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半乳糖修飾的巰基化殼聚糖季銨鹽納米粒及其制備方法和應用.pdf

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半乳糖 修飾 巰基 聚糖 銨鹽 納米 及其 制備 方法 應用
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申請專利號:

CN201310029314.X

申請日:

20130125

公開號:

CN103083223B

公開日:

20141203

當前法律狀態:

有效性:

失效

法律詳情:
IPC分類號: A61K9/00,A61K47/36,A61K45/00,A61K48/00 主分類號: A61K9/00,A61K47/36,A61K45/00,A61K48/00
申請人: 復旦大學
發明人: 唐翠,印春華,韓路,張婧
地址: 200433 上海市楊浦區邯鄲路220號
優先權: CN201310029314A
專利代理機構: 上海正旦專利代理有限公司 代理人: 陸飛;盛志范
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CN201310029314.X

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法律狀態類型:

摘要

本發明屬于醫藥技術領域,具體為一種半乳糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽納米粒及其制備方法和應用。本發明的納米粒由荷正電的半乳糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽和離子交聯劑經離子交聯作用生成,同時包載蛋白質多肽藥物或核酸藥物。其中半乳糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽由殼聚糖的氨基依次經季銨化、半乳糖修飾和巰基化修飾而成。該納米粒的制備過程簡單、無需使用有機溶劑,可保護蛋白質多肽藥物或核酸藥物的活性。該納米粒結構穩定,可主動靶向炎癥巨噬細胞和肝癌細胞,有效提高口服藥物的小腸吸收并改善核酸藥物的轉染效率,抗炎和抗腫瘤效果顯著優于現有殼聚糖類納米粒,可用于制備口服給藥系統或者聯合給藥系統等。

權利要求書

1.一種半乳糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽納米粒,其特征在于由荷正電的半乳糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽和離子交聯劑經離子交聯作用生成,同時包載蛋白質多肽藥物或核酸藥物;其中,所述的半乳糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽為殼聚糖的氨基依次經季銨化修飾、半乳糖修飾和巰基化修飾所得的共聚物;殼聚糖分子量為30-1,000?kDa;所述季銨化度為15-60?mol%;半乳糖修飾物為乳糖醛酸,所述的半乳糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽的半乳糖修飾度為5-60?mol%;巰基化修飾物為半胱氨酸鹽酸鹽,所述的游離巰基修飾率為50-200?μmol/g,二硫鍵修飾率為100-300?μmol/g。2.根據權利要求1所述的半乳糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽納米粒,其特征在于所述離子交聯劑選自三聚磷酸鈉、透明質酸、γ-聚谷氨酸、丙烯酸樹脂中的一種或幾種。3.根據權利要求1所述的半乳糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽納米粒,其特征在于所述的蛋白質多肽藥物選自表皮生長因子受體單抗、HER-2單克隆抗體、TNF-α人鼠嵌合單克隆抗體、貝伐單抗、胰島素、降鈣素、干擾素、抗利尿激素、奧曲肽、布舍瑞林、亮丙瑞林、紅細胞生長素、白介素或抗原中的一種或幾種;所述核酸藥物選自DNA、RNA、寡聚核苷酸或多核苷酸中的一種或幾種。4.根據權利要求3所述的半乳糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽納米粒,其特征在于所述的DNA為pDNA;所述的RNA為siRNA、shRNA或microRNA。5.根據權利要求1–4之一所述的半乳糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽納米粒,其特征在于所述納米粒的平均粒徑為100-500?nm。6.根據權利要求1–4之一所述的半乳糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽納米粒,其特征在于所述納米粒的Zeta電勢為10-45?mV。7.根據權利要求1–4之一所述的半乳糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽納米粒,其特征在于所述納米粒對蛋白質多肽藥物或核酸藥物的包封率為60-100%。8.一種如權利要求1–7之一所述半乳糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽納米粒的制備方法,其特征在于具體步驟為:(1)將半乳糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽、離子交聯劑和蛋白質多肽藥物或核酸藥物溶于水;(2)將半乳糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽溶液滴加至離子交聯劑和蛋白質多肽藥物或核酸藥物的混合溶液中,其中半乳糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽與一種或幾種離子交聯劑的質量比為1:1-20:1,一種或幾種離子交聯劑與蛋白質多肽藥物或核酸藥物的質量比為1:5-25:1;(3)室溫靜置,荷正電的半乳糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽與荷負電的離子交聯劑、蛋白質多肽藥物或核酸藥物經離子交聯作用形成納米粒。9.根據權利要求8所述的制備方法,其特征在于步驟(1)中所述的半乳糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽按如下步驟制備:(1)合成殼聚糖季銨鹽,反應時間為45-180?min,所得殼聚糖季銨鹽以Cl型陰離子交換樹脂去除I,冷凍干燥;其中反應45、120和180?min所得殼聚糖季銨鹽的季銨化度分別為15mol%、30?mol?%和60?mol?%;(2)將殼聚糖季銨鹽和乳糖醛酸分別溶于四甲基乙二胺/HCl緩沖液,乳糖醛酸和殼聚糖季銨鹽的質量比為0.2:1-3:1,加入終濃度為50-200?mM的1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)-碳二亞胺鹽酸鹽和N-羥基琥珀酰亞胺,調節反應pH為3.0-5.0,室溫反應24-72?h,超濾,冷凍干燥,得半乳糖修飾殼聚糖季銨鹽;(3)將半乳糖修飾殼聚糖季銨鹽和半胱氨酸鹽酸鹽溶于水,半乳糖修飾殼聚糖季銨鹽和半胱氨酸鹽酸鹽的質量比為1:1-1:4,加入終濃度為50-200?mM的1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)-碳二亞胺鹽酸鹽和N-羥基琥珀酰亞胺,調節pH至3.0-5.0,室溫反應2-8?h,透析,冷凍干燥,得半乳糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽。10.權利要求1–7之一所述的半乳糖修飾的巰基化殼聚糖季銨鹽納米粒在制備口服給藥系統或者聯合給藥系統中的應用。11.權利要求1–7之一所述的半乳糖修飾的巰基化殼聚糖季銨鹽納米粒在制備同時包載多種藥物,實現多靶點聯合治療的給藥系統中應用。

說明書

技術領域

本發明屬于醫藥技術領域,具體涉及一種半乳糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽納米粒及其制備方法和應用。

背景技術

納米粒是一種新型藥物遞送系統,可包載化療藥物、基因藥物等多種藥物。納米粒可改變藥物的體內分布,具有靶向給藥、緩釋藥物、降低藥物毒副作用、增溶難溶性藥物、提高藥物穩定性、促進生物膜的轉運和吸收、提高生物大分子藥物生物利用度等優勢(Adv?Drug?Deliv?Rev?2008,60:1638-1649),在生物大分子藥物給藥系統中應用尤為廣泛。納米粒的制備方法主要有共價交聯法、離子交聯法、復凝聚/沉淀法、乳化/溶劑擴散法、反膠束法、噴霧干燥法、熱加工法、簡單聚合法等。共價交聯、反膠束法、乳化/溶劑擴散法等均需使用有機溶劑,易造成藥物活性降低甚至失活。離子交聯法通過荷相反電荷物質間的聚電解質作用自組裝形成納米粒,無需使用有機溶劑,反應條件溫和,可最大限度保護生物大分子藥物的活性(Int?J?Biol?Macromol?2010,46:342-349)。

天然陽離子聚合物殼聚糖無免疫原性、生物可降解、安全性好,分子結構上的活性氨基可連接不同功能基團,如季銨等質子化基團、pH敏感基團、巰基或特異性靶向配體等。殼聚糖衍生物N,N,N-三甲基殼聚糖季胺鹽(Trimethyl?chitosan,?TMC)在中性條件下荷正電,溶解性好,用于口服給藥時,可打開腸道上皮細胞間緊密連接,促進親水性大分子藥物經細胞旁路轉運和吸收;巰基化聚合物用于口服給藥時,可緊密結合于黏膜,延長滯留時間,提高局部藥物濃度,促進藥物吸收,并發揮促滲作用。靶向給藥系統的研究中,半乳糖靶向配體修飾的給藥系統可通過與肝細胞去唾液酸糖蛋白受體(asialoglycoprotein?receptor,?ASGP-R)或巨噬細胞半乳糖/N-乙酰半乳糖胺特異性凝集素(macrophage?galactose/N-acetyl?galactosamine-specific?lectin,?MGL)特異性結合,實現主動靶向肝臟或巨噬細胞,發揮疾病治療功效。聚乙烯亞胺接枝半乳糖修飾殼聚糖(GC-g-PEI)包載pDNA,對肝癌細胞株HepG2細胞的轉染效率明顯高于宮頸癌細胞株HeLa細胞(Gene?Ther?2007,14:1389-1398)。半乳糖修飾的低分子量殼聚糖包載反義寡聚核苷酸,結腸給藥后可主動靶向炎癥巨噬細胞發揮抗炎功效(Gut?2010,59:470-479)。但上述半乳糖修飾的納米粒均未通過口服途徑給藥實現主動靶向治療功效。上述給藥系統亦缺乏有效途徑可控調節藥物和載體間的結合力,無法保證所載藥物在生理環境中的穩定和在治療靶點的快速釋放。此外,現有文獻中半乳糖修飾的載體均僅包載一種藥物,進行單靶點治療,易產生耐藥性,尚無使用半乳糖修飾的給藥載體同時包載多種藥物,實現多靶點聯合給藥,協同發揮疾病治療功效的報道。

發明內容

本發明的目的是克服現有技術的缺陷,提供一種半乳糖修飾的巰基化殼聚糖季銨鹽納米粒及其制備方法和應用。

本發明第一方面,提供半乳糖修飾的巰基化殼聚糖季銨鹽納米粒。該納米粒可通過離子交聯法(ionic?gelation)制備,包載生物大分子藥物(蛋白質多肽藥物或核酸藥物)。其中:?

所述的離子交聯法為荷正電的半乳糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽與荷負電的離子交聯劑通過聚電解質作用形成納米粒,同時包載蛋白質多肽藥物或核酸藥物;所述的半乳糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽為殼聚糖的氨基依次經季銨化修飾、半乳糖修飾和巰基化修飾所得的共聚物,其中殼聚糖分子量為30-1000?kDa,季銨化度為15-60?mol%(根據1H?NMR計算而得,方法參見Eur?J?Pharm?Biopharm?2004,57:77-83),半乳糖修飾物為乳糖醛酸,半乳糖修飾度為5-60?mol%(根據1H?NMR計算而得,方法參見J?Control?Release?2008,131:150-157),巰基化修飾物為半胱氨酸鹽酸鹽,游離巰基修飾率為50-200?μmol/g,二硫鍵修飾率為100-300?μmol/g。

在本發明的優選例中,所述的半乳糖修飾的巰基化殼聚糖季銨鹽具有下式結構:

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所述離子交聯劑為三聚磷酸鈉、透明質酸、γ-聚谷氨酸、丙烯酸樹脂中的一種或幾種。

所述的半乳糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽與離子交聯劑的質量比為1:1-20:1,優選的質量比為5:1-15:1。

所述的蛋白質多肽藥物選自下組:尼妥珠單抗(Nimotuzumab,表皮生長因子受體單抗)、群司珠單抗(Trastuzumab,HER-2單克隆抗體)、英夫利昔(Infliximab,TNF-α人鼠嵌合單克隆抗體)、貝伐單抗、胰島素、依諾肝素、降鈣素、干擾素、抗利尿激素、奧曲肽、布舍瑞林、亮丙瑞林、紅細胞生長素、各種生長因子、白介素、集落刺激因子、抗原或抗體的一種或幾種。

所述的核酸藥物選自DNA、RNA、寡聚核苷酸或多核苷酸中的一種或幾種。

所述的DNA為質粒DNA(pDNA)。

所述的pDNA可以表達蛋白質或轉錄成小分子干擾RNA。

所述的RNA為siRNA、shRNA、mRNA或microRNA中的一種或幾種。

所述的半乳糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽納米粒的平均粒徑為100-500?nm,優選的平均粒徑為100-200?nm。

所述的半乳糖修飾的巰基化殼聚糖季銨鹽納米粒的Zeta電勢為10-45?mV,優選的Zeta電勢為15-30?mV。

所述的半乳糖修飾的巰基化殼聚糖季銨鹽納米粒的包封率為60-100%,優選的包封率為80-100%。

本發明第二方面,提供所述半乳糖修飾的巰基化殼聚糖季銨鹽納米粒的制備方法,包括如下步驟:

(1)半乳糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽、離子交聯劑和蛋白質多肽藥物或核酸藥物溶于水;

(2)將半乳糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽溶液滴加至離子交聯劑和蛋白質多肽藥物或核酸藥物的混合溶液中,其中半乳糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽與一種或多種離子交聯劑的質量比為1:1-20:1,一種或多種離子交聯劑與蛋白質多肽藥物或核酸藥物的質量比為1:5-25:1;

(3)室溫靜置,荷正電的半乳糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽與荷負電的離子交聯劑、蛋白質多肽藥物或核酸藥物經聚電解質作用形成納米粒。

其中,所述半乳糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽的制備的具體步驟如下:

(1)按照文獻報道方法(Eur?J?Pharm?Biopharm?2004,57:77-83)在甲基吡咯烷酮溶劑中加入殼聚糖和碘甲烷加熱反應制得殼聚糖季銨鹽,反應時間為45-180?min,所得殼聚糖季銨鹽以Cl-型陰離子交換樹脂去除I-,冷凍干燥;其中反應45、120和180?min所得殼聚糖季銨鹽的季銨化度分別為15mol?%、30mol?%和60mol?%;

(2)將殼聚糖季銨鹽和乳糖醛酸分別溶于四甲基乙二胺/HCl緩沖液(pH?4.7),乳糖醛酸和殼聚糖季銨鹽的質量比為0.2:1-3:1,加入終濃度為50-200?mM的1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)-碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS),調節反應pH為3.0-5.0,室溫反應24-72?h,超濾,冷凍干燥,得半乳糖修飾殼聚糖季銨鹽;

(3)將半乳糖修飾殼聚糖季銨鹽和半胱氨酸鹽酸鹽溶于水,半乳糖修飾殼聚糖季銨鹽和半胱氨酸鹽酸鹽的質量比為1:1-1:4,加入終濃度為50-200?mM的1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)-碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS),調節pH至3.0-5.0,室溫反應2-8?h,透析,冷凍干燥,得半乳糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽。

半乳糖修飾的巰基化殼聚糖季銨鹽的三步合成反應需按照季銨化修飾、半乳糖修飾和巰基化修飾的順序依次進行,這是由于半乳糖修飾反應需常溫攪拌24-72?h,若先進行巰基化修飾,所得的游離巰基易氧化,降低材料的黏膜黏附性。

乳糖醛酸和殼聚糖季銨鹽的質量比為0.2:1-3:1。質量比過低,半乳糖修飾率較低,材料的主動靶向性降低;質量比過高,半乳糖修飾率較高,占用的殼聚糖氨基數量較多,影響巰基化修飾反應,減弱材料的黏膜黏附性。

離子交聯法制備納米粒可通過控制交聯劑的種類和質量比調節藥物和載體間的結合力。參與形成納米粒的交聯劑種類越多,納米粒與藥物結合力越強,藥物釋放速度越慢;分子量高的交聯劑含量越多,藥物釋放速度越慢。

本發明第三方面,提供所述半乳糖修飾的巰基化殼聚糖季銨鹽納米粒在制備口服給藥系統中的應用。

在一優選例中,提供了半乳糖修飾的巰基化殼聚糖季銨鹽納米粒在抗炎口服給藥系統中的應用。所述的半乳糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽納米粒以三聚磷酸鈉為單一交聯劑,粒徑為100-200?nm,可在pH?1.2-7.4的高離子強度環境下保持結構穩定,胃腸道穩定性較好。所述的半乳糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽納米粒可顯著增加在腸道炎癥部位聚集的巨噬細胞攝取量,提高炎癥部位的藥物濃度,顯著增強用于腸道局部炎癥治療的蛋白質多肽藥物或核酸藥物的抗炎功效。

本發明第四方面,提供半乳糖修飾的巰基化殼聚糖季銨鹽納米粒在制備抗腫瘤給藥系統中的應用。

在一優選例中,提供了半乳糖修飾的巰基化殼聚糖季銨鹽納米粒在制備抗腫瘤給藥系統中的應用。所述的半乳糖修飾的巰基化殼聚糖季銨鹽納米粒以三聚磷酸鈉、γ-聚谷氨酸和丙烯酸樹脂的一種或者幾種為交聯劑,粒徑為100-200?nm,具有不同的siRNA結合-釋放速率性。所述的半乳糖修飾的巰基化殼聚糖季銨鹽納米粒具有不同的胞外穩定性和胞內釋放速率,調節離子交聯劑種類和比例可顯著提高用于抗肝癌治療的核酸或蛋白質、多肽藥物的治療功效。

本發明第五方面,提供半乳糖修飾的巰基化殼聚糖季銨鹽納米粒在制備同時包載多種藥物,實現多靶點聯合治療的給藥系統中應用,協同發揮疾病治療功效。

在一優選例中,提供了同時包載VEGF?siRNA和iSUR-pDNA的半乳糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽納米粒在抗腫瘤口服基因傳釋系統中的應用。所述的半乳糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽納米粒粒徑為100-200?nm,具有良好的胃腸道穩定性。所述的半乳糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽納米粒可提高pDNA和siRNA的小腸轉運效率,口服后可快速經小腸吸收進入血液循環,富集于肝癌細胞,發揮多靶點治療作用,協同提高口服抗腫瘤功效,也可用于顯著改善抗肝癌蛋白質、多肽藥物的治療功效。

本發明的主要優點在于:

(1)半乳糖修飾的巰基化殼聚糖季銨鹽納米粒同時具有殼聚糖季銨鹽和巰基化聚合物在口服給藥系統中的優勢。荷正電季銨基團和巰基基團可分別通過靜電吸引和形成分子間二硫鍵提高與荷負電細胞膜和富含半胱氨酸殘基的黏蛋白的親和力,從而具有更好的細胞黏附和黏膜黏附能力。此外,殼聚糖季銨鹽和巰基化聚合物可分別通過正電性和抑制酪氨酸磷酸酶活性打開小腸上皮緊密連接,促進親水性藥物的小腸吸收。

(2)半乳糖修飾的巰基化殼聚糖季銨鹽納米粒胃腸道穩定性較好,可在稀釋、高離子強度和pH變化的環境下保持結構穩定,可有效屏蔽生物大分子藥物的酶切位點,提高藥物的抗酶解能力。對于蛋白質多肽藥物而言,可有效抑制蛋白水解酶,如腸腔中的胰蛋白酶、糜蛋白酶和縮肽酶,刷狀緣膜囊中的外肽酶和細胞液中的溶菌酶對藥物的降解,保持藥物在轉運和吸收過程中的生物活性。對于核酸藥物而言,可有效抑制核酸酶,如脫氧核糖核酸酶(DNase)和核糖核酸酶(RNase)對藥物的降解,保護藥物在細胞外液和細胞內液中免受降解,發揮其生物功效。

(3)對于消化道局部炎癥疾病而言,本發明納米粒可發揮局部給藥作用。機體發生炎癥時,炎癥部位巨噬細胞表面過量表達半乳糖受體,本發明的納米粒經口服后可在腸道黏膜處通過半乳糖受體介導的特異性細胞內吞進入活化巨噬細胞,并隨巨噬細胞聚集于炎癥部位,發揮靶向抗炎作用。

(4)對于非消化道局部炎癥疾病而言,本發明納米粒可發揮全身給藥作用。粒徑為100-300?nm的納米粒在正常小腸上皮細胞、Peyer’s結處巨噬細胞的攝取量較高,經口服后可快速經小腸吸收進入體循環,將藥物遞送至全身。

(5)本發明的納米粒不僅可包載單一大分子藥物,還可同時包載多種蛋白質多肽藥物或核酸藥物,實現多靶點聯合給藥治療,避免單靶點治療所產生的耐藥性。

(6)本發明通過控制離子交聯劑的種類和比例調節藥物與載體的結合力,可針對不同疾病特征,調整藥物釋放速率,保證藥物到達到治療靶點前的穩定和到達靶點后的快速釋放。

(7)本發明的納米粒制備過程簡便,無需使用有機溶劑,可最大限度保護生物大分子藥物的活性。

(8)半乳糖修飾和巰基化修飾可降低殼聚糖季銨鹽的正電荷,減輕由正電荷帶來的細胞毒性。

術語:

“TMC”指殼聚糖季銨鹽;

“TC”巰基化殼聚糖季銨鹽;

“GT”指半乳糖修飾殼聚糖季銨鹽;

“GTC”指半乳糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽;

“GTC(m,n)”指殼聚糖分子量為m(kDa)、季銨化度為n(%)的半乳糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽;

“TC(m,n)”指殼聚糖分子量為m(kDa)、季銨化度為n(%)的巰基化殼聚糖季銨鹽。

附圖說明

圖1為同時包載siRNA和pDNA的GTC(200,30)納米粒(實施例69)的掃描電鏡圖。

圖2為同時包載siRNA和pDNA的GTC(200,30)納米粒(實施例69,70)在小鼠體液中的穩定性電泳圖。圖中A為裸pDNA或裸siRNA?;B為半乳糖修飾殼聚糖季銨鹽納米粒(實施例69);C為半乳糖修飾殼聚糖季銨鹽納米粒(實施例70)。

具體實施方式

下面結合具體實施例,進一步闡述本發明。應理解,這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的試驗方法,通常按照常規條件,或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明,濃度為質量體積百分數(w/v)。

實施例1?半乳糖修飾的巰基化殼聚糖季銨鹽的制備

按照文獻報道方法(Eur?J?Pharm?Biopharm?2004,57:77-83)在甲基吡咯烷酮溶劑中合成TMC,殼聚糖分子量為30?kDa,反應時間分別為45?min、120min和180?min,所得TMC的季銨化度分別為15mol?%、30mol?%和60mol?%。Cl-型陰離子交換樹脂去除I-,冷凍干燥;稱取50?mg乳糖醛酸(LA)溶于3?mL?四甲基乙二胺(TEMED)/HCl緩沖液(pH?4.7),加入終濃度分別為50?mM的1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)-碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS),攪拌溶解;稱取100?mg?TMC溶于12?mL?TEMED/HCl緩沖液(pH?4.7);混合LA和TMC溶液,加1?mol/L?NaOH調pH至3.0,室溫攪拌24?h,4?°C超濾純化(MWCO?10?kDa),冷凍干燥,制得GT;稱取100?mg?GT和400?mg半胱氨酸鹽酸鹽(Cys)分別溶于12?mL和3?mL水,加10?mol/L?NaOH調節Cys溶液pH至2-3;混合GT和Cys溶液,加入終濃度分別為200?mM的EDC和NHS溶液,攪拌溶解;加1?mol/L?NaOH調pH至5.0,室溫避光攪拌2?h;以pH?5.0?HCl溶液4?°C透析3天(MWCO?3,500?Da),冷凍干燥,制得GTC。?

實施例2半乳糖修飾的巰基化殼聚糖季銨鹽的制備

按照文獻報道方法(Eur?J?Pharm?Biopharm?2004,57:77-83)在甲基吡咯烷酮溶劑中合成TMC,殼聚糖分子量為100?kDa,反應時間分別為45?min、120min和180?min,所得TMC的季銨化度分別為15mol?%、30mol?%和60mol?%。Cl-型陰離子交換樹脂去除I-,冷凍干燥;稱取150?mg乳糖醛酸(LA)溶于3?mL?四甲基乙二胺(TEMED)/HCl緩沖液(pH?4.7),加入終濃度分別為100?mM的1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)-碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS),攪拌溶解;稱取100?mg?TMC溶于12?mL?TEMED/HCl緩沖液(pH?4.7);混合LA和TMC溶液,加1?mol/L?NaOH調pH至4.0,室溫攪拌24?h,4?°C超濾純化(MWCO?10?kDa),冷凍干燥,制得GT;稱取100?mg?GT和300?mg半胱氨酸鹽酸鹽(Cys)分別溶于12?mL和3?mL水,加10?mol/L?NaOH調節Cys溶液pH至2-3;混合GT和Cys溶液,加入終濃度分別為150?mM的EDC和NHS溶液,攪拌溶解;加1?mol/L?NaOH調pH至5.0,室溫避光攪拌5?h;以pH?5.0?HCl溶液4?°C透析3天(MWCO?3,500?Da),冷凍干燥,制得GTC。

實施例3半乳糖修飾的巰基化殼聚糖季銨鹽的制備

按照文獻報道方法(Eur?J?Pharm?Biopharm?2004,57:77-83)在甲基吡咯烷酮溶劑中合成TMC,殼聚糖分子量為200?kDa,反應時間分別為45?min、120min和180?min,所得TMC的季銨化度分別為15mol?%、30mol?%和60mol?%。Cl-型陰離子交換樹脂去除I-,冷凍干燥;稱取120?mg乳糖醛酸(LA)溶于3?mL?四甲基乙二胺(TEMED)/HCl緩沖液(pH?4.7),加入終濃度分別為80?mM的1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)-碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS),攪拌溶解;稱取100?mg?TMC溶于12?mL?TEMED/HCl緩沖液(pH?4.7);混合LA和TMC溶液,加1?mol/L?NaOH調pH至5.0,室溫攪拌72?h,4?°C超濾純化(MWCO?10?kDa),冷凍干燥,制得GT;稱取100?mg?GT和250?mg半胱氨酸鹽酸鹽(Cys)分別溶于12?mL和3?mL水,加10?mol/L?NaOH調節Cys溶液pH至2-3;混合GT和Cys溶液,加入終濃度分別為120?mM的EDC和NHS溶液,攪拌溶解;加1?mol/L?NaOH調pH至5.0,室溫避光攪拌5?h;以pH?5.0?HCl溶液4?°C透析3天(MWCO?3,500?Da),冷凍干燥,制得GTC。

實施例4半乳糖修飾的巰基化殼聚糖季銨鹽的制備

按照文獻報道方法(Eur?J?Pharm?Biopharm?2004,57:77-83)在甲基吡咯烷酮溶劑中合成TMC,殼聚糖分子量為500?kDa,反應時間分別為45?min、120min和180?min,所得TMC的季銨化度分別為15mol?%、30mol?%和60mol?%。Cl-型陰離子交換樹脂去除I-,冷凍干燥;稱取200?mg乳糖醛酸(LA)溶于3?mL?四甲基乙二胺(TEMED)/HCl緩沖液(pH?4.7),加入終濃度分別為150?mM的1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)-碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS),攪拌溶解;稱取100?mg?TMC溶于12?mL?TEMED/HCl緩沖液(pH?4.7);混合LA和TMC溶液,加1?mol/L?NaOH調pH至4.5,室溫攪拌48?h,4?°C超濾純化(MWCO?10?kDa),冷凍干燥,制得GT;稱取100?mg?GT和150?mg半胱氨酸鹽酸鹽(Cys)分別溶于12?mL和3?mL水,加10?mol/L?NaOH調節Cys溶液pH至2-3;混合GT和Cys溶液,加入終濃度分別為80?mM的EDC和NHS溶液,攪拌溶解;加1?mol/L?NaOH調pH至5.0,室溫避光攪拌8?h;以pH?5.0?HCl溶液4?°C透析3天(MWCO?3,500?Da),冷凍干燥,制得GTC。

實施例5半乳糖修飾的巰基化殼聚糖季銨鹽的制備

按照文獻報道方法(Eur?J?Pharm?Biopharm?2004,57:77-83)在甲基吡咯烷酮溶劑中合成TMC,殼聚糖分子量為1000?kDa,反應時間分別為45?min、120min和180?min,所得TMC的季銨化度分別為15mol?%、30mol?%和60mol?%。Cl-型陰離子交換樹脂去除I-,冷凍干燥;稱取300?mg乳糖醛酸(LA)溶于3?mL?四甲基乙二胺(TEMED)/HCl緩沖液(pH?4.7),加入終濃度分別為200?mM的1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)-碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS),攪拌溶解;稱取100?mg?TMC溶于12?mL?TEMED/HCl緩沖液(pH?4.7);混合LA和TMC溶液,加1?mol/L?NaOH調pH至4.5,室溫攪拌24?h,4?°C超濾純化(MWCO?10?kDa),冷凍干燥,制得GT;稱取100?mg?GT和100?mg半胱氨酸鹽酸鹽(Cys)分別溶于12?mL和3?mL水,加10?mol/L?NaOH調節Cys溶液pH至2-3;混合GT和Cys溶液,加入終濃度分別為50?mM的EDC和NHS溶液,攪拌溶解;加1?mol/L?NaOH調pH至5.0,室溫避光攪拌8?h;以pH?5.0?HCl溶液4?°C透析3天(MWCO?3,500?Da),冷凍干燥,制得GTC。

實施例6半乳糖修飾的巰基化殼聚糖季銨鹽的制備

按照文獻報道方法(Eur?J?Pharm?Biopharm?2004,57:77-83)在甲基吡咯烷酮溶劑中合成TMC,殼聚糖分子量為200?kDa,反應時間分別為45?min、120min和180?min,所得TMC的季銨化度分別為15mol?%、30mol?%和60mol?%。Cl-型陰離子交換樹脂去除I-,冷凍干燥;稱取20?mg乳糖醛酸(LA)溶于3?mL?四甲基乙二胺(TEMED)/HCl緩沖液(pH?4.7),加入終濃度分別為50?mM的1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)-碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS),攪拌溶解;稱取100?mg?TMC溶于12?mL?TEMED/HCl緩沖液(pH?4.7);混合LA和TMC溶液,加1?mol/L?NaOH調pH至4.5,室溫攪拌24?h,4?°C超濾純化(MWCO?10?kDa),冷凍干燥,制得GT;稱取100?mg?GT和250?mg半胱氨酸鹽酸鹽(Cys)分別溶于12?mL和3?mL水,加10?mol/L?NaOH調節Cys溶液pH至2-3;混合GT和Cys溶液,加入終濃度分別為120?mM的EDC和NHS溶液,攪拌溶解;加1?mol/L?NaOH調pH至5.0,室溫避光攪拌5?h;以pH?5.0?HCl溶液4?°C透析3天(MWCO?3,500?Da),冷凍干燥,制得GTC。

實施例7半乳糖修飾的巰基化殼聚糖季銨鹽的制備

按照文獻報道方法(Eur?J?Pharm?Biopharm?2004,57:77-83)在甲基吡咯烷酮溶劑中合成TMC,殼聚糖分子量為200?kDa,反應時間分別為45?min、120min和180?min,所得TMC的季銨化度分別為15mol?%、30mol?%和60mol?%。Cl-型陰離子交換樹脂去除I-,冷凍干燥;稱取50?mg乳糖醛酸(LA)溶于3?mL?四甲基乙二胺(TEMED)/HCl緩沖液(pH?4.7),加入終濃度分別為50?mM的1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)-碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS),攪拌溶解;稱取100?mg?TMC溶于12?mL?TEMED/HCl緩沖液(pH?4.7);混合LA和TMC溶液,加1?mol/L?NaOH調pH至4.5,室溫攪拌48?h,4?°C超濾純化(MWCO?10?kDa),冷凍干燥,制得GT;稱取100?mg?GT和250?mg半胱氨酸鹽酸鹽(Cys)分別溶于12?mL和3?mL水,加10?mol/L?NaOH調節Cys溶液pH至2-3;混合GT和Cys溶液,加入終濃度分別為120?mM的EDC和NHS溶液,攪拌溶解;加1?mol/L?NaOH調pH至5.0,室溫避光攪拌5?h;以pH?5.0?HCl溶液4?°C透析3天(MWCO?3,500?Da),冷凍干燥,制得GTC。

實施例8半乳糖修飾的巰基化殼聚糖季銨鹽的制備

按照文獻報道方法(Eur?J?Pharm?Biopharm?2004,57:77-83)在甲基吡咯烷酮溶劑中合成TMC,殼聚糖分子量為200?kDa,反應時間分別為45?min、120min和180?min,所得TMC的季銨化度分別為15mol?%、30mol?%和60mol?%。Cl-型陰離子交換樹脂去除I-,冷凍干燥;稱取200?mg乳糖醛酸(LA)溶于3?mL?四甲基乙二胺(TEMED)/HCl緩沖液(pH?4.7),加入終濃度分別為100?mM的1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)-碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS),攪拌溶解;稱取100?mg?TMC溶于12?mL?TEMED/HCl緩沖液(pH?4.7);混合LA和TMC溶液,加1?mol/L?NaOH調pH至4.5,室溫攪拌72?h,4?°C超濾純化(MWCO?10?kDa),冷凍干燥,制得GT;稱取100?mg?GT和250?mg半胱氨酸鹽酸鹽(Cys)分別溶于12?mL和3?mL水,加10?mol/L?NaOH調節Cys溶液pH至2-3;混合GT和Cys溶液,加入終濃度分別為120?mM的EDC和NHS溶液,攪拌溶解;加1?mol/L?NaOH調pH至3.0,室溫避光攪拌5?h;以pH?5.0?HCl溶液4?°C透析3天(MWCO?3,500?Da),冷凍干燥,制得GTC。

實施例9半乳糖修飾的巰基化殼聚糖季銨鹽的制備

按照文獻報道方法(Eur?J?Pharm?Biopharm?2004,57:77-83)在甲基吡咯烷酮溶劑中合成TMC,殼聚糖分子量為200?kDa,反應時間分別為45?min、120min和180?min,所得TMC的季銨化度分別為15mol?%、30mol?%和60mol?%。Cl-型陰離子交換樹脂去除I-,冷凍干燥;稱取300?mg乳糖醛酸(LA)溶于3?mL?四甲基乙二胺(TEMED)/HCl緩沖液(pH?4.7),加入終濃度分別為200?mM的1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)-碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS),攪拌溶解;稱取100?mg?TMC溶于12?mL?TEMED/HCl緩沖液(pH?4.7);混合LA和TMC溶液,加1?mol/L?NaOH調pH至4.5,室溫攪拌72?h,4?°C超濾純化(MWCO?10?kDa),冷凍干燥,制得GT;稱取100?mg?GT和250?mg半胱氨酸鹽酸鹽(Cys)分別溶于12?mL和3?mL水,加10?mol/L?NaOH調節Cys溶液pH至2-3;混合GT和Cys溶液,加入終濃度分別為120?mM的EDC和NHS溶液,攪拌溶解;加1?mol/L?NaOH調pH至5.0,室溫避光攪拌5?h;以pH?5.0?HCl溶液4?°C透析3天(MWCO?3,500?Da),冷凍干燥,制得GTC。

實施例10半乳糖修飾的巰基化殼聚糖季銨鹽的制備

按照文獻報道方法(Eur?J?Pharm?Biopharm?2004,57:77-83)在甲基吡咯烷酮溶劑中合成TMC,殼聚糖分子量為200?kDa,反應時間分別為45?min、120min和180?min,所得TMC的季銨化度分別為15mol?%、30mol?%和60mol?%。Cl-型陰離子交換樹脂去除I-,冷凍干燥;稱取120?mg乳糖醛酸(LA)溶于3?mL?四甲基乙二胺(TEMED)/HCl緩沖液(pH?4.7),加入終濃度分別為80?mM的1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)-碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS),攪拌溶解;稱取100?mg?TMC溶于12?mL?TEMED/HCl緩沖液(pH?4.7);混合LA和TMC溶液,加1?mol/L?NaOH調pH至4.5,室溫攪拌72?h,4?°C超濾純化(MWCO?10?kDa),冷凍干燥,制得GT;稱取100?mg?GT和100?mg半胱氨酸鹽酸鹽(Cys)分別溶于12?mL和3?mL水,加10?mol/L?NaOH調節Cys溶液pH至2-3;混合GT和Cys溶液,加入終濃度分別為50?mM的EDC和NHS溶液,攪拌溶解;加1?mol/L?NaOH調pH至4.5,室溫避光攪拌2?h;以pH?5.0?HCl溶液4?°C透析3天(MWCO?3,500?Da),冷凍干燥,制得GTC。

實施例11半乳糖修飾的巰基化殼聚糖季銨鹽的制備

按照文獻報道方法(Eur?J?Pharm?Biopharm?2004,57:77-83)在甲基吡咯烷酮溶劑中合成TMC,殼聚糖分子量為200?kDa,反應時間分別為45?min、120min和180?min,所得TMC的季銨化度分別為15mol?%、30mol?%和60mol?%。Cl-型陰離子交換樹脂去除I-,冷凍干燥;稱取120?mg乳糖醛酸(LA)溶于3?mL?四甲基乙二胺(TEMED)/HCl緩沖液(pH?4.7),加入終濃度分別為80?mM的1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)-碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS),攪拌溶解;稱取100?mg?TMC溶于12?mL?TEMED/HCl緩沖液(pH?4.7);混合LA和TMC溶液,加1?mol/L?NaOH調pH至4.5,室溫攪拌72?h,4?°C超濾純化(MWCO?10?kDa),冷凍干燥,制得GT;稱取100?mg?GT和150?mg半胱氨酸鹽酸鹽(Cys)分別溶于12?mL和3?mL水,加10?mol/L?NaOH調節Cys溶液pH至2-3;混合GT和Cys溶液,加入終濃度分別為100?mM的EDC和NHS溶液,攪拌溶解;加1?mol/L?NaOH調pH至4.0,室溫避光攪拌5?h;以pH?5.0?HCl溶液4?°C透析3天(MWCO?3,500?Da),冷凍干燥,制得GTC。

實施例12半乳糖修飾的巰基化殼聚糖季銨鹽的制備

按照文獻報道方法(Eur?J?Pharm?Biopharm?2004,57:77-83)在甲基吡咯烷酮溶劑中合成TMC,殼聚糖分子量為200?kDa,反應時間分別為45?min、120min和180?min,所得TMC的季銨化度分別為15mol?%、30mol?%和60mol?%。Cl-型陰離子交換樹脂去除I-,冷凍干燥;稱取120?mg乳糖醛酸(LA)溶于3?mL?四甲基乙二胺(TEMED)/HCl緩沖液(pH?4.7),加入終濃度分別為80?mM的1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)-碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS),攪拌溶解;稱取100?mg?TMC溶于12?mL?TEMED/HCl緩沖液(pH?4.7);混合LA和TMC溶液,加1?mol/L?NaOH調pH至4.5,室溫攪拌72?h,4?°C超濾純化(MWCO?10?kDa),冷凍干燥,制得GT;稱取100?mg?GT和300?mg半胱氨酸鹽酸鹽(Cys)分別溶于12?mL和3?mL水,加10?mol/L?NaOH調節Cys溶液pH至2-3;混合GT和Cys溶液,加入終濃度分別為150?mM的EDC和NHS溶液,攪拌溶解;加1?mol/L?NaOH調pH至3.0,室溫避光攪拌5?h;以pH?5.0?HCl溶液4?°C透析3天(MWCO?3,500?Da),冷凍干燥,制得GTC。

實施例13半乳糖修飾的巰基化殼聚糖季銨鹽的制備

按照文獻報道方法(Eur?J?Pharm?Biopharm?2004,57:77-83)在甲基吡咯烷酮溶劑中合成TMC,殼聚糖分子量為200?kDa,反應時間分別為45?min、120min和180?min,所得TMC的季銨化度分別為15mol?%、30mol?%和60mol?%。Cl-型陰離子交換樹脂去除I-,冷凍干燥;稱取120?mg乳糖醛酸(LA)溶于3?mL?四甲基乙二胺(TEMED)/HCl緩沖液(pH?4.7),加入終濃度分別為80?mM的1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)-碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS),攪拌溶解;稱取100?mg?TMC溶于12?mL?TEMED/HCl緩沖液(pH?4.7);混合LA和TMC溶液,加1?mol/L?NaOH調pH至4.5,室溫攪拌72?h,4?°C超濾純化(MWCO?10?kDa),冷凍干燥,制得GT;稱取100?mg?GT和400?mg半胱氨酸鹽酸鹽(Cys)分別溶于12?mL和3?mL水,加10?mol/L?NaOH調節Cys溶液pH至2-3;混合GT和Cys溶液,加入終濃度分別為200?mM的EDC和NHS溶液,攪拌溶解;加1?mol/L?NaOH調pH至4.0,室溫避光攪拌8?h;以pH?5.0?HCl溶液4?°C透析3天(MWCO?3,500?Da),冷凍干燥,制得GTC。

實施例14載尼妥珠單抗的半乳糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽納米粒的制備

實施例3的半乳糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽溶于水,濃度為2?mg/mL。三聚磷酸鈉(TPP)和尼妥珠單抗分別溶于水,濃度均為1?mg/mL,按TPP和尼妥珠單抗質量比為15:1混合。攪拌下將半乳糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽溶液滴加至TPP和尼妥珠單抗混合溶液中,半乳糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽與TPP的質量比為8:1。室溫靜置30?min,荷正電的半乳糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽與荷負電的TPP經聚電解質作用形成納米粒,同時包載尼妥珠單抗。

實施例15載尼妥珠單抗的半乳糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽納米粒的制備

實施例3的半乳糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽溶于水,濃度為2?mg/mL。三聚磷酸鈉(TPP)和尼妥珠單抗分別溶于水,濃度均為1?mg/mL,按TPP和尼妥珠單抗質量比為1:5混合。攪拌下將半乳糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽溶液滴加至TPP和尼妥珠單抗混合溶液中,半乳糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽與TPP的質量比為20:1。室溫靜置30?min,荷正電的半乳糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽與荷負電的TPP經聚電解質作用形成納米粒,同時包載尼妥珠單抗。

實施例16載尼妥珠單抗的半乳糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽納米粒的制備

實施例3的半乳糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽溶于水,濃度為2?mg/mL。透明質酸(HA)和尼妥珠單抗溶于水,濃度均為1?mg/mL,按HA和尼妥珠單抗質量比為25:1混合。攪拌下將半乳糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽溶液滴加至HA和尼妥珠單抗混合溶液中,半乳糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽與HA的質量比為5:1。室溫靜置30?min,荷正電的半乳糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽與荷負電的HA經聚電解質作用形成納米粒,同時包載尼妥珠單抗。

實施例17載尼妥珠單抗的半乳糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽納米粒的制備

實施例3的半乳糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽溶于水,濃度為2?mg/mL。γ-聚谷氨酸(γ-PGA)和尼妥珠單抗溶于水,濃度均為1?mg/mL,按γ-PGA和尼妥珠單抗質量比為15:1混合。攪拌下將半乳糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽溶液滴加至γ-PGA和尼妥珠單抗混合溶液中,半乳糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽與γ-PGA的質量比為10:1。室溫靜置30?min,荷正電的半乳糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽與荷負電的γ-PGA經聚電解質作用形成納米粒,同時包載尼妥珠單抗。

實施例18載尼妥珠單抗的半乳糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽納米粒的制備

實施例3的半乳糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽溶于水,濃度為2?mg/mL。丙烯酸樹脂溶于pH?8.0?NaOH后調節pH至中性,尼妥珠單抗溶于水,丙烯酸樹脂和尼妥珠單抗的濃度均為1?mg/mL,按丙烯酸樹脂和尼妥珠單抗質量比為25:1混合。攪拌下將半乳糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽溶液滴加至丙烯酸樹脂和尼妥珠單抗混合溶液中,半乳糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽與丙烯酸樹脂的質量比為1:1。室溫靜置30?min,荷正電的半乳糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽與荷負電的離子交聯劑經聚電解質作用形成納米粒,同時包載尼妥珠單抗。

實施例19載尼妥珠單抗的半乳糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽納米粒的制備

實施例3的半乳糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽溶于水,濃度為2?mg/mL。丙烯酸樹脂溶于pH?8.0?NaOH后調節pH至中性,尼妥珠單抗溶于水,丙烯酸樹脂和尼妥珠單抗的濃度均為1?mg/mL,按丙烯酸樹脂和尼妥珠單抗質量比為5:1混合。攪拌下將半乳糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽溶液滴加至丙烯酸樹脂和尼妥珠單抗混合溶液中,半乳糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽與丙烯酸樹脂的質量比為8:1。室溫靜置30?min,荷正電的半乳糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽與荷負電的離子交聯劑經聚電解質作用形成納米粒,同時包載尼妥珠單抗。

實施例20載尼妥珠單抗的半乳糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽納米粒的制備

實施例3的半乳糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽溶于水,濃度為2?mg/mL。三聚磷酸鈉(TPP)、透明質酸(HA)和尼妥珠單抗溶于水,TPP和HA的濃度均為1?mg/mL,尼妥珠單抗的濃度為0.2?mg/mL。按TPP/HA/尼妥珠單抗質量比為5:1:1混合。攪拌下將半乳糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽溶液滴加至離子交聯劑和尼妥珠單抗混合溶液中,半乳糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽與各離子交聯劑質量總和的質量比為20:1。室溫靜置30?min,荷正電的半乳糖修飾殼聚糖季銨鹽與荷負電的離子交聯劑經聚電解質作用形成納米粒,同時包載尼妥珠單抗。

實施例21載尼妥珠單抗的半乳糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽納米粒的制備

實施例3的半乳糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽溶于水,濃度為2?mg/mL。三聚磷酸鈉(TPP)、γ-聚谷氨酸(γ-PGA)和尼妥珠單抗溶于水,TPP和γ-PGA的濃度均為1?mg/mL,尼妥珠單抗的濃度為0.2?mg/mL。按TPP/γ-PGA/尼妥珠單抗質量比為5:1:1混合。攪拌下將半乳糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽溶液滴加至離子交聯劑和尼妥珠單抗混合溶液中,半乳糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽與各離子交聯劑質量總和的質量比為20:1。室溫靜置30?min,荷正電的半乳糖修飾殼聚糖季銨鹽與荷負電的離子交聯劑經聚電解質作用形成納米粒,同時包載尼妥珠單抗。

實施例22載尼妥珠單抗的半乳糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽納米粒的制備

實施例3的半乳糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽溶于水,濃度為2?mg/mL。三聚磷酸鈉(TPP)和尼妥珠單抗溶于水,丙烯酸樹脂溶于pH?8.0?NaOH后調節pH至中性,TPP和丙烯酸樹脂的濃度均為1?mg/mL,尼妥珠單抗的濃度為0.2?mg/mL。按TPP/丙烯酸樹脂/尼妥珠單抗質量比為5:1:1混合。攪拌下將半乳糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽溶液滴加至離子交聯劑和尼妥珠單抗混合溶液中,半乳糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽與各離子交聯劑質量總和的質量比為15:1。室溫靜置30?min,荷正電的半乳糖修飾殼聚糖季銨鹽與荷負電的離子交聯劑經聚電解質作用形成納米粒,同時包載尼妥珠單抗。

實施例23載尼妥珠單抗的半乳糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽納米粒的制備

實施例3的半乳糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽溶于水,濃度為2?mg/mL。三聚磷酸鈉(TPP)、透明質酸(HA)、γ-聚谷氨酸(γ-PGA)和尼妥珠單抗溶于水,TPP、HA和γ-PGA的濃度均為1?mg/mL,尼妥珠單抗的濃度為0.2?mg/mL。按TPP/HA/γ-PGA/尼妥珠單抗質量比為5:1:1:1混合。攪拌下將半乳糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽溶液滴加至離子交聯劑和尼妥珠單抗混合溶液中,半乳糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽與各離子交聯劑質量總和的質量比為15:1。室溫靜置30?min,荷正電的半乳糖修飾殼聚糖季銨鹽與荷負電的離子交聯劑經聚電解質作用形成納米粒,同時包載尼妥珠單抗。

實施例24載尼妥珠單抗的半乳糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽納米粒的制備

實施例3的半乳糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽溶于水,濃度為2?mg/mL。三聚磷酸鈉(TPP)、透明質酸(HA)和尼妥珠單抗溶于水,丙烯酸樹脂溶于pH?8.0?NaOH后調節pH至中性,TPP、HA和丙烯酸樹脂的濃度均為1?mg/mL,尼妥珠單抗的濃度為0.2?mg/mL。按TPP/HA/丙烯酸樹脂/尼妥珠單抗質量比為5:1:1:1混合。攪拌下將半乳糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽溶液滴加至離子交聯劑和尼妥珠單抗混合溶液中,半乳糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽與各離子交聯劑質量總和的質量比為5:1。室溫靜置30?min,荷正電的半乳糖修飾殼聚糖季銨鹽與荷負電的離子交聯劑經聚電解質作用形成納米粒,同時包載尼妥珠單抗。

實施例25載尼妥珠單抗的半乳糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽納米粒的制備

實施例3的半乳糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽溶于水,濃度為2?mg/mL。三聚磷酸鈉(TPP)、γ-聚谷氨酸(γ-PGA)和尼妥珠單抗溶于水,丙烯酸樹脂溶于pH?8.0?NaOH后調節pH至中性,TPP、γ-PGA和丙烯酸樹脂的濃度均為1?mg/mL,尼妥珠單抗的濃度為0.2?mg/mL。按TPP/γ-PGA/丙烯酸樹脂/尼妥珠單抗質量比為5:1:1:1混合。攪拌下將半乳糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽溶液滴加至離子交聯劑和尼妥珠單抗混合溶液中,半乳糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽與各離子交聯劑質量總和的質量比為5:1。室溫靜置30?min,荷正電的半乳糖修飾殼聚糖季銨鹽與荷負電的離子交聯劑經聚電解質作用形成納米粒,同時包載尼妥珠單抗。

實施例26載尼妥珠單抗的半乳糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽納米粒的制備

實施例3的半乳糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽溶于水,濃度為2?mg/mL。三聚磷酸鈉(TPP)、透明質酸(HA)、γ-聚谷氨酸(γ-PGA)和尼妥珠單抗溶于水,丙烯酸樹脂溶于pH?8.0?NaOH后調節pH至中性,TPP、HA、γ-PGA和丙烯酸樹脂的濃度均為1?mg/mL,尼妥珠單抗的濃度為0.2?mg/mL。按TPP/HA/γ-PGA/丙烯酸樹脂/尼妥珠單抗質量比為5:1:1:1:1混合。攪拌下將半乳糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽溶液滴加至離子交聯劑和尼妥珠單抗混合溶液中,半乳糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽與各離子交聯劑質量總和的質量比為10:1。室溫靜置30?min,荷正電的半乳糖修飾殼聚糖季銨鹽與荷負電的離子交聯劑經聚電解質作用形成納米粒,同時包載尼妥珠單抗。

實施例27載胰島素的半乳糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽納米粒的制備

實施例3的半乳糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽溶于水,濃度為2?mg/mL。三聚磷酸鈉(TPP)溶于水,胰島素溶于pH?2.0?HCl中并調節pH至7.0,TPP和胰島素溶液濃度均為1?mg/mL,按TPP和胰島素質量比為20:1混合。攪拌下將半乳糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽溶液滴加至TPP和胰島素混合溶液中,半乳糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽與TPP的質量比為10:1。室溫靜置30?min,荷正電的半乳糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽與荷負電的TPP經聚電解質作用形成納米粒,同時包載胰島素。

實施例28載胰島素的半乳糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽納米粒的制備

實施例3的半乳糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽溶于水,濃度為2?mg/mL。透明質酸(HA)溶于水,胰島素溶于pH?2.0?HCl中并調節pH至7.0,HA和胰島素溶液濃度均為1?mg/mL,按HA和胰島素質量比為10:1混合。攪拌下將半乳糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽溶液滴加至HA和胰島素混合溶液中,半乳糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽與HA的質量比為5:1。室溫靜置30?min,荷正電的半乳糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽與荷負電的HA經聚電解質作用形成納米粒,同時包載胰島素。

實施例29載胰島素的半乳糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽納米粒的制備

實施例3的半乳糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽溶于水,濃度為2?mg/mL,丙烯酸樹脂溶于pH?8.0?NaOH后調節pH至中性,胰島素溶于pH?2.0?HCl中并調節pH至7.0,丙烯酸樹脂和胰島素溶液的濃度均為1?mg/mL,按丙烯酸樹脂和胰島素質量比為15:1混合。攪拌下將半乳糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽溶液滴加至丙烯酸樹脂和胰島素混合溶液中,半乳糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽與丙烯酸樹脂的質量比為8:1。室溫靜置30?min,荷正電的半乳糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽與荷負電的丙烯酸樹脂經聚電解質作用形成納米粒,同時包載胰島素。

實施例30載胰島素的半乳糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽納米粒的制備

實施例3的半乳糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽溶于水,濃度為2?mg/mL。三聚磷酸鈉(TPP)、透明質酸(HA)、γ-聚谷氨酸(γ-PGA)溶于水,胰島素溶于pH?2.0?HCl中并調節pH至7.0,丙烯酸樹脂溶于pH?8.0?NaOH后調節pH至中性,TPP、HA、γ-PGA和丙烯酸樹脂的濃度均為1?mg/mL,胰島素的濃度為0.2?mg/mL。按TPP/HA/γ-PGA/丙烯酸樹脂/胰島素質量比為1:1:1:1:5混合。攪拌下將半乳糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽溶液滴加至離子交聯劑和胰島素混合溶液中,半乳糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽與各離子交聯劑質量總和的質量比為1:1。室溫靜置30?min,荷正電的半乳糖修飾殼聚糖季銨鹽與荷負電的離子交聯劑經聚電解質作用形成納米粒,同時包載胰島素。

實施例31載胰島素的半乳糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽納米粒的制備

實施例3的半乳糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽溶于水,濃度為2?mg/mL。三聚磷酸鈉(TPP)、透明質酸(HA)溶于水,胰島素溶于pH?2.0?HCl中并調節pH至7.0,TPP和HA的濃度均為1?mg/mL,胰島素的濃度為0.2?mg/mL。按TPP/HA/胰島素質量比為1:5:1混合。攪拌下將半乳糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽溶液滴加至離子交聯劑和胰島素混合溶液中,半乳糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽與各離子交聯劑質量總和的質量比為15:1。室溫靜置30?min,荷正電的半乳糖修飾殼聚糖季銨鹽與荷負電的離子交聯劑經聚電解質作用形成納米粒,同時包載胰島素。

實施例32載胰島素的半乳糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽納米粒的制備

實施例3的半乳糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽溶于水,濃度為2?mg/mL。三聚磷酸鈉(TPP)、透明質酸(HA)溶于水,胰島素溶于pH?2.0?HCl中并調節pH至7.0,丙烯酸樹脂溶于pH?8.0?NaOH后調節pH至中性,TPP、HA和丙烯酸樹脂的濃度均為1?mg/mL,胰島素的濃度為0.2?mg/mL。按TPP/HA/丙烯酸樹脂/胰島素質量比為5:1:1:1混合。攪拌下將半乳糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽溶液滴加至離子交聯劑和胰島素混合溶液中,半乳糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽與各離子交聯劑質量總和的質量比為20:1。室溫靜置30?min,荷正電的半乳糖修飾殼聚糖季銨鹽與荷負電的離子交聯劑經聚電解質作用形成納米粒,同時包載胰島素。

實施例33載siRNA的半乳糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽納米粒的制備

實施例3的半乳糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽溶于水,濃度為2?mg/mL。三聚磷酸鈉(TPP)和siRNA分別溶于水,TPP濃度為1?mg/mL,siRNA濃度為0.2?mg/mL,按TPP和siRNA質量比為25:1混合。攪拌下將半乳糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽溶液滴加至TPP和siRNA混合溶液中,半乳糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽與TPP的質量比為5:1。室溫靜置30?min,荷正電的半乳糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽與荷負電的TPP經聚電解質作用形成納米粒,同時包載siRNA。

實施例34載siRNA的半乳糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽納米粒的制備

實施例3的半乳糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽溶于水,濃度為4?mg/mL。三聚磷酸鈉(TPP)和siRNA分別溶于水,TPP濃度為1?mg/mL,siRNA濃度為0.2?mg/mL,按TPP和siRNA質量比為18:1混合。攪拌下將半乳糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽溶液滴加至TPP和siRNA混合溶液中,半乳糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽與TPP的質量比為8:1。室溫靜置30?min,荷正電的半乳糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽與荷負電的TPP經聚電解質作用形成納米粒,同時包載siRNA。

實施例35載siRNA的半乳糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽納米粒的制備

實施例3的半乳糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽溶于水,濃度為6?mg/mL。透明質酸(HA)和siRNA分別溶于水,HA濃度為1?mg/mL,siRNA濃度為0.2?mg/mL,按HA和siRNA質量比為25:1混合。攪拌下將半乳糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽溶液滴加至HA和siRNA混合溶液中,半乳糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽與HA的質量比為1:1。室溫靜置30?min,荷正電的半乳糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽與荷負電的HA經聚電解質作用形成納米粒,同時包載siRNA。

實施例36載siRNA的半乳糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽納米粒的制備

實施例3的半乳糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽溶于水,濃度為6?mg/mL。透明質酸(HA)和siRNA分別溶于水,HA濃度為1?mg/mL,siRNA濃度為0.2?mg/mL,按HA和siRNA質量比為15:1混合。攪拌下將半乳糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽溶液滴加至HA和siRNA混合溶液中,半乳糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽與HA的質量比為5:1。室溫靜置30?min,荷正電的半乳糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽與荷負電的HA經聚電解質作用形成納米粒,同時包載siRNA。

實施例37載siRNA的半乳糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽納米粒的制備

實施例3的半乳糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽溶于水,濃度為4?mg/mL。γ-聚谷氨酸(γ-PGA)和siRNA分別溶于水,γ-PGA濃度為1?mg/mL,siRNA濃度為0.2?mg/mL,按γ-PGA和siRNA質量比為10:1混合。攪拌下將半乳糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽溶液滴加至γ-PGA和siRNA混合溶液中,半乳糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽與γ-PGA的質量比為8:1。室溫靜置30?min,荷正電的半乳糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽與荷負電的γ-PGA經聚電解質作用形成納米粒,同時包載siRNA。

實施例38載siRNA的半乳糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽納米粒的制備

實施例3的半乳糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽溶于水,濃度為4?mg/mL。γ-聚谷氨酸(γ-PGA)和siRNA分別溶于水,γ-PGA濃度為1?mg/mL,siRNA濃度為0.2?mg/mL,按γ-PGA和siRNA質量比為1:5混合。攪拌下將半乳糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽溶液滴加至γ-PGA和siRNA混合溶液中,半乳糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽與γ-PGA的質量比為20:1。室溫靜置30?min,荷正電的半乳糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽與荷負電的γ-PGA經聚電解質作用形成納米粒,同時包載siRNA。

實施例39載siRNA的半乳糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽納米粒的制備

實施例3的半乳糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽溶于水,濃度為2?mg/mL。丙烯酸樹脂溶于pH?8.0?NaOH后調節pH至中性,siRNA溶于水,丙烯酸樹脂和siRNA的濃度分別為?1?mg/mL和0.2?mg/mL,按丙烯酸樹脂和siRNA質量比為5:1混合。攪拌下將半乳糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽溶液滴加至丙烯酸樹脂和siRNA混合溶液中,半乳糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽與丙烯酸樹脂的質量比為8:1。室溫靜置30?min,荷正電的半乳糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽與荷負電的離子交聯劑經聚電解質作用形成納米粒,同時包載siRNA。

實施例40載siRNA的半乳糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽納米粒的制備

實施例3的半乳糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽溶于水,濃度為2?mg/mL。三聚磷酸鈉(TPP)、透明質酸(HA)和siRNA溶于水,TPP和HA的濃度均為1?mg/mL,siRNA的濃度為0.2?mg/mL。按TPP/HA/siRNA質量比為5:1:1混合。攪拌下將半乳糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽溶液滴加至離子交聯劑和siRNA混合溶液中,半乳糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽與各離子交聯劑質量總和的質量比為20:1。室溫靜置30?min,荷正電的半乳糖修飾殼聚糖季銨鹽與荷負電的離子交聯劑經聚電解質作用形成納米粒,同時包載siRNA。

實施例41載siRNA的半乳糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽納米粒的制備

實施例3的半乳糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽溶于水,濃度為2?mg/mL。三聚磷酸鈉(TPP)、γ-聚谷氨酸(γ-PGA)和siRNA溶于水,TPP和γ-PGA的濃度均為1?mg/mL,siRNA的濃度為0.2?mg/mL。按TPP/γ-PGA/siRNA質量比為5:1:1混合。攪拌下將半乳糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽溶液滴加至離子交聯劑和siRNA混合溶液中,半乳糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽與各離子交聯劑質量總和的質量比為15:1。室溫靜置30?min,荷正電的半乳糖修飾殼聚糖季銨鹽與荷負電的離子交聯劑經聚電解質作用形成納米粒,同時包載siRNA。

實施例42載siRNA的半乳糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽納米粒的制備

實施例3的半乳糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽溶于水,濃度為2?mg/mL。三聚磷酸鈉(TPP)、γ-聚谷氨酸(γ-PGA)和siRNA溶于水,TPP和γ-PGA的濃度均為1?mg/mL,siRNA的濃度為0.2?mg/mL。按TPP/γ-PGA/siRNA質量比為1:5:1混合。攪拌下將半乳糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽溶液滴加至離子交聯劑和siRNA混合溶液中,半乳糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽與各離子交聯劑質量總和的質量比為10:1。室溫靜置30?min,荷正電的半乳糖修飾殼聚糖季銨鹽與荷負電的離子交聯劑經聚電解質作用形成納米粒,同時包載siRNA。

實施例43載siRNA的半乳糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽納米粒的制備

實施例3的半乳糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽溶于水,濃度為2?mg/mL。三聚磷酸鈉(TPP)和siRNA溶于水,丙烯酸樹脂溶于pH?8.0?NaOH后調節pH至中性,TPP和丙烯酸樹脂的濃度均為1?mg/mL,siRNA的濃度為0.2?mg/mL。按TPP/丙烯酸樹脂/siRNA質量比為5:1:1混合。攪拌下將半乳糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽溶液滴加至離子交聯劑和siRNA混合溶液中,半乳糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽與各離子交聯劑質量總和的質量比為20:1。室溫靜置30?min,荷正電的半乳糖修飾殼聚糖季銨鹽與荷負電的離子交聯劑經聚電解質作用形成納米粒,同時包載siRNA。

實施例44載siRNA的半乳糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽納米粒的制備

實施例3的半乳糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽溶于水,濃度為2?mg/mL。三聚磷酸鈉(TPP)和siRNA溶于水,丙烯酸樹脂溶于pH?8.0?NaOH后調節pH至中性,TPP和丙烯酸樹脂的濃度均為1?mg/mL,siRNA的濃度為0.2?mg/mL。按TPP/丙烯酸樹脂/siRNA質量比為1:5:1混合。攪拌下將半乳糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽溶液滴加至離子交聯劑和siRNA混合溶液中,半乳糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽與各離子交聯劑質量總和的質量比為10:1。室溫靜置30?min,荷正電的半乳糖修飾殼聚糖季銨鹽與荷負電的離子交聯劑經聚電解質作用形成納米粒,同時包載siRNA。

實施例45載siRNA的半乳糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽納米粒的制備

實施例3的半乳糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽溶于水,濃度為2?mg/mL。三聚磷酸鈉(TPP)、透明質酸(HA)、γ-聚谷氨酸(γ-PGA)和siRNA溶于水,TPP、HA和γ-PGA的濃度均為1?mg/mL,siRNA的濃度為0.2?mg/mL。按TPP/HA/γ-PGA/siRNA質量比為5:1:1:1混合。攪拌下將半乳糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽溶液滴加至離子交聯劑和siRNA混合溶液中,半乳糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽與各離子交聯劑質量總和的質量比為20:1。室溫靜置30?min,荷正電的半乳糖修飾殼聚糖季銨鹽與荷負電的離子交聯劑經聚電解質作用形成納米粒,同時包載siRNA。

實施例46載siRNA的半乳糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽納米粒的制備

實施例3的半乳糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽溶于水,濃度為2?mg/mL。三聚磷酸鈉(TPP)、透明質酸(HA)和siRNA溶于水,丙烯酸樹脂溶于pH?8.0?NaOH后調節pH至中性,TPP、HA和丙烯酸樹脂的濃度均為1?mg/mL,siRNA的濃度為0.2?mg/mL。按TPP/HA/丙烯酸樹脂/siRNA質量比為5:1:1:1混合。攪拌下將半乳糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽溶液滴加至離子交聯劑和siRNA混合溶液中,半乳糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽與各離子交聯劑質量總和的質量比為20:1。室溫靜置30?min,荷正電的半乳糖修飾殼聚糖季銨鹽與荷負電的離子交聯劑經聚電解質作用形成納米粒,同時包載siRNA。

實施例47載siRNA的半乳糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽納米粒的制備

實施例3的半乳糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽溶于水,濃度為2?mg/mL。三聚磷酸鈉(TPP)、γ-聚谷氨酸(γ-PGA)和siRNA溶于水,丙烯酸樹脂溶于pH?8.0?NaOH后調節pH至中性,TPP、γ-PGA和丙烯酸樹脂的濃度均為1?mg/mL,siRNA的濃度為0.2?mg/mL。按TPP/γ-PGA/丙烯酸樹脂/siRNA質量比為5:1:1:1混合。攪拌下將半乳糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽溶液滴加至離子交聯劑和siRNA混合溶液中,半乳糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽與各離子交聯劑質量總和的質量比為20:1。室溫靜置30?min,荷正電的半乳糖修飾殼聚糖季銨鹽與荷負電的離子交聯劑經聚電解質作用形成納米粒,同時包載siRNA。

實施例48載siRNA的半乳糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽納米粒的制備

實施例3的半乳糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽溶于水,濃度為2?mg/mL。三聚磷酸鈉(TPP)、透明質酸(HA)、γ-聚谷氨酸(γ-PGA)和siRNA溶于水,丙烯酸樹脂溶于pH?8.0?NaOH后調節pH至中性,TPP、HA、γ-PGA和丙烯酸樹脂的濃度均為1?mg/mL,siRNA的濃度為0.2?mg/mL。按TPP/HA/γ-PGA/丙烯酸樹脂/siRNA質量比為5:1:1:1:1混合。攪拌下將半乳糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽溶液滴加至離子交聯劑和siRNA混合溶液中,半乳糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽與各離子交聯劑質量總和的質量比為20:1。室溫靜置30?min,荷正電的半乳糖修飾殼聚糖季銨鹽與荷負電的離子交聯劑經聚電解質作用形成納米粒,同時包載siRNA。

實施例49載pDNA的半乳糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽納米粒的制備

實施例3的半乳糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽溶于水,濃度為2?mg/mL。三聚磷酸鈉(TPP)和pDNA分別溶于水,TPP濃度為1?mg/mL,pDNA濃度為0.2?mg/mL,按TPP和pDNA質量比為5:1混合。攪拌下將半乳糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽溶液滴加至TPP和pDNA混合溶液中,半乳糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽與TPP的質量比為20:1。室溫靜置30?min,荷正電的半乳糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽與荷負電的TPP經聚電解質作用形成納米粒,同時包載pDNA。

實施例50載pDNA的半乳糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽納米粒的制備

實施例3的半乳糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽溶于水,濃度為2?mg/mL。三聚磷酸鈉(TPP)和pDNA分別溶于水,TPP濃度為1?mg/mL,pDNA濃度為0.2?mg/mL,按TPP和pDNA質量比為1:5混合。攪拌下將半乳糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽溶液滴加至TPP和pDNA混合溶液中,半乳糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽與TPP的質量比為20:1。室溫靜置30?min,荷正電的半乳糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽與荷負電的TPP經聚電解質作用形成納米粒,同時包載pDNA。

實施例51載pDNA的半乳糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽納米粒的制備

實施例3的半乳糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽溶于水,濃度為2?mg/mL。透明質酸(HA)和pDNA分別溶于水,HA濃度為1?mg/mL,pDNA濃度為0.2?mg/mL,按HA和pDNA質量比為25:1混合。攪拌下將半乳糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽溶液滴加至HA和pDNA混合溶液中,半乳糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽與HA的質量比為1:1。室溫靜置30?min,荷正電的半乳糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽與荷負電的HA經聚電解質作用形成納米粒,同時包載pDNA。

實施例52載pDNA的半乳糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽納米粒的制備

實施例3的半乳糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽溶于水,濃度為2?mg/mL。透明質酸(HA)和pDNA分別溶于水,HA濃度為1?mg/mL,pDNA濃度為0.2?mg/mL,按HA和pDNA質量比為5:1混合。攪拌下將半乳糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽溶液滴加至HA和pDNA混合溶液中,半乳糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽與HA的質量比為10:1。室溫靜置30?min,荷正電的半乳糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽與荷負電的HA經聚電解質作用形成納米粒,同時包載pDNA。

實施例53載pDNA的半乳糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽納米粒的制備

實施例3的半乳糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽溶于水,濃度為2?mg/mL。γ-聚谷氨酸(γ-PGA)和pDNA分別溶于水,γ-PGA濃度為1?mg/mL,pDNA濃度為0.2?mg/mL,按γ-PGA和pDNA質量比為5:1混合。攪拌下將半乳糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽溶液滴加至γ-PGA和pDNA混合溶液中,半乳糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽與γ-PGA的質量比為10:1。室溫靜置30?min,荷正電的半乳糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽與荷負電的γ-PGA經聚電解質作用形成納米粒,同時包載pDNA。

實施例54載pDNA的半乳糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽納米粒的制備

實施例3的半乳糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽溶于水,濃度為2?mg/mL。丙烯酸樹脂溶于pH?8.0?NaOH后調節pH至中性,pDNA溶于水,丙烯酸樹脂和pDNA的濃度分別為?1?mg/mL和0.2?mg/mL,按丙烯酸樹脂和pDNA質量比為5:1混合。攪拌下將半乳糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽溶液滴加至丙烯酸樹脂和pDNA混合溶液中,半乳糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽與丙烯酸樹脂的質量比為10:1。室溫靜置30?min,荷正電的半乳糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽與荷負電的離子交聯劑經聚電解質作用形成納米粒,同時包載pDNA。

實施例55載pDNA的半乳糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽納米粒的制備

實施例3的半乳糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽溶于水,濃度為2?mg/mL。三聚磷酸鈉(TPP)、透明質酸(HA)和pDNA溶于水,TPP和HA的濃度均為1?mg/mL,pDNA的濃度為0.2?mg/mL。按TPP/HA/pDNA質量比為5:1:1混合。攪拌下將半乳糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽溶液滴加至離子交聯劑和pDNA混合溶液中,半乳糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽與各離子交聯劑質量總和的質量比為20:1。室溫靜置30?min,荷正電的半乳糖修飾殼聚糖季銨鹽與荷負電的離子交聯劑經聚電解質作用形成納米粒,同時包載pDNA。

實施例56載pDNA的半乳糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽納米粒的制備

實施例3的半乳糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽溶于水,濃度為2?mg/mL。三聚磷酸鈉(TPP)、γ-聚谷氨酸(γ-PGA)和pDNA溶于水,TPP和γ-PGA的濃度均為1?mg/mL,pDNA的濃度為0.2?mg/mL。按TPP/γ-PGA/pDNA質量比為5:1:1混合。攪拌下將半乳糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽溶液滴加至離子交聯劑和pDNA混合溶液中,半乳糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽與各離子交聯劑質量總和的質量比為20:1。室溫靜置30?min,荷正電的半乳糖修飾殼聚糖季銨鹽與荷負電的離子交聯劑經聚電解質作用形成納米粒,同時包載pDNA。

實施例57載pDNA的半乳糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽納米粒的制備

實施例3的半乳糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽溶于水,濃度為2?mg/mL。三聚磷酸鈉(TPP)和pDNA溶于水,丙烯酸樹脂溶于pH?8.0?NaOH后調節pH至中性,TPP和丙烯酸樹脂的濃度均為1?mg/mL,pDNA的濃度為0.2?mg/mL。按TPP/丙烯酸樹脂/pDNA質量比為5:1:1混合。攪拌下將半乳糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽溶液滴加至離子交聯劑和pDNA混合溶液中,半乳糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽與各離子交聯劑質量總和的質量比為20:1。室溫靜置30?min,荷正電的半乳糖修飾殼聚糖季銨鹽與荷負電的離子交聯劑經聚電解質作用形成納米粒,同時包載pDNA。

實施例58載pDNA的半乳糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽納米粒的制備

實施例3的半乳糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽溶于水,濃度為2?mg/mL。三聚磷酸鈉(TPP)、透明質酸(HA)、γ-聚谷氨酸(γ-PGA)和pDNA溶于水,TPP、HA和γ-PGA的濃度均為1?mg/mL,pDNA的濃度為0.2?mg/mL。按TPP/HA/γ-PGA/pDNA質量比為5:1:1:1混合。攪拌下將半乳糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽溶液滴加至離子交聯劑和pDNA混合溶液中,半乳糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽與各離子交聯劑質量總和的質量比為20:1。室溫靜置30?min,荷正電的半乳糖修飾殼聚糖季銨鹽與荷負電的離子交聯劑經聚電解質作用形成納米粒,同時包載pDNA。

實施例59載pDNA的半乳糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽納米粒的制備

實施例3的半乳糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽溶于水,濃度為2?mg/mL。三聚磷酸鈉(TPP)、透明質酸(HA)和pDNA溶于水,丙烯酸樹脂溶于pH?8.0?NaOH后調節pH至中性,TPP、HA和丙烯酸樹脂的濃度均為1?mg/mL,pDNA的濃度為0.2?mg/mL。按TPP/HA/丙烯酸樹脂/pDNA質量比為5:1:1:1混合。攪拌下將半乳糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽溶液滴加至離子交聯劑和pDNA混合溶液中,半乳糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽與各離子交聯劑質量總和的質量比為20:1。室溫靜置30?min,荷正電的半乳糖修飾殼聚糖季銨鹽與荷負電的離子交聯劑經聚電解質作用形成納米粒,同時包載pDNA。

實施例60載pDNA的半乳糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽納米粒的制備

實施例3的半乳糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽溶于水,濃度為2?mg/mL。三聚磷酸鈉(TPP)、γ-聚谷氨酸(γ-PGA)和pDNA溶于水,丙烯酸樹脂溶于pH?8.0?NaOH后調節pH至中性,TPP、γ-PGA和丙烯酸樹脂的濃度均為1?mg/mL,pDNA的濃度為0.2?mg/mL。按TPP/γ-PGA/丙烯酸樹脂/pDNA質量比為5:1:1:1混合。攪拌下將半乳糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽溶液滴加至離子交聯劑和pDNA混合溶液中,半乳糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽與各離子交聯劑質量總和的質量比為20:1。室溫靜置30?min,荷正電的半乳糖修飾殼聚糖季銨鹽與荷負電的離子交聯劑經聚電解質作用形成納米粒,同時包載pDNA。

實施例61載pDNA的半乳糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽納米粒的制備

實施例3的半乳糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽溶于水,濃度為2?mg/mL。三聚磷酸鈉(TPP)、透明質酸(HA)、γ-聚谷氨酸(γ-PGA)和pDNA溶于水,丙烯酸樹脂溶于pH?8.0?NaOH后調節pH至中性,TPP、HA、γ-PGA和丙烯酸樹脂的濃度均為1?mg/mL,pDNA的濃度為0.2?mg/mL。按TPP/HA/γ-PGA/丙烯酸樹脂/pDNA質量比為5:1:1:1:1混合。攪拌下將半乳糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽溶液滴加至離子交聯劑和pDNA混合溶液中,半乳糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽與各離子交聯劑質量總和的質量比為20:1。室溫靜置30?min,荷正電的半乳糖修飾殼聚糖季銨鹽與荷負電的離子交聯劑經聚電解質作用形成納米粒,同時包載pDNA。

實施例62同時包載尼妥珠單抗和siRNA的半乳糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽納米粒的制備

實施例3的半乳糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽溶于水,濃度為2?mg/mL。三聚磷酸鈉(TPP)、尼妥珠單抗和siRNA溶于水,TPP濃度為1?mg/mL,尼妥珠單抗和siRNA濃度均為0.2?mg/mL。按TPP/尼妥珠單抗/siRNA質量比為5:1:1混合。攪拌下將半乳糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽溶液滴加至離子交聯劑和藥物混合溶液中,半乳糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽與交聯劑的質量比為1:1。室溫靜置30?min,荷正電的半乳糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽與荷負電的交聯劑經聚電解質作用形成納米粒。

實施例63同時包載尼妥珠單抗和siRNA的半乳糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽納米粒的制備

實施例3的半乳糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽溶于水,濃度為2?mg/mL。三聚磷酸鈉(TPP)、尼妥珠單抗和siRNA溶于水,TPP濃度為1?mg/mL,尼妥珠單抗和siRNA濃度均為0.2?mg/mL。按TPP/尼妥珠單抗/siRNA質量比為5:1:1混合。攪拌下將半乳糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽溶液滴加至離子交聯劑和藥物混合溶液中,半乳糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽與交聯劑的質量比為10:1。室溫靜置30?min,荷正電的半乳糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽與荷負電的交聯劑經聚電解質作用形成納米粒。

實施例64同時包載尼妥珠單抗和siRNA的半乳糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽納米粒的制備

實施例3的半乳糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽溶于水,濃度為2?mg/mL。三聚磷酸鈉(TPP)、尼妥珠單抗和siRNA溶于水,TPP濃度為1?mg/mL,尼妥珠單抗和siRNA濃度均為0.2?mg/mL。按TPP/尼妥珠單抗/siRNA質量比為5:1:1混合。攪拌下將半乳糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽溶液滴加至離子交聯劑和藥物混合溶液中,半乳糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽與交聯劑的質量比為20:1。室溫靜置30?min,荷正電的半乳糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽與荷負電的交聯劑經聚電解質作用形成納米粒。

實施例65同時包載尼妥珠單抗和pDNA的半乳糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽納米粒的制備

實施例3的半乳糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽溶于水,濃度為2?mg/mL。三聚磷酸鈉(TPP)、尼妥珠單抗和pDNA溶于水,TPP濃度為1?mg/mL,尼妥珠單抗和pDNA濃度均為0.2?mg/mL。按TPP/尼妥珠單抗/pDNA質量比為5:1:1混合。攪拌下將半乳糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽溶液滴加至離子交聯劑和藥物混合溶液中,半乳糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽與交聯劑的質量比為1:1。室溫靜置30?min,荷正電的半乳糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽與荷負電的交聯劑經聚電解質作用形成納米粒。

實施例66??同時包載尼妥珠單抗和pDNA的半乳糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽納米粒的制備

實施例3的半乳糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽溶于水,濃度為2?mg/mL。三聚磷酸鈉(TPP)、尼妥珠單抗和pDNA溶于水,TPP濃度為1?mg/mL,尼妥珠單抗和pDNA濃度均為0.2?mg/mL。按TPP/尼妥珠單抗/pDNA質量比為5:1:1混合。攪拌下將半乳糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽溶液滴加至離子交聯劑和藥物混合溶液中,半乳糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽與交聯劑的質量比為10:1。室溫靜置30?min,荷正電的半乳糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽與荷負電的交聯劑經聚電解質作用形成納米粒。

實施例67??同時包載尼妥珠單抗和pDNA的半乳糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽納米粒的制備

實施例3的半乳糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽溶于水,濃度為2?mg/mL。三聚磷酸鈉(TPP)、尼妥珠單抗和pDNA溶于水,TPP濃度為1?mg/mL,尼妥珠單抗和pDNA濃度均為0.2?mg/mL。按TPP/尼妥珠單抗/pDNA質量比為5:1:1混合。攪拌下將半乳糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽溶液滴加至離子交聯劑和藥物混合溶液中,半乳糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽與交聯劑的質量比為20:1。室溫靜置30?min,荷正電的半乳糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽與荷負電的交聯劑經聚電解質作用形成納米粒。

實施例68??同時包載pDNA和siRNA的半乳糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽納米粒的制備

實施例3的半乳糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽溶于水,濃度為2?mg/mL。pDNA和siRNA溶于水,濃度均為0.2?mg/mL。按pDNA和siRNA質量比為5:1混合。攪拌下將半乳糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽溶液滴加至離子交聯劑和藥物混合溶液中,半乳糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽與藥物的質量比為1:1。室溫靜置30?min,荷正電的半乳糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽與荷負電的藥物經聚電解質作用形成納米粒。

實施例69??同時包載pDNA和siRNA的半乳糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽納米粒的制備

實施例3的半乳糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽溶于水,濃度為2?mg/mL。pDNA和siRNA溶于水,濃度均為0.2?mg/mL。按pDNA和siRNA質量比為5:1混合。攪拌下將半乳糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽溶液滴加至離子交聯劑和藥物混合溶液中,半乳糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽與藥物的質量比為10:1。室溫靜置30?min,荷正電的半乳糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽與荷負電的藥物經聚電解質作用形成納米粒。

實施例70??同時包載pDNA和siRNA的半乳糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽納米粒的制備

實施例3的半乳糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽溶于水,濃度為2?mg/mL。pDNA和siRNA溶于水,濃度均為0.2?mg/mL。按pDNA和siRNA質量比為5:1混合。攪拌下將半乳糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽溶液滴加至離子交聯劑和藥物混合溶液中,半乳糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽與藥物的質量比為20:1。室溫靜置30?min,荷正電的半乳糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽與荷負電的藥物經聚電解質作用形成納米粒。

實施例71??半乳糖修飾殼聚糖季銨鹽的半乳糖修飾度測定

GT凍干粉(實施例1、3、4、6、7、8、9,季銨化度為30mol?%)分別溶于氘水(D2O),以四甲基硅烷(TMS)為內標,AVANCE?DMX500型核磁共振儀于80?○C測定1H?NMR圖譜。按下列公式計算GT的半乳糖修飾度(GD,mol%):

?

其中[CH]為化學位移4.5?ppm處半乳糖上的氫峰面積,[CH3]為化學位移2.0?ppm處殼聚糖骨架上乙酰基氫的峰面積,DD為GT的脫乙酰度(85%)。

如表1所示,GT的半乳糖修飾度為5-60mol?%。

表1?GT的半乳糖修飾度

實施例72??半乳糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽游離巰基和二硫鍵的測定

游離巰基標準曲線:精密稱取Cys?0.035?g,置100?mL量瓶中,加水溶解并定容至刻度,制得2?μmol/mL貯備液;分別精密量取0.1、0.25、0.5、1、1.5、2.5、5?mL,置10?mL量瓶中,加水至刻度,制得濃度分別為0.02、0.05、0.1、0.2、0.3、0.5、1.0?μmol/mL的Cys標準溶液。分別精密量取0.5?mL,加0.5?mL?0.3?mg/mL?DTNB溶液(以0.5?mol/L?pH?8.0?PBS配制),混勻,室溫避光靜置2?h,以不加Cys標準溶液管為對照,測定450?nm處吸光值。以濃度(μmol/mL)對吸光值(A)進行線性回歸。

總巰基標準曲線:配制濃度分別為0.2、0.3、0.5、1.0、1.5?μmol/mL的Cys標準溶液;分別精密量取0.5?mL,加0.5?mL?0.05?mol/L?PBS(pH?8.0),混勻,室溫靜置30?min;加0.6?mL?3%(w/v)NaBH4溶液,37?°C水浴2?h;加0.5?mL?1?mol/L?HCl溶液和0.1?mL丙酮,混勻,室溫靜置10?min;加1?mL?1?mol/L?PBS(pH?8.0)和0.2?mL?0.5?mg/mL?DTNB溶液(以0.5?mol/L?pH?8.0?PBS配制),混勻,以不加Cys標準溶液管為對照,測定450?nm處吸光值。以濃度(μmol/mL)對吸光值(A)進行線性回歸。

樣品游離巰基含量測定:量取0.25?mL?GTC溶液(實施例1、2、3、4、5、10、12、13,季銨化度為30mol?%,濃度為2?mg/mL),加0.25?mL?0.5?mol/L?PBS(pH?8.0)和0.5?mL?0.3?mg/mL?DTNB溶液(以0.5?mol/L?pH?8.0?PBS配制),混勻,室溫避光靜置2?h,以不加GTC溶液管為對照,測定450?nm處吸光值。由標準曲線計算游離巰基含量,結果以每1克GTC含游離巰基的量(μmol)表示(μmol/g)。

樣品二硫鍵含量測定:量取0.5?mL?GTC溶液(實施例1、2、3、4、5、10、12、13,季銨化度為30mol?%,濃度為2?mg/mL),加0.5?mL?0.05?mol/L?PBS(pH?8.0),混勻,室溫靜置30?min;加0.6?mL?3%(w/v)NaBH4溶液,37?°C水浴2?h;加0.5?mL?1?mol/L?HCl溶液和0.1?mL丙酮,混勻,室溫靜置10?min;加1?mL?1?mol/L?PBS(pH?8.0)和0.2?mL?0.5?mg/mL?DTNB溶液(以0.5?mol/L?pH?8.0?PBS配制),混勻,以不加GTC溶液管為對照,測定450?nm處吸光值。由標準曲線計算總巰基含量。總巰基含量減去游離巰基含量差的一半為二硫鍵含量,結果以每1克GTC含二硫鍵的量(μmol)表示(μmol/g)。

表2?GTC上-SH和-S-S-的含量

實施例73??載尼妥珠單抗的半乳糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽納米粒的粒徑、Zeta電勢和包封率

粒徑、Zeta電勢:

Zetasizer?Nano-ZS型電位及粒度測定儀測定納米粒的粒徑和Zeta電勢。粒徑測定參數:He-Ne激光(波長633?nm),散射角θ=173°,測定溫度25?°C;Zeta電勢測定參數:He-Ne激光(波長635?nm),散射角θ=14°,測定溫度25?°C。

尼妥珠單抗包封率:

取載尼妥珠單抗的半乳糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽納米粒(實施例14、16、17、19、20、21、22、23、24、25、26,季銨化度為30mol?%)溶液1?mL,13,300?rpm離心30?min,取上清液500?μL,Lowry法測定尼妥珠單抗含量。按下式計算尼妥珠單抗包封率:

包封率(%)=?(A-B)×100/A

其中A為尼妥珠單抗投料量(mg);B為離心后上清液中的尼妥珠單抗含量(mg)。

如表3所示,載尼妥珠單抗的半乳糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽納米粒的粒徑為200-500?nm,Zeta電勢為15-30?mV,胰島素的包封率均高于70%。

表3?載尼妥珠單抗的半乳糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽納米粒粒徑、Zeta電勢和包封率

實施例74??載siRNA的半乳糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽納米粒的粒徑、Zeta電勢和包封率

粒徑、Zeta電勢:

Zetasizer?Nano-ZS型電位及粒度測定儀測定載siRNA的半乳糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽納米粒(實施例34、36、37、39、40、41、43、45、46、47、48,季銨化度為30mol?%)的粒徑和Zeta電勢。粒徑測定參數如下:He-Ne激光(波長633?nm),散射角θ=173°,測定溫度25?°C。Zeta電勢測定參數如下:He-Ne激光(波長635?nm),散射角θ=14°,測定溫度25?°C。

siRNA包封率:

取載siRNA的半乳糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽納米粒(實施例34、36、37、39、40、41、43、45、46、47、48,季銨化度為30mol?%)溶液1?mL,13,300?rpm離心30?min,取上清液500?μL,Pico?green試劑測定siRNA含量。按下式計算siRNA包封率:

包封率(%)=?(A-B)×100/A

其中A為siRNA投料量(mg);B為離心后上清液中的siRNA含量(mg)。

如表4所示,載siRNA的半乳糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽納米粒的粒徑為100-200?nm,Zeta電勢為20-30?mV,siRNA的包封率均高于60%。

表4?載siRNA的半乳糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽納米粒粒徑、Zeta電勢和包封率

實施例75??載pDNA的半乳糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽納米粒的粒徑、Zeta電勢和包封率

粒徑、Zeta電勢:

Zetasizer?Nano-ZS型電位及粒度測定儀測定載pDNA的半乳糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽納米粒(實施例49、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61,季銨化度為30mol?%)的粒徑和Zeta電勢。粒徑測定參數如下:He-Ne激光(波長633?nm),散射角θ=173°,測定溫度25?°C。Zeta電勢測定參數如下:He-Ne激光(波長635?nm),散射角θ=14°,測定溫度25?°C。

pDNA包封率:

取載pDNA的半乳糖修飾的巰基化殼聚糖季銨鹽納米粒(實施例49、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61,季銨化度為30mol?%)溶液1?mL,13,300?rpm離心30?min,取上清液500?μL,Hochest?33258試劑測定pDNA含量。按下式計算pDNA包封率:

包封率(%)=?(A-B)×100/A

其中A為pDNA投料量(mg);B為離心后上清液中的pDNA含量(mg)。

如表5所示,載pDNA的半乳糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽納米粒的粒徑為150-250?nm,Zeta電勢為15-30?mV,pDNA的包封率均高于60%。

表5載pDNA的半乳糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽納米粒粒徑、Zeta電勢和包封率

實施例76??同時包載多種蛋白質多肽藥物或核酸藥物的半乳糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽納米粒的粒徑、Zeta電勢和包封率

粒徑、Zeta電勢:

Zetasizer?Nano-ZS型電位及粒度測定儀測定同時載多種蛋白質多肽藥物或核酸藥物的半乳糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽納米粒(實施例62、63、64、65、66、67、68、69、70,季銨化度為30mol?%)的粒徑和Zeta電勢。粒徑測定參數如下:He-Ne激光(波長633?nm),散射角θ=173°,測定溫度25?°C。Zeta電勢測定參數如下:He-Ne激光(波長635?nm),散射角θ=14°,測定溫度25?°C。

如表6所示,同時包載多種蛋白質多肽藥物或核酸藥物的半乳糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽納米粒的粒徑為150-250?nm,Zeta電勢為15-30?mV,

表6同時包載多種蛋白質多肽藥物或核酸藥物的半乳糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽納米粒粒徑和Zeta電勢

實施例77??載siRNA的半乳糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽納米粒離子強度和pH穩定性

載siRNA的GTC(200,?30)納米粒(實施例34)加1?mol/L?NaCl調節離子強度至0.2?mol/L,測定納米粒的粒徑和Zeta電勢。

載siRNA的GTC(200,?30)納米粒(實施例34)加1?mol/L?HCl調節pH至1.2,靜置1?min,以1?mol/L?NaOH回調pH至7.4,測定納米粒的粒徑和Zeta電勢。

環境離子強度升至0.2?mol/L后,載siRNA的GTC(200,?30)納米粒(實施例34)的粒徑為144.0?±?13.6?nm,Zeta電勢為20.9?±?1.6?mV;pH由1.2調節至7.4后,載siRNA的GTC(200,?30)納米粒(實施例34)的粒徑為193.8?±?27.1?nm,Zeta電勢為13.5?±?1.3?mV。表明載siRNA的GTC(200,?30)納米粒可抵抗胃腸道高離子強度環境和pH變化對納米粒結構帶來的破壞作用。

實施例78???交聯劑對載siRNA的半乳糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽納米粒稀釋穩定性的影響

無交聯劑載siRNA的GTC(200,?30)納米粒的制備方法包括如下步驟:實施例3的半乳糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽溶于水,濃度為2?mg/mL。siRNA溶于水,濃度為0.2?mg/mL,攪拌下將半乳糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽溶液滴加至siRNA溶液中,半乳糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽與siRNA的質量比為15:1。室溫靜置30?min,荷正電的半乳糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽與荷負電的siRNA經聚電解質作用形成納米粒。測定納米粒的粒徑和Zeta電勢。

無交聯劑載siRNA的GTC(200,?30)納米粒和TPP交聯的載siRNA的GTC(200,?30)納米粒(實施例34)分別加水稀釋250倍,測定納米粒的粒徑和Zeta電勢。

無交聯劑載siRNA的GTC(200,?30)納米粒的粒徑為150.2?±?11.8?nm,Zeta電勢為24.5?±?2.7?mV,經過250倍稀釋后粒徑為367.1?±?10.7?nm,Zeta電勢為4.8?±?1.2?mV;載siRNA的GTC(200,?30)納米粒(實施例34)經過250倍稀釋后粒徑為187.0?±?1.0?nm,Zeta電勢為23.5?±?2.9?mV。表明交聯劑可提高載siRNA的GTC納米粒的穩定性。

實施例79??同時包載pDNA和siRNA的半乳糖修飾殼聚糖季銨鹽納米粒在小鼠體液中的穩定性

同時包載pDNA和siRNA的半乳糖修飾巰基化殼聚糖納米粒(實施例69、70)、siRNA溶液或pDNA溶液,加入等體積小鼠胃液、小腸液或小腸勻漿液,混勻,37?°C孵育一定時間;80?°C水浴5?min終止酶反應,加入4?μL?40?mg?mL-1肝素鈉溶液,室溫放置2?h使納米粒解離;量取一定體積(含100?ng?NC?siRNA或1?μg?pDNA),加至瓊脂糖凝膠上樣孔(siRNA電泳:4%瓊脂糖凝膠;pDNA電泳:1%瓊脂糖凝膠),電泳(siRNA電泳:55?V,60?min;pDNA電泳:100?V,60?min),EB顯色,凝膠成像儀觀察siRNA或pDNA條帶并拍照。

?如圖2所示,與小鼠體液溫育后,裸siRNA和pDNA降解,GTC(200,?30)納米粒組均可見清晰的siRNA和pDNA電泳條帶,表明GTC(200,?30)納米粒通過包載核酸藥物、屏蔽siRNA和pDNA上的酶切位點可有效保護siRNA和pDNA免被小鼠體液中的核酶降解。

實施例80??載siRNA半乳糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽納米粒的體外釋放

量取一定體積納米粒溶液(實施例34、42、44,含1?μg?FAM-NC?siRNA),13,300?rpm離心10?min,棄上清液,加1?mL?0.2?mol/L?PBS(pH?7.4)分散沉淀,37?°C、100?rpm振蕩溫育。分別于0.5、1、2、4?h?13,300?rpm離心10?min,精密量取上清液0.5?mL,酶標儀測定FAM-siRNA(FAM?λex=480?nm,?λem=520?nm;),并計算累積釋放量(%)。每次取樣后補加0.5?mL釋放介質,分散沉淀,繼續溫育。

載siRNA的GTC(200,?30)納米粒(實施例34、42、44)的4?h體外siRNA累積釋放量分別為77.26?±?1.30%、58.70?±?2.90%和52.43?±?2.21%,表明改變離子交聯劑種類可有效調節納米粒中siRNA的結合-釋放速率。

實施例81??同時包載siRNA和pDNA的半乳糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽納米粒在SD大鼠小腸的離體轉運

取SD大鼠,實驗前禁食12小時,可自由飲水。斷頸椎處死,沿腹中線打開腹腔,取出回腸,以Kreb’s-Ringer緩沖液清洗干凈,剪下約8?cm長的腸段(含3個Peyer’s結),兩端約1?cm處用絲線結扎形成封閉腸環,腸環內注入0.6?mL?納米粒(實施例69,含4?μg?FAM-NC?siRNA或20?μg?FITC-pDNA),以相同濃度的FAM-NC?siRNA或FITC-pDNA溶液為對照。腸環置高型稱量瓶中,加入6?mL?37?°C、氧氣飽和的Kreb’s-Ringer緩沖液,使腸環保持拉伸狀態,37?°C、100?rpm振蕩培養。分別于15、30、60、90、120、180、240?min取樣200?μL,補加37?°C?Kreb’s-Ringer緩沖液200?μL。樣品12,000?rpm離心5?min,熒光多功能酶標儀測定上清液中FAM-siRNA或FITC-pDNA含量(FAM?λex=480?nm,?λem=520?nm;FITC?λex=488?nm,?λem=519?nm)。按下式計算計算表觀滲透系數Papp:

GTC(200,?30)納米粒組siRNA和裸siRNA的Papp分別為(3.99?±?0.77)×10-6?cm/s和(0.93?±?0.05)×10-6?cm/s,GTC(200,?30)納米粒組pDNA和裸pDNA的Papp分別為(3.37?±?0.48)×10-6?cm/s和(1.04?±?0.04)×10-6?cm/s,表明納米粒可顯著促進siRNA和pDNA的小腸轉運。

實施例82??載siRNA半乳糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽納米粒在LPS刺激的Raw?264.7細胞的細胞黏附

取對數生長期的Raw?264.7細胞,胰酶消化,3,000?rpm離心5?min,沉淀以等滲緩沖液(葡萄糖44.4?g/L,KCl?0.2?g/L,Na2HPO4·12H2O?2.9?g/L,KH2PO4?0.2?g/L)重復洗滌三次,稀釋至0.5×106-1×106細胞/mL的細胞懸液;分別量取30?μL的納米粒,加至1?mL細胞懸液中,加入20?μL?0.5?μg/mL?LPS溶液(以0.2?mol/L?pH?7.4?PBS配制),37?°C培養2?h;3,000?rpm離心5?min,沉淀以1?mL?0.2?mol/L?PBS(pH?7.4)分散,測定Zeta電勢。以加PBS的細胞為空白對照。

LPS刺激的Raw?264.7細胞與GTC(200,?30)納米粒(實施例34)和相應TC(200,?30)納米粒共培養后,Zeta電勢由-14.9?±?0.3?mV分別變為-1.1?±?0.5?mV和-5.7?±?0.5?mV。與GTC(200,?30)納米粒共培養后細胞的Zeta電勢顯著高于TC(200,?30)納米粒組,表明GTC納米粒的細胞黏附力顯著高于TC(200,?30)納米粒。

實施例83??同時包載siRNA和pDNA的半乳糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽納米粒在BEL-7402細胞和HeLa細胞的細胞黏附

取對數生長期的BEL-7402細胞或HeLa細胞,胰酶消化,3,000?rpm離心5?min,沉淀以等滲緩沖液(葡萄糖44.4?g/L,KCl?0.2?g/L,Na2HPO4·12H2O?2.9?g/L,KH2PO4?0.2?g/L)重復洗滌三次,稀釋至0.5×106-1×106細胞/mL的細胞懸液;分別量取30?μL的納米粒加至1?mL細胞懸液中,37?°C培養2?h;3,000?rpm離心5?min,沉淀以1?mL?0.2?mol/L?PBS(pH?7.4)分散,測定Zeta電勢。以加PBS的細胞為空白對照。

BEL-7402細胞與GTC(200,?30)納米粒和相應TC(200,?30)納米粒共培養后,Zeta電勢由-13.2?±?0.6?mV分別變為-6.3?±?0.3?mV和-9.1?±?0.1?mV;HeLa細胞與GTC(200,?30)納米粒和相應TC(200,?30)納米粒共培養后,Zeta電勢由-11.2?±?0.7?mV分別變為-7.9?±?0.2?mV和-7.7?±?0.4?mV。與GTC(200,?30)納米粒共培養后BEL-7402細胞的Zeta電勢顯著高于TC納米粒組,而二種納米粒對HeLa細胞表面電勢的影響無顯著差異,表明GTC(200,?30)納米粒對肝癌細胞的黏附力顯著高于TC(200,?30)納米粒,對非肝癌細胞的黏附力與?TC(200,?30)納米粒無差異。

實施例84??載siRNA的半乳糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽納米粒在LPS刺激的Raw?264.7細胞的攝取

以5×104細胞/孔的密度接種對數生長期的Raw?264.7細胞至24孔板,37?°C、5%?CO2培養24?h;吸棄孔中液體,依次加入1?mL無血清培養基和20?μL?0.5?μg/mL?LPS溶液(以0.2?mol/L?pH?7.4?PBS配制),3孔為一組,按每孔0.4?μg?FAM-NC?siRNA分別加入納米粒溶液,37?°C、5%?CO2培養4?h;吸棄孔中液體,以0.2?mol/L?PBS(pH?7.4)洗滌三次,加0.8?mL?0.5%?SDS(w/v)溶液(pH?8.0),37?°C、100?rpm避光振蕩2?h。熒光多功能酶標儀測定細胞裂解液中FAM-NC?siRNA的含量(λex=480?nm,λem=520?nm),Lowry法測定裂解液中蛋白質的含量。攝取量以每1?mg蛋白質含FAM-NC?siRNA的量(ng)表示(ng/mg)。

載siRNA?GTC(200,30)納米粒(實施例34)在LPS刺激的Raw?264.7細胞的攝取量為340.5?±?22.3?ng/mg,而相應的TC(200,?30)納米粒在LPS刺激的Raw?264.7細胞的攝取量為210.0?±?29.1?ng/mg,表明半乳糖修飾顯著提高活化巨噬細胞對納米粒的攝取能力。

實施例85同時包載siRNA和pDNA的半乳糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽納米粒在BEL-7402細胞和HeLa細胞的細胞攝取

取生長旺盛的BEL-7402和HeLa細胞,以5×104細胞/孔的密度接種細胞至24孔板,37?°C、5%?CO2培養24?h;吸棄培養基,加入1?mL無血清DMEM,3孔為一組,按每孔0.4?μg?FAM-siRNA分別向每組孔中加入同時包載siRNA和pDNA的半乳糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽納米粒(實施例69),37?°C、5%?CO2培養4?h;吸棄孔中液體,加PBS洗滌三次,加入0.5?mL?0.5%?SDS溶液(pH?8.0),室溫、避光裂解20?min。熒光多功能酶標儀測定裂解液中FAM-siRNA或FITC-pDNA的含量(FAM?λex=480?nm,?λem=520?nm;FITC?λex=488?nm,?λem=519?nm),Lowry法測定蛋白質含量。攝取量以每1?mg蛋白質含FAM-siRNA或FITC-pDNA的量(μg)表示(μg/mg)。

BEL-7402細胞對GTC(200,?30)納米粒和相應TC(200,?30)納米粒中pDNA攝取量分別為5.91?±?0.13和3.64?±?0.16?μg/mg,siRNA攝取量分別為0.60?±?0.04和0.36?±?0.02?μg/mg;HeLa細胞對GTC(200,?30)納米粒和相應TC(200,?30)納米粒中pDNA攝取量分別為3.37?±?0.36和3.61?±?0.13?μg/mg,siRNA攝取量分別為0.30?±?0.06和0.32?±?0.04?μg/mg。GTC(200,?30)納米粒在BEL-7402細胞中的攝取量顯著高于TC(200,?30)納米粒組,而二種納米粒在HeLa細胞中的攝取量無顯著差異,表明GTC納米粒可提高pDNA和siRNA在肝癌細胞中的攝取量。

實施例86??載siRNA的半乳糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽納米粒在LPS刺激的Raw?264.7細胞的轉染

以Map4k4?siRNA為基因藥物,以2×104細胞/孔的密度接種Raw?264.7細胞至24孔板,37?°C、5%?CO2培養24?h;吸棄孔中液體,依次加入1?mL新鮮無血清培養基和20?μL?0.5?μg/mL?LPS溶液(以0.2?mol/L?pH?7.4?PBS配制),3孔為一組,按每孔0.4?μg?Map4k4?siRNA分別加入載藥納米粒或Lipofecatmine?2000/siRNA復合物,37?°C、5%?CO2培養4?h;吸棄孔中液體,每孔加入1?mL含10%?FCS的培養基,37?°C、5%?CO2繼續培養20?h;更換培養基,每孔加入20?μL?0.5?μg/mL?LPS溶液(以0.2?mol/L?pH?7.4?PBS配制),37?°C、5%?CO2培養5?h。吸取上清液,小鼠TNF-α?ELISA試劑盒測定TNF-α蛋白質的含量(ng/mL)。

載siRNA?GTC(200,30)納米粒(實施例34)在Raw?264.7細胞的基因沉默效率為59.2?±?2.4%時,而相應的載siRNA?TC(200,?30)納米粒和Lipofectamine2000/siRNA復合物在LPS刺激的Raw?264.7細胞的基因沉默效率分別為51.4?±?4.6%和31.1?±?7.4%。上述結果表明半乳糖修飾顯著提高了納米粒的細胞轉染效率,且GTC(200,30)納米粒的轉染效率優于常用的轉染試劑Lipofectamine?2000。

實施例87同時包載pDNA和siRNA的半乳糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽納米粒在BEL-7402細胞的轉染

以iSUR-pDNA和VEGF?siRNA為靶基因,以4×104細胞/孔的密度接種BEL-7402細胞至24孔板,37?°C、5%?CO2培養24?h;更換無血清培養基,加入納米粒,37?°C、5%?CO2培養4?h;不加納米粒的孔為空白對照,Lipofectamine?RNAiMAX/siRNA和Lipofectamine2000/pDNA復合物的孔為陽性對照;吸棄孔中液體,每孔加入1?mL含10%?胎牛血清的DMEM培養基,37?°C、5%?CO2繼續培養20?h(轉染總時間為24?h);吸取上清液,人VEGF?ELISA試劑盒測定VEGF含量,以空白對照組VEGF含量為100%,計算各試驗組相對百分含量(%);繼續培養24?h(轉染總時間為48?h),熒光素酶報告基因檢測試劑盒測定pDNA中熒光素酶表達量,Lowry法測定細胞蛋白質的含量。攝取量以每1?mg蛋白質所含相對光子數(RLU)表示(RLU/mg)。

GTC(200,30)納米粒(實施例69)在BEL-7402細胞的siRNA沉默效率為65.99?±?3.41%,而相應的TC(200,?30)納米粒和Lipofectamine?RNAiMAX/siRNA復合物在BEL-7402細胞的基因沉默效率分別為50.06?±?1.31%和73.98?±?2.11%。上述結果表明半乳糖修飾顯著提高了納米粒的siRNA基因沉默效率。GTC(200,30)納米粒(實施例69)在BEL-7402細胞的pDNA表達量為(2.97?±?0.19)×105?RLU/mg,而相應的TC(200,?30)納米粒和Lipofectamine?2000/pDNA復合物在BEL-7402細胞的基因沉默效率分別為(1.56?±?0.08)×105和(1.69?±?0.06)×105。上述結果表明半乳糖修飾顯著提高了納米粒的pDNA轉染效率,且GTC(200,30)納米粒的轉染效率優于常用的轉Lipofectamine?2000。

實施例88??載Map4k4?siRNA的半乳糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽納米粒口服后在葡聚糖硫酸鈉誘導潰瘍性結腸炎模型小鼠的體內轉染

雄性C57BL/6小鼠,稱重,隨機分為三組。第一組給予3%葡聚糖硫酸鈉(DSS)溶液自由飲用7天且于前6天連續每天灌胃給予GTC(200,?30)納米粒(實施例34,給藥劑量按Map4k4?siRNA計為250?μg?kg-1);第二組給予3%?DSS溶液自由飲用7天且于前6天連續每天灌胃給予0.2?mL生理鹽水(疾病對照組);第三組給予水自由飲用7天(正常對照組)。第8天處死小鼠,小鼠TNF-α?ELISA試劑盒測定小鼠結腸組織勻漿液中TNF-α含量。

載Map4k4?siRNA?GTC(200,?30)納米粒組、疾病對照組和正常對照組小鼠結腸組織TNF-α含量分別為732.4?±?214.8、3272.7?±?803.8和480.8?±?189.0?pg/g,GTC納米粒可有效降低DSS誘導潰瘍性結腸炎模型小鼠結腸組織的TNF-α含量,表明半乳糖修飾可促進納米粒口服后靶向聚集于結腸炎癥部位的巨噬細胞,并轉染巨噬細胞、沉默TNF-α,發揮口服RNAi作用。

實施例89??載siRNA半乳糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽納米粒的組織分布

取C57BL/6小鼠24只,以3%(w/v)葡聚糖硫酸鈉(DSS)溶液替代普通飲用水,正常喂食,構建潰瘍性結腸炎小鼠模型。造模第7天,小鼠禁食12小時,可自由飲水,稱重,隨機分為二組,每組12只,分別灌胃給予載tamra-NC?siRNA的GTC(200,?30)納米粒(實施例34)和TC(200,?30)納米粒(給藥劑量按tamra-NC?siRNA計為250?μg/kg)。每組分別于2、6、12?h取4只小鼠,摘眼球取血,血樣置經肝素抗凝處理的離心管中,3,000?rpm離心10?min,熒光多功能酶標儀測定上清液血漿中tamra-NC?siRNA含量(λex=544?nm,?λem=576?nm);分別取肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、小腸和結腸,生理鹽水清洗,濾紙吸干水分,稱重,剪碎,每0.1?g組織中加1?mL?RIPA裂解液以玻璃勻漿器勻漿,勻漿液3,000?rpm離心10?min,熒光多功能酶標儀分別測定上清液中tamra-NC?siRNA含量(λex=544?nm,?λem=576?nm)。不同時間血漿或組織中tamra-NC?siRNA占總給藥量的百分數即為體內藥物的相對分布百分率(%)。

tamra-NC?siRNA在脾臟、肺臟和腎臟中的分布百分比顯著低于在肝臟、血液、小腸和結腸中的分布百分比。tamra-NC?siRNA在小腸和結腸中的分布隨著時間的延長而下降,給藥后2?h,GTC(200,?30)納米粒(實施例34)組tamra-NC?siRNA在小腸和結腸中的分布水平分別為28.5?±?10.6%和21.3?±?3.5%;TC(200,?30)納米粒組tamra-NC?siRNA在小腸和結腸中的分布水平分別為48.9?±?10.3%和9.0?±?4.5%。給藥后6?h,tamra-NC?siRNA在血漿和肝臟中的分布達到峰值,此時GTC(200,?30)納米粒組tamra-NC?siRNA在血漿和肝臟中的分布水平分別為1.2?±?0.2%和7.8?±?1.4%;TC(200,?30)納米粒組tamra-NC?siRNA在血漿和肝臟中的分布水平分別為6.2?±?2.6%和15.6?±?2.0%。表明GTC(200,?30)納米粒可顯著促進tamra-NC?siRNA在結腸中的分布,且GTC(200,?30)納米粒經口服后主要聚集于炎癥結腸組織,僅少量經小腸吸收進入血液循環。

實施例90??同時包載pDNA和siRNA的半乳糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽納米粒抗腫瘤

胰酶消化對數生長期BEL-7402細胞,1,500?rpm離心5?min收集細胞;加入10?mL?PBS?(0.2?M,?pH?7.4)重懸細胞沉淀,1500?rpm離心5min收集細胞,PBS重復洗滌三次;向細胞沉淀中加入適量0.2?mol/L?PBS(pH?7.4)制備單細胞懸液,細胞計數后調整細胞濃度至2×107細胞/mL;吸取0.2?mL細胞懸液,皮下接種于雌性Balb/c裸鼠右前肢腋下部位,待腫瘤體積長至100?mm3時,隨機分為5組,每組6只。分別灌胃給予同時包載iSUR-pDNA和VEGF?siRNA的GTC納米粒,同時包載iSUR-pDNA和VEGF?siRNA的TC納米粒,同時包載pGL-3和VEGF?siRNA的GTC納米粒,同時包載iSUR-pDNA和scramble?VEGF?siRNA的GTC納米粒和200?μL生理鹽水。第一次給藥時間定為第0?d,分別于第0、2、4、6、8?、10、12、14、16和18?d給藥(給藥劑量按siRNA計為200?μg/kg)。隔天用游標卡尺測量瘤塊的長徑(Lt,?mm)和短徑(St,?mm),計算腫瘤體積(Vt,?mm3):Vt?=?Lt×St2/2,繪制腫瘤生長曲線。第20?d處死所有小鼠,剖出瘤塊,拍照,稱重,-70?°C保存。

上述四個納米粒組的抑瘤率分別為87.94%、74.88%、63.30%和75.78%,GTC(200,?30)納米粒組抑瘤效率優于相應TC(200,?30)納米粒組,表明半乳糖修飾可提高體內轉染效率,GTC(200,?30)聯合給藥組抑瘤效率優于GTC(200,?30)單給藥組,表明siRNA和pDNA聯合給藥可發揮協同作用,提高體內抗腫瘤療效。

實施例91??同時包載pDNA和siRNA的半乳糖修飾巰基化殼聚糖季銨鹽納米粒抗腫瘤

胰酶消化對數生長期QGY-7703細胞,1,500?rpm離心5?min收集細胞;加入10?mL?PBS?(0.2?M,?pH?7.4)重懸細胞沉淀,1500?rpm離心5min收集細胞,PBS重復洗滌三次;向細胞沉淀中加入適量0.2?mol/L?PBS(pH?7.4)制備單細胞懸液,細胞計數后調整細胞濃度至2×107細胞/mL;吸取0.2?mL細胞懸液,皮下接種于雌性Balb/c裸鼠右前肢腋下部位,待腫瘤體積長至100?mm3時,隨機分為4組,每組6只。分別瘤內注射給予載VEGF?siRNA的GTC納米粒(實施例34、42、44)和100?μL生理鹽水。第一次給藥時間定為第0?d,分別于第0、2、4、6、8?、10、12、14、16和18?d給藥(給藥劑量按siRNA計為50?μg/kg)。隔天用游標卡尺測量瘤塊的長徑(Lt,?mm)和短徑(St,?mm),計算腫瘤體積(Vt,?mm3):Vt?=?Lt×St2/2,繪制腫瘤生長曲線。第20?d處死所有小鼠,剖出瘤塊,拍照,稱重,-70?°C保存。

上述三組GTC(200,?30)納米粒組的抑瘤率分別為70.86%、94.22%和85.67%,實施例42納米粒組抑瘤效率最佳,表明改變離子交聯劑調節siRNA結合-釋放速率后,可保證siRNA的胞外穩定和胞內釋放,提高siRNA的體內抗腫瘤功效。

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本文標題:半乳糖修飾的巰基化殼聚糖季銨鹽納米粒及其制備方法和應用.pdf
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