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黃烷類化合物在制備抗補體藥物中的用途.pdf

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黃烷 化合物 制備 補體 藥物 中的 用途
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摘要
申請專利號:

CN201110338747.4

申請日:

20111031

公開號:

CN103083342B

公開日:

20150422

當前法律狀態:

有效性:

失效

法律詳情:
IPC分類號: A61K31/7048,A61K31/353,A61P37/02,A61P19/04,A61P29/00,A61P11/00 主分類號: A61K31/7048,A61K31/353,A61P37/02,A61P19/04,A61P29/00,A61P11/00
申請人: 復旦大學
發明人: 陳道峰,金家宏
地址: 200433 上海市楊浦區邯鄲路220號
優先權: CN201110338747A
專利代理機構: 上海元一成知識產權代理事務所(普通合伙) 代理人: 吳桂琴
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法律狀態
申請(專利)號:

CN201110338747.4

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法律狀態公告日:

法律狀態類型:

摘要

本發明屬制藥領域,涉及黃烷類化合物在制備抗補體藥物中的新用途。本發明應用現代藥理篩選方法,對植物藥中的抗補體活性物質進行研究,從鴨跖草科植物鴨跖草的正丁醇提取物和蓼科植物金蕎麥的正丁醇提取物分離得到黃烷類化合物,并通過體外抗補體活性評價試驗證實其對補體系統的經典途徑和旁路途徑具有很強的抑制作用。所述化合物對補體系統的經典途徑抑制作用的CH50為0.13±0.03~0.78±0.06mM,對旁路途徑抑制作用的AP50為0.12±0.01~1.00±0.15mM。所述化合物可用于制備抗補體藥物。

權利要求書

1.具有下述結構通式的黃烷類化合物在制備抗補體藥物中的用途,當R=(S)H,R=(S)O-2-(6-Cinnamyl)-Glu,R=R=R=H時,化合物為兒茶素-3-O-β-D-(2-肉桂酰基)-吡喃葡萄糖苷(1);當R=(S)OH,R=(R)OH,R=R=t-Bu,R=OH時,化合物為(2R,3R,4S)-3′,5′-二叔丁基-3,4,5,7,4′-五羥基黃烷(2)。2.按權利要求1所述的用途,其特征在于,所述的黃烷類化合物為鴨跖草科植物鴨跖草的正丁醇提取物或蓼科植物金蕎麥的正丁醇提取、分離物。3.按權利要求1所述的用途,其特征在于,所述的兒茶素-3-O-β-D-(2-肉桂酰基)-吡喃葡萄糖苷(1)對補體系統的經典途徑有抑制作用,其中,50%溶血所需最小供試品濃度(CH)為0.13±0.03mM。

說明書

技術領域

本發明屬中藥制藥領域,涉及黃烷類化合物在制備抗補體藥物中的新用途。

背景技術

現有技術公開了補體系統的過度激活會引發系統性紅斑狼瘡、類風濕性關節炎、急性呼吸窘迫綜合征等多種疾病。抗補體藥物研究多年來一直是世界藥學研究的熱點和重點。目前臨床實踐對此類疾病尚無理想的治療藥物,因此,臨床上急需高效、低毒、專一的新型補體抑制劑。研究表明,直接從天然產物中研究開發補體抑制劑的成本低,并且大多數活性成分作為天然產物的一部分可以直接被機體消化吸收,因此近年來從天然來源中尋找新的具有抗補體活性的藥物受到人們越來越多的關注。國內外的學者從包括海洋生物在內的天然產物中分離得到大量的具有補體系統抑制作用的單體化合物,為抗補體藥物的研究與開發提供了廣闊的前景。

鴨跖草科(Commelinaceae)鴨跖草屬(Commelina)植物主要分布于熱帶,少數種產于亞熱帶和溫帶地區。中國產13屬49種,多分布于長江以南各省,尤以西南地區為盛。鴨跖草為鴨跖草屬(Commelina)植物鴨跖草(Commelina?communis?Linn.)的全草,性溫味辛,專入脾胃兩經,具有清熱解毒,涼血,利尿的功效,在臨床上可單獨或與其他中藥合用用于治療流行性感冒、急性扁桃腺炎、咽炎、水腫、小兒肺炎、泌尿系感染、急性腸炎、黃疸型肝炎、高血壓、痢疾、毒蛇咬傷、瘡療腫毒、痔瘡等疾病。近年來對鴨跖草的研究僅集中在化學成分的分離及結構鑒定上,從中分離得到了一些黃酮類、甾體、萜類等化合物,但迄今為止,尚未見黃烷類化合物對補體系統具有抑制作用的報道。

金蕎麥為蓼科(Polygonaceae)蕎麥屬(Fagopyrum)植物金蕎麥(Fagopyrum?dibotrys(D.Don)Hara)的干燥根莖,生于荒地、路旁、河邊陰濕地,具有清熱解毒、活血消癰、祛風除濕瘡毒、蛇蟲咬傷等功效,主治肺熱咳喘、咽喉腫痛、痢疾、風濕痹證、跌打損傷和癰腫癌等。現代藥理研究證明其具有抗癌和抑菌等作用。化學成分研究表明其中主要成分為黃酮類、單寧類化合物及黃烷類化合物等,但未見其對補體系統具有抑制作用的報道。

發明內容

本發明的目的是提供新的具有抗補體活性的物質,具體涉及鴨跖草、金蕎麥中的黃烷類化合物其具有抗補體活性,所述的黃烷類化合物包括兒茶素-3-O-β-D-(2-肉桂酰基)-吡喃葡萄糖苷(1)、(2R,3R,4S)-3′,5′-二叔丁基-3,4,5,7,4′-五羥基黃烷(2)、原花青素B-2(3)和原花青素C-1(4)。

本發明的進一步目的是提供上述黃烷類化合物在制備抗補體藥物中的用途。

本發明應用現代藥理篩選方法,對植物藥中的抗補體活性物質進行研究,從鴨跖草科(Commelinaceae)植物鴨跖草(Commelina?communis?Linn.)全草乙醇提取物的正丁醇部位和蓼科(Polygonaceae)植物金蕎麥(Fagopyrum?dibotrys(D.Don)Hara)干燥根莖的乙醇提取物的正丁醇部位分離得到黃烷類化合物并證實其對補體系統的經典途徑和旁路途徑均有較強的抑制作用。

本發明的活性黃烷類化合物具有下述結構通式的化學結構:

本發明中,上述的黃烷類化合物,當R1=(S)H,R2=(S)O-2-(6-Cinnamyl)-Glu,R3=R4=R5=H時,化合物為兒茶素-3-O-β-D-(2-肉桂酰基)-吡喃葡萄糖苷(1);

當R1=(S)OH,R2=(R)OH,R3=R5=t-Bu,R4=OH時,化合物為(2R,3R,4S)-3′,5′-二叔丁基-3,4,5,7,4′-五羥基黃烷(2);

當(2R)R1=(S)8-O-(-)-epicatechin,R2=(R)OH,R3=H,R4=R5=OH時,化合物為原花青素B-2(3);

當(2R)R1=(S)8-O-procyanidin?B-2,R2=(R)OH,R3=H,R4=R5=OH時,化合物為原花青素C-1(4)。

本發明所述的黃烷類化合物通過下述方法制備:

取鴨跖草全草14kg,用乙醇室溫冷浸(50L×5次),合并提取液濃縮至無醇味,提取液加水稀釋至2L,依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取(各2L×3次),合并正丁醇萃取液濃縮至干即得正丁醇萃取物19.2g。正丁醇部位經干法上樣進行硅膠柱色譜,以石油醚(60~90℃)、石油醚(60~90℃)-丙酮、丙酮梯度洗脫,所得流分以不同洗脫劑進行反復硅膠柱色譜和SephadexLH-20純化,分離得到化合物兒茶素-3-O-β-D-(2-肉桂酰基)-吡喃葡萄糖苷(1)。

取金蕎麥根莖粗粉15kg,用乙醇室溫冷浸(50L×5次),合并提取液濃縮至無醇味,提取液加水稀釋至2L,依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取(各2L×3次),合并正丁醇萃取液濃縮至干即得正丁醇萃取物220g。正丁醇部位經干法上樣進行硅膠柱色譜,以氯仿、氯仿-甲醇、甲醇梯度洗脫,所得流分以不同洗脫劑進行反復硅膠柱色譜,SephadexLH-20純化和制備色譜,分離得到化合物(2R,3R,4S)3′,5′-二叔丁基-3,4,5,7,4′-五羥基黃烷(2),原花青素B-2(3)和原花青素C-1(4)。

本發明中,兒茶素-3-O-β-D-(2-肉桂酰基)-吡喃葡萄糖苷(1):淡黃色粉末,1HNMR(400MHz,acetone-d6,ppm):δ4.90(1H,d,J=6.5Hz),4.19(1H,m),2.91(1H,dd,J=16.5,5.5Hz),2.76(1H,dd,J=16.5,7.0Hz),6.04(1H,d,J=2.5Hz),5.91(1H,d,J=2.5Hz),6.90(1H,dd,J=2.0Hz),6.81(1H,d,J=8.5Hz),6.78(1H,dd,J=8.5,2.0Hz),4.32(1H,d,J=8.0Hz),3.13(1H,dd,J=9.0,8.0Hz),3.37(1H,dd,J=9.5,9.0Hz),3.54(1H,ddd,J=9.5,6.5,2.0Hz),4.59(1H,dd,J=12.0,2.0Hz),4.29(1H,dd,J=12.0,6.5Hz),6.58(1H,d,J=16.0Hz),7.69(1H,d,J=16.0Hz),7.61(2H,m),7.40(3H,m)。

本發明中,(2R,3R,4S)-3′,5′-二叔丁基-3,4,5,7,4′-五羥基黃烷(2):淡黃色粉末,1HNMR(400MHz,DMSO-d6,ppm):δ8.30(1H,s),7.38(2H,s),7.28(1H,d,J=2.1Hz),7.15(1H,d,J=2.1Hz),5.02(1H,brs),4.75(1H,d,J=6.4Hz),4.34(1H,dd,J=6.4,4.9Hz),4.28(1H,d,J=4.9Hz),1.38(9H,s),1.35(9H,s)。

本發明中,原花青素B-2(3):淡黃色粉末,1H?NMR(400MHz,acetone-d6,ppm):δ2.78-2.90(2H,m,H-4′),4.23(1H,s,H-3),4.26(1H,m,H-3′),4.67(1H,s,H-4),4.95(1H,s,H-2′),5.04(1H,s,H-2),5.93-5.99(3H,m,H-6,6′,8),6.73-7.08(6H);13C?NMR(100MHz,acetone-d6,ppm):δ29.2(C-4′),36.4(C-4),66.5(C-3′),72.3(C-3),76.7(C-2),79.2(C-2′),95.4,96.2,96.8(C-8,6,6′),100.7,101.4(C-10,10′),107.1(C-8′),154.0,155.6×2,157.2×2,158.5(C-9,9′,7,7′,5,5′),114.4,115.0,115.4,115.6(C-2,2′,5,5′),118.3,119.0(C-6,6′),131.9×2(C-1,1′),145.0,145.2,149.4,149.0(C-3,3′,4,4′)。

本發明中,原花青素C-1(4):淡黃色粉末,1H?NMR(400MHz,CDCl3,ppm):δ2.6-3.0(2H,m),4.17(2H,brs),4.33(1H),4.80(2H,brs),5.01-5.15(3H,m),5.95-6.10(4H),6.67-7.14(9H)。

本發明的黃烷類化合物經體外經典途徑和旁路抗補體活性評價試驗,結果證實,所述化合物對補體系統的經典途徑和旁路途徑均有顯著抑制作用(如表1所示)。其中,兒茶素-3-O-β-D-(2-肉桂酰基)-吡喃葡萄糖苷(1)對補體系統的經典途徑有最強的抑制作用,經典途徑中,50%溶血所需最小供試品濃度(CH50)分別為0.13±0.03mM;旁路途徑中,原花青素C-1(4)對旁路途徑均有最強的抑制作用,50%溶血所需最小供試品濃度(AP50)分別為0.12±0.01mM。

本發明的黃烷類化合物可作為藥物活性成分,進一步制備抗補體藥物。

表1是化合物1~4對補體系統經典途徑和旁路途徑抑制作用。

表1

aμg/ml.

附圖說明:

圖1是鴨跖草和金蕎麥正丁醇部位所得黃烷類化合物1-4提取分離流程圖。

具體實施方式

實施例1制備黃烷類化合物

(1)取鴨跖草全草14kg,用乙醇室溫冷浸(50L×5次),合并提取液濃縮至無醇味,提取液加水稀釋至2L,依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取(各2L×3次),合并正丁醇萃取液濃縮至干即得正丁醇萃取物19.2g。正丁醇部位經硅膠柱色譜,以石油醚(60~90℃)、石油醚-丙酮、丙酮梯度洗脫,流份以反復柱色譜,SephadexLH-20純化得到黃烷類化合物(1)。具體步驟如下:

石油醚-丙酮(2:1)洗脫所得流份,經SephadexLH-20純化,得到化合物1(4mg)。采用波譜學方法分析,其結構確定為對兒茶素-3-O-β-D-(2-肉桂酰基)-吡喃葡萄糖苷。

(2)取金蕎麥根莖粗粉15kg,用乙醇室溫冷浸(50L×5次),合并提取液濃縮至無醇味,提取液加水稀釋至2L,依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取(各2L×4次),合并正丁醇萃取液濃縮至干即得正丁醇萃取物790g。取正丁醇部位220g經干法上樣進行硅膠柱色譜,以氯仿、氯仿-甲醇、甲醇梯度洗脫,所得流分以不同洗脫劑進行反復硅膠柱色譜,SephadexLH-20純化和制備色譜,分離得到化合物2-4。

①氯仿-甲醇(7:1)洗脫所得流份,經硅膠柱色譜,石油醚-丙酮(3:1)為洗脫劑,流份經SephadexLH-20純化,以氯仿-甲醇(1:1)為洗脫劑,得到化合物2(4mg)。采用波譜學方法分析,其結構確定為(2R,3R,4S)3′,5′-二叔丁基-3,4,5,7,4′-五羥基黃烷。

②氯仿-甲醇(3:1)洗脫所得流份,經硅膠柱色譜,石油醚-丙酮(1:1)為洗脫劑,流份經制備色譜,以氯仿-甲醇(2:1)為展開劑,得到化合物3(4mg)。采用波譜學方法分析,其結構確定為原花青素B-2。

③氯仿-甲醇(1:1)洗脫所得流份經SephadexLH-20純化,以甲醇為洗脫劑,得到化合物4(75mg)。采用波譜學方法分析,其結構確定為原花青素C-1。

實施例2體外抗補體經典途徑試驗

取補體(豚鼠血清)0.1ml,加入BBS配制成1:5溶液,用BBS對倍稀釋成1:10、1:20、1:40、1:80、1:160、1:320和1:640溶液。取1:1000溶血素、各濃度補體及2%SRBC各0.1ml溶于0.3ml?BBS中,混勻,37℃水浴30min后放入低溫高速離心機,在5000rpm、4℃條件下離心10min。分別取每管上清0.2ml于96孔板,在405nm測定吸光度。實驗同時設置全溶血組(0.1ml?2%SRBC溶于0.5ml三蒸水中)。以三蒸水溶血管的吸光度作為全溶血標準,計算溶血率。以補體稀釋度為X軸,各稀釋濃度補體造成的溶血百分率為Y軸作圖。選擇達到相似高溶血率的最低補體濃度作為確保體系能正常溶血所需的臨界補體濃度。取臨界濃度的補體與分別于本發明的黃烷類化合物1-4混勻,于37℃預水浴10min后,加入適量BBS、溶血素和2%SRBC。將每管37℃水浴30min后放入低溫高速離心機,5000rpm、4℃條件下離心10min后分別取每管上清0.2ml于96孔板,405nm下測定吸光度。實驗同時設置中藥對照組、補體組和全溶血組。將中藥組吸光度值扣除相應中藥對照組吸光度值后計算溶血率。以中藥粗提物濃度作為X軸,溶血抑制率作為Y軸作圖,計算CH50值。結果顯示,本發明的黃烷類化合物對補體系統的經典途徑有較強的抑制作用,如表1所示。

實施例3體外抗補體旁路途徑試驗

取補體(人血清)0.2ml,加入AP稀釋液配制成1:5稀釋溶液,并對倍稀釋成1:10、1:20、1:40、1:80、1:160、1:320和1:640溶液。取各濃度補體0.15ml、AP稀釋液0.15ml及0.5%RE?0.20ml,混勻,37℃水浴30min后放置入低溫高速離心機,在5000rpm、4℃條件下離心10min。分別取每管上清0.2ml于96孔板,在405nm測定吸光度。實驗同時設置全溶血組(0.20ml?0.5%RE溶于0.3ml三蒸水中)。以三蒸水溶血管的吸光度作為全溶血標準,計算溶血率。以補體稀釋度為X軸,各稀釋濃度補體造成的溶血百分率為Y軸作圖。選擇達到相似高溶血率的最低補體濃度作為確保體系能正常溶血所需的臨界補體濃度。取確定的臨界濃度的補體與供試品混勻,于37℃預水浴10min后,加入適量0.5%RE。將每管37℃水浴30min后放置入低溫高速離心機,5000rpm、4℃,離心10min后分別取每管上清0.2ml于96孔板,405nm下測定吸光度。實驗同時設置中藥對照組、補體組和全溶血組。將中藥組吸光度值扣除相應中藥對照組吸光度值后計算溶血率。以中藥粗提物濃度作為X軸,溶血抑制率作為Y軸作圖,計算AP50值。結果顯示,本發明的黃烷類化合物對補體系統的旁路途徑有較強的抑制作用,如表1所示。

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