,200~300?W?超聲提取0.5~2h。

作為優選的,步驟(2)在濾液中加入等量的水萃取。

由上述方法制備得到的抗HIV中藥有效部分。

本發明的有益效果是:

本發明制備得到的抗HIV有效部位的CC50值為146.93±4.43?μg/ml,其細胞毒性較小。該抗HIV有效部位的CC50值比其抗R5病毒感染活性的IC50值大得多,表明其可在較大濃度范圍內對病毒感染產生抑制作用,而不對細胞造成較大的毒性。

附圖說明

圖1是本發明抗HIV有效部位與N36結合的HPCE電泳圖,其中,?A為單獨進本發明有效部位的電泳圖,B為依次進本發明有效部位和N36(100?μg/ml)的電泳圖,?C為依次進本發明有效部位和N36(200?μg/ml)的電泳圖;

圖2?是對照藥TF與N36結合的HPCE電泳圖,其中,D為單獨進TF的電泳圖,E為依次進TF和N36的電泳圖;

圖3是本發明抗HIV有效部位與TF抑制HIV六螺旋束核心結構形成的N-PAGE電泳圖,其中,1是C34的電泳結果,2是N36和C34共孵育后的電泳結果,3是終濃度為454?μg/ml的本發明有效部位與N36和C34共孵育后的電泳結果,4是終濃度為454?μg/ml的TF與N36和C34共孵育后的電泳結果;

圖4是本發明抗HIV有效部位與TF抑制HIV六螺旋束核心結構形成的N-PAGE電泳圖,其中,1是C34的電泳結果,2是N36和C34共孵育后的電泳結果,3-5是終濃度分別為227?μg/ml、114?μg/ml、45?μg/ml的本發明有效部位與N36和C34共孵育后的電泳結果。

具體實施方式

下面結合實施例對本發明作進一步的說明,但并不局限于此。

實施例1

稱取地龍50g,加入150?ml無水乙醇,靜置?30?min,28℃,250?W?超聲提取?1?h,抽濾,濾液留用,藥渣再加125?ml無水乙醇提取兩次,抽濾,合并三次濾液,減壓除去乙醇;在提取物中加入200?ml石油醚,超聲溶解,靜置?2?h,抽濾,在濾液中加入等量水萃取,取上相,加入等量的水萃取,取上相,減壓除去石油醚;提取物上硅膠柱,以石油醚-乙酸乙酯混合液梯度洗脫(混合液梯度為20:1,20:2,20:3;20:4……),收集石油醚-乙酸乙酯比例為20:3的洗脫液,減壓除去石油醚-乙酸乙酯,得抗HIV的中藥有效部位。

實施例2

稱取地龍50g,加入200?ml無水乙醇,靜置?30?min,30℃,300?W?超聲提取?1.5?h,抽濾,濾液留用,藥渣再加100?ml無水乙醇提取兩次,抽濾,合并三次濾液,減壓除去乙醇;在提取物中加入200?ml石油醚,超聲溶解,靜置?2?h,抽濾,在濾液中加入等量水萃取,取上相,加入等量的水萃取,取上相,減壓除去石油醚;提取物上硅膠柱,以石油醚-乙酸乙酯混合液梯度洗脫(混合液梯度為20:1,20:2,20:3;20:4……),收集石油醚-乙酸乙酯比例為20:3的洗脫液,減壓除去石油醚-乙酸乙酯,得抗HIV的中藥有效部位。

實施例3

稱取地龍50g,加入100?ml無水乙醇,靜置?30?min,25℃,200?W?超聲提取?1?h,抽濾,濾液留用,藥渣再加150?ml無水乙醇提取三次,抽濾,合并四次濾液,減壓除去乙醇;在提取物中加入200?ml石油醚,超聲溶解,靜置?2?h,抽濾,在濾液中加入等量水萃取,取上相,加入等量的水萃取,取上相,減壓除去石油醚;提取物上硅膠柱,以石油醚-乙酸乙酯混合液梯度洗脫(混合液梯度為20:1,20:2,20:3;20:4……),收集石油醚-乙酸乙酯比例為20:3的洗脫液,減壓除去石油醚-乙酸乙酯,得抗HIV的中藥有效部位。

本發明制備得到的抗HIV有效部分作用于HIVgp41六螺旋束核心結構,為了證明其所具有的技術效果,我們采用實施例1制備得到的抗HIV有效部位進行了以下實驗:

一、高效毛細管電泳(HPCE)柱端微反應器對本發明有效部位與N36結合的檢測。

1.實驗方法

1)配制磷酸鹽緩沖液(PBS),其組成為:30?mM?NaH2PO4-Na2HPO4,?pH?7.2。?

2)實施例1抗HIV有效部位用無水乙醇配成濃度為1000?μg/ml的溶液;茶黃素(TF)用PBS配成濃度為1000?μg/ml的溶液;N36?用PBS配成濃度為100?μg/ml的溶液。

3)以PBS為緩沖液,電壓為17?kV,重力進樣,本發明有效部位及TF樣品進樣時間為10秒,N36溶液的進樣時間為3分鐘,用HW-2000色譜工作站進行譜圖采集。首先分別獲得本發明有效部位、TF和N36單獨進樣時的譜圖,然后再獲得依次進本發明有效部位和N36的譜圖以及依次進TF和N36的譜圖。

2.實驗結果

本發明抗HIV有效部位與N36結合的效果如圖1和圖2的HPCE電泳圖所示,從圖中可以看出,在進了N36的譜圖中,本發明有效部位和TF的峰高明顯降低,峰形發生了變化,可見,N36與樣品在毛細管電泳過程中發生了結合;比較圖1B和圖1C,增大N36的濃度可使本發明有效部位的峰高降低更顯著,可見,本發明有效部位與N36的結合呈劑量依賴性。

二、天然凝膠電泳(N-PAGE)法對本發明有效部位抑制HIVgp41六股螺旋束結構形成活性的檢測。

1.實驗方法

1)配制不連續天然聚丙烯酰胺凝膠,其中分離膠為18%,積層膠為5%。

2)將有效部位10?μl與400?μg/ml的N36?6?μl?在37℃共同孵育30分鐘,再加入400?μg/ml的?C34?6?μl?在37℃共同孵育30分鐘。

3)將孵育好的混合液與8?μl?2×Tris-甘氨酸天然凝膠上樣緩沖液混勻,加樣到?10×0.1?cm?的天然聚丙烯酰胺凝膠孔中(每孔25?μl),靜置5分鐘。室溫120?V電壓電泳2小時,考馬斯藍R250染色,脫色后用佳能400D相機拍照記錄。

2.實驗分組

本發明實驗組:稱取實施例1抗HIV有效部位適量,用DMSO溶解,用PBS配成濃度為1000?μg/ml、?500?μg/ml、250?μg/ml和100?μg/ml的溶液。

TF對照組:茶黃素(TF)用水溶解,用PBS配成濃度為1000?μg/ml的溶液。

3.實驗結果

本發明有效部位對HIVgp41六螺旋束結構形成的抑制效果如圖3和圖4的N-PAGE電泳圖所示,從圖中可以看出,在未加藥物作用的的空白對照樣品中,N36和C34混合物形成兩條帶,箭頭A所指的是gp41六螺旋束的條帶,箭頭B所指的是過量的C34的條帶,其形成是因為N36發生了部分聚集而不能充分與C34結合形成六螺旋束,導致C34過剩;加入本發明有效部位或TF的樣品中,六螺旋束結構的條帶消失或僅可見很淺的條帶,說明六螺旋束結構的形成明顯受到了抑制。本發明有效部位在終濃度為227?μg/ml時幾乎能完全抑制六螺旋束結構的形成,在濃度為114?μg/ml時能抑制大部分六螺旋束結構的形成,在濃度為45?μg/ml時能抑制部分六螺旋束結構的形成,其抑制程度隨劑量的遞增而增加。本實驗證明本發明有效部位能夠抑制HIVgp41六螺旋束結構形成。由此可見,本發明抗HIV有效部位具有抗HIV活性。

三、本發明有效部位抗HIV-1 JRFL 假病毒感染活性的檢測

1、化合物抗R5病毒感染活性的檢測

(1)實驗方法

按1×104/孔細胞濃度接種TZMb-1細胞100?μl,次日細胞生長狀態良好后,加入化合物(50?μl)與R5病毒(50?μl)于37?℃預孵育30?min得到的混合物,感染過夜,更換新鮮培養基。48小時后,用熒光素酶報告基因檢測試劑盒檢測化學發光。

抑制率的計算公式為:抑制率=(1-加藥孔OD值/對照孔OD值)×100%,半數有效濃度(IC50)采用CalcuSyn軟件計算。

2)實驗結果

本發明有效部位的IC50值為32.14±1.16?μg/ml,小于陽性對照藥T-20的IC50值(見表1和表2),說明本發明有效部位具有抗R5病毒感染的活性。

表1

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表2

2.MTT法檢測細胞毒性

(1)實驗方法

①生長良好的U87.CD4.CCR5用胰酶消化,離心收集,用1mLDMEM培養基吹打均勻,制成細胞懸液,細胞計數后調整其濃度至1?×?105/ml,然后將細胞懸液按照100?μl/孔接種到96孔板,37℃,5%?CO2條件下培養過夜;

②?按照100μl/孔加入梯度稀釋的藥物,繼續培養48?h;

③按照100μl/孔加入0.5?mg/ml?MTT溶液,37oC條件下孵育4?h;

④于倒置顯微鏡下觀察有沒有藥物的結晶析出,或是否有其它雜志生成,做好標記。

⑤離心96孔板,輕輕吸去上清,按照150μl?/孔加入DMSO溶解結晶。輕輕振蕩10?min,酶標儀讀取A570值。

抑制率的計算公式為:抑制率=(1-加藥孔OD值/對照孔OD值)×100%,半數細胞毒性濃度(CC50)采用CalcuSyn軟件計算。

(2)實驗結果

見表3,由實驗結果可知,本發明有效部位的CC50值為146.93±4.43?μg/ml,說明其細胞毒性較小。本發明有效部位的CC50值比其抗R5病毒感染活性的IC50值大得多,說明其可在較大濃度范圍內對病毒感染產生抑制作用,而不對細胞造成較大的毒性。

表3

以上實施例僅為介紹本發明的優選案例,對于本領域技術人員來說,在不背離本發明精神的范圍內所進行的任何顯而易見的變化和改進,都應被視為本發明的一部分。

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