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用于制備染色體置換文庫的方法.pdf

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用于 制備 染色體 置換 文庫 方法
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摘要
申請專利號:

CN201580032909.8

申請日:

20150708

公開號:

CN106659137A

公開日:

20170510

當前法律狀態:

有效性:

審查中

法律詳情:
IPC分類號: A01H1/02,A01H1/04,A01H1/08,C12N15/82 主分類號: A01H1/02,A01H1/04,A01H1/08,C12N15/82
申請人: 瑞克斯旺種苗集團公司
發明人: R·H·G·迪克斯,E·W·古特令,G·威利卡卡姆詹姆斯,R·A·尤瑟姆
地址: 荷蘭德利爾
優先權: 14176208.8,14192516.4
專利代理機構: 中國國際貿易促進委員會專利商標事務所 代理人: 李瑛
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法律狀態
申請(專利)號:

CN201580032909.8

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法律狀態公告日:

法律狀態類型:

摘要

本發明涉及用于產生染色體置換文庫的方法,包括:a)從至少部分雜合的起始生物體產生DH系的群;b)鑒定所述群中具有至少一個非重組染色體對的第一個DH系;c)鑒定所述群中匹配的第二個DH系,該第二個DH系具有至少一個與第一個DH系的非重組染色體對相同的非重組染色體對和至少一個與第一個DH系的非重組染色體對不同的非重組染色體對;d)選擇第一個DH系和第二個DH系作為一對親本,其子代具有至少三個非重組染色體,其中至少兩個形成一對;e)對雜合起始生物體的DH群重復步驟b)、c)和d)一次或多次,或對從步驟d)中選定的一對親本的子代植物產生的DH群重復步驟a)?d),直至優選地來自選定的DH系的全部染色體都是非重組并且優選地選擇親本染色體的全部可能的組合,以裝配染色體置換系的文庫。本發明進一步涉及如此獲得的文庫。

權利要求書

1.用于產生染色體置換文庫的方法,包括:a)從至少部分雜合的起始生物體產生DH系的群;b)鑒定所述群中具有至少一個非重組染色體對的第一個DH系;c)鑒定所述群中匹配的第二個DH系,該第二個DH系具有至少一個與第一個DH系的非重組染色體對相同的非重組染色體對和至少一個與第一個DH系的非重組染色體對不同的非重組染色體對;d)選擇第一個DH系和第二個DH系作為一對親本,其子代具有至少三個非重組染色體,其中至少兩個形成一對;e)對雜合起始生物體的DH群重復步驟b)、c)和d)一次或多次,或對從步驟d)中選定的一對親本的子代植物產生的DH群重復步驟a)-d),直至優選地來自選定的DH系的全部染色體都是非重組并且優選地選擇親本染色體的全部可能的組合,以裝配染色體置換系的文庫。2.如權利要求1中所要求的方法,其中起始生物體是植物。3.如權利要求1或2中所要求的方法,其中步驟d)中選定的DH系中的至少一個在遺傳上與至少部分雜合的起始生物體的兩個親本之一相同或其中替代所述遺傳上與親本相同的DH系,將原始親本用作步驟d)中那對親本的一個成員。4.如權利要求1-3中所要求的方法,其中至少部分雜合的起始生物體是植物。5.置換系的文庫,可通過權利要求1-4任一項的方法獲得。6.如權利要求5中所要求的文庫,其中在每個置換系中,一個染色體對源自雜合起始生物體的第一個親本而其他染色體對源自雜合起始生物體的第二個親本。

說明書

發明領域

本發明涉及用于制備染色體置換文庫的方法。

背景

在植物和動物中相似地,減數分裂過程中的染色體重組確保在每個連續世代中出現新的性狀組合。在野生情況下,這種隨機的基因組改組是進化適應環境變化背后的驅動力,并且其是物種成功存活和競爭的基本機制。兩個遺傳上獨特且不同親本的有性生殖后代遺傳了獨特的新的性狀組合,并且自然選擇將最終確定無限數量可能的性狀組合中哪個將在該特定環境中具有最佳適應性。這是大規模水平上的試驗和誤差,并且在有利的氣候條件下,在特定性狀在群體中獲得優勢地位前,可能需要花費很多代。優良的性狀組合將優選地傳遞至下一代,并且它們將增強所述物種在群落生境中的生物學成功。

然而,在栽培物種中,育種背后的主要驅動力是人的偏好和選擇。植物育種者試圖在單個基因組中組合盡可能多的杰出性狀,同時消除盡可能多的不合需要的性狀。在工業規模中,這種遺傳堆積(堆金字塔)應當盡可能有效地進行。理想地,應當只花費最小的努力和有限數量的世代來獲得所需的性狀組合。因為植物種植者通常確保栽培的植物不受田間或溫室中其他植物(“雜草”)的自然競爭(通過除草和/或施用除草劑),并且它們不需要盡可能有效地傳播它們的花粉和種子,人的選擇常常導致與將會在野生情況下成功的非常不同的偏好。

一些性狀在栽培和野生條件中都是重要的,如抗病性、增強的生長速度、耐旱性、耐旱性和耐熱性,以及在寬范圍的氣候條件下產生許多健康種子的能力。然而,與大自然相反,植物育種者常常還選擇對于植物物種自身不是直接有益的而只對種子公司、對種植者以及對最終購買從這些植物采收的產品的消費者有益的性狀。存在許多只具有商業價值的性狀,例如,果實和葉子的新顏色、較高水平的特定化合物、谷粒不從谷物稈上脫落、雄性不育等。

從我們祖先那時開始,植物育種已經走了很長的路,當時他們懷著在下一個生長季開始時在開采的小塊土地上播種的意圖,從野外看上去很有趣的個別植物收集種子。標志物輔助的育種、基因組測序、(定點)誘變方法和不斷進展的關于重要性狀的遺傳基礎的知識呈現為強有力的工具箱,其幫助植物育種者尋求更快速地將杰出性狀堆金字塔似地堆入單個基因組中。然而,存在一個主要的障礙:植物基因組在每個單個減數分裂過程中重新改組,由此引起在前一代已經在一起的性狀的隨機分離(在F2代中)。盡管性狀的減數分裂分離是在野生條件下植物存活的基本優點,但形成了許多游戲難題,并且對于植物育種者可能是個損害。

已經提出了幾種解決方案來解決植物物種利益和育種者利益之間的矛盾。

最直接(但商業上不那么有吸引力)的方式是將源自兩個選定的親本植物雜交的F1植物與親本植物之一重復回交,并且在每一代中再次選擇帶有全部所需性狀或實踐中盡可能多的性狀的個體。選擇可以基于表型特征,和/或借助于各種性狀相關的分子標志物來進行。這種傳統的育種過程非常耗時,因為其通常需要四至六個回交代和大量后代來獲得很大程度上純合的并且代表親本植物并且其中已經基因滲入和固定了來自供體植物的一個或多個所需性狀的世系。盡管一些一年生作物,如生菜,具有相對短的生命周期,其他(二年生)作物,如胡蘿卜,需要兩年來產生種子。因此根據物種,新商業品種的產生很可能要花費約8至約20年。

另一種方法是將一個或多個所需的基因引入植物基因組中。通過將轉基因直接引入杰出的世系基因組中,不需要將杰出世系與另一個天然攜帶目標性狀的世系雜交,并且由此避免了組合的杰出性狀(其通常已經以純合狀態存在)的分離。

這些轉基因通常以顯性方式遺傳。它們可以對應于相同植物物種中或可以與其雜交產生能生育后代的植物物種中天然產生的基因、基因簇或基因間序列。這被稱為同源轉基因。或者,它們可以對應于來自不能與目標植物物種自然雜交的生物體的合成基因或DNA片段,如來自另一科的植物,或來自不同分類單元的生物體,如動物、真菌、病毒或細菌。這被稱為轉基因。將這些DNA序列未改變地引入目標植物物種的基因組中,或以一定方式,例如,通過重組DNA技術,使用或未用誘變將其改變。

轉基因重組DNA技術允許研究者將多個DNA構建體組合至相同植物的基因組中,并且因此將不同性狀呈現為金字塔形。這些構建體可以容易地在育種途徑中追溯,并且通常通過選擇標志物(例如,除草劑或抗生素抗性)大規模地選擇其存在。這種方法通過編碼這些所需性狀的轉基因的組合堆積/金字塔式堆放,最終可以導致帶有大量選定性狀的植物的形成。

然而,這樣的轉基因方法具有許多缺陷。其常常不能預先預測轉基因是否以未曾預料的方式不利地影響植物性能。此外,給定的轉基因的作用和/或功能性常常強烈地依賴于其中插入植物基因組中的準確位置。對于收到商業使用以及動物和/或人食用批準的任何遺傳修飾的先例,需要經歷非常大量的法規程序,其是非常昂貴和耗時的。認可常常只授予給定基因組中的特定轉基因插入事件。多個轉基因的累積使得這種方法甚至成本更高、更漫長和復雜。此外,在全世界食品市場的重要部分中,不允許轉基因食品用于人食用,也不受到公眾歡迎。

用于組合所需性狀的另一種方法是部分或完全遏制減數分裂過程中的交換(重組)機制。通過確保減數分裂過程中不發生正常、野生型水平的雙鏈斷裂和/或染色體配對和/或鏈交換的機制,或它們完全不存在,親本染色體以非重組的完整方式傳遞至孢子中。尤其是當將這種方法結合從已經在不存在重組的情況下產生的孢子產生雙單倍體(DH)世系時,有效地制備親本基因組的新組合變得可能。這種方法稱為反向育種(WO03/017753;Dirks等,2009,Plant Biotech J 7:837-845)。然而,這種方法的缺陷是缺乏染色體配對,導致染色單體在通常從減數分裂形成的四個子細胞中隨機分布。物種帶有越多染色體,孢子是整倍體(含有完整的染色體組)的概率越小。孢子或配子是整倍體時,其含有物種基因組典型的單倍體染色體(n)的完整補體。原則上,只有整倍體孢子可以成功進行受精或再生成有生活力的植物,因此異倍性(存在超過該物種特有的單倍體染色體的完整補體或少于該物種特有的單倍體染色體的完整補體)在這個階段是非常不合需要的。通常通過自然自發地消除異倍性,并且異倍性的出現引起孢子群含有低頻率的正常、有生活力的孢子,這不利地影響了從少量存活的孢子誘導胚胎發生的效率。這種方法的另一個潛在缺點是其依賴于轉基因構建體的作用,其可能在世界的某些區域在當前的法規下給予所得到的產物以“遺傳修飾生物體”狀態,甚至在轉基因自身不再存在于所述產物中時。

另一種避免育種方法過程中性狀分離的方法是從一對平行系形成染色體置換系。如之前所述的(WO2014/001467),染色體置換系理想地是雙單倍體(DH)系,其完全純合的基因組由從其孢子已經形成DH的雜合起始植物的親本遺傳的完整和全部染色體組成,沒有出現重組。

可以通過例如雄核發育或雌核發育實驗方案,或通過使用單倍體誘導劑系統,從雜合起始植物的孢子形成DH。這些單倍體植物的基因組隨后加倍。基因組加倍,其可以自發地發生,或通過添加有絲分裂阻斷化學品,如秋水仙堿、黃草消或氟樂靈,導致加倍的單倍體植物的形成(DH植物,DH),其能夠產生種子。以這種方式,使加倍的單倍體系不朽。

從這種方法得到的DH具有由從雜合起始植物的親本遺傳的完整染色體組成的完全純合的基因組,沒有出現重組。存在各種可能的初始親本染色體的組合,并且不同DH系的數量安全依賴于植物物種的染色體數量。

DH準確地對應于雜合起始植物的兩個親本之一,或它們的基因組由第一個親本的一個或多個染色體結合第二個植物的剩余染色體組組成,以達到物種的完整單倍體染色體數量。這樣的DH是染色體置換系,其中,當與雜合起始植物的初始親本之一比較時,至少一條染色體已經被來自另一個親本的完整和完全的相應染色體置換,沒有出現交換。完整染色體置換文庫包括可以從給定的雜合起始植物獲得的所有染色體置換系,并且因此所有可能的來自雜合植物的兩個親本系的染色體的組合。

可以通過部分或完全遏制減數分裂重組(如在反向育種中),例如,直接從給定的雜合起始植物獲得完整染色體置換文庫,或替換地,尤其是當物種的染色體數量大時,可能需要兩輪或更多連續輪的減數分裂重組的部分或完全遏制(代表兩輪或更多連續輪的反向育種)來獲得所有可能的染色體置換系。

在后一種情況中,通過減數分裂重組的部分或完全遏制獲得的兩個不同染色體置換系可以雜交,以產生其中一些染色體以純合狀態存在,同時其他染色體以雜合狀態存在的雜交植物。在這個新的雜交植物中應用減數分裂重組的部分或完全遏制導致其他染色體置換系的形成。這種在多個步驟中使用減數分裂重組遏制的方式降低了雜合染色體的數量并且因此非常顯著地提高了獲得所需的獨特核型(特定的親本染色體組合)和獲得完整染色體置換文庫的概率。

使用屬于具有10個染色體對的物種(如,例如,玉米)的雜合起始植物,使用理論實例最佳地說明了這個概念。使用減數分裂重組的部分或完全遏制,從這個起始F1雜合體產生加倍單倍體時,通常根據二項分布,發生染色體至DH的轉移,獲得含有來自雜合起始植物的第一個初始親本的5個非重組親本染色體和來自雜合起始植物的第二個初始親本的5個非重組親本染色體的DH系的整體概率比獲得含有就來自一個初始親本的10個非重組染色體的DH的概率高252倍。對于具有10個染色體對的物種,這是通過如下事實引起的:對于獲得10個非重組染色體只存在兩種概率(來自任一親本的一種選擇),但獲得含有來自第一個初始親本的5個非重組親本染色體和來自第二個初始親本的5個非重組親本染色體的DH系存在252種不同的概率(排列)(例如,來自第一個親本的染色體I、II、III、IV和V,結合來自第二個親本的染色VI、VII、VIII、IX和X是獲得包括來自F1雜交體的每個初始親本的5個染色體的整單倍體基因組的一種概率;第二種概率是來自第一個親本的染色體I、III、IV、V和VI與來自第二個親本的染色體II、VII、VIII、IX和X的組合;并且以這種方式,對于包括來自F1雜合體的每個初始親本的5個染色體的整倍體加倍單倍體基因組,252種不同的組合是可能的)。

如果在第一輪反向育種后沒有獲得完整染色體置換文庫,已經獲得的染色體置換系的特定成對組合可以用作第二輪或隨后輪反向育種中的起始材料來獲得剩余的染色體置換系。當將特定的、選定的加倍單倍體染色體置換系對雜交時,這將獲得對于一些染色體純合的和對其他染色體雜合的子代植物。例如,帶有來自第一個親本的染色體I、II、III、IV、V和VI和來自第二個親本的染色體VII、VIII、IX和X的第一個DH植物可以與帶有來自第一個親本的染色體I、II、III、IV、V、IX和X和來自第二個親本的染色體VI、VII和VIII的第二個DH植物雜交。從這個雜交獲得的子代對于染色體I、II、III、IV、V、VII和VIII是純合的,對于染色體VI、IX和X是雜合的。因此,這種方法降低了基因組的復雜性,因為替代10個雜合染色體,(這個實施例中)得到的子代只具有3個雜合染色體和7個純合染色體。當對這個子代植物進行反向育種時,其行為將如同只具有3個染色體對的植物,因為其他7個染色體已經固定在純合狀態。在實施例4中進一步解釋了這種原理。

當形成這些靶向DH組合中的幾個時,這種方法將很大程度上提高鑒定從這個第二輪反向育種得到的DH群體中所有可能的親本染色體組合的概率。因此使用兩輪或更多連續輪的反向育種方便地允許針對具有大的染色體數量的物種構建完整染色體置換文庫,而不需要大量篩選大的DH群體。

在形成本發明的研究中,令人驚訝地發現了不需要轉基因也可以進行上述用于形成染色體置換文庫的方法,即,不需要主動的減數分裂重組的部分或完全遏制。本發明是基于令人驚訝的發現:在給定的非純合植物產生的孢子群體中的孢子子集中,一個或多個染色體保持非重組,即使沒有用減數分裂重組機理的外部干擾。發明人考慮了可以通過分子技術(如分子標志物或DNA-測序技術)來鑒定這樣的非重組染色體。本發明的主要優勢是不存在異倍體(引起嚴重降低的雄性和/或雌性不育),不用必須形成其中遏制減數分裂交換的轉基因植物(和鑒定對于單個轉基因拷貝半合的植物)獲得的時間和用所述方法可獲得的產物的非-GMO(非轉基因)狀態。

不存在異倍體表示通過所述植物產生的孢子是平衡的,即,它們含有該物種特異性的單倍體染色體的完整補體。這解決了反向育種中最重要的問題,即異倍體的出現、不平衡的孢子,其通過體外胚胎發生通常不能產生有生活力的植物并且其也不能使胚珠有效地授粉來產生有生活力的胚芽。異倍性的消除是減數分裂重組沒有被遏制的直接結果,使得減數分裂的所有步驟可以不受干擾地進行,并且雄性減數分裂因此導致平衡孢子的四分體的形成。這種優勢確保了本發明可以應用于任何植物物種,與染色體的數量無關。

本發明因此涉及一種用于產生染色體置換文庫的方法,包括:

a)從至少部分雜合的起始生物體產生DH系的群;

b)鑒定所述群中具有至少一個非重組染色體對的第一個DH系;

c)鑒定所述群中匹配的第二個DH系,該第二個DH系具有至少一個與第一個DH系的非重組染色體對相同的非重組染色體對和至少一個與第一個DH系的非重組染色體對不同的非重組染色體對;

d)選擇第一個DH系和第二個DH系作為一對親本,其子代具有至少三個非重組染色體,其中至少兩個形成一對;

e)對雜合起始生物體的DH群重復步驟b)、c)和d)一次或多次,或對從步驟d)中選定的一對親本的子代植物產生的DH群重復步驟a)-d),直至優選地來自選定的DH系的全部染色體都是非重組并且優選地選擇親本染色體的全部可能的組合,以裝配染色體置換系的文庫。

本發明尤其適用于植物。本發明因此還涉及一種用于產生染色體置換文庫的方法,包括:

a)從至少部分雜合的起始植物產生DH系的群;

b)鑒定所述群中具有至少一個非重組染色體對的第一個DH系;

c)鑒定所述群中匹配的第二個DH系,該第二個DH系具有至少一個與第一個DH系的非重組染色體對相同的非重組染色體對和至少一個與第一個DH系的非重組染色體對不同的非重組染色體對;

d)選擇第一個DH系和第二個DH系作為一對親本,其子代具有至少三個非重組染色體,其中至少兩個形成一對;

e)對雜合起始植物的DH群重復步驟b)、c)和d)一次或多次,或對從步驟d)中選定的一對親本的子代植物產生的DH群重復步驟a)-d),直至優選地來自選定的DH系的全部染色體都是非重組并且優選地選擇親本染色體的全部可能的組合,以裝配染色體置換系的文庫。

在優選實施方案中,從偶然只含有完整和未改變的來自初始親本的染色體的F1雜合體產生至少一個DH系。優選的染色體組成是來自兩個親本的染色體的組合,使得雜合體的所述親本已經可利用時,沒有重新形成親本系。二項分布允許以其出現概率預測基因型(染色體組成)。在這個實施方案中,沒有一個染色體經歷重組,但應用/有用性不限于具有完整組的非重組染色體的系。此外,含有全部除了一個,全部除了2個,全部除了3個源自初始親本的附加非重組染色體的DH系可以用于與初始親本系組合或彼此組合,或與具有完整組的非重組染色體的DH系雜交。DH系產生的第二個循環的最佳組合和完整染色體置換文庫的合適的新的DH系的鑒定可以通過專門的軟件來計算(一種可以稱為“組合優化”的方法)。

令人驚訝地,如實施例4中針對含有10個染色體對的基因組說明的,鑒定具有10個初始親本染色體之間重組中的一個染色體的DH系的概率比鑒定沒有任何重組染色體的一個DH系的概率高10倍。分別對于5和7個染色體對發現了相同的數量級(大約高5倍和7倍的概率)。具有另外非重組染色體的DH系中一個重組染色體的出現沒有危害使用完整組的完全非重組染色體形成染色體置換文庫的概念。

在另一個優選實施方案中,步驟d)中選擇的DH系中的至少一個在遺傳上與至少部分雜合的起始生物體(也稱為“起始雜合體”)的兩個親本之一相同,或替代所述遺傳上與親本相同的DH系,將初始親本用作步驟d)中那對親本的一個成員。在這個實施方案中,加速了形成任選完整染色體置換文庫的程序,因為按照限定的起始雜合體的親本的基因組具有一套完整的非重組親本染色體。當起始雜合體的親本之一與具有至少一個源自相同親本的非重組染色體的DH系雜交時,所得到的F1后代對所述至少一個親本染色體將是純合的,且對于來自該親本的全部其他親本(非重組)染色體是雜合的。

起始雜合體的親本可以選自所述方法(如,例如,實施例2中所述的)的步驟a)中獲得的DH系,但也可以是通過自交獲得的起始雜合體的初始親本的有性后代。當起始雜合體的兩個親本中的至少一個是實驗者已知和可利用時,并且當所述親本基本上純合時,后一種方法是可能的。

在所要求的方法中,可以通過首先通過雄核發育(如,微孢子培養或花藥培養)、通過雌核發育或通過誘導從受精事件獲得的合子失去母系或父系染色體形成孢子的單倍體植物,并隨后將由此獲得的單倍體植物的染色體加倍,從而從雜合起始生物體的孢子產生DH。本領域技術人員非常熟悉這些DH產生的非轉基因方法,并且知道在其中意的植物物種中哪種方法工作最佳。基因組加倍可以自發產生,或可以通過施用化學品,如秋水仙堿、黃草消或氟樂靈來誘導。這些化學品破壞有絲分裂過程中的紡錘體形成,并且通常用于阻斷有絲分裂。

可以在雜交通過使用單倍體誘導系作為雌性來誘導從受精事件獲得的合子失去母系染色體。已經在各種植物物種中描述了單倍體誘導系統。在一個實施方案中,雌性是不同物種的植物。在物種間雜交中,常常觀察到失去親本之一的染色體,如在小麥和珍珠粟之間、大麥和球莖大麥(Hordeum bulbosum)之間以及煙草(Nicotiana tabacum)和煙草(Nicotiana africana)之間的雜交中。

雌性植物葉可以是包括雜合轉基因表達盒的轉基因植物,所述表達盒包括可操作地連接編碼重組改變的CENH3、CENPC、MIS12、NDC80或NUF2多肽的多核苷酸的啟動子,并且具有相應的滅活的內源性CENH3、CENPC、MIS12、NDC80或NUF2基因。這種通過基因組消除獲得單倍體的方法首次描述于擬南芥(Arabidopsis thaliana)(Maruthachalam Ravi&Simon W.L.Chan;Haploid plants produced by centromere-mediated genome elimination(通過著絲粒介導的基因組消除產生的單倍體植物);Nature 464(2010),615-619;US-2011/0083202;WO2011/044132),并且可廣泛地應用于植物中。

可以以本領域技術人員已知的任何方式來選擇具有至少一個非重組染色體的匹配DH系。例如,他們可以基于表型特征和/或基于基因組測試,如通過DNA-標志物分析、單核苷酸多態性(SNP)檢測、DNA-測序等,來選擇。

作為從其中沒有外部干擾已經進行了減數分裂重組的群選擇具有非重組親本染色體的DH的替換方案,還可以將每個染色體交換事件的平均數量限制在大約每二價大約一個交換。這可以大約在減數分裂時通過用例如嘌呤霉素處理孢子來進行,并且這種方法很大程度上降低了減數分裂過程可能的結果的復雜性,并且因此降低了DH群中的遺傳復雜性。嘌呤霉素是一種引起孢子中減數分裂停止的蛋白合成抑制劑。其抑制作用可以逆轉。

重組頻率并且因此圖譜大小和基因座之間的距離依賴于植物生長的溫度。這意味著在最佳生長溫度下的具有遺傳圖譜長度超過100cM(這對應于四價階段中超過一個交換)染色體的物種中的遺傳圖譜大小可以通過將其置于較低溫度方案中來改變。這意味著大于100cM的染色體的圖譜大小可以顯著降低。在優選的實施方案中,這種降低至約100cM(=在四價階段中一個交換事件)。(還參見Francis K,Lam S,Harrison B,Bey A,Berchwitz,L和Copenhaver G(2007)Pollen tetrad-based visual assay for meiotic recombination in Arabidopsis(用于擬南芥中減數分裂重組的基于四分花粉的視覺測定法),PNAS Vol 104,no 10,3913-3918)。

本發明涉及從源自起始雜合體的DH群產生染色體置換文庫的方法,包括:

a)將DH系彼此雜交和/或與起始在合體的親本雜交,獲得用于DH產生的第二個循環的第二代供體群;

b)從選定DH的F1后代的孢子產生DH群;

c)將DH系彼此雜交和/或與起始雜合體的親本雜交,獲得用于DH產生的第三個循環的第三代供體群;

d)重復步驟b)和c)一次或多次,直至形成合適的完全染色體置換文庫。

本發明進一步涉及用于從DH群產生染色體置換系的方法。

在所述方法中,術語“相同的染色體”是指源自雜合體生物體的相同親本并且具有該物種相同的染色體編號(=染色體I、II、...)的染色體。在所述方法中,術語“不同/不相似的染色體”是指源自雜合體生物體的相同親本并且具有該物種不同的染色體編號的染色體。

在所述方法中,第一個和第二個DH系的子代具有至少三個非重組染色體,其中至少兩個形成一對。這意味著所述子代具有遺傳的來自起始雜合體的親本之一的至少一個染色體的兩個拷貝,所述拷貝形成一對染色體,和來自起始雜合體的相同親本的另一個染色體的至少一個拷貝,并且對于來自該親本的全部其他親本(非重組)染色體是雜合的。合適地,所述子代遺傳了一個染色體、兩個染色體、三個染色體等等,直至(n-1)個染色體的兩個拷貝,n為該物種中單倍體染色體的數量。有效地,這降低了子代基因組的復雜性,因為其一個或多個染色體以完全純合的狀態存在。從此類植物的孢子產生DH系時,減數分裂重組將不會導致所述一個或多個染色體的遺傳組成的可檢測變化。當有效地選擇DH系時(例如,通過組合優化),這種方法使得可以快速地獲得針對任何給定的起始雜合體的完整染色體置換文庫。DH系的群越大,完成這個程序越容易且越快。

本發明進一步涉及一種用于產生染色體置換文庫的方法,包括:

a)從至少部分雜合的起始生物體產生DH系的群;

b)鑒定具有至少一個非重組染色體對的群中的第一個DH系;

c)鑒定具有至少一個與第一個DH系的非重組染色體對相同的非重組染色體對和至少一個與第一個DH系的非重組染色體對不同的非重組染色體對的群中匹配的第二個DH系;

d)選擇第一個DH系和第二個DH系作為一對親本,其子代具有至少三個非重組染色體,其中至少兩個形成一對;

e)對雜合起始生物體的DH群重復步驟b)、c)和d)一次或多次,或對從步驟d)中選定的一對親本的子代植物產生的DH群重復步驟a)-d),直至優選地來自選定的DH系的全部染色體都是非重組并且優選地選擇親本染色體的全部可能的組合,以裝配染色體置換系的文庫,其中至少部分雜合起始生物體是植物。

在優選的實施方案中,措辭形成步驟d)中一對的“至少兩個非重組染色體”對應于植物的全部染色體(=n)。在遞減的擇優中,該措辭還對應于(n-1)、(n-2)或(n-3)等。在其中“至少兩個”對應于n的情況中,鑒定的DH系的子代將包括n個完整的、非重組染色體,并且沒有重組染色體。在其中“至少兩個”對應于(n-1)的情況中,鑒定的DH系的子代將包括(n-1)個完整的、非重組染色體,和一個重組染色體。在擬南芥的情況中,n等于5,并且(n-1)因此等于4。

本發明還涉及通過上述方法可獲得的置換系文庫。因為用于獲得所述置換系文庫的方法不含有任何轉基因步驟,文庫自身也是非轉基因的。這是與之前從擬南芥Col-0x Ler雜合體起始植物產生的轉基因置換系文庫(Wijnker等2012,Nature Genet.44:467-471)的重要差異。本發明進一步涉及通過上述方法可獲得的置換系的非轉基因文庫,其中在每個置換系中,一個染色體對源自雜合起始生物體的第一個親本和其他染色體對源自雜合起始生物體的第二個親本。

本發明進一步涉及在其基因組包括至少一個來自任一親本或來自兩個親本的非重組染色體的非轉基因系。還涉及各自在其基因組中包括至少一個來自任一親本或來自兩個親本的非重組染色體的系(部分或完整)的文庫。

本發明可以應用于對其可以形成DH的全部植物品種。

對其可以實施本發明的作物物種包括但不限于煙草、白楊、玉米、小麥、大麥、水稻、高粱、甘蔗、油菜、黑麥草、向日葵、大豆、西紅柿、黃瓜、西印度黃瓜、野苣、芝麻菜、菠菜、胡椒、矮牽牛、馬鈴薯、茄子、甜瓜、西瓜、胡蘿卜、蘿卜、生菜、蔬菜蕓苔(Brassica)物種(卷心菜、花菜、西蘭花、大頭菜、球芽甘藍)、韭蔥、大豆、豌豆、苦苣、菊苣、洋蔥、草莓、茴香、食用甜菜、芹菜、塊根芹、蘆筍、向日葵、葡萄藤、木薯、櫻桃、蘋果、梨、桃、香蕉、郁金香、矮牽牛、玫瑰和菊花(chrysanthemum)。

染色體置換系(也稱為“置換系”)是在其基因組中帶有至少一個來自另一個系或植物的染色體的系。來自第一個系或植物的一個或多個初始染色體的一個或兩個拷貝已經被來自另一個系或植物的一個或多個染色體的一個或多個相應拷貝替代(置換)。剩余的染色體與最初存在于第一個系或植物中的那些相同。

在本發明的情況下,置換系文庫(也稱為“染色體置換系文庫”或“染色體置換文庫”)用來表示包括各自帶有來自兩個不同親本源的完整染色體的不同組合的單獨染色體置換系的一群染色體置換系。

完整染色體置換文庫包括來自兩個不同親本源的親本染色體的全部可能的組合。例如,在具有5個染色體對的單倍體物種擬南芥中,染色體置換系的完整文庫包括2x=25=32個成員(系)。起始F1植物中含有的全部遺傳變化存在于這個小的32株植物的文庫中。完整置換文庫允許以空前的方式來檢測上位相互作用。具有全部染色體區代表的NIL文庫將需要接近無限數量的交叉和回交以甚至極小地接近這種情況。

重要的是注意到染色體置換文庫(并且因此還有形成其的方法)將使植物育種革命化:在傳統育種方案中,從分離群(如F2)中,或在特殊情況中,從RIL、BIL、NIL、MAGIC、HIF和用于作圖目的或用于基因滲入特定所需性狀的特定基因的其他群中,選擇植物。在所有這些情況中,這些群可能的基因型的數量是絕對無限的,并且因為這超過了育種者或遺傳學家的能力,因此迫使其以簡化設定來操作。因此其可以只使用可能的基因型的整個集合的微小子集來工作,這是非常常見的沒有代表性的或不足以獲得其育種活動的最佳可能結果。與傳統方法不同,染色體置換文庫含有全部可能的等位基因組合,因為它們存在于初始親本系的不同染色體中,并且因此遺傳學家現在可以非簡化地操作。

對于本發明可以設想許多不同的應用。一種應用是將性狀快速且有效地作圖于特定染色體。當通過表型比較染色體置換系內的不同系時,通過比較具有目標表型的和不具有目標表型的每個系中存在的染色體,鑒定目標表型性狀為基礎的基因和/或定量性狀基因座(QTL)位于哪個染色體就變得非常可行。使用相似的方法,另一種應用是上位相互作用的研究。再另一種應用是單染色體育種(每個染色體育種),其中育種者可以例如決定起始雜合體的每個染色體的哪個親本形式包括在新的雜合體中。以這種方式,通過例如染色體的一個親本拷貝被來自其他親本的染色體的相應拷貝替代,如果第二個拷貝優于第一個拷貝,也可以在遺傳上改善起始雜合體。這種方法導致例如對于全部除了一個染色體雜合,剩余染色體純合的并且只源自起始雜合體的兩個親本之一的雜合體的形成。

本申請還可以用于形成亞雜合體文庫。本發明還可以用于繪制雜種優勢圖譜、用于繪制組合能力圖譜等。

本發明還可以應用于系設計(WO2014/001467中描述的發明)的情況中,以形成所謂的非轉基因的三雜合體(tribrid)或多雜合體(multibrid)(多雜合體(polybrid))。

本發明還可以應用于從不同背景快速地產生多個染色體置換文庫,并且由于轉基因步驟的省略,其變得可以避免冗長的轉化途徑,單個轉基因事件的鑒定,具有足夠敲低的靶基因的轉化體的表征和全部其他與轉基因方法相關的復雜性。

盡管已經詳細描述了本發明及其優勢,但應當理解在本文中可以進行各種變化、替代和改變而不脫離所附權利要求中所限定的本發明的精神和范圍。

附圖

圖1:通過單倍體誘導系統從Col-0x Ler雜合體獲得的101系的DH群中的非重組親本染色體數量的概覽。

圖2:通過應用如實施例1中解釋的本發明的方法,用于有效地獲得擬南芥的特異性染色體置換系的雜交方案的實例。每個框表示其中顯示植物id、名稱和基因型的植物系。當植物是來自雜交的產物時,植物名稱由其親本名稱來替代。

圖3:通過雄核發育從黃瓜雜合體獲得的301系的黃瓜DH群中非重組親本染色體數量的概覽。

圖4:在本發明的方法中使用具有一個重組染色體和六個非重組染色體(對于具有由7個染色體對組成的基因組的物種)的系的實例。將所述系與起始雜合體的兩個初始親本系組合,并且在隨后的DH產生循環中,可以消除重組染色體。

圖5.1:在黃瓜中,沒有使用起始雜合體的親本,用于獲得特異性染色體置換系(圖4.2中顯示的)的交叉方案的實例。每個框表示其中顯示了植物id、名稱和基因型的植物系。當植物是來自交叉的產物時,植物名稱由其親本名稱來替代。

圖5.2:應用本發明方法的實例。在黃瓜中通過使用起始雜合體的親本有效地獲得特異性染色體置換的示例交叉方案。每個框表示其中顯示了植物id、名稱和基因型的植物系。當植物是來自交叉的產物時,植物名稱由其親本名稱來替代。

圖6:分別由175和148個系組成的大麥DH群OWB和SM中非重組親本染色體數量的概覽。

圖7:如實施例3中解釋的,通過應用本發明的方法,用于有效地獲得大麥特異性染色體置換系的交叉方案的實例。每個框表示其中顯示了植物id、名稱和基因型的植物系。當植物是來自交叉的產物時,植物名稱由其親本名稱來替代。

圖8:分別由117和108個系組成的玉米DH群CFF13和CFD07中非重組親本染色體數量的概覽。

實施例

實施例1

擬南芥中染色體置換文庫的構建

將擬南芥種質Colombia(Col-0)和Landsberg erecta(Ler)彼此雜交,并將得到的F1雜合體群用于加倍單倍體系(DH)的產生。這通過將Ravi&Chan所述的單倍體誘導系(Nature 464(2010),615-619;US-2011/0083202;WO2011/044132)用來自Col x Ler F1植物的花粉進行授粉來實現,并隨后收集子代種子,其是單倍體,并且遺傳上與產生其的花粉粒相同。隨后通過單倍體植物中的自發基因組加倍來獲得DH。以這種方式總共獲得了101個DH,并且用均與覆蓋全部5個染色體的分子標志物來分析這些植物,以確定那些標志物覆蓋的每個染色體區域的來源。令人驚訝地發現了只有23個DH在全部5個染色體中具有重組事件,并且其他78個DH具有至少一個非重組染色體。這樣的非重組染色體因此整體上源自起始雜合體(ColxLer F1)親本之一,即,Col-0或Ler。

圖1說明了這個分析的結果:28個DH具有一個非重組染色體,31個DH具有兩個非重組染色體,14個DH具有三個非重組染色體,4個DH具有四個非重組染色體和一個DH具有五個非重組染色體。

使用這些DH,變得可以形成特定的染色體置換系,包括例如四個Col-0染色體和一個Ler染色體。這種方法的一個實例顯示于圖2中。針對具有四個非重組親本染色體,選擇一個系(源自Col-0xLer雜合體的DH編號6):染色體I、II和IV整個源自Col-0種質(圖2中顯示為“A”),和染色體III來自Ler種質(圖2中顯示為“B”),而染色體V已經經歷了重組并且因此包括Col-0和Ler兩者的片段(圖2中顯示為“-”)。由于系的加倍單倍體性質,每個染色體的兩個拷貝彼此相同,因為植物是完全純合的。將這個DH系與初始Col-0種質(即,起始雜合體的親本之一)雜交,并且得到的F1代包括染色體I、II和IV完全純合(即,整個源自Col-0)和染色體III雜合(即,帶有一個來自Col-0的染色體的完整拷貝和一個來自Ler的染色體的完整拷貝)的植物。對于染色體V,這個雜交的后代包括一個來自Col-0的染色體的完整拷貝和一個染色體的重組拷貝,包括Col-0和Ler兩者的片段。

在下一個步驟中,將這個F1自交,并且在得到的F2子代植物中,可以基于分子標志物譜,容易地鑒定出染色體置換系。這個系包括四個來自Col-0的非重組親本染色體(染色體I、II、IV和V)和一個來自Ler的非重組親本染色體。可以通過將特定的DH對彼此組合和/或與起始雜合體的親本組合,以相似的方式來制得其他染色體置換系,使得最終可以獲得包括32個不同系的完整染色體置換文庫。

在這個實施例中,從初始種質(Col-0和Ler)開始,這種染色體置換系的形成因此總地只采用了三次雜交和一個DH步驟。這個程序的準確持續時間因此很大程度上取決于植物物種的傳代時間(完成生命周期,從種子到種子,需要的時間)以及快速和有效的DH實驗方案的可利用性。

表1顯示了對于具有5個染色體的植物物種,如擬南芥,在假定50%染色單體重組的情況下(即,平均每個染色體產生一個交換事件,即,非姐妹染色單體之間第一個減數分裂的profase I中四價階段中的一個交換),鑒定具有0、1、2、3、4或5個非重組親本染色體的一個DH系(具有95%確定性)需要的DH群大小。從這個表得出鑒定具有2個或3個非重組親本染色體的DH系的機會比鑒定不具有或具有5個非重組親本染色體的DH系的機會高得多。為了鑒定一個具有5個非重組染色體的DH系,需要約95個DH的群。在我們的實驗中,使用101株植物的群大小,可以鑒定一個具有5個非重組染色體的DH系。這與估算的50%交換頻率是完全一致的。

表1

實施例2

黃瓜中染色體置換文庫的構建

將黃瓜(Cucumis sativus)的原種雜合體的胚珠用作加倍單倍體(DH)系產生的起始材料。雜合體通過兩個完全純合的近交黃瓜系的雜交產生。基本上使用歐洲專利no.EP-0374755中所述的雌核發育實驗方案,進行DH生產,并且在這個實驗中總共獲得了301個單獨的DH系。起始雜合體的親本系也是可利用的,并且基于兩個親本系的全基因組序列,在兩個親本基因組之間鑒定出大量多態性。對于DH系的分子分析,選擇了總共108個多態性,并且針對其研發了KASP測試(分別使用14、18、14、10、23、16和13標志物測試,測定了染色體I、II、III、IV、V、VI和VII的基因型)。黃瓜基因組具有7個單倍體染色體數。

隨后,使用上述分子標志物,測定了301個DH系的基因型,并且這個分析揭示了7個染色體的每個中存在和不存在重組事件。令人驚訝地,相當大數量的DH系具有多個非重組染色體。在三個DH系中,全部7個染色體保持非重組的:

-ATB101從起始雜合體的父系遺傳了3個完整的、非重組染色體(染色體I、II和VII)以及從起始雜合體的母系遺傳了4個完整的、非重組染色體(染色體III、IV、V和VI);

-AUW055從起始雜合體的父系遺傳了2個完整的、非重組染色體(染色體I和III)以及從起始雜合體的母系遺傳了5個完整的、非重組染色體(染色體II、IV、V、VI和VII);

-AVZ067從起始雜合體的父系遺傳了4個完整的染色體(染色體I、II、III和VI)以及從起始雜合體的母系遺傳了3個完整的染色體(染色體IV、V和VII)

在五個其他DH系中,僅在7個染色體中的一個中檢測到了一個或多個重組事件,而其他6個染色體保持非重組的。另外22個DH系各自具有五個非重組染色體和兩個重組染色體。這個觀察揭示了減數分裂重組不總是發生,即使是重組過程沒有受到干擾時,并且可以鑒定其中實質性數量的染色體(在一些情況中:全部)保持非重組的自發事件。整個數據組示于圖3中。

在下一個步驟中,將特定的DH系用于有效地產生針對起始雜合體的完整染色體置換文庫。對于具有7個染色體的物種,如黃瓜,這樣的文庫由27=128個不同的DH系組成,其各自包括起始雜合體的兩個親本的7個染色體的不同組合。使用301個DH系的群作為起點,進行許多雜交來最大化這種方法的效率。以下針對具有7個非重組染色體的一個DH系(AUW 055)給出了實例,但當然,還可以通過包括具有7個非重組染色體的其他兩個DH系以及還有具有少于7個非重組染色體的DH系,來進一步優化所述策略。

a)將DH系AUW055與起始雜合體的母系雜交。在兩個雜交伴侶中,染色體II、IV、V、VI和VII是相同的(源自起始雜合體的母本),并且因此這個雜交得到的F1子代對于那5個染色體是純合的,并且對于染色體I和III是雜合的(即,攜帶了來自起始雜合體父本的拷貝和來自起始雜合體母本的拷貝)。這個雜交的F1子代植物的自花授粉得到了F2群,其中染色體I和III分離,并且在其中,可以鑒定染色體置換文庫的以下四個成員,“m”表示源自起始雜合體的母本的染色體(母系的),和“p”表示源自起始雜合體的父本的染色體(父系的):

·I(p)/II(m)/III(p)/IV(m)/V(m)/VI(m)/VII(m)(該系與DH系AUW055相同)

·I(m)/II(m)/III(p)/IV(m)/V(m)/VI(m)/VII(m)

·I(p)/II(m)/III(m)/IV(m)/V(m)/VI(m)/VII(m)

·I(m)/II(m)/III(m)/IV(m)/V(m)/VI(m)/VII(m)(該系與起始雜合體的母系相同)

b)還將DH系AUW055與起始雜合體的父系雜交。在兩個雜交伴侶中,染色體I和III是相同的(源自起始雜合體的父本),并且因此這個雜交得到的F1子代對于那兩個染色體是純合的,并且對于染色體II、IV、V、VI和VII是雜合的(即,攜帶來自起始雜合體的副本的拷貝和來自起始雜合體的母本的拷貝)。這個雜交的F1子代植物的自花授粉得到了F2群,其中染色體II、IV、V、VI和VII分離,并且在其中,可以鑒定染色體置換文庫的以下32個成員,“m”表示源自起始雜合體的母本的染色體(母系的),和“p”表示源自起始雜合體的父本的染色體(父系的):

·I(p)/II(p)/III(p)/IV(p)/V(p)/VI(p)/VII(p)(這個系與起始雜合體的父系相同)

·I(p)/II(p)/III(p)/IV(p)/V(p)/VI(p)/VII(m)

·I(p)/II(p)/III(p)/IV(p)/V(p)/VI(m)/VII(p)

·I(p)/II(p)/III(p)/IV(p)/V(p)/VI(m)/VII(m)

·I(p)/II(p)/III(p)/IV(p)/V(m)/VI(p)/VII(p)

·I(p)/II(p)/III(p)/IV(p)/V(m)/VI(p)/VII(m)

·I(p)/II(p)/III(p)/IV(p)/V(m)/VI(m)/VII(p)

·I(p)/II(p)/III(p)/IV(p)/V(m)/VI(m)/VII(m)

·I(p)/II(p)/III(p)/IV(m)/V(p)/VI(p)/VII(p)

·I(p)/II(p)/III(p)/IV(m)/V(p)/VI(p)/VII(m)

·I(p)/II(p)/III(p)/IV(m)/V(p)/VI(m)/VII(p)

·I(p)/II(p)/III(p)/IV(m)/V(p)/VI(m)/VII(m)

·I(p)/II(p)/III(p)/IV(m)/V(m)/VI(p)/VII(p)

·I(p)/II(p)/III(p)/IV(m)/V(m)/VI(p)/VII(m)(這個系與DH系AVZ067相同)

·I(p)/II(p)/III(p)/IV(m)/V(m)/VI(m)/VII(p)

·I(p)/II(p)/III(p)/IV(m)/V(m)/VI(m)/VII(m)

·I(p)/II(m)/III(p)/IV(p)/V(p)/VI(p)/VII(p)

·I(p)/II(m)/III(p)/IV(p)/V(p)/VI(p)/VII(m)

·I(p)/II(m)/III(p)/IV(p)/V(p)/VI(m)/VII(p)

·I(p)/II(m)/III(p)/IV(p)/V(p)/VI(m)/VII(m)

·I(p)/II(m)/III(p)/IV(p)/V(m)/VI(p)/VII(p)

·I(p)/II(m)/III(p)/IV(p)/V(m)/VI(p)/VII(m)

·I(p)/II(m)/III(p)/IV(p)/V(m)/VI(m)/VII(p)

·I(p)/II(m)/III(p)/IV(p)/V(m)/VI(m)/VII(m)

·I(p)/II(m)/III(p)/IV(m)/V(p)/VI(p)/VII(p)

·I(p)/II(m)/III(p)/IV(m)/V(p)/VI(p)/VII(m)

·I(p)/II(m)/III(p)/IV(m)/V(p)/VI(m)/VII(p)

·I(p)/II(m)/III(p)/IV(m)/V(p)/VI(m)/VII(m)

·I(p)/II(m)/III(p)/IV(m)/V(m)/VI(p)/VII(p)

·I(p)/II(m)/III(p)/IV(m)/V(m)/VI(p)/VII(m)

·I(p)/II(m)/III(p)/IV(m)/V(m)/VI(m)/VII(p)

·I(p)/II(m)/III(p)/IV(m)/V(m)/VI(m)/VII(m)(這個系與DH系AUW055相同)

c)步驟b)的實例需要相當大的群大小來鑒定所有提及的染色體置換系,因為五個染色體在這個雜交的子代中是分離的。在可替換的方法中,可以通過將DH系AUW055和AVZ067彼此雜交來進行更多的組合優化,并且將其F1子代自交,以形成染色體II和VI的全部置換系組合,其他五個染色體源自親本系。平行地,還將DH系AVZ067與起始雜合體的父系雜交,并且還將來自這個雜交的F1子代自交。在F2中,獲得了染色體IV、V和VII的全部置換系,其他四個染色體源自親本系。因此這兩個雜交能夠鑒定相同染色體置換系,如以上這個實施例的步驟b)中詳述的,但使用較小的群大小。

d)如所述的,進行了步驟a)和b)或c)后,因此已經獲得了染色體置換文庫的總共36個不同的成員(包括DH系AUW055、ATB101和AVZ067,以及起始雜合體的兩個親本)。通過將來自這36個系的子群的特定系雜交,通過可利用的親本系、DH和染色體置換系的有效組合,可以獲得文庫的全部剩余成員。以這種方式,針對起始雜合體黃瓜植物,可以構建完整染色體置換文庫,由128個不同的系組成。

在圖4中,圖示了在本發明的方法中使用具有一個重組染色體和六個非重組染色體的系(對于具有由7個染色體對組成的基因組的物種)。將所述系與起始雜合體的兩個初始親本系組合,并且在隨后的DH生產循環中,可以消除重組染色體。

如果起始雜合體的親本系不可獲得,仍然可能形成染色質置換系和文庫,盡管與以上實施例相比,整個程序隨后需要幾個其他代。這說明于圖5.1和5.2中。圖5.1說明了從這個實驗中獲得的301個黃瓜DH系開始,將需要至少4代來形成具有一個來自起始雜合體母系的完整非重組染色體I和6個來自起始雜合體父系的完整非重組染色體(II、III、IV、V、VI和VII)的染色體置換系。確切地,通過鑒定最佳DH系和通過連同起始雜合體的父系使用那些,可以在3代內形成相同的染色體置換系(如圖5.2中所示)。

表2說明了預期在約382個DH系中鑒定至少一個具有7個非重組染色體的DH系,使用50%的平均交換頻率。在本文針對黃瓜描述的實際實施例中,在301個植物的群中,可以鑒定不少于三個這樣的系。這可以表示對于這個實驗中實際的重組率,50%不是準確的估算,并且這個實驗中的實際重組率低于50%。

表2

根據沒有重組而遺傳染色體的概率,這將獲得具有(在黃瓜的情況中)7、6、5、4、3、2、1或0個非重組染色體的特定部分。每個部分的概率可以如下計算:

N=染色體的總數,M是非重組染色體的總數和P是預期的非重組染色體的遺傳概率(在此假定概率對于全部染色體是相等的)。對于黃瓜(N-7),表2顯示了對于P=0.5具有M個非重組染色體的預期植物部分。

為了計算獲得具有特定非重組染色體組合(例如,在總共7個非重組染色體中4個母系和3個父系染色體的組合)的植物的概率,可以使用以下公式:

(如以上公式中的)M是非重組染色體的總數和X是針對一個親本的非重組染色體的數量。

通過添加校正系數2M,這些公式可以組合來計算預期的特定非重組染色體組合部分

這些公式假定每個染色體具有相等的概率來沒有重組地遺傳。然而,染色體可能具有不相等的概率來沒有重組地遺傳。在這種情況中,預期的概率將是非重組和重組遺傳概率的全部可能的乘積組合的總和。例如,對于黃瓜,存在六個非重組和一個重組染色體的七種可能的組合,如下(0表示重組染色體):

在每個位置填入非重組染色體Pi的遺傳的染色體特異性概率,在那存在1和(1-Pi),在公式3中存在0,然后將所有行的概率相乘,并合計不同乘積,將產生獲得具有六個非重組染色體的DH植物的整體概率。

實施例3

大麥中染色體置換文庫的構建

針對基因組中非重組染色體的出現,分析了兩個大麥DH群-Oregon Wolfe大麥(OWB)和源自‘Steptoe’x‘Morex’雜交的DH群(SM)。OWB群由175個DH系組成,已經使用總共444個分子標志物對其進行了基因型測定,而SM群由148個DH系組成,已經使用了總共798個分子標志物對其進行了基因型測定(Cistué等,2011,Theor.Appl.Genet.122:1399-1410;Kleinhofs等,1993,Theor.Appl.Genet.86:705-712)。在兩個群中,本發明的發明人可以鑒定具有非重組染色體的單獨DH系,并且這個分析的結果顯示于圖6中。OWB群包括總共175個DH,其中66個系不具有任何非重組染色體,69個系具有一個非重組染色體,24個系具有兩個非重組染色體,13個系具有三個非重組染色體和3個系具有四個非重組染色體。

SM群包括總共148個DH,并且在此34個DH系不具有任何非重組染色體,60個系具有一個非重組染色體,37個系具有兩個非重組染色體,14個系具有三個非重組染色體,沒有一個系具有四個非重組染色體和3個系具有五個非重組染色體。

大麥基因組具有7個單倍體染色體數,并且事實是在這兩個群的任一個中都沒有發現具有6個或7個非重組染色體的系,可能是由于DH群的大小小的原因。理論上,預期在約382個DH系的群中將發現至少一個具有7個非重組染色體的系,如表2中針對50%的平均交換頻率所說明的。

如之前實施例中的一樣,可以使用這些有限的DH群作為用于形成染色體置換系的起始點。這說明于圖7中。從SM群(使用來自Steptoe和Morex種質之間雜交的F1作為起始雜合體),選擇了兩個特定的DH,其各自在其基因組中具有3個非重組染色體:DH系SM124從Morex遺傳了完整的染色體II和III(圖7中的“B”)和從Steptoe遺傳了染色體VI(圖7中的“A”),而DH系SM127從Morex遺傳了完整染色體II、III和V。其他染色體經歷了重組,并且因此包括來自兩個親本Morex和Steptoe的基因組片段(圖7中的“-”)。將DH系SM124和SM127雜交獲得了F1后代,其具有來自Morex的染色體II和III的兩個完整非重組拷貝,一個來自Morex的染色體V的完整非重組拷貝和一個來自Steptoe的染色體VI的完整非重組拷貝。隨后將F1個體與初始Morex種質(起始雜合體的兩個親本之一)雜交,并且在所得到的子代中,可能容易地鑒定(基于分子標志物譜)對于完整非重組染色體II、III、IV和V純合的,對于完整非重組染色體VI雜合的(即,帶有來自Morex和Steptoe的這個染色體的一個親本拷貝),以及對于染色體I和VII雜合的(對于其中每一個,存在一個包括來自兩個親本的基因組片段的重組拷貝,和一個來自Morex的親本染色體的非重組拷貝)的個體。

然后將這個系與初始Morex種質再次雜交,其導致染色體I和VII在一些子代植物中的進一步固定,其因此在全部染色體除了編號VI中與Morex相同,為此,它們仍然是雜合的(即,攜帶來自起始雜合體的任一個親本的這個染色體的拷貝,所述親本即Morex和Steptoe)。這樣的特定個體的自交獲得了只有染色體VI分離的群,并且在這個群中,可能容易地鑒定(基于分子標志物譜)其中染色體VI源自Steptoe(非重組和完整的)和其中全部其他染色體源自Morex(非重組和完整的)的染色體置換系。可以按照這個實施例中所述的相似方式,形成其他染色體置換系(和最終由128個不同個體組成的完整染色體置換文庫)。

實施例4

玉米中染色體置換文庫的構建

從Bauer等(GenomeBiol.14(2013):R103)的研究,研究了兩個玉米DH群。這些DH群-CFF13(兩個Flint基因池親本之間的雜種)和CFD07(兩個Dent基因池親本之間的雜種)-各自源自近交系之間的雜合體。CFF13由117個DH系組成,使用6,379個多態性分子標志物測定了基因型,而CFD07由108個系組成,使用13,466個多態性分子標志物測定了基因型。如圖8中所示,兩個群包括不少具有至少一個非重組親本染色體的系。這些群中遇到的非重組染色體的最高數量為六個(在CFD07群的一個系中)和七個(在CFF13群的一個系中)。如果DH群更大,遇到具有超過一個非重組染色體的系的機會將更高。

可以將獲得的具有非重組親本染色體的DH再次彼此雜交和/或與起始雜合體的親本雜交,以獲得特定的染色體置換系和最終完整染色體置換文庫,包括1024個不同的系。

表3說明了對于具有10個染色體的植物物種(如玉米)和50%的平均交換頻率,使用95%確定性,將需要約3,067個DH系的群來鑒定一個具有10個非重組染色體的DH系。該表還清楚地顯示了使用本發明的方法,鑒定具有2、3、4、5、6、7或8個非重組染色體的玉米DH系的機會高得多,并且只需要非常小的DH群來具有非常好的鑒定至少一個這樣的DH系的機會。

如以上解釋的,其中染色體子集已經是非重組的DH系的可利用性使得在本發明方法的第二輪中有更好的起始位置。例如,具有7個非重組染色體的DH系可以與另一個具有5個非重組染色體的DH系雜交,其中幾個非重組染色體在兩個情況中是相同的。這導致其中幾個非重組的親本染色體以純合狀態存在的F1,并且因此導致變得不太復雜的基因組狀況。通過從這個F1產生DH并且隨后將那些DH中的一些與其他策略上選定的系(其他DH、染色體置換系或起始雜合體的親本系)雜交,可以形成更多染色體置換系,并且合適地形成完整或不完整染色體置換文庫。

表3

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