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一種乳酸菌素PLNE的應用.pdf

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一種 乳酸 菌素 PLNE 應用
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摘要
申請專利號:

CN201811125569.5

申請日:

20180926

公開號:

CN109170268A

公開日:

20190111

當前法律狀態:

有效性:

審查中

法律詳情:
IPC分類號: A23K50/30,A23K50/60,A23K50/75,A23K20/147,C07K14/335 主分類號: A23K50/30,A23K50/60,A23K50/75,A23K20/147,C07K14/335
申請人: 江蘇傲農生物科技有限公司,北京慧農生物科技有限公司
發明人: 樊倩,周盛昌,肖麗萍,檀新珠,黃彪,湯建平,仲偉迎,李兵,吳有林
地址: 223700 江蘇省宿遷市泗陽縣經濟開發區金雞湖路9號
優先權: CN201811125569A
專利代理機構: 上海科盛知識產權代理有限公司 代理人: 趙志遠
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法律狀態
申請(專利)號:

CN201811125569.5

授權公告號:

法律狀態公告日:

法律狀態類型:

摘要

本發明涉及一種乳酸菌素plnE的應用,該乳酸菌素plnE的氨基酸序列如SEQ?ID?NO.1所示,該乳酸菌素plnE可用于殺菌以及提高斷奶仔豬的免疫力。與現有技術相比,本發明利用基因工程技術體外重組表達乳酸菌素plnE,對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、巴氏桿菌等細菌具有很強的殺菌作用,可用于飼養豬或家禽,尤其在乳仔豬、斷奶仔豬、生長豬或種豬等的飼料中應用可以降低腹瀉率、改善腸道功能和提高腸道黏膜免疫力。

權利要求書

1.一種乳酸菌素plnE的應用,其特征在于,該乳酸菌素plnE的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示,所述乳酸菌素plnE用于殺菌。2.根據權利要求1所述的一種乳酸菌素plnE的應用,其特征在于,所述殺菌為殺大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌或巴氏桿菌中的一種或多種。3.根據權利要求1所述的一種乳酸菌素plnE的應用,其特征在于,所述乳酸菌素plnE用于飼養豬。4.根據權利要求3所述的一種乳酸菌素plnE的應用,其特征在于,所述豬包括乳仔豬、斷奶仔豬、生長豬或種豬中的一種或多種。5.根據權利要求4所述的一種乳酸菌素plnE的應用,其特征在于,所述乳酸菌素plnE用于降低斷奶仔豬腹瀉率。6.根據權利要求4所述的一種乳酸菌素plnE的應用,其特征在于,所述乳酸菌素plnE用于改善斷奶仔豬腸道功能。7.根據權利要求6所述的一種乳酸菌素plnE的應用,其特征在于,所述乳酸菌素plnE用于提高斷奶仔豬的腸道黏膜免疫力。8.根據權利要求1所述的一種乳酸菌素plnE的應用,其特征在于,所述乳酸菌素plnE用于飼養家禽。9.根據權利要求8所述的一種乳酸菌素plnE的應用,其特征在于,所述家禽為雞或鴨。

說明書

技術領域

本發明涉及基因工程領域,具體涉及一種乳酸菌素plnE的應用。

背景技術

隨著抗生素的大量使用甚至濫用,它也隨之產生了很多的不良影響,如引起動物菌群失衡、產生耐藥性、危害人類健康等。因此,研究可以改善畜禽健康、提高生長性能且安全無毒的能替代抗生素的添加劑具有重要的意義。乳酸菌素指的是部分乳酸菌在其代謝過程中,可以通過核糖體合成而產生的能夠抑菌的蛋白。乳酸菌素具有無毒、無副作用、無殘留,耐低溫貯藏,熱穩定性等優點,可以選擇性的殺死一些致病菌,并可以保護和促進機體益生菌的生長,從而調節機體的免疫功能,在動物生產上可以作為飼料添加劑被應用。過去大多都是采用硫酸銨沉淀、乙酸乙酯等方法提純乳酸菌素,然而得到的乳酸菌素的產量有限且活性不高。

專利CN106191044A公開了一種提高乳酸菌素plnK產量的基因工程方法,專利CN107043769A公開了一種提高乳酸菌素plnJ的產量的基因工程,這兩篇專利制備得到了乳酸菌素plnK和plnJ,但在應用中發現,這兩種乳酸菌素雖然也有抑菌效果,但抑菌所需的量較大,即抑菌所需的成本較高。

發明內容

本發明的目的就是為了克服上述現有技術存在的缺陷而提供一種產量高、活性好的乳酸菌素plnE的應用。

為實現上述目的,本發明提供一種乳酸菌素plnE,其特征在于,所述乳酸菌素plnE的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。所述乳酸菌素plnE的分子量為6.2KDa,等電點為11.7。

本發明還保護所述一種乳酸菌素plnE的應用,其特征在于,所述乳酸菌素plnE用于殺菌。

進一步的,所述殺菌為殺大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌或巴氏桿菌中的一種或多種。

進一步的,所述乳酸菌素plnE用于飼養豬。

進一步的,所述豬包括乳仔豬、斷奶仔豬、生長豬或種豬中的一種或多種。

進一步的,所述乳酸菌素plnE用于降低斷奶仔豬腹瀉率。

進一步的,所述乳酸菌素plnE用于改善斷奶仔豬腸道功能。

進一步的,所述乳酸菌素plnE用于提高斷奶仔豬的腸道黏膜免疫力。

另外,所述乳酸菌素plnE用于飼養家禽。

進一步的,所述家禽為雞或鴨。

乳酸菌素plnE不僅具有廣譜的抗菌活性,還有一個很重要的功能,就是起到調節黏膜免疫功能的作用,可以提高細胞因子如MDA5、IFN-α、IFN-β的表達量,這些細胞因子能夠殺死腸道中的病微生物,起到調節黏膜免疫功能的作用,從而提高斷奶仔豬的免疫力。

所述的菌包括大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌或巴氏桿菌中的一種或多種。該乳酸菌素plnE具有廣譜的抗菌活性,且當同為0.1mg/mL濃度時,plnE的抑菌效果比同類物質更強。

與現有技術相比,本發明的有益效果體現在:利用基因工程技術體外重組表達乳酸菌素plnE,具有分子量小,人工合成方便且活性高等特點,對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、巴氏桿菌等細菌具有很強的殺菌作用,可用于飼養豬或家禽,尤其在斷奶仔豬飼料中應用可以降低腹瀉率、改善腸道功能和提高腸道黏膜免疫力。

具體實施方式

下面對本發明的實施例作詳細說明,本實施例在以本發明技術方案為前提下進行實施,給出了詳細的實施方式和具體的操作過程,但本發明的保護范圍不限于下述的實施例。

實施例:乳酸菌素plnE的制備

(1)參考Gene Bank乳酸菌(Gene Bank:X94434)的plnE基因的核苷酸序列,采用Primer Premier6設計一對特異性引物,plnE上游引物F:5’-CGCGGATCCATGCTACAGTTTGAGAAGTT-3’,plnE下游引物R:5’-CGGAATTCTTAACGAATACTTTTCAAAA-3’,將設計好的引物序列送往上海生工生物工程股份有限公司合成。

(2)以plnE基因的上游引物F和下游引物R作為擴增引物,乳酸菌DNA為模板,對plnE基因進行PCR擴增,PCR擴增產物用瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

(3)瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR產物后,切線目的條帶進行純化;將純化后的plnE產物與質粒pET-32(+)進行雙酶切;取酶切的PCR目的片段和載體片段進行連接反應;將連接后的重組質粒,轉化至BL21感受態細胞,獲得能夠在體外誘導表達的重組蛋白。將其蛋白命名為乳酸菌素plnE,最后用酶標儀測定乳酸菌素plnE的濃度(濃度為0.48mg/mL)。

一、乳酸菌素plnE的抑菌實驗

(1)試驗設計

1、指示菌的復蘇:大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、巴氏桿菌按1:100的比例加入到高壓好的LB Broth中。其中,巴氏桿菌培養基需加入5%的血清。

2、加熱LB Broth Agar培養基,然后倒入約20mL的固體培養基至無菌的平板中,待平板凝固后,加入200uL的指示菌液。

3、待指示菌液吹干,將無菌的牛津杯放入含有指示菌的平板,在牛津杯中各加入10uL的樣品。試驗設計見表1,分為3個處理組,每組3個重復。最后將固體平板放入37℃恒溫培養箱,培養至24h,游標卡尺用于測量抑菌圈的大小,并做好記錄。

表1試驗設計

組別 乳酸菌素類型 濃度(mg/mL) 空白對照組 —— 0 對比組 plnJ 0.1 試驗組 plnE 0.1

(2)試驗結果

乳酸菌素plnE對大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、巴氏桿菌的抑菌效果由抑菌圈的直徑大小(mm)表述,如表2所示,乳酸菌素plnE濃度為0.1mg/mL對大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、巴氏桿菌都有顯著的抑菌效果,而且,在0.1mg/mL濃度下,plnE的抑菌效果優于現有同類產品,說明本發明具有很強的殺菌作用。

表2抑菌效果

二、動物試驗設計

(1)試驗設計

選取200頭24日齡斷奶仔豬,然后隨機分成4個處理組,每個處理組設置5個重復,每個重復10頭,基礎日糧配方見表3、表4。A組為空白對照組,不添加乳酸菌素plnE,B組添加1.2ug/mL的乳酸菌素plnE,C組添加2.4ug/mL乳酸菌素plnE,D組添加4.8ug/mL的乳酸菌素plnE。試驗期為45d,每天觀察仔豬的精神、食欲、腹瀉、發病、體重等變化,并做好記錄。試驗結束后稱重,計算料重比,測定乳酸菌素plnE對動物生產性能的影響(見表5)。采集各組豬的空腸和十二指腸,先測量空腸絨毛高度(VH)、隱窩深度(CD),各指標取平均值,試驗結果見表6;再采用ELISA法測定各處理組豬的十二指腸SIgA含量,運用熒光定量PCR法檢測各處理組豬的十二指腸黏膜免疫細胞因子(MDA5、IFN-α、IFN-β基因)的表達量,試驗結果見表7。

表3基礎日糧配方

日糧組成 含量(%) 玉米 50 豆粕 23 膨化大豆 8 進口魚粉 4 乳清粉 5 谷殼糠 6 預混料 4 合計 100

表4預混料主要組分

組分 含量 鐵(mg/kg) 120 銅(mg/kg) 200 鋅(mg/kg) 120 錳(mg/kg) 50 硒(mg/kg) 0.2 碘(mg/kg) 0.4 維生素A(IU) 12000 維生素D3(IU) 2000 維生素E(IU) 40 維生素K3(mg/kg) 3.2 維生素B1(mg/kg) 3.0 維生素B2(mg/kg) 6.0 維生素B6(mg/kg) 3.5 維生素B12(mg/kg) 0.04 煙酸(mg/kg) 40 泛酸(mg/kg) 25 葉酸(mg/kg) 3.2 生物素(mg/kg) 0.3

(2)試驗結果

表5生產性能

結果表明,不同濃度的乳酸菌素plnE對斷奶仔豬的生長發育有影響,添加乳酸菌素plnE后,發病率、死亡率、腹瀉率比A組(空白對照)低,且以C組(添加2.4ug/mL)效果最好,說明本發明能顯著提高動物機體的生產性能。

表6各組斷奶仔豬空腸組織形態測定結果

項目 A組 B組 C組 D組 絨毛高度(μm) 359.1a 387.6a 446.8b 412.33b 隱窩深度(μm) 261.5a 268.9a 250.3b 260.5a 絨毛高度/隱窩深度 1.37a 1.44a 1.79b 1.58a

結果表明,與A組(空白對照)相比,斷奶仔豬的絨毛高度有不同程度的提高,其中C的效果最佳;隱窩深度有不同程度的下降,其中C組最低,絨毛高度/隱窩深度的比值以C組最好,說明本發明能顯著促進動物機體的腸道健康。

表7乳酸菌素plnE對斷奶仔豬十二指腸黏膜SIgA含量及細胞因子表達量的影響

項目 A組 B組 C組 D組 SIgA含量(ug/mL) 80.47a 110.56b 122.49b 118.36b MDA5相對表達量 1A 7A 12B 10B IFN-α相對表達量 1A 2A 10B 8B IFN-β相對表達量 1A 5A 9B 7A

結果表明,C組十二指腸黏膜SIgA含量顯著高于A組(P<0.05),且免疫細胞因子MDA5、IFN-α、IFN-β基因的表達量極顯著高于A組(P<0.01),說明本發明能顯著增強動物機體的免疫功能。

序列表

<110> 江蘇傲農生物科技有限公司

北京慧農生物科技有限公司

<120> 一種乳酸菌素plnE的應用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 56

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Leu Gln Phe Glu Lys Leu Gln Tyr Ser Arg Leu Pro Gln Lys Lys

1 5 10 15

Leu Ala Lys Ile Ser Gly Gly Phe Asn Arg Gly Gly Tyr Asn Phe Gly

20 25 30

Lys Ser Val Arg His Val Val Asp Ala Ile Gly Ser Val Ala Gly Ile

35 40 45

Arg Gly Ile Leu Lys Ser Ile Arg

50 55

<210> 2

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

cgcggatcca tgctacagtt tgagaagtt 29

<210> 3

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

cggaattctt aacgaatact tttcaaaa 28

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